Raccolta del seme

TECNICHE CHIRURGICHE E MINI-INVASIVE DI RACCOLTA DEL SEME: STATO DELL’ ARTE Prof. ALESSANDRO NATALI Responsabile Servizio di Andrologia Urologica Clinica Urologica I Università di Firenze

QUANDO E’ NECESSARIO RICORRERE A TECNICHE CHIRURGICHE E MININVASIVE DI RACCOLTA DEL SEME ?

• AZOOSPERMIA OSTRUTTIVA ( ESCRETORIA - OA ) (senza possibilità di ripristino di almeno una via seminale)

• AZOOSPERMIA SECRETIVA ( NON-OSTRUTTIVA - NOA )

UNA VOLTA RECUPERATI GLI SPERMATOZOI QUALI SONO LE POSSIBILITA’ DI UTILIZZO ?

ART FIVET/ICSI • A FRESCO • CRIOCONSERVAZIONE

+

COME DEVONO ESSERE CONSIDERATI I RISULTATI DELLE VARIE TECNICHE DI ART? GLOSSARIO sec. WHO ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGY SUCCESS RATES Current Practices and Controversies in ART “Medical, Ethical and Social Aspects of ART” Geneve 2001

FERTILIZATION PENETRAZIONE SPONTANEA O FORZATA DELLO SPERMATOZOO NELL’ OVULO CON FUSIONE DI MATERIALE GENETICO CUI CONSEGUE LO SVILUPPO DI UNO ZIGOTE (CELLULA DIPLOIDE)

FERTILIZATION RATE PERCENTUALE DEL NUMERO DI OVOCITI FECONDATI (ZIGOTI) DIVISO IL NUMERO DI OVOCITI INSEMINATI

Ovociti Fecondati Ovociti Inseminati

CLEAVAGE INIZIO DELLA DIVISIONE CELLULARE DELLO ZIGOTE CON LO SVILUPPO DELL’ EMBRIONE

CLEAVAGE RATE PERCENTUALE DEL NUMERO DI EMBRIONI OSSERVATI DIVISO IL NUMERO DEGLI OVOCITI FECONDATI Embrioni osservati Ovociti Fecondati

IMPLANTATION PENETRAZIONE E ANNIDAMENTO DELLA BLASTOCISTI PRIVA DI ZONA PELLUCIDA NELL’ ENDOMETRIO

IMPLANTATION RATE PERCENTUALE DEL NUMERO DI CAMERE GESTAZIONALI OSSERVATE DIVISO IL NUMERO TOTALE DI EMBRIONI TRASFERITI

Camere gestazionali Embrioni trasferiti

DELIVERY RATE NUMERO DI PARTI IN PERCENTUALE SUI CICLI INIZIATI, PICK UP o EMBRYO-TRANSFER (deve sempre essere indicato il denominatore)

LIVE-BIRTH DELIVERY RATE NUMERO DI PARTI (CON NATI VIVI) IN RAPPORTO A CICLI INIZIATI, PICK-UP O EMBRYO-TRANFER (deve essere sempre indicato il denominatore)

SUCCESS RATE Live-birth deliveries Embryo-tranfer procedures

GRAVIDANZA CLINICA (CLINICAL PREGNANCY) DIMOSTRAZIONE DI GRAVIDANZA ATTRAVERSO PARAMETRI ULTRASONOGRAFICI (Camera Gestazioinale e Battito Cardiaco Fetale).

INCLUDE LE GRAVIDANZE ECTOPICHE

(CLINICAL) PREGNANCY RATE PERCENTUALE DI GRAVIDANZE CLINICHE RISPETTO AI CICLI INIZIATI, PICK-UP O EMBRYO-TRANSFER

QUANDO SI PARLA DI PR, OCCORREREBBE SEMPRE INDICARNE IL DENOMINATORE

• PR/INITIATED CYCLE • PR/PICK-UP • PR/EMBRYO-TRANSFER

ONGOING PREGNANCY RATE PERCENTUALE DEL NUMERO DI GRAVIDANZE IN EVOLUZIONE ( > 12 SETTIMANE) DIVISO IL NUMERO DI GRAVIDANZE CLINICHE TOTALI Gravidanze in evoluzione Gravidanze cliniche totali

TECNICHE CHIRURGICHE E MINI-INVASIVE DI RACCOLTA DEL SEME

ALLA RICERCA DELLO SPERMATOZOO PERDUTO !!!

