“CARACTERIZACIÓN MEDIANTE MARCADORES ITS, RCBL Y PSBMTRND Y SECUENCIACIÓN DE ESPECIES DEL GENERO POL

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

“Caracterización Mediante Marcadores ITS, rcbL y psbMtrnD y Secuenciación de especies del genero Polylepis spp. de Huaccoto, San Jerónimo - Cusco” TESIS PARA OPTAR AL TITULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO Presentada por: Bach: Marishani Marín Carrasco Asesor: M.Sc. Jorge Acuario Saavedra

Auspiciado por el Consejo de Investigación de la UNSAAC CUSCO-PERU 2017

Dedicatoria Jehová es mi pastor y nada me faltara En prados herbosos me hace recostar Me conduce por descansaderos donde abunda El agua, refresca mi alma.

Aunque ande en el valle de la sombra profunda No temo nada malo porque tú estás conmigo Jehová es mi pastor y nada me faltara. (Salmo 23)

AGRADECIMIENTOS La realización de esta tesis es mi mayor odisea anhelada en estos dos años de vida profesional, el cual no habría sido posible sin el apoyo de varias instituciones que me abrieron las puertas para que este trabajo llegue a su término. Por lo cual es un privilegio el poder utilizar este espacio para expresar mis más sinceros agradecimientos.

A la Universidad Nacional San Antonio Abad Del Cusco, por permitirme acrecentar mis conocimientos como persona y profesional, A la escuela profesional de Biología y a todos los docentes por haberme permitido acrecentar mi amor a la investigación.

A mi asesor M.Sc. Jorge Acurio Saavedra, por su apoyo, tiempo dedicado, paciencia brindada y por sus palabras de aliento en este camino tan batallado que atravesé para culminar la tesis.

Al Instituto de ADN Uchumayo-Arequipa, al Dr. Julio Cesar Bernabe y Dra.Jani Pacheco por darme la oportunidad de realizar mi tan anhelado trabajo es sus laboratorios, por la dureza de sus palabras que fueron la principal razón por la cual no se desistió en el culmen de la tesis.

Al M.Sc. Wilfredo Mendoza por su disposición de apoyo y facilidad que me brindo desde el inicio de la tesis.

A la Dra. Isabell Hensen directora del Instituto de Biología Y Geobotanica (Universidad Halle Wittenberg, Alemania) por su apoyo y correcciones necesitadas.

Al Vicerrectorado de Investigación por el apoyo económico brindado sin el cual no hubiera sido posible la realización de esta tesis.

A la M.Sc. Fructuosa de la Torre Mayorga por su apoyo permanente y sus palabras de aliento y al M.Sc. Héctor Condori por su soporte y apoyo en todo el proceso informático y por su paciencia.

A mis dictaminantes Mgt.Griselda Muñiz Duran y Blga. María Luisa Ochoa por tomarse el tiempo de entender este trabajo y brindarme opciones de mejora.

A mi familia mis padres, mis abuelos, tíos, primos por su apoyo en todo momento y su insistencia a que culmine la tesis.

A Alex mi shoshino por su paciencia, amor, compañía y apoyo brindado en este proceso tan arduo que fue culminar la tesis. A mis amigas Alelí y Mari por arriesgar sus vidas conmigo mientras realizábamos la colecta gracias a Paul Iturbe por facilitarme las herramientas que me ayudaron a absolver dudas.

INDICE Resumen ........................................................................................................................... 1 Introducción ...................................................................................................................... 2 Identificación del Problema .............................................................................................. 3 Justificación de la Investigación ....................................................................................... 4 Hipótesis ........................................................................................................................... 5 Objetivos de la Investigación ........................................................................................... 6 Objetivo general ............................................................................................................ 6 Objetivos específicos .................................................................................................... 6 CAPITULO I .................................................................................................................... 7 GENERALIDADES ......................................................................................................... 7 1.1.- Antecedentes ......................................................................................................... 7 1.2.- Marco Teórico ...................................................................................................... 8 1.2.1- El género Polylepis ......................................................................................... 8 1.2.2.- Distribución Geográfica de Polylepis ............................................................ 8 1.2.3.- Descripción Botánica ..................................................................................... 9 1.2.4.- Posición taxonómica .................................................................................... 10 1.2.5.- Polylepis incana. ......................................................................................... 10 1.2.6.- Polylepis microphylla. ................................................................................. 12 1.2.7.- Función ecológica ........................................................................................ 14 1.3 Marcadores Moleculares ....................................................................................... 15 1.3.1 Código de barras de ADN .............................................................................. 15 1.4 Caracterización Molecular .................................................................................... 19 1.4.1 Colecta del material vegetal ........................................................................... 19 1.4.2 Extracción de ADN ........................................................................................ 19 1.4.3 Electroforesis de ADN en geles de agarosa ................................................... 20 1.4.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR ................................................... 21 1.4.5 Secuenciación ................................................................................................. 22 1.5.- Bioinformática .................................................................................................... 22 1.5.1 Bioedit versión 7.0.0 ...................................................................................... 23 1.5.2.-DNAsp .......................................................................................................... 24 1.5.3 MEGA7 .......................................................................................................... 25 CAPITULO II ................................................................................................................. 26 AREA DE ESTUDIO ..................................................................................................... 26

2.1 Área de Estudio ..................................................................................................... 26 MATERIALES Y METODOS....................................................................................... 30 3.1 Materiales .............................................................................................................. 30 3.1.1 Biológico ........................................................................................................ 30 3.2.2 Campo ............................................................................................................ 31 3.2.3 Materiales de Laboratorio .............................................................................. 31 3.2.4 Laboratorio ..................................................................................................... 31 3.2.5 Reactivos de laboratorio ................................................................................. 32 3.2.- METODOLOGÍA ............................................................................................... 32 Colecta de material .......................................................................................... 34 Determinación morfología ............................................................................... 34 Extracción de ADN .......................................................................................... 35 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) .................................................. 36 Electroforesis y purificación de productos de PCR ......................................... 37 Secuenciación de productos de PCR ............................................................... 37 Análisis Bioinformático ................................................................................... 38 CAPITULO IV ............................................................................................................... 39 RESULTADOS Y DISCUCIONES ............................................................................... 39 4.1. Determinación Morfológica ................................................................................. 39 4.2.- Caracterización molecular .................................................................................. 39 4.2.1.- Análisis de secuencias amplificadas mediante cebador ITS ........................ 39 4.3.3.-Análisis de secuencias amplificadas mediante el primer pbsM- trnD ......... 66 CONCLUSIONES .......................................................................................................... 69 RECOMENDACIONES ................................................................................................ 70 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ................................................................................ 71

ÍNDICE DE FIGURA Figura 1: Distribución del genero Polylepis mediante MAXENT ................................... 8 Figura 2: Características morfológicas de Polylepis incana Humboldt, Bonpland & Kunth A) Rama; B) Envés de los foliolos; y C) Fruto, escala A) 2cm, B) 1cm C) 4 mm .................................................................................................................. 11 Figura 3: Distribución de la especie Polylepis incana esta especie se encuentra distribuida desde los 3000- 4200 m de altitud. ............................................................... 12 Figura 4: Características morfológicas de Polylepis microphylla (wedd) Bitter, A)Rama; B) haz de los Foliolos; C) Envés de los foliolos; D) Flor y E)fruto escalas A)2 cm, B)5mm, C)5mm, D)2mm, E)2mm. ................................................................................ 13 Figura 5: Distribución de la especie Polylepis microphylla está ubicada desde los 42004800 m de altitud para el sur del Perú sin embargo puede ubicarse a los 5200 m en Bolivia (Mendoza &Cano 2012). ................................................................................... 14 Figura 6: Regiones más utilizadas de código de barra genético de ADN en plantas ..... 16 Figura 7: esquema del genoma de cloroplasto................................................................ 17 Figura 8: Representación de los primers ITS1 y ITS4, tambien de los ITS espaciadores internos transcriptos, ETS espaciadores esternos transcriptos y IGS espaciadores intergénicos no transcritos.(Bla Alid et al 2013) ........................................................... 18 Figura 9: ventana básica del documento de alineación de BioEdit. ............................... 23 Figura 10: Ventana básica o menú principal del software.............................................. 24 Figura 11: ventana básica o menú principal del software. ............................................. 25 Figura 12: Geo referencia de quebrada temporal comunidad Huaccoto distrito de San Jerónimo. ........................................................................................................................ 27 Figura 13: colecta de ejemplares de Polylepis................................................................ 34 Figura 14 : alineamiento múltiple de las secuencias ...................................................... 40 Figura 15: composición nucleotídica .............................................................................. 41 Figura 16: Distancias genéticas calculadas mediante MEGA7 para las secuencias obtenidas mediante primer ITS agrupados en 3 grupos ................................................ 42 Figura 17: Distancias genéticas calculadas mediante MEGA7 para las secuencias obtenidas mediante primer ITS en un solo grupo ........................................................... 43 Figura 18: Análisis con Blast para plant1_ITS1-F TRIM QUALITY: 20 ..................... 43 Figura 19: alineamiento y emparejamiento de secuencias para plant1_ITS1-F TRIM QUALITY: 20 ................................................................................................................ 44 Figura 20Analisis con Blast para plant2_ITS1-F TRIM QUALITY: 20 ....................... 45 Figura 21: alineamiento y emparejamiento de secuencias para plant2_ITS1-F TRIM QUALITY: 20 ................................................................................................................ 45 Figura 22: Análisis con Blast para >plant3_ITS1-F TRIM QUALITY: 20 ................... 46 Figura 23: Alineamiento y emparejamiento de secuencias >plant3_ITS1-F TRIM QUALITY: 20 ................................................................................................................ 46 FIGURA 24:Analisis con blast para >PLANT4_ITS1-F TRIM QUALITY:20 ........... 47 Figura 25:Alinemiento y emparejamiento de secuencias plant4_ITS1-F TRIM .......... 47 Figura 26: Figura 26:Alineamiento múltiple de las secuencias amplificadas mediante el primer rcbL .................................................................................................................... 49 Figura 27:Analisis con Blast para >plant1_rbclTRIM QUALITY: 20 .......................... 50 Figura 28: alineamiento y emparejamiento de secuencia >plant1_rbcl TRIM QUALITY: 20 ................................................................................................................ 51

Figura 29: Análisis con Blast para >plant2_rbclTRIM QUALITY: 20 ......................... 52 Figura 30: alineamiento y emparejamiento de secuencia >plant2_rbclTRIM QUALITY: 20 .................................................................................................................................... 52 Figura 31: Análisis con Blast para >plant3_rbcl TRIM QUALITY: 20 ........................ 53 Figura 32: alineamiento y emparejamiento de secuencia >plant3_rbclTRIM QUALITY: 20 .................................................................................................................................... 54 Figura 33: Análisis con Blast >plant4_rbcl TRIM QUALITY: 20 ................................ 55 Figura 34: Análisis con Blast >plant4_rbcl TRIM QUALITY: 20 ................................ 55 Figura 35: Análisis con Blast >plant5_rbclTRIM QUALITY: 20 ................................. 56 Figura 36:alinemiento y emparejamiento de secuencia >plant5_rbcl TRIM QUALITY: 20 .................................................................................................................................... 57 Figura 37: Análisis con Blast >plant6_rbclTRIM QUALITY: 20 ................................. 58 Figura 38: Alineamiento y emparejamiento de secuencia >plant6_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20 ................................................................................................................ 58 Figura 39: Análisis con Blast >plant7_rbcl TRIM QUALITY: 20 ................................ 59 Figura 40: alineamiento y emparejamiento secuencia >plant7_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20 ................................................................................................................ 59 Figura 41:Análisis con Blast >plant8_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20 ........................... 60 Figura 42: Alineamiento y emparejamiento secuencia >plant8_rbclTRIM QUALITY: 20 .................................................................................................................................... 61 Figura 43:: Análisis con Blast>plant9_rbcl TRIM QUALITY: 20 ................................ 61 Figura 44:Alineamiento y emparejamiento secuencia>plant9_rbclTRIM QUALITY: 20 ........................................................................................................................................ 62 Figura 45: Análisis con Blast >plant10_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20 ........................ 63 Figura 46:Alineamiento y emparejamiento secuencia >plant10_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20 ................................................................................................................ 63 Figura 47:: Análisis con Blast plant11_rbcL TRIM QUALITY: 20 .............................. 64 Figura 48:: Alineamiento y emparejamiento secuencia >plant11_rbcL TRIM QUALITY: 20 ................................................................................................................ 64 Figura 49:análisis con Blast >plant12_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20 .......................... 65 Figura 50: alineamiento y emparejamiento secuencia >plant12_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20 ................................................................................................................ 66 Figura 51:Alineamiento múltiple de las secuencias amplificadas mediante el primer psbM-trnD ...................................................................................................................... 67 Figura 52: Análisis con Blast las secuencias plant2, plant6 y plant7 amplificadas mediante el primer pbsM- trnD ...................................................................................... 68

