22 minute read
In Vivo Kinase Manipulation And Assessment Of Physiologic Outputs
2.6 Sirius Red Staining
2.7 Masson’s Trichrome Staining
Advertisement
3.1 Osmotic Minipump Implantation
1. Paraffin-embedded tissue sections mounted on slides. 2. Xylene. 3. Ethanol. 4. Weigert’s iron hematoxylin A solution. 5. Weigart’s iron hematoxylin B solution. 6. 0.1 % Sirius Red in saturated picric acid. 7. 0.01 N HCl.
1. Paraffin-embedded tissue sections mounted on slides. 2. Xylene. 3. Ethanol. 4. Weigert’s iron hematoxylin A solution. 5. Weigart’s iron hematoxylin B solution. 6. Bouin’s solution. 7. Biebrich scarlet-acid fuchsin solution. 8. Phosphotungstic-phosphomolybdic acid solution. 9. Aniline blue solution. 10. 1 % acetic acid.
3 Methods
Fill micro-osmotic pump 1. Weigh the empty pump and flow moderator, together (see
Note 1). 2. Prepare stock solution of AngII (see Note 2). Taking into account the animal’s weight, calculate dilution of stock solution so that 1000 ng/kg/min is delivered to the animal for 2 weeks. (a) 140{[10/(1000 × body weight/1 × 106/0.25 × 60)] − 1}. 3. Draw the solution of Ang II into a 1 ml syringe. Attach the 27 G filling tube (see Note 3). 4. Remove the flow moderator from the pump and hold the pump upright. Insert the filling tube as far as possible into the opening at the top of the pump. 5. Inject drug slowly into pump. Remove tube when solution reaches the outlet. 6. Wipe excess solution and insert flow moderator until the white flange is flush with the top of the pump. 7. Weigh the filled pump to determine the weight of the solution loaded (see Note 4).
3.2 Genotyping
of Sm22α cre-lox Mice
3.3 Western Blot to Quantitate Kinases
8. Place filled pumps in eppendorf tubes and cover with 0.9 % sterile saline. Incubate at 37 °C overnight (see Note 5).
Implantation 1. Anesthetize animal. 2. Shave and disinfect the skin on the right shoulder where the implantation site will be. 3. Make a midline skin incision, 0.5 cm long, perpendicular to the tail. Carefully tent up the incision and use straight hemostats to make a subcutaneous tunnel underneath the skin to create a pocket for the mini-pump. 4. Insert the filled pump into the cavity with the flow moderator pointing away from the incision (see Note 6). 5. Close the wound with three or four interrupted sutures.
1. Through standard breeding practices, breed experimental mice that are cre/+;lox/lox. 2. Use a freshly cut mouse toe from a 2 week old pup (see Note 7). 3. With tissue in an eppendorf tube, add 180 μl of 50 mM NaOH, then vortex for 30 s. 4. Boil sample for 10 min then vortex for 30 s. 5. Add 20 μl of 1 M Tris–HCl pH 8.0, then vortex for 30 s. 6. Spin at 10,000 × g for 5 min. 7. Use 0.5 μl of supernatant for PCR. 8. Perform PCR with Cre primers to identify cre positive mice.
Perform PCR with primers flanking lox site to identify +/+, +/ lox, and lox/lox mice. 9. Experimental animals are cre positive; lox/lox mice. Control mice can be cre positive; +/+ mice or cre positive; +/lox depending on the gene to be knocked out.
Prepare samples of mouse tissue 1. Homogenize tissue in RIPA buffer. 2. Quantitate protein by standard methods. 3. Dilute sample for western using RIPA buffer so that each sample has equivalent protein amount and volume in final 1× SDS
Sample buffer (see Note 8).
Run western blot
1. Run sample on 7.5 % or 10 % SDS PAGE with stacking gel at 50 V until sample through stacking gel. Increase voltage to 100 V. 2. Transfer the protein to nitrocellulose membrane by overnight transfer at 30 V in 4 °C using Overnight Transfer Buffer.
3.4 Immunohisto chemistry to Evaluate Phosphorylation of Kinase
3. Wash membrane three times for 10 min in TBS-Tween, with slight rocking. 4. Block membrane with 5 % (w/v) nonfat dry milk in TBS-
Tween for 1 h at room temperature, with slight rocking. 5. Incubate blot with primary antibody in TBS-Tween overnight at 4 °C, with slight rocking. 6. Wash membrane three times for 10 min in TBS-Tween, with slight rocking. 7. Incubate blot with secondary antibody (HRP-conjugated antimouse or anti-rabbit) in TBS-Tween for 1 h at room temperature, with slight rocking. 8. Wash membrane three times for 10 min in TBS-Tween, with slight rocking. 9. Add ECL reagents, incubate at room temperature for 1 min, expose to X-ray film.