AZOOSPERMIE OSTRUTTIVE (OA) 1) TESTICOLO ED EPIDIDIMO Tecniche CHIRURGICHE * MICROSURGICAL EPIDIDYMAL SPERM ASPIRATION (MESA) * TESTICULAR SPERM EXTRACTION ( TESE ) * EPIDIDYMAL SPERM EXTRACTION (ESE) Tecniche PERCUTANEE * PERCUTANEOUS EPIDIDYMAL SPERM ASPIRATION (PESA) *TESTICULAR SPERM ASPIRATION (TESA) / TESTICULAR FINE NEEDLE ASPIRATION (TEFNA) * BIOPSIA PERCUTANEA DEL TESTICOLO (BPT)

2) DEFERENTE E VIE SEMINALI DISTALI * SEMINAL TRACT WASHOUT (STW) * MICROSURGICAL VASAL SPERM ASPIRATION (MVSA) * DISTAL SEMINAL TRACT ASPIRATION (DISTA) * TRANS-RECTAL ULTRASONICALLY CYST ASPIRATION (TRUSCA)

AZOOSPERMIE NON OSTRUTTIVE ( NOA ) Tecniche CHIRURGICHE * TESTICULAR SPERM EXTRACTION (TESE) Tecniche PERCUTANEE * TESTICULAR SPERM ASPIRATION (TESA) * TESTICULAR FINE NEEDLE ASPIRATION (TEFNA)

AZOOSPERMIA OSTRUTTIVA -OA-

RECOVERY SPERMATOZOARIO TESTICOLO ED EPIDIDIMO Tecniche CHIRURGICHE * MICROSURGICAL EPIDIDYMAL SPERM ASPIRATION (MESA) * TESTICULAR SPERM EXTRACTION ( TESE ) * EPIDIDYMAL SPERM EXTRACTION (ESE) Tecniche PERCUTANEE * PERCUTANEOUS EPIDIDYMAL SPERM ASPIRATION (PESA) *TESTICULAR SPERM ASPIRATION (TESA) / TESTICULAR FINE NEEDLE ASPIRATION (TEFNA) * BIOPSIA PERCUTANEA DEL TESTICOLO (BPT)

QUANDO RICORRERVI ?

• In caso di AO da verisimile ostruzione prossimale [ intratesticolare (rete testis) o epididimo deferenziale], con impossibilità di ripristino di pervietà di almeno una via seminale con ricanalizzazioni microchirurgiche

VASOVASOSTOMIA

VASOEPIDIDIMOSTOMIA

TECNICHE CHIRURGICHE in OA * MICROSURGICAL EPIDIDYMAL SPERM ASPIRATION (MESA) * TESTICULAR SPERM EXTRACTION (TESE) * EPIDIDYMAL SPERM EXTRACTION (ESE)

MICROSURGICAL EPIDIDYMAL SPERM ASPIRATION ( MESA ) • Silber 1987 • Prima tecnica di recupero di spermatozoi per FA • Recupero di spermatozoi dall’epididimo con tecnica microchirurgica ed ausilio di MO • MESA tradizionale : anestesia generale, esteriorizzazione del testicolo,ingrandimento 20-30x, agocannula 22-23G, apertura ed aspirazione da un tubulo epididimario.

• Mini-MESA : anestesia locale, incisione a finestra sulla cute scrotale attraverso la quale si lussa la testa dell’epididimo, si procede come per MESA tradizionale.

• Vantaggi : recupero migliore in termini di qualità e quantità degli spermatozoi ( > 95%) per FIVET/ICSI a fresco ma soprattutto per crioconservazione, minima contaminazione ematica degli spermatozoi, possibilità di scegliere i tubuli epididimari migliori.