INDICE DE TABLAS Tabla 1:Clima del distrito de San Jerónimo ................................................................................ 26 Tabla 2:Temperatura del Distrito de San Jerónimo..................................................................... 27 Tabla 3: Flora presente en el área de estudio ............................................................................. 28 Tabla 4:Fauna presente en el área de estudio. ............................................................................ 29 Tabla 5:Material biológico colectado .......................................................................................... 30 Tabla 6:kit de cebadores utilizados ............................................................................................. 36 Tabla 7 :composición de Platinum Blue PCR Supermix High Fidelity. ..................................... 37

Resumen En la actualidad, los boques de Polylepis están disminuyendo principalmente por la acción antropogénica y por las malas políticas de conservación las cuales se realizaron por desconocimiento de la genética de Polylepis. Por ello se seleccionó a la comunidad de Huaccoto, que presenta el ultimo parche de Polylepis microphylla reportado para la región Cusco como zona estratégica de estudio.

Primeramente, las colectas se realizaron en la comunidad de Huaccoto- San Jerónimo; en los meses de marzo, abril, mayo, junio del 2015 y 2016 respectivamente, colectando un total de 24 muestras. Se realizó la determinación morfológica bajo los criterios propuestos en el libro “El género Polylepis en el Perú” encontrándose las especies de Polylepis microphylla y Polylepis incana para la zona de estudio. Para el tratamiento molecular se utilizaron marcadores del tipo código genético de barras (ITS, rcbL y psbM-trnD) los cuales fueron escogidos por su alta afinidad y buenos resultados para plantas, la experimentación se realizó en las instalaciones del Instituto de ADN UchumayoArequipa.

Polylepis resultó ser un género muy complicado de trabajar por lo que la extracción de ADN y PCR se realizaron con kits comerciales de alta fidelidad. Se realizaron modificaciones al protocolo a fin de cumplir con los objetivos planteados. Las secuenciaciones fue realizada por la empresa Functional Biosciences USA por el método sanger acoplado a Big Dye terminator v3.1 y corridos en un secuenciador ABI 3770xl.

Se observó que todas las muestras amplificadas por el cebador ITS, el genoma de la planta fue enmascarado por el genoma de hongos endófiticos del genero Capnocheirides sp. y Mycosphaerellaceae.

Mientras que las muestras amplificadas por el cebador rcbL mostraron que Polylepis a la tribu Sanguisorbinae ya que este cebador muestra alta fidelidad hasta esta categoría.

No obstante, el análisis informático también dio a conocer a que especies pertenecían las muestras, para reforzar este resultado se utilizó el complejo cebador psbM-trnD que brindo mayor especificidad y fidelidad a nivel de especie permitiendo identificar las siguientes especies: Polylepis sp, Polylepis australis, Polylepis reticulata.

Para los tres casos anteriormente mencionados se realizó el análisis respectivo con el software MEGA7; realizándose el alineamiento múltiple y la construcción de árboles filogenéticos mediante el método Neighbor joinning-boostrap adicionalmente se realizó un Blast-n para la comparación respectiva de las secuencias del GenBank- NCBI, limitando los resultados la no existencia de secuencias suficientes en la base de datos del GenBank para este género, debido a que Polylepis no es un grupo muy estudiado genéticamente por lo complicado que es encontrar el método adecuado para su secuenciación.

Introducción La familia Rosaceae comprende alrededor de 100 géneros y 300 especies con una distribución casi cosmopolita (Romelorux 1996). La tribu Sanguisorbinae presenta 14 géneros de gran interés biogeográfico, porque están distribuidos casi en todos los continentes; el centro principal de diversificación se encuentra en el hemisferio sur, donde el género Polylepis es el más representativo (Pérez De Paz 2004).

Cada vez más vulnerables, los bosques de Polylepis son un ecosistema andino importante para la protección de la biodiversidad. Dentro de esta riqueza biológica, los bosques de Polylepis representan la vegetación natural de gran parte de los andes peruanos (Pérez De Paz 2004). En largo plazo mantener la variabilidad evolutiva de las especies y así maximizar las posibilidades de supervivencia en un entorno cambiante, es valiosa información para la formulación de políticas de conservación. Se ha demostrado que en los andes Polylepis es considerado como un recurso maderable porque provee carbón de buena calidad (Pérez De Paz 2004). Para determinar morfológicamente especies del genero Polylepis existen varios criterios, los cuales se contradicen entre si ya que esta clasificación está basada en la cantidad de foliolos, los cuales no siempre permiten realizar un buen trabajo de identificación también depende del estado de conservación de la muestra, los cuales no siempre son óptimos (Herberg 1964).

Las diferencias a nivel bioquímico son clave para caracterizar a las especies, pero los basados en el ADN son la mejor alternativa ya que no son afectados considerablemente por el ambiente y no varían con la edad de la planta (Raya, 2013). Se a aplicado marcadores moleculares que permitan identificar características específicas de cada especie y permiten definir relaciones genéticas entre especies. Los marcadores moleculares de ADN permiten caracterizar: la naturaleza, amplitud y distribución de la diversidad genética de especies forestales, por lo que facilitan la toma de decisiones sobre qué y cómo conservar. Con los avances en la biología molecular, los botánicos usan técnicas nuevas que facilitan la clasificación de las especies basándose en el ADN de las plantas. (Raya, 2013).

Las herramientas bioinformáticas disponibles en el NCBI (National Center for Biotechnology Information) y MEGA7, son importantes para analizar y comparar secuencias. Este análisis nos permite obtener información acerca de su relación con otras especies y su ubicación taxonómica.

En este trabajo de investigación se buscó caracterizar molecularmente especies del genero Polylepis que se colectaron en la comunidad de Huaccoto- San Jerónimo, Cusco ya que en esta zona se puede observar como los parches de Queuñas han ido desapareciendo por la acción antropogénica. Las cuales se determinaron morfológicamente todo ello se realizó mediante convenios profesionales y la parte experimental se realizó en el Instituto de ADN Uchumayo- Arequipa y la empresa Functional Biosciences USA.

Identificación del Problema

La identificación de especies del género Polylepis con descriptores morfológicos no son muy precisos porque toman en consideración el número de foliolos de la planta o el estado de la muestra y estos están basados en criterios que a su vez difieren para cada autor. Por otro lado, muchos marcadores moleculares conocidos y empleados en procesos de identificación nos son compatibles con los métodos de secuenciación existentes en el mercado los cual varían de acuerdo al tipo de muestra con la cual se elegido trabajar.

Las herramientas informáticas disponibles online, que permiten la identificación de especies basadas sus secuencias de ADN, demandan que el uso de marcadores moleculares sean los más específicos posibles para la muestra problema, el cual no estaba establecido para este género ya que este trabajo es la primero en su tipo, anteriormente no se realizó ningún estudio a nivel molecular completo para este género.

Justificación de la Investigación Los bosques de Polylepis comúnmente conocidos como “Queuñal” en la cordillera del Vilcanota, son ecosistemas únicos con una fauna y flora única y con altos niveles de endemismo. Desafortunadamente estos bosques también representan uno de los hábitats más vulnerables de los altos andes por la fuerte presión antropogénica existente, ya que es considerado como un buen recurso maderable (Grace,2002).

Los marcadores moleculares son una herramienta que tiene la ventaja de darnos a conocer polimorfismos, posición de las bases nitrogenadas y comprender su función, así como las distancias genéticas que hay entre especies por lo que trabajar con marcadores moleculares adecuados para la muestra problema nos brindan mejores resultados.

Los marcadores código de barras genético (ADN barcode) son de muy buen desempeño por su alta fidelidad molecular en plantas. Polylepis es un grupo en el cual no todas las especies tienen el mismo número de cromosomas considerando ello los cebadores del tipo código de barras genéticos tienen segmentos específicos que permiten la amplificación de las muestras problema. Combinado ello con un adecuado método de secuenciación y una base de datos adecuada se logra identificar especies problema.

Hipótesis Los marcadores moleculares y métodos de secuenciación permiten la determinación de especies del genero Polylepis.

Objetivos de la Investigación Objetivo general  Caracterizar mediante marcadores (ITS, rcbL y psbM-trnD) y secuenciar especies del genero Polylepis en la comunidad de Huaccoto San Jerónimo.

Objetivos específicos  Determinar las especies del genero Polylepis mediante clave de identificación taxonómica.  Amplificar ADN de Polylepis mediante marcadores moleculares código de barras genético (ITS, rcbL y psbM-trnD).  Secuenciar y analizar informáticamente los productos de la amplificación.

CAPITULO I GENERALIDADES

1.1.- Antecedentes .

Asociación Ecosistemas Andinos- ECOAN (2005). - Evaluaron la biodiversidad de los bosques de Polylepis del corredor de Conchucos – Huaraz evaluando 13 bosques en época de lluvias identificando cuatro especies Polylepis weberbaueri, Polylepis serícea, Polylepis incana.

Hensen (2012). - Considera que los bosques de Polylepis representan uno de los ecosistemas más amenazados en los andes.

Koepcke & et al (2002). - Consideran que existe un gran interés ecológico, sistemático y biogeográfico por el género Polylepis, porque representa un sistema biológico único en los andes.

Mendoza (2005). - Describió una nueva especie en la cordillera del Vilcanota Polylepis sp1 (Boyle 2001).

Weberbahuer & et al (1945) .- consideran la cordillera del Vilcanota con los mayores fragmentos de bosques de Polylepis los cuales se hallan comprendidos entre los 3600y 4500m de altura, usualmente rodeados de formaciones morrenas desprendidas de las laderas orientales de los andes. La naturaleza fragmentada de estos bosques ha sido atribuida la especificad en condiciones fisiológicas y microclimáticas.

Zutta & et al (2012). - Consideran que los bosques de Polylepis son recursos vitales para la conservación de la biodiversidad y funciones hidrológicas la cual se verán alteradas por el cambio climático, desarrollaron y analizaron modelos de distribución de las especies Polylepis serícea y P.besseri usando el software MAXENT.

1.2.- Marco Teórico 1.2.1- El género Polylepis El nombre Polylepis deriva de las palabras griegas poly (muchas) y lepis (capas) refiriéndose a varias capas de ritidomas que posee el tallo (Kessler 2006) El género Polylepis pertenece a la tribu Sanguisorbeae, que se caracteriza por su receptáculo urceolado. En Perú existen 27 especies de Polylepis la mayor concentración de estos parches se encuentran en Huaraz – Cusco la mayor diversidad se estima en Cusco con 10 especies (Mendoza y Cano, 2011).Estas agrupaciones se conocen como Queñual que deriva de las voces quechuas qéñe que significa torcido y wiñay en referencia al crecimiento.