Deparaffinize and hydrate slides 1. Incubate slide in Xylene, twice for 5 min. 2. Incubate slide in 100 % ethanol, twice for 3 min. 3. Incubate slide in 90 % ethanol, once for 2 min. 4. Incubate slide in 70 % ethanol, once for 2 min. 5. Incubate slide in distilled water, once for 2 min.
Unmasking 1. Incubate slide in boiling citrate buffer, 10 min. 2. Incubate slide at room temperature, 20 min. 3. Wash slide with distilled water, three times for 3 min.
Deactivation of endogenous peroxidase 1. Incubate slide in 0.3 % H2O2 in MeOH, 20 min. 2. Wash slide with distilled water, three times for 2 min. 3. Wash slide with PBS, three times for 1 min.
Blocking (see Note 9) 1. Incubate slide in PBS-T with 5 % Normal Goat Serum and 1 %
BSA for 60 min at room temperature. 2. Wash slide with 0.1 % BSA PBS-T, two times for 1 min. 3. Incubate slide with one drop of Avidin for 10 min. 4. Wash slide with 0.1 % BSA PBS-T, two times for 1 min. 5. Incubate slide with one drop Biotin for 10 min. 6. Wash slide with 0.1 % BSA PBS-T, two times for 1 min.
3.5 Telemetry to Evaluate Hypertension (See Note 10)
Primary antibody 1. Incubate slide with primary antibody (diluted in 1 % BSA PBS-
T) overnight at 4 °C. 2. Wash slide with 0.1 % BSA PBS-T four times for 5 min.
Secondary antibody 1. Incubate slide with Biotinylated Goat anti-rabbit IgG or
Biotinylated Horse anti-mouse IgG in 1 % BSA PBS-T for 90–120 min at room temperature. 2. Wash slide with 0.1 % BSA in PBS-T, four times for 5 min.
Amplification 1. Incubate slide with ABC complex for 30 min. 2. Wash slide with PBS, three times for 5 min.
Development 1. Perform DAB reaction for 1–10 min depending on antibody. 2. Wash slide with distilled water, three times for 3 min.
Counter stain
1. Wash slide with hematoxylin for 30 s. 2. Wash slide with distilled water for 15 s. 3. Wash slide with acid alcohol for 20 s. 4. Wash slide with distilled water for 15 s. 5. Wash slide with blueing agent for 20 s. 6. Wash slide with distilled water for 1 min.
Dehydration and penetration (Fig. 1) 1. Wash slide with 70 % EtOH for 1 min. 2. Wash slide with 100 % EtOH three times for 1 min. 3. Wash slide with CitriSolv three times for 1 min. 4. Wash slide with Xylene one time for 5 min.
1. Create a subcutaneous pocket in left shoulder by cutting a 1 cm linear incision. 2. Make a midline incision from the sternum to the jaw, approximately 2 cm. Retract the salivary glands to expose the muscles of the trachea. 3. Insert the transmitter into the subcutaneous pocket on the left shoulder (Fig. 2) and guide the catheter subcutaneously to the neck. 4. Loosely tape the animal’s forelimbs to the table.
Fig. 1 IHC data using anti-EGFR-pY1068 with heart samples with coronary arteries
Fig. 2 Location of the transmitter
5. Locate the carotid artery along the left side of the trachea and carefully isolate the vessel from the connective tissue and vagus nerve (see Note 11). 6. Pass two lengths of nonabsorbable suture (6-0) underneath the isolated section of artery. 7. Position one suture just proximal to the bifurcation of the external and internal carotid arteries and ligate the vessel. 8. Position the other suture close to the clavicle and apply tension to elevate the artery and occlude blood flow. 9. Cut the vessel just below the point of ligation with fine micro scissors and insert the catheter. Alternatively, a bent-tipped syringe needle can be used to incise the vessel wall and introduce the catheter into the artery (Fig. 3) [5]. Advance the tip so that the catheter notch is a few millimeters above the clavicle. Tie in the catheter using the two sutures.
Fig. 3 Bent tip syringe to help introduce telemetry catheter
3.6 Sirius Red Staining to Evaluate End Organ Damage (See Note 12)
10. Confirm that the radiotelemetry is transmitting. If not working well, change the position of the catheter tip and retry. 11. Close the catheter skin incision with nonabsorbable sutures (5-0 or 6-0). 12. Close the telemetry skin incision with nonabsorbable sutures (5-0 05 6-0). 13. Allow animal to recover at least 10 min on warming pad. 14. Starting the next day, measure blood pressure continuously.
