CUADERNO DE PRÁCTICAS
CURSO DE VITICULTURA 10-Septiembre-2009 Área de Tecnología de Los Alimentos Facultad de Ciencias Químicas (UCLM)
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1. DETERMINACIÓN DE VOLÁTILES MAYORITARIOS EN VINOS El vino es probablemente la bebida más compleja que existe, y es precisamente en su aroma donde reside dicha complejidad. La fracción volátil de un vino está constituida por gran número de compuestos de familias químicas diferentes y en concentraciones muy variables que van desde los tantos por cien hasta las ng/l. Los compuestos aromáticos que se encuentran en un vino (ésteres, alcoholes, aldehídos, ácidos, etc.) pueden haberse originado tanto en la maduración de la uva, como durante las etapas de elaboración y envejecimiento del mismo.
De todos los compuestos del aroma del vino se consideran volátiles mayoritarios aquellos que se encuentran en cantidades mínimas de 0.5-5.0 mg/l. Este grupo de volátiles, entre los que se encuentran el metanol, acetato de etilo y los alcoholes superiores, se pueden analizar mediante inyección directa de las muestras de vino en el sistema cromatográfico, previa adición de un estándar interno.
OBJETIVO: El objetivo de esta práctica es realizar el análisis cuantitativo de los compuestos volátiles mayoritarios formados en el vino durante la fermentación alcohólica mediante cromatografía de gases.
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MATERIAL Y MÉTODOS Para el análisis de la fracción de los compuestos volátiles mayoritarios, las muestras serán sometidas a centrifugación durante 30 minutos a 12000 rpm y 4ºC para eliminar las posibles partículas sólidas. 90 μL de 2-pentanol (Sigma-Aldrich) de concentración 1 g/L serán añadidos como patrón interno, a 1.5 mL de vino. Las muestras serán inyectadas directamente al cromatógrafo de gases 5890N (Hewlett-Packard), equipado con un detector de ionización de llama (FID) y una columna capilar CP-Wax (50 m x 0.25 mm d.i. x 0.2 µm de espesor de fase). La temperatura del inyector y detector serán de 220 y 250ºC respectivamente. El volumen de inyección 1μL y el gas de secado N2 a un flujo de 1 mL/min. La rampa de temperatura del horno: 40ºC (10 minutos), 4 ºC/min hasta alcanzar 130 ºC, y 5 ºC/min hasta 210 ºC (16 minutos).
Los compuestos identificados de esta forma serán: acetaldehído, acetato de etilo, metanol,
1-propanol,
isobutanol,
2-metil-1-butanol
y
3-metil-1-butanol.
La
identificación será llevada a cabo mediante comparación de los tiempos de retención con los correspondientes standards comerciales (Sigma-Aldrich). Para la cuantificación utilizaremos rectas de calibrado calculadas para concentraciones crecientes de dichas sustancias patrón en soluciones hidroalcohólicas al 12% v/v. Compuesto Concentración (g/L) Ecuación de la recta acetaldehído 3.90 y = 0.50x acetato de etilo 4.50 y = 0.72x metanol 2.37 y = 0.62x 1-propanol 2.40 y = 1.10x isobutanol 2.40 y = 1.29x 2-metil-1-butanol 2.46 y = 1.17x 3-metil-1-butanol 8.10 y = 1.27x y.- área pico / área patrón interno x.- concentración pico / concentración patrón interno
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2.
DETERMINACIÓN
DE
VOLÁTILES
MINORITARIOS
EN
VINOS
MEDIANTE EXTRACCION SPE-GC/MS y SDE-GC/MS Muchos de los compuestos volátiles con propiedades organolépticas más relevantes en el aroma del vino se encuentran en concentraciones bajas o incluso en concentraciones traza (ppm, ppb), como es el caso de terpenos, norisoprenoides, fenoles volátiles, etc. En muchas ocasiones se requiere la separación previa de estas moléculas de la matriz generalmente acuosa y no volátil en la que se encuentran. Para ello necesitamos utilizar alguna técnica de extracción y concentración previa como la Extracción en Fase Sólida (SPE) basada base en la retención por adsorción de los analitos de interés en polímeros porosos, o la Extracción y Destilación Simultánea (SDE) basada en una extracción y destilación continua de los aromas.
OBJETIVO: El objetivo de esta práctica es realizar el análisis de los volátiles minoritarios del vino mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.
MATERIAL Y MÉTODOS a) Extracción de los compuestos volátiles minoritarios mediante la técnica de Extracción en Fase Sólida (SPE) - Acondicionamiento del cartucho de 500 mg de fase polar con 10 mL de diclorometano, seguidos de 5 mL de metanol y 10 mL de solución hidroalcohólica (10% v/v) con un flujo aproximado de 2 mL/min aproximadamente, para activar los puntos activos de unión de volátiles al cartucho. - Elución de 100 mL de vino, a la que se añadirán 40 μL de 4-nonanol de 1g/L como patrón interno, a través del cartucho.
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- Lavado con 50 mL de agua destilada, con el fin de eliminar los compuestos volátiles hidrofílicos no deseados, tales como azúcares. - Elución de los compuestos volátiles deseables con 10 mL de diclorometano. Los extractos orgánicos obtenidos se congelarán durante unas horas con el fin de eliminar las posibles trazas de agua que hayan podido ser eluídas en el proceso de extracción. Posteriormente, dicha fracción será concentrada en una corriente de nitrógeno hasta aproximadamente 200μL, y queda preparada para su posterior inyección en el cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas (GC-MS).
b) a) Extracción de los compuestos volátiles minoritarios mediante la técnica de Extracción y Destilación Simultánea (SDE) - Utilizar 50 ml de vino con 140 μL de 4-nonanol de 1g/L como patrón interno. - Se utilizarán 2 ml de diclorometano para recoger los volátiles. - El tiempo total de extracción será de 2 horas. - Concentrar con nitrógeno hasta un volumen aproximado de 200 l. Análisis mediante Cromatografía de Gases-Espectrometría de masas Un cromatógrafo de gases modelo 6890N acoplado a un detector de masas modelo 5973 inert (Agilent Technologies), será utilizado para el análisis de los componentes volátiles minoritarios del aroma del vino, con una columna capilar BP-21 (60.0 m x 0.25 mm d.i. x 0.25 µm espesor de fase). La temperatura del inyector: 250ºC y la utilizada para el horno fue programada de la siguiente manera: 70 ºC (5 minutos), 1 ºC/min hasta alcanzar 95 ºC (10 minutos), 2 ºC/min hasta 200 ºC (40 minutos). Helio como gas portador (1 mL/min). El volumen de inyección será de 1μL, en modo splitless. La ionización de los compuestos será efectuada en modo de impacto electrónico, a 70eV. La temperatura de la fuente de ionización: 230ºC y el rango de adquisición de masas de 40 a 450 a.m.u.
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