1.2.2.- Distribución Geográfica de Polylepis Los bosques de Polylepis en el Perú son extensos a lo largo de los andes. El estudio mediante la herramienta MAXENT, el cual predice el clima y capas ambientales en una resolución de 1km se posibilita utilizando datos de satélites que brindan la ayuda para definir las áreas de diversidad y mejorar las estrategias de conservación de los andes.

Figura 1: Distribución del genero Polylepis mediante MAXENT

Fuente: Zutta et al 2012

1.2.3.- Descripción Botánica La corteza de Polylepis consiste en numerosas capas finas de hojas de corteza que se exfolian, todas estas capas pueden tener alrededor de una pulgada de grosor. Aparentemente, esta corteza sirve como aislamiento de las heladas nocturnas y la inmensa radiación diurna. Debido al medio en que se desarrollan los arboles tienden a ser torcidos y contorneados, los que normalmente se asocia al viento, frio y los hábitats áridos. Dentro de los patrones de ramificación su crecimiento es simpodial (Hedberg 1964).

Todas las especies de Polylepis tiene hojas compuestas, imparipinadas (uno a nueve pares) y alternadas, las hojas se aglomeran en los extremos de las ramas y nacen de una manera alternada, cada hoja tiene un par de estipulas fusionadas alrededor de la rama formando una envoltura. La aglomeración resulta en un patrón de amontonamiento y conos invertidos debido al solapamiento de las estipula, Las hojas jóvenes y las estipulas tienden a ser más pubescentes que las hojas maduras, debido a que las inflorescencias nacen en las axilas de las hojas y las hojas jóvenes son particularmente más sensibles al frio, esta densa pubescencia puede servir para aislar los tejidos sensitivos (Simpson 1979).

Dentro de este género existen dos tricomas: primero capilli resiniferi incluye la mayoría de tricomas multicelulares y aparentemente contiene o secretan resina, la cual produce un material rojo o anaranjado. Segundo capilli pili son unicelulares o con dos células basales cuya forma varia; pueden ser cortos o largos (lanosos, ásperos o suaves), formando un anillo junto con las estipulas alrededor de las ramas (Hedberg 1964), La cobertura en el envés y a veces en el haz de los folios es muy específica en cada especie, aunque la densidad de tricomas lo cual puede variar frecuentemente dentro de las especies. Las especies de todo el complejo incana tienen tricomas pequeños y glandulares, los cuales secretan una resina amarillenta que se dispersa en todas sus superficies (Simpson 1979).

Las flores de todas las especies del género nacen de inflorescencias, en la mayoría de los casos la inflorescencia es lo suficiente larga para permanecer colgada. En especies con inflorescencias colgantes, las flores nacen regularmente a lo largo del raquis. Algunos racimos de flores presentan una reducción de la inflorescencia, que resulta de la selección a las condiciones extremas en estas elevaciones. Las flores en sí misma, están reducidas y esto se relaciona estrechamente con la polinización la cual es llevada a cabo por el viento ya que está demostrado que especies con inflorescencia reducida normalmente crecen en áreas muy ventosas. La reducción ha dado lugar, a la ausencia de pétalos, sépalos verdes en lugar de sépalos coloreados, ausencia de perfume y néctar numerosas anteras con largos filamentos, polen abundante y seco un estigma largo y fibrilado con hojas compuestas. La reducción puede representar un compromiso entre: la sobrexponían a las células de polen materno vulnerables y las adaptaciones a la polinización anemófila (Simpson 1979; Whiltehead 1969).

Los caracteres taxonómicos más importantes para distinguir entre especies de Polylepis están dados por las hojas y sus folios. Entre estos caracteres tenemos el número de folios, la forma del borde, el tamaño, el tipo de ápice, el aspecto de la base y la cobertura. Sin embargo, los caracteres de los folios son frecuentemente

correlacionados con otros, como el largo de inflorescencia y tipos de protuberancias en los frutos. Además, varios taxones difieren de uno a otro en el tipo y cantidades de tricomas que cubren los raquis. Los raquis pueden ser tomentosos, vellosos, lanosos, sericeosos, pilosos o granulares (Romelourox 1996; Simpson 1979).

1.2.4.- Posición taxonómica Según APG II el género Polylepis presenta la siguiente posición taxonómica: Reino: Plantae Subreino: Embryobionta División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Rosales Familia: Rosaceae Género: Polylepis 1.2.5.- Polylepis incana. Árbol de 5- 14 m de alto; ritidoma de los troncos rojizo. Vaina estipular con la superficie exterior glabrescente ligeramente villoso hacia el ápice, con tricomas glandulares que exudan resina. Hojas agrupadas en el extremo de las ramas; peciolo 0.4-1 cm parte basal interna hacia el ápice villoso; hojas 1.9-6.4 x 1.4-3,9 cm, con un par de folios; raquis con pequeños tricomas espiralados, mesclados con algunos tricomas glandulares que exudan resina, punto de unión de los folios con pequeños tricomas fasciculados, largos, rizados; foliolos ovados,(0.5)-1.2-4.0 x 0.4-1.4 cm, base atenuada, ápice obtuso, ligeramente emarginado, margen crenado, haz glabro, envés cubierto por tricomas pequeños retorcidos que secretan resina (dan aspecto pulverulento) y pueden estar mesclados con tricomas largos unicelulares. Racimo simple,2-7 cm de largo, con 3-10 flores; bráctea floral lanceolada de 3mm de largo, superficie exterior glabro o ligeramente piloso. Flor de 0.3-0.7 cm de diámetro; sépalos 3(4) ovados, interior con pequeños tricomas glandulares, ligueramente pilosos principalmente en el ápice, exterior glabro; estambres 8-24, anteras orbiculares, base del estilo villoso.

Hipantio del fruto 0.2- 0.5 x 0.2- 0.7 cm, incluyendo protuberancias turbinado a fusiforme, irregularmente surcado con alas puntiagudas (Mendoza & Cano 2012)

Figura 2: Características morfológicas de Polylepis incana Humboldt, Bonpland & Kunth A) Rama; B) Envés de los foliolos; y C) Fruto, escala A) 2cm, B) 1cm C) 4 m

Fuente: Mendoza & Cano 2012

Figura 3: Distribución de la especie Polylepis incana esta especie se encuentra distribuida desde los 3000- 4200 m de altitud.

Fuente: Mendoza & Cano 2012 1.2.6.- Polylepis microphylla.

Arbusto o arbolillo de 1.5-4 m de alto; ritidoma de los troncos marón rojizo, vaina espuelas escaso a densamente villosos, mezclados con pequeñas tricomas multicelulares rojizas. Hoja congestionada en el extremo de las ramas; peciolo 0.5-4 cm de largo densamente villoso; hojas1-2.7x0.2-1.2 cm, con 3-6 pares de foliolos, raquis densamente villoso, rojizo, punto de unión de los foliolos villosos formando un anillo mezclado con tricomas glandulares multicelulares rojos; foliolos oblongos a ligeramente obovados,0.3-0.7x0.6-1.3cm; base desigualmente cordado, ápice profundamente bilobado, margen entero revoluto, envés densamente villoso frecuentemente mezclado con tricomas glandulares rojos, haz ligeramente villoso en la depresión de la nervadura media. Racimo simple, 0.4-3.5cm de largo, con 2-5 flores,bráctea floral 5-6mm,villoso.Flor 46mm de diámetro, sépalos 4 ovados interior y exterior lanoso, antera 1-2mm de largo lanoso, estilo fimbriado de 3-4mm,con un mechón de pelos villosos en la base. Hipantio en fruto 3-5x 2-4.5 mm incluyendo espinas, subgloboso, villoso con espinas aplanadas. (Mendoza &Cano 2012)

Figura 4: Características morfológicas de Polylepis microphylla (wedd) Bitter, A)Rama; B) haz de los Foliolos; C) Envés de los foliolos; D) Flor y E)fruto escalas A)2 cm, B)5mm, C)5mm, D)2mm, E)2mm.

Fuente: Mendoza & Cano 2012

Figura 5: Distribución de la especie Polylepis microphylla está ubicada desde los 4200-4800 m de altitud para el sur del Perú sin embargo puede ubicarse a los 5200 m en Bolivia (Mendoza &Cano 2012).

Fuente: Mendoza & Cano 2012 1.2.7.- Función ecológica Los parches o bosques de Polylepis cumplen una importante función ecológica como oasis biológicos en las monótonas pasturas de los páramos, debido a que los bosques detienen la escorrentía en la vegetación y tienen la capacidad de liberar el agua gradualmente, dejándola filtrar dentro del suelo (Hamilton,1987; Smiet,1987). En las regiones áridas la vegetación puede consumir más agua de la almacenada y así reducir el agua que está disponible, pero en regiones con bosques nublados el efecto esponja es positivo. Hay una relación directa entre la presencia de bosques y el abastecimiento de agua de buena calidad. El agua de lluvia se filtra a través del suelo orgánico del bosque, donde muchas impurezas son retenidas y los componentes orgánicos son usualmente degradados por microrganismos. Así, el manantial o la corriente debajo del bosque tiene agua pura libre de sedimentos y potable (Cevallos;1997& Fjedsa et al, 2004)

Mediante el almacenamiento y la detención de la escorrentía, los bosques reducen los picos de flujo de que otro modo causaría problemas rio abajo. El agua adicional en el invierno pocas veces puede ser utilizada, pero puede lavar suelos de las tierras cultivadas.

Gran parte de los Andes tiene un alto riesgo de erosión del suelo, lo cual ha reducido fuertemente la productividad del área. La erosión es especialmente severa en áreas con fluctuaciones definidas entre época seca y lluviosa done al final de la época seca el suelo queda expuesto a lluvias torrenciales (Morgan, 1986) del invierno, que arrastran consigo la capa orgánica del suelo.

La zona ecológica donde crece Polylepis se caracteriza por una radiación solar extrema durante el día y las heladas regulares por las noches. Sim embargo, el dosel del bosque retiene la radiación nocturna proveniente del suelo y así el interior de los parches retiene la radiación nocturna proveniente del suelo así los bosques están libres de las heladas. Esto demuestra la abundancia de hierbas dentro de los bosques encontrando hasta plantas comestibles y medicinales. También, el clima del bosque permite la práctica de agroforestería como algunos tubérculos por encima de los 4000msnm.Ademas en épocas de nevada las aves habitan estos bosques alto andinos y la presencia de mamíferos menores es marcada.

1.3 Marcadores Moleculares Un marcador molecular es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen y cuya herencia mendeliana se puede rastrear permitiendo conocer la información genética.(Picca et al 2002).

Además, los marcadores moleculares identifican polimorfismos presentes en el genoma de las especies. Las propiedades deseables para los marcadores moleculares de ADN se basan en .(Picca et al 2002): ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓

Alta naturaleza polimórfica Co-dominante No influenciable por el medio ambiente De rápida identificación De simple análisis Alta reproductibilidad

Varios tipos de marcadores moleculares han sido utilizados para evaluar los polimorfismos de ADN y se los clasifica como marcadores basados en hibridación y/o basados en la PCR. 1.3.1 Código de barras de ADN Código de barras de ADN que se refiere a las etiquetas UPC que se encuentran en productos comerciales, los códigos de barras de ADN consisten en una secuencia corta estandarizada de ADN entre 400 y 800 pb de largo que, en teoría, puede ser fácilmente aislada y caracterizada para todas las especies del planeta. Código de barras de ADN ensu definición más simple, es una o más secuencias de genes cortas tomadas de una porción estandarizada del uso del genoma para identificar especies. El concepto de un segmento universalmente recuperable de ADN que se puede aplicar como un marcador de identificación a través se aplicó inicialmente a los animales. Después de varias

proyecciones amplias de regiones genéticas en el genoma de la planta, tres regiones de genes plástidos (rbcl, matk y trnH-psbA) y una nuclear (ITS) se han convertido en el código de barras estándar de elección en la mayoría de las aplicaciones para plantas y hongos.

