Recursos genéticos en el Perú y patrimonio genético

FORO: “ DEFENSA DEL PATRIMONIO CULTURAL Y PATRIMONIO GENÈTICO DEL PERÙ”

RECURSOS GENÈTICOS DESARROLLADOS EN EL PERÙ Y SU CARACTERIZACIÒN PARA SER CONSIDERADOS PATRIMONIO GENÈTICO

EXPOSITOR : NICOLAS A. ROMÁN CABELLO

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ENTER THE NEW WORLD !!

SON LA BASE FUNDAMENTAL PARA EL DESARROLLO DE NUEVAS RECOMBINACIONES DEL MATERIAL GENÈTICO; VARIEDADES, HÌBRIDOS Y SUS MUCHAS APLICACIONES: MEDICINA, AGRICULTURA, INDUSTRIAS DE ALIMENTOS BIORREMEDIACIÒN CONTROL DE PLAGAS Y ENFERMEDADES DE TODO TIPO.

TALLER LINEA DE BASE (22 Y 23/102013.

MINISTERIO DEL AMBIENTE

PRIORIDAD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CULTIVO N. CIENTÌFICO GRUPOS P PAPA Solanum sp 4 MAIZ Zea mays 4 ALGODÒN Gossipium sp 3 PAPAYA Carica papaya 3 AJIES Capsicum sp 3 FREJOL Phaseolus vulgaris 3 CACAO Theobroma cacao 2 QUINUA Chenopodium quinoa 2 TOMATE Solanum lycopersicum 2 CALABAZA Cucurbita sp 2

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Azotobacter- Alu I 21112 21151 24114 24113 22215 E.coli

21152 24115 24133 21123 21243 E.coli 0.5

0.6

0.7

0.8

Coefficient

0.9

1.0

. CEREALES: Trigo, cebada, avena, centeno, triticale, maíz (amiláceo, duro) . GRANOS: quinua, cañihua, kihuicha . LEGUMINOSAS: Frejol, haba, soya, arveja . RAICES Y TUBEROSAS: papa, oca, mashua, olluco, arracacha, chicuro, yacòn . PASTOS Y FORRAJES: Costa sierra y selva . MICROORGANISMOS: Azospirillum, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium. .

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ES UN CONJUNTO DE METODOS Y TECNICAS OPERACIONES Y PROCEDIMIENTOS DESTINADOS AL AISLAMIENTO, CLONAJE CARACTERIZACION, MODIFICACION, Y EXPRESION DEL MATERIAL GENETICO (DNA)

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ES UN AMPLIO RECETARIO QUE INCORPORA PROCEDIMIENTOS MUY DIVERSOS Y EN CONSTANTE ACTUALIZACION. SUS LIMITES SE VEN MODIFICADOS DIA A DIA LO QUE HACE MUY DIFICIL LA PRESENTACION ACTUAL Y COMPLETA QUE INCLUYE:

* Electroforesis en geles y capilar * Electroforesis de geles en gradientes denaturantes (DGGE) * DNA complementario (DNAc)

* Banco genómico y banco de genes. * Mapeo de genes: mapas físicos, de genes. * Hibridación “in situ” fluorescente (FISH) * Transgénesis

BANCO DE GENES

ENZIMAS DE RESTRICCION

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Secuenciación del DNA y de genomas Enzimología del DNA Enzimas de restricción Vectores de clonación: Plásmidos, BACs, YACs, Charon, Virus, Lanzaderas etc.

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Espectrofotometría UV Microarrays (“chips” de DNA) MARCADORES MOLECULARES DE DNA

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El DNA unido a una matriz proteica forma el cromosoma en los eucariotas y en las bacterias (procariotas) se presenta “desnudo” La información para construir proteínas está contenida en la secuencia de bases del DNA y es traducida a partir de un código de señales.

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Son segmentos o fragmentos de DNA obtenidos o identificados por cualquier procedimiento y que corresponden a regiones expresadas o no del genoma de un individuo.

Generalmente son fragmentos de zonas no expresadas del genoma o sea cualquier fragmento o segmento o “pedazo” de DNA Incluso hasta de dos simples nucleótidos (SSR) Si el fragmento de DNA incluye a una zona expresiva del genoma se le denomina “marcador genético” o “marcador de expresión”

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El DNA es una molécula gigantesca y de una increíble longitud.

El DNA de una sola bacteria mide alrededor de un metro!!! (una bacteria mide 1 micra ) El DNA de un cerebro humano, o de una planta de maíz extraído y puesto en línea tiene una longitud de…

…CIENTO CINCUENTA MILLONES DE KILOMETROS MULTIPLICADO X 15!!!!

O SEA QUE ESTE DNA PODRIA IR Y VOLVER DE LA TIERRA AL SOL UNAS…150 VECES!!!

