RMCP Vol. 10, Núm. 1 (2019): Enero-Marzo [versión en español] by Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias

Edición Bilingüe Bilingual Edition

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 10 Núm. 1, pp. 1- 266, ENERO-MARZO-2019

ISSN: 2448-6698

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 10 Núm. 1, pp. 1-266, ENERO-MARZO-2019

REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS Volumen 10 Número 1 EneroMarzo, 2019. Es una publicación trimestral de acceso abierto, revisada por pares y arbitrada, editada por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Avenida Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina, Delegación Coyoacán, C.P. 04010, Cuidad de México, www.inifap.gob.mx Distribuida por el Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad, Km 15.5 Carretera México-Toluca, Colonia Palo Alto, Cuidad de México, C.P. 05110. Editor responsable: Arturo García Fraustro. Reservas de Derechos al Uso Exclusivo número 04-2016-060913393200-203. ISSN: 2448-6698, otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor (INDAUTOR). Responsable de la última actualización de este número: Arturo García Fraustro, Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad, Km. 15.5 Carretera México-Toluca, Colonia Palo Alto, Ciudad de México, C.P. 015110. http://cienciaspecuarias. inifap.gob.mx, la presente publicación tuvo su última actualización en Enero de 2019. Polinización de cultivos de hortalizas en el Campo Experimental Costa de Hermosillo. Fotografía tomada por: Agustín Alberto Fu Castillo. Concurso de fotografía INIFAP 2010

DIRECTORIO FUNDADOR John A. Pino EDITORES ADJUNTOS Oscar L. Rodríguez Rivera Alfonso Arias Medina

EDITOR EN JEFE Arturo García Fraustro

EDITORES POR DISCIPLINA Dra. Yolanda Beatriz Moguel Ordóñez, INIFAP, México Dr. Ramón Molina Barrios, Instituto Tecnológico de Sonora, México Dra. Maria Cristina Schneider, PAHO, Estados Unidos Dra. Elisa Margarita Rubí Chávez, UNAM, México Dr. Javier F. Enríquez Quiroz, INIFAP, México Dra. Martha Hortencia Martín Rivera, Universidad de Sonora URN, México Dr. Fernando Arturo Ibarra Flores, Universidad de Sonora URN, México Dr. James A. Pfister, USDA, Estados Unidos Dr. Eduardo Daniel Bolaños Aguilar, INIFAP, México Dr. Sergio Iván Román-Ponce, INIFAP, México Dr. Sergio D. Rodríguez Camarillo, INIFAP, México Dr. Martin Talavera Rojas, Universidad Autónoma del Estado de México, México Dra. Maria Salud Rubio Lozano, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dra. Elizabeth Loza-Rubio, INIFAP, México Dr. Juan Carlos Saiz Calahorra, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, España Dra. Silvia Elena Buntinx Dios, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dr. José Armando Partida de la Peña, INIFAP, México Dr. José Luis Romano Muñoz, INIFAP, México. Dr. Alejandro Plascencia Jorquera, Universidad Autónoma de Baja California, México Dr. Juan Ku Vera, Universidad Autónoma de Yucatán, México Dr. Ricardo Basurto Gutiérrez, INIFAP, México. Dr. Luis Corona Gochi, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dr. Juan Manuel Pinos Rodríguez, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, México Dr. Arturo Francisco Castellanos Ruelas, Facultad de Química. UADY Dra. Guillermina Ávila Ramírez, UNAM, México. Dr. Emmanuel Camuus, CIRAD, Francia. Dr. Héctor Jiménez Severiano, INIFAP., México Dr. Juan Hebert Hernández Medrano, UNAM, México. Dr. Adrian Guzmán Sánchez, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, México Dr. Eugenio Villagómez Amezcua Manjarrez, INIFAP, CENID Salud Animal e Inocuidad, México Dr. Fernando Cervantes Escoto, Universidad Autónoma Chapingo, México Dr. Adolfo Guadalupe Álvarez Macías, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, México Dr. Alfredo Cesín Vargas, UNAM, México.

TIPOGRAFÍA Y FORMATO Nora del Rocío Alfaro Gómez Indizada en el “Journal Citation Report” Science Edition del ISI . Inscrita en el Sistema de Clasificación de Revistas Científicas y Tecnológicas de CONACyT; en EBSCO Host y la Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal (RedALyC) (www.redalyc.org); en la Red Iberoamericana de Revistas Científicas de Veterinaria de Libre Acceso (www.veterinaria.org/revistas/ revivec); en los Índices SCOPUS y EMBASE de Elsevier (www.elsevier. com).

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Se publican en la revista tres categorías de trabajos: Artículos Científicos, Notas de Investigación y Revisiones Bibliográficas (consultar las Notas al autor); la responsabilidad de cada trabajo recae exclusivamente en los autores, los cuales, por la naturaleza misma de los experimentos pueden verse obligados a referirse en algunos casos a los nombres comerciales de ciertos productos, ello sin embargo, no implica preferencia por los productos citados o ignorancia respecto a los omitidos, ni tampoco significa en modo alguno respaldo publicitario hacia los productos mencionados.

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Todas las contribuciones serán cuidadosamente evaluadas por árbitros, considerando su calidad y relevancia académica. Queda entendido que el someter un manuscrito implica que la investigación descrita es única e inédita. La publicación de Rev. Mex. Cienc. Pecu. es trimestral en formato bilingüe Español e Inglés. El costo

VISITE NUESTRA PÁGINA EN INTERNET Artículos completos desde 1963 a la fecha y Notas al autor en: http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is an open access peer-reviewed and refereed scientific and technical journal, which publishes results of research carried out in any scientific or academic institution, especially related to different areas of veterinary medicine and animal production. Papers on disciplines different from those shown in Editorial Committee can be accepted, if related to livestock research.

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The journal publishes three types of papers: Research Articles, Technical Notes and Review Articles (please consult Instructions for authors). Authors are responsible for the content of each manuscript, which, owing to the nature of the experiments described, may contain references, in some cases, to commercial names of certain products, which however, does not denote preference for those products in particular or of a lack of knowledge of any other which are not mentioned, nor does it signify in any way an advertisement or an endorsement of the referred products.

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REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS REV. MEX. CIENC. PECU.

VOL. 10 No. 1

ENERO-MARZO-2019

CONTENIDO ARTÍCULOS

Pág. Frecuencia de Cryptosporidium en perros asociados a establos lecheros y en áreas urbanas del estado de Aguascalientes, México Cryptosporidium infection frequency in dogs on dairy farms and in urban areas of the state of Aguascalientes, Mexico Irene Vitela-Mendoza, Kenia Padilla Díaz, Carlos Cruz-Vázquez, Leticia Medina-Esparza, Miguel Ramos-Parra .................................................................................................................................... …..1

Distribución potencial de Musca domestica en el municipio de Jesús María, Aguascalientes, con el uso de escenarios de cambio climático Potential distribution of Musca domestica in Jesús María Municipality, Aguascalientes, Mexico, based on climate change scenarios Antonio de Jesús Meraz Jiménez, Armando López Santos, Carlos Alberto García Munguía, Jorge Alejandro Torres González, Alberto Margarito García Munguía ......................................................... .14

Control de la helmintiasis en becerros criados en una región semiárida cálida de Brasil Helminthiasis control in calves raised in a hot Semi-arid area Ludmilla de Fátima Leal Pereira, Eduardo Robson Duarte, Gabriela Almeida Bastos, Viviane de Oliveira Vasconcelos, Evely Giovanna Leite Costa, Laydiane de Jesus Mendes, Idael Matheus Góes Lopes, Iara Maria Franca Reis ............................................................................................................................... 30

Importancia de la jerarquía social sobre los comportamientos alimenticios y parasitarios de ovinos criados en dos sistemas pastoriles Importance of sheep social hierarchy on feeding behavior and parasite load in silvopastoral and grass monoculture grazing systems Carolina Flota-Bañuelos, Juan A. Rivera-Lorca, Bernardino Candelaria-Martínez.......................... …..52

Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico para becerros del altiplano mexicano Isolation and identification of potentially probiotic lactic acid bacteria for Holstein calves in the Mexican Plateau Patricia Landa-Salgado, Yesenia Caballero-Cervantes, Efrén Ramírez-Bribiesca, Ana María HernándezAnguiano, Luz Mariana Ramírez-Hernández, David Espinosa-Victoria, David Hernández-Sánchez .... 68

III

Efecto de monensina intraruminal sobre el β-hidroxibutirato, enfermedades del periparto, producción de leche y sus componentes en ganado Holstein Effect of an intraruminal monensin bolus on blood β-hydroxybutyrate, peripartum diseases, milk yield and solids in Holstein cows Pedro Melendez, Alejandra Arévalos, Mario Duchens, Pablo Pinedo .................................................. 84

Evaluación y análisis sensorial del Queso Bola de Ocosingo (México) desde la perspectiva del consumidor Consumer evaluation and sensory analysis of Queso Bola de Ocosingo (Mexico) Mónica Agudelo-López, Alfredo Cesín-Vargas, Angélica Espinoza-Ortega, Benito Ramírez-Valverde104

REVISION DE LITERATURA

Factors affecting the ruminal microbial composition and methods to determine microbial protein yield. Review Factores que afectan la composición microbiana ruminal y métodos para determinar el rendimiento de la proteína microbiana. Revisión Ezequias Castillo-López, María G. Domínguez-Ordóñez .................................................................... 120

NOTAS DE INVESTIGACIÓN

Dinámica de infección por Cystoisospora suis (Isospora suis) en una granja piloto ubicada en el estado Carabobo, Venezuela Infection dynamics of Cystoisospora suis (Isospora suis) on a pilot swine farm in Carabobo State, Venezuela Juan Carlos Pinilla León, Natalia Da Silva Borges ............................................................................. 149

Design of an electrochemical prototype to determine relative NaCl content and its application in fresh cheeses Desarrollo y evaluación de un prototipo electroquímico para determinar el contenido relativo de NaCl y su aplicación en quesos frescos Rubén Cázares-Gallegos, Juan Antonio Vidales-Contreras, Alejandro Isabel Luna-Maldonado, Michael E. Hume, Ramón Silva-Vázquez, Armando Quintero-Ramos, Gerardo Méndez-Zamora ................... 161

La calidad sanitaria del chorizo rojo tradicional que se comercializa en la ciudad de Toluca, Estado de México Hygienic quality of the traditional red chorizo commercialized in the city of Toluca, State of Mexico Ana Laura Becerril Sánchez, Octavio Dublán García, Aurelio Domínguez-López, Daniel Arizmendi Cotero, Baciliza Quintero-Salazar ..................................................................................................... 172

Impacto de la vigilancia sanitaria del clembuterol en Guerrero, México: Resultados de 2011 a 2015 Impact of health monitoring of clenbuterol in Guerrero, Mexico: Results from 2011 to 2015 Luis Alberto Chávez-Almazán, Jesús Antonio Díaz-Ortiz, Diana Garibo-Ruiz, Mario Alberto AlarcónRomero, Miguel Angel Mata-Diaz, Beatriz Pérez-Cruz, Elizabeth Godoy-Galeana ............................ 186

Condiciones poblacionales y alimenticias de colonias de abejas melíferas (Apis mellifera) en tres regiones del altiplano semiárido de México Populations and food stores of honey bee (Apis mellifera) colonies from three regions of Mexico’s semiarid high plateau Carlos Aurelio Medina-Flores, Ernesto Guzmán-Novoa, Jairo Iván Aguilera Soto, Marco Antonio López Carlos, Sergio Ernesto Medina-Cuéllar.............................................................................................. 199

Composición botánica y valor nutritivo de la dieta consumida por bovinos en un área invadida por pasto rosado [Melinis repens (willd.) Zizka] Botanical composition and nutritive value of the diet consumed by cattle in an area invaded by natal grass [Melinis repens (Willd.) Zizka] Obed Gabriel Gutiérrez Gutiérrez, Carlos Raúl Morales Nieto, José Carlos Villalobos González, Oscar Ruíz Barrera, Juan Ángel Ortega Gutiérrez, Jorge Palacio Núñez ..................................................... 212

Dosis letal media (DL50) y reducción de crecimiento (GR50) por irradiación gamma en pasto garrapata (Eragrostis superba) Mean lethal dose (LD50) and growth reduction (GR50) due to gamma radiation in Wilman lovegrass (Eragrostis superba) Alan Álvarez-Holguín, Carlos Raúl Morales-Nieto, Carlos Hugo Avendaño-Arrazate, Raúl CorralesLerma, Federico Villarreal-Guerrero, Eduardo Santellano-Estrada, Yaudiel Gómez-Simuta ............. 227

Rendimiento de forraje y sus componentes en variedades de alfalfa en el altiplano de México Yield of forage and its components in alfalfa varieties of the Mexican high plateau Adelaido Rafael Rojas García, Nicolás Torres Salado, María de los Ángeles Maldonado Peralta, Jerónimo Herrera Pérez, Paulino Sánchez Santillán, Aldenamar Cruz Hernández, Félix de Jesús Mayren Mendoza, Alfonso Hernández Garay..................................................................................... 239

Evaluation of clinical, radiological, ultrasonographic and microbiological findings of septic arthritis in 50 calves Evaluación de los hallazgos clínicos, radiológicos, ultrasonográficos y microbiológicos de la artritis séptica en 50 becerros İbrahim Yurdakul .............................................................................................................................. 254

Actualización: abril, 2018 NOTAS AL AUTOR La Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias se edita completa en dos idiomas (español e inglés) y publica tres categorías de trabajos: Artículos científicos, Notas de investigación y Revisiones bibliográficas.

indican, empezando cada uno de ellos en página aparte. Página del título Resumen en español Resumen en inglés Texto Agradecimientosy conflicto de interés Literatura citada Cuadros y gráficas

Los autores interesados en publicar en esta revista deberán ajustarse a los lineamientos que más adelante se indican, los cuales en términos generales, están de acuerdo con los elaborados por el Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (CIERM) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437. 1.

Sólo se aceptarán trabajos inéditos. No se admitirán si están basados en pruebas de rutina, ni datos experimentales sin estudio estadístico cuando éste sea indispensable. Tampoco se aceptarán trabajos que previamente hayan sido publicados condensados o in extenso en Memorias o Simposio de Reuniones o Congresos (a excepción de Resúmenes).

Todos los trabajos estarán sujetos a revisión de un Comité Científico Editorial, conformado por Pares de la Disciplina en cuestión, quienes desconocerán el nombre e Institución de los autores proponentes. El Editor notificará al autor la fecha de recepción de su trabajo.

El manuscrito deberá someterse a través del portal de la Revista en la dirección electrónica: http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, consultando el “Instructivo para envío de artículos en la página de la Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias”. Para su elaboración se utilizará el procesador de Microsoft Word, con letra Times New Roman a 12 puntos, a doble espacio. Asimismo se deberán llenar los formatos de postulación, carta de originalidad y no duplicidad y formato de derechos patrimoniales disponibles en el propio sitio oficial de la revista.

Por ser una revista con arbitraje, y para facilitar el trabajo de los revisores, todos los renglones de cada página deben estar numerados; asimismo cada página debe estar numerada, inclusive cuadros, ilustraciones y gráficas.

Página del Título. Solamente debe contener el título del trabajo, que debe ser conciso pero informativo; así como el título traducido al idioma inglés. En el manuscrito no es necesaria información como nombres de autores, departamentos, instituciones, direcciones de correspondencia, etc., ya que estos datos tendrán que ser registrados durante el proceso de captura de la solicitud en la plataforma del OJS (http://ciencias pecuarias.inifap.gob.mx).

Resumen en español. En la segunda página se debe incluir un resumen que no pase de 250 palabras. En él se indicarán los propósitos del estudio o investigación; los procedimientos básicos y la metodología empleada; los resultados más importantes encontrados, y de ser posible, su significación estadística y las conclusiones principales. A continuación del resumen, en punto y aparte, agregue debidamente rotuladas, de 3 a 8 palabras o frases cortas clave que ayuden a los indizadores a clasificar el trabajo, las cuales se publicarán junto con el resumen.

Resumen en inglés. Anotar el título del trabajo en inglés y a continuación redactar el “abstract” con las mismas instrucciones que se señalaron para el resumen en español. Al final en punto y aparte, se deberán escribir las correspondientes palabras clave (“key words”).

10. Texto. Las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. consisten en lo siguiente: a) Artículos científicos. Deben ser informes de trabajos originales derivados de resultados parciales o finales de investigaciones. El texto del Artículo científico se divide en secciones que llevan estos encabezamientos:

Los artículos tendrán una extensión máxima de 20 cuartillas a doble espacio, sin incluir páginas de Título, y cuadros o figuras (los cuales no deberán exceder de ocho). Las Notas de investigación tendrán una extensión máxima de 15 cuartillas y 6 cuadros o figuras. Las Revisiones bibliográficas una extensión máxima de 30 cuartillas y 5 cuadros.

Introducción Materiales y Métodos Resultados Discusión Conclusiones e implicaciones

Los manuscritos de las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. deberán contener los componentes que a continuación se

En los artículos largos puede ser necesario agregar subtítulos dentro de estas divisiones a fin de hacer más claro el contenido, sobre todo en las secciones de Resultados y de Discusión, las cuales también pueden presentarse como una sola sección.

apellidos compuestos se debe poner un guión entre ambos, ejemplo: Elías-Calles E. Entre las iniciales de un autor no se debe poner ningún signo de puntuación, ni separación; después de cada autor sólo se debe poner una coma, incluso después del penúltimo; después del último autor se debe poner un punto.

b) Notas de investigación. Consisten en modificaciones a técnicas, informes de casos clínicos de interés especial, preliminares de trabajos o investigaciones limitadas, descripción de nuevas variedades de pastos; así como resultados de investigación que a juicio de los editores deban así ser publicados. El texto contendrá la misma información del método experimental señalado en el inciso a), pero su redacción será corrida del principio al final del trabajo; esto no quiere decir que sólo se supriman los subtítulos, sino que se redacte en forma continua y coherente.

El título del trabajo se debe escribir completo (en su idioma original) luego el título abreviado de la revista donde se publicó, sin ningún signo de puntuación; inmediatamente después el año de la publicación, luego el número del volumen, seguido del número (entre paréntesis) de la revista y finalmente el número de páginas (esto en caso de artículo ordinario de revista). Puede incluir en la lista de referencias, los artículos aceptados aunque todavía no se publiquen; indique la revista y agregue “en prensa” (entre corchetes).

c) Revisiones bibliográficas. Consisten en el tratamiento y exposición de un tema o tópico de relevante actualidad e importancia; su finalidad es la de resumir, analizar y discutir, así como poner a disposición del lector información ya publicada sobre un tema específico. El texto se divide en: Introducción, y las secciones que correspondan al desarrollo del tema en cuestión.

En el caso de libros de un solo autor (o más de uno, pero todos responsables del contenido total del libro), después del o los nombres, se debe indicar el título del libro, el número de la edición, el país, la casa editorial y el año. Cuando se trate del capítulo de un libro de varios autores, se debe poner el nombre del autor del capítulo, luego el título del capítulo, después el nombre de los editores y el título del libro, seguido del país, la casa editorial, año y las páginas que abarca el capítulo.

11. Agradecimientos y conflicto de interés. Siempre que corresponda, se deben especificar las colaboraciones que necesitan ser reconocidas, tales como a) la ayuda técnica recibida; b) el agradecimiento por el apoyo financiero y material, especificando la índole del mismo; c) las relaciones financieras que pudieran suscitar un conflicto de intereses. Las personas que colaboraron pueden ser citadas por su nombre, añadiendo su función o tipo de colaboración; por ejemplo: “asesor científico”, “revisión crítica de la propuesta para el estudio”, “recolección de datos”, etc. Siempre que corresponda los autores deberán mencionar si existe algún conflicto de interés. 12. Literatura citada. Numere las referencias consecutivamente en el orden en que se mencionan por primera vez en el texto. Las referencias en el texto, en los cuadros y en las ilustraciones se deben identificar mediante números arábigos entre paréntesis, sin señalar el año de la referencia. Evite hasta donde sea posible, el tener que mencionar en el texto el nombre de los autores de las referencias. Procure abstenerse de utilizar los resúmenes como referencias; las “observaciones inéditas” y las “comunicaciones personales” no deben usarse como referencias, aunque pueden insertarse en el texto (entre paréntesis).

En el caso de tesis, se debe indicar el nombre del autor, el título del trabajo, luego entre corchetes el grado (licenciatura, maestría, doctorado), luego el nombre de la ciudad, estado y en su caso país, seguidamente el nombre de la Universidad (no el de la escuela), y finalmente el año. Emplee el estilo de los ejemplos que aparecen a continuación, los cuales están parcialmente basados en el formato que la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos usa en el Index Medicus. Revistas

Artículo ordinario, con volumen y número. (Incluya el nombre de todos los autores cuando sean seis o menos; si son siete o más, anote sólo el nombre de los seis primeros y agregue “et al.”). I)

Reglas básicas para la Literatura citada Nombre de los autores, con mayúsculas sólo las iniciales, empezando por el apellido paterno, luego iniciales del materno y nombre(s). En caso de

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

Sólo número sin indicar volumen. II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in

VII

pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10.

Beltsville Symposium: Biotechnology’s role in genetic improvement of farm animals. USDA. 1996:13.

III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status ofthe use of artificial insemination in developing countries. World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

No se indica el autor. IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

Suplemento de revista. V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

Organización, como autor. VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand. Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282-284.

En proceso de publicación. VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000.

Libros y otras monografías

Autor total. VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

Autor de capítulo. IX)

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor. Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

Memorias de reuniones. X)

Loeza LR, Angeles MAA, Cisneros GF. Alimentación de cerdos. En: Zúñiga GJL, Cruz BJA editores. Tercera reunión anual del centro de investigaciones forestales y agropecuarias del estado de Veracruz. Veracruz. 1990:51-56.

XI)

Olea PR, Cuarón IJA, Ruiz LFJ, Villagómez AE. Concentración de insulina plasmática en cerdas alimentadas con melaza en la dieta durante la inducción de estro lactacional [resumen]. Reunión nacional de investigación pecuaria. Querétaro, Qro. 1998:13.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domestic animals: strategies for conservation and development. In: Miller RH et al. editors. Proc XX

Tesis. XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989. XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

Organización como autor. XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984. XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996. XVII) AOAC. Oficial methods of analysis. 15th ed. Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990. XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988. XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Publicaciones electrónicas XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accessed Jul 30, 2003. XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicas para estimar la degradación de proteína y materia orgánica en el rumen y su importancia en rumiantes en pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134. http://www.tecnicapecuaria.org/trabajos/20021217 5725.pdf. Consultado 30 Ago, 2003. XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions. Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://www.sciencedirect. com/science/journal/03016226. Accessed Sep 12, 2003. 13. Cuadros, Gráficas e Ilustraciones. Es preferible que sean pocos, concisos, contando con los datos

VIII

necesarios para que sean autosuficientes, que se entiendan por sí mismos sin necesidad de leer el texto. Para las notas al pie se deberán utilizar los símbolos convencionales.

km kilómetro (s) L litro (s) log logaritmo decimal Mcal megacaloría (s) MJ megajoule (s) m metro (s) msnm metros sobre el nivel del mar µg microgramo (s) µl microlitro (s) µm micrómetro (s)(micra(s)) mg miligramo (s) ml mililitro (s) mm milímetro (s) min minuto (s) ng nanogramo (s)Pprobabilidad (estadística) p página PC proteína cruda PCR reacción en cadena de la polimerasa pp páginas ppm partes por millón % por ciento (con número) rpm revoluciones por minuto seg segundo (s) t tonelada (s) TND total de nutrientes digestibles UA unidad animal UI unidades internacionales

14 Versión final. Es el documento en el cual los autores ya integraron las correcciones y modificaciones indicadas por el Comité Revisor. Los trabajos deberán ser elaborados con Microsoft Word. Las gráficas y figuras se deberán elaborar en Word, Power Point, Corel Draw y enviadas en archivo aparte (nunca insertarlas como imágenes en el texto). Los cuadros no deberán contener ninguna línea vertical, y las horizontales solamente las que delimitan los encabezados de columna, y la línea al final del cuadro. 15. Una vez recibida la versión final, ésta se mandará para su traducción al idioma inglés o español, según corresponda. Si los autores lo consideran conveniente podrán enviar su manuscrito final en ambos idiomas. 16. Tesis. Se publicarán como Artículo o Nota de Investigación, siempre y cuando se ajusten a las normas de esta revista. 17. Los trabajos no aceptados para su publicación se regresarán al autor, con un anexo en el que se explicarán los motivos por los que se rechaza o las modificaciones que deberán hacerse para ser reevaluados. 18. Abreviaturas de uso frecuente: cal cm °C DL50 g ha h i.m. i.v. J kg

caloría (s) centímetro (s) grado centígrado (s) dosis letal 50% gramo (s) hectárea (s) hora (s) intramuscular (mente) intravenosa (mente) joule (s) kilogramo (s)

versus

gravedades

Cualquier otra abreviatura se pondrá entre paréntesis inmediatamente después de la(s) palabra(s) completa(s). 19. Los nombres científicos y otras locuciones latinas se deben escribir en cursivas.

Updated: April, 2018 INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is a scientific journal published in a bilingual format (Spanish and English) which carries three types of papers: Research Articles, Technical Notes, and Reviews. Authors interested in publishing in this journal, should follow the belowmentioned directives which are based on those set down by the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437. 1.

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Text. The three categories of articles which are published in Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias are the following:

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Title page Abstract Text Acknowledgments

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Examples The style of the following examples, which are partly based on the format the National Library of Medicine of the United States employs in its Index Medicus, should be taken as a model.

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Journals

Standard journal article (List the first six authors followed by et al.) I)

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

Issue with no volume II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10.

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III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status of the use of artificial insemination in developing countries. World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

No author given

b. The title of the paper should be written in full, followed by the abbreviated title of the journal without any punctuation sign; then the year of the publication, after that the number of the volume, followed by the number (in brackets) of the journal and finally the number of pages (this in the event of ordinary article).

IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

Journal supplement V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

c. Accepted articles, even if still not published, can be included in the list of references, as long as the journal is specified and followed by “in press” (in brackets).

Organization, as author

d. In the case of a single author’s book (or more than one, but all responsible for the book’s contents), the title of the book should be indicated after the names(s), the number of the edition, the country, the printing house and the year.

VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand. Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282284.

In press

e. When a reference is made of a chapter of book written by several authors; the name of the author(s) of the chapter should be quoted, followed by the title of the chapter, the editors and the title of the book, the country, the printing house, the year, and the initial and final pages.

VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide-treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000.

XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988.

Books and other monographs

Author(s)

XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

Electronic publications XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accesed Jul 30, 2003.

Chapter in a book IX)

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor. Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicas para estimar la degradación de proteína y materia orgánica en el rumen y su importancia en rumiantes en pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134. http://www.tecnicapecuaria.org/trabajos/20021217 5725.pdf. Consultado 30 Jul, 2003.

Conference paper X)

XI)

XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions. Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://www.sciencedirect.com/science/journal/030 16226. Accesed Sep 12, 2003.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domestic animals: strategies for conservation and development. In: Miller RH et al. editors. Proc XX Beltsville Symposium: Biotechnology’s role in genetic improvement of farm animals. USDA. 1996:13.

12. Tables, Graphics and Illustrations. It is preferable that they should be few, brief and having the necessary data so they could be understood without reading the text. Explanatory material should be placed in footnotes, using conventional symbols. 13. Final version. This is the document in which the authors have incorporated all the corrections and modifications asked for by the editors. Graphs and figures should be submitted separately in Microsoft Word, MS Power Point, or Corel Draw. Figures must not be inserted as images within the text. In Tables do not use internal horizontal or vertical lines.

Thesis XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989. XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

14. Once accepted, the final version will be translated into Spanish or English, although authors should feel free to send the final version in both languages. No charges will be made for style or translation services.

Organization as author XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984.

15. Thesis will be published as a Research Article or as a Technical Note, according to these guidelines. 16. Manuscripts not accepted for publication will be returned to the author together with a note explaining the cause for rejection, or suggesting changes which should be made for re-assessment.

XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996.

17. List of abbreviations:

XVII) AOAC. Official methods of analysis. 15th ed. Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990.

cal cm °C

XII

calorie (s) centimeter (s) degree Celsius

DL50 g ha h i.m. i.v. J kg km L log Mcal MJ m Âľl Âľm mg ml mm min ng

lethal dose 50% gram (s) hectare (s) hour (s) intramuscular (..ly) intravenous (..ly) joule (s) kilogram (s) kilometer (s) liter (s) decimal logarithm mega calorie (s) mega joule (s) meter (s) micro liter (s) micro meter (s) milligram (s) milliliter (s) millimeter (s) minute (s) nanogram (s)

probability (statistic) p page CP crude protein PCR polymerase chain reaction pp pages ppm parts per million % percent (with number) rpm revolutions per minute sec second (s) t metric ton (s) TDN total digestible nutrients AU animal unit IU international units

versus

gravidity

The full term for which an abbreviation stands should precede its first use in the text. 18. Scientific names and other Latin terms should be written in italics.

XIII

http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4758 Artículo

Frecuencia de Cryptosporidium en perros asociados a establos lecheros y en áreas urbanas del estado de Aguascalientes, México

Irene Vitela-Mendozaa* Kenia Padilla Díaza Carlos Cruz-Vázqueza Leticia Medina-Esparzaa Miguel Ramos-Parraa

Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes, Km 18 Carretera Ags-SLP., Municipio de El Llano, Ags., 20330, Aguascalientes, México.

* Autor de correspondencia: vitelairene@yahoo.com.mx

Resumen: El objetivo del estudio fue determinar la frecuencia de Cryptosporidium spp, así como llevar a cabo la identificación de algunos factores de riesgo asociados a la infección en perros asociados a establos lecheros en Aguascalientes, México, y en perros procedentes del área urbana de la capital del mismo estado. Se colectaron muestras de excremento de 168 perros domiciliados en 30 establos lecheros distribuidos en diez municipios del estado, y de 144 perros residentes del Centro de Control, Atención y Bienestar Animal (CCABA), del municipio de Aguascalientes (área urbana), las cuales se procesaron mediante frotis fecal teñido con Kinyoun para identificar la presencia de ooquistes del parásito. Se levantó una encuesta para identificar diferentes características de los individuos y se realizó un análisis de riesgos mediante regresión logística. La frecuencia general de perros infectados por Cryptosporidium spp., fue 20.5 % (64/312; IC95% 1625), mientras que en los perros procedentes del CCABA fue 9 % (13/144; IC95% 5-15), y en los asociados a establos fue de 30 % (51/168; IC95% 23-38). El 70 % de los establos tuvieron animales positivos, mientras que el promedio de perros por establo fue de 5.6, y la densidad fue de 2 a 12 perros. Se identificó como factor de riesgo a la infección por 1

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Cryptosporidium a la variable excremento diarreico, tanto en los perros de origen urbano (OR, 3.2; IC95% 1.06-9.79 P<0.03) como en los asociados a los establos (OR, 2.7; IC95% 1.36-5.49 P<0.001). En ninguna de las otras variables analizadas fue posible identificar una asociación estadísticamente significativa. Palabras clave: Cryptosporidium, Frecuencia, Perros, Factores de riesgo.

Recibido: 29/01/2018 Aceptado: 06/03/2018

Introducción

La criptosporidiosis es una parasitosis intestinal causada por protozooarios del género Cryptosporidium (Apicomplexa: Cryptosporiidae); a diferencia de otros coccidios los ooquistes de Cryptosporidium spp, son infectantes desde el momento de ser excretados por los individuos afectados y pueden infectar a otro huésped al tiempo de ser ingeridos. Este protozoario es de distribución cosmopolita, considerado como parásito oportunista, causante de trastornos digestivos severos en individuos jóvenes, afecta a numerosas especies de animales domésticos, silvestres y al ser humano(1). La tendencia actual a poseer mascotas, particularmente perros y gatos es común en todo el mundo; el contacto con los animales produce un vínculo afectivo y ayuda a los niños en su desarrollo emocional, aunque los perros están expuestos a numerosas infecciones parasitarias, representando un riesgo de transmisión tanto a otros animales como a los humanos(2). Los perros pueden ser naturalmente infectados por C. canis(3), C. parvum(4), C. meleagridis(5) y C. muris(6); generalmente la infección es asintomática; sin embargo en ocasiones puede cursar con manifestaciones clínicas severas que incluyen diarrea acuosa, fiebre y puede afectar el aparato respiratorio, hígado y páncreas, especialmente en animales inmunocomprometidos(7,8). La criptosporidiosis canina tiene una amplia distribución y se ha reportado en perros con dueño, en criaderos, en refugios, así como en perros callejeros, principalmente en áreas urbanas y en algunas comunidades rurales de diversas partes del mundo(9,10,11). En México, existe escasa información sobre los rasgos epidemiológicos de esta parasitosis en poblaciones de perros asociadas a las áreas y comunidades urbanas y rurales, que permita comprender su potencial participación en la transmisión y mantenimiento de la

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infección tanto a otros animales domésticos, como al ganado bovino, así como al ser humano. El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de Cryptosporidium spp, así como llevar a cabo la identificación de algunos factores de riesgo asociados a la infección, en una muestra de perros de ambiente rural asociados a establos lecheros en Aguascalientes, México, y otra de perros procedentes del área urbana de la capital del mismo estado.

Material y métodos

El estudio se realizó en el estado de Aguascalientes, que se encuentra localizado a 21° 37' y 22° 01' N y 101° 52' y 102° 35' O, con altitud entre 1,765 y 2,400 msnm, temperatura promedio anual de 17.4 °C, y precipitación pluvial media anual de 526 mm, que se concentra en el verano(12).

Sitios de muestreo de perros asociados a establos lecheros

Se seleccionaron por conveniencia, 30 establos lecheros distribuidos en 10 municipios del estado de Aguascalientes. En cada uno de los municipios se seleccionaron tres establos considerando que contara al menos con un perro domiciliado, y que el propietario proporcionara las facilidades pertinentes para desarrollar el trabajo.

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Figura 1: Localización de los establos incluidos en el estudio, los cuales están señalados con los números 1, 2 y 3 en cada municipio, así como del CCABA

Los municipios son: Pabellón de Arteaga (PA), Asientos (ASI), San José de Gracia (SJG), Cosío (COS), Tepezalá (TEP), Rincón de Romos (RR), San Francisco de los Romo (SFR), Calvillo (CAL), Jesús María (JM), Aguascalientes (AGS) y El Llano (ELL).

Sitio de muestreo de perros del área urbana

Esta actividad se desarrolló en las instalaciones del Centro de Control, Atención y Bienestar Animal del municipio de Aguascalientes (CCABA), sitio en que se alojan perros sin dueño que son recogidos de las calles del área urbana, así como aquellos que son abandonados por sus propietarios en estas instalaciones. De acuerdo a las normas y procedimientos de CCABA, los perros que no son reclamados en el término de 72 h, son sacrificados humanitariamente de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM-033SAG/ZOO-2014.

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Toma de muestras

Los establos lecheros se visitaron por una sola ocasión, colectando una muestra de excremento de aproximadamente 25 g, de cada uno de los perros, mismos que se mostraban clínicamente sanos; en total se obtuvieron 168 muestras. El CCABA se visitó una vez por semana durante un periodo de tres meses; en cada ocasión se eligieron al azar 12 perros clínicamente sanos de los cuales se tomó una muestra de excremento previo a su sacrificio; en total se obtuvieron 144 muestras. Las muestras se trasladaron al laboratorio en condiciones de refrigeración para ser procesadas el mismo día de la colecta, y se acompañaron de una encuesta con datos de identificación del perro, tales como el sexo, edad (mediante la revisión de la dentición), así como de la consistencia de la muestra de excremento (firme/diarreica); en los animales asociados a establos, se registró además información sobre la alimentación (seco balanceado/preparado en casa/combinado), sitio donde beben agua (bebederos exclusivos de los perros/compartidos con otras especies), y el programa de medicina preventiva (vacunación/desparasitación).

Diagnóstico parasitoscópico

Las muestras se procesaron de acuerdo a lo descrito por Castillo et al(13), tomando, en cada caso, 10 g de excremento diluyendo muestra 1:1 con agua oxigenada, preparando seis frotis fecales sobre una laminilla. Después se dejó secar por 24 h a temperatura ambiente y se tiñeron mediante la técnica de tinción ácido-alcohol resistente de Kinyoun, y se observó el frotis en un microscopio (LCD Digital, Leica®) a 100X. Con la finalidad de minimizar las lecturas de falsos positivos, la muestra se consideró positiva cuando se observaron al menos ≥ 5 ooquistes de Cryptosporidium spp., después de revisar los seis frotis (los ooquistes se presentan de forma esférica y teñidos de color rojo a rosa pálido).

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Análisis de la información

Se calculó la frecuencia de perros positivos a Cryptosporidium spp., en base al resultado del examen parasitoscópico en la muestra total y de acuerdo a diferentes características de los perros en las dos poblaciones estudiadas. Se realizó un análisis de riesgos mediante regresión logística(14), en donde la variable dependiente fue el estado de infección parasitario y las variables independientes se seleccionaron por el método “backward step by step”, y según la prueba de Ji cuadrada, se excluyeron las variables no significativas (P<0.05). Las posibilidades de riesgo (OR) se estimaron para las variables independientes que mostraron significancia estadística en el análisis multivariado (P<0.05). El análisis se desarrolló con el programa Statistics Data Analysis (STATA) v. 9.1

Resultados

La frecuencia general de perros infectados con Cryptosporidium spp., diagnosticada mediante el análisis parasitoscópico, fue de 20.5 % (64/312; IC95% 16-25), mientras que en los perros procedentes del área urbana del municipio de Aguascalientes fue de 9 % (13/144; IC95% 5-15), y en los asociados a establos lecheros de 30 % (51/168; IC95% 23-38). La frecuencia de la infección por Cryptosporidium spp., de acuerdo al municipio de origen de los perros asociados a establos lecheros se muestra en el Cuadro 1. En el mismo se puede observar que la frecuencia más alta se registró en el municipio de Jesús María (58 %), mientras que la menor lo fue en el de Cosío (15 %). El 100 % de los municipios estudiados tuvieron animales positivos, mientras que solo 70 % de los establos (21/30), tuvieron animales positivos. El promedio de perros por establo fue de 5.6, y la densidad fue de 2 a 12 perros.

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Cuadro 1: Distribución de la infección por Cryptosporidium spp., en diez municipios del estado de Aguascalientes, México Municipio/Establo Aguascalientes 1 2 3 Asientos 1 2 3 Cosío 1 2 3 El Llano 1 2 3 Jesús María 1 2 3 Pabellón de Arteaga 1 2 3 Rincón de Romos 1 2 3 San Fco. de los Romo 1 2 3 San José de Gracia 1 2 3 Tepezalá 1 2 3 Total

Positivas

18 9 5 4 14 7 2 5 13 2 6 5 31 12 10 9 19 2 8 9 22 11 6 5 11 5 4 2 16 5 4 7 12 4 4 4 12 3 5 4 168

4 4 3 2 1 2 1 1 12 6 4 2 11 2 6 3 4 2 2 0 4 4 4 1 3 2 2 5 3 2 51

* IC: Intervalo de confianza 95%.

Frecuencia (%)

IC 95%*

7-48

5-51

2-46

22-57

33-78

6-41

12-68

8-52

3-49

16-71

23-38

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La frecuencia de animales positivos a Cryptosporidium spp., de acuerdo a las diferentes características registradas en la encuesta individual, se muestran en el Cuadro 2. La mayoría de los perros incluidos en el estudio fueron jóvenes, no mayores de 18 meses, y en estos mismos la frecuencia de la infección fue más importante; en los perros asociados a establos la frecuencia fue mayor que en los del área urbana (37 y 12 %, respectivamente). En ambas poblaciones, las hembras tuvieron más casos positivos que los machos, y en las muestras de excremento diarreico la frecuencia de casos positivos al parásito fue más alta que en las muestras de consistencia firme (31 y 11 %, respectivamente). En los perros asociados a los establos, la frecuencia de casos positivos al parásito de acuerdo al tipo de alimento que consumían, mostró valores de 22, 32 y 36 % para alimento seco, preparado en casa y combinado, mientras que en los perros que consumía agua en bebederos exclusivos, la frecuencia fue más alta que en los que compartían el bebedero. Los perros vacunados contra alguna enfermedad infecciosa, generalmente rabia, y los no vacunados, tuvieron valores prácticamente iguales, mientras que los perros no desparasitados resultaron con mayor frecuencia de casos positivos al parásito.

Cuadro 2: Frecuencia de Cryptosporidium spp., diagnosticada por microscopía en perros del estado de Aguascalientes, México, de acuerdo a diferentes características

Variable

Perros del área urbana n Posit. %

Edad (meses): 0-6 7-18 19-66 > 66

58 41 28 17

7 3 1 2

12 7 3 12

67 49 20 32

25 15 3 8

37 31 15 25

125 90 48 49

32 18 4 10

26 20 8 20

Sexo: Macho Hembra

74 70

6 7

8 10

78 90

20 31

25.6 34

152 160

24 40

16 25

Excremento: Firme Diarreico

90 54

5 8

5 15

77 91

14 37

18 41

167 145

19 45

11 31

37 28 103

8 10 33

22 36 32

37 28 103

8 10 33

22 36 32

98 70

42 9

43 13

98 70

42 9

43 13

121 47 37 131

36 15 7 44

30 32 19 33

121 47 37 131

36 15 7 44

30 32 19 33

Alimento: Seco Preparado Combinado

Agua bebida: Exclusiva Compartida

Medicina preventiva: Vacunación No vacunación Desparasitación No desparasitación

Perros asociados a establos n Posit %

na: no aplica. 8

Total Posit. %

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El análisis de riesgos indicó que la variable excremento diarreico (OR, 3.2; IC95% 1.069.79 P<0.03) en los perros de origen urbano y en los perros asociados a los establos (OR, 2.7; IC95% 1.36-5.49 P<0.001), están relacionados con la frecuencia del parásito determinada por el análisis parasitoscópico. En ninguna de las otras variables analizadas fue posible identificar una asociación estadísticamente significativa.

Discusión

La literatura reporta que la prevalencia de la infección por Cryptosporidium en perros con dueño y callejeros en áreas urbanas y rurales se encuentra en un rango de 1 a 45 %, y que es más importante en cachorros que en animales adultos(9-11,15-21). Aunque hay que considerar que cada estudio guarda características únicas en su diseño, prueba diagnóstica, región geográfica y condiciones ambientales. En el presente trabajo, la frecuencia de infección en perros del área urbana fue 9 %, lo que sitúa a la población estudiada en un nivel relativamente bajo, situación similar a la observada en perros con dueño domiciliados en la ciudad de México, en la cual se determinó una frecuencia de infección de 11.5 %(22). En los perros asociados a establos lecheros, la frecuencia determinada en el presente estudio fue de 30 %, sensiblemente más alta que la observada en los perros del área urbana; además, la presencia de animales positivos a la prueba se encuentra ampliamente distribuida en los sitios de muestreo, lo que confirma el carácter cosmopolita de Cryptosporidium; en la literatura se ha reportado una situación similar, en donde perros callejeros y con dueño de comunidades rurales tiene mayor frecuencia de infección que los perros de ciudad(9). Hasta donde se conoce, no existen reportes en la literatura sobre la presencia de Cryptosporidium spp., en perros asociados a establos lecheros. Cabe mencionar que la criptosporidiosis en el ganado lechero de Aguascalientes se encuentra ampliamente distribuida, con una importante presencia en becerras de reemplazo, en las cuales se ha determinado una prevalencia entre 40 y 67 %, identificándose como única especie presente a C. parvum(13,23). La frecuencia de Cryptosporidium en este estudio fue más importante en perros jóvenes, situación observada por otros autores(15,22); la información indica que la prevalencia a la infección tiende a disminuir en los cachorros infectados naturalmente conforme crecen(24); sin embargo, la edad no es considerada un factor de riesgo a contraer la infección(25,26), como lo ha sido también en el presente trabajo. El género de los animales no tuvo influencia en la presentación de casos positivos al protozoario en las poblaciones estudiadas, esto a pesar de que las hembras mostraron 9

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valores más altos que los machos; en otros estudios se ha observado este mismo resultado, y al igual que en este trabajo, no ha sido posible considerar al género como un factor de riesgo(25,27,28). La presencia de diarrea es considerada un signo clínico preponderante en la criptosporidiosis canina(8), en el presente estudio las muestras de excremento consideradas por su consistencia como diarreicas, tuvieron mayor frecuencia de casos positivos que las heces firmes, y se identificó como un factor de riesgo, tanto en los perros de origen urbano (OR 3.2), como en los asociados a los establos (OR 2.7); cabe mencionar que las muestras provenían de animales clínicamente sanos, de tal forma que se considera que estos eran portadores asintomáticos. En la literatura se ha mencionado que los perros con diarrea excretan más ooquistes que aquellos que no muestran este signo clínico(29), reconociéndose como un factor de riesgo(15,25,27). Los perros asintomáticos o con episodios de diarrea esporádica son fuente de contaminación al suelo y agua en el entorno en que habitan, y debido a la resistencia de los ooquistes al medio ambiente, representan un riesgo de transmisión importante para el ser humano, así como para otros animales domésticos y silvestres, tanto en los ambientes rurales y de convivencia con el ganado, como en las ciudades y entornos peridomésticos(1). En los perros asociados a los establos lecheros, el tipo de alimentación no fue identificado como factor de riesgo, similar situación se observó en otro estudio(25), pero debe notarse que los perros estudiados deambulan libremente en las instalaciones del establo lechero, de manera que pueden tener acceso a fetos y desechos placentarios así como desarrollar esporádicamente cacería de pájaros y pequeños roedores. El agua de bebida ha sido considerado un vehículo apropiado para la transmisión de Cryptosporidium, especialmente en las poblaciones humanas(1);sin embargo, en este estudio solo se evaluó el uso del recipiente en que beben agua los perros, y esta variable no se identificó como factor de riesgo; en otro estudio, se evaluó la fuente del agua de bebida, sin embargo, no se encontró que fuera un factor de riesgo(25). La existencia de un programa mínimo de medicina preventiva en los perros asociados a los establos, reflejó que tanto los perros vacunados como los no vacunados sufren por igual la parasitosis; sin embargo, los que reciben un tratamiento antiparasitario presentaron menor frecuencia de infección que los que no lo reciben, aun así, esta variable no fue identificada como un factor de riesgo y tampoco de protección. De acuerdo a la información recabada en el presente estudio, es posible estimar que el ambiente prevalente en los establos lecheros favorece la transmisión y mantenimiento de la infección, además de que la densidad de perros en cada establecimiento, su movilidad y la interrelación que tienen con otros animales domésticos y silvestres también colaboren en esta situación; mientras que los perros en el ambiente urbano, la mayoría de ellos callejeros, se enfrentan a una situación ambiental diferente y resultan menos expuestos a la infección.

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Conclusiones e implicaciones

La infección por Cryptosporidium spp., está presente tanto en perros del ámbito urbano como en los que se encuentran asociados a establos lecheros, siendo que en los primeros la frecuencia es relativamente baja, mientras que en los segundos ésta debe de considerarse elevada. La distribución de la infección es amplia en las áreas rurales consideradas en el estudio y son reflejo de la capacidad infectiva del protozoario, siendo recomendable estudiar la relación perros-ganado bovino en la epidemiología de esta parasitosis. En tanto que debe de considerarse que ambas poblaciones de perros representan un riesgo para la transmisión al ser humano, ya que pueden ser portadores tanto de C. canis como de C. parvum.