Como una herramienta de descubrimiento de la biodiversidad, el código de barras ayuda a señalar especies que son potencialmente nuevas para la ciencia, Especialmente especies no descritas y crípticas. Código de barras de ADN están siendo usados para abordar cuestiones ecológicas y evolutivas fundamentales, tales como la forma en que se agrupan las comunidades de plantas de especies y el grado de especialización en herbívoros tropicales frente a zonas templadas. El proceso de código de barras de ADN implica dos pasos básicos: ✓ Construyen la biblioteca de códigos de barras de especies conocidas. ✓ Emparejan o asignan la secuencia de código de barras de la muestra desconocida contra la biblioteca de códigos de barras para su identificación 1.3.1.1.-rcbL Por su mayor característica de la subunidad ribulosa-1,5-bifostato carboxilasa oxidasa despierta el interés de ingenieros genéticos y filogenetistas de plantas por ser un gen codificante de una proteína altamente conservada o rbcL o sitio activo que es el responsable por casi toda la fijación de carbono en la tierra (Kellogg & Nickolas,1997).

Este gen localizado en la región Large Simgle Copy del cloroplasto con aproximadamente 1,430 pb presenta una tasa de evolución lenta y bastante conservada, presentando buena respuesta para niveles taxonómicos más elevados como familia (fig.

6).

Rubisco es una enzima fotosintética muy importante, rbcL fue el primer gen de planta secuenciado (Zuawski et al, 1981). Este gen ha sido utilizado ampliamente en estudios filogenético de plantas con más de 10000 secuencias de rbcL disponibles en el GenBank (Chase et al, 2007).

Figura 6: Regiones más utilizadas de código de barra genético de ADN en plantas

Fuente: Morfofisiologia vegetal2014/Souza

1.3.1.2 Maturase K El gen matK, utilizado como marcador en construcción filogenética ha mostrado que tiene un alto poder de distinción taxonómica tanto en niveles de familia y niveles de género y especie en plantas, debido a su rápida evolución; presenta un elevado poder de discriminación entre especies (Hilu & Liang,1997).

El gen matK tiene aproximadamente 1500pd está localizado dentro de un intron clase II, entre los exones 5’y 3’ del gen que codifica a tmK (Sugita et al 1985,Steane,2005; Daniell et al 2006). Este gen tiene una única copia con altas tasas de sustitución dentro de las especies y es uno de los potenciales candidatos para estudios de sistemática vegetal y evolución (fig.7). De esta forma, filogenéticamente la tasa de evolución de matK es adecuada para resolver relaciones inter-genero, bien conocidas como las relaciones inter-especies en plantas angiospermas (Hilu&Liang, 1997).

El complejo gen matk-trnd es comúnmente utilizado para estudios de evolución de plantas ya que aborda solución para varios niveles taxonómicos. El gen matK tiene el tamaño ideal, elevada tasa de sustitución, gran porción variable en nivel de ácido nucleico en la primera y segunda posición del codón y baja proporción de transición/transversion y presencia de sectores mutacionalmente conservadas (Hilu&Liang, 1997). Para estudios de barcoding el segmento utlizado de matK comprende en aproximadamente 790pb (Stoeckle et al 2001).

Figura 7: esquema del genoma de cloroplasto

Fuente :sildeshare/chloropast-2014

1.3.1.3.- ITS La región de los ITS ha sido considerada como una fuente muy útil de caracteres de estudios filogenéticos en angioespermas dado que los ITS se encuentran altamente representados en el genoma, se pueden amplificar con cantidades pequeñas de ADN y las secuencias altamente conservadas dentro de la mayoría de los genes nrADN son muy útiles en el diseño de oligonucleótidos universales lo que facilita la amplificación de los ITS mediante el uso de la PCR. Los espaciadores transcriptos internos son la parte más variable de la región de los ITS. La región de los ITS comprende el ITS2, la sub unidad 5.8S y el ITS1 debido a que se encuentran flanqueando a la subunidad 5.8S que es la más conservada y se posibilita la alineación no ambigua de esta región (grafico 1). ( Baldwin & et al 1993)Una limitación de la utilidad de los ITS en la sistemática de las angiospermas, es que este locu presenta una cantidad relativamente pequeña de nucleótidos .En angiospermas los ITS tienen de 565 a 700 pb en longitud puesto que la unidad 5.8S (163-164 pb) exhibe niveles muy bajos de variación en su secuencia, solamente los 400-353pb del ITS1 y ITS2 son útiles para la reconstrucción filogenética entre géneros y especies relacionadas. ( Baldwin & et al 1993).

En contraste, la región ITS de ginmospermas es considerable más larga y tiene mayor rango de variación que va desde 750 pb. Recientemente se realizó un estudio detallado sobre la variación en la longitud de la región ITS en gimnospermas. En los eucariotas, los genes que codifican ARNs ribosómicos se organizan en matrices que contienen unidades transcripcionales repetitivas que implican 16 - 18S,5.5S y 23-28 rRNAs, dos espaciadores transcritos intergénicos y dos secuencias espaciadoras externas.

Estas unidades son transcritas por la ARN polimerasa I y separadas por espaciadores intergénicos no transcritos (IGS). El producto de la ARN polimerasa I es procesado en los nucléolos, donde ITS1 y ITS2 son divididos en tres tipos de ARNs. En genomas eucariotas las regiones ITS varían grandemente en el tamaño de la secuencia.

Figura 8: Representación de los primers ITS1 y ITS4, tambien de los ITS espaciadores internos transcriptos, ETS espaciadores esternos transcriptos y IGS espaciadores intergénicos no transcritos.(Bla Alid et al 2013)

Fuente: Bla Alid et al /2013

1.4 Caracterización Molecular 1.4.1 Colecta del material vegetal La calidad y cantidad de ADN son en general afectadas por la condición del tejido antes de la extracción, por ello las condiciones más importantes en cualquier técnica de extracción de ADN de plantas es la forma utilizada para colectar el tejido vegetal. Las condiciones que se deben cumplir en la colecta son: ✓ El material debe ser joven o lo más joven posible ✓ No debe maltratarse ✓ No debe cortarse ni pulverizarse Evitando así de esta manera que un a mayor superficie del tejido se exponga al oxígeno y desencadene procesos oxidativos de polifenoles (Tapia & Fries 2007). Una vez colectado el tejido debe congelarse inmediatamente en -20° C hasta que se realice la extracción de ADN.(Alejos, et al 2010).

1.4.2 Extracción de ADN La aplicación de las diferentes técnicas moleculares empleadas en la biología molecular para el análisis del genoma, depende en gran medida de la habilidad de extraer el ADN (Velazco, 2005). Por otro lado, existen diversos métodos para la extracción de ADN dependiendo del tipo de tejido a emplear, una técnica muy conocida es la metodología CTAB (Doylle &Doylle,1990) que ha mostrado buenos resultados trabajando con plantas. El propósito del aislamiento del ADN es separar el material genético de todos los componentes celulares (agua, iones orgánicos, aminoácidos, nucleótidos, lípidos, proteínas y RNA para obtener una separación homogénea de ADN que represente toda la información genética contenida en la célula.

La calidad del ADN constituye un elemento crucial, la cual necesita un método de extracción lo más estandarizado posible con el que se obtenga un ADN puro, no degradado, libre de ARN y de inhibidores de la reacción en cadena de la polimerasa ya que cambios en la pureza afectan los perfiles de amplificación y esto se manifiesta en la presencia de bandas falsas y en la poca reproductibilidad del ensayo (Fraga et al 2004).

En general existen varios métodos, todos ellos constan de cuatro pasos esenciales que son: ● La ruptura celular. - la ruptura de la membrana celular es uno de los pasos más importantes en el aislamiento de ADN. Los procedimientos para romper las células son químicos, mecánicos y enzimáticos. Los métodos mecánicos incluyen a la sonicación, molienda, licuado o alta presión, sim embargo su aplicación puede causar fragmentación del ADN. Los mejores procedimientos para abrir las células u obtener ADN intacto son a trevez de los químicos (detergentes) o enzimas. Los detergentes pueden solubilizar los lípidos de la membrana celular resultando en una lisis celular. En ciertos casos las células no se rompen únicamente con detergente, por lo que es necesario un tratamiento inicial con enzimas, el cual permite que el detergente actué sobre la membrana celular (Surzycki 1999).

● Remoción de proteínas y ARN. - el segundo paso en la purificación y remoción de proteínas y ARN del lisado celular. La remoción de proteínas de la solución de ADN depende de las diferencias físicas entre las propiedades de los ácidos nucleicos y proteínas. Los métodos de desproteinizacion expresan ciertas diferencias mediante uso de solventes orgánicos (diferencia en solubilidad), gradiente de densidad (diferencias en volumen especifico) y proteínas (sensibilidad e enzimas digestivas). La remoción del ARN de las preparaciones de ADN se lleva a cabo usando procedimientos enzimáticos (RNAsa)(Surzycki 1999). ● Concentración de ADN.- este paso de la purificación de ADN tiene dos propósitos. Primero concentrar el ADN de la solución de Desproteinizacion y Segundo remover las impurezas que permanecen en la solución producto de la lisis celular. Este paso puede ser implementado de dos maneras: precipitando el ADN con los alcoholes o diálisis al concentrar el ADN usando compuestas que absorban el agua (Dellaporta, 1983). ● Determinación de la pureza y cantidad de ADN. - el último paso en cualquier procedimiento de aislamiento de ADN es la evaluación de los resultados, el cual se realiza al determinar la pureza y concentración del ADN. Este tipo de determinaciones se puede realizar mediante espectrofotometría UV, flurometria y comparación de la intensidad de bandas en geles de agarosa, En espectrofotometría se conoce la concentración de ADN a partir de la medida de absorbancia a una longitud de onda de 260nm y se conoce la pureza al comparar la lectura de la absorbancia a 260nm y 280 nm (propia de proteínas). En fluorometria la concentración se calcula a partir de la flourescencia emitida por flourocormos fijados en el ADN, la cual se comparan con patrones estándar ( Surzycki 1999). Mientras que en los geles de agarosa electroforesis se compara la muestra de ADN con marcadores de peso molecular útiles para cuantificación y determinación de pureza.

1.4.3 Electroforesis de ADN en geles de agarosa La electroforesis es una técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando son sometidas a la influencia de un campo eléctrico. Durante la electroforesis solo los iones positivos hidratados, normalmente asociados con los grupos anionicos fijados de la agarosa, pueden moverse hacia el electrodo negativo y las moléculas negativas, como el ADN, migran hacia el electrodo positivo. El índice de ,migración del ADN a través de los geles de agarosa depende del tamaño de la molécula, concentración del gel, voltaje aplicado, conformación del ADN y buffer usada (Técnicas de Biología Molecular , 2001).

Las moléculas de ADN migran en el gel de electroforesis en un índice inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular o número de pares de bases.

El rango de movilidad lineal depende de la concentración del gel y el voltaje aplicado.

Un fragmento de ADN de un determinado tamaño migra con índices diferentes en geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa. Usando geles de diferentes concentraciones es posible distinguir fragmentos de diferentes tamaños en un amplio

rango, si se aplica un voltaje correcto al gel. Normalmente el índice de migración de los fragmentos de ADN es directamente proporcional al voltaje aplicado.

Consecuentemente, la fuerza de campo aplicada en la, mayoría de los geles debe ser entre 0,5V/cm y 10V/cm. (Surzycki, 1999).

La forma del ADN (conformación) también influencia el índice de migración.

Existen tres estados conformacionales del ADN que son el circular cerrado superenrrolado, circular abierto con moléculas relajadas y lineales. La movilidad relativa de estas tres formas depende de la concentración del gel, voltaje aplicado y la fuerza iónica del buffer, Como regla general, el buffer TAE (tris- acetato EDTA) las diferentes formas de ADN migran ( de la más lenta a la más rápida) en este orden : lineal, superenrrolado y circular relajado. Mientras que en el buffer TBE (tris-borato EDTA) el orden es el siguiente: relajado circular, lineal y superenrrolado (Surzycki, 1999).

