Microrganismos de Interesse Agrícola Preservados no Instituto Agronômico de Pernambuco

RG NEWS

IV – Bancos Ativos de Germoplasma

Microrganismos de Interesse Agrícola Preservados no Instituto Agronômico de Pernambuco

Antonio Félix da Costaa, Luciana Gonçalves de Oliveiraa, Ana Carla da Silva Santosb, Athaline Gonçalves Dinizb , Mariele Porto Carneiro Leãoa, José de Paula Oliveiraa e Patricia Vieira Tiagob

a Instituto Agronômico de Pernambuco, Avenida General San Martin, 1371, CEP 50.761 -000, Recife, PE, Brasil. E-mails: felix.antonio@ipa.br, lugoliveira@gmail.com, mariele_carneiro@hotmail.com, jose.paula@ipa.br b Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Biociências, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, Cidade Universitária, CEP 50.670-901, Recife, PE, Brasil E-mails: ana.carla.bio@hotmail.com, athalinediniz@hotmail.com, patiago@hotmail.com

Resumo

O Banco de Germoplasma (BAG) de Microrganismos do Instituto Ag ronômico de Pernambuco foi iniciado na década de 1970 e teve como objetivo, inicialmente, trabalhar com fungos controladores de insetos-pragas de culturas economicamente importantes. Posteriormente, surgiu a necessidade de outros microrganismos serem incor porados à coleção como as bactérias diazotróficas, bacilos de interesse na aquicultura, bacilos de interesse agrícola, bacilos de interesse de saúde pública, fungos micorrízicos arbusculares, fungos fitopatogênicos ao feijoeiro e fungos do gênero Trichoderma. A maioria desses microrganismos já foi caracterizada morfológica e molecularmente e testada para diversos fins na área agrícola e de saúde pública. A importância desse BAG é bastante relevante para o Estado de Pernambuco, pois permite o conhecimento e o intercâmbio de pesquisas significativas no controle de pragas agrícolas e urbanas, na promoção de crescimento vegetal, no controle de patógenos de solo e no melhoramento genético do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). Palavras-chave: controle biológico, fungos entomopatogênicos, fungos fitopatogênicos, microrganismos de solo, melhoramento vegetal.

Abstract

Microorganisms of Agricultural Interest Preserved at the Agronomic Institute of Pernambuco . The Microorganism Germplasm Bank of the Agronomic Institute of Pernambuco was started in the 1970s and initially aimed to work with fungi that control insect pests from economically important crops. Subsequently, the need arose for other microorganisms to be incorporated into the collection, such as diazotrophic bacteria, bacilli of interest in aquaculture, bacilli of agricultur al interest, bacilli of public health interest, arbuscular mycorrhizal fungi, phytopathogenic fungi to common bean (Phaseolus vulgaris L.) and fungi of the Trichoderma genus. Most of these microorganisms have already been characterized morphologically and molecularly and tested for various purposes in the agricultural and public health areas. The maintenance of this AGB is very relevant for the Pernambuco State, as it allows the knowledge and exchange of relevant research in the control of agricultural and urban pests, in the prom otion of plant growth, in the control of soil pathogens and in the beans plant breeding. Keywords: biological control, entomopathogenic fungi, phytopathogenic fungi, soil microorganisms, plant breeding.

HISTÓRIA DO BANCO

A coleção de microrganismos do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) está localizada na sede do Instituto, nos Laboratórios de Biologia de Solo, de Fungos Entomopatogênicos e de Biotecnologia. As coleções de Bactérias Diazotróficas, Bacilos de interesse na aquicultura e de Fungos Micorrízicos Arbusculares foram iniciadas em 1986 e estão localizadas no Laboratório de Biologia de Solo com o objetivo de desenvolver pesquisas na área de microbiologia do solo. No Laboratório de Biotecnologia está localizada a coleção de Bacilos de Interesse Agrícola e de Saúde Pública.

