MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE UNA FRACCIÓN ANTIGÉNICA DE 21 A 31 KDA DE LÍQUIDO DE QUISTE HIDATÍDICO DE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº22
M.SC. ELIZABETH LUZ SÁNCHEZ ROMANÍ BLGO. OMAR ALBERTO CÁCERES REY DR. CÉSAR GABRIEL NÁQUIRA VELARDE
[2004]
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE UNA FRACCIÓN ANTIGÉNICA DE 21 A 31 KDA DE LÍQUIDO DE QUISTE HIDATÍDICO DE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS
I.
Título : Aislamiento y purificación de una fracción antigénica de 21 a 31 kDa de líquido de quiste hidatídico de Echinococcus granulosus
II.
Autores: M.Sc. Elizabeth Luz Sánchez Romaní, Instituto Nacional de Salud Blgo. Omar Alberto Cáceres Rey, Instituto Nacional de Salud Dr. César Gabriel Náquira Velarde, Instituto Nacional de Salud CODIGIO OGITT: 2-01-05-02-030
III.
RESUMEN
Fracción antigénica de 21 a 31 kDa de líquido de quiste hidatídico de Echinococcus granulosus de ovino procedentes de Perú (LHL-O) detectadas por inmunoblot son específica para el diagnóstico de la hidatidosis humana en nuestra área endémica. Teniendo en cuenta la importancia de ésta fracción como alternativa mas específica para la detección del quiste hidatídico en pacientes infectados, nosotros purificamos estas proteínas mediante los métodos de precipitación con sulfato de amonio al 60% de saturación y ultrafiltración El aislamiento de la fraccion antigenica de 21 a 31 kDa fue realizada por electroelución en gel. Las proteínas antigénicas de la fracción 21 a 31 kDa fueron parcialmente purificadas por los métodos utilizados en el estudio. IV.
INTRODUCCIÓN
Echinococcus granulosus (Batsch, 1786) es un pequeño platelminto parásito que pertenece a la Clase Céstoda. Este parásito envuelve en su ciclo de vida dos hospedero mamíferos (8). La forma adulta de E. granulosus infecta un hospedero definitivo que siempre es un carnívoro (perro doméstico y otros cánidos). La forma larvaria o metacéstode desarrolla en el hospedero intermediario principalmente ungulados (ganado ovino, bovino, caprino y porcino). Los seres humanos adquieren la infección al ingerir accidentalmente huevos del parásito. El metacétode de E. granulosus es el agente etiológico de la forma quística de la enfermedad hidatídica, esta condición patológica es resultado del crecimiento de uno o mas quistes. El hígado y los pulmones son las localizaciones más comunes del desarrollo del quiste hidatídico. Los síntomas de esta enfermedad dependen del tamaño y localización del quiste. La hidatidosis es una enfermedad que tiene distribución mundial y está relacionada con la ganadería, infraestructura sanitaria deficiente, asociados generalmente a bajos niveles socio-económicos y a la ausencia o deficiente educación sanitaria. En Sud América la infección presenta una elevada incidencia en Argentina, Uruguay, Chile, Sur de Brasil y Perú. En Perú las zonas endémicas están situadas en los valles interandinos de la Sierra Central y Sierra Sur (Náquira, 1994), siendo los departamentos de Pasco, Huancavelica, Junín y Puno los más afectados. El diagnóstico de la hidatidosis está basada en la identificación de las estructuras del quiste por técnicas de proyección de imágenes (Ultrazonografía, Tomografía computarizada, radiografía entre otros) y de la confirmación por pruebas inmunodiagnósticas (8). El líquido de quiste hidatídico es el más utilizado como fuente de antígeno para el inmunodiagnóstico de la hidatidosis humana, sin embargo éste es una mezcla compleja de antígenos del parásito y componentes séricos del hospedero (Coltorti y