Finalmente, para visualizar el ADN en los geles de agarosa se utiliza bromuro de etidio, se une a los ácidos nucleicos al intercalarse entre las bases nitrogenadas, El bromuro de etidio absorbe la radiación ultravioleta en una longitud de onda entre 302 y 366nm y la reemite como una florescencia de una longitud de onda de 590nm. Mediante fotodocumentadores es posible ver el ADN en estos geles y almacenar la información digitalmente.

1.4.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica muy valiosa, ya que permite obtener una gran cantidad de copias de fragmentos de ADN in vitro, duplicando solo secuencias deseadas específicas. Los componentes para una reacción estándar de PCR son ( Ferreira y Grattapagalia, 1998): ● ● ● ● ●

La polimerasa termoestable (enzima que replica el ADN) Primers (fragmento que señalan las secuencias a duplicarse) Desoxirribonucleicos trifosfato MgCl2 (cofactor enzimático) Sales estabilizadoras (estabilizadores de enzima)

El fundamento de la técnica de la PCR es la repetición cíclica de tres reacciones que varían en cuanto a su temperatura de incubación. El primer paso consiste en la desnaturalización del ADN nativo de doble hebra por calentamiento a temperatura elevada, proporcionando hebras sencillas. En el segundo paso, a menor temperatura se alinean los primers con su secuencias complementarias del ADN diana. En el tercer paso se realiza la síntesis de una segunda hebra complementaria de ADN nuevo, que se produce al extenderse el primer utilizando la ADN Taq polimerasa, copiando la secuencia dl ADN molde adyacente. Tras la extensión de los primers, el ciclo se repite, aumentando primero la temperatura, de modo que todo el ADN de doble hebra se convierta en ADN de cadena sencilla y de esta manera las hebras del ADN sintetizadas de nuevo son molde de las siguientes (Gonzales & Medina, 2001) El número de ciclos de la amplificación para producir una banda visible es un gel de agarosa, depende del número de copias de ADN molde y la eficiencia de los primers.

El límite de la reacción ocurre generalmente después de los 30 ciclos con una concentración de 105 copias del ADN molde y una eficiencia del ADN polimerasa del

70%. Los fragmentos generados son separados por electroforesis y así se detectan los diferentes patrones de bandas característicos de cada marcador molecular (Swati et al 1999).

1.4.5 Secuenciación Las técnicas de secuenciaciones empleadas actualmente de forma rutinaria están basadas en metodologías publicadas en 1977: el método Sanger y el de Maxam- Gilbert, siendo el primero el más popular. Ambos se basan en la generación de una población de moléculas marcadas radiactivamente, que representan todos los tamaños y combinaciones posibles. El producto de cada una de las cuatro reacciones se somete, en cuatro carriles independientes, a electroforesis en gel de policramina y se revela siguiendo los métodos clásicos de autorradiografia. Las manchas aparecidas indican las bases presentes en cada posición de la secuencia. (Dorado, 2005).La segunda tecnología masiva de secuenciación masiva que salió al mercado en el 2006 fue la de Solexao mejor conocido como illunina.

En esta tecnología, se utilizan nucleótidos terminadores marcados con moléculas fluorescentes al igual que en la secuenciación Sanger. Además, de la paralelizácion masiva (es decir la capacidad de realizar miles de secuencias en cada corrida), la diferencia con el método convencional es la posibilidad de eliminar la fluorescencia una vez obtenida la imagen y desbloquear carbono 3´ de modo que pueda aceptar una nueva base para continuar la reacción de secuenciación, haciendo que la incorporación de un nucleótido terminador sea reversible. En este caso, las longitudes obtenidas son menores que los secuenciadores 454 (en la actualidad hasta 150 bases).Sin embargo la capacidad de realizar secuencias en paralelo es mucho mayor que en 454(hasta 250millones de secuencias).Como resultado es posible obtener 6x1012 en una sola corrida. (Greif, 2012)

1.5.- Bioinformática La bioinformática es un área de investigación interdisciplinaria que combina la informática y la bioestadística con las ciencias biológicas y biomédicas tales como la bioquímica, biología celular, la genética, la genómica, la fisiología, la inmunología y la biotecnología, entre otras (Moore et al, 2007).

Estudia el flujo de información en todos los estadios del dogma central, como la organización y la regulación de los genes en la secuencia de ADN, la identificación de las zonas de transcripción de ADN, la predicción de la estructura de las proteínas a partir de su secuencia y el análisis de la función molecular de las biomoléculas, implicando la tecnología que utiliza las computadoras para el almacenamiento, recuperación, manipulación y distribución de información relacionada con macromoléculas.El énfasis aquí es sobre el uso de ordenadores, porque la mayor parte de las tareas de análisis de datos genómicos son muy repetitivos o complejos matemáticamente (Xiong et al, 2006, Forman et al, 2010, Kim et al, 2002).

La bioinformática surgió como una disciplina importante poco después del desarrollo de tecnologías de alto rendimiento de secuenciación de ADN en la década de 1970 (Moore et al, 2007)

1.5.1 Bioedit versión 7.0.0 Bioedit es un editor de secuencias biológicas que se ejecuta en Windows 95/98 / NT / 2000 / XP y es destinado a proporcionar funciones básicas de edición de proteínas y secuencia de ácidos nucleicos, la alineación, la manipulación y el análisis. Bioedit no es un potente programa de análisis de la secuencia, pero oferta muchas funciones rápidas y fáciles para edición de secuencias, anotación y manipulación, así como algunos enlaces a programas de análisis de secuencias externas. Longitudes de secuencia y los números se limitan sólo por la memoria disponible del sistema. Alineaciones> 100 Mb han sido editadas en un promedio de escritorio con una eficiencia razonable.

Bioedit ofrece las siguientes características: ✓ Una interfaz gráfica sencilla para la manipulación y edición de secuencias. ✓ Residuos, opciones de selección de variables, inserción del mouse-clic y eliminación de espacios vacíos, columna completa ✓ Dividir la ventana vertical u horizontalmente para manipular dos regiones de una alineación al mismo tiempo. ✓ Anclaje de columnas de alineación para proteger regiones fijas en una alineación. ✓ Anota automáticamente y manualmente secuencias con características tales como intrones, exones. ✓ Promotores y todos los tipos de características estándar de GenBank. Anota automáticamente otras secuencias en una alineación utilizando una secuencia como una plantilla. ✓ Agrupe las secuencias en familias con códigos de colores y bloquee a los miembros del grupo para el alineamiento sincronizado.

Figura 9: ventana básica del documento de alineación de BioEdit.

Fuente: bioedit/version7.0.0

1.5.2.-DNAsp La genética de poblaciones es una rama de la biología evolutiva que trata de determinar el nivel y distribución del polimorfismo genético en poblaciones naturales y también para detectar la fuerzas evolutivas (mutación, migración, selección y deriva) que podrían determinar la patrón de variación genética observado en poblaciones naturales.

Idealmente, la mejor manera de cuantificar la variación genética en las poblaciones naturales debería ser por comparación de las secuencias de ADN (Kreitman 1983). Sin embargo, aunque la metodología para la secuenciación del ADN está disponible desde 1977 (Maxam y Gilbert 1977 Sanger et al., 1977), hasta 1990 el uso de datos de secuencia de ADN tuvo poco impacto en la genética de poblaciones. Esto se debe a que los esfuerzos necesarios para obtener datos de secuencia de ADN de un número relativamente grande de alelos fue sustancial.

El DnaSP (DNA Sequence Polymorphism) es un software dirigido a la población molecular genetistas, puede calcular varias medidas de la variación de la secuencia de ADN. Entre poblaciones no codificantes, en sitios sinónimo o no sinónimos; flujo de genes, la recombinación y los parámetros de desequilibrio de ligamiento.Además, DnaSP realiza algunas pruebas de neutralidad: Hudson, Kreitman y Aguadé (1987), DnaSP aprovecha las capacidades de Microsoft Windows, para que pueda manejar un gran número de secuencias de miles de nucleótidos cada uno en un microordenador.

Además, DnaSP puede intercambiar datos con otros programas, por ejemplo, programas para realizar múltiples alineaciones de secuencias, análisis de árbol filogenético o análisis estadístico.

Figura 10: Ventana básica o menú principal del software.

Fuente: DNAsequence Polymorphism

1.5.3 MEGA7 El objetivo de MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) es proveer herramientas para explorar, descubrir y analizar ADN y secuencias de proteínas desde una perspectiva evolutiva. MEGA permite realizar alineamiento de secuencias, estimar distancias evolutivas, construir árboles, agrupar secuencias, análisis computacionales y estadísticos.

Figura 11: ventana básica o menú principal del software.

Fuente: MEGA

CAPITULO II AREA DE ESTUDIO 2.1 Área de Estudio La zona de estudio se encuentra localizada en el departamento de Cusco, provincia de Cusco, distrito de San Jerónimo en la comunidad de Huaccoto a 1 hora de la población en carro y 3 horas caminado. Esta zona fue elegida como zona de trabajo ya que aquí se encuentra el único bosque de Polylepis microphylla en Cusco.  Accesibilidad Se accede por una carretera o trocha afirmada que llega al poblado de Huaccoto, poblado prehispánico y lugar de paso para los peregrinos que se desplazan al señor de Huanca, donde se tiene una carretera de explotación de rocas volcánicas.  Economía La población en la mayoría se dedica al cultivo de papa (Solanum tuberosa) y habas (Vicia faba).Sin embargo, un porcentaje muy notable se dedica a la explotación de roca volcánica, la comercialización y trabajo artesanal de ésta. Existiendo también pequeños negocios como tiendas. La ganadería se realiza en forma minoritaria, básicamente crianza de ovejas para el consumo de cada propietario.  Clima Es relativamente variable y la vulnerabilidad de acuíferos es baja a media El valle de Cusco cuenta con un clima semiseco y frío. La temperatura media anual máxima es de 19,6 °C y la mínima de 4,2 °C. La temporada de lluvias se inicia en noviembre y concluye en marzo, época en que las montañas se cubren de verde.

En invierno hace frío en la noche y la temperatura aumenta considerablemente desde las primeras horas de la mañana hasta el mediodía. En los días soleados se alcanzan los 20 °C. y en las noches frías se puede llegar a -5°C. Entre junio y julio son comunes las "heladas" (frío intenso) en las que se han reportado nevadas muy ocasionales. De manera general se distinguen dos estaciones climáticas: la estación de lluvias, de noviembre a marzo y la estación de secano, de abril a octubre.

Tabla 1:Clima del distrito de San Jerónimo Meses

Características

Noviembre a Lluvioso-húmedo; 746 mm de precipitación pluvial promedio.

Marzo Abril a Octubre Seco; 99.8 de precipitación pluvial promedio Agosto Noviembre

denominado de transición; características a Intermedio, climatologías de consumo y recarga son equilibradas Fuente: SENAMHI 2010

Tabla 2:Temperatura del Distrito de San Jerónimo Temperatura T máxima T media T mínima

Meses Promedio anual Octubre a Diciembre 25°C Enero, Abril 13.35°C Mayo, Junio y Julio 4.5°C (con presencia de heladas) Fuente: SENAMHI 2010



Hidrología El distrito de San Jerónimo cuenta con 12 ríos quebradas de las cuales 02 tiene uso pecuario, 05 agrícola-pecuarios, 01 agrícola, 02 uso múltiple y 02 sin uso. Es decir, Huaccoto cuenta con 04 ríos quebradas con un caudal 206.70 l/s el cual representa el 29.44% del potencial hidrológico de San Jerónimo (Gobierno Regional de Cusco 2012).

Figura 12: Geo referencia de quebrada temporal comunidad Huaccoto distrito de San Jerónimo.

Fuente: Gobierno regional /2012 El régimen hidrológico de las sub cuencas existentes en la zona está condicionado por las precipitaciones pluviales y las características físicas de la cuenca.

