Producción Ovina y Caprina • 1998 • XXIII: 399-402
DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO POR UNA TÉCNICA ELISA DE UN BROTE DE ASPERGILOSIS EN GANADO OVINO GARCÍA, M.E.; FERNÁNDEZ-GARAYZÁBAL, J.F.; LAS HERAS, A.; GUEDEJA-MARRÓN, J.; LÓPEZ, I. y BLANCO, J.L. Dpto Patología Animal I (Sanidad Animal). Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense. 28040 Madrid.
RESUMEN En el presente trabajo describimos el uso de una técnica ELISA indirecto para la determinación del nivel de IgG anti-Aspergillus en el suero de animales afectados de mamitis aspergilar, y su posible aplicación al diagnóstico de esta enfermedad. El rebaño se componía de un total de 96 animales. De ellos, 11 presentaron una mastitis clínica de curso agudo con lesiones específicas de mastitis aspergilar; estos 11 animales murieron, pudiendo obtener suero sólo de 5, todos ellos claramente positivos en el análisis por ELISA. Otros 5 animales presentaron un curso crónico de la enfermedad, todos positivos al ELISA, 2 evolucionando hacia la curación total y 3 con pérdida de la mama afectada. 16 animales del rebaño presentaron signos de mastitis crónica con lesiones no específicas de mastitis aspergilar; de ellos sólo 2 resultaron positivos al ELISA. El resto de los animales, 64, permanecieron asintomáticos, detectándose sólo 5 positivos al ELISA. En el seguimiento de los animales seropositivos, se detectó en sólo 3 semanas una disminución evidente del nivel de anticuerpos anti-Aspergillus en un animal de los afectados que presentó una curación clínica total, si bien manteniéndose todavía dentro del rango de suero positivo. En conclusión, se propone la utilización de la metodología ELISA descrita no sólo para el diagnóstico de este tipo de procesos, sino para el seguimiento de los brotes, permitiendo deducir, según los resultados obtenidos en los sucesivos controles efectuados, la evolución clínica del proceso. Palabras clave: aspergilosis, mastitis, ELISA, ovino.
INTRODUCCIÓN La mayoría de las mastitis micóticas descritas en la bibliografía se refieren a ganado bovino, siendo producidas principalmente por levaduras, y más concretamente aquéllas incluidas en los géneros Candida, Cryptococcus, y Trichosporon (Aalbaek et al., 1994). Las mamitis debidas a hongos filamentosos son mucho menos comunes, si bien es cierto que se han descrito, principalmente producidas por Aspergillus fumigatus (Hakogi et al., 1981; Ferreiro et al., 1980). Las mastitis micóticas se han asociado principalmente con la terapia antibiótica, especialmente cuando los fármacos están contaminados y se aplican vía intramamaria (Thompson et al., 1978). Diferentes factores se unen para la dificultad de
alcanzar un exacto diagnóstico. En primer lugar, el hecho de que los hongos del género Aspergillus sean ubicuos en el ambiente hace que sean considerados como contaminantes cuando se aislan de una muestra de leche (Hakogi et al., 1981); por otro lado, tanto los síntomas como las lesiones resultan ser inespecíficas. Todo ello hace que sean muy limitados los casos en que el aislamiento del hongo se ve acompañado del diagnóstico histopatológico, desarrollando un diagnóstico definitivo.
MATERIAL Y MÉTODOS Cepa fúngica: Utilizamos una cepa de A.fumigatus aislada de un proceso de aspergilosis nasal canina.