A coleção de culturas de Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Mogn) Lams-Scrib surgiu devido à grande necessidade de se desenvolver cultivares de feijão-comum resistentes às raças fisiológicas desse fungo, devido aos prejuízos econômicos causados pelo referido patógeno no Estado de Pernambuco, considerando o caráter local da existência dessas raças. A diferença de produtividade entre cultivares suscetíveis e resistentes, em 2013, observada em campo, na região do Agreste Meridional, é da ordem de 91%, tornando clara a importância dessa doença para o produtor rural, considerando-se ainda a existência de uma área cultivada com feijão comum no estado da ordem de 120 mil hectares, em sua totalidade conduzida pela agricultura familiar (IBGE, 2019). A ampla variabilidade patogênica apresentada pelas raças fisiológicas de C. lindemuthianum dificulta a obtenção de novas cultivares, sendo necessário que exista à disposição dos pesquisadores novas fontes de resistência que possam ser utilizadas para a introgressão de genes de resistência em cultivares comerciais (PINTO et al., 2012). Dessa forma, a coleção de culturas de C. lindemuthianum é uma fonte valiosa de informações para que os programas de melhoramento do feijoeiro adotem as melhores estratégias que permitam ampliar a durabilidade da resistência das cultivares de feijão. Além dessa coleção, o IPA tem fungos provenientes do solo que causam doenças para o feijoeiro comum e caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) no Estado de Pernambuco, dos quais destacam-se: Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, F. oxysporum f. sp. tracheiphilum, F. solani, Rhizoctonia solani, Macrophomina phaseolina, Sclerotium rolfsii e Sclerotinia sclerotiorum. Esses fungos são os principais agentes etiológicos que causam doenças de solo significativas no feijoeiro em Pernambuco. A necessidade de fazer o levantamento dos principais fungos do solo surgiu a partir do momento em que se verificou que a produtividad e do feijão foi afetada com essas doenças no Estado, causando sérios prejuízos no rendimento das culturas, propondo um controle mediante a utilização de compostos naturais e/ou atividade biocontroladora com espécies do fungo Trichoderma. Razão do interesse em incorporar ao banco de microrganismos espécies de Trichoderma eficazes no controle dos fitopatógenos (FIGUEIRÊDO et al., 2010). Fungos entomopatogênicos vêm sendo estudados no IPA desde meados da década de 1970, usando dois importantes grupos de entomopatógenos (Metarhizium e Beauveria) no controle de pragas em culturas de expressão econômica no Estado de Pernambuco, como a cigarrinha da folha e de raízes da cana-de-açúcar, cigarrinha de pastagem e do moleque da bananeira. Paralelamente, também têm sido estudados outros grupos de fungos entomopatogênicos como Cordyceps (=Isaria) e espécies de Fusarium para o controle de pragas urbanas e agrícolas. Os curadores do BAG Microrganismo do IPA estão representados pelos pesquisadores Dr. José de Paula Oliveira que está responsável pelos laboratórios de Biologia de Solo e d e Biotecnologia e pelo pesquisador Dr. Antonio Félix da Costa, coordenador do Programa Feijão do IPA e supervisor das pesquisas realizadas a partir das coleções de culturas que compõem os fungos causadores de doenças ao feijoeiro, fungos entomopatogênicos e de fungos controladores de doenças de feijão.

COLEÇÕES QUE COMPÕEM O BANCO

A coleção de Bactérias Diazotróficas do IPA está localizada no Laboratório de Biologia de Solo, composta por 200 estirpes. A coleção de estirpes de Bacilos de interesse para aq uicultura contém 19 estirpes e a coleção de Fungos Micorrízicos Arbusculares, seis espécies. No Laboratório de Biotecnologia está localizada a coleção de Bacilos de Interesse Agrícola e de Saúde Pública, composta por 117 estirpes de Bacillus thuringiensis. A coleção de C. lindemuthianum é composta por 66 isolados obtidos de feijão-comum, provenientes das regiões produtoras do Sertão e Agreste do Estado de Pernambuco, onde encontram -se bastante disseminados devido às condições ambientais nessas áreas favorecerem a sua disseminação durante a época de produção. Até o momento são descritas mais de 100 raças fisiológicas desse fungo no mundo, sendo que aproximadamente 71 delas já foram registradas no Brasil, ocorrendo, principalmente, nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Bahia e Pernambuco e, ainda, têm relevância nos estados do Espírito Santo, Alagoas, Sergipe e Paraíba (PINTO et al., 2012). A coleção de fungos fitopatogênicos do feijoeiro é composta por 172 isolados, assim distribuídos: Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (32 isolados), F. oxysporum f. sp. tracheiphilum (43 isolados), F. equiseti (3 isolados), F. lateritium (12 isolados), F. solani (9 isolados), Rhizoctonia solani (10 isolados), Macrophomina phaseolina (52 isolados), Sclerotium rolfsii (5 isolados) e Sclerotinia sclerotiorum (6 isolados), provenientes de culturas de feijão comum e feijão-