Las aguas subterráneas que afloran como manantiales constituyen los principales abastecedores para el distrito. La naturaleza de las cuencas presenta una configuración donde la pendiente es bastante pronunciada en los primeros kilómetros de su desarrollo y a medida que el río corre hacia bajo la pendiente disminuye, creando de esta manera remansos y embalses naturales.

La cuenca del bajo Huatanay tiene una extensión total de 341.3 Km ; en ella se identifican nueve micro cuencas de las cuales tres corresponden al distrito de San Jerónim 2



Micro cuenca de Kayra

Ubicada al Sur del poblado de San Jerónimo (margen derecha) representa la cuarta micro cuenca en orden de tamaño debido a la recepción de las aguas subterráneas de los manantiales como Pucasa, Conchacalla y Pumahuanca, en la parte alta, con un área de 43.49 Km .Tiene un caudal de 17.5 litros por segundos, sus aguas son captadas para fines agrícolas a través de canales sin revestimiento.

2

 Micro cuenca de Huaccoto Ubicada en la margen izquierda del río Huatanay, tiene un área de 50 Km ; conformada por un conjunto de manantiales.

Su caudal varía de 8 a 8,000 litros por segundo, esto ocasiona problemas de desborde en las zonas bajas.Sus aguas son aprovechadas para la agricultura por las comunidades de Picol y Patapata.

2

 Flora La zona en estudio de acuerdo a las evaluaciones y a la variedad de características fisiográficas, climáticas y edáficas, favorece desarrollo de su vegetación en abundancia tanto en plantas silvestres, cultivables, y forestales.

Tabla 3: Flora presente en el área de estudio Escallonia resinosa Estrato Arbóreo

Polylepis incana Alnus acuminata Schinus molle Escallonia myrtilloides Kagenckia lanceolata, Baccharis buxifolia Ambrosia arborecences

Estrato Arbustivo

Berberias boliviana Colletia spinosissima Barmadessia horrida Lycianthes lycioides Senna birrostris Bacharis odorata Festuca dolychophylla Stipa ichu Plantago montícola

Fuente: Marín/EIA -ladrilleras 2014

 Fauna La fauna representativa de la zona de acuerdo a estudios realizados anteriormente destaca la diversidad faunística.

Tabla 4:Fauna presente en el área de estudio.

Anfibios

Rinella spinulosus Lialoemus alticolor

Reptiles

Protoporus bolivianus Tachymesis peruviana Falco sparvericus Zenaida auriculata Colibri Coruscans Troglidetes aedon

Aves

Turdus chiaguaco Coláteres rupicula

Agriormis andicola Nothoprocta pentlandii Rollandia rolland Fulica ardesiaca Larus serranus Mamíferos Pseudalopex culpaeus Orearilurus jacobita Lama pacos Fuente: EIA -ladrilleras 2014 

Relieve y Suelos Huaccoto constituye una altiplanicie situada entre los 4000 y 4350msnm; separa la ladera empinada norte con las montañas de Pachatusan. Resalta por la presencia de dos cuerpos volcánicos cuaternarios, uno denominado Huaccoto por situarse en el poblado y el otro del Ichchu Orcco juntos desarrolla relieves moderados con pendientes que varían entre 15 y 25%. Además la zona de estudio está conformada geológicamente por el Grupo San Jerónimo Una potente serie roja de origen continental de más de 6000 m, el cual se divide en dos formaciones geológicas.  Zona de vida En base a la clasificación desarrollada por Holdrigde, se tiene que la zona de San Jerónimo se ubica en el bosque Húmedo-Montano subtropical (bh-MS). La precipitación total anual varía entre 600nm y 800nm y la biotemperatura media anual entre 10°C y 6°C. Se ubica entre 3200 y 4000 msnm. Según el Diagrama esta zona tiene una evapotranspiración potencial que varía entre la mitad (0,5) y una cantidad igual (1) al volumen promedio de precipitación total por año, hecho que ubica esta zona de vida la provincia de humedad Húmedo.

MATERIALES Y METODOS 3.1 Materiales 3.1.1 Biológico Tabla 5:Material biológico colectado N° Código

Denominación Coordenadas

Altitud Fecha

común

de colecta

1 T(01plant)

Queuña

13°31'05.83''S 71°51'00.55''O

3996

01/03/15

2 T(02plant)

Queuña

13°31'05.75''s 71°51'00.26''O

3996

01/03/15

3 T(03plant)

Queuña

13°31'05.66''S 71°50'59.98''O

3997

01/03/15

4 T(04plant)

Queuña

13°31'05.19''S 71°51'01.22''O

4004

01/03/15

5 T(05plant)

Queuña

13°31'05.22''S 71°51'01.53''O

4005

05/03/15

6 T(06plant)

Queuña

13°31'05.92''S 71°51'01.71''O

4003

05/03/15

7 T(07plant)

Queuña

13°31'05.62''S 71°51'00.56''0

3997

05/04/15

8 T(08plant)

Queuña

13°31'04.68''S 71°50'58.68''O

4010

05/04/15

9 T(09plant)

Queuña

13°31'04.82''S 71°50'58.25''O

4013

05/04/15

10 T(10plant)

Queuña

13°31'04.44''S 71°50'57.57''O

4021

05/04/15

11 T(11plant)

Queuña

13°31'04.24''S 71°50'56.97''O

4027

05/04/15

12 T(12plant)

Queuña

13°31'04.02''S 71°50'56.82''O

4029

13/03/16

13 T(13plant)

Queuña

13°31'06.75''S 71°50'55.93''O

4052

13/03/16

14 T(14plant)

Queuña

13°31'06.75''S 71°50'55.93''O

4041

13/03/16

15 T(15plant)

Queuña

13°31'09.05''S 71°50'59.52'' O

4331

13/03/16

16 T(16plant)

Queuña

13°31'02.42'' S 71°50'59.03''O

4037

13/04/16

17 T(17plant)

Queuña

13°31'02.31''S 71°50'57.00''O

4051

13/04/16

18 T(18plant)

Queuña

13°31'02.12''S 71°50'55.29''O

4035

13/04/16

19 T(19plant)

Queuña

13°31'03.96''S 71°50'56.48''O

4032

13/04/16

20 T(20plant)

Queuña

13°31'03.65''S 71°50'56.46''O

4033

13/04/16

21 T(21plant)

Queuña

13°31'03.37''S 71°50'56.57''O

4034

15/05/16

22 T(22plant)

Queuña

13°31'03.33''S 71°50'55.38''O

4043

15/05/16

23 T(23plant)

Queuña

13°31'02.80''S 71°50'59.92''0

4049

15/05/16

24 T(24plant)

Queuña

13°31'02.80''S 71°50'59.05'' O

4055

15/05/16

3.2.2 Campo 

Caja de Tecnopor ( cooler)



Geles de hielo seco



Frascos estériles



Cinta maskin y ligas



Tijeras de podar



GPS



Prensa botánica



Periódico



Plumón indeleble



Etiquetas



Bolsas polietileno



Arnés



Estrobo



Estaca



Guantes

3.2.3 Materiales de Laboratorio  Tubos microcentrifuga de 1.5.ml.. 

Pipetas automáticas de 10, 100 y 1000 ml



Micropipetas 10, 50, 200, 1000 µl.



Microperlas de vidrio 0.5 mm.



Papel absorbente



Pinzas



Tijeras



Mortero y Pilones

3.2.4 Laboratorio  Microscopio Esteroscopio (Leica) 

Microcentrifuga (BioSan)



Hotblock a 55 ºC.



Refrigeradora (-80)



Cámara de flujo laminar



Termociclador (Biorad)



Cámara horizontal de electroforesis



SafeImager ™ Invitrogen.



Balanza analítica



Computadora (Linux)

3.2.5 Reactivos de laboratorio 

Kit de Extracción PureLink DNA Invitrogen ®.



Binding/Lysis del Kit PureLink de Invitrogen



Buffer fosfato salino (PBS)



Proteinasa K.



RNAasa A



Etanol 99%



Agua ultrapura



Agarosa grado molecular



SYBRSafe



Agua destilada



MgCl2 y dNTPs



Cebadores (ITS, rcbL,psbM-trnD)



Microperlas de vidrio de 0.5mm



ElutionBuffer (Buffer TE) del kit PureLink



Platinum Blue PCR Supermix High Fidelity

3.2.- METODOLOGÍA Flujograma “Identificación in sílico y Caracterización Molecular mediante Marcadores Moleculares para Polylepis spp. de Huaccoto, San Jerónimo - Cusco”

Colecta de las muestras Trasporte de las muestras

Determinación taxonómica de las muestras

Claves taxonómicas propuestas por Mendoza y Cano

Extracción de ADN a partir de los foliolos y tronco Cuantificación y visualización de la calidad ADN

PCR( primers,rbcL y psbM- tnrD,)

Visualización de los Polimorfismos

a) Iniciadores b) Condiciones de amplificación c) Programa de amplificación

a) Armado de la cámara de Electroforesis b) Condiciones de migración

Secuenciación

Identificación in silico

Análisis Bioinformático



Colecta de material. – Se colectó 24 muestras en los periodos de marzo, abril, mayo del 2015 y 2016 respectivamente en la quebrada de la comunidad de Huaccoto zona con difícil acceso el protocolo de colecta fue modificado para el trabajo de investigación. 

Se colectaron las ramillas más prominentes para ponerlas a la prensa botánica, estas etiquetadas y debidamente acomodadas se enviaron al especialista para su determinación morfológica.



Se cortó las ramillas más tiernas de cada árbol de Polylepis



Se colocaron las muestras en los tubos eppendorfs conteniendo solución conservante (fotografía 1)



Las muestras fueron trasladas en un cooler que contenía hielo seco en gel enviadas en avión hasta las instalaciones del Instituto de Biotecnologia ADN Uchumayo-Arequipa.

Figura 13: colecta de ejemplares de Polylepis

Fuente: Elaboración propia/2016 

Determinación morfología.- 24 muestras fueron determinadas fue realizado por el especialista M,Sc. Wilfredo Mendoza (2012) bajo los criterios propuestos en

el libro “ El género Polylepis en el Perú” ya que este libro fue basado en colectas de la misma zona de estudio que el presente trabajo de investigación



Extracción de ADN: La extracción de ADN de material se realizó mediante el protocolo de ADN barcoding establecido por Aron J, kuzmina, con algunas modificaciones. 

Se procedió a colocar parte de la muestra en tubos eppendorfs correspondientes con 400µl de PBS y 10µl de Proteinasa K.



Se trocearon las muestras dentro del tubo y se encubaron por 10 minutos a 55°C dentro del hotblock.



Posterior a la incubación se añadió 100µl de microperlas de vidrio ( glass beads) de 0.5mm a cada tubo, se llevó a vortex por 1minuto,repitiéndose este paso por 3veces



Se centrifugaron los tubos y se recuperó 300ul de lisado a un tubo eppendorf nuevo se añadió 5µl de RNAasa A y se incubo a temperatura ambiente por 15 minutos.



Luego se añadió 300 µl de binding/Lysis del Kit PureLink de Invitrogen ® y 300µl de etanol al 99%



Se verifico la ausencia de turbidez en los tubos y se trasladó la mezcla lisado/Lysis/etanol a las columnas de extracción del kit Purelink.



Se centrifugo por 1min a máxima velocidad y se descartó el tubo colector junto con su contenido.



Se colocaron las columnas en tubos y seguidamente se añadió 50µ0l de WashBuffer1 a las columnas de extracción y se centrifugo a máxima velocidad por 1minuto luego se descartó el contenido de los tubos colectores.



Se añadió 500µl de Washbuffer2 se centrifugo a máxima velocidad por 3 minutos; se descartó el tubo colector y se colocaron en columnas de extracción en tubos eppendorfs nuevos.



Se procedió a la elución del ADN utilizando 30µl de ElutionBuffer (Buffer TE) del kit PureLink; se dejó reposar por un minuto y se centrifugo a máxima velocidad por 1minuto.