• Svantaggi : tecnica complessa effettuabile solo in Centri d’eccellenza, costi elevati.

MESA

MESA (dettaglio aspirazione)

MESA da dotti efferenti della rete testis

MESA/ICSI Pregnancy rate Cicli iniziati

Curr. Opin. Urol. 1994

MESA/ICSI in OA Cornell University Experience ( 76 cicli) New York 1998

Tasso di fertilizzazione

80% (665/833)

Gravidanze cliniche

75% (57/76)

Gravidanze in corso/a termine

64% (49/76)

TESTICULAR SPERM EXTRACTION (TESE) • Silber 1995 • Estrazione di spermatozoi da frammenti con biopsie chirurgiche testicolari semplici o multiple con tecnica a finestra • Anestesia locale (funicolo + cute scrotale) • Vantaggi : non si ledono i tubuli epididimari, recupero di grandi Q spermatozoi per crioconservazione per più cicli FIVET/ICSI • Svantaggi : perdita di parenchima testicolare, contaminazione ematica degli spermatozoi.

TESE CON TECNICA A FINESTRA

TESE/ICSI in OA RISULTATI • Fertilization rate : 60-68% (Ov.fec./Ov.ins.)

• Pregnancy rate : 40-43% (Gr.cl./ET)

EPIDIDYMAL SPERM EXTRACTION (ESE) • Kim 1995 • Asportazione chirurgica di porzioni più o meno cospicue di testa dell’epididimo per estrazione degli spermatozoi • Anestesia locale (funicolo + cute scrotale), tecnica sovrapponibile a TESE con lussazione della testa dell’epididimo dalla finestra praticata sulla cute scrotale • Vantaggi : rapida, Q di spermatozoi sufficienti per crioconservazione (95%) • Svantaggi : invasiva, demolitiva, non ripetibile, possibilità di ematomi scrotali, alta contaminazione ematica del frammento da trattare

ESE

TECNICHE PERCUTANEE in OA * PERCUTANEOUS EPIDIDYMAL SPERM ASPIRATION (PESA) *TESTICULAR SPERM ASPIRATION (TESA) / TESTICULAR FINE NEEDLE ASPIRATION (TEFNA) * BIOPSIA PERCUTANEA DEL (BPT)

TESTICOLO

PERCUTANEOUS EPIDIDYMAL SPERM ASPIRATION (PESA) • Craft 1995 • Aspirazione percutanea di spermatozoi dall’epididimo tramite butterfly (21-23G) • Anestesia locale (funicolo + cute scrotale) • Vantaggi : semplice, mininvasiva, facilmente ripetibile, permette discreto recupero di spermatozoi (60% dei casi) per effettuare FIVET/ICSI a fresco • Svantaggi : Q spermatozoi recuperati non sono assolutamente sufficienti per crioconservazione per cui la procedura deve essere ripetuta per ogni ciclo di FIVET/ICSI, rischi di ematoma scrotale.

PESA

PESA/ICSI in OA RISULTATI • Fertilization rate : 42-46% (Ov.fec./Ov.ins.)

• Pregnancy rate : 19-50% (Gr.cl./ET)

TESTICULAR SPERM ASPIRATION TESTICULAR FINE NEEDLE ASPIRATION ( TESA/TEFNA ) • Tournaye 1998, Sheynkin 1998 • Aspirazione percutanea di spermatozoi dal testicolo tramite butterfly (21-23 G) collegato ad una siringa (TESA), o direttamente con siringa con ago sottile (TEFNA) • Anestesia locale (funicolo + cute scrotale) • Vantaggi : semplice, facilmente ripetibile, buon recupero di spermatozoi (80% dei casi) per FIVET/ICSI a fresco • Svantaggi : Q spermatozoi non sufficiente per crioconservazione per cui necessità di ripetizione per ogni ciclo FIVET/ICSI

TESA/TEFNA

TESA-TEFNA/ICSI in OA RISULTATI • Fertilization rate : 42-46 % (Ov.fec./Ov.ins.)