caupi de municípios da Zona da Mata Norte, Agreste Meridional e Setentrional e Sertão de Itaparica, Moxotó, de São Francisco e do Araripe. A coleção de fungos entomopatogênicos é composta por 94 isolados, distribuídos entre os gêneros Fusarium (47 isolados), Trichoderma (15 isolados), Cordyceps (11 isolados), Beauveria (10 isolados), Metarhizium (10 isolados) e Lecanicillium (um isolado). A maioria dos isolados de Fusarium (28 isolados) foi obtida de fêmeas adultas da cochonilha do carmim [Dactylopius opuntiae (Cockerell) (Hemiptera: Dactylopiidae)], coletadas em 20 municípios do estado de Pernambuco, distribuídos entre os sertões do Pajeú e do Moxotó. Os outros 19 isolados foram obtidos a partir de ninfas da mosca-negra-dos-citros [Aleurocanthus woglumi Ashby (Hemiptera: Aleyrodidae)], coletadas em uma área de cultivo de consórcio de citros (laranjeiras e limoeiros) com outras fruteiras, em Paudalho-PE. Os isolados de Fusarium foram identificados por abordagem polifásica como pertencentes às espécies Fusarium caatingaense Santos, Lima, Tiago & Oliveira (23 isolados), F. pernambucanum Santos, Lima, Tiago & Oliveira (oito isolados), F. volatile Al-Hatmi, Sand.Den., S.A. Ahmed & de Hoog (cinco isolados), F. sulawesiense Maryani, Sand.-Den., L. Lombard, Kema & Crous (quatro isolados), F. proliferatum (Matsush.) Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg (quatro isolados), F. chlamydosporum Wollenw. & Reinking (um isolado) e F. verticillioides (Sacc.) Nirenberg (um isolado), e F. pseudocircinatum O'Donnell & Nirenberg (um isolado). Os isolados de Trichoderma foram cedidos pela Micoteca URM da Universidade Federal de Pernambuco e são provenientes de amostras de solo, coletadas em três sistemas agroflorestais, localizados em Recife-PE, Olinda-PE e Abreu e Lima-PE. Esses fungos apresentaram potencial para o controle de algumas pragas (dados não publicados) e são das espécies Trichoderma atroviride P. Karst. (seis isolados), T. asperellum Samuels, Lieckf. & Nirenberg (dois isolados), T. afroharzianum P. Chaverri, F.B. Rocha, Degenkolb & Druzhin (dois isolados), T. brevicompactum G.F. Kraus, C.P. Kubicek & W. Gams (dois isolados), T. longibrachiatum Rifai (um isolado), T. breve K. Chen & W.Y. Zhuang (um isolado) e T. asperelloides Samuels (um isolado). Outros 176 isolados de Trichoderma foram provenientes de solos, coletados em municípios da Mata Norte, Agreste e Sertão do estado, os quais foram testados no controle dos fungos fitopatogênicos do feijoeiro e estão sendo caracterizados molecularmente, tendo -se identificado até o momento T. asperellloides (14), T. asperellum (19) e T. afroharzianum (3). Entre os isolados de Cordyceps estão três espécies – Cordyceps fumosorosea (=Isaria fumosorosea) (Wize) Kepler, B. Shrestha & Spatafora (cinco isolados), C. farinosa (=Isaria farinosa) (Holmsk.) Kepler, B. Shrestha & Spatafora (quatro isolados) e C. javanica (=Isaria javanica) (Bally) Kepler, B. Shrestha & Spatafora (dois isolados). Parte desses isolados foi cedida pela Micoteca URM da Universidade Federal de Pernambuco e outra, pela Micoteca do Departamento de Fitossanidade da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), de hospedeiros diversos. Nos gêneros Beauveria e Metarhizium foram identificadas apenas uma espécie em cada − Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokīn. Esses fungos foram obtidos do acervo da Micoteca URM do Departamento de Micologia (UFPE) e da Coleção de Cultura da Micoteca do IPA, e são provenien tes de diversos hospedeiros. O isolado de Lecanicillium presente na coleção de fungos entomopatogênicos é uma espécie ainda não identificada, obtida de ninfas da mosca-negra-dos-citros, coletadas em plantações de laranja, em Paudalho-PE.