Seguidamente se realizó una segunda elución utilizando 30µl de agua ultrapura, se centrifugo a máxima velocidad por 1 minuto y se guardaron los tubos con contenido de ADN.



El ADN extraído fue probado mediante electroforesis en un gel de agarosa teñido con 1µl de SYBR safe a130V por 15minutos. El gel fue visualizado en el Safelmager de invitrogen.



PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) La PCR se realizó con 12 muestras (limitaciones económicas siendo este el 6to ensayo).  El aislamiento de ADN y amplificación de rbcL para identificación de familia de plantas y el psbM-trnD a fin de identificar especies se utilizó el siguiente kit: Tabla 6:kit de cebadores utilizados

Primers

Secuencias

Temperatura

ATGTCACCACAAACAGAAAC

95℃ 2 min

2 reverse

TCGCATGTACCTGCAGTAGC

94℃ 1 min, 55℃ 30 sec,

psbM-

TTTGACTGACTGTTTTTACGTA 52°C

rbcL 1forward

forward trnD-r

CAGAGCACCGCCCTGTCAAG

52°C

Los cebadores anteriormente mencionados fueron propuestos por la empresa Functional Biosciences USA.Se utilizó Platinum Blue PCR Supermix High Fidelity para las 12 muestras ya que este kit comercial estandarizado de alta fidelidad ofrece mejores resultados en plantas o especies difíciles de trabajar, esto quiere decir que si en ensayos consecutivos la PCR nos brinda los resultados esperados si se usa un Kit a fin de tener buenos resultados en la secuenciación siguiendo el protocolo establecido por Invitrogen y recomendaciones.

Supermix High Fidelity

Platinum Blue PCR

Tabla 7 :composición de Platinum Blue PCR Supermix High Fidelity.

20ml

recombiante Taq DNA polymerasa

6.25

Pyrococcus species GB-D complejo polimerasa termoestable

100mM

Platinum® Taq anticuerpo

66 mM

Tris-SO (pH 8.9)

19.8mM

(NH ) SO

2.4 mM

MgSO

220 µM

dNTPs

4

4 2

4

4

estabilizadores



Se colocó y 30 µl de Platinum Blue PCR Supermix High Fidelity.



Los tubos, se colocaron en un termociclador BioRad (MyCycler™ ThermalCyclerSystem WithGradientOption) y se programó de la siguiente manera: 95℃ 2 min , 94℃ 1 min, 55℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 34 cycles 72℃ 7 min.



Para psbM-trnD , annealing Temp de 52°C y las mismas condiciones de PCR.



Luego de la amplificación las muestras fueron mantenidas en el termociclador a 4ºC (post incubación).



Electroforesis y purificación de productos de PCR El producto de de la PCR fue separado en un gel de agarosa al 1.5% y la banda

correspondiente al gen fue cortado del gel para su purificación utilizando el kit QIAquick PCR Purification Kit. Donde se utilizó columnas de QIAGEN y se siguió las instrucciones de la compañía



Secuenciación de productos de PCR

Las 21 muestras fueron secuenciadas por Functional Biosciences, Inc. (USA) bajo el trasporte de muestras por convenio y pago de franquicias siguiendo el protocolo:

 A 20µ l de ADN purificado se le añadió 1 µl de Primer para secuenciar  fueron secuenciados siguiendo el método sanger acoplado a Big Dye terminator v3.1 y corridos en un secuenciador ABI 3770xl.  Las secuencias fueron chequeadas y corregidas usando el software Sequencher v. 4.1 (Gene Codes).

 Análisis Bioinformático Este análisis fue realizado bajo la metodología propuesta por Herbet et al 2003  Las secuencias que fueron obtenidas por secuenciación, fueron analizadas individualmente.  Para determinar las distancias genéticas se utilizó MEGA7,Bioedit y DNAsp.  Se realizó el alineamiento múltiple  Análisis de bases nitrogenadas  Construcción de árboles filogenéticos por la metodología de Neirbor joinning y BOOTSTRAP.  Posteriormente las secuencias fueron analizadas por el Blas-n (NCBI) y comparadas con las secuencias depositadas en la base de datos GenBank  se construyó arboles filogenéticos en el NCBI para corroborar resultados

CAPITULO IV RESULTADOS Y DISCUCIONES 4.1. Determinación Morfológica En los meses entre estación seca y lluviosa marzo, abril y mayo del 2015 y 2016 respectivamente fueron colectados

un total de 24 ejemplares de Polylepis de la

comunidad de Huaccoto.

Como resultado de la determinación morfológica se encontraron dos especies del género Polylepis presentes en la zona de estudio como se observa en la tabla 9 y en anexos.  Polylepis microphylla  Polylepis incana.

4.2.- Caracterización molecular 4.2.1.- Análisis de secuencias amplificadas mediante cebador ITS Se realizó la amplificación mediante el cebador ITS para las 12 muestras seleccionadas para el proceso de secuenciación, el cebador ITS tiene alta afinidad con los genomas de hongos .No obstante, dos muestras no se pudieron amplificar debido a la cantidad de ADN y calidad de ADN no era la adecuada se encontraron hongos endófiticos que enmascararon en todos los casos la secuencia de la planta por lo que el tratamiento molecular se repitió 3 veces se encontraron:  Capnocheride sp  Hongos de la familia Mycosphaerellaceae Los ITS son muy útiles para la identificación de diferentes grupos taxonómicos por poseer secuencias de uso universal lo cual se demostró con los resultados de la tabla 08.



Análisis de MEGA7 para las secuencias amplificadas mediante el cebador ITS Figura 14 : alineamiento múltiple de las secuencias

 Construcción de árboles filogenéticos utilizando Neighbor-Joining (MEGA7)

En la figura 14 se observa el alineamiento múltiple que realiza MEGA7 todos las secuencias deben encontrase en formato fasta. También muestran los puntos variables donde las bases nitrogenadas cambian, lo cual es muy importante para la identificación de especies si bien se interpreta que son ejemplares muy cercanos.

Figura 15: composición nucleotídica

MEGA7 tambien nos muestra la compocicion nuecleotidica de las secuencias de cada ejemplar esto quiere decir que el sofware calcula la cantidad de TIMINA, CITOCINA GUANINA y ADENINA. Esto es importante porque nos ayuda a reconocer la ubicación de los genes y el número de reorganizaciones génicas (breakpoints) en comparación con la secuencia que se presume ancestral para el grupo. Además, las delecciones nos indica que hay variaciones en la bases nitrogenadas esto genera un cambio en la expresión de un codón punto clave para el proceso de especiación.

En la grafica 1y 2 se observa los arboles filogenticos se muestra la asociacion evolutiova mediante la metodologia neighbor joining .Conocimiendo la distancia entre cada par de taxones, se observa que la matriz de distancia de entrada es correcta, entonces el árbol de salida es correcto. El árbol de salida es garantizado siempre cuando la matriz de distancia es 'casi aditiva', específicamente la distancia verdadera es menos de la mitad de la longitud de rama más corta en el árbol. La distancia entre cada brazo es aditiva y el brazo izquierdo distante reafirma que las secuencias analizadas corresponden a los grupos que están agrupados.

Figura 16: Distancias genéticas calculadas mediante MEGA7 para las secuencias obtenidas mediante primer ITS agrupados en 3 grupos

En la figura 15 y 16 MEGA7 expresa las distancias genéticas existentes entre cada ejemplar esto según el código de barras de la vida indica que de ser mayor 0.020 cada ejemplar es una especie diferente por lo que en la figura muestra que de todos los ejemplares se tiene

2 especies diferentes o grupos diferentes. Los cuales fueron

previamente agrupados de acuerdo a la divergencia evolutiva de cada uno de ellos. Para poder identificar que especie son se utilizó el Blast-n para comparar las secuencias.

Figura 17: Distancias genéticas calculadas mediante MEGA7 para las secuencias obtenidas mediante primer ITS en un solo grupo

 Analisis con Blast-n para las secuncias obtenidas medinate el cebador ITS

Figura 18: Análisis con Blast para plant1_ITS1-F TRIM QUALITY: 20

En la figura 18 se observa que la secuenia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar

secuencias similiares a la secuncia problema.Ademas,query cover muestra que la secunencia fue emparejada al 93% lo cual se refleja en la identidad de la secuencia de un 96% estos datos sutentarian que la secuncias problema corresponden al hongo endofitico del genero Capnocheride.

Figura 19: alineamiento y emparejamiento de secuencias para plant1_ITS1-F TRIM QUALITY: 20

En la figura 19 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY� y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria.

Figura 20: Análisis con Blast para plant2_ITS1-F TRIM QUALITY: 20

Figura 21: alineamiento y emparejamiento de secuencias para plant2_ITS1-F TRIM QUALITY: 20

En la figura 20 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias

similires.Ademas,query cover muestra que la

secuencia fue emparejada al 99% lo cual se refleja en la identidad de la secuencia de un 98% estos datos sutentarian que la secuncias problema corresponden al hongo endofitico Mycosphaerellaceae.

En la figura 21 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria.

Figura 22: Análisis con Blast para >plant3_ITS1-F TRIM QUALITY: 20

Figura 23: Alineamiento y emparejamiento de secuencias >plant3_ITS1-F TRIM QUALITY: 20

En la figura 22 E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay

probabilidad

que

al

azar

se

pueda

encontrar

otras

secuncias

similires.Ademas,query cover muestra que la secuencia fue emparejada al 93% lo cual

se refleja en la identidad de la secuencia de un 96% estos datos sutentarian que la secuncias problema corresponden al hongo endofitico Capnocheirides sp.

En la figura 23 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY� y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria.

FIGURA 24:Analisis con blast para >PLANT4_ITS1-F TRIM QUALITY:20

Figura 25:Alinemiento y emparejamiento de secuencias plant4_ITS1-F TRIM

En la figura 24 E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas

de que

una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias similires.

Ademas,query cover muestra que la secunencia fue emparejada al 94%

lo cual se

refleja en la identidad de la secuencia de un 95% estos datos sutentarian que la secuncias problema corresponden al hongo endofitico Capnocheirides .

En la figura 25 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria.

4.2.2.- Análisis de secuencias amplificadas mediante cebador rcbL. Se realizó la aplicación mediante el cebador rcbL para las 12 muestras seleccionadas para el proceso de secuenciación, el cebador rcbL tiene alta afinidad con los genomas de plantas y nos ayuda a identificar categorías taxonómicas de familia, tribu y género. Sin embargo las secuencias de este cebador no son consideradas específicas en su totalidad y puede generar resultados aleatorios.

Los rcbL son muy útiles para la identificación de diferentes grupos taxonómicos lo cual se demostró con los resultados de la tabla 09.



Análisis de MEGA7 para las secuencias amplificadas mediante el cebador rcbL

Figura 26: Figura 26:Alineamiento múltiple de las secuencias amplificadas mediante el primer rcbL

En la figura 26 se observa el alineamiento múltiple que realiza MEGA7 todos las secuencias deben encontrase en formato fasta. También se muestran los puntos variables donde las bases nitrogenadas cambian. Además, se observa los breakpoints representados por (-) indicando que son puntos en los cuales el ADN no fue alineado.

En las graficas 3y 4 arboles filogenticos muestra la asociacion evolutiova la distancia sabiendo la distancia entre cada par de taxones, tiene la propiedad de que si la matriz de distancia de entrada es correcta, entonces el árbol de salida es correcto como en el caso anterior.

Por otro lado, la hipótesis del reloj molecular, explica que la tasa de mutación de las biomoléculas para deducir el tiempo en la prehistoria cuando dos o más formas de vida divergieron . Estos datos biomoleculares son soportados en base a la alineación múltiple realizada por MEGA7. Ademas, se entiende que el gen rcbL nos permite identificar las secuncias problemas solo hasta familias por lo cual no hay mayor divergencia en el arbolfilogentico entendiendo que las muestras estudiadas pertenecen a la misma familia.