Agradecimientos

Se agradece al personal del CCABA del municipio de Aguascalientes, así como a los ganaderos participantes en el estudio, su colaboración desinteresada en el desarrollo de este trabajo. El proyecto estuvo financiado por el Tecnológico Nacional de México.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4241 Artículo

Distribución potencial de Musca domestica en el municipio de Jesús María, Aguascalientes, con el uso de escenarios de cambio climático

Antonio de Jesús Meraz Jiméneza Armando López Santosb Carlos Alberto García Munguíac Jorge Alejandro Torres Gonzáleza Alberto Margarito García Munguíaa*

Universidad Autónoma de Aguascalientes. Centro de Ciencias Agropecuarias, Jesús María, Aguascalientes, México. b

Universidad Autónoma Chapingo. Unidad Regional Universitaria de Zonas Áridas. Bermejillo, Durango, México. c

Universidad de Guanajuato. Departamento de Veterinaria y Zootecnia, DICIVA. Irapuato, Guanajuato, México.

Autor de correspondencia: almagamu@hotmail.com

Resumen: M. domestica es el mayor parásito doméstico que causa descomposición de alimentos y actúa como vector de más de 100 patógenos para la medicina humana y veterinaria, tiene una cercana asociación con el hombre y su ambiente. El objetivo del presente estudio fue evaluar el desarrollo de M. domestica a diferentes niveles de temperatura y humedad relativa y determinar su potencial incidencia en el municipio de Jesús María, Aguascalientes. El estudio se desarrolló en el Centro de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Aguascalientes (CCA-UAA), que presenta un clima semiseco templado (BS1k) con 14

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promedios anuales de temperaturas y precipitación de 16 a 18 °C y 500 a 600 mm, respectivamente; se evaluaron seis tratamientos con diferentes temperaturas y humedad relativa. Los resultados se analizaron en un diseño completamente al azar y mediante comparación de medias de Tukey (α=0.005). Los resultados muestran que la mosca doméstica se puede desarrollar a temperaturas ambientales de 20 a 30 °C; y con base en el modelo CNRMCM5 (RCP4.5) en diferentes horizontes de tiempo cercano (2015-2039), medio (2040-2060) y lejano (2090) de escenarios de cambio climático, la mosca tendrá una duración de alrededor de tres meses para el horizonte cercano y de cinco meses para el medio y lejano. Con estos datos se provee información importante que permite planear el desarrollo de estrategias para su prevención, monitoreo y control. Palabras clave: Parásito, Vector, Temperatura, Humedad relativa, Precipitación pluvial.

Recibido: 02/08/2016 Aceptado: 05/03/2018

Introducción

Musca domestica es un insecto sinantrópico, que tiene una cercana asociación con el hombre y su ambiente; se puede encontrar en cualquier lugar donde existe población humana, y además se asocia con animales de corral, como aves, ganado vacuno, equino y porcino(1), es por ello que tiene un alto potencial en la propagación de diversas enfermedades que pueden pasar de una persona a otra, o bien del animal a la persona(2). Se estima que en los Estados Unidos de América se gastan anualmente 1.6 millones de dólares americanos en insecticidas para el control de este parásito en granjas avícolas(3). La importancia en la prevención, monitoreo y control de M. domestica es debido a que se trata del principal parásito doméstico que causa irritación, descomposición de alimentos y actúa como vector de más de 100 patógenos(4). Además, está implicada en la propagación de alrededor de 30 enfermedades causadas por bacterias y protozoarios, aunque, M. domestica puede prosperar sin causar ninguna infección(5).

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La temperatura es un factor limitante importante para la supervivencia de poblaciones ectotermas, como las moscas, que a menudo permanecen expuestas a las variaciones térmicas extremas en su hábitat natural, sobre todo durante los meses de verano(6). La temperatura de 25 °C es la más cercana al óptimo desarrollo de la M. domestica(7); varios factores del ambiente como la temperatura, precipitación, humedad relativa y el tipo y uso de suelo tienen una influencia directa en la dinámica de sus poblaciones(8). Está claro que la presencia y persistencia de M. domestica puede exacerbarse por el ganado doméstico, como es el caso del estado de Aguascalientes, donde hasta 2015(9) registró una gran cantidad de establos que sumaron una población de bovino lechero aproximadamente de 20 mil cabezas. La interacción con áreas urbanas densamente pobladas, por ejemplo para regiones ganaderas como la Comarca Lagunera, semejante al caso de Aguascalientes, y en particular de Jesús María, puede ocasionar problemas de salud pública por la gran cantidad de enfermedades que propaga, por lo que es importante tomar medidas de control de dicho insecto. Por ello, se planteó como objetivo evaluar el desarrollo poblacional de M. domestica con variaciones de temperatura y humedad relativa, para determinar su distribución potencial en el escenario de cambio climático CNRMCM5 (RCP4.5) y tres periodos de tiempo futuro, cercano (2015-2039), medio (2045-2069) y lejano (2075-2099) para el municipio de Jesús María del Estado de Aguascalientes.

Material y métodos

La presente investigación se realizó en el laboratorio de análisis de recursos naturales y sistemas agrarios, del Centro de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Aguascalientes (CCA). Se utilizó una incubadora del laboratorio de investigación de clínica veterinaria e invernadero. Las pupas de mosca utilizadas como progenitoras se recolectaron en el área pecuaria del CCA, para su posterior desarrollo en laboratorio. Las pupas recolectadas, se colocaron en jaulas de 30 x 30 x 30 cm a una temperatura de 24 ± 2° C, elaboradas con alambre de acero inoxidable y cubiertas con tela tipo tul (100% nylon) donde se llevó a cabo la reproducción de la mosca; una vez emergidas las moscas, se alimentaron con agua azucarada al 10% con la que se saturaron pequeñas porciones de algodón, y como sustrato para oviposición y alimentación de las larvas se utilizó una mezcla de agua con salvado de trigo (70 %), otra de leche en polvo y agua (30 %). Las pupas obtenidas de las jaulas fueron las que se usaron para el establecimiento del experimento a diferente temperatura y humedad relativa (HR). Cada pupa se colocó en vasos 16

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de polipropileno de una onza con tapa para evitar la copulación entre hembra y macho. Una vez que emergieron, las moscas fueron sexadas y colocadas en diferentes jaulas (tamaño 30 x 30 x 30 cm); de ahí se extrajeron nueve hembras y nueve machos, las cuales se colocaron en tres jaulas (tamaño 10 x 10 x 10) cm de acero inoxidable y cubiertas con tela tul con tres individuos por sexo en cada una. Este diseño fue sometido a seis tratamientos con condiciones diferentes de temperatura y humedad relativa (Cuadro 1).

Cuadro 1: Clave por tratamiento, rangos de temperatura y humedad relativa definidos para el experimento en M. domestica Tratamientos T1 T2 T3 T4 T5 T6

Temperatura (°C) 27.5 ± 2.5 22.5 ± 2.5 32.5 ± 2.5 32.5 ± 2.5 35 32.5 ± 2.5

Humedad relativa (%) 90 a 95 60 a 65 20 a 25 35 a 40 90 15 a 20

El diseño experimental fue completamente aleatorizado con tres repeticiones. Se evaluaron las variables de número de larvas, pupas y emergencia de mosca por jaula con ayuda del programa STATISTICA® Versión 13. Además, se utilizó la Red Nacional de Estaciones Estatales Agroclimatológicas, Agroclima(10) del Instituto Nacional de Investigaciones, Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) para obtener datos de las temperaturas máxima, mínima y media, así como de humedad relativa (HR) para el municipio de Jesús María; con base en ello, se analizó la relación de las variables con el desarrollo poblacional de M. domestica y su posible infestación en el área de estudio. Los datos climáticos se interpolaron por el método basado en el inverso de la distancia ponderada (IDW, por sus siglas en inglés), el cual es descrito y aplicado en casos semejantes por diversos autores(11,12). El primer producto del proceso geoespacial fue la creación de una imagen de barrido (raster) ajustada al máximo y mínimo como valores extremos. El segundo producto fue una imagen clasificada a partir del cambio de sus propiedades en cinco clases asociado a su distribución a nivel de municipal. Las imágenes raster de temperatura mínima se construyeron con base en el modelo creado por el Centro Nacional de Investigación Meteorológica (CNRM, por sus siglas en francés), bajo la nomenclatura: CNRMCM5 (RCP4.5)(13), el cual forma parte del 5° Informe de Valoración de Cambio Climático del IPCC(14). Este y otros modelos (GDFLCM3, HADGEM2-ES, etc.), tras ser probados y re-escalados de 0.5° x 0.5° (55 x 55 km, aproximadamente) a 30” x 30” (926 x 926 m) para su aplicación en la Región México, Sur 17

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de los Estados Unidos de América y el Caribe, fueron descargados del portal de la Unidad de Informática para las Ciencias Atmosféricas y Ambientales (UNIATMOS) del Centro de Ciencias de la Atmósfera de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)(15). El CNRMCM5, se procesó a partir de diferentes horizontes de tiempo futuro: cercano (20152039), medio (2045-2069) y lejano (2075-2099). Para ello, se utilizaron distintos módulos del programa ArcMap 10.2.2® (ESRI, Redlands, CA).

Resultados y discusión

Desarrollo de larvas

Al hacer la comparación entre medias del número de larvas por tratamiento, se observó que el tratamiento uno (T1) fue el mejor con 161 larvas por jaula (Figura 1). Por el contrario, en los tratamientos donde no se presentaron larvas se debió a la variabilidad de la temperatura, ya que el desarrollo de las larvas depende de ésta(16), siendo 8 °C el umbral para su desarrollo(17). Las larvas prefieren para su desarrollo temperaturas de 35 °C con alta humedad y cuando están completamente desarrolladas de 15 a 20 °C con baja HR, y no resisten temperaturas por encima de los 45 °C(18). En otro estudio se reporta que la mayor distribución de larva de mosca en gallinaza ocurre a una temperatura de 17 a 35 °C(19).

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Figura 1: Comparación de medias del número de larvas de M. domestica por tratamiento 180

160

No. de Larvas

140

120 100 C

80 60 40 20

0 T1

Tratamientos *Valores con la misma letra no presentan diferencia significativa (P≤0.01).

El T5 fue el segundo mejor después del T1, con 122 larvas por jaula; la diferencia entre estos dos fue la temperatura más baja para el primero (25 a 30 °C para el T1 y 35 °C para el T5) y la HR constante para el T5. La humedad es un factor determinante para la sobrevivencia de las larvas, ya que se secan si no hay suficiente, mientras que demasiada humedad conduce a su ahogamiento(20).

Desarrollo larvario a estado de pupas

En tres de los seis tratamientos (T3, T4 y T6) no hubo presencia de larva debido a que al inicio del experimento las temperaturas no permitieron el desarrollo del huevecillo. Debido a que esos tratamientos están por encima de los 30 °C con baja humedad relativa, y la máxima ovoposición M. domestica está entre los 25 a 30 °C y los huevecillos deben de permanecer húmedos o no eclosionarán(21). En el paso del estadio larvario a pupa, nuevamente el T1 fue mejor que los demás tratamientos, ya que sobrevivieron 115 pupas en promedio por jaula de las 160 larvas, seguido del T2 con 62 pupas de 72 larvas por jaula (Figura 2), en el T5 solo el 9.5 % 19

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sobrevivió de larva a pupa (12 pupas de 122 larvas); esto se pudo deber a la alta HR que fue del 90 % a las que fueron expuestas; mismo efecto fue observado en un estudio en donde la máxima mortalidad se presentó al llegar al 100 % de HR y una temperatura superior a los 30 °C(22). La pupa tolera menor humedad que la larva y puede desarrollarse a temperatura de 35 a 40 °C pero solo en un periodo mínimo de 3 a 4 días(18), mientras que en este estudio, las pupas permanecieron por 16 días y a temperaturas 35 °C. En un estudio se encontró que a temperaturas de 48 °C (por 15 min) se eliminan todas las etapas del ciclo de vida de la mosca, a 37 °C sobrevivieron por poco más de 4 h y a 42 °C y solo afectó a los adultos (aunque solo fueron expuestos durante una hora aproximadamente), mientras que en el caso de las pupas se observó resistencia hasta 44 a 46 °C(23). En dicho estudio los periodos a los que fueron sometidos los tratamientos fueron relativamente cortos (de algunas horas), mientras que en este estudio se sometieron a las diferentes condiciones de temperatura y HR hasta completar el ciclo de vida de la mosca, que fue de 19 a 22 días. Se realizó un análisis de varianza entre tratamientos para comparar el porcentaje de larva transformada a pupa y se encontró que los tratamientos uno y dos fueron los mejores con el 74 y 86 % de pupas respectivamente.

Figura 2: Comparación de medias del número de pupas de M. domestica por tratamiento.

120

No. de Larva

No de Pupas

100

60 40

0 T1

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

A *A

90 80 70 B 60 50 40 30 20 10 *B D D *B D *B *B 0 T3 T4 T5 T6

No de Larvas (I)

% de Lar va a Pupa

140

Tratamientos

*Valores con la misma letra no presentan diferencia significativa (P≤0.01).

Cambio de estado pupa a estado adulto

En relación a la emergencia de los adultos, el tratamiento 1 fue el mejor, por tener la mayor emergencia de adultos por jaula, con 85, le siguió el tratamiento 2 con 54 adultos (Figura 3). 20

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De lo anterior se deduce que la temperatura ideal para el desarrollo de las mosca en este estudio fue de 20 a 30 °C. En otro estudio se observó una alta densidad de moscas a una temperatura media de 20 a 25 ºC y no se detectó presencia de mosca en temperaturas mayores de 45 °C ni en menores de 10 °C(17). De igual manera, en un estudio similar se encontró que el mayor número de moscas se dio a temperaturas entre los 25 y 35 ºC(24), por lo que el rango observado en este estudio está dentro de lo reportado por dichos estudios.

Figura 3: Comparación de medias del número de adultos de M. domestica por tratamiento 120

100

No. de Pupas

No. de Mosca

70 60

50 40 30

*A No. De Pupas (I)

* de Pupas a Mosca (D)

60 B

60 40 40

% de Pupa a Mosca

0 T1

C *B

10 0

Tratamientos

*Valores con la misma letra no presentan diferencia significativa (P≤0.01).

Al realizar el análisis de la transformación de pupa a adulto, el tratamiento 2 y 1 porcentualmente son mejores con el 84 y 74 % respectivamente de emergencia (54 y 85 adultos respectivamente). En el caso del T2 con una HR de 62.5 ± 2.5 % se acerca a lo reportado en estudios similares, donde mencionan que la HR óptima para el desarrollo de la mosca es de 65 a 75 %(22). Es por eso que este tratamiento es más consistente en cuanto al desarrollo de sus diferentes etapas. En el caso del tratamiento cinco, tanto el número de pupas (11) como el de adultos (1) fueron mínimos (Figura 3).

Cambio de estado larvario a estado adulto

En el análisis del porcentaje del desarrollo larvario al estado adulto, el tratamiento 2 y 1 estadísticamente fueron los mejores con el 73 y 55 % de adultos respectivamente (Figura 4). 21

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Figura 4: Comparación del número de larvas de M. domestica y el porcentaje de larva a adulto 160

*% de Larva a Mosca (D)

140

No. de larvas

No. de larva (I)

80 70

120

60 *A

100

50 C

0 T1

D *B

*B T3

*B T5

% de lar va a mosca

180

10 *B

Tratamientos *Valores con la misma letra no presentan diferencia significativa (P≤0.01).

Relación entre la temperatura y humedad y las condiciones de desarrollo de M. domestica

Al relacionar los datos de la temperatura y la humedad relativa en el área del CCA durante el año 2015, con la presencia de M. domestica, y los resultados obtenidos en este estudio, se estima que el aumento de la población de la mosca se dio en los meses de junio (con una temperatura mínima extrema de 11.8 °C) a agosto (temperatura mínima extrema de 10 °C), como se muestra en la Figura 5; siendo esta última temperatura el límite para la eclosión de los huevos y en la que la mosca adulta prácticamente no puede volar(17), por ende se infiere que hay poca copulación. Como regla general la ovoposición no tiene lugar por debajo de 15 °C(18), lo cual hace que en los meses de abril y mayo las poblaciones de mosca se mantienen bajas en comparación con los meses con mayor temperatura. Con estos datos se podrá determinar el comportamiento de la mosca, ya que como se ha dicho, ésta entra en mayor activad a temperaturas altas (30 a 33 °C) y humedad relativa baja; por el contrario disminuye su actividad a temperaturas y humedad altas(17,25). En otro trabajo se observó que la abundancia de la mosca se vio influida únicamente por los cambios de lluvia y humedad relativa, ya que la temperatura se mantuvo prácticamente constante durante el año(24). De la

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misma manera, en explotaciones equinas el tamaño de la población de mosca se vio afectada por la temperatura y la humedad, ya que la población de moscas aumenta en primavera cuando las temperaturas suben y disminuye en otoño cuando las temperaturas bajan(26). Se ha observado que la temperatura tiene un gran impacto en la actividad física de M. domestica durante el día, la actividad se incrementa con la temperatura a intervalo de 10 a 30-35 °C, además de que se incrementa la dispersión y transmisión de patógenos, y la actividad física disminuye cuando la temperatura está por arriba de 35 °C(27). Esto indica que la mosca tiene un amplio rango de temperaturas para realizar su actividad; esta información se puede utilizar para establecer medidas preventivas y evitar algún brote de enfermedades.

72 70 68 66 64 62 60 58 56 54 52 50 48 46 44 42

H. Relativa (I) Máxima (D) Mínima (D) Media (D) Minima extrema (D)

30 25 20 15 10

Temperatura °C

Humedad relativa ,%

Figura 5: Temperaturas y humedad relativa para el municipio de Jesús María durante el año 2015

0 -5 1

Mes Fuente: Red Nacional de Estaciones Estatales Agroclimatológicas, Agroclima (INIFAP).

Modelo de proyección de temperaturas mínimas

El conocer las temperaturas mínimas extremas que se presentarán en el futuro en el municipio de Jesús María, permitirá predecir en qué momento la mosca tiene las condiciones ideales para su desarrollo, para esto, se tomó como base el modelo CNRMCM5. RCP45, desarrollado por la UNAM. Los resultados de este experimento muestran que la temperatura es el valor más significativo que induce la mortalidad(22) de M. domestica, mientras que la humedad 23

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relativa jugó un papel importante en la regulación de la viabilidad, pero a un rango moderado de temperatura. Para el caso del horizonte cercano, se mantendrán las condiciones actuales, es decir, con el desarrollo de la mosca durante los meses de junio a agosto, mientras que para los horizontes mediano y lejano, se incrementarán dos meses las condiciones favorables para el desarrollo de la mosca, de mayo a septiembre (Figura 6). Las proyecciones anteriores van a depender igualmente de otros factores como el viento, alimento, luz y la humedad relativa de la zona. Con este resultado se puede prever que las poblaciones de M. domestica, se mantendrán estables hasta el año 2039. En el caso del Reino Unido utilizaron modelos de escenarios de cambio climático y predicen que la población de la mosca podría tener aumentos de hasta el 244 % en 2080 con incrementos en los meses de verano(28).

Figura 6: Proyección de las temperaturas mínimas extremas en diferentes horizontes cercano 2015-2039, medio 2045-2069, lejano 2075-2099 e INIFAP 2015, del municipio de Jesús María

Temperatura mínima exterma °C

Cercano

Medio

Lejano

Inifap 2015

12 10 8 6 4 2 0 -2

Mes

Fuente: (15) y Red nacional de estaciones estatales agroclimatológicas, Agroclima INIFAP.

Con esta información se puede contribuir para establecer programas de control en periodos más favorables para el desarrollo de las moscas y evitar afectaciones en explotaciones pecuarias; en la agroindustria, disminuir la contaminación de alimentos y la propagación de enfermedades a la población. La mosca tiene un alto potencial reproductivo, por lo que requiere de buenas prácticas de control para proteger la salud humana y animal (29). Los métodos de control de la mosca se investigan en países desarrollados, sobre todo los que van dirigidos a granjas e industrias lácteas, donde se formulan los agentes de control y estos son igualmente aplicados en asentamientos humanos y zonas rurales(1). En los casos en que se 24

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vayan a realizar aplicaciones de algún insecticida para el control de la mosca, estos datos ayudarán a programar dichas actividades y hacerlas más eficaces. En esta proyección no se toman en cuenta los factores bióticos como predadores y parasitoides que se pueden llegar a presentar en próximos años(28). En la (Figura 7) se muestra la distribución potencial de los diferentes rangos de temperatura en el municipio de Jesús María, donde se observa que cerca de 100,000 habitantes de las 235 localidades del municipio (INEGI 2010(30)), se verán afectadas por el desarrollo poblacional de mosca. El problema se incrementará en las zonas de tonos rojos en donde se concentra la mayor parte de la población (219 localidades con un total de 99,046 habitantes). La M. domestica es a menudo asociada con el ganado de granjas e instalaciones de eliminación de residuos domésticos, donde la acumulación de materia orgánica proporciona condiciones de cría apropiadas(28). Una de las características de la mosca constituye sus preferencias de alimentación, ya que son atraídas por la descomposición de materia vegetal y animal; esto la pone en contacto con los organismos patógenos presentes en los desechos de basura y animales, de donde su potencial riesgo como vector de enfermedades a los seres humanos(31).

Figura 7: Distribución de la temperatura mínima promedio anual de 2015-2039 en el municipio de Jesús María

El desarrollo de M. domestica en sus diferentes etapas fue afectado por la temperatura y humedad relativa a las que fue expuesta, ya que en el análisis de varianza se encontraron efectos altamente significativos entre los tratamientos para las tres etapas (larva, pupa y 25

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adulto). Cabe destacar que en algunos tratamientos no se tuvo presencia de larvas, por lo que su valor fue cero, ya que presentaron temperaturas por encima de 42 °C provocando la muerte de la mosca y que los huevecillos no se desarrollaran.

Conclusiones e implicaciones

La M. domestica se pudo desarrollar a temperaturas de 20 a 30 °C, durante un periodo actual de tres meses al año (de junio a agosto), y con los análisis de los datos climáticos para el caso del municipio de Jesús María, se prevé que la presencia de moscas se verá favorecida por las proyecciones de temperaturas del horizonte medio y lejano, ya que el rango en el cual se puede presentar se extenderá del mes de mayo a septiembre. Esta afectación potencial incluye a prácticamente la totalidad de las áreas pobladas del municipio, por lo que constituye un riesgo que debe considerarse para diseñar medidas de monitoreo y control, por los problemas de contaminación en explotaciones pecuarias, en la agroindustria y en alimentos, que favorece la propagación de enfermedades en la población.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4597 Artículo

Control de la helmintiasis en becerros criados en una región semiárida cálida de Brasil

Ludmilla de Fátima Leal Pereiraa Eduardo Robson Duartea* Gabriela Almeida Bastosa Viviane de Oliveira Vasconcelosb Evely Giovanna Leite Costaa Laydiane de Jesus Mendesa Idael Matheus Góes Lopesa Iara Maria Franca Reisa

Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Agrárias, Avenida Universitária, 1000, Tel.: + 55 38-2101-7707; Fax: + 55 38 2101-7703. Bairro Universitário, Montes Claros, Minas Gerais 39400-006, Brasil. b

Universidade Federal Estadual de Montes Claros. Montes Claros, Minas Gerais, Brasil.

*Autor de correspondencia: duartevet@hotmail.com

Resumen: El uso excesivo o inadecuado de los antihelmínticos sintéticos está promoviendo la selección de cepas resistentes de nematodos gastrointestinales al nivel mundial. Se llevó a cabo la caracterización de la helmintiasis y la eficacia antihelmíntica de cinco antihelmínticos en una muestra de becerros criados en el estado de Minas Gerais, Brasil. El estado está ubicado en una región conocida como el Sertão, y el clima es semiárido cálido. Se aplicaron cuestionarios semi-estructurados para recopilar datos sobre 60 granjas de ganado en el norte del estado. En ocho hatos se realizaron pruebas de la reducción del recuento de huevos fecales (RHF) para analizar el perfil de resistencia a cinco antihelmínticos comunes (albendazol, levamisol, ivermectina, doramectina y 30

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abamectina). Para aplicar el RHF, se recolectaron muestras fecales de grupos de al menos 10 becerros homogéneos con un RHF ≥150 por tratamiento. Se tomaron las muestras un día antes y catorce días después de la desparasitación con uno de los antihelmínticos; un grupo de control no recibió ningún tratamiento. Por medio de coprocultivo, se identificaron los géneros de las larvas presentes en las muestras. El cuestionario arrojó que el pastoreo extensivo fue el sistema predominante de producción de becerros, que se administraron antihelmínticos cada seis meses en el 64 % de las granjas, y que las lactonas macrocíclicas fue el grupo antihelmíntico más utilizado. La eficacia de los antihelmínticos evaluados varió entre el 62 y el 98.9 %. El perfil de resistencia verificado de la ivermectina, el levamisol, el albendazol y la doramectina es preocupante porque el género Haemonchus fue el más frecuente antes y después de los tratamientos. Se detectaron variaciones entre los hatos en términos de los sistemas de cría, las prácticas de control y los perfiles de susceptibilidad a los antihelmínticos. Los resultados resaltan la importancia de implementar el control estratégico de parásitos mediante la prueba de reducción de RHF para la elección de antihelmínticos, y de fomentar prácticas alternativas de control. Palabras clave: Ganado, Resistencia antihelmíntica, Nematodos, Parásitos, Control estratégico.

Recibido: 15/08/2017 Aceptado: 30/03/2018

Introducción

La producción ganadera representa una importante actividad económica en las zonas tropicales y subtropicales(1) y es la principal fuente de ingresos de una proporción sustancial de la población rural(2). Las enfermedades como la helmintiasis gastrointestinal pueden influir en el desarrollo de los becerros, y como consecuencia aumentar los costos de producción(3,4). Los nematodos gastrointestinales (NG) pueden causar daño severo en los bovinos jóvenes y en las hembras primíparas, reduciendo su desarrollo, bajando su productividad, y resultando en pérdidas económicas; en casos extremos se puede aumentar la tasa de mortalidad en becerros can altas cargas parasitarias(3,5,6). Los antihelmínticos sintéticos (AH), como los benzimidazoles (BZ), las lactonas macrocíclicas (ML) y los imidazotiazoles (IMZ) se han utilizado intensamente para el control de los NG en bovinos(7,8). Sin embargo, el uso inapropiado de ellos, la aplicación de dosis demasiado bajas, los diagnósticos incorrectos, y la falta de conocimiento sobre la epidemiología de los NG han contribuido a la selección de NG resistentes(4,9). 31

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Como medida de prevención de la resistencia, las pruebas de eficacia de los AH se deben de realizar en las granjas por lo menos una vez al año. Esto permite identificar los AH con eficacias bajas para sustituirlos con otros que todavía la tienen(4,10). En comparación con los pequeños rumiantes, muy pocos estudios han estado enfocados en la resistencia a los AH en bovinos en áreas tropicales. Desde luego es muy probable que las estimaciones del número de casos son inferiores a la incidencia real(11). Se han generado reportes en diferentes continentes sobre los hatos bovinos que manifiestan la multiresistencia a los AH(4,12). Sin embargo, muy pocos estudios han abarcado el perfil de susceptibilidad a AH, la epidemiología de la helmintiasis bovina y la gestión del control de éste condición en regiones de clima semiárido caliente. El objetivo de este estudio fue caracterizar el control de los nematodos gastrointestinales y su eficacia en becerros criados en el norte del estado de Minas Gerais, Brasil.

Material y métodos

Área de estudio y granjas ganaderas investigadas

La recolección de datos sobre el manejo de los hatos, la infraestructura de las granjas, el uso de los AH, y las medidas empleadas para el control de NG se hizo por medio de un cuestionario. Esto se aplicó a los encargados de 59 granjas ubicadas en el norte del estado de Minas Gerais, en la región conocida como el Sertão (Cuadro 1, Figura 1). Según la clasificación climática Köppen-Geiger, el clima de esta región es semiárido caliente (BSh) con una corta temporada de lluvias (verano) y un largo periodo de sequía (invierno)(13). La aplicación de los cuestionarios se realizó durante sucesivas estaciones secas (abril a septiembre de 2013-2015). Durante los periodos de sequía la precipitación media mensual fue de 17.14 mm, la humedad promedio 57.57 % y la temperatura promedio es de 20.82 ºC (5o Distrito, Instituto Nacional de Metereología, Brasil).

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Cuadro 1: La distribución y la caracterización geográfica de los hatos bovinos evaluados en el norte del estado de Minas Gerais, Brasil No. de animales 1. Capitão Enéas 54 2. Claro dos Poções 3. Coração de Jesus 4. Engenheiro Navarro 30 5. Francisco Dumont 6. Francisco Sá 7. Ibiaí 8. Jaíba 9. Janaúba 10. Januária 11. Jequitaí 44 12. Juramento 13. Lagoa dos Patos 14. Matias Cardoso 15. Mirabela 16. Montes Claros 108 17. Pedras de Maria da Cruz 18. São João da Lagoa 59 19. São João da Ponte 20. São João do Pacuí 21. Varzelândia 22. Verdelândia Total 295 Municipalidades

No. de granjas 4 1 4 1 3 6 1 1 1 2 2 1 1 1 1 19 1 3 3 1 1 1 59

Latitud

Longitud

-16º19’28” -17º04’47” -16º41’47” -17°16’47” -17°31’33” -16°47’61” -16º51’40” -15º20’18” -15º48’09” -15º29’17” -17º14’08” -16º84’81” -16º59’00” -14º51’17” -16º15’46” -16°73’50” -15°60’58” -16º51’11” -15º55’45” -15º32’31” -15°70’17” -15º35’21”

-43º42’38” -44º12’31” -44º21’54” -43°57’00” -44°23’42” -43°48’86” -44º54’52” -43º40’28” -43º18’32” -44º21’42” -44º26’44” -43º58’67” -44º34’56” -43º55’19” -44º09’52” -43°86’22” -44°39’19” -44º21’07” -44º00’28” -44º30’58” -44°02’72” -43º36’10”

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Figura 1: Distribución geográfica de las municipalidades evaluadas en el norte del estado de Minas Gerais, Brasil. Los números corresponden al Cuadro 1.

Entre las 59 granjas evaluadas se seleccionaron cinco granjas para llevar a cabo las pruebas de eficacia de los AH. Además de los criterios de la ubicación geográfica, las granjas se seleccionaron por tener hatos con grupos separados de becerros, los cuales no habían recibido un tratamiento de AH durante los dos meses anteriores a la aplicación de las pruebas. Los grupos eran homogéneos en cuanto al peso, la edad y la cantidad de animales (mínimo 30) en cada uno.

Exámenes parasitológicos y las pruebas de resistencia a los antihelmínticos

Se recolectaron muestras de 10 g de heces fecales de becerros de las razas Nellore o Girolando de 6 a 14 meses de edad, los cuales se habían infectado por NG de manera natural. Las muestras se guardaron en bolsas plásticas y se mantuvieron bajo refrigeración hasta llevar a cabo los recuentos de huevos fecales (RHF) y la obtención de larvas por el coprocultivo. 34

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Los RHF se determinaron mediante la técnica de McMaster. Una porción (4 g) de las deyecciones se diluyó en una solución saturada del cloruro de sodio y una muestra colocado en cada cámara McMaster. Usando un microscopio, se hicieron los recuentos bajo una amplificación de 10x y con una sensibilidad de detección de 25 huevos por gramo (HPG). Basado en los resultados, se calcularon valores promedio para cada animal(14,15). La identificación de los principales géneros de nematodos presentes en los hatos estudiados se realizó por coprocultivo(16) utilizando muestras fecales tomadas antes y después de los tratamientos. En total se identificaron aproximadamente 100 larvas del tercer estadio por cada grupo de tratamiento(17). Se identificaron y pesaron a los becerros, y luego se agruparon en grupos homogéneos de raza, edad, sexo y peso corporal (PC). En el día uno del periodo experimental, se distribuyeron los animales según sus cargas parasitarias (balanceadas) en grupos experimentales correspondientes a los tratamientos, cada uno de los cuales contenían al menos 10 animales. El Comité de Ética de Experimentos de Animales de la Universidad Federal de Minas Gerais aprobó todos los procedimientos adoptados bajo el protocolo 42/2008. Para diagnosticar la resistencia contra los AH, se aplicó la prueba de reducción del recuento de huevos fecales (RHF) siguiendo las recomendaciones de la Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria (World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology – WAAVP)(18). Se aplicaron tres criterios de inclusión para seleccionar los hatos en que se iba a aplicar la prueba de las eficacias de los AH: 1) hatos con una población homogéneos de becerros; 2) los becerros no se habían desparasitados durante los sesenta días anteriores al estudio; y 3) los becerros tenían un RHF de >150 HPG. El factor principal que limitó el número de hatos evaluados fue la falta de animales homogéneos los cuales excretaban >150 HPG. La elección de que AH eran los más indicados para cada granja se hizo según la historia de control parasitario de cada una. El número de productos probados dependió de la disponibilidad de animales con infecciones de un nivel de >150 HPG. Antes del tratamiento, se pesaron a los animales de manera individual para poder administrar la dosis correcta de AH, y, por lo tanto, evitar la variabilidad entre las dosis utilizadas en los tratamientos. Se evaluaron cinco AH: el albendazol (10 mg/kg PC); el levamisol clorhidrato (7.5 mg/kg PC); y la ivermectina, la doramectina o la abamectina (0.2 mg/kg PC). Todos los AH se administraron de manera subcutánea, después de 12 h de ayuno, y según las recomendaciones del fabricante. Catorce días (14) después del tratamiento con los AH, se recolectaron muestras fecales adicionales. Como se menciona anteriormente, se llevaron a cabo los RHF por cada grupo, y luego se hicieron los coprocultivos para identificar los géneros de NG (larvas del tercer estadio) involucrados en la resistencia a los AH. Se estimó la eficacia de los AH con la ecuación siguiente(18): Eficacia = [1-(RHF promedio del grupo tratado/RHF promedio del grupo control)] x 100 35

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Una vez generados los resultados de las pruebas de reducción de RHF, se elaboraron informes técnicos e informativos sobre los exámenes parasitológicos para cada hato estudiado. Basado en estos, los ganaderos participantes recibieron instrucciones y asesoría sobre el control de NG en sus hatos. La evaluación de la eficacia de los AH se basó en los lineamientos propuestos por el Grupo del Mercado Común (GMC): altamente eficaz = >98 % reducción de la HPG; eficaz= 90-98 % de reducción; moderadamente eficaz= 80-89 % de reducción; insuficientemente activa= <80 % de reducción; y no detectable(19). Se consideraron a los NG como resistentes cuando el porcentaje de la reducción en el RHF fue menor al 95 % y el límite inferior del intervalo de confianza fue menor que 90 %(20).

Análisis estadísticos

Los datos de RHF se compararon usando las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis o de Wilcoxon. Se usó una prueba de Ji-cuadrada para comparar las frecuencias de los géneros de NG y la información generada de los cuestionarios. Todos los análisis estadísticos se hicieron aplicando un nivel de significancia de 5% y usando el software estadístico de SAEG 9.1(21).

Resultados

Caracterización de los sistemas de crianza y los animales

La actividad de la crianza del ganado vacuno fue la principal en el 96.2 % de las granjas encuestadas, y el 3.7 % de todas las granjas producían becerros tanto cárnicos como 36

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lecheros. El sistema de producción extenso fue el predominante, representando el 83.9 % de las granjas estudiadas. En las granjas evaluadas se usaron un total de siete especies de zacates forrajeros: 49.5 % cultivaban Urochloa spp.; 19.5 % Panico sp.; 17.53 % Andropogon gayanus; 5.84 % Cynodon sp.; 3.59 % Hyparrhenia rufa; 3 % Cechrus cilliaris; y 0.64 % Penninsetum purpureum. En cuanto a los sistemas de pastoreo, el 54.5 % usaron el sistema rotacional, y el 68.5 % separaron los rebaños por grupos de edad. En el 83 % de las granjas, pastoreaban a los becerros en zonas más bajas que los animales más viejos, y un 55.5 % de las granjas contaban con un corral dedicada a la maternidad. La raza de mayor frecuencia (P<0.05) fue la Nellore, representando el 56.1 % de los hatos estudiados. La población mestiza Nellore fue criada en el 10.3 % de las granjas, mientras que en las 146 granjas lecheras estudiadas la Girolando fue la única raza en uso. Un porcentaje pequeño (8.4 %) usaban otras razas como la Caracu, Sindhi, Guzerat o Angus Rojo.

Control de helmintiasis

Las lactonas macrocíclicas fueron las principales sustancias activas de AH utilizado en las granjas (P<0.01), y la ivermectina fue el componente más común (Cuadro 2). En el 78.9 % de las granjas no utilizaron el pesaje de animales antes de administrar los tratamientos y solo calcularon la dosificación del AH por medio de la evaluación del puntaje corporal. Apenas el 14.54 % de las granjas pusieron sus animales en ayunas antes de aplicar los tratamientos AH.

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Cuadro 2: Los antihelmínticos usados en los hatos bovinos estudiados en el norte del estado de Minas Gerais, Brasil. Clase de antihelmíntico

Observación†

Frecuencia (%)‡

Lactonas macrocíclicas Ivermectina Abamectina Doramectina Moxidectina

71* 52 6 10 3

86.4 62.9 7.4 12.3 3.7

Benzimidazoles (albendazol)

4.9

Imidotiazoles (levamisol)

4.9

Asociaciones Abamectina + Ivermectina Fluazurona + Abamectina

2 1 1

2.5 1.2 1.2

Homeopatía

1.2

Total

100.00

†El

número de granjas difiere del número total de observaciones debido al uso de más de un producto de control de helmintos en la misma granja. ‡Frecuencia= número de granjas en las cuales el producto comercial está en uso / número total de productos reportados. *Clase de productos usados con más frecuencia, (P<0.05).

Se aplicaron los tratamientos de AH a todas las categorías de ganado en el 72.7 % de los hatos, pero en el 26.3 % de los hatos se los aplicaron sólo a los becerros. Las hembras en el periparto fueron desparasitadas en el 33.3 % de las granjas. La frecuencia de los tratamientos AH varió entre las diferentes granjas. El 60 % de ellas siguieron un calendario de vacunas para el control del virus de la fiebre aftosa en mayo y noviembre. El uso del control estratégico por medio de AH durante la estación seca sólo se realizó en el 33.2 % de las granjas y la alternancia de los compuestos activos se registró en 66.8 % de ellas.

Incidencia de la helmintiasis

Los promedios de los RHF fueron bajos tanto en los becerros vacunos (174.0 ± 84.8) como en las lecheras (162.4 ± 122), sin diferencias significativas entre estos dos grupos 38

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(P>0.05) (Cuadro 3). Los RHF más bajos para los becerros vacunos se registraron en el hato 4, y para las lecheras en el hato 7 (P<0.05).

Cuadro 3: Promedios de recuentos de huevos fecales (RHF) en becerros criados en el norte del estado de Minas Gerais y los porcentajes de cada género de nematodo identificado antes de la desparasitación Granjas

EPG (día 0) Becerros cárnicos 1 158.87 a 2 138.06 ab 3 190.00 a 4 11.80 c 5 50.00 b Becerros lecheros 2 248.50 a 6 80.00 bc 7 69.50 c 8 145.10 ab CV (%) 82.2

Haem (%)*

Trich (%)

Oeso (%)

Coop (%)

Bunos (%)

70 97 89 92 70

15 1 11

2 10 4 12

15 5

4 2

95 88 92 93

2 1

3 12 8 4

Haem= Haemonchus spp.; Trich= Trichostrongylus spp.; Oeso= Oesophagostomum spp.; Coop= Cooperia spp.; Bunos= Bunostomum spp.; (-) = no detectado. abc Letras diferentes en las mismas columnas indican una diferencia significativa (P<0.05). CV= coeficiente de variación.

En el día cero, se encontraron infecciones generadas por los géneros de NG Haemonchus, Trichostrongylus, Cooperia, Oesophagostomum y Bunostomum. El perfil de los géneros de NG no fue diferente (P>0.05) entre los hatos, y el NG más frecuente para ambos grupos de becerros y en todas las granjas evaluadas fue el Haemonchus spp. (P<0.01).

Eficacia de los antihelmínticos

En todos los hatos evaluados, los RHF se redujeron en todos los grupos de becerros desparasitados en comparación con los grupos testigo (P<0.05). Se registraron bajas eficiencias para la ivermectina (24.28 %) y la doramectina (81.63 %)(Cuadro 4). Las más 39

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altas eficacias (>98 %) se observaron con los tratamientos de albendazol o levamisol en los becerros de la granja 2; sin embargo, el levamisol produjo una menor eficacia entre los becerros lecheros que en los becerros cárnicos (P<0.05) (Cuadro 5).

Cuadro 4: Promedio del recuento de huevos fecales (RHF) por gramo de heces en becerros cárnicos después de la desparasitación y la eficacia (%) de cada antihelmíntico Hatos Control Albendazol 1 2 3

490.0a 233.3a 175.0a

77.5b 2.77c 22.5b

Levamisol

84.18 98.81 87.14

3.57c 47.90b

Ivermectin % CV% a 90.00b 81.63 91.3 b 98.47 118.75 49.09 88.2 b 72.62 42.50 24.28 85.3 %

CV%= coeficiente de la variación. abc Letras diferentes en la misma línea indican diferencias significativas (P<0.05).

Cuadro 5: Promedio del recuento de huevos fecales (RHF) por gramo de heces en becerros lecheros después de la desparasitación y la eficacia (%) de cada antihelmíntico Hatos Sin tratamiento Albendazol % Levamisol % Doramectina % CV% 2

289.5 a

57.1B

80.27

150.83 a

32.2 b

78.65

54.2 b

87.3

64.06 90.4

CV%= coeficiente de la variación. abc Letras diferentes en la misma línea indican diferencias significativas (P<0.05).

Género de nematodos identificados post-tratamiento

Después del tratamiento antihelmíntico, el NG más frecuente entre los becerros tratados y el grupo testigo fue el género Haemonchus (P<0.01). Para el hato 1, el género Trichostrongulus representó el 13 % de las larvas del tercer estadio (L3) identificado a partir del coprocultivo en becerros tratados con ivermectina (Cuadro 6). En los hatos 2 y 8, el Haemonchus spp. fue también el más frecuente (87 a 93 %). Sin embargo, los números de L3 recuperados de grupos tratados fueron insuficientes para permitir el análisis estadístico. 40

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Tabla 6: Perfiles del género de los nematodos (%) en becerros de vacuno después del tratamiento antihelmíntico

Género Haemonchus

Herd number 1

Herd number 3

Control Ivermec Albend

Control Ivermec Albend Levam

93*

80*

93*

83*

96*

97*

Trichostrongylys

Cooperia

Oesophagostomum

Bunostomum

*Género con mayor frecuencia, Ji cuadrada (P<0.01). Ivermec= ivermectina, Albend= albendazol, Levam= levamisol

Discusión

Caracterización de los sistemas de cría y los animales

El sistema predominante de producción bovina en Brasil es el pastoreo extensivo. En ello el pasto es la principal fuente de alimento, y también representa la principal fuente de infección por la L3 de los NG(22,23). La amplia distribución de pasto del género Urochloa sp. (Brachiaria sp.) es debido a su adaptación a suelos ácidos y de baja fertilidad, y su considerable tolerancia a la sequía(24). Las estrategias de manejo de pastos son esenciales para el control de los NG, ya que ayuda a reducir la contaminación del pasto con las L3 y su ingesta por los bovinos(25). Las condiciones ambientales influyen mucho en el desarrollo y la supervivencia de las etapas libres de las L3 y su migración entre los pastos de forraje. Las diferencias morfológicas entre especies forrajeras crean variaciones en los microclimas proporcionados por las plantas, y como resultado influyen en el desarrollo y la supervivencia de los huevos y las larvas de los parásitos(26). Una estrategia estacional que ha sido ampliamente utilizada por los ganaderos del norte de Minas Gerais es la de reservar áreas de Brachiaria spp. (Urochloa spp.) para pastoreo 41

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a finales del verano o postergar su uso hasta la estación seca(27). Esta podría haber reducido drásticamente la supervivencia de las larvas de los NG en las praderas, y desde luego podría haber contribuido a la baja RHF observada en el presente estudio. En un estudio en el estado de São Paulo, Brasil, la tasa de recuperación general más alta de las larvas del parasito Haemonchus sp. en muestras fecales depositadas en diferentes forrajes en los meses de agosto, febrero y mayo fue en el Panico sp., lo cual fue más alto que en Urochloa sp. y Cynodon grases(28). Otro estudio enfocó en la recuperación de larvas infecciosas de Trichostrongylus colubriformis a partir de tres pastos de forraje (Urochloa, Costa-Cruz y Aruana) en el invierno y la primavera. El Urochloa spp. (Brachiaria sp.) fue lo que tenía el forraje más denso, lo cual resultó en las concentraciones más bajas de L3/kg de materia seca(26). El 54.5 % de las granjas en el presente estudio usaron la rotación del pastoreo, lo cual obliga a los ganaderos a controlar el número de unidades animales introducidas en cada pradera. Además, el período de rotación debe ser mayor que el ciclo de vida de los parásitos, lo que permite la inactivación de los huevos y las larvas, y una reducción consecuente de la tasa de infección por las L3(29). Otra estrategia usada por el 68.5 % de los ganaderos en el presente estudio es la separación de los animales por edad, lo cual es crucial, ya que los animales jóvenes son más susceptibles a la infección por parásitos que los adultos(5). La composición racial influye en la intensidad del parasitismo; las razas Cebú son más resistentes que las razas europeas(2,9). En la región septentrional de Minas Gerais, los hatos con animales de las razas Cebú y Nellore fueron la mayoría, explicando en parte los bajos RHF observados en los resultados para los becerros cárnicos. Los estudios de progenie resultantes de cruzamientos entre las razas taurinas y Cebú tienen niveles intermedios de susceptibilidad a los NG(2,9). La selección genética para bovinos resistentes constituye una alternativa efectiva para el control de los NG. Muy pocos becerros (5 a 8 %) en los hatos estudiados presentaron niveles altos de RHF; esto indica que estos animales tienen una mayor susceptibilidad a los NG y desde luego no deben incluirlos en los programas de mejoramiento genético. La selección genética puede aumentar la frecuencia de los animales resistentes a estos parásitos y debe formar una parte importante de los programas estratégicos de control de los NG(30,31).