Deparaffinize and hydrate slides 1. Incubate slide in xylene, twice for 5 min. 2. Incubate slide in 100 % ethanol, twice for 3 min. 3. Incubate slide in 90 % ethanol, once for 2 min. 4. Incubate slide in 70 % ethanol, once for 2 min. 5. Incubate slide in distilled water, once for 2 min.
Staining 1. Make iron hematoxylin working solution by mixing a 1:1 ratio of Weigert’s iron hematoxylin A and Weigart’s iron hematoxylin B solutions. 2. Stain slide with hematoxylin working solution for 10 min at room temperature. 3. Wash slide, twice for 3 min. 4. Stain slide with Sirius Red (0.1 % in saturated picric acid) for 1 h at room temperature. 5. Wash slide with 0.01 N HCl, twice for 3 min.
3.7 Masson’s Trichrome Staining to Evaluate End Organ Damage (See Note 13)
Dehydration and penetration 1. Incubate slide in 70 % ethanol for 3 min. 2. Incubate slide in 100 % ethanol for 3 min. 3. Incubate slide in xylene, twice for 5 min. 4. Mount slides (Fig. 4).
Deparaffinize and hydrate slides 1. Incubate slide in xylene, twice for 5 min. 2. Incubate slide in 100 % ethanol, twice for 3 min. 3. Incubate slide in 90 % ethanol, once for 2 min. 4. Incubate slide in 70 % ethanol, once for 2 min. 5. Incubate slide in distilled water, once for 2 min.
Staining 1. Stain slide with Bouin’s solution for 1 h at 56 °C. 2. Rinse slide in tap water, three times for 3 min. 3. Make hematoxylin working solution by mixing a 1:1 ratio of
Weigert’s iron hematoxylin A and Weigart’s iron hematoxylin
B solutions. 4. Stain slide with hematoxylin working solution for 7.5 min at room temperature. 5. Rinse slide in distilled water for 30 s. 6. Stain slide in Biebrich scarlet-acid fuchsin solution for 7.5 min. 7. Rinse slide in distilled water for 30 s. 8. Differentiate slide in phosphotungstic-phosphomolybdic acid solution for 5 min (see Note 14). 9. Stain slides in aniline blue solution for 5 min. 10. Differentiate slide in 1 % acetic acid solution for 1 min.
Fig. 4 Sirius Red staining data in heart samples with coronary arteries
11. Rinse slide in distilled water for 30 s. 12. Nuclei will stain black; collagen will stain blue; muscle, cytoplasm, and keratin will stain red.
Dehydration and penetration 1. Incubate slide in 70 % ethanol for 3 min. 2. Incubate slide in 100 % ethanol for 3 min. 3. Incubate slide in xylene, twice for 5 min. 4. Mount slides.
4 Notes
1. Use sterile technique including filter sterilization of drug. 2. Store as filter sterilized solution of 10 mM Ang II in saline. 3. Avoid air bubbles. 4. Weight of pump in milligrams is equivalent to volume in milliliters. 5. Incubate overnight for a 2 week pump and 48 h for a 4 week pump. 6. If the pocket is not large enough to hold the implant comfortably, remove the implant and enlarge the pocket as described above. 7. Do not freeze tissue sample. 8. Make a 5× sample buffer to use for final sample dilution. 9. Starting at this step, work with slides in a moisturizing box. 10. Potential adverse effects from this procedure may include: anesthetic related respiratory distress, infection of the subcutaneous pocket, catheter insertion site, dehiscence of the surgical site, seroma formation around the transmitter, hind limb paresis or paralysis related to ischemia or nerve damage, hemorrhage due to leaking of the vessel around the catheter insertion site. 11. Do not disturb the vagus nerve. 12. This procedure works best on paraffin-embedded sections. 13. This procedure works well on both paraffin-embedded sections and frozen tissue samples. 14. Immerse until collagen is no longer red.