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Sueros: Utilizamos 2 tipos de sueros: * Sueros control: utilizamos un total de 20 sueros procedentes de animales clínicamente sanos mantenidos en una explotación sanitariamente controlada y sin ningún antecedente de enfermedad fúngica. * Sueros de animales sospechosos: De los 96 animales que componían el rebaño, se obtuvo suero de 90, mientras que los 6 restantes murieron antes que se pudiera efectuar la toma de sangre. Obtención de extracto antigénico de A.fumigatus: Preparamos extracto antigénico miceliar basándonos en el método previamente descrito por nosotros (García et al., 1997), que podemos resumir en: se cultiva el hongo en medio líquido sintético (caldo Czapeck-Dox suplementado con 1% Dextrosa) durante 96 horas en agitación a 37 C. Tras el período de incubación, se obtiene el micelio por filtración, se lava 3 veces con PBS, y se seca con ayuda de un papel de filtro. En este momento se procede a macerar completamente el micelio en un mortero, tras lo que el extracto se somete a sonicación. Se centrifuga a 10.000 rpm durante 30 minutos, se recoge el sobrenadante y se dializa frente a agua destilada. El contenido del tubo de diálisis se filtra a través de un filtro de 0’45 µm y se concentra mediante el sistema Ultrafree-15 (Millipore) con una membrana de un tamaño de exclusión de 10 kDa. El extracto antigénico así obtenido se somete a determinación proteíca según el procedimiento de Bradford. Metodología ELISA para el diagnóstico de aspergilosis ovina: Cada pocillo de la microplaca es tapizado con 100 µl del extracto antigénico de A.fumigatus en una concentración de proteínas de 5 µg/ml. Tras una incubación de 72h a 4 C, se lava la placa 3 veces con Buffer fosfato salino con 0’05% de Tween 20 (PBS-T), tras lo que se añaden 100µl de la solución bloqueante constituida por Albúmina Sérica Bovina al 3% en PBS; se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se lava de nuevo. Tras este paso, las placas pueden ser utilizadas o bien se pueden almacenar a -20 C para uso posterior. El siguiente paso es la adición de suero problema, 100µl en la dilución 1:5000. Se incuba 1 hora a 37 C, tras lo cual la placa es lavada de nuevo, y se adiciona el conjugado: 100µl de una dilución 1:10.000 de anti-IgG ovina conjugada con peroxidasa. Tras una nueva incubación de 1 hora a temperatura ambiente, se añaden 100µl de substra-
to, constituido por una solución de O-fenilendiamina, con incubación de 15 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. La reacción se detiene por la adición de 50µl de ácido sulfúrico 6N, procediendo a leer la Densidad Optica de los pocillos mediante un lector de ELISA a 492 nm.
RESULTADOS Estimación de la línea de corte: Los resultados obtenidos con los 20 sueros control fueron los siguientes, referidos a valores de Densidad Optica (DO) en ladilución 1/5000: Media (X) = 0’189 Desviación Típica (SD) = 0’104 X + 2SD = 0’397 X + 3SD = 0’501 Siguiendo los valores obtenidos, aplicamos los siguientes criterios diagnósticos: - Valor positivo: DO por encima de 0’5. - Valor dudoso: DO comprendida entre 0’4 y 0’5. - Valor negativo: DO por debajo de 0’4. Diagnóstico de aspergilosis ovina: De los 96 animales que componían el rebaño, se consideraron clínicamente afectados por el brote de mastitis aspergilar un total de 16 animales: 11 de ellos presentaron un curso agudo de la enfermedad, pudiéndose obtener suero sólo de 5 de estos animales. Todos ellos resultaron claramente positivos por ELISA, con valores de DO por encima de 0’9. Los 5 animales restantes presentaron un curso crónico de la enfermedad, también resultaron todos positivos al ELISA, con valores por encima de 0’6 en todos los casos, y con evolución hacia la curación total en 2 casos, y con pérdida de una mama en los otros 3. Del resto de los animales, podemos hacer una diferenciación en 2 grupos: * 16 presentaron signos de mastitis crónica con lesiones no específicas de mastitis aspergilar. En este caso sólo 2 animales resultaron positivos al ELISA. * Los otros 64 animales permanecieron asintomáticos, detectando sólo 5 positivos por ELISA. En una segunda toma de muestras, realizada 3 semanas después, se observó seroconversión en
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uno de los animales que había mostrado curación total en este periodo, pasando de un valor de DO de 1’1 a 0’6, todavía dentro del rango de la positividad, pero con una evidente disminución en un corto período de tiempo.
ban restringidas en todos los casos a las glándulas mamarias y ganglios linfáticos regionales. Por métodos inmunohistoquímicos (Inmunofluorescencia Indirecta) se diagnosticó una infección doble aspergilosis y zigomicosis. Estos autores aceptan la hipótesis de infección ascendente, que ellos relacionan con la aplicación de antibióticos antes del parto.