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Control de la helmintiasis

El hecho de que las lactonas macrocíclicas eran los AH de preferencia en las granjas estudiadas podría crear una mayor presión para la selección de NG resistentes. Varios reportes ya existen de la resistencia a la ivermectina en regiones tan diversos como el norte de California, Estados Unidos(32); Buenos Aires, Argentina(33); y en São Paulo y Minas Gerais, Brasil(30,34). Esto resalta la importancia de evaluar el perfil de susceptibilidad de un AH en cada región o hato para asegurar que va a ejercer un control efectivo de los NG(33). La eficacia de los AH a lago plazo depende de la alternancia en el uso de diferentes clases de químicos dentro de los períodos apropiados(35). En el presente estudio, sólo en el 66.8 % de las granjas realizaron prácticas de rotación de los AH, lo que podría favorecer la selección de los NG resistentes. En este caso, se debe resaltar la importancia de la frecuencia de rotación de estos productos, ya que de otra manera se puede favorecer la selección de los NG multiresistentes(35,36). Cualquier AH que tiene una eficacia menor al 80 % debe ser sustituido inmediatamente por otras clases de AH para evitar el establecimiento de poblaciones resistentes de los NG(37). Otra práctica que podría aumentar la probabilidad de la selección de NG resistentes es la desparasitación de todas las categorías de edad dentro del hato en el 72.7 % de las granjas estudiadas. Para evitar esto se debe de priorizar a los becerros de ambos sexos hasta los 24 meses de edad y a las hembras en el periparto. Ambas categorías están mucho más susceptibles a los helmintos(38,39,40). Solo en el 33.3 % de las granjas trataron a las vacas en periparto. Esta práctica es especialmente relevante para las vaquillas en desarrollo, ya que tienen comprometido su sistema inmune, haciéndolas más susceptibles a endoparásitos en el pre- y post-parto. Las vacas Cebú con múltiples partos no requieren de la desparasitación, y han mostrado tener una resistencia natural a los NG y una baja potencial de contaminación cuando se maneja apropiadamente(5,41). Se deben promover cambios en las estrategias de control de los NG(38), para que incluya categorías de edad, que sigue los criterios climáticos y regionales, y que consideren el perfil de las poblaciones resistentes de los NG(37). El criterio implementado para determinar el período de desparasitación de los hatos varió entre las granjas evaluadas. La mayoría (60 %) de ellas trataron a todos los animales al principio de la estación seca (mayo) y luego al final (noviembre); administraron simultáneamente la vacuna contra la fiebre aftosa. En la región septentrional de Minas Gerais también se debe de realizar el tratamiento desparasitante además en septiembre para cubrir toda la temporada. Un estudio llevado a cabo en el centro de Brasil con becerros de la raza Nellore apoya esta propuesta. En ello se observó que un protocolo de AH aplicado en los meses de mayo, agosto y noviembre, y utilizando los AH de larga acción, incrementó el aumento de peso hasta 34.1 kg (31.9 %) en comparación con los 43

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animales no tratados(6). Un tratamiento simultaneo con los periodos de vacunación contra la fiebre aftosa en mayo y noviembre no tuvo ningún afecto sobre el aumento de peso(6), apoyando la teoría que un protocolo adecuado puede aumentar la ganancia de peso durante la fase de crecimiento. Las condiciones climáticas de esta zona son bastante cercanas a las del norte de Minas Gerais, aunque con más precipitaciones, y desde luego el control estratégico propuesto podría aplicarse también en zonas semiáridas calientes. Los cambios climáticos y el manejo intensivo de las granjas han afectado a los riesgos de las infecciones con los NG y su transmisión(42). Estas alteraciones en la epidemiologia de las infecciones de los NG, en conjunto con sus altas frecuencias de resistencia a los AH, requiere de adecuaciones en las prácticas actuales de control de los NG(42). Los estudios en el futuro deben de considerar estas alteraciones climáticas en las definiciones de las prácticas de control de los NG en hatos ganaderos criados en áreas con clima semiárido caliente, como lo de Minas Gerais. Solo en una granja usaron los productos homeopáticos para el control de los NG. Este estudio no está enfocado en evaluar la eficacia de estos productos, y esta medida alternativa debe aplicarse con mucho cuidado. Se requiere de mucha más investigación para contribuir a las discusiones de su aplicabilidad y determinar las dosis correctas(43).

Ocurrencia de helmintiasis en hatos de ganado vacuno

Los hatos ganaderos evaluados mostraron un RHF generalmente bajo, aunque el nivel de contaminación con NG difería entre granjas. Los bajos promedios observados en las granjas 4, 6 y 7 pueden atribuirse a las condiciones de manejo de los becerros. En el hato de becerros vacunos 4, pesaron a los animales antes de aplicar el AH, y cambiaron los AH de manera anual; se podrían mejorar aún más el control de los NG aplicando la separación por grupo de edad. En los hatos 6 y 7, de becerras lecheras, las criaron en corrales sin pastoreo, recogieron las heces semanalmente para enviar al compostaje, y los alimentaron con el ensilaje. De esta manera afectaron de manera negativa a la supervivencia de las larvas L3, produciendo el RHF más bajo en el presente estudio. Los hatos 1, 2, 3 y 5, de becerros vacunos, presentaron similitudes en el control de los NG, tales como las épocas de desparasitación anual o la aplicación durante períodos de mayor infestación de las moscas y las garrapatas. Además, usaron la ivermectina como el AH más común, en particular en las granjas que usaron la rotación de clase de AH pero sin un control estratégico. Las granjas 6 y 7, de becerras lecheras de raza Girolando cruzados, tenían los promedios más altos de RHF comparados con los de las granjas 1, 2, 44

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3 y 5. Los valores más bajos probablemente sean debidos al sistema de confinamiento de los becerros en corales de tierra sin vegetación. El NG más frecuente entre los hatos de carne y leche fue Haemonchus spp. Este género tiene una prevalencia más alta entre los pequeños rumiantes, mientras que el género Cooperia sp. tiende a ser el más frecuente entre el ganado en Brasil(35,40). Sin embargo, Haemonchus spp. es el nematodo patógeno más común en el ganado en regiones tropicales. Infección de este NG en los becerros promueve la reducción de los valores medios de hematocrito y cause una pérdida de peso. La larva de cuarto estadio (L4) de Haemonchus es una sanguijuela que se establece en el abomaso, y por lo tanto los animales infectados con una gran carga de estas larvas pueden presentar anemia antes de que un RHF las detecte en las heces. También se identificaron los géneros Trichostrongylus, Cooperia, Oesophagostomum y Bunostomum en los coprocultivos antes del tratamiento con el AH. Las infecciones con los NG frecuentemente implican varias especies, las cuales pueden tener un efecto patógeno aditivo sobre los becerros(42).

La eficacia de los antihelmínticos

El albendazol y el levamisol fueron los AH más efectivos contra los NG en becerros en la granja 2, sin embargo, se detectaron NG resistentes al levamisol en los becerros lecheros en esta misma granja. El perfil de resistencia a la ivermectina, el levamisol, el albendazol y/o la doramectina observado en los resultados es preocupante. Se detectaron a NG multiresistentes en los hatos 1, 3 y 8, es decir, ninguna de los AH probados fue capaz de reducir los RHF. La ivermectina, la doramectina y la abamectina mostraron la eficacia más baja en la reducción de los RHF. La baja eficacia observada de las lactonas macrocíclicas podría asociarse con el uso histórico de estos AH en la región de estudio, lo cual podría haber seleccionado para poblaciones de NG resistentes a este AH. La mayoría (72.7 %) de las granjas evaluadas desparasitaron a todos los animales en sus hatos, previniendo la opción del refugio a la población de NG sensibles. El tratamiento al huésped según los NG refugiados no afectó a las larvas en las praderas, el porcentaje de animales no tratados ni las etapas de larvas con el desarrollo detenido. La proporción de los NG en refugio debe ser óptima para diluir a los genes resistentes en el grupo de los genes susceptibles(44). Los datos reportados en el presente estudio corroboran a reportes anteriores de la resistencia a las lactonas macrocíclicas en NG colectados de bovinos en los Estados 45

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Unidos(45). En este país el uso indiscriminado de las lactonas macrocíclicas en regiones áridas y semiáridas para el control de las infecciones con NG fue en respuesta a la eficacia más alta de ellas y a su actividad antihelmíntica prolongada. Sin embargo, este uso desmesurado ejerció una alta presión a favor de la selección de los NG resistentes, causando resistencia en los nematodos por las altas dosis aplicadas(46). La resistencia a la ivermectina también se ha reportado en Santa Catarina, Brasil, en donde este AH mostró eficacias de >95 % en siete granjas de ganado vacuno, pero de <14 % en dos granjas, indicando resistencia a la sustancia. En este mismo estudio el levamisol y el albendazol se mostraron eficaces en un >95 % contra los NG(35). El género Haemonchus sp. fue el NG más frecuente (80 a 97 % de las larvas L3 identificadas) en los becerros desparasitados de los hatos 1 y 3, y se caracterizó como multiresistente a los benzimidazoles, los imidotiazoles y las lactonas macrocíclicas. También se identificaron los géneros Trichostrongylus, Oesophagostomum, Cooperia y Bunostomum en lo coprocultivos, y los análisis post-tratamiento indicaron que estos cuatro ya estaban en una selección inicial de cepas resistentes. La mayor patogenicidad y mayor potencial biótico de Haemonchus sp. han llevado a un incremento en la frecuencia de los tratamientos de AH, y desde luego a una mayor presión selectiva a favor de las cepas resistentes de este género(35). En un estudio previo en Betim, Minas Gerais, también se observó la resistencia a la ivermectina y la doramectina de los géneros Haemonchus (72 %) y Cooperia (85 %)(46). Los géneros Haemonchus y Oesophagostomum también mostraron resistencia a las lactonas macrocíclicas en un estudio en Teófilo Otoni, Minas Gerais, en que estos AH eran los más usados para el control de NG en las granjas evaluadas(40). Los resultados de otro estudio también confirman la predominancia de Haemonchus spp. después de la desparasitación con la ivermectina, el fosfato de levamisol y el dimetilsulfóxido albendazol en granjas en el estado de Santa Catarina, Brasil, revelando una aparente multiresistencia de este género contra estos AH(35). La resistencia a las lactonas macrocíclicas (en particular la ivermectina y la doramectina) en los géneros Cooperia y Haemonchus es frecuente en los hatos comerciales en los Estados Unidos, aunque en el mismo estudio se reportó que el género Cooperia fue sensible a los benzimidazoles(46). En un estudio en Veracruz, México, los géneros Cooperia y Haemonchus también eran los más frecuentes, y había una alta frecuencia de granjas en que las poblaciones de NG mostraron resistencia a la ivermectina(4). Una situación similar prevalece en Europa, en donde un estudio involucrando granjas en Alemania, Francia, Italia y el Reino Unido reportó que la ivermectina y la moxidectina mostraron una baja eficacia contra los NG, con resistencia documentada en un 12 % de los 40 hatos evaluados(47). Los géneros más frecuentes fueron Cooperia y Ostertagia, y se registraron principalmente en las granjas del Reino Unido y de Alemania.

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Conclusiones e implicaciones

En la mayoría de las granjas evaluadas no practicaron controles estratégicos o tácticos de los NG, y era común el uso inapropiado e indiscriminado de los antihelmínticos sintéticos y las lactonas macrocíclicas. En todos los hatos evaluados se detectaron por lo menos un antihelmíntico con baja eficacia, y en dos granjas de becerros de vacuno se identificaron nemátodos multiresistentes con el género más frecuente siendo el Haemonchus. Para lograr un control más sustentable de los nematodos en los hatos evaluados habrá que aplicar varias medidas, incluyendo la aplicación del control estratégico en becerros y de controles tácticos en las vaquillas en periparto; la alternancia en el uso de las clases de antihelmínticos; y el desarrollo e implementación de medidas alternativas como la selección de animales resistentes, el uso de hongos para el control biológico y los extractos de planta para reducir las poblaciones resistentes de nematodos.

Reconocimientos

La investigación reportada en el presente estudio ha recibido apoyo de las siguientes instancias: Programas de Bolsa de Extensão (PBEXT); Banco do Nordeste; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG); y Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Declaración de conflicto de intereses Los autores de este manuscrito no tienen ninguna relación financiera o personal con personas u organizaciones que pudieran influir o sesgar inapropiadamente el contenido del papel.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4655 Artículo

Importancia de la jerarquía social sobre los comportamientos alimenticios y parasitarios de ovinos criados en dos sistemas pastoriles

Carolina Flota-Bañuelosa Juan A. Rivera-Lorcab Bernardino Candelaria-Martínezc*

Conacyt-Colegio de Postgraduados Campus Campeche, Km 17.5 Carretera Federal Haltunchen-Edzná, Sihochac, Champotón, Campeche. México. b

Instituto Tecnológico de Conkal, Yucatán. México.

Instituto Tecnológico de Chiná, Chiná, Campeche. México.

*Autor de correspondencia: bcm8003@gmail.com

Resumen: Para determinar la relación entre el nivel jerárquico, preferencias por forraje y parasitismo de ovinos en dos sistemas de pastoreo (sistema silvopastoril: SSP y monocultivo de pasto estrella: PE), se utilizaron 22 ovinos Pelibuey mantenidos en pastoreo diurno, a los cuales se les aplicaron pruebas de jerarquía social para obtener el índice de dominancia, pruebas de selectividad de especies vegetales forrajeras (C. nlemfuensis, L. leucocephala, G. sepium, G. ulmifolia y H. rosa-sinensis), análisis parasitario de huevecillos por gramo de excremento y determinación de hematocrito. Se observó una jerarquía no lineal con dominancia lineal y bidireccional para los grupos, de h=0.75 en el SSP y h=0.5 en PE. Los ovinos más dominantes presentaron mayor cantidad de conductas agresivas en el SSP y PE (rs= 0.790909, P=0.05 y rs= 0.845455, P=0.05); y menor carga parasitaria (rs= -0.909091, P=0.05) en el SSP y PE (rs= -0.727273, P=0.05). Los ovinos del SSP tuvieron preferencia por C. nlemfuensis, pero los animales que consumieron más follaje de L. leucocephala presentaron mayor nivel de

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hematocrito (rs=0.694269, P=0.05). Se concluye que los ovinos con mayor índice de dominancia que pastorearon en el sistema silvopastoril y en potreros con pasto estrella, tuvieron menores cargas parasitarias, y que el pastoreo en sistemas silvopastoriles ofrece a los ovinos el consumo de follaje de especies arbóreas y arbustivas, que promueve la capacidad de resistir cargas parasitarias elevadas, y mantener niveles estables de hematocrito independientemente de su nivel jerárquico dentro del grupo. Palabras clave: Comportamiento animal, Hábitos alimentarios, Parásitos, Rumiantes.

Recibido: 07/10/2017 Aceptado: 06/01/2018

Introducción

A nivel mundial se estima un rebaño de 1,173 millones de ovinos(1), que satisface un consumo per cápita de 2,5 kg(2). Siendo las principales zonas de cría Europa, Asia, América del Sur, Australia y Nueva Zelanda. México, presenta un rebaño de 8.7 millones de cabezas(3), y una producción de 55,605 t de carne en 2017(4). El estado de Yucatán destaca como uno de los estados con mayor auge de productores de ovinos(5). Sin embargo, los productores se enfrentan a diversos problemas como manejo de los rebaños, nutrición y sanidad(6). Con relación al manejo, es importante considerar las estructuras jerárquicas dentro del grupo, para entender los rasgos, las funciones y características de las organizaciones sociales de los animales(7,8), que promueven la eficiencia de los grupos de animales en el rebaño(9), para la proyección óptima de los sistemas productivos; esto debido a que determinan el acceso a los recursos alimenticios, reflejándose en la calidad, cantidad de las especies forrajeras cosechadas e ingesta de nutrientes(10). La manipulación de la nutrición durante el pastoreo de los ovinos, proporciona opciones útiles para controlar los parásitos gastrointestinales como componente de una estrategia integrada(11). Se ha propuesto que la selección de especies forrajeras no gramíneas en arreglos silvopastoriles mejora la salud animal al disminuir el consumo de pasturas infestadas con larvas de nematodos(4), reflejándose en una menor cantidad de huevecillos presentes en sus deposiciones fecales(12). En este sentido, la cuantificación de la selección del forraje es una 53

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herramienta importante para hacer más efectivo y eficiente el uso del recurso forrajero por los rumiantes en pastoreo(13). Por lo tanto, el objetivo en esta investigación fue determinar la relación del nivel jerárquico con las preferencias alimenticias y el grado de infestación de ovinos Pelibuey pastoreando en un sistema silvopastoril o en una pradera de pasto estrella, como una estrategia para hacer eficientes los sistemas de producción.

Material y métodos

Ubicación

El estudio se realizó en Conkal, Yucatán, México ubicado a 21°04’30.1” N y 89°30’18.4” W a 8 msnm, con clima cálido sub húmedo Awo, temperatura media anual de 26.5 °C y precipitación media anual de 900 mm. Con suelo calcáreo, poco profundo y alto porcentaje de pedregosidad (Litosoles y Rendzinas)(14). Se utilizaron dos sistemas de pastoreo: a) uno silvopastoril (SSP) con un área de 130 x 24 m; conformada por pasto estrella de África (Cynodon nlemfuensis) como gramínea base, leucaena (Leucaena leucocephala) establecida en callejones sembrada a 0.5 m entre plantas y 3 m entre hileras, tulipán (Hibiscus rosa-sinensis) como cerco vivo, sembrado a 0.25 m entre plantas intercalado con gliricidia (Gliricidia sepium) cada 2 m, y una línea central de pixoy (Guazuma ulmifolia) cada 3 m; b) área constituida por una pradera con pasto estrella de África (C. nlemfuensis) (PE), con una dimensión de 130 x 24 m. El área total del SSP y del PE se dividió en 11 potreros de 9 x 22 m y se delimitó con un cerco eléctrico móvil. Al inicio del experimento cada potrero se homogeneizó con un corte, las especies arbóreas y arbustivas se podaron a 50 cm de altura y el pasto estrella a 10 cm sobre el suelo. Los potreros tuvieron un manejo rotacional con 3 días de ocupación por 30 días de descanso, con una carga animal equivalente a 1 UA/ha. Se utilizaron 22 ovinos Pelibuey, divididos en dos grupos de 11 animales (cinco machos y seis hembras) para cada tratamiento, con edad y peso promedio de 78 días y 19.2 ± 1.4 kg. 54

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Los ovinos se manejaron de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO1999), que se rige bajo especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales para experimentación. Previo al experimento, los animales se vacunaron con 2.5 ml de bacterina triple y desparasitados con ivomec® (0.2 mg por kg de peso vivo). El periodo de pastoreo fue de 0700 a 1400 h, durante cinco meses (agosto-diciembre). Al término del pastoreo, se alojaron en corrales individuales para su complementación individual al 1 % de su peso vivo con alimento balanceado comercial y agua ad libitum.

Pruebas de jerarquía social

Se elaboró una lista de conductas con las formas de expresión de la dominancia entre los ovinos, para evaluar el comportamiento(15,16). Para las pruebas de dominancia se colocaron dos ovinos del mismo lote en un corral de ensayo después de una restricción de alimento de 18 h. Luego, se les ofrecieron 20 g de alimento balanceado comercial y se permitió que se dieran encuentros de conflicto entre ellos. Durante cinco minutos se observó y registró la frecuencia con que se presentó cada conducta del catálogo, utilizando el muestreo focalanimal para cada ovino(17). Al final se registraron las actitudes de dominancia y subordinación para cada animal. Esta prueba se realizó una vez al mes con todos los ovinos de cada grupo (SSP y PE), los resultados se sintetizaron en una tabla de contingencia de pruebas pareadas(18).

Selección del forraje

Los ovinos se marcaron e identificaron de manera individual, y mediante observación directa(19) se registraron los primeros 100 bocados a las plantas forrajeras presentes en el área de pastoreo. Las observaciones se realizaron quincenalmente, durante dos días consecutivos en dos horarios 0700 y 1200 h en cada potrero. Los datos recabados se registraron en un formato marcado con los horarios, días y número del animal.

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Los 100 bocados de los ovinos en el SSP, se clasificaron en el consumo de las especies C. nlemfuensis, L. leucocephala, G. sepium, G. ulmifolia y H. rosa-sinensis, Para los animales del PE, los 100 bocados del primero y segundo día se clasificaron en pasto estrella y arvenses.

Huevecillos por gramo de excremento (HPG)

Se recolectó cada 15 días una muestra de 10 g de excremento fresco directamente del recto de cada animal y se colocaron en bolsas de polietileno previamente identificadas. El estiércol de cada animal se homogenizó y posteriormente se procesó individualmente para cuantificar los huevecillos de nematodos gastrointestinales por cada gramo de excremento empleando la técnica de McMaster(20).

Determinación del hematocrito (HT)

De cada ovino se tomó una muestra de 3 ml de sangre directamente de la vena yugular quincenalmente, y se colocó en tubos de ensayo con EDTA disódico previamente identificados. Luego, se procesaron mediante la técnica de micro hematocrito capilar(21).

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AnĂĄlisis de jerarquĂas sociales del grupo

La linealidad jerĂĄrquica en el grupo se estimĂł mediante la linealidad en la jerarquĂa de Landau(18), con la que es posible conocer el grado de estratificaciĂłn del lote mediante la fĂłrmula Linealidad: â&#x201E;&#x17D; = [12/(đ?&#x2018;&#x203A;3 â&#x20AC;&#x201C; đ?&#x2018;&#x203A;)] đ?&#x203A;´ [đ?&#x2018;&#x2030;đ?&#x2018;&#x17D; â&#x2C6;&#x2019; (đ?&#x2018;&#x203A; â&#x2C6;&#x2019; 1)/2]2 , Donde: h= Ăndice de linealidad, n= nĂşmero de animales en el grupo, Va= nĂşmero de animales que domina cada individuo.

La agresividad, dominancia y eficiencia para desplazar, se estimaron mediante las expresiones usadas anteriormente para rumiantes en pastoreo(22). Para todos estos indicadores los valores oscilan entre 0 y 1, siendo el valor 1 la linealidad absoluta, mĂĄxima agresividad, dominancia absoluta y mĂĄxima eficiencia para desplazar. La agresividad se estimĂł con: đ??´đ?&#x2018;&#x201D;đ?&#x2018;&#x2013;

(đ??´đ?&#x2018;&#x201D; = đ??´đ?&#x2018;&#x201D;đ?&#x2018;Ą), Donde: Ag= Ăndice de agresividad, Agi= agresiones que el individuo iniciĂł, Agt= agresiones totales en las que participĂł.

La dominancia se calculĂł con (đ??źđ??ˇ = đ??ˇâ&#x2C6;&#x2014; Exr) Donde: ID= Ăndice de dominancia, D= Ăndice de dominio en el grupo, Exr= ĂŠxito relativo en el desplazamiento. 57

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A su vez 𝐷𝑜

𝐷 = 𝐷𝑜+𝐷𝑜𝑛 , Donde: Do= individuos a los que domina, Don= individuos a los que no domina

𝐷𝑧

𝐸𝑥𝑟 = 𝐷𝑧+𝐷𝑧𝑜 , Donde: Dz= veces que el individuo desplazó, Dzo= veces que el individuo fue desplazado. La eficiencia para desplazar se determinó con la fórmula

𝐸𝑓𝑑𝑧 =

𝐷𝑧 𝐷𝑧+𝑁𝑑𝑧

Donde: Efdz= eficiencia individual para desplazar, Dz= veces que el individuo desplazó, Ndz= veces que no desplazó.

El nivel de rango social se determinó según el índice de dominancia (ID) que presentaron los ovinos. Donde: alto= se imponen a >50 % de sus adversarios, medio= se imponen entre 10 y 49 % de los adversarios y bajo= se imponen a <10 % o ninguno de sus adversarios. La dominancia, preferencias alimenticias, cantidad de hematocrito, huevecillos por gramo de excremento y su interacción, se analizaron mediante un modelo lineal mixto para mediciones repetidas en el tiempo, utilizando el procedimiento MIXED(23). También se realizaron pruebas de correlación de Spearman con una significancia P<0.05, para establecer la relación entre las preferencias alimenticias, parasitismo, cantidad de hematocrito, dominancia, eficiencia para desplazar y agresividad. Los datos se analizaron con el paquete estadístico SAS® versión 9.0.

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Resultados y Discusión

Pruebas de dominancia

Con relación al rango social dentro de los grupos de los dos sistemas de pastoreo, se encontró 1 ovino dominante y 10 subordinados en el SSP, representando una jerarquía lineal; y para el sistema PE se observaron dos ovinos dominantes y nueve subordinados, siendo una jerarquía bidireccional (Figura 1). En los grupos pequeños, con animales del mismo sexo y tamaño, la estructura social frecuentemente es lineal o próxima a lineal(24).

El nivel jerárquico mostró tendencias poco lineales, con valores de h=0.75 y h=0.50 para los ovinos en sistema silvopastoril y monocultivo de pasto estrella, con R2= 0.9198 y R2= 0.9822, respectivamente (Figura 1). Se considera lineal una jerarquía con índice de Landau superior a 0.9, en grupos de animales machos(17,18), como en grupos de cabríos estabulados, los cuales presentan una clara gradación jerárquica, con linealidades de 0.92 y 0.99(25) y en grupos de borregas existe una estructura social significativamente jerárquica(26). En el caso de vaquillas de búfalo, se presenta del 55.24 % de dominancia unidireccional en pastizales grandes y del 54 al 63 % de dominancia unidireccional en pequeños pastizales, clasificando a los grupos como jerarquía semi-lineal(27). Cabe señalar que no existe reporte de rangos jerárquicos en grupos mixtos de ovinos en condiciones de pastoreo.

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Índice de dominancia

Figura 1: Jerarquía social en los rebaños en pastoreo en un sistema silvopastoril (SSP) y en una pradera de pasto estrella (PE) 0.42 0.40 0.38 0.36 0.34 0.32 0.30 0.28 0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

SSP

y = 0.043x - 0.0672 R² = 0.9198

Índice de dominancia

0 0.38 0.36 0.34 0.32 0.30 0.28 0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

y = 0.0379x - 0.0332 R² = 0.984

Número de animales

Los ovinos más dominantes presentaron mayor cantidad de conductas agresivas (F1, (28) . Estas características de 21=0.65256, P=0.000154); que involucran ataques o amenazas organizaciones sociales, aunadas a las funciones de cada animal, son indispensables para hacer un manejo más eficiente de los grupos de animales y para la proyección óptima de los sistemas productivos(29); dado que la jerarquía social en un grupo de animales está influenciada por diferentes factores y está definida como la inhibición del comportamiento de un animal sumiso por otro dominante a través de amenazas, embestidas y otras agresiones(30). Así mismo, los ovinos más dominantes en los dos sistemas de pastoreo, tuvieron menores cargas 60

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parasitarias (Figura 2); coincidiendo con un estudio con cabras lecheras, donde se observó que la cantidad de huevecillos de parásitos gastrointestinales en heces, es superior en los animales con categorías jerárquicas medias y bajas (subordinados)(31).

Figura 2: Relación entre nivel de dominancia ( ) y el número de huevecillos de nematodos gastrointestinales por gramo de heces ( ) de ovinos en un sistema silvopastoril (SSP) y monocultivo de pasto estrella (PE) SSP 1400

0.40

1200

Dominancia

0.35 1000

0.30 0.25

800

0.20

600

0.15

400

0.10 200

0.05 0.00

Número de huevecillos

0.45

11 1400

0.35

1200

Dominancia

0.30

1000

0.25

800

0.20

600

0.15

400

0.10

200

0.05 0.00

Número de huevecillos

PE 0.40

Número de animales

Selección de forraje

Los ovinos que pastorearon en el sistema silvopastoril tuvieron mayor preferencia por C. nlemfuensis con 68 %, seguido por el H. rosa-sinensis con 22 % y L. leucocephala con 10 % (F2, 11=15.95349, P=0.00034), mientras que las especies G. sepium y G. ulmifolia no fueron consumidas por los animales. Esta misma tendencia en la preferencia de las especies 61

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se observó con ovejas adultas vacías en el mismo sistema silvopastoril(32). Este comportamiento se debe a que los ovinos son consumidores de selectividad intermedia que prefieren el consumo de gramíneas de piso, pero que ocasionalmente pueden ramonear(33). También esta selección de la dieta en ovinos está fuertemente determinada por interacciones sociales, hasta el punto de que esta relación puede mejorar la aversión hacia ciertos forrajes que en el pasado hayan causado un efecto desagradable al ser consumidos(34). Los animales que consumieron mayor cantidad H. rosa-sinensis disminuyeron la cantidad de bocados sobre C. nlemfuensis (rs=-0.763636, P= 0.05) (Figura 3), aun cuando C. nlemfuensis presenta una disponibilidad de biomasa mayor en ese sistema(32), y se debe a que el follaje de H. rosasinensis contiene una menor cantidad de compuestos antinutricionales(35,36,37), los cuales son causa de conductas de rechazo(38).

Figura 3: Relación entre el porcentaje de consumo de tres diferentes especies vegetales y de hematocrito de ovinos en un sistema silvopastoril 100

33.0

32.0

80 70

31.0

60 50

30.0

40 29.0

30 20

Hematocrito (%)

Preferencia de consumo (%)

28.0

10 0

27.0 1

Número de animales H. rosa-sinensis

L. leucocephala

C. nlemfuensis

Hematocrito

Los ovinos del SSP que consumieron mayor cantidad de forraje de L. leucocephala presentaron mayor cantidad de hematocrito (rs=0.694269, P=0.05). Coincidiendo con lo reportado para ovinos Pelibuey en pastoreo en sistemas silvopastoriles con L. leucocephala, G. sepium, A. lebbeck y pasto P. máximum, propiciando valores superiores a 28 de hematocrito. En ovejas Pelibuey y corderos suplementados con follaje de L. leucocephala y L. pallida, respectivamente, se encontraron niveles de hemoglobina y volumen celular superiores(39,40), siendo un indicador favorable en el crecimiento de crías y salud de reproductoras(41) repercutiendo positivamente en el incremento de la productividad y sustentabilidad de los sistemas de producción(42). En este sentido, L. leucocephala contiene en promedio 381.30 mg Fe kg-1 MS)(43), y el consumo de 94.38 g MS de L. leucocephala 62

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aporta 200 ppm de hierro(44), cantidad superior de las necesidades de consumo de hierro por los ovinos que va de 30 a 50 ppm(45). Favoreciendo los crecimientos acelerados, mayor resistencia a infecciones, ausencia de anemia (reflejada en el hematocrito), letargia, incremento de la frecuencia respiratoria, y disminuye los índices de mortalidad por deficiencia del elemento(46). Por otra parte, L. leucocephala posee metabolitos secundarios (fenoles totales y saponinas), que al ofrecerse en la dieta de los ovinos, fomenta la reducción del número de huevecillos de nematodos gastrointestinales(47), mostrando un efecto inhibitorio >50% (a concentraciones de 100 mg/ml) sobre las larvas de la tercera etapa (L3)(48). Por lo tanto, los ovinos dominantes en el SSP, demuestran mejores condiciones tanto de alimentación, como de resistencia a cargas parasitarias e incremento de hematocrito; en este sentido se ha establecido que los individuos con mayor estatus social tienden a tener mejor productividad(49).

Conclusiones e implicaciones

Los ovinos que pastorearon en el sistema silvopastoril y en potreros con pasto estrella, no mostraron tendencias lineales significativas en su nivel jerárquico. Sin embargo, al correlacionarlo con el número de huevecillos de parásitos, se observó que los animales con mayor índice de dominancia tuvieron menores cargas parasitarias. En el sistema silvopastoril, los ovinos tuvieron mayor preferencia por consumir forraje de C. nlemfuensis, seguido por H. rosa-sinensis y L. leucocephala. Los individuos que consumieron L. leucocephala, presentaron mayor cantidad de hematocrito, debido al aporte de hierro que se obtiene al consumir esta leguminosa.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4512 Artículo

Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico para becerros del altiplano mexicano

Patricia Landa-Salgadoa Yesenia Caballero-Cervantesa Efrén Ramírez-Bribiescaa* Ana María Hernández-Anguianoa Luz Mariana Ramírez-Hernándezb David Espinosa-Victoriaa David Hernández-Sáncheza

Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. Km 36.5 Carretera México Texcoco. Montecillo Estado de México. CP 56230. b

Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Facultad de Medicina.

*Autor de correspondencia: efrenrb@colpos.mx

Resumen: Los becerros neonatos son expuestos continuamente a un amplio rango de microorganismos habitantes del ambiente, y a patógenos causantes de diarrea. El objetivo de este estudio fue aislar e identificar bacterias acido lácticas (BAL) de la mucosa oral de becerros, calostro y leche de vacas Holstein. El aislamiento de BAL se realizó en caldo y placas con medio ManRogosa Sharp (MRS). Una vez purificadas las colonias bacterianas, se realizaron pruebas morfológicas y bioquímicas para la caracterización de BAL. Se aislaron 16 colonias bacterianas, de las cuales se clasificaron en 12 de la mucosa oral, 2 en leche y 2 en calostro.

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Estas colonias se evaluaron a pH ácido (4.0 y 4.5) y sales biliares (SB: 0.3 y 1.5 g). Posteriormente se identificaron con el Sistema API50CHL. Las especies aisladas con resistencia a pH de 4 y 1.5 de SB fueron: Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus crispatus y Lactococcus lactis. Estas colonias cuentan con un potencial probiótico para ser usadas en becerros. Palabras clave: Becerras, Probióticos, Aislamiento, Resistencia.

Recibido: 01/06/2017 Aceptado: 27/02/2018

Introducción

La cría de becerras para reemplazo presenta algunos problemas, como el mal suministro de calostro, alimentación con sustitutos de leche de baja calidad y cambios repentinos en la ración(1). Estas malas prácticas provocan diarreas ocasionadas principalmente por enteropatógenos, provocando tasa de mortalidad en más de 10 %, durante las primeras semanas de vida(2). Para reducir la mortalidad se recurre al uso de antibióticos, pero la resistencia a las cepas patógenas afecta negativamente la salud de los animales(3,4). En consecuencia, diferentes laboratorios veterinarios promueven el uso de probióticos hechos de bacterias ácido lácticas (BAL), prometiendo beneficios en la prevención y disminución de diarreas, con mejora en la ganancia de peso. Sin embargo, los productos deben de cumplir con requisitos idóneos para ser probióticos eficientes. Por ejemplo, el número mínimo de microorganismos que se requiere en el intestino del becerro para generar una adecuada salud, es de 106 unidades formadoras de colonias (UFC) /ml(1). Los ensayos clínicos realizados en la década pasada, demostraron que el 45 % de probióticos comercializados, tienen nula eficiencia de las BAL en la prevención de diarreas en becerras, e incluso parece que estos en lugar de favorecer, incrementaron la incidencia y severidad de diarreas(4,5), y no hay respuesta para mejorar la ganancia diaria de peso y la conversión alimenticia(6,7). En la actualidad estos mismos parámetros son similares por los laboratorios que comercializan probióticos en las unidades de producción ganadera lechera. Las cepas usadas tienen baja viabilidad de microorganismos probióticos presentes en los productos comerciales; además se han encontrado especies de bacterias diferentes a las citadas en las etiquetas(8). En cuanto a su origen, las bacterias probióticas provienen de diferentes regiones 69

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geográficas e incluso de otras especies animales, lo que ocasiona baja viabilidad y actividad probiótica(4). El objetivo del estudio se enfocó en el aislamiento y la identificación de bacterias con potencial probiótico (resistencia a pH ácido y sales biliares (SB)) en ganado Holstein de la región del altiplano de México.

Material y métodos

Aislamiento de bacterias de mucosa oral y de calostro

Se utilizaron cinco becerros lactantes de 30 días de edad y cinco vacas adultas de segundo parto en lactancia, raza Holstein Friesan del rancho del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. También se tomaron muestras de calostro de cinco vacas Holstein recién paridas del Rancho privado Xalapango. Ambos sitios están ubicados en el valle de Texcoco, Estado de México, entre los paralelos 18° 21ý 20° 17Ń y 98° 36ý 100° 36Ó(9).

Toma de muestras

Mucosa oral: se tomaron muestras duplicadas de exudado de la mucosa oral por becerro lactante, frotando por 3 seg el hisopo (3MTMSwab-Sampler), previo a la ingesta de alimento matutino. Cada hisopo se colocó dentro de un tubo estéril con 10 ml de agua peptonada buferada (RS96010BPW). Calostro y leche: antes del muestreo se realizó la limpieza, desinfección y despunte de los pezones y se colectaron 5 ml de calostro y 10 ml de leche por grupo de vacas asignadas. Las muestras se depositaron en frascos estériles manteniéndose a 4 °C y trasladándose inmediatamente al laboratorio para su análisis, según lo descrito por la Norma Mexicana(10). 70

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Procesamiento de las muestras

Las muestras fueron pre-enriquecidas (para favorecer el crecimiento de las BAL) en medio de cultivo líquido(11). Se tomó por duplicado 1 ml de la suspensión bacteriana de mucosa oral y se depositó en tubos con 5 ml de caldo mann rogosa sharp (MRS). Los tubos inoculados se dividieron en dos grupos aleatorios. El primero se mantuvo en condiciones aerobias y el segundo en condiciones anaerobias, ambos a 37 °C por 18 h. En el caso de las muestras de calostro y leche, se tomaron 200 μl por duplicado y también se depositaron en tubos con 5 ml de caldo MRS. Los tubos inoculados se mantuvieron en un desecador con ambiente anaerobio (inducido con una vela encendida) por 18 h a 37 °C. Al final del tiempo, a cada tubo se le extrajo una muestra con la asa bacteriológica y se sembraron en cajas Petri con medio sólido MRS(12), incubando a 37 °C por 48 h, en condiciones anaerobias y aerobias. Como grupos testigo positivos y negativos, se incluyeron una cepa de Lactobacillus casei ATCC y una de E.coli O42, donadas por la Universidad Autónoma de Querétaro.

Selección de las bacterias

Los cultivos fueron seriados en el proceso de sembrado, por las duplicaciones en el medio solido MRS, se acumularon 54 colonias con características de BAL, de acuerdo al tamaño, forma, superficie, elevación, borde y color(13). La caracterización de las cepas se realizó con las pruebas de tinción de Gram, morfología celular, tinción de esporas y la prueba de catalasa(12). Adicionalmente, se efectuaron las pruebas de producción de indol y de motilidad, en medio de cultivo SIM (sulfhídrico, indol, motilidad), hidrólisis de la gelatina y reducción de nitratos(14). Se realizó una segunda selección de las colonias aisladas, considerando los mejores puntajes y la morfología idónea de cocobacilos y bacilos. Entre éstas, se identificaron 27 colonias, las cuales se reprodujeron en 5 ml de caldo MRS por 18 h, para su evaluación como bacterias probióticas. De cada suspensión bacteriana obtenida se tomaron 800 µl por duplicado y se transfirieron a tubos Eppendorf con 800 µl de glicerol estéril al 50% como crioprotector, conservándose a -20 ºC por 3 h y posteriormente a -80 ºC por tiempo indefinido.

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Determinación de la resistencia y supervivencia de las cepas seleccionadas a condiciones gastrointestinales

Resistencia a pH ácido

Preparación de inóculo: de las 27 colonias obtenidas, se hizo nueva selección. Se escogieron 16 de ellas por seguir manteniendo una morfología bien definida de cocobacilos y bacilos. El cepario final quedó integrado con 12 aislamientos de la mucosa oral, 2 de leche y 2 de calostro. Todas las colonias seleccionadas se reactivaron a -20 ºC y temperatura ambiente; luego se transfirió cada muestra en tubos con 5 ml de caldo MRS. Posteriormente se incubaron a 37 ºC en condiciones anaerobias por 24 h y nuevamente 1 ml de cada suspensión bacteriana (106 Log10 UFC/ml) se adicionó en tubos con 9 ml de caldo MRS, incubándose por 18 h. La suspensión bacteriana obtenida se centrifugó a 2,056 xg por 10 min; el paquete celular se resuspendió en 10 ml de leche semidescremada (Alpura® 2000®) esterilizada (110 °C por 15 min) para realizar la prueba de resistencia a pH 4.5 y 4.0. La leche se utilizó como medio protector y como vehículo de los microorganismos probióticos(15), siguiendo el protocolo descrito por Fernández de Palencia et al(16). La resistencia a condiciones de pH ácido se evaluó con la disminución con las células bacterianas. La reducción de pH se hizo con alícuotas controladas de HCl al IN. Cuando el pH se estabilizó a 4.5 y 4.0, las muestras se incubaron a 37 °C por 10 min. Posteriormente se tomó 1 ml de cada suspensión para hacer diluciones seriadas, y de cada dilución se tomaron 100 µl, sembrándose en agar MRS, para estimar la viabilidad de las células bacterianas. Las colonias evaluadas a pH de 4.5 y 4.0, se sembraron a diluciones10-6 y 10-7 en una suspensión de leche.

Resistencia a la exposición de sales biliares en placas de microtitulación

Las colonias seleccionadas se expusieron a SB en placas de microtitulación (BD PrimariaTM) con capacidad de 3.5 ml por pozo. Se utilizó una placa por cada concentración y previo al establecimiento de la prueba, se prepararon dos matraces con 100 ml caldo MRS; uno con 72

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0.3 g y otro con 1.5 g de SB de bovino (Oxgall DifcoTM)(17,18). En la prueba se incluyeron dos testigos negativos: solución MRS-con SB sin bacteria y un MRS-sin SB con bacteria. La prueba se estableció por triplicado y cada colonia ocupó seis pozos de la placa. Adicionalmente, se depositaron 2 ml de solución (MRS-con SB sin bacteria) y 20 μl (1:10 v/v) de suspensión bacteriana por 18 h de crecimiento. Después de 1 h de inoculación y previo a la incubación de las placas, se midió la densidad óptica (DO) de cada suspensión a 600 nm con un espectrofotómetro (GENESYS 10 UV/ Thermo Spectronic). Posteriormente, las placas con los tratamientos se incubaron a 37 ºC en condiciones anaerobias, a las 24 h se registró nuevamente la lectura de la DO.

Identificación bioquímica y colección de cepas con potencial probiótico

Las colonias con características de BAL se identificaron con el sistema APICHL (System; BioMerieux SA, France). En el procedimiento, se reactivaron las colonias en 5 ml de caldo MRS en condiciones anaerobias a 37 ºC por 18 h, adicionando el diluyente 50CH (suministrado con la galería: API50CH), de acuerdo a las indicaciones del producto. La suspensión preparada se usó para llenar 50 microtubos de la galería; las cúpulas de estos microtubos se llenaron con aceite mineral estéril, para generar condiciones anaerobias. Las galerías inoculadas (una por colonia) se mantuvieron a 37 ºC por 48 h para establecer el perfil bioquímico de cada colonia. La interpretación de los resultados se hizo con la identificación de cambio de color en el medio API50CHL de cada microtubo; el azul indicó un valor negativo, y el amarillo y negro indicaron valores positivos (hoja de seguridad placas). Los datos registrados se analizaron con el sistema computarizado Apiweb®. La Figura 1, resume en tres fases las secuencias metodológicas que se realizaron para identificar y asilar las BAL con potencial probiótico.

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Figura 1: Diagrama de aislamiento y selección de bacterias probioticas Fase 1 AISLAMIENTO Muestras Mucosa oral (becerras lactantes)

Leche y calostro (vacas Holstein)

Procedimiento

Preenriiquecimiento en cultivo MRS por 18 h

Enriquecimiento en cultivo Agar MRS por 48 h

Fase 2

Fase 3

SELECCIÓN

CONDICIONES DE RESISTENCIA GASTROINTESTINAL

Identificación morfológica

Pruebas bioquímicas

-Apariencia de la colonia

-Catalasa -Indol

-Cepa Gram

-Movilidad

-Morfología celular

-Gelatinasa

-Esporas

-Reducción de Nitratos

Resistencia a condiciones ácidas Inoculación en leche con cepa ácido lactica Inoculado en leche Ajuste a pH 4.0 y 4.5, incubado por 10 min

Incubación anaerobica y aerobica a 37°C

Conteo de viabilidad cellular en agar MRS

Resistencia a sales biliares 0.3 y 1.5% sales biliares/100mL de MRS (reactivo) 20 µL inoculado en 2 mL reactivo Medición de densidad óptica (OD 600nm) 1 h y 24 h Evaluación de resistencia por diferencia OD en 1 y 24 h.

Análisis estadístico

Los datos que fueron analizados con pruebas estadísticas inicialmente, presentaron una distribución normal (Prueba de Kolmogorov–Smirnov) y homogeneidad de varianzas (prueba de Levene). Posteriormente se realizó el análisis de varianza y la prueba de Tukey para la comparación de medias. Se utilizó un nivel mínimo de significancia de 0.5%, utilizando el paquete estadístico SPSS Ver. 15(19).

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Resultados y discusión

Aislamiento y crecimiento de colonias

Las colonias seleccionadas en el medio anaerobio tuvieron mejor crecimiento que las cultivadas en condiciones aerobias. Las colonias por la morfología seleccionada fueron cocobacilos y bacilos, gram positivas, sin presencia de esporas, catalasa negativa, sin motilidad, sin producción de indol, gelatinasa y negativas a la reducción de nitratos. Las muestras de la mucosa oral tuvieron un tamaño promedio de 2 a 4 mm de diámetro con características morfológicas homogéneas de forma circular, elevación convexa, borde entero, superficie lisa y color blanco sin pigmentos. Del total de las muestras de leche, solo el 20 % tuvo crecimiento de colonias bacterianas, el tamaño promedio fue de 2.5 mm de diámetro. Mientras las colonias aisladas de calostro presentaron un color beige y tamaño variable de entre 1 y 5 mm de diámetro. Generalmente, las bacterias probióticas se han aislado de las mucosas oral, vaginal e intestinal de becerros sanos y en muestras de leche(11,20). En este estudio, las colonias de la mucosa oral y de leche, tuvieron la capacidad de los lactobacilos para adaptarse y sobrevivir(13), debido a la presencia del grupo hemina, que les permite activar la cadena respiratoria con el oxígeno como aceptor de electrones(21). Los diferentes géneros de las BAL comparten características morfológicas, metabólicas y fisiológicas como la forma, elevación, margen, color y reacciones bioquímicas(13). Sus características morfológicas celulares y pruebas bioquímicas han sido reportadas como básicas, para la selección de cepas probióticas(5,22), y se recomienda complementarlo con estudios moleculares(23).

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Viabilidad de las cepas seleccionadas con base en su resistencia a pH ácido

El Cuadro 1 muestra las poblaciones de las colonias evaluadas a diferentes pH. El crecimiento con el pH testigo de 6.5, promedió 9.07 Log10 UFC/ml. Mientras que a pH 4.0, el crecimiento disminuyó (P<0.001) a 5.09 Log10 UFC/ml. Las colonias que no crecieron con un pH de 4 fueron eliminadas y no se incluyeron en el cepario final; éstas fueron las dos colonias de leche. Específicamente las bacterias probióticas para poder llegar al sitio de acción y mantenerse viables, deben ser capaces de resistir el pH ácido y la presencia de SB en el duodeno(24). Varios autores(7,25) han desarrollado metodologías para evaluar la resistencia de cepas probióticas en condiciones gástricas. Por ejemplo, L.plantarum y L. acidophilus, crecieron y fueron viables a pH 5.0, mientras que a pH 4.0 y 3.0 se detuvieron estas actividades(16); lo que coincide con la información obtenida en este estudio a un pH de 4.0. Esta sensibilidad de las cepas, puede estar relacionado con la respuesta ácido tolerante o resistencia adquirida. Broadbent et al(26) compararon células de L. casei crecidas a pH 6.0 (testigo) contra grupos de células adaptadas pH 4.5 por 10 min y células adaptadas a pH 4.5 por 20 min, presentando disminución de viabilidad de hasta 4.0 Log10 y de 0.7 a 2.4 Log10 UFC/ml en 10 y 20 min de adaptación, respectivamente. Los autores mencionan que la adaptación de las células al ácido provocó cambios en la composición de lípidos de la membrana, mostrando un dramático incremento de ácidos grasos saturados e insaturados, así como la fermentación maloláctica y acumulación intracelular de histidina. Por otro lado, otros autores(27,28,29) reportan habilidades de las bacterias probióticas para sobrevivir a la digestión acida del estómago; ésta es variable y depende de cada cepa, lo que explica las diferencias en resistencia, como ocurrió en el estudio a pH 4.0. Comúnmente, los lactobacilos tienen mejor crecimiento a pH 4.0 vs pH 3.0(30). Pocas colonias llegan a resistir el pH 3, comúnmente 4 de 200 cepas BAL sobreviven(31).