References
1. Shirai H, Autieri M, Eguchi S (2007) Small gtp-binding proteins and mitogen-activated protein kinases as promising therapeutic targets of vascular remodeling. Curr Opin Nephrol
Hypertens 16:111–115 2. Sarikonda KV, Watson RE, Opara OC, Dipette
DJ (2009) Experimental animal models of hypertension. J Am Soc Hypertens 3:158–165 3. Qin Z (2008) Newly developed angiotensin iiinfused experimental models in vascular biology. Regul Pept 150:1–6 4. Kurtz TW, Griffin KA, Bidani AK, Davisson RL,
Hall JE, Subcommittee of P, Public Education of the American Heart A (2005) Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: blood pressure
measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American heart association council on high blood pressure research. Hypertension 45:299–310 5. Takayanagi T, Kawai T, Forrester SJ, Obama T,
Tsuji T, Fukuda Y, Elliott KJ, Tilley DG,
Davisson RL, Park JY, Eguchi S. (2015) Role of epidermal growth factor receptor and endoplasmic reticulum stress in vascular remodeling induced by angiotensin II. Hypertension 65(6): 1349–55 6. Huetteman DA, Bogie H (2009) Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods Mol Biol 573:57–73
Index
A
Acetylcholine (Ach) �������������������������������� 355–357, 362–366, 369, 371–374, 376 Adenovirus ����������������������������������������������� 201–203, 205–209 Adipocytes�������������������������������������������������������� 283–293, 405 Adoptive transfer��������������������������������������321, 322, 325, 326, 328–335, 337, 338, 340–342, 344 Affymetrix arrays�������������������������6–10, 13–19, 43, 45, 48, 49 Aldosterone ������������������������������������������������������ 139–150, 321 Aldosterone synthase������������������������������������������������139–150 Amino terminal fragments �������������������������������������������������82 Amplex red resorufin��������������������������������������������������������������221, 229 Angiotensin-II (Ang-II) ����������������������������� 42, 81, 82, 84–87, 89, 94–99, 101, 117, 118, 127–136, 152, 153, 155, 158, 201, 203, 207–210, 321, 356, 369, 382, 395, 421 Angiotensin converting enzyme (ACE) ���������������������� 82, 96, 99, 102–105, 107, 109–111, 113, 114, 117–125, 127, 128, 369 Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) �����������������������82, 102–105, 107, 109–114, 117–125, 356, 369 Angiotensin peptides
Ang I ����������������������������� 81–83, 85, 86, 89, 127, 134, 371
Ang II�������������������������������42, 81–87, 89, 94–99, 101, 117, 127–136, 152, 153, 155, 158, 201, 203, 207–208, 210, 321, 356, 369, 371, 395, 421
Ang-(1-7)���������������������������81–83, 85, 89–90, 92, 94–99, 101, 110, 117, 118, 356, 369, 371, 372, 374–377 Annexin V ����������������������������������������������������������������272–279 Antibody����������������������������������� 11, 12, 54, 82, 129, 132, 133, 155, 156, 159–161, 166, 171, 202, 216, 217, 272, 298, 325, 423, 426, 427 Anti-miR (Anti-miRNA) anti-miR-oligonucleotide ��������������������������� 411, 412, 416 Aorta ���������������������������� 56, 201, 204, 226, 228, 242, 246, 343, 348, 349, 352–353, 356, 361, 365, 369–372, 374, 376, 378, 397–402, 405 Apoptotic bodies ������������������������������������������������������271, 274 Artery ����������������������������������������� 64, 127, 154, 157, 174, 190, 191, 196, 198, 204, 213, 220, 242, 245, 349–352, 355, 356, 359–363, 365, 366, 389, 397–400, 403, 404, 409, 410, 428 Atherosclerosis ��������������������������������������������������� 63, 346, 349
B
BALB/c������������������������������������������������������������ 383, 390, 403 Bioinformatics ��������������������������� 19, 43, 54, 56, 58–59, 73, 74 Biological fluid ���������������������������62, 102–105, 107, 109–111, 113, 114, 163 Biomarker��������������������������������������������������26, 41, 62, 66, 271 Blood��������������������������������������1, 2, 41, 62, 64, 81, 83–86, 105, 113, 117, 128, 154, 163–165, 189, 192–194, 219, 220, 242, 248, 274–275, 283, 287, 297, 298, 304, 323, 325, 338, 340, 342, 345, 350, 352, 356, 360–363, 366, 381, 397, 409, 410, 416, 422, 428, 429 pressure��������������������1, 2, 64, 81, 117, 128, 189, 219, 220, 298, 350, 356, 362, 363, 381, 409, 410, 416, 422, 429 vessel���������������������������� 192–194, 283, 287, 297, 345, 381 B-lymphocytes����������������������������������������������������������273, 321 Brain hypothalamus������������������������������������������������������118–119 Broad Institute �������������������������������������������������������������������47 Buffy coat �����������������������������������������������������������������313–314
C