 Analisis con Blast para las secuncias amplificadas medinate el cebador rcbL

Figura 27:Analisis con Blast para >plant1_rbclTRIM QUALITY: 20

Figura 28: alineamiento y emparejamiento de secuencia >plant1_rbcl TRIM QUALITY: 20

En la figura 27 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias similires. Ademas,query cover muestra que la secuencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuencia fue emparejada en su ,la identidad de la secuencia de un 100% estos datos sutentarian que la secuencias problema corresponden a Polylepis australis.

En la figura 28 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del Blast-

NCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que la sencuencia se alineo al 100%

Figura 29: Análisis con Blast para >plant2_rbclTRIM QUALITY: 20

Figura 30: alineamiento y emparejamiento de secuencia >plant2_rbclTRIM QUALITY: 20

En la figura 29 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuencia

problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias similires. Ademas,query cover muestra que la secunencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuncia fue emparejada en su ,la identidad de la secuencia de un 100% estos datos sutentarian que la secuncias problema corresponden a Polylepis sp.

En la figura 30 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que la sencuencia se alineo al 100%

Figura 31: Análisis con Blast para >plant3_rbcl TRIM QUALITY: 20

En la figura 31 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuencias similires. Ademas,query cover muestra que la secuencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuncia fue emparejada en su ,la identidad de la secuencia de un 99% estos datos sutentarian corresponden a Polylepis reticulta.

que la secuencia problema

Figura 32: alineamiento y emparejamiento de secuencia >plant3_rbclTRIM QUALITY: 20

En la figura 32 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que el gap es 1 lo cual indica que si hay penalidad lo cual se ve reflejada en la identidad de la secuencia.Se entiende por penalidad de gap a la zona donde hay errores de replicación son inserciones y deleciones de bases de ADN únicas de la cadena de ADN (indels) puntos en los cuales no hubo alineacion.

Figura 33: Anรกlisis con Blast >plant4_rbcl TRIM QUALITY: 20

Figura 34: Anรกlisis con Blast >plant4_rbcl TRIM QUALITY: 20

En la figura 33 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas

de que una secuencia de tamaño similiar

dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuencia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias similires. Ademas,query cover muestra que la secunencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuencia fue emparejada en su totalidad ,la identidad de la secuencia de un 100% estos datos sutentarian que la secuncia problema corresponden a la tribu Sanguisorbeae, esto porque el gen rcbL nos permite identificar familias con alta afinidad y cuando la secuencias o el fragmento insertado en la base de datos puede encontrar una alta afinidad con secuencias de otra especie como es Acaena rorida.

En la figura 34 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que el frgamento insertado se alineo al 100%

Figura 35: Análisis con Blast >plant5_rbclTRIM QUALITY: 20

En la figura 35 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuencia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuencias similires. Ademas,query cover muestra que la secunencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuncia fue emparejada en su totalidad ,la identidad de la secuencia de un 99% estos datos sutentarian que la secuencia problema corresponden a

la tribu Sanguisorbeae, esto porque el gen rcbL nos permite identificar familias con alta afinidad y cuando la secuncias o el fragmento insertado en la base de datos puede encontrar una alta afinidad con secuencias de otra especie como es Margyricarpus pinnalus

Figura 36:alinemiento y emparejamiento de secuencia >plant5_rbcl TRIM QUALITY: 20

En la figura 36 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY� y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que el fragamento insertado se alineo al 100%

Figura 37: Análisis con Blast >plant6_rbclTRIM QUALITY: 20

En la figura 37 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuencias similires. Ademas,query cover muestra que la secuencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuncia fue emparejada en su totalidad ,la identidad de la secuencia de un 99% estos datos sutentarian que la secuencia problema corresponden a la tribu Sanguisorbeae, a Polylepis australis

Figura 38: Alineamiento y emparejamiento de secuencia >plant6_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20

En la figura 38 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que el fragamento insertado se alineo al 100%

Figura 39: Análisis con Blast >plant7_rbcl TRIM QUALITY: 20

Figura 40: alineamiento y emparejamiento secuencia >plant7_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20

En la figura 39 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas

de que una secuencia de tamaño similiar

dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias similires. Ademas,query cover muestra que la secunencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuncia fue emparejada en su totalidad ,la identidad de la secuencia de un 99% estos datos sutentarian que la secuncia problema corresponden a la tribu Sanguisorbeae, a Polylepis sp En la figura 40 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que el fragamento insertado se alineo al 100%

Figura 41:Análisis con Blast >plant8_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20

En la figura 41 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la probabilidad de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias similires. Ademas,query cover muestra que la secunencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuncia fue emparejada en su totalidad ,la identidad de la secuencia de un 100% estos datos sutentarian que la secuencia problema corresponden a la tribu Sanguisorbeae, a Polylepis reticulata

Figura 42: Alineamiento y emparejamiento secuencia >plant8_rbclTRIM QUALITY: 20

En la figura 42 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que el fragamento insertado se alineo al 100%

Figura 43:: Análisis con Blast>plant9_rbcl TRIM QUALITY: 20

Figura 44:Alineamiento y emparejamiento secuencia>plant9_rbclTRIM QUALITY: 20

En la figura 43 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuencia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias similires. Ademas,query cover muestra que la secuencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuencia fue emparejada en su totalidad ,la identidad de la secuencia de un 100% estos datos sutentarian que la secuencia problema corresponden a la tribu Sanguisorbeae, a Polylepis australis En la figura 44 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que el fragamento insertado se alineo al 100%

Figura 45: Análisis con Blast >plant10_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20

En la figura 45 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas

de que una secuencia de tamaño similiar

dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuencias similires. Ademas,query cover muestra que la secuencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuencia fue emparejada en su totalidad ,la identidad de la secuencia de un 99% estos datos sutentarian que la secuencia problema corresponden a la tribu Sanguisorbeae, a Polylepis sp Figura 46:Alineamiento y emparejamiento secuencia >plant10_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20

En la figura 46 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del Blast-NCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que el fragamento insertado se alineo al 100%.

Figura 47:: Análisis con Blast plant11_rbcL TRIM QUALITY: 20

Figura 48:: Alineamiento y emparejamiento secuencia >plant11_rbcL TRIM QUALITY: 20

En la figura 47 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas

de que una secuencia de tamaño similiar

dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuencia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias similires. Ademas,query cover muestra que la secuencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuncia fue emparejada en su totalidad ,la identidad de la secuencia de un 100% estos datos sutentarian que la secuencia problema corresponden a la tribu Sanguisorbeae, a Polylepis Australis

En la figura 48 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que el fragamento insertado se alineo al 100%

Figura 49:análisis con Blast >plant12_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20

En la figura 49 se observa que la secuencia problema ha obteniendo un E- value de 0.0. el E-value es la cantidad de veces esperadas de que una secuencia de tamaño similiar dé el mismo score por azar en esta base de datos,nuestro resultado es de 0.0 para la secuenia problema lo cual quiere decir que no hay probabilidad que al azar se pueda encontrar otras secuncias similires. Ademas,query cover muestra que la secunencia fue emparejada al 100% esto quiere decir que el secuncia fue emparejada en su totalidad ,la identidad de la secuencia de un 100% estos datos sutentarian que la secuencia problema corresponden a la tribu Sanguisorbeae, a Polylepis sp

Figura 50: alineamiento y emparejamiento secuencia >plant12_rbcl-rev TRIM QUALITY: 20

En la figura 50 se observa el alinemiento de la secuencia problema representada como “QUERY” y a la secuencia con la cual se esta comparo en la base de datos del BlastNCBI.Tambien nos indica el origen y la orientacion en el genoma estudiado que en este caso seria la hebra complementaria. Ademas,observamos que los gaps son 0 lo cual indica que no hay ningun tipo de penalidad ya que el fragamento insertado se alineo al 100% 4.3.3.-Análisis de secuencias amplificadas mediante el primer pbsM- trnD Se realizó la aplicación mediante el complejo cebador

para las 12 muestras

seleccionadas para el proceso de secuenciación de las cuales solo 3

lograron

secuenciarse, el cebador pbsM- trnD tiene alta afinidad con secuencias especificas por lo que ayuda a identificar categorías taxonómicas más específicas como son los de especie . Sin embargo

las muestras o secuencias que no se lograron secuenciar nos

indican que el método de secuenciación no es el adecuado para este tipo de cebadores Como se muestra en los resultados de la tabla 10

Figura 51:Alineamiento múltiple de las secuencias amplificadas mediante el primer psbM-trnD

En la figura 51 se observa el alineamiento múltiple de las secuencias que se pudieron amplificar mediante el complejo cebador psbM-trnD como se tiene conocimiento este cebador tiene alta afinidad para identificar especies por lo cual se puede observar la variación en algunas bases nitrogenadas, se sabe que los tripletes codifica proteínas y el cambio en una base genera que se codifique una proteína diferente, presumiendo así que corresponderían a especies diferentes.

 Análisis con Blast para secuencias amplificadas mediante el cebador psbM-trnD

Figura 52: Análisis con Blast las secuencias plant2, plant6 y plant7 amplificadas mediante el primer pbsM- trnD

En la figura 52 se muestra que BLAST (un método heurístico creado en 1990 por Altschull) esta herramienta de búsqueda de alineamientos locales BLAST busca regiones de nuestra secuencia que tengan homología con alguna región de las secuencias de la base de datos esto permite interpretar e interrogar en una base de datos donde existen miles de secuencias encontrando la más parecida a la secuencia problema. Como resultado de esta búsqueda se encontró que nuestras secuencias problemas son parecidas: Polylepis sp, Polylepis australis, Polylepis reticulata.

CONCLUSIONES 1. La determinación se realizó mediante claves de identificación taxonómica se encontró que en la comunidad de Huaccoto-San Jerónimo están presentes las especies de Polylepis microphylla y Polylepis incana.

2. La caracterización molecular mediante el cebador ITS mostro que el ADN de Polylepis se encuentra enmascarado por el ADN de hongos endófiticos que son Mycosphaerellaceae, Capnocheirides sp. Asimismo, la amplicacion

con el

cebador rcbL mostro que las muestras correspoden a Polylepis asutralis, polylepis reticulata, Polylepis sp, Acaena rorida, Margyricarpus pinnalus.

La

amplificacion mediante el complejo cebador psbM-trnD demostró la alta afinidad para especies encontrando que en la comunidad de Huaccoto están presentes Polylepis sp, Polylepis australis, Polylepis reticulata.

3.

El analisis bioinformatico de las secuencias obtenidas realizado en MEGA7 mediante la elaboracion de arboles filogenticos ( Neirbor joinning y Bootstrap) y respaldado por Blast-n (NCBI) reafirman que en La comunidad de Huaccoto existen tres especies de Polylepis. Las cuales según la base de datos del Genbank del NCBI corresponden ha Polylepis sp, Polylepis australis, Polylepis reticulata.

RECOMENDACIONES Secuenciar más ejemplares de Polylepis y subirlas al Genbank ya que la actual base de datos limita el trabajo de identificación, como se pudo observar en el presente trabajo de investigación. Además, se recomienda estandarizar protocolos de extracción de ADN, PCR y secuenciación ya que este grupo desafía muchos protocolos existentes y obliga al uso de kits comerciales de alta fidelidad.

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A

revisión

of

the

genus

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(Rosaceae:

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Smithson.

Contrib.

Bot.

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doi:

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ANEXOS

ANEXO FOTOGRAFICO Fotografía 1: colecta de material vegetal

Fotografía 2: colecta de material vegetal

Fotografía 3: colecta de material vegetal

Fotografía 5: zona de estudio

ďƒź Orden de pedido de secuencias de Functional Biosciences

 Clave para identificar especies de Polylepis MENDOZA y CANO

 Arboles Filogenéticos (NCBI-GENBANK)