• Pregnancy rate : 40-42% (Gr.cl./ET)

BIOPSIA PERCUTANEA DEL TESTICOLO (BPT) • Girardi 1997, Schlegel 1999 • Recupero di spermatozoi percutaneo con pistola automatica per biopsia con ago 14G con escursione di 1 cm • Anestesia locale (funicolo spermatico + cute scrotale) • Vantaggi : buone Q di spermatozoi recuperati • Svantaggi : possibilità di formazione di ematoceli da evacuare chirurgicamente

RECOVERY SPERMATOZOARIO DEFERENTE VIE SEMINALI DISTALI * SEMINAL TRACT WASHOUT (STW) * MICROSURGICAL VASAL SPERM ASPIRATION (MVSA) * DISTAL SEMINAL TRACT ASPIRATION (DISTA) * TRANS-RECTAL ULTRASONICALLY CYST ASPIRATION (TRUSCA)

QUANDO RICORRERVI ? • In caso di AO da verisimile ostruzione distale (vescichette seminali, dotti eiaculatori, deferente distale) o da alterazione funzionale della progressione degli spermatozoi nelle vie seminali • Oggi sicuramente meno utilizzate rispetto al passato, in quanto si preferisce, per il recovery spermatozoario, agire piÚ prossimalmente a livello epididimo - testicolare

SEMINAL TRACT WASHOUT (STW) • Colpi 1992 • Lavaggio anterogrado delle vie seminali a valle delle code degli epididimi, attraverso il quale gli spermatozoi vengono sospinti in vescica e qui recuperati tramite cateterismo vescicale e crioconservati o utilizzati a fresco • Tecnica : anestesia locale funicolo spermatico bilaterale, esteriorizzazione deferenti con ago 25G, infusione anterograda di 20 ml per parte di T6 medium • Indicazioni : disturbi funzionali dello svuotamento delle vie seminali distali (mielolesi, diabete giovanile, esiti LNRP, aneiaculazione psicogena) • Vantaggi : semplice, economico, Q di spermatozoi paragonabile alla TESE con unico prelievo • Precauzioni : rispetto dell’ arteria e vena deferenziale, accuratezza nell’incannulamento del deferente

STW

MICROSURGICAL VASAL SPERM ASPIRATION ( MVSA ) • Hirsh 1993 • Aspirazione microchirurgica di spermatozoi dal lume del deferente • Indicazioni : ostruzione deferenziale iatrogena, eiaculazione retrograda o aneiaculazione nei mielolesi in cui fallisce vibromassaggio o elettroeiaculazione • Anestesia locale ( cute scrotale ) . Incisione cutanea con isolamento ed emisezione del deferente, agocannula 23-24G nel moncone prossimale del deferente, sutura microchirurgica (10/0) del deferente emisezionato • Vantaggi : recupero di buone Q di spermatozoi anche per crioconservazione • Svantaggi : richiede tecnica microchirurgica per la chiusura del deferente pena un’ostruzione iatrogena, rispetto alle più semplici TESA/TESE

Isolamento deferente

MSVA

DISTAL SEMINAL TRACT ASPIRATION (DISTA) • Jarow 1994 • Aspirazione ecoguidata, in anestesia locale con ago tipo Chiba 20-22G, per via transperineale o transrettale del liquido seminale contenuto nelle VS • Indicazioni : ostruzione non cistiche, solitamente infiammatorie, dei dotti eiaculatori non trattabili con TURED (resezione endoscopica del dotti eiaculatori) • Vantaggi : minimamente invasiva, ripetibile, rapida, economica, recovery spermatozoario buono anche per crioconservazione • Svantaggi : necessità di un buon apparecchio ecografico, occasionali infezioni ascendenti delle vie seminali

Dotto eiaculatorio ostruito

ANATOMIA DEI DOTTI EIACULATORI

(dilatata)