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Cuadro 1: Conteo de colonias recobradas en agar Man-Rogosa-Sharpe (MRS) inmediatamente después de la exposición a pH ácido y su identificación bioquímica Número de cepas

T1 pH 6.5

~ Mucosa oral 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Identificación bioquímica de cepas ácido lácticas con sistema API (API 50CHL)

T2 pH 4.5

T3 pH 4.0

9.40

9.21

5.74

8.77 9.46 9.02 9.06 8.28 8.78 8.71 9.36 9.39 9.37 9.36 8.82

8.40 8.43 9.36 7.23 7.67 8.47 8.49 8.39 9.11 8.68 8.84 8.48

5.08 5.49 5.09 4.83 5.06 4.01 6.43 6.47 5.44 NG NG 3.33

Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Pediococcus pentosaceus Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum Lactobacillus salivarius Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus crispatus Leuconostoc mesenterodes Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis Leuconostoc mesenteroides

9.02 9.15

8.14 8.31

NG NG

Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis

15 16

9.32 9.32

9.14 8.95

5.34 4.52

Lactococcus lactis Leuconostoc mesenteroides

Media

9.07±0.33a

8.50±0.54b

5.09±0.89c

Leche 13 14 Calostro

Treatment, ~ correspond to positive control strain L. casei. Data are mean values of three replicates and correspond to Log10 CFU/mL NG: No growth. a,b Different letters in the mean value ± Std. deviation, indicate significant differences P<0.03.

Por otro lado, la resistencia y crecimiento a la exposición de SB se ha realizado con concentraciones desde 0.1 hasta 4.0 %(32,33). En el presente estudio, las BAL continuaron creciendo a altas concentraciones de SB (1.5 g), siendo un parámetro importante para los microorganismos que componen los productos comerciales(34,35), sin embargo no es comúnmente considerado. En un estudio similar(36) se evaluó la resistencia de L. plantarum a la exposición de varias concentraciones de SB de origen porcino (0.01, 0.05, 0.10 y 0.15 g); el crecimiento de la cepa fue monitoreado por 24 h con mediciones de DO, y la mayor 77

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tasa de crecimiento se dio con la menor concentración de SB. De este modo, la densidad final alcanzada por esta cepa con 0.10 g SB fue tres veces más baja con respecto al testigo. Mientras que, en este estudio, las colonias tuvieron una DO final de 2.5 veces más baja, con una concentración de 0.3 g, a diferencia del grupo testigo. La resistencia a SB de bacterias productoras de ácido láctico (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Lactococcus lactis) y bacterias probióticas (L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus y Bifidobacterium) se ha reportado con dosis mayores de 0.3 a 1% de SB(37,38). S. thermophilus fue la cepa más sensible a la concentración de 0.5 g SB y Lactococcus lactis fue resistente con 1 g de SB. Todas las cepas probióticas mostraron resistencia a 1.5 g SB, aunque la resistencia a la exposición de SB puede diferir entre los miembros del género Lactobacillus, debido a la habilidad de algunas cepas para colonizar y estabilizarse rápidamente en el intestino de las becerras(7). Estudios in vivo, administrando L. acidophilus a becerras, fueron capaces de incrementar el número total de lactobacilos en el yeyuno de los animales de 13 a 39 % y por otro lado, cepas de L. plantarum y Lactococcus acidilactici presentaron mejor crecimiento con condiciones de pH 4.0 y 0.3g de SB(5). En este estudio, las BAL mostraron mejor tolerancia a la exposición de SB que a pH 4.0; principalmente la resistencia a la exposición prolongada al pH ácido y a altas concentraciones de SB de las BAL seleccionadas, pueden ser buenos parámetros en capacidad de sobrevivencia y colonización durante el tránsito intestinal(28,39).

Identificación bioquímica de las cepas con el sistema API50CHL y viabilidad a la exposición con sales biliares

El Cuadro 1 también muestra los resultados obtenidos en la identificación de las colonias con base al perfil de fermentación de carbohidratos (API50CHL-BioMerieux). Los resultados tuvieron un intervalo de 96 y 99 % de efectividad. De las colonias aisladas de la mucosa oral, 6 se identificaron como Lactobacillus, 5 como Leuconostoc y 1 como Pediococcus. Las muestras de calostro fueron Leuconostoc y Lactobacillus. El promedio de la DO obtenida en cada una de las cepas evaluadas, incrementó 3.1 veces (P<0.05), después de 24 h de incubación, con la concentración de 0.3 g SB, respecto a la primera lectura. Por otra parte, cuando se aumentó la concentración de SB a 1.5 g, la DO incrementó 2.7 veces a las 24 h. Los efectos principales muestran disminución (P<0.023) de OD con el mayor valor de SB e incrementó (P<0.0001) la OD desde 1 a 24 h (Cuadro 2). Algunos estudios que han evaluado el beneficio de las bacterias probióticas en becerras 78

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reportan datos contradictorios, tal vez por la falta de diversidad en los probióticos por regiones geográficas y por comercializar cepas poco viables. Por tal motivo, es difícil encontrar secuencias de experimentos con una misma cepa(40). En América Latina la comercialización de productos probióticos para becerras es limitada y dudosa; la mayoría de las empresas solo cuentan con cepas de L. acidophilus cepa KA1-A 8 con 3,000 billones de UFC/dosis y con L. casei con 3,000 millones de UFC/dosis, sin especificación para su uso en becerras. Otras empresas promueven productos con Lactobacillus rhamnosus y Bifidobacterium lactis con 1 x 1011 UFC por unidad dosis o con 50 unidades para la aplicación directa en 1,000 L de leche; pero en el producto no se especifica el origen de las cepas, quizás son obtenidas de otras especies animales o alimentos, por lo que no se consideran buenas opciones. Por ejemplo, cuando se administra cepas probióticas de humanos al ganado, estos microorganismos no tienen una colonización duradera en el intestino, debido a las diferencias fisiológicas y alimentarias entre las especies(41,42); razón por la cual en este estudio se realizó el aislamiento de colonias con potencial probiótico de una región ganadera de bovinos Holstein. Actualmente, para el ganado los géneros de bacterias probióticas más utilizadas, son Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Lactococcus y Leuconostoc(43), Lactobacillus plantarum, L. acidophilus, L. casei, L. salivarius y Lactococcus lactis(5,44,45), L. fermentum VC3B-08, W. hellinica V1V-30 and L. farciminis B4F-06(20).

Tabla 2: Promedios de densidad óptica (DO) en el crecimiento de cepas ácido lácticas con dos concentraciones de sales biliares (SB,%) por 1 y 24 horas

I DO P>F

Tratamiento 0.3% SB 1.5% SB 1h 24h 1h 24h 0.33 1.02 0.31 0.84 0.008 0.008

Efectos principales EEM

0.3% SB 1.5% SB

0.03

0.68

0.57

EEM

24h

EEM

0.02

0.32

0.93 0.0001

0.02

0.023

EEM= Error estándar de la media.

Conclusiones e implicaciones

Se seleccionaron 16 colonias BAL de ganado Holstein. Lactobacillus brevis aislado en muestras de la mucosa oral y leche, no creció en pH ácido (4.0). Las colonias seleccionadas 79

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fueron Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum. Lactobacillus crispatus y Lactococcus lactis. Por las características evaluadas, se asume que las colonias identificadas, cuentan ampliamente con un potencial probiótico para ser evaluadas directamente en el tracto gastrointestinal de becerros.

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http://dx.doi.org/ 10.22319/rmcp.v10i1.4661 Artículo

Efecto de monensina intraruminal sobre el β-hidroxibutirato, enfermedades del periparto, producción de leche y sus componentes en ganado Holstein

Pedro Melendeza* Alejandra Arévalosb Mario Duchensb Pablo Pinedoc

University of Georgia, College of Veterinary Medicine. Tifton, GA 31793, EE.UU.

Universidad de Chile, Colegio de Ciencias Veterinarias. Santiago, Chile.

Colorado State University, Department of Animal Sciences. Fort Collins, CO, EE.UU.

*Autor de correspondencia: pedro.melendez@uga.edu

Resumen: El objetivo fue determinar los efectos de la administración de un bolo intraruminal de liberación lenta de monensina en vacas lecheras sobre indicadores de salud y producción. El estudio se realizó en una lechería de la Región Metropolitana de Chile. Se seleccionaron 77 vacas multíparas, que a los 21 días antes de la fecha esperada de parto se asignaron al azar a un grupo tratado (n= 37) o testigo (n= 40). El grupo tratado recibió un bolo de monensina que libera 335 mg/día por aproximadamente 95 días. Se estudiaron la presencia de fiebre (t°≥39.5 °C), incidencia de enfermedades del postparto, concentraciones de β-hidroxibutirato (BHB) en sangre, y la condición corporal desde los 21 días preparto hasta los 21 días postparto. También se comparó la producción y composición de leche y la cuenta de células somáticas (CCS) durante el posparto. Las concentraciones de BHB en sangre fueron similares

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entre ambos grupos (P>0.05). Tampoco se detectaron diferencias en la incidencia de cetosis, temperatura corporal (fiebre), metritis puerperal, retención de membranas fetales; excepto endometritis, donde se observó una tendencia a presentarse una menor incidencia en el grupo tratado vs testigo. La monensina no mejoró significativamente la producción de leche, ni el contenido de grasa o la CCS, salvo un mayor nivel de porcentaje de proteína durante la primera semana postparto en favor del grupo tratado. Las vacas tratadas tuvieron una menor pérdida de condición corporal (P<0.05) entre el parto y los 21 días post parto, que vacas testigo. Palabras clave: Monensina, Bolo intraruminal, Enfermedades, Postparto, Vaca lechera.

Abstract: The objective was to determine the effects of an intraruminal controlled-released capsule of monensin on health and milk production in Holstein cows. The study was conducted in a dairy from the Metropolitan Region, Chile. Seventy seven (77) cows at 21 d before expected parturition were randomly assigned to either a treated (n= 37) or a control (n= 40) group. The treated group received an oral bolus of monensin releasing 335 mg/d for about 95 d. Cows were examined clinically every day beginning at calving for a total of 10 d. The presence of fever (t°≥39.5 °C) and postpartum diseases, weekly blood β-hydroxybutyrate (BHB) concentrations, and body condition from 21 d prepartum to 21 d postpartum were recorded. Milk production, its composition (protein and fat percentage) and somatic cell counts (SCC) during the first 100 d of lactation were also compared. Blood BHB concentrations (mmol/L) were similar between groups (P>0.05). There were also no differences on the incidence of ketosis, fever, puerperal metritis, or retention of fetal membranes, except for endometritis, which tended to be lower in the treated than the control group (P=0.08). Monensin did not significantly improve milk yield, fat, or SCC content. However, cows treated with monensin had a higher protein during the first week postpartum than control cows (P<0.05). In addition, cows treated with monensin gained more body condition (P<0.05) between dry-off and parturition, and had a lower body condition loss (P<0.05) between calving and 21 d postpartum than control cows. Key words: Monensin, Intraruminal bolus, Diseases, Postpartum, Dairy cow.

Recibido: 11/10/2017 Aceptado: 16/02/2018

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Introducción

El período de transición se define como los últimos 21 días de gestación hasta los 21 días después del parto, donde el estrés y los cambios metabólicos que ocurren en este tiempo hacen que el animal sea más susceptible a las enfermedades(1-3). El 75 % de todas las enfermedades en el ganado lechero ocurren en el primer mes de lactancia y el 50 % de las enfermedades metabólicas e infecciosas se generan en el período de transición(4). Además, ocurre una disminución en el consumo de materia seca (CMS) y un aumento en la demanda de energía debido al crecimiento fetal y al aumento de la producción de leche postparto(1); como resultado, la vaca experimenta un balance energético negativo (BEN), caracterizado principalmente por la movilización de grasa, que se transporta en el plasma como ácidos grasos no esterificados (NEFA, por sus siglas en inglés) alcanzando el hígado y siguiendo diferentes vías metabólicas. Cuando los niveles de glucosa son normales, los NEFA son reesterificados a triglicéridos y transportados a la sangre en forma de lipoproteínas de muy baja densidad(5). Si los niveles de glucosa son bajos, los NEFA entran a la mitocondria y se oxidan hasta acetil-CoA para continuar en el ciclo de Krebs o formar cuerpos cetónicos. Para entrar al ciclo de Krebs, se requiere de oxaloacetato, el cual proviene principalmente de la glucosa. Dado que hay una respuesta adaptativa pobre al BEN y la glucosa se dirige a la glándula mamaria para la síntesis de lactosa, la formación de cuerpos cetónicos se incrementa con un resultado final de cetosis(5), la cual puede ser clínica o subclínica. La cetosis subclínica se caracteriza por niveles de β-hidroxibutirato circulante (BHB) ≥ 1.2 mmol/L en ausencia de signos clínicos(6-8). La cetosis se puede diagnosticar mediante la determinación de los cuerpos cetónicos en la orina (acetoacetato), la leche (BHB), el suero (BHB), el plasma (BHB) y la sangre (BHB)(9). Las vacas que desarrollan cetosis disminuyen su producción de leche y corren mayor riesgo de experimentar otras enfermedades posparto, en consecuencia, reducen su fertilidad(10,11), lo que implica pérdidas significativas para la industria lechera(7,12). Dado a que existe una mayor susceptibilidad a las enfermedades durante el período de transición, es necesario establecer estrategias de prevención, incluyendo un adecuado manejo nutricional. Dentro de esto, el uso de aditivos como la monensina, un ionóforo que altera la fermentación ruminal en favor de la producción de ácido propiónico (principal precursor gluconeogénico en el rumiante), podría contribuir a disminuir la incidencia de cetosis y trastornos relacionados(13,14), con la consecuente mejora en producción de leche, la salud y la fertilidad durante la lactancia(2,15). La hipótesis de este estudio fue que las vacas tratadas con un bolo de monensina intraruminal tienen menores concentraciones de BHB en sangre, menor incidencia de enfermedades posparto y mayor producción de leche que las vacas sin suplementación. Por lo tanto, el 86

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objetivo fue evaluar el efecto de una cápsula de monensina sódica intraruminal que libera 300 mg de monensina por día durante 95 días sobre los niveles de BHB en el postparto, incidencia de enfermedades del periparto y producción de leche y sus componentes en vacas Holstein bajo condiciones chilenas, relativo al medio ambiente y clima (tipo mediterráneo), variedades y calidades de los forrajes (heno y ensilaje de alfalfa y ensilaje de maíz) y calidad de los concentrados (en base a maíz grano, harina de soya, harina de canola, harinilla de trigo, semilla de algodón, y subproductos agrícolas), etc.

Material y métodos

Lechería y animales

El estudio se realizó en una lechería Holstein, con 400 vacas en ordeña de la zona central de Chile (33.8o S, 71.3o O). La precipitación media anual y la temperatura más baja y más alta fue de 235 mm, 2 °C y 30 °C, respectivamente(16). Las vacas eran confinadas en cubículos con camas de arena; eran ordeñadas tres por día, con una producción a los 305 días de 12,800 kg de leche. Las vacas se secaban entre 45 y 60 días antes de la fecha probable de parto (FPP), alojadas en un corral de tierra y alimentadas con una ración para vacas secas. A las cuatro semanas de la FPP, las vacas se movían a un grupo preparto y se alimentaban con una dieta aniónica y un precursor de glucosa (propilenglicol; 200 g/vaca/día). Este producto no se utilizó en el posparto. Las vacas parían en maternidades y después se trasladaban al grupo posparto hasta los 21 días en Lactación. Las raciones se formularon para cubrir los requerimientos nutricionales del modelo Cornell Net Carbohydrate and Protein System(17) usando un software comercial (NDS, RUM & N Sas, Reggio Emilia, Italia).

Diseño experimental

Con el fin de encontrar una diferencia en la concentración de BHB en sangre de 0.2 mmol/L (DE= 0.22) entre el grupo tratado (1.0 mmol/L) y el grupo control (1.2 mmol/L (valor de 87

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corte para cetosis subclínica)(6), con un 95% de confianza y un 80% de potencia, se calculó un tamaño muestral de 30 animales por grupo. Debido a que durante el experimento se pueden producir eliminaciones involuntarias de animales, se decidió asignar 40 animales por grupo para poder terminar el periodo experimental con el número mínimo de animales calculados. Los animales se asignaron aleatoriamente a los 28 días antes de la FPP. El grupo de tratamiento recibió por vía oral un bolo de monensina sódica que libera diariamente ~ 335 mg de monensina de sodio durante un período de 95 días (Rumensin® Cápsula, Elanco, Greenfield, IN, USA). El bolo tenía un número de identificación, que se registra en el momento de su aplicación para identificar la vaca si el bolo es regurgitado. Tanto las vacas tratadas como las controles fueron alojadas en el mismo corral preparto, recibieron la misma ración y fueron expuestas a las mismas condiciones ambientales y de manejo. Diariamente, se inspeccionaba el corral preparto y posparto para identificar bolos regurgitados. Si un bolo era encontrado, se evaluaba su estado y si no se observaba defectuoso era re-administrado; de lo contrario, se aplicaba un nuevo bolo. La composición de las dietas y su contenido nutricional se muestran en los Cuadros 1 y 2.

Cuadro 1: Composición de la dieta preparto y postparto (kg/día, base materia seca) consumidas por las vacas tratadas con monensina y el grupo control Ingrediente Heno alfalfa Ensilaje de maíz Paja de trigo Maíz grano Harina de soya Harina de canola Harinilla de trigo Grasa de sobrepaso Orujo de cebada Carbonato de calcio Sal aniónica Minerales Vitaminas Ligante de micotoxinas Precursor gluconeogenico1 Levaduras Total materia seca 1

Preparto

Postparto

0.90 5.04 1.8 0.44 0.45 0.25 0.88 2.45 0.049 0.87 0.12 0.032 0.05 0.02 0.01 13.22

2.65 6.24 3.98 2.5 0.29 2.03 0.09 1.6 0.09 0.1 0.015 0.05 0.01 19.64

Precursor en base a propilenglicol al 50%.

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Cuadro 2: Composiciones nutricionales de las dietas preparto y postparto consumidas por las vacas tratadas con monensina y el grupo control Nutriente

Preparto

Postparto

48.5 15.2 26.6 9.49 27.4 47.1 32.3 25.1 16.6 4.59 7.99 0.89 0.41 0.40 0.23 1.02 0.21 1.23 1.19 -90

49.5 15.9 27.3 9.08 18.3 35.0 21.6 37.2 23.5 5.01 6.96 0.85 0.41 0.31 0.32 1.13 0.21 0.30 1.60 +210

Materia seca, % Proteína cruda, % MS1 Proteína soluble, % PC1 Proteína degradable, % MS2 FDA, % MS1, a aFDNmo, % MS1, b peFDN, % MS 2, c CNF, % MS1, d Almidón, % MS1 EE, % MS1 Cenizas, % MS1 Ca, % MS1 P, % MS1 Mg, % MS1 Na, % MS1 K, % MS1 S, % MS1 Cl, % MS1 ENLac, Mcal/kg MS2 DCAD, mEq/kg MS3 1

Análisis de laboratorio. Calculado a partir de fórmulas después del análisis de laboratorio. 3 Fórmula diferencia catiónica-aniónica dietaria (Na+ + K+) – (Cl- + S-). a Fibra detergente acido. b Fibra detergente neutro libre de cenizas y tratada con amilasa. c Fibra detergente neutro físicamente efectiva. d Carbohidratos no fibrosos. 2

Muestra de sangre

Se recolectaron muestras de sangre a los 7, 14, 21 y 28 días postparto para evaluar los niveles de BHB mediante un medidor portátil (FreeStyle Optium®, Abbott Diabetes Care Inc., Alameda, CA). El medidor tiene una sensibilidad del 94.8% (IC95%: 92.6-97.0), y 89

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especificidad del 97.5% (IC95%: 96.9-98.1)(9). Se definió como cetosis subclínica un valor de BHB ≥ 1.2 mmol/L(6-8).

Condición corporal, enfermedades del postparto y producción de leche

El puntaje de condición corporal se evaluó por la misma persona a la asignación de la vaca, al parto y a los 28 días después del parto utilizando la escala de 1 a 5 con un incremento de 0.25 unidades, basado en una metodología estándar(18). Para la identificación de las enfermedades posparto, la temperatura corporal se midió con un termómetro digital vía rectal a los 3, 5 y 7 días después del parto. Dentro de las 24 h postparto, se observó la presencia de membranas fetales retenidas (RMF), definidas como membranas presentes en la vulva, vagina o en el útero por examen vaginal después de 24 h postparto(19). Dentro de las primeras dos semanas de lactancia, se realizó palpación rectal diaria para determinar la presencia de secreciones puerperales de mal olor o metritis, definida como la inflamación uterina con flujo genital anormal con o sin signos sistémicos, que ocurren dentro de los primeros 14 días en lactación(20). La presencia de mastitis se evaluó en la sala de ordeña a través de la inspección visual de la leche. Se consideró como mastitis clínica una leche visualmente anormal (por ejemplo, coagulada, acuosa, restos de fibrina o pus) de uno o más cuartos. Esta secreción podía estar o no acompañada de signos de inflamación de la ubre (calor, hinchazón o enrojecimiento)(19). La presencia de endometritis se evaluó al día 25 a 38 postparto, mediante vaginoscopio y secreciones genitales caracterizadas por descargas vaginales purulentas o muco-purulentas después de 21 días del parto(20). La producción de leche se midió semanalmente a través de un test oficial hasta los 90 días de lactancia, utilizando medidores proporcionales (Waikato Milking Systems LP, Verona, WI 53593, EE.UU). Además, se midieron semanalmente los porcentajes de grasa y proteína y el contenido de células somáticas (CCS) durante las primeras tres semanas de lactancia, utilizando un laboratorio comercial (Cooprinsem, Osorno, Chile).

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Análisis estadístico

El análisis de los datos se realizó con el programa computacional SAS 9.4(21). La incidencia de las enfermedades posparto se comparó a través de un modelo de regresión logística considerando como variable principal el efecto tratamiento y ajustando por el número de lactancia y la condición corporal al parto. Se calcularon las Razones de Riesgo (RR) ajustadas e intervalos de confianza al 95% (IC 95%). Se analizaron las concentraciones de BHB, los porcentajes de grasa y proteína y CCS mediante análisis de varianza para medidas repetidas, considerando los efectos de tratamiento, día de la muestra, número de lactancia (2, ≥3) y condición corporal al parto y sus interacciones. Los porcentajes de grasa y proteína se transformaron al arco seno de la raíz cuadrada, según la fórmula propuesta por Blis(22). El CCS se transformó a su puntuación lineal usando la fórmula log 2 (CCS/100) +3, según el método de Dabdoub y Shook(23). Se construyeron modelos mixtos considerando la mejor estructura de covarianza basada con la mejor prueba de bondad del ajuste(24). La condición corporal se evaluó mediante el cambio en la puntuación de la condición corporal desde el pre-parto hasta el parto y desde el parto hasta los 21 días posparto. Esta variable se analizó mediante un ANDEVA multivariable. El nivel de significancia se estableció con un valor de P≤0.05. La tendencia se consideró con un valor de P entre 0.1 y 0.05.

Resultados

Para el análisis final se consideraron 40 vacas en el grupo control y 37 vacas en el grupo tratado. Tres vacas del grupo tratado no fueron consideradas debido a que una vaca murió de enterotoxemia poco después del parto, y dos vacas abortaron pocos días después de recibir el bolo de monensina. Las concentraciones sanguíneas promedio (± error estándar de la media) de BHB (mmol/L) no fueron diferentes entre los dos grupos a través del tiempo (P>0.05) (Cuadro 3). Esto significa que la interacción grupo por tiempo no tuvo un efecto significativo y por ende ambas curvas fueron paralelas. La mayor diferencia en BHB se dio al día 7 postparto con una concentración para el grupo control de 0.7 mmol/L y para el grupo tratado de 0.57 mmol/L, sin embargo, esta diferencia tampoco fue significativa (P>0.05). 91

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Cuadro 3: Resultados análisis de varianza para medidas repetidas y mínimos cuadrados medios para BHB (mmol/L) para el grupo control y monensina durante las primeras cuatro semanas postparto Efecto Tratamiento Semana Tratamiento por semana Lactancia

GL num1 1 3 3 1

GL den2 74 225 225 74

Valor F 0.14 1.30 1.20 1.74

Valor de P 0.70 0.27 0.31 0.19

Concentraciones de BHB (mmol/L) en sangre Semana 1 2 3 4

Control 0.695 0.605 0.595 0.658

EEM3 0.062 0.062 0.062 0.062

Monensina 0.573 0.597 0.608 0.716

Valor de P > 0.05 > 0.05 > 0.05 > 0.05

1 2

grados de libertad numerador. grados de libertad denominador. 3 Error estándar de la media.

A la asignación de los animales ambos grupos no difirieron en su condición corporal (3.28 y 3.21 para el grupo control y tratado respectivamente, P>0.05). Sin embargo, las vacas tratadas con el bolo de monensina presentaron una condición corporal más alta al momento del parto (3.21) que las vacas controles (3.12), así como a los 28 días de lactancia (3.14 y 2.78, para el grupo tratado y control, respectivamente). En el Cuadro 4 se presentan los mínimos cuadrados medios de las pérdidas de condición corporal entre el preparto y el parto y entre el parto y el postparto.

Cuadro 4: Cambio en la condición corporal (CC) entre preparto y parto y entre parto y postparto en vacas tratadas con monensina y controles Grupo

Diferencia entre CC parto - preparto

EEM

Valor de P

Monensina Control

0.17 0.01

0.04 0.04

0.015

Diferencia entre CC postparto - parto -0.13 -0.31

EEM1

Valor de P

0.04 0.04

0.008

Grupo Monensina Control

EEM= error estándar de la media. 92

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Para la incidencia de enfermedades sólo hubo una tendencia (P=0.08) de presentación de una menor frecuencia de endometritis en el grupo tratado (14 %) en comparación al grupo control (30 %). La cetosis fue de 15 vs 27 %, RMF 23 vs 16 %, metritis 45 vs 30 % y fiebre 25 vs 16 %, para el grupo control y tratado, respectivamente. Las diferencias no fueron significativas (P>0.05). La producción de leche a través del tiempo no fue diferente entre ambos grupos (P>0.05) (Figura 1). En general, el primer control postparto (semana 1) la producción del grupo control fue de 37.4 kg y la del grupo tratado de 36.0 kg (P>0.05). Esta diferencia se mantuvo durante las 10 semanas del estudio entre ambos grupos, por lo tanto, la interacción grupo por semana no fue significativa, lo que implica que ambas curvas fueron paralelas. Para los sólidos de la leche, sólo el porcentaje de proteína en la semana 1 fue mayor para el grupo tratado con monensina (3.4 7%) que para el grupo control (3.16 %) (Cuadro 5, Figura 2). Sin embargo, los kilogramos totales de proteína por semana no fueron diferentes entre ambos grupos. Para la grasa de la leche, tanto el porcentaje como el total de kilogramos entre ambos grupos no fueron estadísticamente diferentes (P>0.05) (Cuadro 5, Figura 3), a pesar que en la primera semana postparto la grasa para el grupo tratado fue 4.10 % y para el grupo control 3.71 %. Tampoco hubo diferencias en la puntuación lineal de CCS en la semana 1, 2, y 3 entre ambos grupos (P>0.05) con una puntuación lineal que se mantuvo alrededor de 2 a 2.5 para ambos grupos (200 a 300 mil células por ml aproximadamente), salvo para la semana 2 en que la puntuación de CCS para el grupo tratado fue de 1.57 y para el grupo control de 2.05 (P>0.05) (Figura 4).

Figura 1: Promedio de producción de leche semanal en vacas tratadas con monensina y controles 60

Produccion de leche (kg/d)

55 50 45 40 35

Tratamiento

Control

25 20 1

semanas postparto Interacción grupo por tiempo no fue significativo (P>0.05).

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Cuadro 5: Porcentaje de grasa y proteína de la leche en vacas tratadas con monensina y controles durante las primeras cuatro semanas postparto EEM= error estándar de la media.

% Grasa Semana

Control

Monensina

EEM

Valor de P

3.88

4.26

0.61

> 0.05

3.36

3.19

0.59

> 0.05

4.43

4.26

0.60

> 0.05

3.40

3.45

0.61

> 0.05

% Proteína Semana

Control

Monensina

EEM

Valor de P

3.19

3.51

0.06

0.002

3.12

2.99

0.06

> 0.05

3.06

3.00

0.06

> 0.05

3.16

3.11

0.06

> 0.05

Figura 2: Porcentaje de proteína de la leche durante las 4 primeras semanas postparto entre vacas tratadas con monensina y controles 3.8 3.6 3.4

Proteina (%)

3.2 3

P=0.002

2.8 2.6 2.4

Tratamiento

Control

2.2 2 1

Semana postparto

Semana 1 diferencias significativas (P≤0.05).

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Figura 3: Porcentaje de grasa de leche durante las 4 primeras semanas postparto entre vacas tratadas con monensina y controles 4.5

Grasa, %

3.5

2.5

Tratamiento

Control

2 1

Semana postparto Interacción grupo por semana no fue estadísticamente significativo (P>0.05).

Figura 4: Puntaje lineal de células somáticas durante las 3 primeras semanas postparto en vacas tratadas con monensina y controles 3 2.5

LS SCC

2 1.5 1 Tratamiento

Control

0.5 0 1

2 Semana postparto

Interacción grupo por semana no fue significativa (P>0.05).

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Discusión

El uso de la monensina sódica en vacas lecheras es ilegal en muchos países del mundo, sin embargo, está permitida en países como EE.UU, Chile y Argentina. Una de las fortalezas de este estudio es que las vacas del grupo tratado y control se mantuvieron en el mismo corral o lote y se manipularon indistintamente durante todo el período de estudio. Esto permitió descartar cualquier efecto de corral y manejo sobre las variables en estudio y así disminuir la variabilidad de las características estudiadas. Sin embargo, una de las deficiencias de este estudio fue que algunas variables del posparto sólo se pudieron evaluar semanalmente y únicamente durante los primeros 30 días en lactación. A pesar que la mayoría de los cambios metabólicos ocurren dentro del postparto temprano, es indudable que hay efectos de arrastre que pueden afectar tanto la producción de leche, como el contenido de sólidos y variables de fertilidad más allá del primer mes de lactancia. Sin embargo, como este estudio se llevó a cabo en una lechería comercial, donde los animales después de los 30 días en lactación se mueven a distintos grupos de producción, fue técnicamente imposible continuar evaluando en forma consistente las variables de estudio. A pesar de estas deficiencias, de igual forma se pudieron demostrar algunas diferencias significativas en variables como porciento de proteína, algunas enfermedades como la endometritis, y cambios en la condición corporal, independiente que es una herramienta visual que presenta cierto grado de subjetividad. Los resultados de este estudio mostraron cierto beneficio de la aplicación de un bolo de monensina de liberación lenta en vacas Holstein durante el período de transición bajo las condiciones de manejo de los animales en la zona central de Chile. La condición corporal a las cuatro semanas de lactancia fue significativamente menor en las vacas control que en el grupo tratado con monensina. Esto podría indicar que el tratamiento con monensina ayudaría a las vacas a tener una menor pérdida de condición corporal después del parto. Resultados similares con respecto a la condición corporal han sido reportados en otros estudios que han evaluado el uso de monensina. Las vacas suplementadas con monensina perdieron menos condición corporal durante la lactancia temprana y mantuvieron o aumentaron su condición corporal desde el inicio del estudio (preparto) hasta el parto que las vacas no alimentadas con monensina(25,26). Esta menor disminución en las reservas corporales podría ser el resultado de una mayor disponibilidad de energía y proteína aportada por el efecto de la monensina en la fermentación ruminal. Este mecanismo podría explicarse parcialmente por un aumento de la proporción molar de ácido propiónico con una disminución simultánea de la proporción molar de acetato y butirato en el rumen(27). El aumento del propionato ruminal podría estar acompañado de una reducción de la cantidad de metano producido en el rumen y por un incremento en el nivel de glucosa en sangre(14,28), ya sea para la síntesis de leche o para la deposición de grasa(2,5). Además, se sabe que la monensina disminuye las concentraciones de 96

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L-lactato(28,29) y afecta al metabolismo del nitrógeno al disminuir la producción de nitrógeno amoniacal (N-NH3) ruminal(28), lo que en consecuencia podría aumentar el flujo duodenal de aminoácidos. Sin embargo, en el presente estudio, las concentraciones sanguíneas de BHB no fueron diferentes entre el grupo control y el grupo tratado. Este resultado contrasta con varios estudios a nivel mundial que informan que la monensina tiene un marcado efecto anticetogénico(26,30-32). Dentro de estos, es clásico el estudio de meta-análisis publicado(14), donde se resumen 59 investigaciones de todas partes del mundo, considerando un numero de 4,000 vacas en estudio, donde se demostró que la monensina sódica disminuyó la concentración de BHB en 13 %, sobre todo en vacas durante el primer mes de lactancia y también en vacas a pastoreo. Sin embargo, dentro de este mismo meta-análisis, se reportaron dos ensayos en que las vacas tratadas con monensina tuvieron una mayor concentración de BHB que vacas control. Una explicación parcial de que las vacas de nuestro estudio demostraron no tener diferencias en los niveles de BHB, podría estar relacionada con la suplementación de precursores gluconeogénicos en la dieta preparto en forma de propilenglicol. Una alta proporción de propilenglicol escapa a la degradación del rumen y se absorbe en el intestino delgado; el resto se metaboliza hacia propionato(33,34). En el hígado, el propilenglicol se convierte en glucosa, principalmente a través de la vía del lactaldehído y posterior oxidación a lactato(35). Desafortunadamente, no fue posible inferir un efecto de interacción potencial positivo o negativo entre el propilenglicol y la monensina en los escenarios experimentales actuales. Esto podría ser en parte una explicación del porqué la monensina no demostró diferencia alguna en los niveles de BHB. No hubo diferencias significativas entre los dos grupos sobre la incidencia de enfermedades del periparto. Esto difiere de Meléndez et al(13,36), quienes señalan que la monensina indirectamente mejora la función inmune, a través de un mejor estado energético. De hecho, el uso de un bolo análogo de liberación lenta de monensina también logró mejorar la condición corporal desde el secado al parto, y se logró disminuir la pérdida de condición corporal entre el parto y el postparto en comparación a vacas sin monensina, resultando en un menor número de enfermedades(36). No obstante, de acuerdo con los resultados de este estudio, en la mayoría de estas enfermedades, el hato estudiado presentó una incidencia de enfermedades que se encuentran dentro de lo considerado normal(19), excepto para la incidencia de metritis y endometritis en el grupo control (>30 %), donde hubo una tendencia a que las vacas tratadas con monensina desarrollaran un menor grado de infecciones uterinas. Cabe señalar, que el uso de modelos mixtos ANDEVA para medidas repetidas es una herramienta estadística muy potente que sirve para comparar medias y curvas de variables continuas a través del tiempo. Esta técnica permite considerar una matriz de correlación entre cada una de las medidas a través del tiempo. En este sentido, cada promedio en un tiempo determinado covaría por el promedio de la medida obtenida en la medición previa, generándose una estructura de covarianza que ofrece un gran poder estadístico(24). En cuanto a la producción de leche, no se encontraron diferencias estadísticas entre ambos grupos. Esto 97

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es consistente con lo que se ha informado en otros estudios, que indican que la aplicación de monensina no produce cambios en la producción de leche(13,37). Además, en la mayoría de los estudios, no se ha demostrado que la administración de propilenglicol antes o después del parto afecte significativamente el nivel de producción de leche en vacas lecheras(38,39). Sin lugar a dudas, el impacto del propilenglicol preparto sobre la producción de leche y la concentración de BHB en sangre es un factor que puede haber enmascarado el efecto positivo de la monensina sobre estas variables en estudio. Tanto la monensina como el propilenglicol suplementados en conjunto pueden tener una interacción positiva o negativa en las rutas metabólicas de la glucosa y energía de las vacas lecheras. Esto podría implicar que algunas vías metabólicas pueden ser saturadas con gran cantidad de propionato disponible para el hígado, afectando marginalmente la síntesis de glucosa. Como resultado, se sugiere que ambos grupos (control y tratamiento) produjeron suficiente glucosa para cubrir el rendimiento en producción de la leche y mantener bajos niveles de cuerpos cetónicos y el exceso potencial de glucosa sintetizada por el grupo tratado (con monensina y propilenglicol) pudo ayudar a disminuir el balance energético negativo y reducir las pérdidas de condición corporal durante el período postparto. Desafortunadamente, no hay un estudio que pruebe la hipótesis de una posible interacción entre monensina y propilenglicol en vacas lecheras de transición. Sólo hay un estudio que compara un grupo alimentado con propilenglicol y un grupo alimentado con monensina comparados con un grupo control; el grupo alimentado con propilenglicol presentó mayores niveles de glucosa y menores niveles de BHB en comparación con el grupo suplementado con monensina, sin haber diferencias en la producción de leche(40). Estos hallazgos apoyan parcialmente los resultados obtenidos en el presente estudio. En consecuencia, basándose en estos resultados, se propone considerar las implicancias del uso de ambos productos, con el fin de aclarar si existe una posible interacción beneficiosa o antagónica entre la monensina y el propilenglicol. En relación con la proteína de la leche, hubo un mayor porcentaje de proteína en la muestra tomada al día 7 posparto a favor del grupo tratado con monensina, pero no hubo diferencias significativas en términos de kilogramos totales de proteína entre el grupo tratado y el grupo control. Esto es contrario a lo que se ha reportado(14), donde la monensina aumentó la producción total de proteína (kg) pero disminuyó el porcentaje en la leche. Por otra parte, el tratamiento con monensina no afectó significativamente el porcentaje de grasa de la leche, contrariamente al estudio de meta-análisis reportado por Duffield et al(14), y que establece claramente que la monensina produce una disminución en el porcentaje de grasa, producción de acetato y butirato en el rumen, lo que lleva a una reducción de precursores lipogénicos para la síntesis de ácidos grasos en la glándula mamaria. Indudablemente, toda la dinámica metabólica de la vaca lechera durante el periodo de transición y principalmente durante el posparto temprano es compleja y multifactorial. Es bien sabido hoy en día que la insulina juega un rol fundamental en todos estos procesos, y que además las vacas en la actualidad presentan un estado de insulino-resistencia hacia 98

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finales de la gestación y comienzos de la lactancia, como una estrategia metabólica de favorecer el drenaje de glucosa hacia el feto y hacia la glándula mamaria durante el posparto temprano(41). Dado estas especulaciones, se sugiere que en futuros estudios se puedan analizar además las concentraciones de glucosa e insulina como para poder intentar dilucidar el real impacto que puede tener la hormona pancreática sobre el estado metabólico de la vaca durante el posparto temprano, bajo manejos de suplementación de precursores que ayudan a estimular la síntesis de glucosa. El CCS en ambos grupos no fue diferente. Los valores promedio para las vacas control y tratadas fueron de 57,000 células/ml y 51,000 células/ml, respectivamente, valores muy por debajo de las 200,000 que se recomiendan para considerar la leche de buena calidad. Estos valores coinciden con el bajo número de mastitis clínicas observadas. La menor pérdida de condición corporal presentada por el ganado al inicio de la lactancia podría deberse a la buena calidad y manejo de la ración y manejo adecuado y mayor confort en los grupos pre y posparto, haciendo que la vaca experimente un menor déficit energético con baja movilización de sus reservas corporales. Esto podría hacer que los niveles de BHB siguieran siendo menores, por lo que la salud y la producción de leche en ambos grupos no se vieran afectadas. Con estos resultados, se podría sugerir que la administración de este aditivo aporta beneficios en ganado lechero bien manejado, teniendo una ración formulada de acuerdo con los requerimientos de los animales y manteniendo buenas condiciones de confort. Además, las buenas prácticas de manejo llevadas a cabo por esta finca, como el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno de las enfermedades, especialmente en la vaca lechera durante el posparto temprano, podrían ser la explicación de un patrón de baja incidencia de enfermedades.

Conclusiones e implicaciones

El uso de un bolo de monensina de liberación lenta mejoró la dinámica de la condición corporal después del parto, hubo una tendencia a reducir la incidencia de infecciones uterinas y mejoró levemente el contenido de proteína de la leche. No hubo diferencias significativas ni en la producción de leche y la concentración de BHB en sangre entre ambos grupos en estudio.

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103

http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4739 Artículo

Evaluación y análisis sensorial del Queso Bola de Ocosingo (México) desde la perspectiva del consumidor

Mónica Agudelo-Lópeza Alfredo Cesín-Vargasb* Angélica Espinoza-Ortegac Benito Ramírez-Valverded a

Universidad Autónoma Chapingo- CIESTAAM, Km. 38.5. Carretera México- Texcoco. CP 56230. Estado de México, México. b

Universidad Nacional Autónoma de México-UAER, Coordinación de Humanidades, Av. Lázaro Cárdenas s/n esquina Felicitas del Río, Jiquilpan, CP 59510. Michoacán, México. c

Universidad Autónoma del Estado de México- ICAR, Toluca, Estado de México. México.

Colegio de Postgraduados Campus-Puebla. Puebla, México.

Autor de correspondencia: alfredo.cesin@gmail.com.

Resumen: El objetivo fue analizar la aceptación y preferencia del consumidor por el Queso Bola de Ocosingo con tres tiempos de maduración: fresco, 21 días y 45 días. Se realizaron 90 encuestas en tres escenarios relacionados con la gastronomía: Gourmet Show, Feria Nacional de la Cultura Rural en Chapingo y Muestra Gastronómica. La información se analizó a través de pruebas estadísticas paramétricas y no paramétricas. Al contrastar las respuestas, con los escenarios de evaluación y las características socioeconómicas de los panelistas, se encontró que aquellos que reportaron ingreso y nivel educativo más bajos, percibieron mejor las características visuales, prefiriendo los quesos más frescos; mientras que los panelistas con ingreso y nivel educativo más altos, apreciaron mejor los atributos asociados al aroma y el sabor del queso más maduro. El Queso Bola de Ocosingo comparte características productivas y culturales con otros quesos artesanales mexicanos, por lo que se espera contribuir para preservarlos como parte del patrimonio gastronómico del país.

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Palabras clave: Aceptabilidad, Alimentos diferenciados, Ferias gastronómicas, Panelistas no entrenados, Preferencia.

Recibido: 04/01/2018 Aceptado: 21/02/2018

Introducción En las últimas décadas se han incrementado los movimientos que buscan conservar y promover la producción y consumo de productos locales. Esto responde parcialmente, al miedo que genera en el consumidor la excesiva industrialización y el desconocimiento del origen de los alimentos, que ha llevado a los consumidores a relacionarse con atributos externos como precios, presentaciones, etiquetas y sellos(1,2). Adicionalmente, diversos autores mencionan la importancia de recuperar la confianza en los alimentos a través del retorno a lo local, protegiendo la diversidad cultural contenida en los mismos(3,4). Así, está surgiendo un nuevo segmento de consumidores preocupados por la forma en que se producen los alimentos y con capacidad para gestionar su propia comida; y que, pueden contribuir a recobrar el significado tradicional de la relación productor-consumidor, por ejemplo, reactivando los mercados locales, las ferias y otro tipo de eventos gastronómicos como escenarios para la valorización de los productos(1,4–6). La mayoría de trabajos que refieren al estudio de los cambios que han tenido los consumidores se han realizado principalmente en países europeos(7–10); sin embargo, actualmente pareciera que también en Latinoamérica el consumidor está cambiando y se desconocen sus características y principales motivos de preferencia, porque los estudios existentes en países en vías de desarrollo han considerado principalmente los efectos de la inserción de la agricultura en el mercado mundial con sus implicaciones sobre las formas tradicionales de producción y los cambios sobre la población locales, especialmente en la dieta(1). Esta situación que remite a la necesidad de estudiar los gustos y preferencias que tiene el consumidor por los productos locales, entre ellos, los quesos artesanales mexicanos. En México se han identificado alrededor de 40 quesos diferentes, algunos elaborados en zonas marginadas del país y que todavía conservan sus formas de producción artesanal, cuya comercialización se realiza principalmente en mercados locales, cumpliendo un papel importante en el desarrollo económico de los territorios(11).

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El queso bola (QBO) es elaborado por diez queseros artesanales en Ocosingo, en el estado de Chiapas, en el sureste del país. Es una bola de queso ácido de doble crema de leche cruda de vaca, y cubierto con un doble forro de queso, descremado. Tradicionalmente el proceso inicia con la recepción de la leche, a la cual se le agrega crema para hacer más suave la textura interna del queso; después se cuaja y desuera; la pasta resultante se madura en mantas, por mínimo 21 días antes del forrado, las cuales se cuelgan y se cambian periódicamente para evitar la contaminación del producto. Transcurrido el plazo de maduración, se elabora una bola de queso que es forrada con dos capas de otro queso descremado, de pasta hilada, cuya función es proteger el relleno, favoreciendo su comercialización a temperatura ambiente, sin contaminarse en el interior(11,12). La competencia con quesos industrializados de otro tipo y con menor precio, sumado a la reputación y demanda del queso bola original, han ocasionado cambios negativos en el proceso, específicamente en la reducción del tiempo de acidificación de la cuajada, aumentando la rotación de inventarios que repercute en la reducción de costos financieros, y mayores ganancias. Es por ello que en el mercado local se encuentran tres tipos de queso, uno fresco, el tradicional de 21 días y otro de 45 días, pero que no están claramente diferenciados ni en etiqueta (especialmente en los quesos frescos y de 21 días) ni en precio. Esto representa una pérdida del patrimonio agroalimentario, porque en el proceso de elaboración del queso fresco, la cuajada no se deja acidificar durante el tiempo que tradicionalmente se ha considerado, respetando el saber hacer y garantizando un producto inocuo; algo que también constituye un riesgo a la salud del consumidor, al tratarse de un queso, que independiente de los días de acidificación de la cuajada, es elaborado con leche cruda. Se han realizado estudios con quesos de más de 21 días de acidificación de la cuajada que demuestran su calidad microbiológica(12,13); pero el queso fresco no ha sido estudiado, lo que sugiere la necesidad, en un principio, de determinar si existe un consumidor que lo valore, y de acuerdo a esto identificar necesidades futuras de investigación que conlleven a su conservación como queso artesanal, además de garantizar su inocuidad. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue conocer la aceptación y preferencia del consumidor por el queso bola de Ocosingo con tres tiempos de maduración, fresco, de 21 y 45 días, y analizar las implicaciones de esa preferencia.