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Varela Diaz, 1972). La presencia de estos contaminantes en el líquido hidatídico han limitado su utilización para el diagnóstico específico de E. granulosus. Dos de estos antígenos inicialmente denominados antígeno 5 (Capron, 1967) y antígeno B o 4 (19,18) son inmunodominates en preparaciones antigénicas del parásito y tiene inmureactividad alta con sueros de pacientes hidatídicos. Estos dos antígenos son lipoproteínas grandes compuestos por subunidades pequeñas. Antígeno 4 de Chordi y Kagan o antígeno 5 de Capron en condiciones reducidas muestran dos bandas con masa rmolecular aproximada de 47 y 20 kDa y antígeno B tres bandas con masa molecular en el rango de 10 a 20 kDa. Una serie de antígenos fueron identificados y analizados en cuanto a especificidad en preparaciones de líquido hidatídico de diversos orígenes en inmunoblot , verificándose bandas con masas moleculares de 38 kDa; (12); 12, 16 y 20 kDa (15, 23, 1); 16 kDa,24 kDa (16) 40 kDa (22) ; 66 y 56 kDa (7) 8 kDa (14, 11, 17) 116 kDa (14,); 100, 130 kDa (2). En el Perú fueron identificadas bandas de 21 a 31 kDa con valor diagnóstico específico para la hidatidosis humana utilizando antígeno preparados a partir de líquido de quiste hidatídico de ovino procedentes de Perú y evaluados con sueros de pacientes en nuestro medio (Sánchez E.,1995). En los últimos años se han realizado esfuerzos importantes en la preparación de proteínas recombinates (12, 9, 10, 24) péptidos sintético (2, 3, 6,) o combinaciones de antígenos bien definidos que realzan la especificidad del diagnóstico de la enfermedad hidatídica, sin embargo el uso de recombinantes todavía muestra baja sensibilidad en el diagnostico en algunos casos. Por lo que la caracterización de antígenos nuevos, estandarización de técnicas y preparación de antígenos siguen siendo la tarea más importante a ser emprendido para mejorar el inmunodiagnótico de la hidatidosis humana. En este estudio nosotros purificamos y aislamos parcialmente la fracción antigénica de 21 a 31 kDa importante en nuestra región por ser altamente sensible y especifica para el diagnóstico seroinmunológica de la hidatidosis humana empleando antígenos de alta pureza y preparados a partir LHL-O de hospederos intermediarios de nuestra región endémicas con fines de desarrollar posteriormente Kits de diagnóstico que faciliten el diangnóstico de la enfermedad hidatídica. V.
OBJETIVOS GENERALES Purificar la fracción antigénica de 21 y 31 kDa a partir de líquido de quiste hidatídico de Echinococcus granulosus de ovino. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS Estandarizar el sistema de purificación de fracciones antigénicas del líquido de quiste hidatídico de Echinococcus granulosus de ovino. Estandarizar el sistema de aislamiento de fracciones antigénicas del líquido de quiste hidatídico de Echinococcus granulosus de ovino. VI.
METODOLOGÍA
Antígeno Líquido hidatídico (LH) fueron colectados de quiste de pulmones e hígado de ovinos infectados , procedentes de diferentes áreas endémicas del Perú. El pool del líquido fue centrifugado a 3,000 rpm por 30 minutos, el sobrenadante fue dializado en
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membrana de diálisis y agua destilada en volumen equivalente a 100 veces mayor al volumen de líquido hidatídico, finalmente este producto dializado fue liofilizado (LHL) y conservado a 4° C. Purificación de proteínas Precipitación con Sulfato de Amonio Líquido de quiste hidatídico liofilizado fue resuspendido en Buffer Tris/HCl 0,05M en volumen 100 veces menor al volumen inicial. (Vo: 25 mL- Vf: 250 L). Esta solución fue sometido a una precipitación con sulfato de amonio hasta llegar al 60% de saturación, se dejo agitando por una hora a 4ºC, luego la solución fue centrifugada a 10,000 rpm por 20 minutos. El sobrenadante (S) y precipitado (P) fueron dializados en buffer de Tris/HCl 0,05 M a 4° C por toda la noche. Finalmente las proteínas del S y P dializados fueron cuantificados por el método de Lowry. SDS-PAGE de las proteínas Las proteínas del sobrenadante y precipitado en cada paso de la purificación de las proteinas fueron analizadas por SDS-PAGE de acuerdo a la metodología descrita por Tsang et. al. (1986) en gel de separación de poliacrilamida al 15%. El gel de apilamiento fue de 4% . Antes de la electroforesis las proteínas fueron diluidas 1:2 con solución de tratamiento (0.125 