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Si utilizamos un enzima de restricción y cortamos el DNA de un individuo en 20,000 o 30,000 fragmentos de diferente longitud, tamaño o peso (fragmentos de restricción)…

Entonces tendríamos unas 20,000 o 30,000 “huellas digitales” moleculares o “finger printings”…

Cualquiera de esos fragmentos puede servir para identificar a un individuo (sea humano, planta o microorganismo) aunque no se sepa su secuencia de bases

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En la actualidad se utiliza esta tecnología llamada de “marcadores moleculares” para identificar, caracterizar individuos de todo tipo incluyendo virus con un margen de seguridad de… 99,99999% Los marcadores moleculares son en la actualidad una tecnología fundamental e indispensable para:

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Determinación de las relaciones filogenéticas y taxonómicas entre individuos La estimación de la semejanza genética Análisis de la diversidad genética Identificación de genes Organización del germoplasma Caracterización de cepas de microorganismos Múltiples aplicaciones en la medicina, industria alimentaria, terapia génica, transgénicos, medio ambiente, genética, bioingeniería etc.

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Técnicas basadas en sondas radioactivas (RFLPs) Técnicas basadas en la PCR (RAPiDs) Mixtos Microarrays QTLs

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RFLPs: Polimorfismo en la longitud de Fragmentos de Restricción RAPDs: DNA Polimórfico Amplificado al Azar SSRs: Secuencia Simple Repetida (microsatélites) VNTRs: Número Variable de Secuencias Repetidas en Tándem (Minisatélites) AFLPs: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados

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Otras Técnicas: SNPs, STS, FLAPs, GRAPs etc.

A la fecha se reportan alrededor de unas 40 técnicas que combinan uno o varios procedimientos y la tendencia es mejorar la discriminación del polimorfismo, la repetitibilidad, la Codominancia, la automatización, simplicidad y el costo.

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Caracterizar (identificar) molecularmente individuos y/o colecciones de individuos (plantas, animales, microorganismos etc Identificar secuencias de DNA en el genoma de los individuos que permitan su diferenciación y su utilidad potencial.

Almacenar información en banco de datos a nivel local, regional y nacional para su uso y para su identidad como propiedad de uso.

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EXTRACCION DE DNA

DIGESTION

PCR DGGE VISUALIZACION EN UV ANALISIS DE BANDAS (NTSYS/ UPGMA)

EVALUACION Y RESULTADOS

1. EXTRACCION DE DNA 

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Eliminación de la matriz proteica, RNAs y componentes celulares; paredes, membranas celulares órganos etc.

Se utilizan sustancias que atacan a las proteínas y las precipitan y procesos físicos como la homogenización y centrifugación

________________________________ ___ Identificaci贸n molecular AISLAMIENTO DE DNA

Figura 4.4: DNA gen贸mico de cepas Azospirillum sp, Azotobacter sp. y Pseudomonas sp. visto en electroforesis en gel de agarosa al 1%, (M) Marcador de peso molecular Lambda DNA/Hind III, (1) 11225, (2) 23134, (3) 14242 (4)32155 , (5) 34235.(6) E coli

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LOS ENZIMAS DE RESTRICCION CORTAN AL DNA EN SITIOS ESPECÍFICOS Y ORIGINAN MILES DE FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAÑOS Y PESOS ESTOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION PUEDEN SER SEPARADOS DE ACUERDO A SU PESO Y TAMAÑO. SE UTILIZAN COMO MARCADORES O HUELLAS DACTILARES (“fingerprintings”) PARA IDENTIFICAR INDIVIDUOS

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La PCR es una técnica poderosa que permite multiplicar, clonar fragmentos de DNA: de un solo fragmento se pueden obtener hasta 30 000 000 fragmentos en un tiempo determinado Para clonar el DNA se necesita: Desnaturalizar al DNA (el DNA se abre en dos hebras)) a una temperatura de 92-94 ºC

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Un iniciador o primer, (un pequeño fragmento de DNA) que permite la actividad del enzima Taq polimerasa y se “pega” a una de las hebras del DNA a una temperatura de 40 -57 ºC.

Taq polimerasa: Enzima que es capáz de sacar “copias” del una hebra del DNA y actúa a 72 ºC

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Cada ciclo comprende tres pasos: Desnaturalización: (92-94 ºC)

Alineación/Hibridación ( 47-56 ºC) Extensión (72ºC)

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Estas tres temperaturas son conjugadas en un termociclador.

También se necesita: ClMg 2 mM DNTP (oligonucleótidos) Solución buffer 10X

Estos elementos forman el “máster mix” que se mezclan en un tubo Eppendorf y se disponen en el termociclador

PERKINS ELMER 2400

MEZCLA DE REACCION Reactivos Volumen c.c. final H2O 11,3 Buffer 10x 2,6 1X DNTP 1 mM 5,2 0,2 Mm PRIMER 10uM 1,3 0,5 Mm MgCl2 23 mM 1,6 1,5 ng DNA 1,0 30 ng Taq DNA pol 0,36 uL

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Nº PASOS 1 2 3 4 5 6 7

Tº (º C) 94 37 72 94 37 72 72

T (min) 1.0 1.0 1.0 0.5 1.0 1.5 5,0

nº CICLO 1 1 1 40 30 30 1

4. ELECTROFORESIS en geles de gradiente

denaturalizante (DGGE)

El DNA amplificado vía PCR incluido en un soporte (gel de poliacrilamida) es sometido a un campo eléctrico en una cámara i en la cubeta DGGE que incluye un sistema para producir gradientes lineales denaturantes de temperatura (Tm).