C57BL/6 mice����������������������������������118, 120, 124, 321, 382, 383, 390, 391, 403 Calcium ������������������������������������128, 131, 154, 177–186, 189, 190, 192–194, 196, 198, 199, 220, 253, 254, 279, 304 Calcium channel���������������� 189, 190, 192–194, 196, 198, 199 Calcium probe �������������������������������������������������� 179, 180, 182 Calcium transient �����������������������������������������������������178, 183 Capillary electrophoresis (CE) �������������������������������������������63 Cardiomyocytes�������������������������127, 128, 130–131, 133, 134 Cardiovascular disease (CVD)��������������������������25, 26, 37, 63, 102, 118, 213, 298, 321, 356 Catheter��������������������������������������������356, 359–362, 365, 366, 410–418, 427–429, 431 Caveolin-1������������������������������������������������������������������������253 CD4+CD25+ ���������������������������������������������������������������������341 Cell adhesion������������������������������������������������������������298, 348 Cell culture ��������������������������������� 41, 102, 106, 107, 113, 118, 130, 151, 152, 201, 202, 204, 215, 221, 225–228, 241, 284, 291, 300, 308, 351, 353 Cell proliferation ��������������������������������������������������������������209 Cerebrospinal fluid (CSF) ���������������������������������� 62, 117–125 Cholesterol depletion ��������������������������������������� 252, 261–264
Rhian M. Touyz and Ernesto L. Schiffrin (eds.), Hypertension: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1527, DOI 10.1007/978-1-4939-6625-7, © Springer Science+Business Media LLC 2017 433
Cholesterol reloading ��������������������������������������� 253, 261–264 Cholesterol-rich microdomains caveolae�������������������������������252, 253, 255, 256, 259–261, 263, 264, 266–268 lipid rafts �������������252, 253, 255, 256, 259–261, 263, 264, 266–268 Chymase (CHYM) ������������������������������������������������������������82 Colony-stimulating factor ����������������������������������������298, 299 Computational biology�������������������������������������������������43, 49 Confocal imaging���������������������������������������������������������������177–186 microscopy������������������������������������������160, 161, 177–179, 182–184, 230, 389, 400 Connectivity Map (CMAP)����������������������������������� 43, 48, 49 Contraction ���������������������������������������127, 183, 213, 349, 374 Cre-Lox��������������������������������������������������������������������422, 425 Cre recombinase ������������������������382, 383, 390, 399, 400, 403 C-terminal products �����������������������������������������������������������82 CYP11B2 �����������������������������������������������������������������139–150 Cytoplasm �������������������������������������������������������� 152, 182, 431 Cytosol ���������������������������������������������������������������������181–186
D
Data integration �����������������������������������������������������������70, 77 Depolarization������������������������������������������ 189, 190, 196, 197 Detergent-free����������������������������������������������������������256–261 Detergents ionic detergents�����������������������������������������������������������186 non-ionic detergents�������������������������������������������252, 387 Dihydroethidium (DHE)������������������������ 221–223, 228–231, 233–235, 237–248 Dismutate�������������������������������������������������������������������������220 Dopamine�����������������������������������������������������������������151–161
E
Electron microscopy ���������������������������������155, 156, 173–174, 272, 276, 279, 387, 388 Electrophysiology������������������������������190, 192–195, 346, 350 Endothelial cells (ECs)������������������������������������ 217, 220, 231, 273, 298, 345–348, 352, 356, 405 Endothelial dysfunction ����������������������������������� 356–363, 381 Endothelial function ������������ 346, 356, 364, 372–374, 403, 404 Endothelial nitric oxide synthase (eNOS)��������������� 220, 247, 346, 356 Endothelin-1 (ET-1)��������������������������������������������������������345 Endothelium ������������������������������������180, 204, 220, 345, 355, 356, 369, 372–376, 401, 405 Enhanced green fluorescent protein (EGFP)������������������384, 388–389, 395, 399, 400 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)��������������102, 105, 129, 132 Epidermal growth factor ������������������������������������������201, 421 Epidermal growth factor receptor (EGFR)������������� 201, 202, 421, 422, 428 Ethidium ������������������������������ 3, 140, 143, 149, 223, 229, 231, 233–236, 238, 239, 242, 244, 247, 292, 386 Exosome�������������������������������������������������������������������271, 274 Explant primary cell culture ����������������������������� 201, 202, 204
F
Fibroblasts ����������������������������������������������������������������300, 352 Fixation ������������������������������������136, 155, 158–159, 325, 333, 334, 337, 360, 363, 386–387, 395–397 Flow cytometry�������������������������129–130, 133, 136, 271–276, 278, 279, 307, 322, 324–328, 331–339, 341, 343 Fluorescent probes
Fluo-3������������������������������������������������� 179, 180, 185, 186
Fluo-4��������������������������������������������������������� 179, 180, 186
Fura-2AM ������������������������������������������������������������������186