MÉTODOS DE CONSERVAÇÃO

Estruturas dos fungos micorrízicos arbusculares (hifas e esporos) e raízes colonizadas estão preservadas e mantidas em substrato à base de mistura de solo e areia em refrigerador (40C). As Bactérias Diazotróficas e as bactérias de interesse na aquicultura estão preservadas em batata, imerso em óleo mineral e armazenadas em sala fria a 170C. Enquanto os Bacilos de Interesse Agrícola e de Saúde Pública são armazenados em geladeira a 40C. Os 66 isolados de C. lindemuthianum que compõem a coleção de cultura do IPA, obtidos a partir de culturas monospóricas, são preservados em tubos de ensaio contendo meio de cultura Mathur [peptona (2,0 gl-1), dextrose (2,8 gl1), MgSO4 (1,73 gl-1), KH2PO4 (2,72 gl-1) e ágar (20 gl-1)], mantidos a 4oC. Para se evitar repiques constantes, bem como permitir a sobrevivência dos isolados fúngicos por mais tempo, garantindo a manutenção das características morfológicas, fisiológicas (esporulação e patogenicidade), genéticas e contaminação indesejável, após longos períodos, esse s isolados também estão preservados segundo o método Castellanii, que consiste na manutenção de discos de micélio, crescido em

BDA (batata-dextrose-ágar), em tubos tipo Eppendorf® contendo 1,5 ml de água destilada esterilizada e acondicionados sob refrigeração a 4oC. Os espécimes que são constantemente manuseados são cultivados em tubo de ensaio com meio de cultura Mathur e mantidos em BOD à temperatura de 22oC (1oC). Os isolados de fungos fitopatogênicos do feijoeiro estão mantidos em tubos de ensaio cont endo meio de cultura BDA e em água destilada esterilizada (CASTELLANII, 1939), armazenados em refrigerador (4°C). As espécies de Trichoderma estão mantidas em tubos de ensaio, em meio sólido, em refrigerador (4°C), renovados periodicamente. Os fungos entomopatogênicos estão mantidos em meios de cultura sólidos, como BDA e SNA (Synthetic Nutrient Agar), renovados periodicamente. A maior parte dos isolados também está preservada em glicerol (10%), estocad a em freezer. Além disso, a maioria dos fungos encontra-se depositada na Coleção de Culturas Micoteca URM do Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brasil.