El DNA corre hacia el polo positivo a través del gel en este ambiente denaturante diferencial debido a que posee una carga neta total negativa .

Los fragmentos pequeños corren mas de prisa y quedan en la parte inferior del gel.

________________________________ ___ IDENTIFICACIÓN MOLECULAR

AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN 9-27-1542 DE LA ZONA 16S rDNA

Productos de PCR de la región 9-27-1542 M Marcador 100bp DNA ladder plus (cada banda representa 100pb) 1) Ecoli , carril 3,6,9,10,11,13,15,16,18 resultado de Pseudomona fluoresces (60ng/µL) carril 4,5,7,8,12,14,17 resultado de Azotobacter (40ng/µL).

Figura 4.5

________________________________ ___ IDENTIFICACIÓN MOLECULAR

RFLP – RNA ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE RESTRICCIÓN DE LA REGIÓN 9-27 – 1542 DE BACTERIAS Azotobacter sp

Figura 4.6: Resultados de los cortes con las enzimas de restricción Alu I, Hpa

II y Rsa de los amplificados de Azotobacter.

________________________________ ___ IDENTIFICACIÓN MOLECULAR RFLP – rDNA ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE RESTRICCIÓN DE LA REGIÓN 9-27 – 1542 DE BACTERIAS Azospirillum sp.

Figura 4.6 . Resultados de los cortes con las enzimas de restricción Alu I, Hpa II y Rsa de los amplificados de Azospirillum

________________________________ ___ IDENTIFICACIÓN MOLECULAR RFLP – RDNA ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE RESTRICCIÓN DE LA REGIÓN 9-27 – 1542 DE BACTERIAS Pseudomonas fluorescens .

Figura 4.6 . . Resultados de los cortes con las enzimas de restricción Alu I, Hpa II y Rsa de los amplificados de Pseudomona fluorescens (resultado negativo).

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GENE BANK BLAST

ANALISIS BIOINFORMÁTICO ________________________ ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

________________________________ ___ ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

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Agrupamiento UPGMA de las cepas de Azospirillum realizado con los cortes de la enzima de restricci贸n Alu I, Hpa II,

Azospirillum - Alu I

Azospirillum-Hpa ll 11242

11242

12141

12141

11232

12121 12145

14211

E.coli

11242

13245

12121

0.35

0.49

0.63 Coefficient

0.78

11241

12145

11232

13245

E.coli

11241

14211

0.92

0.29

0.39

0.49

0.60 0.70 Coefficient

0.80

0.90

1.00

__________ Agrupamiento UPGMA de las cepas de Azotobacter realizado con Alu I y Hpa II s cortes de la enzima de restricci贸n Alu I, Hpa II, Rsa I Azotobacter- Hpa II Azotobacter- Alu I

21112 21112

21151 21151

24114 24114

24113 24113

22215 22215

E.coli E.coli

21152

21152

24115 24115

24133

24133

21123

21123

21243

21243

E.coli

E.coli 0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0.5

0.6

0.7

0.7

1.0

Coefficient

Coefficient

Azotobacter - Rsa I 21112 24113 24114 21151 24115 21112

21123 21243 22215 21152 Ecoli 24133 0.2

0.3

0.8

0.4

0.5

0.7

Coefficient

0.8

0.9

1.0

0.9

0.9

1.0

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. Determinar políticas y estrategias, acciones para la colección, caracterización y evaluación de los R.G. para promover su uso respetando el derecho de pueblos y naciones involucrados. . Unificar Instituciones y tecnologías para el manejo, utilización y conservación de los R.G. Compartir información. . Desarrollar Proyectos Integrales de gestión, colección, caracterización (morfológica, bioquímica, molecular) y conservación. .Desarrollar proyectos de transferencia tecnológica.

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Fuga y apropiación ilìcita de genes y/o material genético 18 casos relacionados con maca, Sachainti (2) Yacòn, camu camu y pasuchaca.

Hay muchos otros casos reportados de fuga de genes: Quinua, oca, mashua, olluco, arracacha, sachatomate, aguaymanto etc

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En el caso de maca una empresa patentó un extracto (2012) y desarrolló productos que le reportaron $ 200,000 mensuales, y en un año 2,4 millones de dólares y en 10 años 20 millones de dólares, los cuales no fueron redituados al Perú (Andina. Agencia Peruana de Noticias)

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1. capacitación continua y permanente de recursos humanos.

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2. Equipamiento.

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3. Medios de integración

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4. Investigación compartida en autopistas informáticas veloces.

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5. Estandarizaciòn de métodos y técnicas.

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