Indo-1�����������������������������������������������������������������179, 186 Forkhead box P3 (FOXP3)������������������������������ 322, 324–326, 333–335, 337–341, 343 Gβ-Galactosidase ������������������������������������� 387–388, 397–399 Gene expression����������������������������������1, 7, 13, 19–24, 41–43, 47, 50, 134, 142, 148–149, 283–293, 349, 410 Gene Expression Omnibus (GEO)������������������������19–24, 47 Gene ontology (GO)�����������������������������������58, 59, 70, 73, 76 Genes ��������������������������������1, 2, 15, 18, 41–43, 45–51, 54, 64, 69, 113, 134, 139, 174, 202, 205, 210, 225, 284, 321, 349, 377, 381, 409, 421, 425 Genetic risk prediction �������������������������������������������������25–38 Genome-wide association�����������������������������������������������2, 64 Genome-wide association study (GWAS) �������������� 2, 26, 31, 37, 64 Genomics��������������������������������� 2, 19, 44, 53, 54, 61, 69, 70, 72–74, 77, 140–143, 146–148, 284, 288, 292, 382, 385–386, 391, 392 G protein-coupled receptor (GPCR) �������������������������������356 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)�����������������������������������������������������������299 Growth factors �����������������������������������������178, 201, 225, 297, 300, 421
H
Heart ���������������������������������������� 3, 4, 35, 37, 63, 64, 117, 118, 127, 128, 131, 180, 183, 186, 362, 363, 365, 366, 382, 397, 398, 400, 422, 428, 430 High-performance liquid chromatography (HPLC)��������������������81–98, 118, 127–136, 164–168, 221, 223, 228, 229, 231, 233–235, 237–248 Human renal epithelial cell�����������������������������������������������151 Hybridization ���������������������������������������������������1, 2, 5–16, 44, 173, 174 Hydroethidine (HE)���������������������������������������������������������233
Hydrogen peroxide (H2O2) ����������������������������� 172, 220, 221, 225–226, 229, 230, 423, 426 2-Hydroxyethidium (2-E+OH) ����������������������� 221, 222, 229, 233, 238, 239, 245 11 β-Hydroxylase (CYP11B1) ���������������������������������139–150 Hypertension �����������������1, 2, 25, 26, 41–51, 61–67, 69, 72–78, 89, 102, 118, 139, 151, 152, 190, 201, 202, 213, 220, 271, 321, 356, 381, 382, 395, 409, 410, 421–431 Hypertrophy���������������������������������������������128, 202–204, 209, 219, 298, 412 Hypothalamus ����������������������������������������������������������118–119
I
Illumina��������������������������������������������������������������������������7, 49 Immune cells ��������������������������������������������321, 322, 325, 326, 328–335, 337, 338, 340–342, 344 Immunity adaptive�����������������������������������������������������������������������321 innate���������������������������������������������������������� 219, 297, 321 Immunoblot������������������������������������������������������������� 214, 215, 217, 350 Immunocytochemistry�������������������������������������� 172–174, 204 Immunofluorescence ��������������������������������151–161, 268, 298, 322, 340, 343, 350, 399 Immuno-precipitation ������������������������������ 132, 214–216, 268 Ingenuity pathway analysis (IPA)��������������������� 54, 56, 58, 66 In situ hybridization �������������������������������������������������173, 174 Intracellular calcium ���������������������������������������� 181–183, 185, 189, 253 In-vitro ��������������������������������� 5, 190, 201–210, 213–217, 234, 298, 308, 346, 349, 409, 411 In vitro kinase assay����������������������������������������������������������214 In-vivo������������������������������ 151, 152, 190, 213–217, 356–363, 409, 411, 421–431 Iodination����������������������������������90–91, 94, 97, 166–168, 170 Ion channels ����������������������������������������������������� 190, 191, 348
K
Kidney �������������������3, 4, 96, 99, 101, 110, 117, 122, 124, 127, 151–161, 219, 271, 382, 398, 400, 405, 410–418, 422 Kinase����������������������������������������201–210, 213–217, 421–431 Knock out mice inducible ����������������������������������������������������� 382, 383, 390
L
Lipid rafts�����������������������������������������������������������������251–268 Liquid chromatography (LC)���������������������������������������������63 Long non-coding RNAs (LncRNAs) ����������������������������������2 L-type calcium channel ����������������������������������������������������191 Lysis ��������������������������2, 55, 56, 128, 131, 215, 216, 223–227, 230, 237, 239, 241, 243, 244, 247, 248, 258, 260, 286, 323, 325, 328, 342, 391
M
Macrophages human�����������������������������������������������������������������311–319
M1 macrophages ������������������������������������������������298, 308