AGO

DISTA

TRANS-RECTAL ULTRASONICALLYGUIDED SPERM CYST ASPIRATION (TRUSCA) • Colpi 1995 • Aspirazione ecoguidata transrettale in anestesia locale con ago tipo Chiba 20-22 G di spermatozoi da cisti mulleriane o del seno uro-genitale comunicanti con uno o entrambi i dotti eiaculatori • Metodica minimamente invasiva, ripetibile, rapida, economica, recovery spermatozoario buono anche per crioconservazione

CISTI MULLERIANA

AZOOSPERMIE NON OSTRUTTIVE -NOA-

ASPETTI CONCETTUALI (NOA) • I quadri istologici, con possibilità di coesistenza, delle NOA possono essere : - aplasia germinale completa - arresto maturativo premeiotico - ipospermatogenesi estrema (foci di cc. germinali)

ASPETTI CONCETTUALI (NOA) • Fino a prima del 1997 la Letteratura riportava tra NOA e OA un “Delivery rate”(numero di parti/cicli iniziati) sovrapponibile DR 33% NOA e OA

• Più recentemente (Silber 2003), ha riportato un “Delivery rate”

DR 29% per le NOA

DR 39% per le OA

RECOVERY SPERMATOZOARIO AZOOSPERMIE SECRETIVE ( NOA ) Tecniche PERCUTANEE * TESTICULAR SPERM ASPIRATION (TESA) * TESTICULAR FINE NEEDLE ASPIRATION ( TEFNA) Tecniche CHIRURGICHE * TESTICULAR SPERM EXTRACTION (TESE)

TESA/TEFNA in NOA • Procedura analoga a quella nelle OA • Tasso di recupero: 34,2%

TESA/TEFNA

TESE in NOA • Procedura analoga a quella nelle OA • Prelievo singolo : tasso di recupero 40,8% • Prelievo multiplo su entrambi i testicoli : tasso di recupero 52,6% • Micro-TESE (Schlegel 1999) : con l’ausilio del MO (20-25x) si esegue un’ampia incisione “equatoriale” dell’albuginea testicolare con lussazione all’esterno di una vasta porzione di parenchima testicolare, in cui si riesce a microdissezionare i tubuli di Ø maggiore prossimi alle arterie dove più frequentemente si trovano foci di spermatogenesi attiva, asportando meno di 10 mg di parenchima.

Tasso di recupero 60%

EAU Guidelines on Male Infertility 2005

PROBLEMATICHE 1

Circa il 50% degli uomini con spermatozoi estraibili dai testicoli,in caso di NOA, non avrebbero beneficiato di una opzione terapeutica potenzialmente efficace, se fosse stato prelevato un singolo campione bioptico Schlegel PN 1994

PROBLEMATICHE 2 Schlegel PN 2001

I vasi che irrorano il testicolo penetrano la tunica albuginea vicino ai dotti efferenti, ma i rami di calibro maggiore decorrono appena al di sotto dell’albuginea prima di approfondirsi nel parenchima testicolare M.O. permette di rispettare queste arterie

UtilitĂ del M.O. per evidenziare i vasi (A), zone con normale spermatogenesi (B) e per prelevare maggiori Q di tessuto testicolare

TESE/Micro-TESE/ICSI in OA-NOA ( con spermatozoi crioconservati) RISULTATI ( Centri Americani e Italiani)

TESE/Micro-TESE/ICSI ( con spermatozoi crioconservati)

Cornell University Experience ( 81 cicli ICSI) New York 1998 •Tasso di recupero 58% (47/81) •Fertilization rate 60% •Gravidanze ( bimbo in braccio) 19 •Gravidanze ciclo 23% •PR (embrio-transfer) 33%

TESE/Micro-TESE/ICSI ( con spermatozoi crioconservati)

Genetic Reproduction Center ( 87 cicli ICSI) Porto-Portugal (Prof. Sousa) 2002 •Tasso di recupero 65,51% (57/87) •Fertilization rate 71,4% •Gravidanze ( bimbo in braccio) 29 •Gravidanze ciclo 28% •PR (embrio-transfer) 31,7%

TESE/Micro-TESE/ICSI (con spermatozoi crioconservati)

