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cia, un frammento specifico di DNA è amplificato, mentre in una fase post-PCR l'amplicone viene legato alla superficie di una piastra tipo ELISA. In seguito a denaturazione, una sonda a DNA sequenza-specifica viene fatta ibridare alI'amplicone a singolo filamento. La sonda viene p01 individuata in una reazione tipo-ELISA (utilizzando un sistema di anticorpi primarl e secondari marcati per lo sviluppo del segnale di rilevamento). Sono pochi i riferimenti pubblicati in tetteratura caratterizzati da questo approccio (Holzhauser et at. 2002). La degradazione del DNA genomico in seguito alt'impatto tecnologico è particolarmente influente nelle analisi quantitative, mentre se ci si riferisce solo alla presenza o all'assenza di segnale anche un DNA fortemente degradato e/o contaminato pub fornire un risultato positivo. In relazione alle problematiche esposte, sembra importante affermare che l'analisi del DNA pub essere considerata un valido complemento alla ricerca diretta dell'allergene mediante ELISA, non sostituendo in ogni caso l'approccio diretto. Alcuni esperti suggeriscono l'uso della tecnica PCR come screening iniziale, per poi ricercare eventualmente le proteine altergeniche mediante ELISA solo nel caso di positivi alla "speciazione via DNA". L'approccio piü significativo scientificamente, comunque, considerando le diverse problematiche delle due tecniche, dovrebbe quindi essere l'uso parallelo combinato, eventualmente completato da un controllo di "secondo livello" attraverso analisi di massa per la ricerca e la caratterizzaziane delle diverse proteine allergeniche. Standard di calibrazione e materiali di riferimento II risultato "quantitativo" della PCR è influenzato dalla natura degli standard utilizzati per costruire le curve di calibrazione. Questo problema, in particolare, influenza la cosiddetta quantificazione "assoluta'ç doe ottenuta mediante l'interpolazione dei cicli di amplificazione soglia del DNA target con la curva creata dal cicli soglia relativi a delle diluizioni note standard del DNA genomico di riferimento. Oltre alla minimizzazione degli errori analitici (parametro aifrontato net paragrafo relativo alla validazione di metodo
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riportato di seguito), la qualità e la natura stessa del "sistema di riferimento" è quindi fondamentale per la signiftcatività dell'analisi. Purtroppo per molti geni utilizzati come marcatori e sfruttati per la rivelazione di ingredienti allergenici negli alimenti, non esistono sufficienti dati in relazione alla bra potenziale ripetizione sul genoma. Le amplificazioni single locus, inoltre, possono essere affette da plO problemi di scarsa resa di amplificazione rispetto a quelle ripetute plO volte su un genoma o su diversi genomi. Nel caso si intenda utilizzare DNA genomico came riferimento per la quantificazione, essendo questo potenzialmente degradabibe dalle alte temperature, ed essendo la fase di estrazione critica per ii clean-up deblo stesso, è necessaria conoscere bene la matrice di partenza utilizzata per applicare ii sistema di estrazione plO appropriata. maItre, non è semplice concludere se l'estrazione del DNA (nella preparazione di uno standard, come pure nei campioni in analisi) sia Stata eSaustiva a no. In considerazione di questo, anche nei kit pre-allestiti commerciali, per costruire be rette di calibrazione si utibizzano spesso plasmidi modificati, che portano al bra interno be stesse sequenze riconasciute dai primer sub genoma debl'organismo da identificare.E fondamentabe determinare l'intervabbo di binearità ottenibile con lo "standard" utilizzato, e per questo controlbo possono essere utilizzati diversi approcci matematici e statistici. Al momento della stesura del presente documento non sono disponibibi né commerciabizzati reference standard certificati che possano essere utilizzati per la comparazione degli standard di calibrazione e per allestire be prove di recupero, fortificando I campiani ed omettendo ii probbema dell'estrazione non esaustiva del DNA. Al momenta, sono pochi I materiabi di riferimento commercializzati (NIST; IRMM); nessuno di questi è certificato e suggerita per la analisi del DNA via PCR per la detection di allergeni, seppure siano stati utilizzati a volte con succesSo. PCR e sensibilità: limite di rivelazione (LOD), limite di quantificazione (LOQ) e recuperi Sono numerosi i parametri che possono