M2 macrophages ������������������������������������������������298, 308 murine ���������������������������������297, 298, 300–303, 306, 309 Magnetic beads������������������������������������������������� 141, 307, 321 Mass spectrometry (MS) ����������������������������������54, 57, 58, 62, 63, 65, 67, 73, 74, 118, 127–136 Membrane �����������������4, 92, 93, 102, 113, 118, 121, 122, 133, 152, 153, 156, 169, 176, 182, 185, 190, 191, 194–196, 199, 203, 208, 216, 217, 220, 222, 225, 228, 231, 233, 234, 236, 243–245, 247, 251–254, 256–261, 263, 264, 267, 268, 271, 279, 292, 301, 401, 422, 425, 426 Membrane-enriched fraction���������������������������� 243–244, 247 Messenger ribonucleic acid (mRNA) ���������������������� 2, 15, 70, 118, 128, 139, 149, 173, 174, 284, 285, 293, 382, 389–390, 402, 405 Metabolomics����������������������������������������53, 54, 61–67, 69, 70 Methyl-β-cyclodextrin (MβCD)�������������� 253, 254, 261–264 Microarray�����������������������������������������1–14, 17, 19–24, 41–51 Microdissection �������������������������346, 351, 389, 405, 411, 412 Microparticles������������������������������������������� 271–276, 278, 279 MicroRNA (miRNA)�������������� 2, 70, 205, 409, 411, 412, 416 Microvesicle����������������������������������������������������������������������271 Migration �����������������������������������������131, 201, 204, 210, 216, 219, 297, 353, 392 Monocytes����������������������������������������������������������������273, 297 Myosin light-chain phosphatase�������������������������������213, 214
N
NADPH oxidase (Nox)�������������220–231, 233–235, 237–248 Nano-liquid chromatography ���������������������������������������56–58 Natriuretic peptides
Atrial natriuretic factor (ANF)����������� 167, 170–173, 175
Atrial natriuretic peptide (ANP) ��������������������������������170
Brain natriuretic peptide (BNP)�������������������������174, 175
C Natriuretic peptide (CNP)���������������������� 163, 174, 175 Nitric oxide (NO)�������������������������������������220, 225, 231, 247, 297, 298, 346, 355, 356, 363, 369, 375 Norepinephrine ����������������������������������������������������������������220 Nox
Duox1/2 ���������������������������������������������������������������������219
Nox1�������������������������������������������������������������������219, 220
Nox2�������������������������������������������������������������������219, 220
Nox3���������������������������������������������������������������������������219
Nox4�������������������������������������������������������������������219, 220
Nox5���������������������������������������������������������������������������219 Nuclear calcium������������������������������������������������ 181, 183–185 Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy������������������������������������������������������62, 63 Nuclear receptor �������������������������������������������������������������������2
O
Oligomerization ���������������������������������������������������������������251 Oligonucleotide��������������������������������9, 13, 14, 135, 142, 174, 383–385, 391, 392, 394, 402, 404, 405, 409–418 Overexpression ������������������������������������������������ 118, 128, 130, 133–134, 220 Oxidants����������������������������������������������������������� 233–235, 237
P
Patch clamp������������������������������������������������������ 190, 192–193 Pathway analysis�����������������������������������������19, 54, 56, 58, 59, 66, 70, 72, 76 Pathway studio ������������������������������������������������������� 54, 56, 58 Peptide isolation �������������������������������������������������������164–165 Perivascular fat (PVAT)����������������������������������������������������382 Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARγ) ������������������43, 381–383, 385, 386, 388–406 Peroxynitrite ���������������������������������������������������������������������220 Pharmacology�������������������������������������������������������������������193 Phosphatidylserine ������������������������������������������� 271, 273–275 Phosphorylation ���������������������������������76, 202, 213, 214, 217, 253, 256, 421, 422, 426–427 Photobleaching������������������������������������������������� 178, 180, 181 Photo-oxidation ���������������������������������������������������������������230 Pioglitazone����������������������������������������������������������������������381 Plasma����������������������������������������62–64, 81, 82, 84–86, 89, 90, 102, 105–108, 113, 118, 163–165, 251–253, 261, 263, 267, 271–275, 277–279 Platelet-free plasma ������������������������������������������ 274, 275, 279 Polymerase chain reaction (PCR)���������������������� 7, 44, 46, 47, 139–149, 174, 175, 284, 286, 290, 293, 294, 384, 385, 391–393, 403, 404, 406, 422, 425 Post-translational modification ����������������������������������54, 252 Primer����������������������������������� 13, 46, 140–143, 146, 148–150, 175, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 384, 394, 404, 405, 422, 425 Principal component analysis (PCA)����������������������������42, 45 Proliferation assay�������������������������������������������������������������209 Prolyl oligopeptidase (POP)�����������������������������������������������82 Protease inhibitors�����������������������81, 102, 103, 128, 176, 225 Protein���������������������������������������� 42, 54, 62, 69, 84, 107, 117, 129, 164, 180, 203, 215, 219, 223, 225–231, 234, 251, 284, 349, 356, 382, 425 Protein-protein interaction�������������������������������������������������76 Proteome ���������������������������������������������������������� 53–58, 73–75 Proteomics������������������������������������������������������������� 53–59, 69, 70, 72–75, 77 Proximal tubule ����������������������������������������������� 101, 151–153, 155, 157