UD Andrologia HSP (75 cicli ICSI) Milano ( Prof. Colpi) 2003 •Tasso di recupero 78,6%(59/75) •Fertilization rate 32,86% •Gravidanze ( bimbo in braccio) 6 •Gravidanze ciclo 15,38 % •PR (embrio-transfer) 24,61%

TESE/Micro-TESE/ICSI (con spermatozoi crioconservati)

Servizio Fisiopatologia Riproduzione (24 cicli ICSI)

Firenze ( Prof. Natali-Noci) 2002-2005 •Tasso di recupero 83% (20/24) •Fertilization rate 34,42% (53/154) •Gravidanze (bimbo in braccio) 3 •Gravidanze ciclo 16,6% (3/18) •PR (embrio-transfer) 9,67% (3/31)

CONCLUSIONI

• Oggi è possibile recuperare spermatozoi dal testicolo o dalle vie seminali ottenendo con la ICSI tassi di gravidanza buoni in OA ed accettabili in NOA • Con la crioconservazione spermatozoaria si sottopone il paziente ad un unico intervento (chirurgico o percutaneo) temporizzando successivamente la ICSI • In linea generale un Centro che offre questo tipo di prestazione deve poter padroneggiare tutte le tecniche di recovery spermatozoario (percutanee e chirurgiche), passando anche nel corso della stessa procedura da una all’altra qualora non si recuperasse del materiale sufficiente • In linea di principio tutti i dati della letteratura sono concordi nell’attribuire alle tecniche chirurgiche, attuate con tecniche mini-invasive, un tasso di recupero spermatozoario quantitativamente e qualitativamente migliore

PER CUI … E’ MEGLIO ATTUARE NELLE AZOOSPERMIE UN RECUPERO SPERMATOZOARIO A CIELO APERTO O PERCUTANEO ?

• Scelta dipendente da

1) Confidenza del Centro con tecniche microchirurgiche e possibilità o meno di crioconservazione dello sperma 2) Preferenza dei biologi della riproduzione a lavorare con sperma a fresco o crioconservato 3) Preferenza da parte del paziente per un unico intervento a cielo aperto con eventuale crioconservazione o per ripetute procedure percutanee di recovery degli spermatozoi

… E SE NON SI RECUPERANO SPERMATOZOI ?

• Spermatidi “allungati” : spermatozoi testicolari giovani con capacità fecondanti sovrapponibili agli spermatozoi maturi • Spermatidi “rotondi” : cellule riscontrabili nei tubuli seminiferi in rapporto all’arresto della spermatogenesi che presentano strutture di transizione che non esistono nello spermatozoo maturo MAGGIORI PROBABILITA’ DI MALFORMAZIONI NEI NATI A TERMINE

… E SE NON SI RECUPERANO SPERMATOZOI ?

• 1997 Schoysman. Recupero di soli spermatidi “allungati” nelle NOA con TESE

ICSI-fertilization rate 5-6% • 2000 Schoysman

50% di malformazioni nei nati a termine

ROSI Round Spermatid Injection

!!!

ELSI Elongated Spermatid Injection

DATI ANCORA PIU’ RECENTI DELLA LETTERATURA CONFERMANO I TASSI DI SUCCESSO DECISAMENTE MIGLIORI DELLA “ELSI” RISPETTO ALLA “ROSI”

I tassi di successo sono accettabili solo con la

ELSI (Elongated Spermatid Injection) ma non con la

ROSI (Round Spermatid Injection) (Khalili et al, 2002; Sousa et al, 2002)

Procedura ART

Cicli Fertilization rate

Pregnancy rate

ROSI

33

17

0

ELSI

39

53,6

26,3

ICSI

87

71,4

31,7 (Sousa et al, 2002)

… PERO’

EAU Guidelines on Male Infertility 2005

… E SE NON SI RECUPERANO SPERMATIDI ?

• Il trapianto di spermatogoni,

studiato finora su modelli animali, sembra essere prossimo all’applicazione sull’uomo Kojima Y. 2001 Tsabalas S. 2002