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inficiare la resa di amplificazione (e quindi la sensibibità di detection). La determinazione dei bimiti di rivelazione (LOD) e di quantificazione (LOQ) è dunque fondamentale per la validaziane del metodo. In alcuni kit commerciali, I protocolbi di vabidazione e le modabità di attribuzione di LOD e LOQ sono chiari, in altri vengano omessi (come pure in alcuni casi be sequenze primer ed i target amplificati). Come nel caso del kit ELISA, malta spesso II valore di LOQ corrisponde alla cancentrazione di standard piO diluito ottenibibe dabla curva di calibrazione. Simibmente, sono pochi i lavori pubblicati in betteratura che riportano la definizione di LOD e LOQ. Non essendo possibibe rapportare in modo diretto la quantificazione debb'ingrediente allergenico can la presenza reale di un ablergene proteico, non si pub usare la PCR nella valutazione del rischio, nonostante be potenziabità e la sensibilità mastrata in mobti casi. Come per ogni altro approcdio analitico, al fine di valutare I'esattezza del data anabitico, anche nel caso della PCR quantitativa applicata alb'anabisi di un abimento multi-ingrediente complesso, è necessaria effettuare studi di recupero, sfruttando lb concetto delta fortificazione delle matrici utilizzando non tanto l'abbergene (come net caso dell'ELISA), ma l'ingrediente stesso, testando maItre matnidi abimentari differenti per valutare, di caso in caso, la funzionabità del sistema di estrazione scelto. Sono pochi i lavori di Ietteratura che descrivono questo approcdio, in particobare lb già citato "incurred sample", doe l'aggiunta deII'ingrediente prima della preparaziane tecnobogica della matnice complessa, mimando be condizioni reabi di processing industriabe. I lavori scientifici sono piO mirati alla deftnizione debb'impatta tecnolagico subla degradaziane e recupero del DNA che ad una vera a prapria validaziane di metodo. PlO utibizzato (anche se meno nei confronti delle tecniche ELISA) I'approccio "spiked sample"; anche in questo caso Si possono attenere delle sovrastime; lb DNA aggiunto post-produzione non subisce infatti b'impatta tecnobogica come ii dampione reabe. PlO infarmaziani suble tematiche legate alla validazione di metodo ed alla accettabibità del risultati ottenuti via PCR sono riportati net paragrafo C.4 Criteri di validazione ed accettabilità delle me-
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todiche analitiche. Espressione dei risultati Come nel caso dei test ELISA, la sensibiIità raggiurita dai kit PCR viene normalmente espressa come mg di alimento allergizzante per kg di derrata alimentare. Trattandosi di metodi indiretti per la ricerca dell'alimento allergizzante, e non dell'allergene, nella loro messa a punto si tende a raggiungere una maggiore sensibilità e capacità di individuare la presenza dell'alimento, piuttosto the a fornire aU'operatore una quantificazione assoluta dello stesso. Inoltre, II metodo non discrimina tra le diverse proteine, proprie di uno stesso alimento, ma in grado di causare reazioni allergiche di diversa portata (es: Cor a 1, responsabile di sindromi orali allergiche, e Cor a 8, potenziale causa di shock anafilattico,
in nocciola). Ad oggi, sono disponibili kit commerciali per quasi tutti gli alimenti inseriti nella norma vigente (cereali, crostacei, uova, pesce, arachide, soia, latte vaccino, mandorla, nocciola, noce, anacardo, pistacchio, sedano, senape, sesamo, lupino, molluschi), ed altri per l'identificazione di altri alimenti allergizzanti non inseriti nell'elenco della normativa (grano saraceno, pesca, pomodora ... ). Alcuni di questi kit presentano I propri limiti di sensibilità sotto forma di pg di DNA dell'alimento ricercato individuati in una miscela contenente una quantità fissa di un DNA proveniente da un'altra forte (di solito DNA bovino). 01tre a questi kit commerciali esistono poi in letteratura decine di lavori, realizzati da singoli gruppi di ricerca, focalizzati sulla messa a punto di nuove metodiche per l'individuazione tramite tecniche PCR di alimenti allergizzanti, che in
molti casi presentano sensibilità persino superiori ai kit commerciali; nel caso di questi lavori di ricerca i limiti di rivelazione sono presentati o come ppm, a come percentuale in una preparazione 'spiked' sul peso totale, o come pg assoluti di DNA. La Norma Europea UNI EN 156341 dell'aprile 2009, relativa alla "Ricerca di allergeni alimentari mediante metodi di biologia molecolare basati sull'analisi del DNA' stabilisce che la sensibilità, identificata dal 'limit of detection' (LOD), debba essere espressa in termini di numero di copie di DNA, equivalenti ad una quantità totale di costituente allergenico per kilogrammo di alimento (mg/kg). La misura di questa equivalenza viene effettuata sulla base di materiali di riferimento certificati dall'Unione Europea.•
* "Allergie alimentari e sicurezza del consumatore" è un documento emanato il 26 marzo 2014, redatto dal Ministero della salute - Dipartimento della sanità pubblica e veterinaria, della sicurezza alimentare e degli organi collegiali per la tutela della salute - Direzione generale per l'igiene e la sicurezza degli alimenti e la nutrizione - Ufficio V
E. ILdLU. Ii primo fitoterapico ad attivazione frattale per ii naturale equilibrio della tua P.N.E.I.
[ Citoyang Zenzero
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