Q
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) ������������ 44, 142, 149, 383, 384, 402, 405, 406
R
Radioimmunoassay (RIA) ������������������������������� 81–93, 95, 97, 98, 164, 166–172
Rat
Spontaneously hypertensive rats���������������������������������152
Sprague Dawley rats ����������������������������������� 154, 202, 204
Wistar Kyoto rats �����������������������������������������������376, 377 Reactive oxygen species (ROS)������������������������ 220–231, 233, 245, 246, 298 Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) ������������������� 149, 284, 294 Receptors�������������������������������� 2, 97, 101, 127, 129–130, 133, 152, 153, 155, 158, 174, 178, 182, 191, 199, 201, 268, 298, 308, 332, 333, 336, 337, 343, 348, 350, 355, 356, 369, 372, 377, 382, 383, 403, 421 Renin�������������������������������������������������81–84, 86, 87, 127, 128 Renin-angiotensin system (RAS)���������������������� 81, 101, 117, 118, 127, 128, 369 Reporter genes�������������������������������������������������� 388–389, 395 Reporter mice������������ 383, 384, 386–387, 390, 391, 394–400 RhoA��������������������������������������������������������������������������������213 Rho-kinase
ROCK 1�������������������������������������������������������������213, 214
ROCK 2�������������������������������������������������������������213–217 Risk score ����������������������������������������������25–27, 29, 31, 32, 37 Rosiglitazone��������������������������������������������������������������������381 R-package��������������������������������������������������������� 28–29, 49, 65
S
Sep-Pak �������������������������������������83–86, 88–90, 164, 165, 168 Serum ����������������������������������9, 62, 83, 92, 105, 130, 134, 166, 169–173, 178, 179, 202, 203, 207, 208, 210, 225, 230, 245, 254, 263–265, 299, 301, 304–307, 325, 326, 346, 351, 405, 423, 426 Signal transduction������������������������������������������ 152, 201–210, 251, 421, 422 Smooth muscle myosin heavy chain ����������������� 382, 383, 403 Sodium nitroprusside (SNP) ����������������������������25, 26, 31, 37, 140–148, 356, 357, 362–364, 366 Staining ��������������������������������������6–13, 16, 135, 136, 152, 153, 155–156, 159–161, 184, 322, 327, 333, 337, 340, 343, 344, 387–389, 398, 399, 422, 424, 429–431 Statins�����������������������������������������������������������������������253, 264 Steroid������������������������������������������������������������������������61, 139 Supernatant ���������������������������������� 65, 87, 105, 122, 124, 131, 135, 144, 145, 164, 171, 172, 176, 194, 206, 209, 216, 227, 241–245, 248, 260, 274, 275, 288, 298, 300, 328, 330–333, 336–338, 347, 351, 352, 401, 425 Superoxide����������������������������������������220, 222, 228–229, 231, 233–235, 237–248 Superoxide dismutase ������������������������������� 220, 234, 241, 242 Surface antigens���������������������������������������� 271, 272, 275, 323 Systems biology������������������������������������������������������69, 72–78
T
Tamoxifen�����������382, 383, 386, 390, 394, 395, 398–403, 405 Tissue ��������������������������������������������� 3, 49, 54, 61, 69, 81, 101, 117, 127, 144, 151, 163–165, 192, 201, 213, 221, 223, 226–228, 234, 273, 283, 284, 286, 287, 290, 291, 297, 298, 302, 306, 307, 322, 346, 349, 359, 372, 382, 409, 424, 425, 428, 431 T-lymphocytes������������������������������������������������� 180, 273, 321, 322, 342 Transcriptomics ������������������������������������������������������������69, 70 Transgenic ��������������������������������������������������������������� 128, 382, 384, 410, 422 T-regulatory cells�����������������������������������������������������321–323, 329–341, 343 T-type calcium channel ����������������������������189, 190, 192–194, 196, 198, 199 Tyrosine kinase���������������������������������������������������������201, 421
U
Uninephrectomy����������������������������������������������� 152, 412–413
V
Vascular injury ������������������������������������������������������������������321 Vascular smooth muscle cells (VSMC)������������� 186, 189, 190, 192–194, 196, 198, 199, 201–205, 207–210, 214–216, 231, 256, 260, 261, 263, 264, 345, 346, 349–353, 422 Voltage����������������������������������������57, 144, 189–191, 196–198, 208, 276, 334, 338, 425 Voltage dependent calcium channel (VDCC)���������189–191, 194, 195, 199
W
Western blot ���������������������������������������77, 118, 176, 202, 203, 208–209, 216–217, 422–423, 425–426