CARACTERIZAÇÃO E DOCUMENTAÇÃO

As bactérias e os fungos micorrízicos que compõem o banco de germoplasma do IPA ainda estão em fase de caracterização. A coleção de culturas de C. lindemuthianum é uma fonte valiosa de informações genéticas que subsidia o programa de melhoramento genético do feijoeiro do IPA, em execução há mais de 50 anos, de modo a permitir a geração de novas cultivares com resistência à antracnose. Essas cultivares poderão ser recomendadas como mais uma opção de plantio não só para os agricultores familiares pernambucanos, mas também para outros estados pro dutores de feijão-comum que apresentem condições ambientais semelhantes, desde que apresentem ampla adaptabilidade a outros locais de plantio, especialmente do Nordeste. Os fungos fitopatogênicos do feijoeiro foram estudados em dois projetos de pesquisa de Pós-doutorado e doze projetos de iniciação científica. Essas pesquisas foram relevantes para a publicação em eventos científicos e na formação de recursos humanos e serão publicados em revistas com indicação para o controle dos fungos fitopatogênicos dos feijões comum e macassar. Os fungos provenientes dessas pesquisas foram testados com agentes biocontroladores de origem vegetal e fúngica, permitindo o conhecimento de uma forma eficaz e segura de controle de doenças sem o uso de agroquímicos no ambiente (GOMES-SILVA et al, 2017; COSTA et al, 2019). Os fungos entomopatogênicos da coleção foram estudados em três teses de doutorado, seis dissertações de mestrado e quatro trabalhos de conclusão de curso, sendo dois de graduação e dois de especialização. Essas pesquisas resultaram na publicação de 12 artigos, reportando o potencial de fungos para o controle biológico da cochonilha do carmim (SANTOS et al., 2016; CARNEIRO-LEÃO et al., 2017; LOPES et al., 2018; LOPES et al., 2019; VELEZ et al., 2019; OLIVEIRA et al., 2020; DINIZ et al., 2020) e do cupim arboríco la Nasutitermes corniger Motschulsky (Blattodea: Termitidae) (LOPES et al., 2017; LOPES et al., 2020). O potencial desses fungos para o controle de outros insetos -praga, tais como lagarta do cartucho, mosca-negra-dos-citros, caruncho do feijão e pulgões também vem sendo estudado (dados não publicados). DNA fingerprints também foram gerados para alguns desses fungos, visando o monitoramento deles em campo (TIAGO et al., 2016), e estudos objetivando a caracter ização de aspectos biológicos de isolados também foram realizados (LOPES et al., 2016), incluindo a descrição de duas novas espécies por abordagem polifásica (SANTOS et al., 2019). Outros artigos estão em processo de produção ou sendo avaliados por revistas científicas.

USO E POTENCIAL INOVAÇÃO

Os fungos entomopatogênicos do banco do IPA têm potencial para o controle de pragas urbanas, como o cupim N. corniger (LOPES et al., 2017; LOPES et al., 2020), e de pragas de interesse agrícola, especialmente de rel evância para a região do Nordeste (CARNEIRO-LEÃO et al., 2017; LOPES et al., 2019; VELEZ et al., 2019; OLIVEIRA et al., 2020; DINIZ et al., 2020). A coleção de cultura de C. lindemuthianum é uma fonte valiosa de informações genéticas que subsidia o programa de melhoramento genético do feijoeiro do IPA, em execução há mais de 50 anos, de modo a permitir a geração de novas cultivares com resistência à antracnose. Essas cultivares poderão ser recomendadas como mais uma opção de plantio não

só para os agricultores familiares pernambucanos, mas também para outros estados produtores de feijão-comum que apresentem condições ambientais semelhantes, desde que apresentem ampla adaptabilidade a outros locais de plantio, especialmente do Nordeste. As espécies de Trichoderma do banco do IPA apresentam atividade biocontroladora para os fungos fitopatogênicos ao feijoeiro e estudos estão sendo desenvolvidos para verificar seu potencial como promotores de cr escimento dos feijões comum e caupi. Todas as bactérias e fungos micorrízicos arbusculares ainda serão testados quanto ao seu potencial de inovação.

PERSPECTIVAS FUTURAS / PARCERIAS

Há um leque imenso de possibilidades de parcerias do IPA com instituições de pesquisa, dentro e fora do estado, para condução de pesquisas envolvendo suas coleções de microrganismos, podendo -se destacar os trabalhos recentes com o Departamento de Solos da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) e com a Universidade Federal do Piauí (UFPI) na área de fixação biológica de nitrogênio; com o Laboratório de Tecnologia de Bioativos (LABTECBIO) da UFRPE, estudando a composição de novos meios de crescimento de Bacillus, com a inclusão de produtos regionais, de modo que se obtenham meios com alta eficiência e custos menores em relação aos existentes no mercado; com o Departamento de Micologia e o Departamento de Bioquímica da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), com os estudos de fungos fitopatogênicos e entomopatogênicos. Os projetos de pesquisa desenvolvidos pelo IPA em parceria com outras instituições envolvem equipes multidisciplinares, compostas por pesquisadores de formação e habilidades diversas, técnicos, e alunos de graduação e pós-graduação. Essas parcerias, já consolidadas, potencializam a capacidade dessas instituições para ações de pesquisa e desenvolvimento, especialmente na área agrícola, prospecção de recursos genéticos e geração de conhecimento e processos biotecnológicos.

Referências

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