M Tris –HCl, pH 6,8, conteniendo 5% de SDS y 2% 2-mercaptoethanol) y hervidas por 5 minutos. La electroforesis fue realizado a 30 mA por gel de corrida en un sistema de electroforesis Mini Protean II, Bio-Rad. Ultrafiltración de las Proteínas La proteínas del precipitado dializado del LHL fueron ultrafiltrados en un sistema cerrado de ultrafiltración (Stirred Ultrafiltration Cell, Millipore Amicon) empleando membrana de celulosa regenerada YM10 cuyo limite de corte es de10000 Da, con el objetivo de retener las proteínas mayores de 10000 Da por la membrana utilizada. La ultrafiltración de las proteínas fue realizada por 35 minutos a temperatura ambiente aplicando una presión de gas nitrógeno a 25 psi. Las proteínas ultrafiltrada así como el producto eluído también fueron analizados por SDS-PAGE. Aislamiento de las proteínas 21 a 31 kDa Para el aislamiento de las fracciones antigénicas de 21 a 31 Kda fue utilizada un sistema de electroelusión (Mini Whole Gel Elutor BIORAD) y se desarrolló de la siguiente manera: Primero se realizó una electroforesis SDS-PAGE de las proteína del LHL concentrada por ultrafiltración. Finalizada la electroforesis, el gel de poliacrilamida conteniendo las proteínas fue colocado en el sistema de electroelusion, en buffer Tris/Hepps pH 8.1 a 160 voltios por 30 minutos siguiendo las instrucciones del fabricante. 14 fracciones de aproximadamente 400μL electroeluidas del gel fueron colectadas y analizadas por electroforesis SDS-PAGE, teñidas con Plata según protocolo de Blums. VII.
RESULTADOS
SDS PAGE de proteínas del sobrenadante y precipitado de LHL luego de haber sido
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sometidas al sulfato de amonio al 60% de saturación y dializadas, muestran que la mayor cantidad de contenido protéico se encuentran en la fracción precipitada con relación al sobrenadate. Foto 1. La ultrafiltación de las proteínas mayores a 10000 Da del LHL purificadas con sulfato de amonio fueron concentradas y son visualizadas por SDS-PAGE. Foto 2. El aislamiento de las proteínas purificadas del LHL por electroelusión nos muestran que la fracción antigénica de 21 a 31 kDa se encuentra en la fracción 7 de la elusión del gel, resultados que muestra en la Foto 3 y 4.
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Foto 1. SDS-PAGE de LHL tratado con sulfato de amonio al 60% de saturación, teñido con Coomasie. Linea A:Patrón de Peso Molecular LHL, Linea B: LHL, Linea C: proteínas del sobrenadante, Linea D: proteínas del precipitado.
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Figura 2. Ultrafiltrado de proteínas mayores a 10000 Da, teñidos con Coomassie. Linea A: Patron de peso molecular, Line B: proteina ultrafiltrada, Linea C: proteínas eluidas por ultrafiltración, Linea D: proteinas sobrenadante LHL.
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Figura 3. SDS-PAGE de proteínas eluídas por Electroelusión teñidas con plata. Linea A:patrón de peso molecular, Linea B: frac.1, Linea C: frac.2, Linea D: frac.3, Linea E: frac.4, Linea F: frac.5, Linea G: frac.10, Linea H: frac.11
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Figura 4. SDS-PAGE de proteínas eluídas por Electroelusión teñidas con plata. Linea A:patrón de peso molecular, Linea B: frac.6, Linea C: frac.7, Linea D: frac.8, Linea E: frac.9, Linea F: frac.5, Linea G: frac.12, Linea H: frac.13,
VIII.
CONCLUSIONES
Se consiguió purificar y aislar parcialmente la fracción antigénica de 21 a 31 kDa de
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LHL-O mediante las técnicas de fraccionamiento con sulfato de Amonio al 60% de saturación , ultrafiltarción y electroelusión de proteínas a partir de líquido de quiste hidatídico liofilizado. IX.
RECOMENDACIONES:
Se recomienda continuar con el estudio dirigido al secuenciamiento de la fracción purificada y aislada (21 a 31 kDa) para la elaboración de antígenos recombinantes y producción de Kits de Diagnóstico. X.
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