Material y métodos Selección de panelistas y escenarios de evaluación

El estudio se realizó con consumidores (panelistas no entrenados), considerados como idóneos por mostrar respuestas espontáneas, rápidas y no condicionadas al resultado de entrenamientos 106

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previos(14–16). Los panelistas fueron asistentes de tres eventos gastronómicos: i) Gourmet Show (GS), se realiza cada año en el World Trade Center de la ciudad de México, reuniendo a proveedores de productos de calidad para la cocina con consumidores potenciales; ii) Feria Nacional de la Cultura Rural en la Universidad Autónoma Chapingo (FCR), un evento anual que reúne a productores provenientes de todo el país, que elaboran productos locales, artesanías y alimentos para su exhibición y venta, también destinan un espacio para la venta de alimentos preparados representativos de cada estado, funcionando como un corredor gastronómico y, iii) Muestra Gastronómica (MG) del Instituto de Ciencias Agropecuarias y Rurales (ICAR,) de la Universidad Autónoma del Estado de México, realizada para conmemorar el día internacional de la alimentación y en la que confluyen estudiantes, docentes y personal administrativo de la institución. La elección de los escenarios fue por conveniencia, aprovechando la facilidad de acceso para realizar las pruebas sensoriales. Para este tipo de estudios se recomienda evaluar entre 50 y 500 panelistas, los cuales generalmente son reclutados por ser usuarios, o porque están familiarizados con los productos a evaluar(15,17). Se entrevistaron a 90 panelistas, distribuidos en los tres escenarios descritos: 34.4 % en el GS, 30 % en la FCR y 35.6 % en la MG; que si bien, la mayoría, no conocían con antelación el queso, se eligieron porque al asistir a este tipo de eventos, pueden valorar los productos locales elaborados artesanalmente. Además, el queso es poco conocido a nivel nacional, por lo que se espera que las respuestas espontáneas de panelistas no entrenados, al no recibir entrenamientos previos, sean más parecidas a las del promedio de la población(15).

Muestras evaluadas

Se utilizaron muestras de QBO elaboradas en una misma quesería, para evitar sesgos relacionados con el proceso. Los quesos sometidos a las pruebas fueron: i) queso fresco con tres días de acidificación de la cuajada antes del forrado, y en total con 17 a 19 días de elaborado (en adelante queso fresco); ii) queso con 21 días de acidificación de la cuajada previo al forrado y en total con 35 a 37 días de elaborado (en adelante queso de 21 días); y iii) queso con 45 días de acidificación de la cuajada antes del forrado y en total con 59 a 61 días de elaborado (en adelante queso de 45 días). Las muestras se distribuyeron en un plato, codificadas aleatoriamente, para evitar que fueran asociadas con los días de maduración y se dispuso de agua, pan y fruta (manzanas verdes) para la limpieza de las papilas gustativas de los panelistas antes de iniciar la evaluación y entre muestras.

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Pruebas realizadas

Se aplicaron dos pruebas, una de aceptación y otra de preferencia. La primera indica el nivel de agrado de las características sensoriales de cada muestra, acorde con una escala de valoración, mientras que en la segunda se elige la muestra de mayor agrado(15). Al final de las pruebas, se solicitó a los panelistas información de procedencia, género, edad e ingreso para facilitar su estratificación. En la evaluación de aceptación se consideraron diez atributos: apariencia externa e interna, color externo e interno, textura en mano, olor, textura en boca, sabor, retrogusto y precio; se utilizó una escala ordinal de cinco puntos (1: no me gusta; 2: me gusta un poco; 3: me es indiferente; 4: me gusta y 5: me gusta mucho), acompañada de una escala visual como estrategia para agilizar el proceso, y evitar, en caso de existir panelistas sin educación formal, un factor de discriminación(18). En la segunda prueba, los panelistas indicaron el orden de preferencia de las muestras evaluadas. Al final de las pruebas, los panelistas fueron informados de las características de cada queso y de sus condiciones de elaboración, para responder a la disposición a comprar y a pagar un valor diferencial por el queso preferido (considerando un rango de ± 60 % del precio base por pieza de 300 g).

Análisis estadístico

Para validar la fiabilidad de las preguntas realizadas se utilizó el coeficiente alfa de Cronbach, tomando en cuenta los 30 atributos que forman las tres pruebas. El resultado mostró un valor de 0.935, por lo que se consideró que el cuestionario era fiable para captar la información sobre las características de los quesos. Este coeficiente se obtuvo mediante la utilización del paquete estadístico SPSS versión 16. Para el análisis de los datos se aplicaron diversas técnicas estadísticas, utilizando el paquete estadístico Infostat(19,20): Para la comparación de los atributos entre quesos y dado que cada panelista, de los tres escenarios seleccionados, probó las tres muestras y dio su opinión respecto a cada atributo, se consideraron como muestras relacionadas, analizadas mediante la prueba de Friedman. Para facilitar la presentación de resultados, los atributos se clasificaron en: visuales (apariencia externa e interna, color externo e interno) y otros (textura en mano, olor, textura en boca, sabor y retrogusto). La percepción del precio se presentó por separado, dado que no se considera un atributo propiamente sensorial, pero su inclusión es fundamental para tener una visión más completa de la evaluación(21,22). 108

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Para comparar la diferencia entre los tres escenarios de evaluación respecto a los atributos de cada uno de los quesos, se empleó la prueba de Kruskal Wallis. Para buscar las preferencias respecto a los quesos, se utilizaron pruebas estadísticas paramétricas y no paramétricas de acuerdo a la escala de medición de la variable. Las variables cuantitativas fueron comparadas a través de análisis de varianza, con prueba de Tukey para la separación de medias y las nominales con la prueba de Ji cuadrada. Finalmente, para buscar diferencias en la disposición a pagar un valor diferente al precio base, se usó la prueba de Kruskal Wallis para comparar los resultados por escenario de evaluación.

Resultados y discusión Perfil socioeconómico de los panelistas Los asistentes del GS son en su mayoría de la Ciudad de México y a diferencia de los otros dos grupos, presentan el nivel de escolaridad más alto y también mayor ingreso; en el grupo de la FCR predominaron personas de diferentes partes del país, y es el grupo con menor escolaridad; los asistentes de la MG fueron en su mayoría estudiantes, provenientes del Estado de México y los de menor edad promedio (Cuadro 1).

Cuadro 1: Características del perfil del consumidor por escenario de evaluación Variable/ escenario de evaluación Lugar de origen, % Ciudad de México Estado de México Otros estados Edad, años Género, % Masculino Femenino Escolaridad, años Ocupación, % Profesionales Independientes Empleados Estudiantes Ingreso mensual*

Gourmet Show

Feria de la Cultura Rural

Muestra Gastronómica

Estadístico Χ2= 26.722

48.4 38.7 12.9 32.5±11.1 (ab)

26 33.3 40.7 34.4±17.2 (b)

3.1 81.3 15.6 26.6±6.3 (a)

51.6 48.4 17.3±3.4 (b)

51.9 48.1 12.4±2.8 (a)

43.7 56.3 16.2±2.5 (b)

30 20 16.7 33.3

7.4 25.9 25.9 40.7

9.4 0 0

90.6

1,077±995 (b)

442±347 (a)

415±243 (a)

P <.0001

F= 3.43 Χ2= 0.525

<.037 .776

F= 27.169 Χ2= 36.865

<.001 <.001

Χ2= 8.98

<.001

* Dólares. Tipo de cambio: 18.492. Fuente: Banco de México (http://www.banxico.org.mx/dyn/portal-mercadocambiario/index.html). Consultado el 18 de julio de 2016. a,b Medias con letra en común no son diferentes (P>0.05). 109

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Percepción de los atributos por tipo de queso y por escenario de evaluación

Para identificar la percepción general del consumidor por tipo de queso, a través de la prueba de Friedman, se observa que no hay diferencias estadísticas significativas por tipo de queso (Cuadro 2). Es importante mencionar que el QBO, al ser un producto sui géneris dentro de los quesos artesanales mexicanos, posee características que lo diferencian de otros tipos de queso del país(11), y al tratarse de un queso llamativo para los panelistas, influyó en la evaluación positiva de todos sus atributos. Cuadro 2: Percepción de los atributos por tipo de queso

Atributo Atributos visuales Otros atributos Percepción del precio

Queso fresco 3.95 3.53 3.29

Promedio* Queso de 21 días 4.01 3.48 3.41

Queso de 45 días 3.92 3.43 3.44

0.39 1.14 1.35

.6789 .3208 .2619

La escala de medición es de tipo ordinal, pero se utiliza el promedio para mostrar la tendencia de la medición del atributo.

En general, se observa que los atributos visuales fueron mejor evaluados, reflejando en primera instancia que se trata de consumidores que dan mayor importancia a las características que les son más fácilmente perceptibles; situación que puede ser reflejo del modelo global empleado para el abasto de alimentos, basado en el sistema de símbolos y señales, diseñado para cubrir el distanciamiento entre productor y consumidor(1,23). Por otro lado, la ausencia de diferencias entre muestras podría atribuirse a, que al tratarse de un queso no convencional y llamativo (sólo el 15.6 % lo conocía con antelación), sea congruente con la evaluación positiva de todos los atributos; pero al no tener experiencia como panelistas, no lograron detectar las diferencias sensoriales entre las muestras. Esto coincidió con otro estudio en el que evaluaron sensorialmente quesos de cabra con diferentes días de maduración, concluyendo que los consumidores que no estaban familiarizados con el consumo de quesos con olores y sabores intensos, no podían reconocer con facilidad las diferencias sensoriales entre muestras(24). Mediante la prueba de Kruskal Wallis se compararon los atributos por escenario de evaluación y tipo de queso, encontrándose diferencias estadísticas significativas para los atributos visuales en las tres muestras de queso, mientras que los otros atributos y la percepción del precio, sólo fueron diferentes en el queso de 45 días (Cuadro 3).

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Cuadro 3: Comparación de los atributos sensoriales por escenario de evaluación y tipo de queso Atributo Gourmet Show Queso fresco Atributos visuales Otros atributos Percepción del precio Queso de 21 días Atributos visuales Otros atributos Percepción del precio Queso de 45 días Atributos visuales Otros atributos Percepción del precio *

Promedio* Feria de la Cultura Rural

Muestra Gastronómica

3.86 (a) 3.48 3.13

3.68 (a) 3.56 3.15

4.27 (b) 3.55 3.56

8.98 0.09 2.37

.0105 .9547 .279

3.99 (ab) 3.63 3.58

3.72 (a) 3.32 2.96

4.28 (b) 3.48 3.63

6.77 1.07 5.03

.0315 .5824 .0652

4.04 (ab) 3.93 (b) 3.97 (b)

3.64 (a) 3.04 (a) 2.93 (a)

4.11 (b) 3.27 (a) 3.38 (ab)

6.07 11.25 10.15

.0457 .0035 .0046

La escala de medición es de tipo ordinal, pero se utiliza el promedio para mostrar la tendencia de la medición del atributo. ab Medias con letra en común no son diferentes (P>0.05).

Los asistentes de la FCR tuvieron las valoraciones más bajas en todos los quesos y, al igual que los de la MG, dieron mayor importancia a los atributos visuales de todos los quesos, mientras que los del GS valoraron mejor los otros atributos y el precio en el queso de 45 días. Es importante notar que los panelistas del GS mostraron una evaluación más consistente, al ir de menos a más en las valoraciones de los quesos a medida que avanzaban en la maduración (Cuadro 3). En los otros dos casos las tendencias no fueron tan claras, aunque se observa un comportamiento contrario, las valoraciones más positivas las dieron para el queso fresco y disminuyen a medida que va aumentando la maduración. Las diferencias encontradas en la percepción de atributos en el queso con diferentes días de maduración, pueden explicarse en función de las características de los panelistas y de la posibilidad que tienen para acceder regularmente a este tipo de productos. El grupo de la FCR fue el más diverso y con la escolaridad más baja, mientras que los de la MG, en su mayoría estudiantes pero más jóvenes; en ambos grupos se identificó el ingreso más bajo, comparados con los del GS (Cuadro 1); es comprensible que los participantes de los grupos con bajo ingreso, valoren mejor las características de los quesos más frescos, dado que son los más ofertados en el país y generalmente, son más baratos(25,26). Además, en la MG, pese que fueron estudiantes de carreras afines con la valorización de productos locales, pero al ser más jóvenes, no 111

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cuentan con la experiencia suficiente para distinguir y valorar un producto por sus condiciones intrínsecas, por lo que dieron mayor importancia a los atributos visuales. Por otra parte, el perfil de los asistentes del GS (al tener mayor escolaridad e ingreso), coincide con el tipo de consumidores que buscan alimentos diferenciados y de calidad. Son personas que aprecian el “buen comer” y buscan experiencias sensoriales que no ofrecen productos de elaboración masiva (que también pueden estar elaborados con materias primas de buena calidad), adquiriendo parte de su comida en mercados exclusivos de productos especiales o de manufactura artesanal. Probablemente, el mayor contacto de estos consumidores con productos diferenciados, les permite valorarlos más allá de la apariencia visual. Dado lo anterior, los resultados sugieren la existencia de dos tipos de consumidores, aquellos que motivan sus elecciones basados en atributos intrínsecos, asociadas al grado de conocimiento y experiencia sobre el producto o similares, coincidiendo con el perfil de los asistentes al GS; y también otros que consideran aspectos visuales, entre ellos la apariencia del producto, como una codificación previa para decidir la compra, propio de los resultados encontrados para la MG y la FCR(6,22). Respecto a la percepción del precio, se encontró diferencia estadística significativa en el queso de 45 días (Cuadro 3). Es comprensible que los asistentes del GS, mientras valoraron menor el precio del queso fresco, percibieron con agrado el precio para el queso de 45 días, al tener mayor riqueza sensorial, y que en el mercado se vende al mismo precio que el fresco. Si cuestan lo mismo, van a aceptar con mejor disposición el precio del queso con características sensoriales más intensas; ocurriendo todo lo contrario con los panelistas de la FCR y de la MG, que percibieron mejor el precio del queso fresco y de 21 días, respectivamente, en comparación con el de 45 días y que indica que al no estar acostumbrados al consumo de productos con aromas y sabores fuertes, consideran que su precio es alto, así cuesten lo mismo. Un componente importante de la evaluación era determinar si los resultados de la percepción de los atributos, coincidía con la elección de preferencia realizada por los panelistas.

Comparativo de la prueba de preferencia por escenario de evaluación

Los resultados de preferencia de los panelistas, sugieren la existencia de un consumidor particular para cada tipo de queso; adicionalmente, mediante la prueba de Ji cuadrada se encontraron diferencias estadísticas por escenario de evaluación (χ2=8.121; P=0.087), indicando algunas preferencias, especialmente en el GS y la FCR (Figura 1). En el GS la mayoría de panelistas prefirieron el queso de 45 días, mientras que en la FCR la mayor preferencia fue por el queso fresco. En la MG no hubo una preferencia marcada hacia algún tipo de queso.

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Figura 1: Preferencia general y por escenario de evaluación Fresco

21 días

45 días

52% 44% 34%

38%

36% 30%

28%

34% 28%

26%

13%

Preferencia general

FCR

GS= Gourmet Show; FCR= Feria Nacional de la Cultura Rural; MG= Muestra Gastronómica. La preferencia de los consumidores se puede explicar también considerando las características demográficas, accesibilidad y frecuencia de contacto con productos diferenciados, y por la misma influencia que pudieron tener los escenarios de evaluación sobre las experiencias individuales de los panelistas(2). En el Cuadro 4 se presentan las características del perfil de los consumidores en función del queso preferido, encontrándose que la preferencia por un tipo de queso particular, estuvo relacionada especialmente con la escolaridad y el ingreso.

Cuadro 4: Características del perfil del consumidor por tipo de queso preferido Variable/Tipo Queso Queso de Queso de de queso fresco 21 días 45 días Estadístico preferido Lugar de origen, % Χ2=3.866 Ciudad de 24 22.6 29.4 México Estado de 44 51.6 58.8 México Otros estados 32 25.8 11.8 Edad, años 31.12±10.9 27.97±12.3 33.62±13.1 F=1.723 Género, % Χ2=0.404 113

P .424

.185 .834

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Masculino Femenino Escolaridad, años Ocupación, % Profesionales Actividades independientes Empleados Estudiantes ingreso mensual*

48 52 14.67±3.7 (a)

45.2 54.8 14.71±3.2 (ab)

52.9 47.1 16.82±3.3 (b)

6.5

24.2

12.1

20 48 463±255 (a)

9.7 67.7 467±471 (a)

12.1 51.5 945±948 (b)

F=4.059

.021

Χ2=5.769

.451

F=4.617

.013

* Dólares. Tipo de cambio: 18.492. Fuente: Banco de México (http://www.banxico.org.mx/dyn/portal-mercadocambiario/index.html). Consultado el 18 de julio de 2016.

El análisis de varianza mostró diferencias estadísticas significativas en la preferencia por el queso de 45 días, indicando que las personas con mayor nivel académico e ingreso, prefirieron los quesos con mayor tiempo de maduración. Además, los resultados de preferencia por escenario de evaluación coincidieron con los de las pruebas de aceptación, permitiendo inferir la existencia de dos tipos de consumidores: en el primero, la aceptación y preferencia por quesos más frescos se dio en la población de menor ingreso, baja escolaridad y en el escenario en que la gastronomía hace parte de un evento asociado a la cultura en general (representado por los asistentes de la FCR); mientras que los del segundo, la aceptación y preferencia por quesos más maduros se dio en la población con ingreso más alto, mayor escolaridad y en escenarios cuya esencia es la actividad gastronómica, por tanto, más especializados (asistentes del GS, principalmente). Los panelistas de la MG, al tener una preferencia menos marcada hacia una muestra particular de queso, se distribuyeron entre estos dos tipos. Dado que las elecciones por determinados alimentos están influenciadas también por las experiencias propias del consumidor(22), la elección del primer grupo, afín al consumo de quesos frescos, coincide con aquellos consumidores que prefieren quesos más suaves porque son los que comúnmente encuentran en el mercado(24). Los consumidores de la FCR, por la naturaleza de la feria, probablemente comparten características similares al promedio de consumidores del país, a los cuales les resulta más fácil el consumo de quesos frescos, debido a su menor precio y mayor accesibilidad(26), mientras que el consumo de quesos maduros están reservados a algunas regiones del país donde son producidos, haciendo parte de sus tradiciones, y para el mercado gourmet de las grandes ciudades donde las ferias especializadas, juegan un papel clave. Asimismo, los escenarios de evaluación, como parte de un contexto social que produce expectativas y experiencias individuales, pudieron influir en los resultados encontrados, porque además contribuyen con la codificación previa, aportando información indirecta de la calidad 114

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esperada de los productos que allí se ofrecen(2,27). Esto permite explicar las razones por las que los consumidores asistentes al GS valoraron mejor los atributos intrínsecos y prefirieron el queso con mayor tiempo de maduración. Al asistir a este tipo de actividades donde la gastronomía diferenciada es la esencia del evento, esperan encontrar productos con gran riqueza sensorial; mientras que espacios como la FCR, al ser más generales y diversos (espacio en el que se ofrece eventos culturales, feria del libro, gastronomía y artesanías), la preferencia de los consumidores estuvo asociada al consumo frecuente de quesos frescos. Por su parte, en la MG, donde hubo similar aceptación por los tres tipos de queso, su elección pudiera relacionarse con la mayor afluencia de estudiantes relacionados con turismo, gastronomía y territorio, de ahí su grado de sensibilidad hacia los productos locales, pero sin el conocimiento necesario para percibir mejor las diferencias entre muestras. Los resultados aportados por la percepción de los atributos y preferencia de los quesos, reflejan aspectos importantes para ser analizados como áreas de oportunidad que permitan mejorar las estrategias de mercado del QBO, en función de sus días de maduración y considerando además, el territorio de producción, la plataforma de ferias agroalimentarias y eventos gastronómicos, como escenarios importantes para la valorización de productos locales en México(28). El queso de 45 días, al ser preferido por un público más exclusivo, permite dimensionar el potencial que tiene para cautivar este tipo de consumidores en el territorio donde el queso es producido, aprovechando el municipio de San Cristóbal de las Casas como destino turístico de proximidad con Ocosingo(28). Los otros dos grupos, más afines a valorar el queso por sus atributos visuales y más frescos, pero con menor ingreso, podrían reflejar la mayor parte de la población del país, a quien puede ofrecerse un queso, con menor tiempo de maduración, pero también más barato y que se constata en la disposición a pagar por el queso preferido.

Intención de compra y disposición a pagar un precio diferente por el queso preferido

Antes de suministrar información de los quesos a los panelistas, la percepción del precio fue uno de los atributos que recibió la más baja calificación (Cuadro 3). Algunos autores establecen que cuando se provee información relacionada con el producto, la imagen hacia el mismo cambia, reflejándose además, en la disposición a la compra y a pagar un valor preferencial(21,29). Esto se vio reflejado al preguntarle a los panelistas por la intención de comprar el queso preferido, después de que se les proporcionara información relativa a la forma de elaboración del queso. En los tres escenarios hubo respuestas positivas, el 93.5 % de los entrevistados del GS, 87 % de la MG y 74 % de la FCR comprarían el queso; sin embargo, los del GS estarían dispuestos a pagar más de lo que cuesta el queso, los de la MG mostraron una disposición a pagar más cercana al precio base y 115

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los de la FCR, pagarían menos por el queso. El análisis de resultados se hizo mediante la prueba de Kruskal Wallis (Cuadro 5), encontrándose diferencias estadísticas significativas al 10% en la disposición a pagar por los quesos fresco y de 21 días, y altamente significativa para el queso de 45 días. Cuadro 5: Comparación de la disposición a pagar por el queso preferido entre los escenarios de evaluación

Disposición a pagar Queso fresco Queso de 21 días Queso de 45 días *

Promedio (proporción sobre el precio base)* Gourmet Feria de la Muestra Show Cultura Rural Gastronómica 0.15 -0.05 -0.01 0.12 -0.08 0.00 0.18 (b) -0.15 (a) -0.04 (a)

4.77 4.76 11.91

.0840 .0833 .0022

La escala de medición es de tipo ordinal, pero se utiliza el promedio para mostrar la tendencia de la medición del atributo. a,b Medias con letra en común no son diferentes (P>0.05).

Al observar los resultados del Cuadro 5, se puede inferir que la disposición a pagar un sobreprecio, estuvo relacionada con el poder adquisitivo de los panelistas, también puede atribuirse al nivel educativo y con la posibilidad que tienen para acceder a productos con calidad diferenciada, dado que los del GS fueron los únicos dispuestos a pagar un valor adicional por cualquiera de los tres tipos de queso y que, mientras están dispuestos a pagar más por el queso de 45 días (18 % adicional, en promedio), en los otros dos escenarios, donde se registró el menor ingreso (Cuadro 1), manifestaron la disposición de pago, por el mismo queso, por debajo del precio base. Si bien el precio y el nivel de ingreso influyen en la decisión de compra, otros factores, intrínsecos del producto, podrían tener una mayor influencia sobre la decisión, pero esto implica que el consumidor tenga la posibilidad de conocer a fondo el producto. Diversos trabajos establecen que el sabor es el atributo más importante para determinar la calidad y la disposición a comprar un alimento local, pero sólo está disponible cuando se vive la experiencia sensorial, mientras que otros factores como precio, marca, presentación y el hecho de que sea artesanal o local, entran en juego cuando no se conoce nada más del producto(2,30,31). Después de que los panelistas eligieron el queso preferido y manifestaron intención de compra, se indagó por las principales motivaciones para comprarlo, y se encontró que el sabor fue el atributo más importante para 55.4 % de los panelistas, 20.7 % porque lo consideró único y artesanal, 24 % por factores como presentación, curiosidad y por ser un producto local, y sólo 6.5 % lo comprarían por el precio. Lo que sugiere que cuando los panelistas participaron en la evaluación sensorial, el sabor fue más importante que el precio, pero que la posibilidad de pagar un valor adicional estuvo condicionada por variables socioeconómicas y por las experiencias del individuo.

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Conclusiones e implicaciones El conocimiento de los gustos y preferencias del consumidor, proporcionado por estudios de este tipo, permitirá a los productores acceder a mercados especializados más rentables y que contribuyan al mantenimiento de las tradiciones, con el queso bola de más de 21 días de maduración y con cualidades organolépticas de mayor riqueza, valoradas en el mercado gourmet. Por otro lado, y al existir un consumidor que valoró cada tipo de queso evaluado, se parte de la premisa que, al ser un queso elaborado con leche cruda, cada tipo tiene que cumplir con la calidad microbiológica para garantizar que su ingesta no dañe la salud del consumidor. Los quesos con más de 21 días de acidificación de la cuajada tienen más posibilidades de ser inocuos al lograr un pH más bajo, a diferencia del queso fresco cuya calidad microbiológica se desconoce, representando un riesgo para los consumidores. Además, alguna patología relacionada con el consumo de queso fresco, con deficiente calidad microbiológica, afectaría también el prestigio de los otros dos tipos de queso, sensorialmente más ricos e inocuos. Por lo tanto, debido a la tendencia a comercializar proporcionalmente mayor cantidad de queso bola fresco, es importante que en futuras investigaciones se determine el tiempo mínimo de acidificación de la cuajada que garantice la inocuidad del queso.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4547 Revisión de literatura

Factores que afectan la composición microbiana ruminal y métodos para determinar el rendimiento de la proteína microbiana. Revisión

Ezequias Castillo-Lopeza* María G. Domínguez-Ordóñezb

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuautitlán, Estado de México. b

Departamento de Zootecnia, Universidad Autónoma Chapingo, Texcoco, Estado de México, México.

*Autor de correspondencia: ezequias@huskers.unl.edu

Resumen: La proteína microbiana sintetizada en el rumen es la fuente principal de proteína metabolizable, por lo que la correcta estimación de su flujo al intestino es esencial en la nutrición de los rumiantes. El objetivo de esta revisión es describir la composición microbiana, los principales factores que afectan su rendimiento y los métodos para medir la proteína microbiana y su contribución al aporte intestinal. Se incluye el uso de técnicas moleculares novedosas para dilucidar el microbioma y mejorar los métodos para medir la proteína microbiana. El microbioma ruminal está conformado por bacterias, protozoarios, hongos y arqueas. Los principales factores que afectan la síntesis de proteína microbiana son la disponibilidad de los carbohidratos, la proteína degradable, la grasa, y el pH ruminal. Los marcadores microbianos principales son las purinas, el ácido diaminopimélico y el isótopo de nitrógeno; además, se está probando el uso del ADN, mediante una PCR en tiempo real, para medir la proteína proveniente de bacterias, protozoarios y levaduras. La mayor dificultad en la estimación del flujo intestinal de proteína microbiana ha sido obtener pellets microbianos representativos del contenido ruminal, que son usados como referencia para establecer la relación marcador/nitrógeno. El análisis filogenético con secuenciación masiva de ADN ha revelado diferencias taxonómicas entre bacterias del fluido ruminal y la digesta

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intestinal. El fluido ruminal contiene menos Fibrobacteres y Proteobacterias, y contiene más Firmicutes que la digesta intestinal. Esto demuestra la necesidad de desarrollar métodos eficaces de colección de bacterias para obtener pellets microbianos representativos, y evitar sesgos en la estimación de la proteína microbiana y su contribución al aporte intestinal de proteína metabolizable. Palabras clave: Proteína microbiana, Proteína metabolizable, Marcador, Rumen, ADN.

Recibido: 04/07/2017 Aceptado: 06/03/2018

Introducción

La proteína metabolizable es la proteína verdadera que el intestino absorbe y que es proporcionada por la proteína microbiana, la proteína no degradable en el rumen y, en menor medida, la proteína (endógena) eliminada(1); la proteína microbiana normalmente representa la principal fuente de suministro de proteína metabolizable(2,3). Cuando esta proteína se absorbe, puede ser utilizada para el mantenimiento, el crecimiento, la reproducción o la lactación. Por lo tanto, es importante que los nutriólogos comprendan la naturaleza del flujo de proteína microbiana al intestino delgado, así como los factores que lo afectan y los métodos adecuados para calcularlo. Se han utilizado diversos métodos para estimar la síntesis de proteína microbiana, incluyendo el análisis de las purinas(4), el método del ácido diaminopimélico y la incorporación isotópica a las células microbianas(6). Los recientes avances en las técnicas moleculares han permitido estimar la proteína microbiana utilizando ADN microbiano a través de la PCR en tiempo real(3,7,8), que es particularmente importante cuando las raciones incluyen ingredientes que contienen ADN de levaduras de Saccharomyces cerevicieae, como los de la industria del etanol(9) o cuando los investigadores necesitan calcular el aporte de los protozoarios a la proteína microbiana total(7). La cuantificación de la proteína microbiana requiere de que se aíslen del rumen los pellets microbianos, que se utilizan como referencia para establecer la relación marcador microbiano:nitrógeno. Sin embargo, si los pellets de referencia aislados no son representativos de todo el contenido ruminal, su estimación estará sesgada(10). Las diferencias 121

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entre las bacterias asociadas a los sólidos y las bacterias asociadas al líquido se han dado por sentado desde hace mucho tiempo(11); sin embago, en buena medida las diferencias filogenéticas detalladas entre estas fracciones han permanecido desconocidas. El uso de tecnología de punta como la secuenciación masiva del ADN microbiano de alto rendimiento, en combinación con la bioinformática(12,13), ha proporcionado nuevos conocimientos de la microbioma ruminal y han revelado diferencias drásticas entre las bacterias asociadas al líquido y las asociadas a los sólidos(14). Los estudios han comparado el uso de marcadores microbianos convencionales(4,11,15) o factores que afectan el crecimiento microbiano. Además, informes recientes han evaluado las ecuaciones para predecir el flujo post-ruminal de proteína microbiana(16,17,18). Sin embargo, hasta donde saben los autores, no existen estudios que integren los avances recientes y los hallazgos derivados del uso de técnicas moleculares en la microbiología ruminal, ni que mejoren la comprensión de los factores que afectan la síntesis de proteína microbiana y su aportación a la proteína metabolizable, o de los procedimientos adecuados para cuantificarla. Por ello, el objetivo de esta reseña es describir la composición de la proteína microbiana que fluye al intestino, los principales factores que afectan su rendimiento y los métodos para estimarla. Además, se analiza el uso de la secuenciación de ADN de alto rendimiento para mejorar nuestra comprensión del microbioma, así como los factores que afectan la cuantificación de la proteína microbiana ruminal y su flujo al intestino delgado.

Los microorganismos ruminales y su importancia El ambiente anaeróbico reducido que existe en el rumen permite el desarrollo de distintos tipos de microbios compuestos principalmente de bacterias, protozoarios, hongos y arqueas(19,20).

Bacterias En 1944(20) se habían cultivado unas 200 especies de bacterias. Informes recientes que utilizan la secuenciación de ADN de alto rendimiento han revelado la presencia de 13 principales filos en el rumen, que incluyen 40 órdenes bacterianos, alrededor de 80 clases de bacterias, y por lo menos 180 familias bacterianas, unos 320 géneros de bacterias y más de 2,000 unidades taxonómicas bacterianas operativas(21,14). La densidad bacteriana en el rumen 122

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se encuentra en el rango de 107 a 1010 células/ml de líquido ruminal. Los filos bacterianos más abundantes son Bacteroidetes y Firmicutes, que incluyen por lo menos el 75 % de la población bacteriana total. El género de bacterias ruminales más abundante es Prevotella, que representa aproximadamente el 20 % de la comunidad bacteriana(14,22,23).

Protozoarios Se han identificado más de 20 especies de protozoarios(20), cuya concentración en el rumen es de aproximadamente 106 células/ml. Si bien el número de géneros de protozoarios es menor que el de los de las bacterias, los protozoarios son físicamente más grandes que las bacterias y pueden constituir aproximadamente la mitad de la biomasa microbiana ruminal total(19). El nitrógeno protozoario oscila entre 4.8 y 12.7 % en el rumen, y entre 5.9 y 11.9 % en el duodeno(3,7). Nuevos reportes que utilizan la secuenciación del ADN de alto rendimiento han demostrado que los géneros protozoarios predominantes son Entodinium, Epidinium, Metadinium, Diploplastron, Polyplastron y Diplodinium(24). Más del 90 % de la población de protozoarios en el rumen pertenece a la clase Litostomatea, que incluye dos grupos: Haptoria y Trichostomatia. La subclase Trichostomatia comprende al género Entodinium, uno de los más estudiados, que constituye entre el 89 y el 91 % de la población protozoaria(24).

Hongos Se han encontrado asociaciones de los hongos con las fracciones más lentamente digeridas de las plantas, y los hongos actúan como colonizadores iniciales de la lignocelulosa e incrementan la velocidad a la cual las bacterias digieren la fibra dietaria al alterar las paredes lignificadas de las células de las plantas(19). Son pequeños organismos flagelados. En un principio se los clasificó erróneamente como protozoarios flagelados; no obstante, después se observó que esos flagelados eran zoosporas fúngicas que llegaron a colonizar las superficies de las plantas para producir un micelio. El micelio da origen a esporangias que liberan más zoosporas, y el ciclo continúa. Los hongos incrementan su tiempo de residencia adhiriéndose a partículas de alimento. Por este motivo ha sido difícil calcular su biomasa en el contenido ruminal(20). Recientemente, la secuenciación del ADN ha revelado la presencia de 5 principales filos fúngicos, que incluyen 55 géneros de hongos. Los géneros predominantes son Ascomycota (27 %), Basidiomycota (3 %) y Neocallimastigomycota (1 %)(25).

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Arqueas La población de arquea incluye microorganismos que se creía eran bacterias. Sin embargo el análisis molecular de su ADN ha revelado que pertenecen a un dominio diferente(26). La densidad de las arqueas en el rumen no ha sido determinada con precisón. Estos microorganismos desempeñan un papel especial en la eficiencia alimenticia porque participan en la formación de metano, la cual utiliza dióxido de carbono e hidrógeno(27). Debido a que el metano emitido al medio ambiente contribuye al calentamiento global, uno de los principales objetivos de las prácticas para reducir los gases de efecto invernadero en el ámbito de la ganadería es disminuir la producción de este gas por los rumiantes(28). Los recientes hallazgos respecto a la secuenciación de ADN de alto rendimiento han revelado que el filo arqueal más abundante en el rumen es Euryarchaeota, que constituye el 99 % de la población de arqueas ruminales. Se han detectado diez géneros de arqueas en el rumen, y el género más abundante es Methanobrevibacter, que representa aproximadamente el 91 %(26). Desde hace mucho tiempo se ha reconocido la importancia de la proteína microbiana sobre el estado nutricional de los rumiantes por ser una de las principales fuentes de proteína metabolizable(19). Las bacterias ruminales y los protozoarios aportan la mayoría de la proteína metabolizable que llega al duodeno. La proteína microbiana sintetizada en el rumen satisface por lo menos el 50 % de los requerimientos de proteina metabolizable de los rumiantes en diversos estados de producción (1,29,30). Bajo la mayoría de las condiciones alimentarias, la proteína microbiana equivale a entre el 50 y el 85 % del nitrógeno total de aminoácidos que entra en el intestino delgado(5). Otros estudios sugieren que la proteína microbiana sintetizada en el rumen aporta entre le 40 y el 90 % de la proteína que llegua al intestino delgado, a pesar de que hasta un 50 % de la proteína microbiana sintetizada podría degradarse a nitrógeno de amoniaco en el rumen(30). Además, la aportación relativa de proteínas microbianas que llegan al intestino delgado depende principalmente de la calidad y solubilidad del nitrógeno ingerido. Esta aportación puede oscilar entre 1,262 y 2,137 g/d en la vaca lechera adulta, y entre 473 y 1,300 g/d en el ganado de carne; adicionalmente, se ha encontrado que la concentración de proteínas microbianas en la digesta duodenal del ganado ovino varía de 130 a 162 mg/g MS (Cuadro 1).

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Cuadro 1: Datos comparativos de la proteína microbiana que llega al intestino delgado medida con diversos métodos Fuente Glenn et al.(86) Ipharraguerre et al.(89) Cooper et al.(85) Sylvester et al.(83) Schwab et al.(90) Moorby et al.(88) Hristov et al.(84) Leupp et al.(87) Belanche et al.(8) Belanche et al.(8) Castillo-Lopez et al.(5) Castillo-Lopez et al.(5) Castillo-Lopez et al.(3) Castillo-Lopez et al.(3)

Marcador utilizado1 BP BP BP rADN NM Citosina NM BP BP rADN DAP rADN BP rADN

Tipo de animal Novillos Holstein Ganado lechero Ganado de carne Ganado lechero Ganado lechero Ganado lechero Ganado lechero Ganado de carne Ovejas Ovejas Ganado de carne Ganado de carne Ganado lechero Ganado lechero

Proteína microbiana que llega al duodeno 1,093 g/d 1,825 g/d 1,300 g/d 1,693 g/d 2,137 g/d 944 g/d 1,906 g/d 545 g/d 162 mg/g MS 130 mg/g MS 473 g/d 561 g/d 1,881 g/d 1,262 g/d

BP= Bases de purina; DAP= Ácido diaminopimélico; NM= Nitrógeno marcado (15N).

Además, los microbios ruminales son una importante fuente de otros nutrientes para los rumiantes(31). Los principales componentes químicos de los microorganismos ruminales son el nitrógeno, los carbohidratos, los lípidos y la ceniza(32) (Cuadro 2). El contenido de materia orgánica, nitrógeno y aminoácidos de las diversas bacterias mezcladas en el rumen se incrementa reduciendo la proporción de forraje en la dieta(19). Estas variaciones podrían deberse a la diferencia en la especie de bacterias resultantes de diferentes dietas (33). Recientemente la secuenciación del ADN de alto rendimiento ha confirmado esta hipótesis(21). Se ha observado un incremento de la materia orgánica y de las concentraciones de nitrógeno de la población protozoaria en respuesta a un aumento de la cantidad de almidones en la dieta(19), el cual puede obedecer a cambios en la comunidad protozoaria, recientemente confirmada utilizando métodos moleculares(34).

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Table 2: Composición de nutrientes de los microorganismos ruminales(30) aislados mediante la centrifugación Fracción centrífuga Contenido de nutrientes (g/kg MS) Humedad Nitrógeno Carbohidrato Lípido Ceniza

EEM3

62 100 91 92 116

50 103 93 94 98

2.3 1.6 7.1 6.7 4.0

Sobrenadante centrifugado a 19,000 ×g durante 8 min que se considera contiene la mayor parte de microorganismos. 2 Sobrenadante re-centrifugado a 19,500 ×g durante 15 min que se considera recoge prácticamente todo el resto de los microorganismos. 3 Error estándar de la media.

Factores que influyen en la síntesis de la proteína microbiana ruminal

El crecimiento microbiano ruminal depende de su capacidad de degrader y fermentar los ingredients del alimento. Las células bacterianas tienen diversos sistemas de transporte para absorber los nutrientes de bajo peso molecular y solubles como los azúcares(35). Debido a que los ingredientes del pienso están compuestos principalmente de polímeros complejos tales como almidón, proteína y celulosa, estos polímeros son primero degradados por enzimas extracelulares a sustancias de bajo peso molecular que son utilizadas luego por las bacterias. La cantidad de rendimiento bacteriano in vivo oscila entre 1.9 y 3.0 mg por cada 100 mg de materia orgánica verdaderamente digerida(36). Algunos de los principales factores que influyen en la síntesis de proteína mocrobiana ruminal incluyen la disponibilidad de carbohidrato alimentario, de proteína degradableen el rumen, de grasa alimentaria, del pH ruminal y de la ingesta de pienso(37). El modelo utilizado para predecir el flujo de proteína microbiana (g/d) al intestino delgado se relaciona con los nutrientes digeribles totales, MN= 0.0166TNDkg(38), o con la ingesta de MCP= 0.087TDN+42.73(18).

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Efectos de los carbohidratos del alimento

La utilización eficiente de los nutrientes alimenticios degradados requiere que la materia orgánica alimentaria se fermente a un ritmo que corresponda con las capacidades de síntesis de los microbios ruminales. Los carbohidratos fácilmente disponibles, como el almidón, son eficaces para incrementar la utilización de los nutrientes degradados y el crecimiento microbiano(39). Además, existe un incremento del crecimiento microbiano en los cultivos continuos (15.0 a 19.5 g de proteína microbiana/100 g MS digeridos) en respuesta a los crecientes niveles de carbohidratos no estructurales (32 a 49 % de MS)(39). Así, el tipo de carbohidratos alimenticios puede influir en el metabolismo bacteriano. El ganado de engorda alimentado con una dieta alta en carbohidratos está prácticamente libre de protozoarios. Sin embargo, otras investigaciones en las que se han utilizado dietas a base de trigo(40) y de maíz y sorgo(41) han mostrado altas concentraciones de protozoarios en el rumen con dietas altas en granos. Se considera que los cambios en la población bacteriana y de protozoarios debidos al drástico aumento de los almidones alimentarios(21) pueden deberse a la disminución del pH ruminal(38).

Efecto de la proteína degradable en el rumen

En general, los microorganismos del rumen no pueden satisfacer por sí solos los requerimientos de aminoácidos de los rumiantes de alta producción. Por ende, la inclusión de proteínas no degradables en el rumen puede incrementar el suministro total de aminoácidos al intestino delgado y modificar el perfil de aminoácidos del duodeno. No obstante, el hecho de alimentar al ganado con fuentes de proteína de baja degradación también puede limitar la fermentación microbiana, lo que da como resultado una disminución del suministro de energía y de aminoácido microbiano al animal huésped. La degradación ruminal de la proteína alimentaria es un proceso que depende del tiempo, y la tasa de la degradación en relación con la tasa de paso es una propiedad dinámica crucial que afecta a la cantidad de proteína que escapa del rumen sin haber sido degradada por éste(43). Una dieta con 5.3 % de proteína degradable en el rumen incrementa el flujo de nitrógeno bacteriano (415 g/d en contraste con 365 g/d cuando se proporciona una alimentación con 4.8 % de proteína degradable en el rumen)(42). Es probable que una mayor cantidad de nitrógeno disponible en el rumen mejore la eficiencia con la que se utiliza la energía, estimulando el 127

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crecimiento de la población bacteriana(43). Esto indica que si la energía obtenida de los carbohidratos para el crecimiento microbiano no es limitante, los péptidos y aminoácidos resultantes son utilizados de manera más eficiente para la síntesis de proteínas microbianas. Sin embargo, si los carbohidratos son limitantes, una fracción considerable de la proteína se descompone en amoniaco, que puede eliminarse parcialmente a través de la orina. Así, tendría que haber una coordinación entre la disponibilidad de energía y el nitrógeno en el rumen(15). Recientemente, se han utilizado ecuaciones para predecir la producción de proteína microbiana como una función lineal de la ingesta de proteína degradable ruminalmente en el ganado de leche(17). Además, el ganado de engorda requiere un mínimo de 100 g de nitrógeno soluble/kg de materia orgánica digerida en todo el tracto para maximizar el flujo del nitrógeno microbiano(44,45).

Efecto de la grasa de la dieta

Si bien desde hace varias décadas se han reconocido los efectos negativos de la grasa de la dieta, los nuevos avances en los métodos moleculares han revelado que los microorganismos ruminales que pertenecen a los géneros Fibrobacter, Ruminocuccus, Butyrivibrio y Prevotella pueden ser muy sensibles a la grasa(46,47). Es importante señalar que se ha demostrado que los ácidos grasos insaturados son tóxicos para las bacterias ruminales, especialmente para aquellas que digieren la fibra. Esta toxicidad podría deberse a un impedimento de la digestión de los nutrientes debido a que los ácidos grasos se adhieren a la pared celular(46). Así, no es de extrañar que una de las principales acciones de algunos géneros bacterianos ruminales sea la biohidrogenación de los ácidos grasos para minimizar los impactos negativos de los ácidos grasos insaturados en el crecimiento microbiano. También se han reportado efectos detrimentales de la grasa alimentaria en los protozoarios ruminales, hongos y arqueas cuando el alimento contiene aceite de linaza o de soya(46).

Efecto del pH ruminal

Se han reconocido los efectos del pH sobre el crecimiento de algunas bacterias ruminales(48). Ciertas especies, como Fibrobacter succinogenes y Ruminoccosus albus son muy sensibles al pH ruminal ácido(49). Esta sensibilidad puede explicarse por los efectos negativos del pH en la absorción de glucosa. Otras especies bacterianas como Prevotella ruminicola y Selenomonas ruminantium son bastante resistentes a la reducción del pH extracelular(50). El tipo de mecanismos de transporte utilizados por las bacterias influye en su sensibilidad al pH. 128

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Por ejemplo, el transporte de arabinosa y xilosa por Prevotella ruminicola es más sensible a las reducciones del pH extracelular que el transporte de glucosa(51). Un bajo pH extracelular también reduce el transporte de la arginina, el glutamato y la leucina en Streptococcus sp.(49). Gracias al desarrollo de la secuenciación de ADN de alto rendimiento se ha descrito el efecto del pH ruminal en todos los taxones de la población bacteriana. Por ejemplo, se ha demostrado que las bacterias que digieren la fibra son más sensibles al pH ruminal bajo que las bacterias que digieren el almidón(37,21). Además, los investigadores han encontrado que la acidosis ruminal leve o severa puede inducir cambios drásticos en la población bacteriana del rumen. Se ha reportado en el ganado la proliferación rápida de algunas bacterias tales como Streptoccocus bovis y Lactobacillus sp. en situaciones en las que el rumen contiene altas proporciones de carbohidratos de fermentación rápida y un pH ruminal bajo(52,53). Además, la reducción del pH ruminal debida a las dietas altas en granos afecta negativamente el crecimiento protozoario(54); por lo tanto, el modelo para predecir la proteína microbiana incluye la fibra detergente neutra como un factor de ajuste(29).

Efecto de la ingesta de alimento

La reducción de la ingesta de alimentos puede afectar la actividad bacteriana y disminuir la eficiencia microbiana debido a la insuficiencia en el nitrógeno soluble y la materia orgánica fermentable(45). No obstante, si la restricción en la ingesta de alimento no es severa, la eficiencia microbiana aumentará (gramos de nitrógeno microbiano/kilogramos de materia orgánica fermentada); pero el rendimiento microbiano (gramos de nitrógeno microbiano que llegan al duodeno) disminuirá como consecuencia de la reducción de la cantidad de materia orgánica fermentada en el rumen. Otros estudios han reportado una relación positiva entre el incremento de la ingesta de alimento y el rendimiento microbiano; esto se debe a que una mayor ingesta de alimento aumenta la tasa de paso que previene la depredación de protozoarios(44,53). Además incrementa la cantidad de nitrógeno bacteriano que llega al duodeno, debido a que la producción de nitrógeno bacteriano se correlaciona positivamente con la ingesta de materia orgánica digerible(53).