DISCUSIÓN
Para algunos autores (Jensen et al., 1996; Mandal y Gupta, 1993) el diagnóstico de las aspergilosis mamarias debe basarse en el aislamiento repetido del hongo acompañado siempre de demostración de hifas fúngicas en tejidos, acompañado de una reacción inflamatoria típica. Consideramos que esta opinión se verá modificada con la aplicación de la técnica descrita por nosotros, con lo que consideramos que una imagen clínica típica con aislamiento repetido del hongo y ELISA antiAspergillus positivo serían criterios suficientes para diagnóstico definitivo de la enfermedad, y simplemente la imagen clínica con ELISA positivo constituiría un diagnóstico muy probable.
La técnica inmunológica descrita permitió una valoración positiva de mastitis aspergilar en los 16 animales diagnosticados clínicamente (100%). Del resto del rebaño, sólo 7 resultaron positivos (9%), indicando la posibilidad de infección aspergilar activa, resuelta por las defensas inmunes del animal sin llegar a originar enfermedad. Por tanto, consideramos nuestra metodología como muy útil como ayuda al diagnóstico de estos procesos, incorporando las ventajas de rapidez, simpleza, economía, sensibilidad y especifidad. Debemos resaltar en este sentido, la poca utilidad del diagnóstico microbiológico por sí solo, pues al considerarse A.fumigatus como hongo ubicuo en la naturaleza, su aparición en la leche de los animales puede no estar relacionada con la enfermedad; y por otro lado, en casos de alteración puede no aislarse el hongo. Esta opinión nuestra es compartida por otros autores (Hakopi et al., 1981; Jensen et al., 1996). En cuanto al diagnóstico histopatológico, éste es plenamente efectivo, pues la detección de hifas fúngicas en la lesión es un signo inequívoco de mastitis micótica; la desventaja que tiene esta metodología es que normalmente se realiza postmortem. Por ello cobra mayor importancia el poder disponer de una metodología eficaz que sólo precise una simple toma de sangre. Existen pocas referencias bibliográficas dedicadas al tema de las mastitis en pequeños rumiantes. En nuestro país, Jensen et al. (1996) describen un brote de mastitis micótica en cabras por una etiología doble de aspergilosis y zigomicosis, en que el agente causal fue identificado por una técnica de imunofluorescencia indirecta tanto con anticuerpos policlonales de conejo como monoclonales murinos. Los síntomas comenzaban de uno a 3 días después del parto, resultando afectadas 27 cabras de un total de 73, todas las cuales habían recibido terramicina como profilaxis vía intramamaria antes del parto. Al no alcanzarse un diagnóstico por cultivo microbiológico, los animales fueron tratados con prednisolona y oxitetraciclina intramuscular, y con terramicina intramamaria. No se apreció mejoría, incrementando las lesiones, con lo que los animales afectados fueron sacrificados. Las lesiones queda-
En nuestro laboratorio hemos aplicado esta metodología principalmente al diagnóstico de las aspergilosis caninas (Blanco et al., 1997), si bien también hemos desarrollado metodologías para dermatofitosis caninas (Guedeja-Marrón et al., 1997) y aspergilosis bovina (datos no publicados).
CONCLUSIONES Proponemos la aplicación de una metodología ELISA para el diagnóstico de mastitis aspergilar ovina, en vista de las deficiencias que presentan el diagnóstico microbiológico e histopatológico. En estos momentos trabajamos en nuestro laboratorio en la puesta a punto de esta metodología de búsqueda de anticuerpos anti-Aspergillus en la leche de los animales, lo que todavía simplificaría más la técnica.
AGRADECIMIENTOS Nuestro agradecimiento más sincero al Dr. V.P.Kurup, del Medical College of Wisconsin, por sus enseñanzas en el campo de las aspergilosis y el inmunodiagnóstico, que supusieron el inicio de nuestros estudios en el campo de la Micología Clínica. El trabajo de D. Javier Guedeja-Marrón se desarrolla como beneficiario de una Beca Predoctoral de la Universidad Complutense de Madrid.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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