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Medición de la proteína microbiana y su aportación a la proteína metabolizable

La medición del flujo intestinal de la proteína microbiana requiere de que se aíslen los pellets microbianos ruminales, que se utilizan luego como referencia para establecer la relación entre el marcador microbiano y el nitrógeno. Posteriormente, se cuantifica el marcador en la digesta intestinal. Durante las últimas décadas se han utilizado diversos métodos para calcular la síntesis de proteína microbiana y la proporción que sale del rumen(4) (Cuadro 1). Uno de los retos fundamentales en este proceso es obtener un pellet microbiano de referencia que sea representativo tanto del fluido como de la fase sólida(10). El contenido de nitrógeno de las bacterias asociadas al líquido es del 8.5 % y el de las bacterias asociadas a partículas es de 7.0 %(19). En consecuencia, si sólo se utilizan las bacterias asociadas al líquido como referencia para establecer la razón entre el indicador y la proteína, se obtendrán como resultado valores por debajo de los reales. También es necesario medir el flujo de la digesta intestinal para calcular el flujo de proteína microbiana(53,54). Uno de los marcadores externos de la digesta más comúnmente utilizados es el óxido crómico (Cr2O3). Para este procedimiento se coloca el Cr2O3 en cápsulas de gelatina y se dosifica en el rumen(55,56) dos veces al día durante 10 días para alcanzar un flujo estable del marcador a través del tracto gastrointestinal(5,57,58). También se ha vuelto una práctica común incorporar Cr2O3 en la dieta en concentraciones de entre 0.25 y 0.40 % de la materia seca. Además, rutinariamente se utiliza la fibra detergente ácida no digerible como marcador interno de la digesta(59,60). Con este enfoque, se determina la concentración de fibra detergente ácida no digerible en las muestras después de una incubación in situ de 288 horas en el rumen. Luego se calcula el flujo de la digesta intestinal con base en la cantidad del marcador suministrado como alimento (fibra detergente ácida no digerible) o dosificado (Cr2O3) y la concentración del marcador respectivo en las muestras duodenales(61). A partir de estos valores, se estima el flujo de proteína microbiana y, por ende, su aportación a la proteína metabolizable total. Otras técnicas para medir el flujo de la digesta incluyen etiquetar las fases particulada y líquida de la digesta con YbCl3 y Cr-EDTA, respectivamente(6). Esta reseña se enfocará en los marcadores microbianos convencionales ampliamente utilizados para calcular la proteína microbiana, como las purinas totales(4), el ácido diaminopimélico(5) y el nitrógeno marcado. Además, se analizará el uso del ADN por medio de una PCR en tiempo real para medir la proteína que tiene su origen en las bacterias, los protozoarios y las levaduras. El marcador microbiano ideal no debe estar presente en el alimento ni ser absorbido; debe ser biológicamente estable, estar presente en un procentaje similar entre los diversos tipos de microbios y ser un porcentaje constante de la célula

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microbiana en todas las etapas de su crecimiento, y todas sus formas deben fluir a un ritmo similar(62).

El uso de las purinas totales como marcador microbiano

Las bases de purina (adenina y guanina) son parte de los ácidos nucleicos de las células microbianas(63). En pocas palabras, este procedimiento combina los métodos estándar para hidrolizar los nucleótidos con ácido perclórico. El primer paso va seguido de la precipitación de las purinas libres con el nitrato de plata para separar las purinas de los compuestos que interfieren. En este método, las purinas ácidas resolubilizadas se cuantifican con un espectrómetro a 260 nm. Después se estima la proteína microbiana con base en la relación entre las purinas y el nitrógeno de los pellets bacterianos de referencia(64) y la concentración de las purinas en las muestras. Se considera que el uso de las purinas tiene algunos retos inherentes. Por ejemplo, las purinas del alimento, que escapan a la destrucción en el rumen debido a que pueden causar una sobreestimación de la proteína microbiana(63). Las células epiteliales intestinales desprendidas también pueden aportar purinas a la digesta, y por lo tanto provocar una sobreestimación. Además, se ha reportado una mayor concentración de purinas en el duodeno de las ovejas que en el abomaso, atribuyéndola a las células desprendidas y a la secreción de bilis(8). El factor de corrección 0.195 × BW^0.75 se ha utilizado para mitigar esta sobreestimación(65). Al parecer, otros retos importantes que se enfrentan cuando se utilizan las purinas totales como marcador microbiano tienen que ver con si las purinas están presentes en un porcentaje similar en las distintas especies y en todas las etapas de crecimiento microbiano. Se ha reportado que los valores para las purinas en las bacterias mezcladas en el rumen varían mucho. Por ejemplo, en un estudio se encontró una concentración media de purinas del 7.28 %, con valores que oscilan entre 2.40 y 13.02 %(53). Se han reportado variaciones en las concentraciones de purinas de las bacterias ruminales mixtas en cultivo continuo utilizando diversas fuentes de proteína(66). Esta variación también se ha reportado entre los cultivos puros. Las concentraciones, expresadas como un porcentaje de la MS, oscilan entre 0.69 y 5.57 %, con un valor medio de 2.98 %. Esta situación indica que, si se utilizara la relación entre las purinas y el nitrógeno para calcular la proteína microbiana a nivel duodenal, se obtendrían valores por encima de los reales. Entre los factores biológicos que pueden ser responsables de estas variaciones se encuentran la diferencia en la composición química entre las bacterias asociadas al líquido y la de las bacterias asociadas a las partículas, así como la etapa de crecimiento bacteriano(19). Por lo tanto, el procedimiento de aislamiento bacteriano tendría que recolectar un pellet bacteriano 131

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que sea representativo no sólo de diferentes sitios del rumen, sino también de las bacterias asociadas al líquido y a partículas(67).

El uso del ácido diaminopimélico como marcador microbiano

Este método se basa en la estimación de la relación entre el ácido diaminopimélico y el nitrógeno en las bacterias ruminales y la cantidad de un marcador microbiano en la digesta(5). La cantidad de nitrógeno bacteriano en la ingesta intestinal se calcula con base en estos valores(68). En pocas palabras, las muestras liofilizadas se hidrolizan con ácido metasulfónico y después se centrifugan. Entonces, la muestra derivatizada se inyecta en la columna y se somete una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Durante el proceso de oxidación, la metionina se convierte en metionina sulfona. En el último paso del proceso se lleva a cabo la separación cromatográfica de las columnas de intercambio iónico. El ácido diaminopoimélico se encuentra en la membrana celular de las bacterias ruminales y está ausente de los alimentos que comúnmente se proporcionan como alimento a los rumiantes(68). La precisión de la técnica depende de que se mantenga una relación constante entre el ácido diaminopimélico y el nitrógeno de las diversas especies de microbios, o entre especies microbianas en el rumen. Sin embargo, este último supuesto no es consistente con la naturaleza secuencial de la fermentación del rumen. Además, la relación entre el ácido diaminopimélico y el nitrógeno puede variar entre las especies bacterianas ruminales(39). Las diversas bacterias tienen distintas concentraciones de peptidoglicano en la pared celular y, por lo tanto, diferentes concentraciones de ácido diaminopimélico. Por ejemplo, las bacterias gram-positivas contienen entre 30 y 70 % de peptidoglicano en la pared celular; las bacterias gram-negativas contienen sólo un 10 %. Además, si se alimenta al ganado exclusivamente con dietas a base de forraje, las bacterias gram-negativas serán predominantes en el rumen, y si el ganado consume más concentrado, la proporción de bacterias gram-positivas aumentará(69,70). Por ello, las variaciones en la abundancia relativa de bacterias grampositivas y gram-negativas puede afectar la estimación de la síntesis del nitrógeno bacteriano. Por ejemplo, si las bacterias gram-positivas predominan en el rumen, esta relación será mayor, y esto dará lugar a una subestimación de la síntesis de proteína bacteriana si los pellets de referencia no son representativos de la digesta entera.

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El uso del nitrógeno marcado como marcador microbiano

La síntesis de la proteína microbiana también ha sido calculada cuantificando la incorporación del 15N de (l5NH4)2SO4 a los microbios(15,6). El 15N se introduce de manera constante en el rumen a través de una cánula ruminal, a razón de aproximadamente 1 L por día. Este método se basa en la incorporación de nitrógeno amoniacal marcado y no toma en cuenta la proteína microbiana sintetizada directamente a partir de los aminoácidos o péptidos. La técnica de utilizar el nitrógeno como marcador es no sólo costosa sino también bastante compleja, y por ende no ha sido ampliamente utilizada. Una de las ventajas de este enfoque, comparado con el análisis de las purinas, es el hecho de que la proteína marcada con 15N que sale del rumen sólo será de origen microbiano, mientras que una porción de las purinas que salen del rumen puede ser de origen alimentario(71). Sin embargo, se ha demostrado que la relacion marcador/nitrógeno difiere entre las bacterias asociadas con la fases líquida y las asociadas con la fase particulada(30). Así, resulta todo un reto establecer esta razón a partir de un pellet bacteriano representativo.

El uso del ADN como marcador microbiano La PCR en tiempo real es una herramienta potente que se utiliza para el análisis cuantitativo del ácido nucléico. Recientemente se ha probado el ADN como marcador microbiano empleando este método. La PCR en tiempo real es un refinamiento de la PCR desarrollado a mediados de los 1980(72,73), que permite la detección rápida del ADN microbiano, indicando así la presencia de un microorganismo o grupo de microorganismos. En comparación con un método convencional de PCR que emplea dos cebadores —uno directo y uno inverso—, en los ensayos de PCR en tiempo real se requiere de una sonda fluorescente adicional. Por ello, este método es altamente sensible y específico, dado que se utilizan tres oligonucleótidos complementarios al marcador de ADN(74). Una ventaja de este enfoque es que permite cuantificar la proteína microbiana que se origina en las bacterias, protozoarios y levaduras, lo cual no se podría lograr utilizando los marcadores microbianos convencionales. Por lo tanto, el método se basa en la cuantificación de un segmento de ADN específico de estos dominios microbianos(74). Uno de los primeros estudios que utilizaron ADN mediante una PCR en tiempo real para estimar la proteína microbiana se realizó en el año 2005(75), empleando el gen protozoario 18S como marcador microbiano. Este ensayo se utilizó para cuantificar la cantidad de biomasa protozoaria en el líquido ruminal y la digesta del intestino delgado. Estos autores también reportaron que el someter la digesta duodenal a dos ciclos de congelación y 133

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descongelación reducía la recuperación casi a la mitad, pero el uso de una sola congelación (una práctica estándar) parecía incrementar la recuperación del ADN microbiano. El ensayo incluye procedimientos para aislar las células protozoarias del rumen a fin de utilizarlas como una norma para convertir las copias del gen 18S a una base de biomasa. Se ha determinado que el nitrógeno protozoario constituye el 12.7 % de la reserva de nitrógeno microbiano ruminal total, y 11.9 % del initrógeno microbiano duodenal en las dietas altas en forraje(75). Los investigadores también han reportado el uso de ADN microbiano como un marcador para estimar la proteína bacteriana midiendo el gen 16S(5,8), o la proteína de levaduras midiendo parte del segundo cromosoma de Saccharomyces cerevisiae(9). Una de las ventajas de utilizar ADN como marcador microbiano consiste en que es altamente específico para un amplicón que forma parte de las bacterias, los protozoarios o las levaduras y excluye cualquier material externo originado de alimento no degradado, lo cual evita la contaminación(8,64). La cuantificación de la proteína de las levaduras de la proteína microbiana es particularmente importante cuando las raciones de alimento de los rumiantes incluyen ingredientes que contienen células de levaduras de Saccharomyces cerevisiae, como las de la industria del etanol(76). Si la contribución de la proteína alimentaria de levaduras no se cuantifica por separado, entonces se sobreestimará la proteína microbiana que se origina de las bacterias y los protozoarios. Entre los principales componentes del ensayo de PCR en tiempo real se incluyen 1) un cebador directo, que es un oligonucleótido de entre 20 y 24 pares base y cuyo extremo 5’ se tiempla hasta el extremo 3’ del marcador de ADN(73); 2) También se requiere un cebador inverso, oligonucleótido cuya longitud debería ser de entre 20 y 24 pares y cuyo extremo 5’ debería ser compatible con el extremo 3’ del marcador de ADN microbiano(73); 3) Asimismo se requiere una Sonda dual marcada. La reacción de la PCR en tiempo real se lleva a cabo mediante ciclos de temperatura. Se aplica una alta temperatura (95 ºC) para separar las cadenas del ADN de doble hélice; después, la temperatura se baja a 60 ºC para permitir que los cebadores se tiemplen hasta el marcador de DNA, y por último, la temperatura se sube a 72 ºC, que es la óptima para la polimerasa que extiende los cebadores(74). No obstante, reportes recientes indican que algunas especies de bacterias y protozoarios pueden presentar diversos números de copias de los marcadores de ADN utilizados. Por ejemplo, los filos Firmicutes y Gammaproteobacteria pueden contener cinco veces más copias del gen 16S que el resto de los filos bacterianos(77), lo cual podría introducir un sesgo en el método si los pellets bacterianos utilizados como referencia no son representativos de las muestras que se están analizando. Además, se ha sugerido que los valores más bajos estimados de proteína microbian podrían deberse a la recuperación incompleta de copias de ADN de las muestras(8) o a que los cebadores universales utilizados no se ligan al 100 % de los genes microbianos 16S y 18S, cuando se cuantifica la proteína bacteriana o protozoaria, respectivamente.

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La secuenciación del ADN mejora el conocimiento sobre los factores que afectan la medición del flujo de la proteína microbiana El uso de la secuenciación del ADN de alto rendimiento Los avances recientes en las técnicas moleculares aplicadas a la secuenciación de ADN de alto rendimiento del ADN microbiano en combinación con el análisis bioinformático de la población microbiana que habita en el rumen han hecho aportaciones importantes a nuestro conocimiento del microbioma ruminal(12). Esta técnica ha sido aplicada a una variedad de temas de investigación relacionados con la nutrición de los rumiantes. Por ejemplo, se han logrado nuevos conocimientos de los cambios en la población bacteriana de los rumiantes debido a un cambio en la composición de la dieta(21), a un cambio en el pH ruminal(37), a las bacterias biohidrogenizadoras(14,78), al papel de las bacterias en la composición de la grasa de la leche(79) y a las arqueas que intervienen en la formación del metano(22,80). Además, la secuenciación del ADN puede mejorar nuestra comprensión de los factores que afectan el cálculo de la proteína microbiana y su flujo al intestino delgado. Específicamente, se han revelado diferencias filogenéticas detalladas entre los pellets bacterianos que se utilizan como referencia y la población bacteriana de la digesta intestinal.

Diferencias taxonómicas entre las bacterias del líquido ruminal y de la digesta intestinal Uno de los principales retos para la estimación de la síntesis de proteína microbiana y de su flujo al intestino delgado consiste en obtener un pellet bacteriano de referencia que sea representativo de la población microbiana de los contenidos ruminales. Si bien por mucho tiempo se han supuesto diferencias entre las bacterias del líquido ruminal y las de la digesta total que fluye (10), apenas en los últimos años el uso de la secuenciación de ADN de alto rendimiento ha permitido a los investigadores examinar el perfil taxonómico completo de los pellets de referencia y de la digesta intestinal (14). Estos hallazgos han revelado que el perfil taxonómico de los pellets bacterianos aislados del líquido ruminal difiere drásticamente del de las bacterias de la digesta intestinal cuando se analiza los niveles taxonómicos de filo, orden, familia y género (Cuadros 3 y 4). Por ejemplo, se han encontrado mayores proporciones de los filos bacterianos predominantes Firmicutes, TM7 y Tenericutes en los pellets bacterianos de referencia que en la digesta intestinal. Además, en los pellets de referencia se encontraron grandes proporciones de los órdenes bacterianos Bacteroidales y 135

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Clostridiales, así como niveles superiores de la familia bacteriana Lachnospiraceae. Por otra parte, los pellets bacterianos de referencia contenían proporciones más bajas de los filos Fibrobacteres, Spyrochaetes, Proteobacteria y Lentisphare, así como de la familia Ruminoccocaceae y del género Butyrivibrio. Estos hallazgos apoyan la idea de que el uso exclusivo de bacterias asociadas al como pellets de referencia daría lugar a un sesgo en la estimación de la síntesis de proteína microbiana, y de que es necesario desarrollar procedimientos de desprendimiento eficaces para obtener pellets bacterianos más representativos de los contenidos ruminales enteros a fin de calcular con exactitud la aportación de proteína microbiana a la proteína metabolizable total. Según estos hallazgos, el desprendimiento de las bacterias fibrolíticas de la fracción sólida de los contenidos ruminales es particularmente importante para obtener pellets microbianos de referencia que sean representativos.

Cuadro 3: Filos y órdenes bacterianos predominantes encontrados en pellets bacterianos de referencia aislados del líquido ruminal y en la digesta intestinal de novillos de carne (%)

Taxones bacterianos Filo, % del total Firmicutes Bacteroidetes Fibrobacteres Chloroflexi TM7 Tenericutes Spyrochaetes Proteobacteria SR1 Planctomyces Lentisphaera Synergistetes Verrucomicrobia WPS2 Otros Orden, % del total Bacteroidales Clostridiales Coriobacteriales Anaerolineales TM7 Campylobacterales Pirellulales

Origen de las bacterias Pellets de referencia Digesta intestinal del líquido ruminal1

EEM2

Valor de P

45.95 44.22 0.1 1.69 1.60 1.45 0.92 0.63 0.33 0.26 0.13 0.11 0.12 0.10 2.49

31.32 42.02 10.1 2.00 0.29 1.00 1.78 3.81 0.22 0.11 2.02 0.14 0.52 0.30 14.46

2.675 2.497 0.06 0.303 0.227 0.199 0.138 0.241 0.150 0.042 0.128 0.031 0.056 0.051 0.122

< 0.001 0.53 < 0.01 0.41 < 0.001 0.027 < 0.001 < 0.001 0.58 0.014 < 0.001 0.552 < 0.001 < 0.001 0.001

44.22 34.99 5.32 1.69 1.60 0.32 0.26

41.90 28.31 1.41 2.00 0.30 0.42 0.11

2.498 1.748 0.881 0.303 0.227 0.039 0.042

0.51 0.004 < 0.001 0.41 < 0.001 0.067 0.014

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Erysipelotrichaeles Victivallales Sipochaetales Sphaerochaetales Rhizobiales Desulfovibrionales YS2 Rickettsiales Otros 1

0.17 0.12 0.12 0.09 0.04 0.04 0.03 0.02 10.97

0.07 1.78 0.16 1.79 0.01 0.04 0.57 0.29 20.84

0.020 0.125 0.021 0.235 0.010 0.018 0.051 0.046 ---

< 0.001 < 0.001 0.17 < 0.001 0.084 0.97 < 0.001 < 0.001 ---

Bacterias aisladas mediante centrifugación diferencial. Adaptado de Castillo-Lopez et al.(14). 2 El mayor error estándar de las medias

Cuadro 4: Familias y géneros bacterianos predominantes encontrados en los pellets bacteriales de referencia aislados del líquido ruminal y en la digesta intestinal de novillos de carne (%) Taxones bacterianos Familia, % del total Sin clasificar bacteroidales Lachnospiraceae Rominococcaceae Prevotellaceae Sin clasificar clostridiales Paraprevotellaceae F16 Clostridiaceae Anaerolinaceae Coriobacteriaceae Anaeroplasmataceae Veillonellaceae Spirochaetaceae Catabacteriaceae BS11 Género, % del total Bacteroidales sin clasificar Lachnospiraceae sin clasificar Prevotella sin clasificar Ruminococcaceae sin clasificar Clostridia

Origen de las bacterias Pellets de referencia Digesta del líquido ruminal1 intestinal

EEM2

Valor de P

27.93

17.80

2.442

0.006

17.38 11.48 10.99

9.27 13.66 12.12

0.979 0.895 1.225

< 0.001 0.061 0.52

7.70

2.47

0.857

< 0.001

3.78 2.80 2.11 1.68 1.30 0.98 0.88 0.78 0.72 0.68

4.27 0.47 1.39 2.00 0.05 0.80 1.44 1.48 1.24 0.18

0.857 0.884 0.202 0.303 0.261 0.185 0.191 0.130 0.147 0.293

0.671 0.055 < 0.001 0.418 < 0.001 0.351 0.047 < 0.01 0.011 0.01

27.94

17.81

2.442

0.006

11.73

6.39

0.582

< 0.001

10.94

12.02

1.127

0.53

8.51

9.71

0.770

0.15

7.71

2.47

0.857

< 0.001

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sin clasificar Coriobacteriales sin clasificar Paraprevotellaceae sin clasificar Ruminococcus Butyrivibrio SHD231 Clostridum Coriobacteriaceae sin clasificar Coprococcus Succiniclasticum Shuttleworthia Catabacteriaceae sin clasificar BS11 Pseudobutyrivibrio

4.02

1.36

0.659

< 0.001

3.79

4.27

0.857

0.67

2.84 2.59 1.69 1.48

3.51 0.88 2.00 0.66

0.326 0.203 0.303 0.120

0.162 < 0.001 0.41 < 0.001

1.10

0.05

0.213

< 0.001

0.97 0.81 0.76

0.23 1.41 0.10

0.225 0.189 0.150

0.011 0.032 < 0.001

0.73

1.25

0.147

0.011

0.68 0.64

1.83 0.73

0.293 0.103

0.01 0.553

Bacterias aisladas mediante centrifugación diferencial. Adaptado de Castillo-Lopez et al.(14). 2 La mayor norma de la media.

Implicaciones de las diferencias taxonómicas entre las bacterias del líquido ruminal y las de la digesta intestinal sobre los marcadores microbianos

Los resultados obtenidos del uso de la secuenciación de ADN de alto rendimiento dilucidan los factores potenciales que pudieran sesgar la estimación del flujo de proteína microbiana al aislar el pellet representativo exclusivamente de la fase líquida de los contenidos ruminales. Por ejemplo, algunos estudios han sugerido que las bacterias asociadas a partículas contienen proporciones menores de purinas que las bacterias asociadas al líquido(81). Los datos sobre el contenido de purina entre los diversos taxones bacterianos son limitados, y dado que existe una gran proporción de bacterias asociadas a partículas que quedan excluidas del pellet de referencia aislado durante la centrifugación diferencial, es probable que la divergencia entre el perfil taxonómico del aislado y el de la digesta intestinal represente una fuente de subestimación del suministro intestinal de proteína microbiana. Esto puede explicar en parte los valores estimados inferiores que se observaron en comparación con los valores predichos(3). La concentración de peptidoglicano varía, además, entre las bacterias, de modo que tienen concentraciones distintas de ácido diaminopimélico. Las bacterias gram-positivas contienen más peptidoglicano en la pared celular que las bacterias gram-negativas. Debido a que, cuando se utiliza el ácido diaminopimélico como marcador microbiano, los pellets de 138

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referencia aislados del líquido ruminal contienen una proporción mayor de Firmicutes (filo), Clostridiales y Coriobacteriales (órdenes) y Lachnospiraceae (familia) —representados en gran medida por bacterias gram-positivas— que las bacterias de la digesta intestinal, los investigadores tendrían que tener en cuenta la posibilidad de subestimar el flujo intestinal de proteína microbiana. La información limitada sobre la manera en que la concentración de nitrógeno marcado varía entre las bacterias ruminales es escasa. Sin embargo, los reportes indican que la razón marcador/nitrógeno difiere entre las bacterias asociadas al líquido y las asociadas a partículas, y que el enriquecimiento de 15N es mayor en las bacterias asociadas al líquido que en las bacterias asociadas a partículas(82). Por lo tanto, los resultados relativos a las diferencias entre el perfil taxonómico de las bacterias del líquido ruminal y el de las bacterias de la digesta intestinal sugieren que, cuando los pellets microbianos de referencia se obtienen únicamente del líquido ruminal, el flujo intestinal de proteína microbiana puede ser subestimado. Por último, dadas las variaciones en el número de copias del gen 16S entre las bacterias ruminales, y en particular en los números mayores de copias en las Firmicutes, y debido a que las proporciones de Firmicutes son mayores en las bacterias aisladas del líquido ruminal, cuando se utiliza el ADN como marcador microbiano se pueden obtener valores de proteína bacteriana inferiores a los reales si los pellets bacterianos de referencia no son representativos de la digesta que fluye al intestino delgado.

Conclusiones

El microbioma ruminal desempeña un papel esencial en la nutrición de los rumiantes; los organismos que aportan la mayor cantidad de proteína microbiana son las bacteias y los protozoarios. Los principales factores relacionados con los animales y su alimentación que influyen en la síntesis de proteína microbiana en el rumen son la disponibilidad de carbohidratos, la proteína degradable en el rumen, la grasa alimentaria, la ingesta de alimento y el pH ruminal. Todos los marcadores microbianos presentan ventajas y desventajas; los marcadores microbianos convencionales que suelen utilizarse para estimar la síntesis de proteína microbiana incluyen las purinas totales, el ácido diaminopimélico y el nitrógeno marcado. Recientemente, el uso de ADN como marcador microbiano en PCR en tiempo real representa un método alternativo. Sin embargo, los investigadores deben estar conscientes de la posibilidad de sesgo cuando utilicen cualquiera de estos métodos. Una de las principales dificultades para la estimación del flujo de proteína microbiana consiste en obtener del rumen un pellet microbiano representativo a fin de establecer la razón marcador microbiano/nitrógeno. Se han visto diferencias entre las bacterias asociadas a 139

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partículas y las bacterias asociadas al líquido. Sin embargo, hasta donde tienen conocimiento los autores, no se han realizado estudios que comparen la composición taxonómica de la comunidad de bacterias asociadas al líquido con la de las bacterias que se encuentran en los contenidos intestinales y analicen sus implicaciones para los marcadores microbianos, así como sus efectos potenciales en la estimación del flujo de proteína microbiana al intestino delgado. Los avances recientes en la secuenciación de ADN de alto rendimiento en combinación con la bionformática han revelado una considerable divergencia filogenética respecto a muchos taxones bacterianos a nivel de filo, familia y género entre los pellets microbianos de referencia aislados exclusivamente del líquido ruminal y las bacterias halladas en los contenidos intestinales enteros. Estos hallazgos indican que se requiere mayor investigación a fin de desarrollar métodos para desprender las bacterias de las partículas de alimento de modo que se obtengan pellets microbianos de referencia que sean representativos de los contenidos ruminales enteros; ello hará posible prevenir sesgos al cuantificar la aportación de la proteína microbiana al suministro de proteína metabolizable en los rumiantes.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4487 Nota de investigación

Dinámica de infección por Cystoisospora suis (Isospora suis) en una granja piloto ubicada en el estado Carabobo, Venezuela

Juan Carlos Pinilla Leóna* Natalia Da Silva Borgesb

Universidad de Santander, Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias, Programa de Medicina Veterinaria, Campus de Bucaramanga, Lagos de Cacique, Bucaramanga, Santander, Colombia. b

Universidad Rómulo Gallegos, Facultad de Agronomía, Departamento de Producción Animal, San Juan de Los Morros, Venezuela.

* Autor para correspondencia: j.pinilla@mail.udes.edu.co, jcpinilla@hotmail.com

Resumen: La investigación se realizó en Venezuela desde septiembre de 2015 hasta agosto de 2016 con la finalidad de determinar la dinámica de la infección por Cystoisospora suis en una granja piloto. Para la determinación parasitaria se colectaron 480 muestras fecales de camadas, distribuidas en cuatro grupos de edades: grupo 1 (1-7 días de edad, 20 %), grupo 2 (8–14 días, 47 %), grupo 3 (15-21 días, 23 %) y grupo 4 (22-28 días, 10 %). Todas las muestras se cultivaron en dicromato de potasio al 2.5% y posteriormente se procesaron con una técnica de centrifugación-flotación. Los resultados señalan que C. suis se encontró presente durante todo el período de estudio con 52.08 % de prevalencia, y presentando mayor frecuencia en lechones con dos semanas de vida. Posiblemente, las condiciones de manejo y salubridad de la granja favorecen los mecanismos de sobrevivencia y proliferación del parásito. Con respecto al mes de muestreo, no se encontró significancia (P>0.05) entre las constantes meteorológicas y la prevalencia por C. suis, lo que podría indicar que el ambiente no tuvo ningún efecto sobre la presencia del protozoario. Los datos recolectados en la encuesta

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epidemiológica se analizaron mediante una prueba de correlación de Spearman, y se determinó asociación significativa (P<0.05) entre la prevalencia y la asistencia veterinaria, protocolo de desinfección 3 y empleo de Baycox al 5%. Se concluye que las condiciones meteorológicas registradas son óptimas para que ocurra el proceso de esporulación, y por tanto, para mantener viables ooquistes de C. suis durante todo el año. Palabras clave: Granjas, Porcinos, Protozoario, Venezuela.

Recibido: 10/05/2017 Aceptado: 01/02/2018

Cystoisospora suis es un protozoario que pertenece al reino Chromista, Infraphylum Apicomplexa, Subclase Coccidea, Orden Eimerida(1,2), y es considerado uno de los entero coccidios más importantes que afectan al cerdo, y agente causal de la cystoisosporosis neonatal porcina(3,4). Los animales con C. suis desarrollan una diarrea de color amarillenta a partir de la segunda semana de edad, que inicialmente es pastosa para hacerse fluida a los 2 a 3 días(3,4). Con respecto a la prevalencia, en granjas porcinas de Alemania se determinó 62.2 y 53.8 % de prevalencia en granjas y camadas, respectivamente(5,6), así como 42.5 % de prevalencia en lechones criados en granjas intensivas(7). Así mismo, en Polonia se demostró 27.8 % de prevalencia en camadas y 66.7 % en granjas(8), mientras que en República Checa se determinó 21.8 % en camadas(9). En Venezuela, se determinó que la prevalencia de C. suis en lechones y cerdos de 0 a 13 semanas de edad fue 21.8 y 26 %, respectivamente(10), mientras que se encontró 75 % de prevalencia en granjas ubicadas en el estado Carabobo(11). Con respecto a la edad, se ha determinado mayor prevalencia en camadas con dos semanas de vida(12), mientras que otros autores señalan mayor prevalencia en camadas de tres y cuatro semanas de edad(13). Referente a la época del año, algunos autores(5,14) no señalaron efecto estadísticamente significativo sobre la presencia de C. suis en lechones; sin embargo, Meyer et al(6) demostraron en granjas de Alemania mayor incidencia de diarrea por C. suis en verano y otoño (66.3 y 61 %, respectivamente). Existe un impacto estacional sobre la incidencia de C. suis, ya que la esporulación se favorece en ambientes calientes (32 a 35 °C) que son las condiciones normales de las unidades paritorias(13). En Venezuela, se encontraron diferencias significativas entre la presencia del parásito con respecto al mes de muestreo (15). Probablemente, los meses de mayor temperatura y humedad favorecen la supervivencia del parásito en las parideras. Con respecto al control sanitario, la higiene y limpieza de las unidades paritorias podría minimizar la propagación del parásito dentro de la camada y por lo tanto disminuir el desarrollo de diarreas(16), y probablemente la asociación entre algunos factores higiénicos y sanitarios pueden minimizar la presencia de C. suis en la granjas(17). El municipio Carlos Arvelo del estado Carabobo es una región agrícola y pecuaria por 150

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excelencia, donde se encuentra aproximadamente el 40 % del total de granjas intensivas del estado Carabobo, lo cual hace una región importante en la producción porcícola Venezolana(18). Por ello, en el presente estudio se planteó como objetivo evaluar la dinámica de infección de C. suis en lechones lactantes criados en una granja piloto durante un período de 12 meses. El estudio se realizó en una granja piloto ubicada en la parroquia Guigue, municipio Carlos Arvelo del estado Carabobo (10°11´35´´N - 67°58´48´´O); ubicada a 500 msnm y con precipitaciones anuales de 1,150 mm, con lluvias de gran intensidad entre junio a octubre, con mayor intensidad entre agosto y octubre, donde comienza a experimentar descenso en los meses de noviembre y diciembre, y a partir de esta fecha se inicia la temporada seca que se extiende hasta finales del mes de mayo(19). La granja se caracteriza por ser una explotación intensiva en flujo continuo y con antecedentes de diarrea neonatal en maternidad. Tiene un tamaño de 3,000 madres en producción y un total de 25,000 animales. El tipo de animal observado pertenece a mestizos de líneas mejoradoras, y son alimentados con raciones balanceadas, formuladas en plantas de alimentos próximas a la unidad de producción. El destete se realiza a los 21 días, en promedio. Los lechones son tratados con Toltrazuril al 2.5 y 5% entre los 3 y 5 días de edad; sin embargo, se observó mucha interrupción en el tratamiento anticoccidial durante el tiempo del estudio. Después de cada destete, los pisos de paleta plástica son remojados y tratados con glutaraldehído al 5% durante 2 h. Previo al estudio, se condujo una prueba piloto para determinar la prevalencia de C. suis en la granja. Se examinó el 15 % (50/325) de camadas de diferentes edades con los métodos descritos abajo, obteniéndose una prevalencia de 80 % (40/50). Con esta cifra obtenida, se determinó el tamaño muestral (n) empleando la fórmula con prevalencia conocida en poblaciones finitas(20): n = N*Zα² (p)(q) /d² (N – 1) + Zα² (p)(q) Donde: N= población (camadas con diarrea); Zα2 = 1.962 (nivel de confianza del 95%); p= prevalencia esperada (80%, según estudio piloto); q: 1 – p; d= error máximo admisible (5%). Durante los meses de septiembre de 2015 hasta agosto de 2016 se colectaron 480 muestras fecales de lechones lactantes, con un promedio de 40 muestras mensuales distribuidas en cuatro grupos de edades resultantes del estudio piloto: grupo 1 (1-7 días de edad, 20 %), grupo 2 (8–14 días, 47 %), grupo 3 (15-21 días, 23 %) y grupo 4 (22-28 días, 10 %). De cada camada seleccionada se tomaron de 4 a 5 lechones con la finalidad de hacer un pool de la 151

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muestra. A cada lechón se le introdujo un hisopo por vía rectal con el propósito de estimular la defecación y colectar las deyecciones en tubos de ensayo previamente identificados. Las muestras se introdujeron en una cava refrigerada a 10 °C para ser trasladadas a la unidad de investigación en parasitología de la Universidad “Rómulo Gallegos”, estado Guárico, Venezuela, donde se conservaron en refrigeración a 9 °C hasta su procesamiento. En cada muestreo se aplicó una encuesta al propietario de la granja con la finalidad de obtener información referente a la asistencia veterinaria, protocolos de limpieza y desinfección, así como tratamientos anticoccidiales empleados, entre otros. Con respecto a la asistencia veterinaria, se categorizó en ausente (1) y presente (2). Los protocolos de limpieza de las jaulas paritorias se clasificaron en tres tipos: lavado o remojado con agua de chorro (1), lavado con agua de chorro más desinfección con solución de glutaraldehído al 5%, empleando una bomba de espalda de 20 L (2), y lavado con agua de chorro más empleo de bomba de hidrojet (bomba para expulsión de agua a 70°C y presión de 3.300 lbs/pulg2) más desinfección con solución de glutaraldehído al 5% (3). Con relación al uso de anticoccidiales por vía oral como tratamiento preventivo, se clasificaron en: no emplea (1), emplea 2 ml/lechón de Baycox al 2.5% (2) y emplea 1 ml/lechón de Baycox al 5% (3). Los datos meteorológicos (temperaturas, humedad relativa y precipitaciones) se tomaron de los registros del anuario de la estación Meteorológica El Pao – Valencia, estado Carabobo, Venezuela(19). La estación se encuentra en latitud: 10.16, longitud: - 67.93. altitud: 430 m. Todas las muestras se cultivaron a temperatura ambiente en cápsulas de Petri utilizando 20 ml de una solución de dicromato de potasio al 2.5% durante 24 h (pool de cada camada)(21). Transcurrido ese tiempo, se empleó una técnica de centrifugación – flotación y McMaster, utilizando una solución saturada de NaCl enriquecida con solución azucarada a temperatura ambiente y gravedad específica de 1.28 (1 L de solución saturada de NaCl + 500 g de azúcar)(22). En aquellas muestras donde la grasa dificultaba observar ooquistes de C. suis, se empleó una técnica de sedimentación con PBS- éter(23). La visualización de ooquistes se hizo con microscopio óptico de luz utilizando magnificación de 10 y 40X. Los resultados obtenidos se analizaron mediante estadísticos descriptivos y test de Ji cuadrada para determinar diferencias estadísticas. Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson para determinar asociaciones entre prevalencia y constantes meteorológicas. Para los cálculos se utilizó el programa estadístico Statistix(24). Se determinó 52.08 % (250/480) de prevalencia en lechones lactantes durante el período de estudio. En la Figura 1, se muestra la dinámica de infección de Cystoisospora suis en lechones lactantes durante todo el año. Estos resultados se analizaron mediante un test de asociación (Ji – cuadrada de Pearson), donde se encontró asociación estadística (X2: 81.36; P<0.05) entre la prevalencia de C. suis con respecto al mes de muestreo, lo que supone un 152

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efecto estacional sobre la presencia del protozoario. Los resultados de prevalencia durante el periodo de estudio coinciden con lo publicado por otros investigadores(5,6,7)quienes determinaron valores altos de prevalencia en lechones lactantes; sin embargo, los resultados difieren con lo señalado en otros estudios(8-11) donde determinaron valores inferiores de prevalencia. Probablemente, las condiciones de manejo y salubridad de la granja favorecen los mecanismos de sobrevivencia y proliferación del parásito.

Figura 1: Dinámica de prevalencia de Cystoisospora suis en lechones lactantes de diferentes edades durante el periodo de estudio 90

Prevalencia (%)

80 70

71.4 61.5

69.5 59.3 52.6

50 40 22.2

20 10 0

P<0.05; X2: 81.36

Durante el primer semestre del estudio, los valores de prevalencia se encontraron por encima de la media anual (52.08 %), mientras que en el segundo semestre se registró un descenso hasta 22.2 % en el mes de marzo, y un aumento a 48 % en abril, para finalmente mantener niveles constantes de 40 % en los últimos cuatro meses del estudio. Probablemente, la prevalencia aumenta en aquellos meses donde las condiciones climatológicas favorecen la esporulación de ooquistes. Estos resultados difieren con lo señalado por otros autores, quienes no encontraron efecto estacional(5,14); sin embargo, otros autores reportaron diferencias estadísticas estacionales(6,13,15), sobre todo en aquellos meses con altas temperaturas. En la Figura 2, se muestra la dinámica de prevalencia por grupo de edad. El grupo 2 (8 a 14 días), mostró los mayores valores de prevalencia durante el período de estudio. El valor más alto se registró en octubre (55 %) y el más bajo en marzo (9.1 %), mientras que el grupo 4 153

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(camadas > 22 días) resultó ser el menos prevalente a C. suis. Los grupos 1 y 3 mostraron diversos valores de prevalencia durante todo el estudio; sin embargo, los grupos 3 y 4 no mostraron excreción de ooquistes en los últimos cuatro meses del estudio.

Prevalencia (%)

Figura 2: Dinámica de prevalencia de Cystoisospora suis en camadas de diferentes edades 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

< 7 días

8-14 días

15-21 días

> 22 días

Los resultados obtenidos coinciden con lo señalado por otros autores, quienes determinaron mayores valores de prevalencia en las dos primeras semanas de vida, y podría deberse a la falta de un adecuado programa de profilaxis y control en la granja, lo que trae consigo mayor presión de infección en esta edad(9,12); sin embargo, en otros estudios se determinó mayores tasas de prevalencia en camadas de 3 y 4 semanas de vida(5,7,14). Dado que los lechones nacen con un sistema inmune inmaduro, la transferencia calostral de anticuerpos y células inmunes parece ser un factor esencial para controlar las infecciones a esa edad. Sin embargo, aún no se entiende el papel de los anticuerpos específicos contra C. suis transferidos de las madres a los lechones y las posibles correlaciones entre los niveles de anticuerpos y la Cystoisosporosis(25). Shrestha et al(26) demostraron la presencia de anticuerpos en el calostro y la leche de cerdas infectadas experimentalmente antes del parto, ya que el efecto protector estuvo altamente correlacionado con los títulos de anticuerpos durante las primeras dos semanas de vida, lo que explicaría la baja prevalencia de C. suis en lechones con menos de una semana de edad. En la Figura 3, se muestran los valores de temperatura, humedad y prevalencia durante los doce meses de estudio. La temperatura media anual fue de 26.3 °C, con lecturas muy bajas (20.2 °C) en el mes de diciembre, mientras que la lectura más alta se registró en abril (34.2 °C). La humedad relativa registró una media anual de 68.2 %, siendo marzo el que menor 154

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porcentaje de humedad mostró (55.8 %), mientras que septiembre y octubre mostraron los mayores porcentajes de humedad. En relación a las precipitaciones, se registraron 552 mm en promedio, siendo noviembre y diciembre los de menor precipitación, mientras que enero a julio comprendió el período de mayor precipitación. Según los resultados obtenidos, la prevalencia disminuyó en los meses con menor humedad relativa; sin embargo, la curva de temperatura fue inversamente proporcional a los valores de prevalencia. Se podría inferir que a mayor precipitación y humedad, mayor sería la presencia del protozoario; sin embargo, los resultados no reflejan esto, ya que en los meses de menor precipitación (primeros cuatro meses del estudio) hubo mayor presencia de C. suis, lo que podría indicar que otros factores diferentes al clima estarían involucrados en el comportamiento del parásito. En Venezuela no existen altas variaciones climatológicas como en otras regiones del mundo, donde existen fluctuaciones estacionales muy marcadas que afectan la dinámica parasitaria; sin embargo, las constantes meteorológicas registradas en nuestro medio son óptimas para que ocurra el proceso de esporulación, y por tanto, mantener viables ooquistes de C. suis durante todo el año, y especialmente hasta la llegada de nuevos hospederos, quienes se encargarán de multiplicar y perpetuar el parásito dentro de la explotación, sobre todo cuando se encuentren vulnerables los mecanismos de bioseguridad.

Figura 3: Constantes meteorológicas y porcentaje de prevalencia de Cystoisospora suis durante el período del estudio

80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15

78.5

Prevalencia (%)

Temperatura (°C)

80.9

77.1 69.4

65.9

65.9 61.5

61 54 49

68.5

27.4

77 27.2

27 26.8 26.6 26.4 26.2 26 25.8 25.6 25.4 25.2 25

Temperatura, °C

Porcentaje

Humedad (%)

Fuente: Estación Meteorológica El Pao-Valencia (804720) SVVA. Latitud: 10.16. Longitud: - 67.93. Altitud: 430 m.

En el Cuadro 1, se muestran los coeficientes de correlación de Pearson (r) entre las constantes meteorológicas con los valores de prevalencia y nivel de infección obtenidos durante los doce meses. Según estos resultados, no se determinó significancia (P>0.05), lo que indica que no 155

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hubo asociación entre las variables estudiadas, y por tal motivo se infiere que los factores ambientales no tuvieron ningún efecto sobre los valores de prevalencia y niveles de infección obtenidos en la granja piloto.

Cuadro 1: Correlación entre prevalencia y nivel de infección con parámetros meteorológicos (temperatura, humedad y precipitación)

Prevalencia Nivel de infección

Temperatura

Humedad

Precipitación

- 0.4 - 0.34

0.34 0.5

- 0.5 - 0.1

(P>0.05).

En el Cuadro 2 se muestran los datos recogidos de la encuesta aplicada (atención veterinaria, protocolos de lavado y desinfección, y tratamientos anticoccidiales). Esta información se analizó mediante una prueba de correlación con rangos de Spearman, y se determinó correlación negativa (rho= -0.9; P<0.05) entre la prevalencia y los protocolos de desinfección, lo que indica que la prevalencia disminuyó en la medida que se aplicó el protocolo N° 3 (lavado + bomba de hidrojet + desinfección). Igualmente, se determinó correlación negativa (rho= -0.65; P<0.05) entre prevalencia y empleo de Baycox al 5%, lo que sugiere que la prevalencia disminuyó cuando se empleó este fármaco. Con respecto a la asistencia veterinaria, se encontró correlación negativa (rho= -0.7; P<0.05), lo que sugiere que la prevalencia tendió a disminuir con la presencia del veterinario en la granja. El protocolo N° 3 (lavado normal + bomba de hidrojet + desinfección) aplicado a unidades paritorias con pisos de paleta plástica, así como la permanencia del Veterinario en la granja, y tratamiento con Baycox al 5%, son modalidades que estuvieron asociadas entre ellas y a su vez con el grupo de granjas que resultaron negativas a C. suis(17). La asistencia veterinaria en la granja garantiza que se lleven a cabo efectivos programas sanitarios en granjas grandes, y de esta manera se controlan las enfermedades infecciosas del rebaño. El mecanismo de acción que tiene el glutaraldehído sobre formas evolutivas de C. suis no ha sido señalado, al menos en la literatura consultada. Sotiraki et al(16) señalaron que el empleo de este desinfectante con buenos programas sanitarios pueden disminuir considerablemente el número de coccidias presentes en una explotación. Por otro lado, el empleo de agua caliente a presión sobre los pisos plásticos y su posterior remojo en soluciones desinfectantes, podrían disminuir considerablemente la presencia de ooquistes esporulados, para que cuando lleguen nuevas camadas, éstas encuentren un ambiente limpio y sin la presencia de ooquistes que puedan permanecer viables en la maternidad. En los programas de control y prevención de la cystoisosporosis en granjas porcinas venezolanas se debe considerar el empleo de buenas normas de higiene combinadas con un programa de saneamiento y desinfección con glutaraldehído que involucre el empleo de alta presión con agua caliente, así como remojo y 156

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desinfección de paletas plásticas. De esta manera se minimizan las posibilidades de proliferación y diseminación del parásito dentro de las parideras, y por tanto disminuirían las diarreas asociadas a C. suis.

Cuadro 2: Prevalencia mensual y resultados recogidos de la encuesta Mes

Asistencia veterinaria

Protocolos

Anticoccidial

Prevalencia (%)

Sep-15

61.5

Oct-15

80.0

Nov-15

71.4

Dic-15

59.3

Ene-16

69.5

Feb-16

52.6

Mar-16

22.2

Abr-16

48.0

May-16

20.0

Jun-16

20.0

Jul-16

20.0

Ago-16

20.0

-0.7 P<0.05

-0.9 P<0.05

-0.65 P<0.05

Rho

P<0.05 (asociación estadísticamente significativa). Asistencia veterinaria: (1) ausente; (2) presente. Protocolos: (1) lavado; (2) lavado + desinfección; (3) lavado + hidrojet + desinfección. Anticoccidiales: (1) no emplea; (2) Baycox al 2.5%; (3) Baycox al 5%.

Los resultados obtenidos indicaron que C. suis se encontró presente durante todo el año, por tanto las condiciones climatológicas registradas son óptimas para que ocurra el proceso de esporulación, y por tanto, mantener viables ooquistes del protozoario en cerdos e instalaciones.

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Agradecimientos

Al Programa de Medicina Veterinaria de la Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias de la Universidad de Santander por su valiosa colaboración y apoyo en la ejecución de este trabajo.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4540 Nota de investigación

Desarrollo y evaluación de un prototipo electroquímico para determinar el contenido relativo de NaCl y su aplicación en quesos frescos

Rubén Cázares-Gallegosa Juan Antonio Vidales-Contrerasa Alejandro Isabel Luna-Maldonadoa Michael E. Humeb Ramón Silva-Vázquezc Armando Quintero-Ramosd Gerardo Méndez-Zamoraa*

Universidad Autónoma de Nuevo León. Facultad de Agronomía. Francisco Villa s/n, Ex Hacienda El Canada, 66050. Escobedo, Nuevo León, México. b

Food and Feed Safety Research Unit, Southern Plains Agricultural Research Center, USDA, TX, USA. c

Instituto Tecnológico de Parral, Chihuahua, México.

Universidad Autónoma de Chihuahua. Facultad de Ciencias Químicas. Chih, México.

* Autor de correspondencia. mezage@hotmail.com

Resumen: Se desarrolló y evaluó un prototipo electroquímico (PEQ) para la medición de variables eléctricas [voltios (V), amperaje (A), resistencia (R) y potencia (P)] en soluciones que contienen NaCl y se probó en quesos frescos. El circuito del PEQ consistió en dos electrodos (un ánodo de aluminio y un cátodo de cobre), un multímetro y una resistencia. Los parámetros experimentales establecidos en el PEQ fueron la distancia entre electrodos (0.5 o 4.0 cm) y 161

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la presencia de la resistencia. Se evaluaron siete tratamientos (soluciones) con diferentes concentraciones de NaCl: 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 g de NaCl/100 ml de agua. Los quesos evaluados fueron un queso comercial (control) y otro “light” (bajo en calcio, sodio y grasa). Las variables eléctricas difirieron (P<0.05) entre los tratamientos y entre los quesos. Un análisis de regresión mostró que un modelo cuadrático dio el mejor ajuste para el PEQ. Los resultados indicaron que a mayores concentraciones de NaCl el voltaje y la resistencia disminuyeron mientras que el amperaje y la potencia aumentaron. El prototipo electroquímico detectó estos cambios de manera rápida y eficaz tanto en soluciones salinas como en quesos frescos, demostrando que es una técnica válida para el análisis de la composición de productos lácteos. Palabras clave: Adulteración, Queso, Potencial eléctrico, NaCl, Control de calidad.

Recibido: 26/06/2017 Aceptado: 08/02/2018

Hoy en día, los hábitos alimentarios inadecuados tienen serias consecuencias en la salud humana. El consumo de alimentos con altos niveles de azúcares simples, grasas y componentes minerales como el NaCl conduce a problemas asociados con la obesidad, la hipertensión y las enfermedades degenerativas crónicas. En la industria de productos lácteos, la adulteración de la leche conlleva a problemas significativos como la pérdida económica, el deterioro de la calidad del producto y los riesgos para la salud de los consumidores (1). A raíz de este fenómeno esta industria se ha visto obligada a implementar varias pruebas químicas y físicas, a menudo costosas y tardadas, para determinar los contenidos de grasas y sólidos totales(1). Se han aplicado varias técnicas basadas en circuitos eléctricos para evaluar la calidad de la leche(2,3), los efectos de la conductancia de los componentes de la leche(4), la presencia de adulterantes(1), y el contenido de grasa(5). La tecnología del circuito eléctrico también se ha aplicado al queso para estudiar las propiedades dieléctricas como parte de los análisis termodinámicos de la sal(6), y el análisis fractal y dinámico del agua(7). Las propiedades de la conducción eléctrica de un material representan su capacidad para interactuar en una corriente eléctrica(4,8). Las propiedades eléctricas de la carne, la leche, las frutas y sus derivados dependen de su composición química, los parámetros de medición de la corriente y las condiciones experimentales(1). Los alimentos que contienen electrolitos cargados (positiva- o negativamente), las moléculas cargadas y las macromoléculas cargadas son capaces de transmitir una corriente eléctrica(9). En el caso de los alimentos, es necesario disponer de “portadores” móviles para los cationes y los aniones; estos se pueden afectar por

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la salinidad, la formulación, el estado de agregación, la masa molar, el tipo de enlace, la carga y el número de portadores cargados(9,10). Una corriente eléctrica (I) fluirá a través de una muestra de alimentos que contenga iones como parte de un circuito eléctrico(9). Se determina la fuerza de la corriente eléctrica por medio de la resistencia eléctrica [R; 1 voltio (V) * amperaje (A-1) = 1 Ohm (Ω)] de la muestra de alimentos, en donde R limita el flujo de corriente eléctrica a través de la muestra. Por lo tanto, dentro de un circuito eléctrico existe una relación lineal entre el voltaje [V representado como U], la corriente (A) y la resistencia eléctrica (R); se conoce este como la ley de Ohm [I = (1/K)*U; ó I = G * U]. Cuando se necesita ser independiente de la geometría de la muestra y del circuito en la realización de ciertos tipos de cálculos, es necesario introducir las propiedades del material, la resistividad eléctrica específica (ρ; en Ω*m), y la conductividad específica (κ; en S*m-1); en donde κ depende solamente del estado de la fase, del contenido de humedad, y de la composición química, pero no del tamaño de la muestra; esto se expresa como R = ρ * (Ɩ/A) ó κ = 1/ρ, en donde Ɩ es la longitud en metros (m), y κ es el área actual en metros cuadrados (m2)(9,11). La leche es un electrólito que se caracteriza por su conductividad iónica la cual se debe a su alto contenido de agua y de minerales(5). Para esta caracterización se consideran: 1) mediciones de la corriente incluyendo el voltaje, la frecuencia, la forma del pulso y el tipo de corriente eléctrica (directa, variable, alternando); 2) la composición química de la materia fresca [por ejemplo, el contenido de agua y las concentraciones de iones (Ca, Na, K, Mg, Cl) y componentes de la materia seca como las grasas, las proteínas y los azúcares]; y 3) las condiciones experimentales, particularmente la temperatura. El queso en cambio es un sistema coloidal que contiene proteína, grasa y una fase acuosa en equilibrio eléctrico; en et fase la sal se usa comúnmente en la industria de los productos lácteos para preservar la calidad del queso(6). El objetivo de este estudio fue desarrollar y evaluar un prototipo electroquímico (PEQ) constituido por: una célula galvánica experimental para generar electricidad a través de una reacción redox espontánea(12); dos electrodos (un cátodo de cobre y un ánodo de aluminio); y un conductor iónico (en este caso soluciones de NaCl y quesos comerciales frescos)(13). Se evaluó la eficacia del PEQ en medir el voltaje, la corriente eléctrica, la resistencia y la potencia como una representación del contenido de NaCl, como prueba de su capacidad para cuantificar la concentración del NaCl de manera rápida.

Los ensayos se llevaron a cabo en el Laboratorio de la Remediación Ambiental y Análisis de Suelos, Agua y Plantas de la Facultad de Agronomía de la Universidad Autónoma de Nuevo León (Cuidad General Escobedo, Nuevo León, México). El laboratorio está ubicado en el noreste de México (26°49’ N; -100°19’ W) a una altura de 500 m(14). El prototipo

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electroquímico incorporaba dos electrodos, uno de aluminio y otro de cobre, cada uno con las dimensiones de 4.5 cm x 4.5 cm x 0.15 cm. A través de todo el experimento se midieron los variables V y A con un multímetro (Modelo 2700/Switch System Keithley, Ohio, USA), y el circuito eléctrico se completó con una resistencia (Ф; 100 Ω tolerancia ± 5%) (Figura 1a').

Figura 1: Diseño del circuito del prototipo electroquímico (a’), los circuitos para medir el voltio (a, b) y el amperaje (c), y las distancias (d) entre los electrodos (4.0 y 0.5 cm)

(d)

(a’)

Las condiciones experimentales para la evaluación del PEQ fueron la distancia de separación (δ) entre los electrodos (0.5 y 4.0 cm) y la presencia de la resistencia (con o sin la resistencia), durante la medición de las variables eléctricas. La variación en la distancia y la presencia de la resistencia en el circuito se utilizaron para definir cómo las mediciones producidas por el PEQ variaron bajo estas condiciones y desde luego obtener la configuración óptima del diseño del PEQ. Para el experimento se usaron siete soluciones tratamiento (Ƭi) con diferentes concentraciones de NaCl (0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 g de NaCl/100 ml de agua). Se prepararon las soluciones con agua desionizada (CTR Scientific, Monterrey, N.L., México) a temperatura ambiente (24 °C). Los electrodos se insertaron a 2.0 cm de profundidad en cada solución. Estaban separados por una u otra distancia (0.5 y 4.0 cm) (Figura 1d), y contaban con la presencia o ausencia de la resistencia (Figuras 1a-b) en el circuito (δ con Ф y δ sin Ф; Figura 1a-d). Estas condiciones se establecieron para medir la variable V. Se insertó una resistencia en el circuito eléctrico para medir el amperaje (Figura 1c). Se utilizaron las variables de V y A para estimar la R, basada en la ley de Ohm(15). La potencia (P) en vatios se midió con la ecuación: P = V I(15). Se llevaron a cabo dos réplicas del experimento y las mediciones se realizaron por duplicado. Se comprobó el PEQ utilizando 400 g de queso comercial fresco sea tipo estándar (Control), y uno ligero (Light), es decir, bajo en calcio, sodio y grasa (Cuadro 1). Ambos quesos tenían las dimensiones de 12 cm de diámetro por 4 cm de alto. Se midieron las variables eléctricas de V, A, R y P en cada queso según las condiciones determinadas en la evaluación del PEQ (Figura 1). Los electrodos se introdujeron a una profundidad de 1.5 cm dentro de los quesos

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y los electrodos se colocaron a dos distancias (0.5 y 4.0 cm). La variación de la distancia entre electrodos se realizó por tres razones: 1) para validar la distancia óptima entre los electrodos; 2) para determinar si una resistencia fue requerida en el circuito cuando el amperaje se midió; y 3) para determinar las condiciones óptimas para medir las variables eléctricas y sus variaciones en el queso. Las mediciones se realizaron por duplicado en cada tipo de queso y cada variable se midió por triplicado. Para el pH, se tomaron tres muestras de 10 g cada una de cada tipo de queso. Cada muestra se homogenizó en 90 ml de agua destilada y se le midió el pH con un potenciómetro (Mettler Toledo, Proprotek; Columbus, OH, EE.UU.).

Cuadro 1: Composición nutricional de los dos tipos de queso Composición (g/20 g de queso)* Control Light 0.60 0.50 3.40 4.00 5.20 2.80 0.11 -§ 0.11 0.08 10.57 12.62

Características Carbohidratos Proteína Grasas Calcio Sodio Humedad y otros componentes *

Los datos son del empaque del producto comercial. § - = no presente.

La evaluación estadística de los resultados del experimento del PEQ se llevó a cabo por medio de un análisis de varianza (ANOVA) aplicado con el procedimiento GLM en el programa estadístico SAS(16), con el siguiente modelo estadístico: yijk = µ + Ƭi + δj + Фk + (Ƭδ)ij + (ƬФ)ik + (δФ)jk + (ƬδФ)ijk + Ԑijk; Donde: yijk = las variables V, A, R y P; μ = el medio general; Ƭi = el efecto fijo del i-ésimo tratamiento (las soluciones de NaCl y los quesos); δj = el efecto fijo del j-ésimo distancia entre los electrodos; Фk = el efecto fijo del k-ésimo condición de la resistencia; (Ƭδ)ij = el efecto fijo de la interacción entre el tratamiento y la distancia; (ƬФ)ik = el efecto fijo de la interacción entre el tratamiento y la resistencia;

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(Î´Đ¤)jk = el efecto fijo de la interacciĂłn entre la distancia y la resistencia; (ĆŹÎ´Đ¤)ijk = el efecto fijo de la interacciĂłn triple entre el tratamiento, la distancia y la resistencia; Ô?ijk = el error aleatorio con una distribuciĂłn normal, un medio de cero y una varianza de Ď&#x192;2 [Ô?ijk ~ N (0, Ď&#x192;2)].

Los resultados del pH del queso se analizaron con un ANOVA simple. El efecto de la variable independiente NaCl sobre las variables dependientas V, A, R y P se analizĂł con un ANOVA, una regresiĂłn lineal y el procedimiento REG in el programa estadĂstico SAS(16), ademĂĄs del siguiente modelo estadĂstico cuadrĂĄtico de segunda orden (17): yi = Î˛0 + Î˛1X1 + Î˛11đ?&#x2018;&#x2039;12 + Ć?i; Donde: yi = variable dependiente y bajo la influencia de X (NaCl); Î˛0 = intersecciĂłn cuando X = 0; Î˛1 = coeficiente de la regresiĂłn lineal, lo cual representa el cambio en y cuando X (NaCl) incrementa por una unidad; X1 = los valores de la i-ĂŠsima soluciĂłn de la variable independiente X1 (NaCl); Î˛11 = los coeficientes de regresiĂłn del segundo orden, los cuales representen el cambio en y cuando X1 se incrementa por una unidad de manera cuadrĂĄtica; đ?&#x2018;żđ?&#x;?đ?&#x;? = el valor de la i-ĂŠsima soluciĂłn cuadrĂĄtica de la variable independiente đ?&#x2018;&#x2039;12 (NaCl2); Ć?i = el error aleatorio de la i-ĂŠsima observaciĂłn del efecto de la variable independiente (X1) sobre y.

Una comparaciĂłn de medias se hizo con la prueba Tukey usando un nivel de confianza de 0.05 (95%). El anĂĄlisis del efecto estadĂstico (valor P) de los factores evaluados en el PEQ sobre las variables medidas en soluciones salinas mostraron que la distancia (Î´j) y su interacciĂłn con el tratamiento con NaCl [(ĆŹÎ´)ij] no tuvieron efecto (P>0.05) sobre las variables elĂŠctricas evaluadas (yijk) (Cuadro 2). Sin embargo, la concentraciĂłn de NaCl (ĆŹi) si tuvo un efecto (P<0.05) sobre las variables evaluadas en las soluciones. Esto indica que se puede utilizar una distancia de 0.5 Ăł 4.0 cm en el diseĂąo del PEQ para medir las variables elĂŠctricas en estas soluciones sin cambiar los valores de las variables. El amperaje se midiĂł solamente con la presencia de la resistencia en el circuito, y por lo tanto no se calculĂł el valor del P para la 166

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interacción de la resistencia (Фk) con el NaCl [(ƬФ)ik], la distancia [(δФ)jk] y la interacción triple [(ƬδФ)ijk] entre el tratamiento, la distancia, y la resistencia.

Cuadro 2: Efectos de los parámetros del modelo sobre las variables evaluadas en soluciones de NaCl por el prototipo electroquímico Parámetros* Modelo Ƭi δj Фk (Ƭδ)ij (ƬФ)ik (δФ)jk (ƬδФ)ijk µ ± Ԑijk

Voltio 0.3902 0.0076 0.3768 0.1794 0.9202 0.8566 0.9527 0.9971 0.564 ± 0.007

Valor de P Amperaje Resistencia 0.0007 0.0007 < 0.0001 < 0.0001 0.8698 0.3705 -§ 0.7314 0.6128 2.615 ± 0.097 220.333 ± 7.562

Potencia 0.0003 < 0.0001 0.7297 0.4448 1464.686 ± 37.189

* Ƭ = i-ésimo tratamiento (NaCl); δ = j-ésimo distancia; Ф = j-ésimo condición de la resistencia; (Ƭδ) = la interacción i j k ij entre el tratamiento y la distancia; (ƬФ)ik = la interacción entre el tratamiento y la resistencia; (δФ)jk = la interacción entre la distancia y la resistencia; (ƬδФ)ijk = la interacción triple entre el tratamiento, la distancia y la resistencia; μ ± Ԑijk = media ± error estándar. n = 42. § - = no detectado.

Las mediciones de la conductividad eléctrica por el PEQ en las diferentes concentraciones de NaCl (Ƭi) muestran que las concentraciones de 2, 4 y 6 g de NaCl/100 ml de agua produjeron los valores de voltaje más altos, mientras que el control (0 g de NaCl/100 ml de agua) produjo el valor más bajo (P<0.05) (Cuadro 3). Las concentraciones más altas de NaCl, incluyendo la de 6 g de NaCl/100 ml de agua, mostraron valores altos de amperaje y potencia, pero tuvieron los valores más bajos para la resistencia. Estos resultados son similares a los de un estudio en que evaluaron las variables eléctricas en el jugo de limón a concentraciones diferentes de NaCl(18). Las conclusiones de ese estudio fueron que: la presencia de ácidos débiles influyó directamente en la transferencia de electrones afectando principalmente al ánodo de magnesio; y que la adición de NaCl bloqueó la interacción del ácido sobre la superficie del electrodo, produciendo una disminución en el potencial eléctrico.

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Cuadro 3: Conductividad eléctrica evaluada en soluciones con diferentes concentraciones de NaCl por el prototipo electroquímico NaCl* (Ƭi)

Voltio 0.539b 0.576a 0.576a 0.580a 0.566ab 0.553ab 0.556ab 0.007

0 2 4 6 8 10 12 EE

Variables¶ Amperaje Resistencia § 2.055b 277.810a 2.240b 253.215ab a 2.715 212.785bc a 2.663 211.610c 2.960a 186.723c a 3.058 179.858c 0.088 9.110

Potencia 1,168.018b 1,267.343b 1,553.998a 1,499.765a 1,626.340a 1,672.655a 45.778

NaCl en g/100 ml de agua. Medias (n = 42) con la misma letra no son diferentes (P>0.05). EE = error estándar. § - = no detectado.

El análisis de regresión de la validación del PEQ mostró un efecto significativo (P<0.05) para un comportamiento lineal e indicó que el mejor ajuste para las variables eléctricas era un modelo cuadrático (Cuadro 4). En el caso de V, el PEQ detectó una disminución de -0003 V, mientras para R hubo una reducción de -19 Ω para cada aumento en la concentración de NaCl. En contraste, para cada incremento de unidad en las concentraciones de sodio el valor de A incrementó más de 0.17 y lo de P más de 107. Los resultados indican que el parámetro cuadrático (β11) es adecuado para detectar disminuciones en los parámetros V, A y P, y aumentos en R, en respuesta a variaciones en las concentraciones de NaCl.

Cuadro 4: Coeficientes de la regresión (β), y la determinación (R2) en la validación del prototipo electroquímico Variable Dependiente Voltio Amperaje Resistencia Potencia *

Coeficiente de la regresión* β0 0.563 1.712 314.511 959.196

β1 -0.003 0.173 -19.289 107.242

β11 - 0.0004 - 0.0051 0.6733 - 4.0418

R2 Lineal 0.2127 0.7854 0.7756 0.7384

Cuadrático 0.2664 0.8024 0.8064 0.7785

Valor de P 0.0387 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001

β0 el intercepto cuando X = 0; β1 = el cambio en y cuando X (NaCl) se incrementa por una unidad; β11 = representa el cambio en y cuando X1 se incrementa por una unidad de manera cuadrática; R2 = el coeficiente de la determinación.

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El análisis del efecto de los parámetros sobre las variables de los dos tipos de queso mostró que el tipo de queso (Ƭi) afectó V, A, P y el pH (P<0.05), mientras que solo la distancia (δj) afectó a V (P<0.05) (Cuadro 5). La interacción entre el tipo de queso y la distancia [(Ƭδ)ij] no influyó en las variables. No se muestran los efectos de las interacciones para otros parámetros que implican la resistencia ya que la resistencia se incluyó en el circuito solamente para medir el amperaje. Cuando se compararon las medias, el queso control mostró los valores más altos para V, A y P, pero tuvo los valores más bajos para R y el pH. El voltaje a la distancia de 4 cm fue el más alto en comparación con V a 0.5 cm. Estos resultados pueden estar relacionados con la composición del queso control, ya que tiene un mayor contenido lipídico. Consecuentemente, tiene una mayor presencia de ácidos grasos disponibles en el sistema, lo cual influye sobre la oxidación en el ánodo. Por ejemplo, algunos ácidos como el CH3COOH son electrolitos débiles, y no están completamente ionizados. Esto puede causar una reacción reversible que produce iones H+ en el medio, y, con la presencia de metales como Zn, Mg y Fe, puede conducir la electricidad(12). Además, el hidrógeno disuelto (H+) en solución se reduce en ausencia del cobre por el efecto de la oxidación del electrodo a H2(19), afectando las variables eléctricas cuantificadas en los quesos. Las propiedades dieléctricas de los alimentos dependen de sus composiciones químicas(1). Las reacciones identificadas en este estudio podrían explicar los altos valores para V, A y P en el queso control, el cual contiene más grasa, Ca y Na que el queso ligero. Desde luego, el PEQ se puede utilizar para evaluar el contenido de la grasa y del Na en los quesos para determinar su calidad y los niveles de las variables empleadas respecto a las normas oficiales mexicanas.

Cuadro 5: Efectos de los parámetros del modelo en las variables evaluadas en los quesos con el prototipo electroquímico Parámetros*

Voltio

Modelo Ƭi δj Фk (Ƭδ)ij (ƬФ)ik (δФ)jk (ƬδФ)ijk

0.0008 0.0004 0.0118 0.0639 0.3775 0.2091 0.9773 0.3930

Control Light

0.528a 0.512b

0.5 3.0

0.515b 0.526a

Amperaje

Resistencia

Valor de P 0.2118 0.2821 0.0421 0.0867 0.5687 0.4656 0.9026 0.5623 Quesos comerciales (Ƭi; µ) 1.082a 507.307b b 0.982 536.689a Distancia (δj; cm) 1.021 525.609 1.044 513.388 169

Potencia

0.1505 0.0312 0.4322 0.8712 -

-§ < 0.0001 -

568.701a 505.675b

6.530b 6.755ª

527.127 547.250

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Resistor (Фk) (Ƭδ)ij (ƬФ)ik (δФ)jk (ƬδФ)ijk EE

0.520 0.520 0.003

1.032 1.032 0.024

519.498 522.590 9.378

537.188 542.330 15.394

0.013

* Ƭ = i-ésimo tratamiento (quesos); δ = j-ésima distancia; Ф = j-ésima condición de la resistencia; (Ƭδ) = la interacción i j k ij entre el tratamiento y la distancia; (ƬФ)ik = la interacción entre el tratamiento y la resistencia; (δФ)jk = la interacción entre la distancia y la resistencia; (ƬδФ)ijk = la interacción triple entre el tratamiento, la distancia y la resistencia; 2 μ ± Ԑijk = media ± error estándar (EE); n = 12. § - = no detectado. ¶ Medias

(n = 12) con la misma letra no son diferentes (P>0.05).

El voltaje y la resistencia son variables que se pueden medir con el prototipo electroquímico, ya que estas variables disminuyeron en las concentraciones más altas de NaCl, mientras que el amperaje y la potencia aumentaron. Las distancias entre los electrodos y la presencia de la resistencia en el circuito no influyeron en los niveles de las variables eléctricas, pero la distancia es necesaria para determinar los datos de resistencia. El prototipo electroquímico detectó diferencias en las variables eléctricas (voltios, amperios, resistencia y potencia) entre los quesos según su composición química. Desde luego el prototipo evaluado podría ser utilizado para evaluar el contenido de minerales y la calidad de quesos por medio del voltio, el amperaje, la resistencia y la potencia.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4344 Nota de investigación

La calidad sanitaria del chorizo rojo tradicional que se comercializa en la ciudad de Toluca, Estado de México

Ana Laura Becerril Sáncheza Octavio Dublán Garcíab Aurelio Domínguez-Lópezc Daniel Arizmendi Coteroc Baciliza Quintero-Salazard*

Universidad Autónoma del Estado de México. Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Químicas, Paseo Colón intersección Paseo Tollocan s/n. Col. Residencial Colón, 50120 Toluca, Estado de México, México. b

Universidad Autónoma del Estado de México. Laboratorio de Toxicología Ambiental, Facultad de Química. México. c

Universidad Autónoma del Estado de México. Facultad de Ciencias Agrícolas, México.

Universidad Autónoma del Estado de México. Facultad de Turismo y Gastronomía. México.

*Autor de correspondencia: bquinteros@uaemex.mx

Resumen: El chorizo rojo tradicional que se comercializa en Toluca es un producto cárnico con gran fama pero, poco se sabe sobre su calidad. El objetivo de este estudio fue determinar la calidad sanitaria de este embutido en diversos puntos de venta. A partir de tres muestreos, se analizaron 75 muestras de los cuatro principales mercados de la ciudad de Toluca y 10 carnicerías especializadas. Con base en normas oficiales mexicanas se determinaron: aw, humedad, pH, acidez y contenido de nitritos. Se realizó el conteo de bacterias mesófilas aerobias (BMA), bacterias ácido lácticas (BAL), coliformes totales y coliformes fecales; así

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como la detección de Salmonella spp. y Escherichia coli. El chorizo rojo tradicional no presentó diferencias significativas (P>0.05) en la mayoría de las variables fisicoquímicas y microbiológicas analizadas. Mostró un aw superior a 0.95; humedad entre 40 y 50 %; pH inferior a 5 y nitritos por debajo de los límites máximos (156 mg/kg) permitidos según normas oficiales mexicanas. El recuento de BMA fue entre 7.3 a 7.8 Log10 UFC/g y 7.8 a 8.1 Log10 UFC/g para BAL; coliformes totales entre 11.1 a 48.6 número más probable, NMP/g y coliformes fecales entre 4.9 a 9.7 NMP/g. La presencia de Salmonella spp. y E.coli spp. se detectó tanto en mercados como en carnicerías especializadas, independientemente de su naturaleza; y el porcentaje de incidencia varió entre 11.1 a 60 % y 16.7 a 43.3 %, respectivamente. El chorizo rojo tradicional de Toluca presenta características distintivas, pero es imperativo implementar programas de manejo higiénico-sanitario durante su producción, almacenamiento y comercialización, que garanticen la obtención de un embutido no sólo típico de la región, sino inocuo. Palabras clave: Chorizo rojo toluqueño, Inocuidad, Embutidos tradicionales mexicanos, Enterobacteriaceae, Calidad.

Recibido: 14/12/2016 Aceptado: 08/02/2018

La creciente valoración y demanda de alimentos tradicionales cuya calidad y reputación está asociada a un origen territorial ha motivado la realización de estudios de caracterización (tipificación) y de determinación de su calidad. En Europa la caracterización de alimentos tradicionales, en especial de embutidos artesanales, es una práctica común en países como Francia(1), Alemania(2), Italia(3) y España(4,5). Particularmente en España, destacan los estudios realizados en embutidos fermentados secos tales como el chorizo de Pamplona(4,5) y de cebolla de Galicia(6). En estos se ha determinado el color y la textura(4), compuestos volátiles(4), cambios bioquímicos durante el proceso de maduración(6,7), así como el efecto de los cultivos iniciadores sobre el perfil de compuestos volátiles, recuentos microbianos, parámetros fisicoquímicos y sensoriales(8). En el caso de México, las técnicas para la elaboración de embutidos fueron traídas por los españoles durante la Conquista(9). Posteriormente el ingenio, la creatividad y biodiversidad locales dieron origen a una gran variedad de embutidos, entre los que destaca el chorizo, un embutido que se popularizó desde épocas novohispanas(10). El chorizo es un producto cárnico curado que se elabora a partir de una mezcla de carne y grasa de cerdo troceadas, adicionada con sales tales como el cloruro de sodio, nitritos, nitratos y otros aditivos alimentarios permitidos(11). Los chorizos mexicanos se caracterizan por 173

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contener en su formulación mezclas de chiles, y son muy importantes dentro de la gastronomía mexicana; actualmente se producen variedades de chorizos tradicionales en entidades tales como Hidalgo, Veracruz, Oaxaca y el Estado de México, principalmente. Sin embargo, a pesar de su importancia gastronómica y económica existen pocos estudios sobre su caracterización fisicoquímica(12), sensorial(13) y microbiológica(14) . En el Valle de Toluca, en el Estado de México, existe un gran arraigo en la producción a pequeña escala de chorizos rojos y verdes, los cuales se comercializan en los principales tianguis y mercados de la localidad(15). La fama de Toluca como ciudad choricera es tal que, para muchos, “Toluca” es sinónimo de chorizo(16). No obstante, a pesar de que la elaboración de estos embutidos es de gran importancia económica para la región(15), sólo existen estudios preliminares sobre la calidad fisicoquímica y morfológica de los chorizos verdes tradicionales(17) y prácticamente no existen investigaciones sobre la calidad, en general, y mucho menos sobre la calidad sanitaria del chorizo rojo tradicional. Con base en lo anterior, y sabiendo la importancia que significa evaluar la calidad microbiológica de los alimentos regionales, el objetivo de este estudio fue determinar la calidad sanitaria del chorizo rojo tradicional que se comercializa en los principales mercados y carnicerías especializadas en la venta de productos cárnicos derivados del cerdo, en la ciudad de Toluca. Se adquirieron muestras de chorizo rojo tradicional en 25 puntos de venta, de los cuales 15 correspondieron a locales establecidos en los principales mercados fijos de la ciudad de Toluca y 10 a carnicerías especializadas en la producción y venta de productos cárnicos de cerdo. Se realizaron tres muestreos: octubre-noviembre de 2015, enero-febrero de 2016 y marzo-abril de 2016. Se realizaron análisis fisicoquímicos. La determinación de actividad de agua (aw) se realizó por el método expuesto por Decagon(18). Las determinaciones de pH y acidez total titulable se efectuaron con base en los métodos reportados por Guerrero et al(19). El contenido de humedad se determinó por secado en horno(20). Para la determinación de nitritos se empleó el método de Griess(11). Se realizaron conteos microbianos para lo cual se realizaron diluciones hasta 10-7. La determinación de mesófilos aerobios se realizó en agar PCA (BD Bioxon, México) incubado a 35 ± 1 °C por 48 h(21). Para coliformes totales y fecales se efectúo la técnica del número más probable (NMP) de acuerdo a la NOM-112-SSA1(22). Se determinó presencia de Escherichia coli. a partir de tubos positivos de la prueba confirmativa de coliformes NMP, en de placas de agar EMB (BD Bioxon, México) a 35 ± 1 °C durante 24 h. Posteriormente se realizaron tinciones Gram para las colonias sospechosas. A las cepas con morfología de bacilos Gram negativos se les realizó la prueba bioquímica IMViC (BD Bioxon, México). Para la determinación de Salmonella spp. se siguió la metodología expuesta en la NOM-114-

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SSA1-1994(23); como medios de enriquecimiento se emplearon tubos de caldo RVS (BD Difco, Estados Unidos) y caldo tetrationato (BD Bioxon, México); como medios selectivos se usó agar HE (BD Difco, United States), agar SB (BD Bioxon, México) y agar SS (BD Bioxon, México). Las colonias sospechosas se transfirieron a medios de identificación bioquímica TSI (BD Bioxon, México) y LIA (BD Bioxon, México). La determinación de bacterias ácido lácticas se realizó por inoculación por el método de doble capa(24) en agar MRS a 35 °C por 48 h. Todas las muestras se analizaron por triplicado y los datos obtenidos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) y el método de Tukey para comparación de medias, empleando el programa Statgraphics Centurion XVI Version 16.1.03, Warrenton, Virginia. La producción de alimentos con calidad sanitaria es primordial, ya que los microorganismos presentes en estos pueden ser causantes no sólo del deterioro, sino de enfermedades que podrían poner en riesgo la salud del consumidor(25). En México actualmente se produce una gran cantidad de alimentos tradicionales de manera artesanal sin embargo, con frecuencia presentan deficiencias en su calidad, especialmente en lo que respecta a la calidad sanitaria(26). Ejemplo de lo anterior son los estudios realizados en el queso de aro de Oaxaca(27), los quesos de Zacazonapan en el Estado de México(28), en chorizos comercializados en Hidalgo(13) y en chorizo verde comercializado en Toluca(29). Es importante aclarar que, para este estudio, los grupos de establecimientos donde se obtuvieron las muestras analizadas responden a características particulares (Cuadro 1). Las carnicerías especializadas (C) son locales establecidos equipados con mostradores refrigerados y áreas de almacenamiento específicas; características similares se aprecian en los locales del mercado Md; ambos atienden a un sector de la población medio-alto. En cambio, los mercados Ma, Mb y Mc cuentan con establecimientos que se caracterizan por presentar espacios reducidos; sin áreas específicas para la producción, almacenaje ni limpieza; los locales del mercado Mb atienden a sector medio-bajo, además del comercio de mayoreo. Los chorizos tradicionales mexicanos presentan características únicas; en principio, son frescos, no madurados, ligeramente acidificados, y reciben cocción previa a su consumo. Particularmente los chorizos rojos tradicionales de Toluca se caracterizan por incluir en su formulación mezclas de chiles (Capsicum annum) incluyendo chile puya y guajillo, ancho, entre otros y, dependiendo de la variedad, por incluir frutos secos tales como piñón (Jatropha curcas), pasas (Vitis vinífera) almendras (Prunus dulcis), nueces (Carya illinoinensis), entre otros(30). Otros aspectos distintivos son el formato (longitud y diámetro del producto), además de los parámetros fisicoquímicos (ejemplo: aw, pH, acidez) que aquí se determinaron.

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Cuadro 1: Características de los grupos de establecimientos donde se comercializa el chorizo rojo en la ciudad de Toluca Grupo de establecimiento Ma (n=15) Mb (n=15) Mc (n=6) Md (n=9) C (n=30)

Grado de tecnificación Artesanal Artesanal Artesanal Artesanal Semi-industrial

Tipo de almacenamiento Intemperie Intemperie Intemperie Refrigeración Refrigeración

Sector de comercio Medio-bajo Medio-bajo Medio-bajo Medio-alto Medio-alto

M= mercados; C= carnicerías especializadas.

Para poder entender la presencia de microorganismos indicadores primero fue necesario realizar las determinaciones fisicoquímicas que se muestran en el Cuadro 2. En términos generales, se puede observar que el valor de aw del chorizo que se comercializa en los diferentes grupos de establecimientos analizados presentó un valor medio superior a 0.95, mostrando diferencia significativa (P<0.05) entre el mercado Ma y las carnicerías especializadas (C). Dichos valores son coherentes por tratarse de embutido fresco; asimismo, son ligeramente mayores a los reportados para los chorizos del estado de Hidalgo (0.930.95)(13) y el chorizo verde que se comercializa en Toluca (0.94-0.96)(17). Cabe señalar que estos valores tan altos de aw fueron un factor que, sin lugar a dudas, influyó en el desarrollo de bacterias, pero no de hongos y levaduras. Respecto al contenido de humedad, el producto presentó porcentajes entre 41.8 a 50.1 %; asimismo, se observó que aquellos grupos de establecimientos en donde los chorizos son almacenados en refrigeración presentaron un mayor porcentaje de humedad (Md y C). Estos valores fueron mayores a los reportados para chorizos del estado Hidalgo (36 a 43 %)(13). Los valores elevados de aw en un alimento sugieren una mayor cantidad de agua disponible para el desarrollo de reacciones químicas, enzimáticas, así como un mayor crecimiento microbiano. Por otra parte, el contenido de humedad hace referencia al contenido total de agua sin especificar la porción de agua que está asociada a otras moléculas.

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Cuadro 2: Parámetros fisicoquímicos del chorizo rojo tradicional que se comercializa en distintos grupos de establecimientos de la ciudad de Toluca Grupo de aw establecimiento Ma (n=15) 0.963±0.003a Mb (n=15) 0.959±0.003ab Mc (n=6) 0.969±0.005ab Md (n=9) 0.964±0.004ab C (n=30) 0.970±0.002 b

Humedad (%)

47.056±1.714b 41.803±1.714a 46.515±2.710ab 50.101±2.213b 49.762±1.212b

4.572±0.085a 4.470±0.085a 4.728±0.134ab 4.588±0.110ab 4.785±0.060b

Acidez (% ácido láctico) 0.022±0.002a 0.021±0.002a 0.022±0.003ab 0.028±0.002bc 0.030±0.002c

Nitritos (mg/kg) 0.267±0.332a 0.667±0.332ab 2.600±0.525c 0.573±0.428ab 1.145±0.428b

M= mercados; C= carnicerías especializadas. a,b,c: Diferentes superíndices en la misma columna, indican diferencias significativas entre los establecimientos (P<0.05).

Respecto al pH, se presentaron valores inferiores a 4.8 y no hubo diferencia significativa (P>0.05) entre los chorizos procedentes de los diferentes mercados. Los chorizos de carnicerías especializadas (C) presentaron valores de pH significativamente mayores que los provenientes de los mercados Ma y Mb. Un comportamiento similar se observó en la acidez, donde el grupo de carnicerías especializadas presentó diferencias significativas (P<0.05) respecto a los mercados Ma, Mb y Mc. Estudios realizados en chorizo de Pamplona y de cebolla de Galicia han reportado valores de pH de 4.4 y pH 4.8 respectivamente(4,6); dichos valores resultan comprensibles dado el proceso de maduración, el cual dura alrededor de 50 días. En el caso de chorizos que se comercializan en Tulancingo, México se han reportado valores de pH entre 4.41 a 5.15(31), en tanto que para los chorizos verdes que se comercializan en Toluca entre 4.49 a 5.64(17). El que los chorizos tradicionales que se comercializan en México, y particularmente en Toluca, presenten valores de pH cercanos al de los chorizos madurados españoles, podría deberse al efecto combinado de la fermentación espontánea durante el proceso de oreo con el consecuente desarrollo de bacterias lácticas y la producción de ácidos orgánicos, aunado a la naturaleza ácida de una cantidad importante de ingredientes como vinagre, vino tinto, vino blanco; además de chiles rojos secos como el guajillo, puya, ancho, chipotle y de árbol (Capsicum annuum L.) reportados en su formulación(14,30). En cuanto a los nitritos, se adicionan con fines antimicrobianos, antioxidantes, así como para fijar y contribuir al desarrollo de características organolépticas de algunos productos cárnicos(32). En este estudio se encontró que los chorizos de todos los grupos de establecimientos analizados presentaron valores de nitritos menores a 0.27 mg/kg, dicho valor se encuentra muy por debajo de los límites máximos permitidos (156 mg/kg) para embutidos por normas oficiales mexicanas(11). Estos resultados concuerdan con lo documentado con los productores tradicionales, quienes aseguran no adicionar nitritos a sus formulaciones(30). La presencia marginal de nitritos podría atribuirse a la oxidación biológica de las aminas o bien a la reducción anaeróbica del nitrato presente naturalmente en los 177

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vegetales empleados en su producción, más que a la adición de manera intencional con fines de conservación del producto. La elaboración de chorizos sin la adición de nitritos es común en algunos lugares y es una disposición que debe cumplirse en productos como el chorizo de Cantimpalos, el cual cuenta con denominación de origen(33). La determinación de microorganismos indicadores en alimentos permite determinar un manejo inadecuado o contaminación; un alto número de microorganismos indicadores, en la mayoría de los casos, podría incrementar el riesgo de presencia de microorganismos patógenos(34). Particularmente en el caso del chorizo rojo tradicional que se comercializa en Toluca se registraron valores de bacterias mesófilas aerobias entre 7.39 a 7.85 log10 UFC/g (Cuadro 3). No se encontraron diferencias significativas (P>0.05) entre los diferentes grupos de establecimientos. La presencia de mesófilos aerobios generalmente indica el grado de contaminación de una muestra; sin embargo, esto no aplica en alimentos fermentados como el analizado aquí, ya que, por su naturaleza, es deseable una gran multiplicación bacteriana. Se ha observado que en embutidos como el chorizo tradicional de Galicia, la presencia de bacterias mesófilas aerobias y bacterias ácido lácticas se incrementa durante el proceso de fermentación, llegando a alcanzar valores de 8.55 log10 UFC/g y 8.1 log10 UFC/g, respectivamente al cabo de 30 días de maduración(7).

Cuadro 3: Valores medios y desviación estándar de los recuentos de diversos grupos microbianos presentes en el chorizo rojo tradicional que se comercializa en Toluca Grupo de establecimiento Ma (n=15) Mb (n=15) Mc (n=6) Md (n=9) C (n=30)

Bacterias mesófilas aerobias (Log10 UFC/g) 7.76±0.48a 7.85±0.56a 7.60±0.44a 7.39±0.49a 7.80±0.49a

Bacterias ácido lácticas (Log10 UFC/g) 7.90±0.36a 7.87±0.46a 7.84±0.47a 8.07±0.63a 8.01±0.47a

Coliformes totales (NMP/g)

Coliformes fecales (NMP/g)

48.56±57.29b 19.61±16.73a 14.33±10.87a 11.07± 8.49a 34.06± 56.30b

7.85±6.11a 9.67±4.67a 5.73±3.44a 4.87±3.38a 7.36±5.59a

M= mercados; C= carnicerías especializadas. ab

NMP= número mínimo permitido. Diferentes superíndices en la misma columna, indican diferencias significativas entre los mercados (P<0.05).

Para el caso de embutidos frescos, en estudios realizados a chorizos del estado de Hidalgo, México se documentaron recuentos de bacterias mesófilas aerobias en un rango entre 7.17 a 8.73 log10 UFC/g)(13), mientras que en chorizos de la Ciudad de México se han reportado valores superiores a 8.0 log10 UFC/g(35). Estas diferencias podrían deberse a la naturaleza de los ingredientes y procesos de producción.

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En cuanto los coliformes (Cuadro 3), su presencia es un indicador de la eficiencia de los procesos de sanitización y desinfección de los alimentos(34). Al respecto, se encontraron valores de coliformes totales entre 11.07 a 48.56 NMP/g observando diferencias significativas (P<0.05) entre los grupos de establecimientos Ma y C respecto al resto de grupos de establecimientos. En cuanto a los coliformes fecales, se presentaron valores entre 4.87 a 9.67 NMP/g sin diferencia significativa (P>0.05), independientemente del grupo de establecimientos. Lo anterior podría deberse, entre otras cosas, a la calidad deficiente de las materias primas utilizadas, fallas en la cadena de frío durante el proceso de elaboración y comercialización, así como a la falta de espacios específicos para el almacenamiento de las materias primas y a la inexistencia de un plan de limpieza para envases o contenedores(31). La Norma Oficial Mexicana para productos cárnicos procesados (NOM-213-SSA1-2002)(11) no indica los límites máximos permitidos de coliformes fecales en productos crudos como el chorizo, únicamente se establece que para productos cocidos el límite debe ser <3 NMP/g. No obstante, siendo el chorizo un ingrediente fundamental de la gastronomía toluqueña, es muy importante aplicar una cocción correcta en la que la temperatura mínima en el centro térmico del producto cárnico sea de 74 ºC, según la NOM-251-SSA1-2009(36). Lo anterior, permitirá evitar la incidencia de infecciones alimentarias que pongan en riesgo la salud, tanto consumidores locales como de aquellos turistas que durante su visita a la ciudad de Toluca desean degustar a tan famoso embutido; especialmente cuando éste es adicionado a platillos tradicionales de preparación rápida tales como tacos, tortas, sopes entre otros. En cuanto a las bacterias ácido lácticas (BAL), su presencia es inherente a los embutidos crudo-curados fermentados, ya sea porque éstas son adicionadas de manera intencional durante el proceso de elaboración o bien por su desarrollo durante la maduración. En los chorizos tradicionales madurados del Chato Murciano y Galicia se han reportado recuentos de BAL en el orden de 8.0 a 8-5 log10 UFC/g y 8.6 log10 UFC/g respectivamente(7,37) dependiendo del tiempo de maduración.. En contraste, en chorizos frescos y ligeramente acidificados del estado de Hidalgo se han reportado recuentos menores y en el orden de 7.4 a 9.0 log10 UFC/g(13). En este caso, se encontraron 7.84 a 8.07 log10 UFC/g de BAL, sin diferencia significativa (P>0.05) entre los grupos de establecimientos estudiados. La presencia de BAL favorece la fermentación espontánea durante el proceso de oreo o secado (1-3 días)(31) y podría ser, en parte, la responsable tanto de la acidez del producto como de su estabilidad. Salmonella es de las principales bacterias patógenas y su simple presencia, aún en bajas cantidades, representa un riesgo importante para la salud(38). De acuerdo a la NOM-213SSA1-2002(11), la presencia de Salmonella spp. no está permitida en productos cárnicos cocidos, curados, marinados, en salmuera, o bien crudos como es el caso del chorizo; debe estar “ausente” en 25 g de producto. No obstante, de acuerdo a la literatura(38,39,40), su presencia ha sido reportada en muestras de chorizos frescos en ciertas localidades en México. Lo anterior se atribuye, entre otras cosas, a un manejo higiénico deficiente del producto; a la 179

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falta de un control constante de la temperatura a lo largo de cadena de suministro del embutido (cadena de frío) desde su producción, distribución, almacenamiento y exhibición en el punto de venta, comercialización y consumo. Lo anterior, derivado de la falta de inversión en equipo e infraestructura adecuados. Otro aspecto que también podría comprometer la inocuidad y propiciar la presencia de Salmonella del producto es la utilización de tripa natural, la cual es usada para embutir al producto(38). En el chorizo rojo tradicional analizado, la presencia de Salmonella fue positiva tanto en el producto proveniente de mercados, como de algunas carnicerías especializadas (Cuadro 4). El mayor porcentaje de incidencia se observó en el mercado Mb: 60 %, 15 muestras dieron positivo. El grupo de establecimientos agrupados en el mercado Mb está dirigido a un sector medio-bajo, y es de gran afluencia por su cercanía a la Central Camionera de Toluca. Por otro lado, el conjunto de locales agrupados en el mercado Md fue en el que menor porcentaje de pruebas fueron positivas a Salmonella 11.11 % (9 muestras); este mercado está dirigido a un sector medio-alto y cuenta con instalaciones de seguridad e higiene. En el caso de las carnicerías especializadas, dada su infraestructura, se esperaba encontrar una menor incidencia de Salmonella sin embargo, no fue así. La presencia de Salmonella spp en este tipo de establecimientos podría deberse a la contaminación cruzada propiciada por la manipulación de otros productos cárnicos (ejemplo: queso de puerco, carne fresca, carne enchilada, entre otros), que con frecuencia se comercializan y exhiben junto con el chorizo.

Cuadro 4: Porcentaje de muestras de chorizo rojo tradicional de Toluca positivas para Salmonella spp. y Escherichia coli por grupo de establecimiento Grupo de establecimiento Ma (n=15) Mb (n=15) Mc (n=6) Md (n=9) C (n=30)

Salmonella spp.

E. coli

20.0 60.0 33.3 11.1 30.0

40.0 40.0 16.7 22.2 43.33

M= mercados; C= carnicerías especializadas.

Con base en lo anterior, el chorizo rojo que se comercializa en Toluca podría representar un riesgo latente para la salud de los consumidores; de ahí que resulta necesaria la implementación de un control y monitoreo de temperaturas, así como un manejo higiénico adecuado a lo largo de la cadena de suministro, para eliminar la posibilidad del desarrollo de microorganismos patógenos. Asimismo, es muy conveniente la sensibilización de los consumidores y encargados de establecimientos de alimentos y bebidas sobre la manipulación y cocción adecuada del producto; recordando que esta última debe realizarse a 180

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temperaturas por arriba de los 74 ºC (en el centro del producto) y por tiempos adecuados, ya que ello eliminará el potencial peligro que representan las infecciones alimentarias por el desarrollo de Salmonella y otros microorganismos patógenos en el producto. Por otra parte, E. coli es una bacteria generalmente inofensiva; sin embargo, cepas patógenas pueden intercambiar genes y generar variaciones de enfermedades(34). Se encontró que en todos los grupos de establecimientos hubo muestras que dieron positivo a E. coli. El grupo de establecimientos con mayor incidencia fueron las carnicerías especializadas (C) con 43.33 % (30 muestras positivas) (Cuadro 4). Curiosamente, el grupo de establecimientos que presentó menor porcentaje de pruebas positivas fue Mc con 17 % de muestras positivas (6 muestras) cuyo comercio está dirigido a sector medio-bajo de la población. El chorizo rojo tradicional que se comercializa en Toluca, a pesar de ser elaborado por diferentes productores a partir de recetas propias, presenta grandes similitudes en cuanto a sus características fisicoquímicas e incluso microbiológicas, especialmente en cuanto al número de BAL se refiere. El hecho de haber encontrado muestras de chorizo rojo tradicional positivas a Salmonella spp. y E. coli spp. representa un llamado de atención para los productores y comercializadores, al tiempo que sugiere la necesidad de trabajar en la implementación de programas que permitan la selección de materias primas de mayor calidad; mejorar el manejo higiénico del producto, así como el mantenimiento de la cadena de frío. Lo anterior, podría contribuir a mantener o mejorar la reputación e incrementar las ventas de este embutido tan tradicional y emblemático más allá del local, derivando en una mejor calidad de vida para quienes por siglos, y de generación en generación, han resguardado el saber hacer en torno a su elaboración.

Agradecimientos

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-México) por la beca de estudios de posgrado otorgada a Ana Laura Becerril Sánchez; así como a la Secretaría de Investigación y Estudios Avanzados (SIEA-UAEMéx) por el financiamiento otorgado a través del proyecto “Determinación de las características de calidad del chorizo rojo toluqueño y su percepción por parte de consumidores y productores”, clave 3744/2014CID.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4350 Nota de investigación

Impacto de la vigilancia sanitaria del clembuterol en Guerrero, México: Resultados de 2011 a 2015

Luis Alberto Chávez-Almazána* Jesús Antonio Díaz-Ortizb Diana Garibo-Ruizc Mario Alberto Alarcón-Romerob Miguel Angel Mata-Diazb Beatriz Pérez-Cruzb Elizabeth Godoy-Galeanab

Universidad Autónoma de Guerrero. Facultad de Ciencias Químico Biológicas. Guerrero, México. Secretaría de Salud de Guerrero. Laboratorio Estatal de Salud Pública “Dr. Galo Soberón y Parra”. Guerrero, México. b

Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. México.

*Autor de correspondencia: chavez_79@hotmail.com>

Resumen: El empleo del clembuterol en la producción de ganado implica riesgos a la salud humana que deben ser evaluados y atendidos por las autoridades agropecuarias y sanitarias. En este trabajo se evaluaron los resultados del programa de vigilancia sanitaria de dicho compuesto en productos cárnicos de bovinos que se comercializan en Guerrero, México. Se realizó un 186

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análisis retrospectivo del periodo comprendido entre 2011 y 2015, sobre la evolución de su uso ilegal y el registro de intoxicaciones alimentarias por clembuterol. Los porcentajes de muestras positivas disminuyeron gradualmente hasta quedar en 2015 en 6.8 % y, en general, fueron más bajos en comparación con los antecedentes inmediatos; sin embargo, siempre fueron superiores a los porcentajes promedio del resto del país (Guerrero= 9.5 %, Nacional= 5.8 %). Las jurisdicciones sanitarias con mayor presencia del fármaco fueron Tierra Caliente y Norte, con 12.1 y 16.8 %, respectivamente, así como en lugares con una población grande como Acapulco (9.6 %). Se reportaron pocos casos de intoxicaciones humanas en los tres primeros años (2011= 3, 2012= 5 y 2013= 4) y ninguno en los dos posteriores; sin embargo, hay un sub-registro que puede deberse a diversos factores tanto individuales, regionales e institucionales que se discuten más adelante. El avance observado en este programa ha sido significativo; sin embargo, debe fortalecerse la vigilancia sanitaria con la finalidad de erradicar esta actividad ilegal en el corto plazo. Palabras clave: Clembuterol, Intoxicación alimentaria, Vigilancia sanitaria.

Recibido: 14/01/2017 Aceptado: 29/11/2017

El clembuterol es un compuesto agonista de los receptores beta-adrenérgicos del músculo liso vascular, miometrial y bronquial, utilizado en la medicina veterinaria como broncodilatador y tocolítico(1), y en algunos países está autorizado para su administración en el tratamiento de enfermedades respiratorias en humanos. Debido a que actúa como agente de repartición en animales mediante la eliminación de grasas y promoviendo la síntesis de proteínas, se provoca un acelerado crecimiento de la masa muscular, por lo cual este compuesto se utiliza de manera ilegal e indiscriminada con fines de producción cárnica de ganado bovino(2-5). La ingesta de alimentos con residuos de clembuterol representa un riesgo para el consumidor, dado que puede derivar en graves intoxicaciones que se asocian con síntomas como palpitaciones, taquicardia, cefalea, temblor en extremidades, presión arterial elevada, ansiedad, nerviosismo, prurito, náuseas, dolor estomacal, fiebre, vómito, astenia y debilidad muscular, los cuales están acompañados de alteraciones de algunos parámetros hematológicos (leucocitosis) y bioquímicos, como electrolitos y glucosa(6-10). Con la finalidad de proteger a la población contra el riesgo por el consumo de alimentos contaminados por clembuterol, la Subsecretaría de Regulación, Control y Fomento 187

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Sanitario, dependiente de la Secretaría de Salud del Estado de Guerrero, ha implementado el Programa de Inocuidad Alimentaria (antes denominado Proyecto de Alimentos Potencialmente Peligrosos) desde el año 2005 basándose en la Norma Oficial Mexicana NOM-194-SSA1-2004(11), que consta de visitas de verificación en diversos establecimientos como mercados, rastros y tiendas de autoservicio, en las cuales se recolectan muestras de productos cárnicos para la detección de clembuterol por el Laboratorio Estatal de Salud Pública de Guerrero “Dr. Galo Soberón y Parra” (LESP-Guerrero) basado en el inmunoensayo enzimático Ridascreen Clenbuterol Fast (r-biopharm, Alemania)(12). Este trabajo tuvo como finalidad evaluar los resultados de este programa para determinar su efectividad en la reducción del uso ilegal del clembuterol en la producción de ganado bovino para su consumo en el estado de Guerrero. El estudio se realizó de manera retrospectiva, transversal, observacional y comparativa. Se llevó a cabo un análisis de los resultados del programa de vigilancia sanitaria del clembuterol en Guerrero implementado entre los años 2011 a 2015, para determinar la idoneidad del esquema de muestreo y establecer si existió una tendencia en los porcentajes de casos positivos a través de los años, además de la comparación entre los resultados obtenidos con respecto a la situación a nivel nacional. También, se aplicó un análisis regional y municipal del comportamiento del uso del clembuterol, así como un recuento de las intoxicaciones alimentarias derivadas de esta práctica ilegal. De los establecimientos visitados por los verificadores sanitarios, se recolectaron muestras de hígado y músculo de bovinos, aproximadamente 250 g (de manera ocasional, se tomaron muestras de globo ocular y orina), para la detección de clembuterol. Las muestras se almacenaron en bolsas de polietileno y frascos de plástico con tapa de rosca (para muestras de orina), perfectamente identificadas y transportadas al LESP-Guerrero a una temperatura entre 2 y 8º C. La preparación de las muestras se realizó de la siguiente manera: A) Hígado y músculo. Se depositaron 5 g de la muestra previamente triturada en un tubo para centrífuga de 50 ml (Corning, Estados Unidos de América), luego se agregaron 25 ml de HCl 0.05 M y se agitó mecánicamente por 20 min; posteriormente se centrifugó a 4,000 xg durante 15 min a una temperatura entre 10 y 15 ºC, y se transfirieron 18 ml de sobrenadante a otro tubo, al cual se le agregaron 2 ml de NaOH 0.5 M y se mezcló por 10 min. Finalmente, se adicionaron 4 ml de buffer de fosfatos (KH2PO4 0.5 M pH 3) y se homogenizó para dejarlo reposar otros 90 min a 2-8 ºC; posteriormente, se centrifugó y se tomaron 10 ml de sobrenadante y se pasaron a través de columnas de extracción en fase sólida tipo C18 (rbiopharm, Alemania). B) Globo ocular. Las piezas se congelaron a -20 ºC durante 24 h para lisar el tejido. Después, se realizó la disección y el líquido obtenido se diluyó con agua destilada en una relación 1:2 y se centrifugó a 2,000 xg durante 5 min. Del sobrenadante se tomaron 20 µl para el inmunoensayo. 188

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C) Orina. Estas muestras se analizaron directamente sin un tratamiento previo de extracción, y solamente cuando presentaron turbiedad se centrifugaron a 2,000 xg durante 5 min. El volumen adecuado para el análisis fue de 30 a 50 ml. La extracción en fase sólida se llevó a cabo acondicionando la columna C18 con 3 ml de metanol y se agregaron 2 ml de un buffer de enjuague (KH2PO4 0.05 M pH 3); se aplicó el sobrenadante y se agregaron 3 ml de buffer de enjuague; la columna se secó y eluyó lentamente con 1 ml de metanol grado HPLC (Honeywell Burdick and Jackson, Estados Unidos de América); la concentración del extracto se realizó a 50 a 60 ºC bajo una corriente de aire; el residuo seco se reconstituyó con 400 µl de agua grado HPLC (Sigma Aldrich, Suiza). El análisis de los extractos se realizó por medio de un inmunoensayo enzimático competitivo (Ridascreen Clembuterol Fast, r-biopharm, Alemania)(12) con lectura en un espectrofotómetro UV-Vis iMark (Bio-Rad Laboratories Inc, Estados Unidos de América) a 450 nm; la concentración de clembuterol se expresó en ng/kg o ppt (partes por trillón). De conformidad con la NOM-194-SSA1-2004(11), se consideraron como muestras contaminadas, detectadas o positivas, aquéllas que presentaron concentraciones mayores a 2,000 ng/kg; las muestras con resultados inferiores se interpretaron como no detectadas con clembuterol. Sobre la calidad analítica del método, se cumplieron los criterios de aceptación descritos en el inserto del reactivo(12); asimismo, en cada corrida se analizaron controles comerciales y muestras con concentraciones conocidas, obteniendo siempre los valores esperados. Cabe mencionar que este Laboratorio está facultado por la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) como Tercero Autorizado para la realización de pruebas analíticas en materia de regulación y control sanitario con base al cumplimiento de los requisitos técnicos y de gestión de calidad establecidos en la NMX-EC-17025-IMNC2006(13). Se analizaron estadísticamente los resultados obtenidos del programa mediante un estudio de correlación (coeficiente r de Pearson) entre el número de especímenes recolectados con variables como la población y el volumen de producción de carne en canal de los municipios visitados. Posteriormente, se calculó el porcentaje de muestras contaminadas de acuerdo a la Jurisdicción Sanitaria (JS) de procedencia y el año de estudio; se elaboraron gráficas que relacionaron los porcentajes anuales de muestras contaminadas en Guerrero versus los obtenidos a nivel nacional, así como con el número de personas intoxicadas durante el periodo estudiado. Los resultados calculados para las JS y los municipios se representaron en mapas temáticos. Estos análisis y gráficos fueron realizados con los programas SPSS versión 21 (IBM Corporation, Estados Unidos de América) y ArcGIS versión 9.3 (ESRI, Estados Unidos de América). En el análisis de resultados se encontró que la recolección de muestras no fue uniforme en lo que se refiere a la cantidad, ya que en 2011 se analizaron más productos cárnicos que en 189

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cualquier otro año (n= 172), mientras que para el 2012 y 2013 disminuyeron de manera sustancial a 91 y 105, respectivamente. En el 2014 existió una recuperación de esta variable y tuvo una progresión en el año posterior (Cuadro 1). Este comportamiento puede deberse a que el presupuesto destinado para operar el programa de vigilancia sanitaria es diferente en cada año, y las actividades que se destinan implican gastos, lo que afecta directamente en la planeación de las visitas de verificación a las tiendas de autoservicio, rastros y expendios de carne. Además, la dinámica de aparición de muestras contaminadas con clembuterol provocan un rediseño de las estrategias para obtener mejores resultados que inhiban esta actividad ilegal en la producción pecuaria; esto significa poner énfasis en la vigilancia especialmente en las localidades que han presentado casos positivos, dejando en segundo término aquellas en las que no se ha observado este problema. Mediante la aplicación de este enfoque basado en riesgos se logra una eficacia del programa, y una reducción en la utilización de recursos tanto económicos como humanos.

Cuadro 1: Muestras contaminadas / recolectadas y porcentaje de muestras contaminadas por año (% anual) y jurisdicción sanitaria (JS) Tierra Caliente Norte Centro Montaña Costa Grande Costa Chica Acapulco Annual, %

2011

2012

2013

2014

2015

Total

JS (%)

4/25 4/22 2/36 0/9 4/28 0/17 8/35 12.8 n=172

0/9 2/12 1/8 2/4 1/16 0/12 1/30 7.7 n=91

6/26 0/10 0/19 0/11 0/11 0/8 0/18 5.7 n=105

2/24 6/19 0/21 0/11 0/13 5/20 2/21 11.6 n=129

1/23 4/30 4/32 1/7 0/24 0/24 1/21 6.8 n=161

13/107 16/95 7/116 3/42 5/92 5/81 12/125 9.3 n=658

12.1 16.8 6.0 7.1 5.4 6.2 9.6

Con respecto al tipo de muestras, hubo cierta igualdad en la cantidad recolectada tanto de hígado (n= 329) como de músculo (n= 310) (Cuadro 2). La COFEPRIS a través de la Comisión de Operación Sanitaria establece en su Instrucción de trabajo(14) que en las visitas de verificación sanitaria a los rastros, carnicerías y tiendas de autoservicio deben colectarse los productos cárnicos por triplicado, una muestra para su análisis en el Laboratorio Estatal, otra para resguardo de la Subsecretaría de Regulación Sanitaria y la tercera para el propietario del establecimiento regulado, por si tuviese alguna inconformidad con el resultado, pueda recurrir con base a su derecho, al análisis en otro laboratorio tercero autorizado del país (para que de esa manera se proceda a la emisión de un dictamen definitivo por parte de la autoridad sanitaria correspondiente).

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Cuadro 2: Porcentaje de muestras detectadas con clembuterol por tipo de muestra y año correspondiente Año 2011 2012 2013 2014 2015

Tipo de muestra Hígado Músculo Hígado Músculo Hígado Músculo Globo ocular Hígado Músculo Hígado Músculo Orina

Resultado No detectado Detectado 89 15 61 7 53 7 31 0 37 1 56 4 6 1 53 4 61 11 67 3 74 5 9 3

Total

104 68 60 31 38 60 7 57 72 70 79 12

16.9 11.5 13.2 0 2.7 7.1 16.7 7.6 18.0 4.5 6.8 33.3

Entre las regiones, la recolección se llevó a cabo de manera similar con excepción de la Montaña, en la que se obtuvieron solamente 42 muestras (Cuadro 1). Las condiciones de difícil acceso a las localidades pueden ser un factor importante que limite la operación del programa en esta zona del Estado, tomando en cuenta además que el transporte y conservación de las muestras deben realizarse a una temperatura entre 2 y 8 ºC, y como los tiempos de traslado hacia el laboratorio suelen ser prolongados, es posible que la red fría se rompa en algún momento perjudicando así la calidad de la muestra, siendo éste otro factor que puede incidir en la escasa recolección observada en esta región. En lo que respecta a los municipios, se visitaron un total de 39 de los 81 que conforman el Estado (48.1 %), concentrándose la atención en aquellos con una mayor población e importancia, tanto turística como económica y política, como son Acapulco (n= 119), Chilpancingo (n= 73), Iguala (n= 39), Tlapa (n= 31), Ciudad Altamirano (n= 34) y Zihuatanejo (n= 29) (Figura 1). En un análisis de correlación entre el número de habitantes en los municipios visitados y la cantidad de productos cárnicos recolectados en estos, se obtuvo una alta relación entre estas dos variables (r= 0.912, P<0.001), lo cual es lógico, ya que en la medida que existen más consumidores la vigilancia sanitaria debe aumentarse con la finalidad de prevención y control de riesgos. No existió una relación entre los niveles de producción de carne en canal de los municipios, con las muestras obtenidas en estos (r= -0.045), es decir, la recolección de muestras no se vio influenciada por los altos volúmenes producidos en algunos municipios. Con base a lo anterior, es recomendable ampliar la cobertura del muestreo en los municipios y regiones para tener más posibilidades de detección de casos positivos, y así tener elementos para la toma de decisiones que coadyuven a lograr mejores resultados en la vigilancia sanitaria del clembuterol.

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Figura 1: Recolección de productos cárnicos en los municipios de Guerrero

El porcentaje de muestras positivas, es decir, la relación entre la cantidad de productos cárnicos contaminados con clembuterol con respecto al total de los productos cárnicos recolectados, presentó una tendencia a la baja con el transcurso de los años (Cuadro 1). Dicha disminución se presentó de manera gradual, con la excepción del año 2014 en el que se obtuvo un ligero incremento (11.6 %). Al final, este porcentaje se vio reducido aproximadamente a la mitad de lo que se observó inicialmente (2011= 12.8 % vs 2015= 6.8 %). Lo anterior indica un logro importante del programa de vigilancia del clembuterol en la reducción de riesgos sanitarios para los consumidores de carne de ganado bovino de esta entidad federativa. El porcentaje global (9.3 %) fue menor a lo obtenido por Chávez et al(15) en un estudio similar correspondiente a los años 2005-2010, cuyo porcentaje anual promedio fue de 13.1 %, con valores en 2005 de hasta casi 24 % de muestras contaminadas con este agente químico. No obstante, estas cifras siempre estuvieron por encima de lo obtenido a nivel nacional (media Guerrero= 9.5 %, media Nacional= 5.8%; P= 0.1) (Figura 2), y en algunos casos como en el 2011, el porcentaje de muestras positivas en Guerrero fue el doble con respecto al resto del país (12.8 vs 5.1 % respectivamente), por lo que debe plantearse una meta de revertir este comportamiento en el mediano o corto plazo para tener niveles de contaminación más acordes a la realidad nacional en torno a este problema.

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Figura 2: Comparación de los porcentajes de muestras positivas en Guerrero y a nivel nacional durante 2011-2014 14

Porcentaje de muestras positivas

Guerrero Nacional

2011

2012

2013

2014

El globo ocular y la orina no fueron las muestras de elección en el esquema de muestreo del programa, sin embargo, como se observa en el Cuadro 1, se tuvo más éxito en la detección de clembuterol en estas muestras biológicas, en las que sólo bastaron siete especímenes de globo ocular para encontrar residuos del fármaco en uno de estos, y del mismo modo, con tan sólo nueve muestras de orina se detectaron hasta tres de ellas con el compuesto de interés. Esto tiene su fundamento en la farmacocinética de la molécula, ya que se han reportado altas concentraciones de clembuterol en retina después de su administración a niveles terapéuticos, y por lo tanto, una alta permanencia(16). De la misma manera, se excreta lentamente a través de la orina y puede encontrarse en los 10 días siguientes a la exposición a este agente(17,18), en tanto que en sangre solamente puede ser detectado durante cinco días posteriores a su ingesta(19). A pesar de la evidencia presentada en éste y otros estudios(16,20), no se ha optado por recolectar muestras de globo ocular por no cumplirse la condición de obtener tres especímenes del mismo animal (por razones lógicas) tal como lo marca la Instrucción de trabajo de la COFEPRIS(14). Asimismo, las muestras de orina únicamente se obtienen en operativos especiales de la autoridad sanitaria en los rastros, siendo esta actividad no muy frecuente, ya que responde a casos particulares en los que existe alguna queja pública o se tienen antecedentes de introducción de carne contaminada en estos establecimientos. En el análisis regional, las principales JS que contribuyeron con mayores porcentajes de muestras positivas fueron la Norte y Tierra Caliente con 16.8 y 12.1 %, respectivamente, cuya presencia de este contaminante químico fue constante en casi todos los años estudiados. En Acapulco, a pesar de la intensa vigilancia realizada (fue el sitio en el que se recolectaron más muestras que en cualquier otra JS) también presentó casos positivos de manera reiterada, aunque en un menor grado que las jurisdicciones mencionadas, con 9.6 %. En las JS restantes, la situación se encontró más controlada y con aparición de casos positivos de manera 193

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esporádica. Se detectó el clembuterol en 22 municipios, entre los que se destacan aquellos que tienen una mayor población como Acapulco, Chilpancingo, Iguala, Ciudad Altamirano y Tlapa, y es justamente en estos donde se encontraron más casos de muestras contaminadas (Figura 3).

Figura 3: Presencia de clembuterol en los municipios de Guerrero

Se registraron algunos casos de intoxicaciones humanas por el consumo de productos cárnicos contaminados con clembuterol, con tres en 2011, cinco en 2012 y cuatro al año siguiente, mientras que para los demás años no ocurrieron eventos de esta naturaleza (Figura 4). De estos casos se registraron seis en Acapulco, tres en Iguala, dos en Chilpancingo y uno en Chilapa, municipios en los que, como se mencionó, se han detectado la mayor cantidad de muestras positivas, con excepción de Chilapa que sólo presentó una muestra positiva, la cual estuvo directamente relacionada con una intoxicación suscitada en 2012. Como en muchos de los padecimientos de salud en México y otros países, hay un sub-registro de las intoxicaciones alimentarias por clembuterol debido posiblemente a una falta de información en el primer nivel de atención para reconocer la sintomatología que implique un estudio más profundo de los casos para llegar a un adecuado diagnóstico(21), a lo que se suma el hecho de que las personas no acuden a los centros de salud para recibir algún tipo de tratamiento, ya sea por falta de recursos económicos o por la escasa oferta de servicios médicos institucionales, por lo que se estima que la cantidad real de estos casos es de una mayor magnitud.

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Figura 4: Porcentaje de muestras contaminadas (barras) y casos de intoxicaciones (línea punteada) en cada año estudiado

En virtud de que aún existe la presencia de este contaminante químico en los alimentos, es importante mantener y fortalecer el monitoreo mediante la ampliación de las visitas a los establecimientos, así como dar seguimiento a los casos de muestras contaminadas mediante la cadena de trazabilidad para ubicar a los productores de ganado y sensibilizarlos sobre las consecuencias negativas para la salud humana de estas prácticas inadecuadas de producción pecuaria. Por último, es indispensable la coordinación intersectorial para combatir este problema; cada institución desde el ámbito de sus atribuciones y responsabilidades debe diseñar un esquema integral para la procuración de buenas prácticas de producción desde sus etapas iniciales, que inhiba las intenciones de los ganaderos de obtener mejores rendimientos a costa de la utilización de sustancias peligrosas para el consumidor. Del mismo modo, cuando exista evidencia suficiente sobre el uso ilegal del clembuterol, deben ejecutarse actos de autoridad con base a la legislación vigente y llegar hasta las últimas consecuencias, partiendo del hecho de que esta actividad supone un atentado contra la salud pública, y en ese tenor debe ser sancionada sin reserva ni excepción alguna. A la luz de estos resultados, y en comparación con años anteriores, es justo mencionar el trabajo que ha realizado la Secretaría de Salud de Guerrero en torno a este fenómeno, con una disminución sustancial de los casos positivos, dando como consecuencia un número menor de intoxicaciones alimentarias. No obstante, debe mantenerse constante la operación del programa de vigilancia para tener como objetivo siguiente erradicar el uso ilegal de clembuterol para proteger a la población contra los riesgos sanitarios relacionados. 195

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Agradecimientos

Al personal de la Subsecretaría de Regulación, Control y Fomento Sanitario por la operación del programa de vigilancia sanitaria del clembuterol en Guerrero. A los colegas Roberto Huante y Diego Morán por la asistencia técnica prestada. Al Dr. Hugo Saldarriaga por la revisión del manuscrito y valiosas aportaciones.

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198

http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4387 Nota de investigación

Condiciones poblacionales y alimenticias de colonias de abejas melíferas (Apis mellifera) en tres regiones del altiplano semiárido de México

Carlos Aurelio Medina-Floresa* Ernesto Guzmán-Novoab Jairo Iván Aguilera Sotoa Marco Antonio López Carlosa Sergio Ernesto Medina-Cuéllarc

Universidad Autónoma de Zacatecas. Unidad Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Carretera Panamericana Zacatecas-Fresnillo km 31.5, El Cordovel, Enrique Estrada. CP. 98500, Zacatecas, México. b

University of Guelph. School of Environmental Sciences. Guelph, ON, N1G 2W1, Canada.

Universidad de Guanajuato. Campus Irapuato-Salamanca, Departamento de Arte y Empresa, Salamanca, Guanajuato, México.

*Autor de correspondencia: carlosmedina@uaz.edu.mx

Resumen: Se estimó la población de abejas, áreas con cría, miel y polen en 150 colonias de abejas melíferas (Apis mellifera) establecidas en las regiones semiseca templada, subhúmeda templada y semiseca semicálida de Zacatecas, México, durante las épocas de primavera y otoño. Las colonias de la región semiseca semicálida tuvieron significativamente más abejas y cría en otoño que las colonias de las otras regiones (P0.001). En primavera, la población de abejas en las colonias de las regiones semiseca templada y semiseca semicálida fue similar, y significativamente mayor que en la región subhúmeda templada (P0.01). Se

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registró menos miel y más polen almacenados en otoño en colonias de la región semiseca semicálida que en las otras regiones (P0.001). En primavera, el área de polen almacenado en colonias de la región semiseca templada fue significativamente mayor que en las otras regiones (P<0.0001). La población de abejas y áreas de cría de las colonias en otoño, se correlacionaron positivamente con la población de abejas, áreas de cría y miel de la primavera (P<0.001). En otoño, la región semiseca semicálida tuvo mejores condiciones para el desarrollo y reproducción de colonias que las otras regiones. Sin embargo, el tamaño poblacional de las colonias estudiadas (21,000 a 35,000 abejas/colmena) no es considerado óptimo (50,000), por lo que se sugiere que previo a floraciones se implementen estrategias tendientes a incrementar la población y reservas de alimento que contribuyan a la sobrevivencia de las colonias en el invierno y a mejorar su productividad. Palabras clave: Apis mellifera, Población de abejas, Areas de cría, Miel, Polen, Regiones climáticas.

Recibido: 25/02/2017 Aceptado: 11/02/2018

El estado de Zacatecas ocupa el décimo lugar como productor de miel en la República Mexicana, y en la región norte del país se ubica en el primer sitio con una producción anual de 1,603 t(1). La producción de miel y la sobrevivencia de las colonias de abejas melíferas (Apis mellifera) obedece al efecto e interacción de diversos factores, que pueden ser resumidos en el tamaño poblacional de las colonias, la laboriosidad de las abejas y el medio ambiente(2). Sin embargo, para la entidad y en general para el altiplano semiárido de México, las condiciones ambientales demandan procesos de manejo eficientes que contribuyan al óptimo aprovechamiento de los recursos. En este sentido, bajo condiciones naturales el crecimiento poblacional de las colonias de abejas se relaciona con la disponibilidad de polen y néctar en el campo. La entrada de néctar y polen a la colmena estimulan la postura de la reina y por lo tanto se incrementa la población de la colonia(3). La producción de miel de las colonias está ligada al rápido aprovechamiento de la floración por parte de las abejas, por lo que la floración y la existencia de una abundante población de abejas en la colmena, deben coincidir para obtener mayores rendimientos productivos. Para que se produzca este paralelismo (población-flujo de néctar), la colonia debe producir con antelación a la floración una cantidad abundante de cría que permita hacer coincidir el máximo de población con el flujo de néctar(2). Adicionalmente a la producción de miel, los parámetros poblacionales y alimenticios representan importantes indicadores de supervivencia de las colonias de abejas melíferas durante el invierno(4), lo cual tiene 200

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implicaciones económicas y ecológicas. Por lo anterior, es de interés para investigadores y apicultores, conocer el tamaño poblacional y las reservas de alimento de colonias de abejas en diferentes épocas del año y regiones climáticas. Este conocimiento puede permitir a los productores implementar estrategias durante el manejo de pre-cosecha que contribuyan a incrementar sus rendimientos productivos, así como a reducir la tasa de pérdida de colonias durante épocas críticas para las mismas (ej. invierno) y su ejecución dependerá del desarrollo poblacional natural de cada región. El objetivo del presente trabajo fue determinar el tamaño poblacional y reservas alimenticias de colonias de abejas melíferas durante las dos épocas del año en que ocurren las principales floraciones, en las tres regiones climáticas de mayor importancia apícola para el estado de Zacatecas. Para alcanzar dicho objetivo, se estimó el tamaño poblacional y las reservas de alimento en el 20 % de las colonias comerciales de abejas ubicadas en 25 apiarios de tres regiones climáticas del estado de Zacatecas. Las evaluaciones se realizaron durante dos ocasiones, a mediados del otoño del 2010 (n= 150) y a mediados de la primavera del 2011 (n= 150 colonias). El 90 % de las colonias que se muestrearon en otoño, se muestrearon también en primavera; el otro 10 % fueron diferentes, ya que 15 de ellas se perdieron durante el invierno. Las colonias estudiadas se seleccionaron al azar en cada apiario muestreado, siempre y cuando fueran clínicamente sanas visualmente. Las colonias pertenecían a diferentes productores, por lo que las condiciones de manejo, origen y edad de las reinas fueron heterogéneas, situación que compartieron las tres regiones estudiadas. Además se asumió que en conjunto y por el amplio número de repeticiones, se representan adecuadamente las condiciones de manejo promedio para el Estado. El valor del trabajo reside en hacer comparaciones relativas de las condiciones de las colonias entre regiones. Las colonias se encontraban distribuidas en 15 municipios pertenecientes a las tres regiones ecológicas de mayor importancia apícola para el estado de Zacatecas (Figura 1), México (22° 57' N, 102° 42' O). En cada región se analizaron 50 colonias en el otoño y 50 en la primavera y de 8 a 13 colonias en cada municipio. Las principales características climáticas y de vegetación de cada región se describen a continuación.

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Figura 1: Mapa de Zacatecas, con la ubicación de las colonias analizadas en las diferentes regiones

Semiseca templada: Fresnillo (1), Villanueva (2), Villa Garcia (3), Guadalupe (4), Ojo Caliente (5) y Zacatecas (6). Subhúmeda templada: Tepechitlán (7), Tlantenango (8), Momax (9), Nochistlán (10) y Valparaíso (11). Semiseca semicálida: Tabasco (12), Jalpa (13), Juchipila (14) y Moyahua (15).

Región semiseca templada (SST). Representa el 60 % de la superficie del territorio estatal y es la región más árida, alta, fría y seca de las tres estudiadas. Su precipitación, temperatura y humedad relativa medias anuales son 469 mm, 15 °C y 54 %, respectivamente. Esta región presenta menor diversidad de especies vegetales en comparación con las otras regiones del Estado y la vegetación dominante es el pastizal mediano abierto(5). Dos importantes flujos de néctar ocurren cada año, uno durante la primavera (principalmente por mezquite (Prosopis laevigata)) y otro durante el otoño. Este último es el de mayor importancia apícola en el Estado y es producto de las floraciones de diversas malezas como la aceitilla (Bidens odorata), el lampote (Tithonia tubaeformis) y el lampotillo (Simsia amplexicaulis)(5-7). Las colonias de esta región se encontraban ubicadas en nueve apiarios de los municipios de Fresnillo, Villanueva, Villa García, Guadalupe, Ojo Caliente y Zacatecas, a altitudes de entre 1,800 y 2,400 msnm. Región subhúmeda templada (SUT). Los parámetros de precipitación, temperatura y humedad relativa medias anuales de esta región son 680 mm, 18 °C y 66.7 %, respectivamente. El clima de la región constituye una transición entre el de las regiones SST y SSSC. La vegetación es de tipo latifoliado esclerófilo caducifolio(5) y la flora de importancia apícola durante la primavera son el tepame (Acacia pennatela) y la manzanilla (Arctostaphylos pungens), y para finales de verano y otoño el garruño (Mimosa aculeaticarpa), la manzanilla (Arctostaphylos pungens) y el varaduz (Eysenhardtia 202

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polystachya)(5-7). Las colonias en esta región estaban localizadas en ocho apiarios en los municipios de Tepechitlán, Tlantenango, Momax, Nochistlán y Valparaíso, a altitudes de entre 1,200 y 2,000 msnm. Región semiseca semicálida (SSSC). Las medias anuales de precipitación, temperatura y humedad relativa de esta región son 704 mm, 19.5 °C y 55 %, respectivamente(5). Es la más baja, cálida y húmeda de las tres regiones estudiadas; además en ella existe una mayor diversidad de recursos florales que en las otras dos regiones. En la región se presentan dos principales flujos de néctar de hierbas, árboles y arbustos caducifolios. En la primavera el mezquite (Prosopis laevigata) es la principal flora apícola mientras que en el otoño varias especies producen néctar o polen como la vara prieta (Verbesina platyptera), la venadilla (Bursera fagaroides) y el ochote (Ipomoea murucoides)(5-7). Las colonias estudiadas estaban ubicadas en ocho apiarios en los municipios de Tabasco, Jalpa, Juchipila y Moyahua, a altitudes entre 1,000 y 1,400 msnm. La población de abejas de las colonias se estimó mediante el conteo de panales cubiertos por abejas, multiplicado por el número de abejas que ocupan un panal jumbo de cámara de cría por ambos lados (3,960 abejas), de acuerdo a lo establecido para abejas africanizadas por Delaplane et al(8). Las áreas de cría y de reservas de alimento se estimaron a través del porcentaje promedio estimado por dos operadores de la superficie de cada lado del panal ocupada por cría operculada, miel y polen. Posteriormente esta superficie porcentual se convirtió en área (cm2), usando la superficie que tiene un panal tipo jumbo en ambos lados (2,260 cm2)(8,9). Las mediciones se realizaron durante el periodo de la tarde (1600 a 1900 h) cuando la mayoría de las abejas se encontraban en el interior de las colmenas. Los datos obtenidos para el número de abejas y las áreas de los panales ocupada por cría, miel y polen, se transformaron a la raíz cuadrada del arcoseno, con la finalidad de normalizar su distribución(10). Las dos estaciones del año se compararon sometiendo los datos de las variables estudiadas a pruebas t de Student. Para determinar si existieron diferencias entre las tres regiones en relación a las variables estudiadas, los datos transformados se sometieron a un análisis de varianza (ANDEVA) y cuando se detectaron diferencias significativas, las medias se compararon a través de la prueba de Tukey. Se utilizó también el análisis de correlación de Pearson para determinar la relación entre las variables registradas(11). Sin considerar las regiones, los resultados muestran significativamente más población de abejas y mayores áreas de cría y miel durante la primavera que en el otoño, mientras que las áreas de polen fueron significativamente mayores durante el otoño (Cuadro 1).

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Cuadro 1: Valores (media  EE) de número de abejas y área de panales con cría, miel y polen en colonias de abejas melíferas durante la primavera y el otoño Variable Abejas por colonia 2

Áreas de cría, cm

Áreas de miel, cm

Áreas de polen, cm

Otoño

Primavera

t y P

23,550626

33,044539

56.9 <.0001

9,392362

10,168288

41.9 <.0001

6,443338

7,177289

30.4 <.0001

1,975161

1,328136

15.4 <.0001

Así mismo, al excluir del análisis las épocas del año, los resultados muestran que las colonias ubicadas en la región SSSC presentaron mayor población de abejas y áreas de cría que las de las otras regiones. Las áreas de reservas de miel de las colonias ubicadas en las regiones SST y SHT fueron mayores que en la región SSSC. Las áreas de polen fueron inferiores en la región SHT en comparación con las regiones SST y SSSC, entre las cuales no hubo diferencia significativa (Cuadro 2). Cuadro 2: Valores (media  EE) de número de abejas y área de panales con cría, miel y polen en colonias de abejas melíferas de tres regiones del estado de Zacatecas Semiseca templada

Subhúmeda templada

Semiseca semicálida

F y P

Abejas por colonia

27,960±981a,b

26,800±876b

29,954±678a

3.52 0.030

Áreas de cría, cm2

9,245±448b

9,186±375b

10,874±363a

5.8 0.0032

Áreas de miel, cm2

7,647±304a

7,407±409a

5,392±399b

10.9 <.0001

Áreas de polen, cm2

2,145±206a

1,130±124b

1,689±202a

7.7 0.0005

Variable

Diferentes literales en una misma fila indican diferencias significativas basadas en un análisis de varianza y la prueba de Tukey.

El Cuadro 3 muestra los valores promedio por colonia de abejas y áreas de cría considerando las tres regiones y las dos épocas de año en estudio; se observa que las colonias de la región SSSC presentaron mayor población de abejas durante el otoño que las colonias de las regiones SST y SHT, entre las cuales no hubo diferencias significativas para esa época del año. En la primavera, las colonias de las regiones SST y SSSC tuvieron una población similar y significativamente mayor a la población de las colonias ubicadas en la región SHT.

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Cuadro 3: Valores (media  EE) de número de abejas y área de panales con cría en colonias de abejas melíferas de tres regiones durante la primavera y el otoño Abejas por colonia en otoño

Abejas por colonia en primavera

t y P

Semiseca templada

20,9081,091b

35,155779a

t=112.8 P.0001

6,282461c

12,268489a

t=80.9 P0.0001

Subhúmeda templada

22,8881,200b 30,7911,032b

t=51.2 P.0001

9,695611b

8,666439b

t=3.8 P=0.052

t=28.2 P.0001

12,141526a

9,582445b

t=14 P=0.0003

F=30.72 P0.0001

F=16.92 P0.0001

Región

Semiseca semicálida FyP ab

26,788804a

33,185913a

F=8.38 P=0.0004

F=5.79 P=0.003

Áreas de cría Áreas de cría (cm2) en (cm2) en otoño primavera

t y P

Diferentes literales en una misma columna indican diferencias significativas. Los valores t y probabilidad asociada resultan de la comparación de estaciones del año para cada región.

En el otoño, las áreas de cría fueron mayores en las colonias de la región SSSC que en las otras regiones, mientras que en la primavera, las áreas de cría fueron significativamente mayores en la región SST que en las otras dos regiones (Cuadro 3). El Cuadro 4 muestra que en el otoño hubo significativamente menos miel almacenada en las colmenas de la región SSSC que en las otras regiones. Las áreas de miel almacenada en las colonias de las tres regiones durante la primavera no fueron significativamente diferentes. En el otoño, las áreas de polen fueron mayores en la región SSSC en comparación con las otras dos regiones, mientras que en la primavera, las colonias de la región SST tuvieron áreas significativamente mayores de polen que las colonias de las otras dos regiones.

Cuadro 4: Valores medios de área de panales con miel y abejas melíferas de tres regiones durante la primavera y el otoño Áreas de miel (cm2) en otoño

Áreas de miel (cm2) en primavera

t y P

Áreas de polen (cm2) en otoño

Áreas de polen (cm2) en primavera

t y P

Semiseca templada

8,701474a

6,572320a

t=13.7 P0.0003

1,943304b

2,352286a

t=.98 P=0.32

Subhúmeda templada

7,774561a

7,033609a

t=1,6 P=0.20

1,175159c

1,083196b

t=.27 P=0.60

Semiseca semicálida

2,924351b

7,910530a

t=62.9 P0.0001

2,791310ª

565139b

t=43.1 P0.0001

F=44.55 P0.0001

F=1.88 P=0.15

Región

FyP ab

F=9.32 P=.0002 F=18.64, P0.0001

Diferentes literales en una misma columna indican diferencias significativas. Los valores t y probabilidad asociada resultan de la comparación de estaciones del año.

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Se encontró una correlación positiva y significativa entre el número de abejas y las áreas de cría de las colonias en las dos estaciones del año (otoño: r= 0.79, P<0.001; primavera. r= 0.54, P<0.001, n= 150). La población de abejas en el otoño se correlacionó positiva y significativamente con la población de abejas, áreas de cría y miel registradas en la primavera (r= 0.32, r= 0.36, r= 0.28, respectivamente; n= 150, P<0.0001). Así mismo, el área de cría de las colonias en el otoño se relacionó significativamente con la población de abejas, áreas de cría y miel de la primavera (r= 0.30, r= 0.33, r= 0.26, respectivamente; n= 150, P<0.001). No se encontraron correlaciones significativas entre estaciones respecto a las áreas de polen con los valores poblacionales de las colonias. Estos resultados indican que las condiciones poblacionales y de reservas de miel fueron mejores en la primavera en comparación con lo registrado en el otoño, y que la región SSSC, tuvo mayor población de abejas y áreas de cría a diferencia de la regiones SST y SHT, las cuales se caracterizan por contar con temperaturas, precipitación pluvial y diversidad de especies vegetales inferiores que la región SSSC(5). Considerando las regiones y las épocas del año en conjunto, los resultados mostraron que el tamaño poblacional de abejas y áreas de cría en el otoño, fueron mayores en las colonias ubicadas en la región SSSC en comparación con las otras regiones, y solo durante la primavera las áreas de cría fueron mayores en la región SST. Esto posiblemente se deba principalmente a diferencias entre regiones respecto a las condiciones ambientales como la diversidad de especies vegetales, precipitación pluvial, temperatura y humedad. Por ejemplo, el hecho de que hubiera reservas relativamente altas de polen (fuente de proteínas) en otoño y relativamente bajas en la primavera en las colonias de la región SSSC, pudiera explicar en buena medida, porqué las colonias de esa región tuvieron significativamente más cría y abejas en el otoño comparado con las colonias de las otras regiones. Posiblemente, en otoño la disponibilidad del polen de Verbesina platyptera, Bursera fagaroides y Ipomoea murucoides de la región semiseca semicálida sea mayor que las especies vegetales de las regiones semiseca templda (Bidens odorata, Tithonia tubaeformis y Simsia amplexicaulis) y subhúmeda templada (Mimosa aculeaticarpa, Arctostaphylos pungens y Eysenhardtia polystachya). Cabe destacar, que el mayor tamaño poblacional de abejas y cría en el otoño para las colonias de la región SSSC, no se tradujo en una mayor cantidad de miel almacenada. Se observó que hubo más miel y menos polen en la primavera y más polen y menos miel en el otoño en dicha región que en las regiones SST y SHT, lo cual podría deberse a que la intensidad de flujo de néctar de la floración no fue suficiente para registrar una alta producción de reservas de alimento y al haber más población de abejas se incrementó el consumo de alimentos y consecuentemente se redujeron sus reservas. Posiblemente el mayor tamaño poblacional de abejas y cría no debió ser duradero, ya que con menos alimento disminuiría la población a consecuencia de la reducción de la postura de la reina(12). Si bien pudiera no esperarse una alta producción de miel, la producción de abejas y cría en la región SSSC durante el otoño, 206

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es suficiente para aprovecharse en la formación de núcleos de abejas que tienen un alto valor comercial. Las poblaciones de cría y abejas dependen de las reservas de alimentos en la colonia y de su disponibilidad en el campo(13). Si las reservas y disponibilidad de polen son bajas, habrá menos proteína para la alimentación de las larvas, por lo que la calidad (respecto a tamaño, nutrición y viabilidad) y cantidad de abejas en la siguiente generación (35 días) se puede reducir. Esto a su vez influye negativamente en el desarrollo de la colonia(14,15). Lo anterior concuerda con que en el presente trabajo hubo una relación significativa entre la cantidad de abejas y el área de cría en el otoño y la primavera. El contenido proteico del polen de floraciones en México no ha sido estudiado, sin embargo reportes en otros países revelan amplias variaciones entre especies vegetales (2 al 62 %)(16). Por ello, cuando la colonia no dispone de suficiente polen o el contenido proteico del polen almacenado es menor al 20 %, ésta tiende a colectar mayor cantidad de polen para cubrir sus requerimientos nutricionales, ya que de no lograrlo, se reduce la postura de la reina(17), lo que conlleva a que la colonia no se desarrolle óptimamente. Las diferentes regiones del presente estudio varían en diversidad, distribución y abundancia de especies vegetales, por lo que basándose en la cantidad de polen almacenado, se puede especular que pudiera haber diferente aporte de elementos nutritivos en el polen colectado por las abejas en las distintas regiones. Esto, al menos en parte, pudiera explicar las diferencias encontradas en reservas de polen y cría de las colonias entre regiones y estaciones, y la ausencia de correlación entre las áreas de reservas de polen y el tamaño poblacional (cría y abejas) de las colonias. Sin embargo, esta hipótesis requiere ser probada en futuros estudios. Se ha reportado que la población de abejas y las reservas de alimento de las colonias durante el otoño, influye en el tamaño poblacional durante la primavera(4), lo que a su vez puede repercutir sobre las poblaciones de abejas en el verano y por lo tanto en la productividad de la colonia. Lo anterior coincide con las correlaciones encontradas en el presente estudio, ya que estas sugieren que, al incrementarse la población de abejas, áreas de cría y reservas de miel a mediados del otoño, se incrementarán también dichas condiciones en la primavera. Además, Guzmán-Novoa et al(4), encontraron que el bajo tamaño poblacional y las bajas reservas de alimento se asocian al 69 y 68 % de la mortalidad de colonias durante el invierno, respectivamente. Ambas estaciones analizadas corresponden a épocas de floración y cosecha de miel en el altiplano semiárido de México, pero se observó que con excepción de la región SSSC, las mejores condiciones para el desarrollo de colonias se presentaron en la primavera, ya que en esa estación hubo mayor población de abejas y reservas de polen en las colonias. Las condiciones ambientales y el manejo, son factores variables que influyen significativamente en la sobrevivencia y tamaño poblacional de las colonias de abejas, así

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como en su producción de miel. En Zacatecas se han registrado producciones promedio por floración de 17.5 a 30 kg de miel por colmena(18,19), pero estas producciones muy probablemente pudieran mejorarse. Por ello es indispensable que los apicultores monitoreen el estado sanitario, poblacional y alimenticio de sus colonias en diferentes épocas, para implementar estrategias de manejo previo a la cosecha como el cambio de reinas, control de enfermedades, suplementación alimenticia y movilización de colmenas, previo al flujo de néctar (al menos 45 días). Esto permitirá hacer coincidir el máximo de población de las colonias con el inicio de las floraciones. Las medias poblacionales de aproximadamente 21,000 a 35,000 abejas por colmena encontradas en épocas de floración en el presente estudio, fueron superiores a las reportadas en colonias de Apis mellifera syriaca de Jordania, bajo condiciones semiáridas del mediterráneo(20), y similares a las colonias bajo condiciones tropicales del estado de Chiapas, México(21), pero inferiores a las de Canadá, donde se han registrado poblaciones de más de 50,000 abejas por colonia(2). Se puede inferir que el manejo previo a la cosecha de las colonias estudiadas pudo no ser el adecuado. Esta hipótesis se basa en que a diferencia de las regiones de Chiapas y Canadá, las floraciones del altiplano semiárido de México generalmente se presentan de forma súbita y son de corta duración pero con abundante flujo de néctar, lo cual demanda que los apicultores sean más eficientes en el manejo de sus colonias para aprovechar mejor los recursos florales. El bajo tamaño poblacional observado es entendible, dado que la mayoría de los apicultores en México prefieren no alimentar a las colonias previo a las floraciones y esperan que éstas las fortalezcan (observación personal). Con esa estrategia, las medias de producción tienden a ser bajas, ya que cuando las colonias alcanzan sus poblaciones máximas generalmente sucede al final de las floraciones. Por ello sería recomendable realizar estudios comparativos de productividad entre colonias con manejos alternos que incluyan el cambio de reinas y la alimentación artificial (energética y proteica) previo a las floraciones, así como también el control de enfermedades y parásitos, ya que se sabe que diferentes patologías pueden afectar significativamente la productividad y poblaciones de las colonias de abejas en el altiplano mexicano(19,22,23). Estos estudios permitirían hacer recomendaciones específicas de manejo para elevar la producción de miel y la sobrevivencia de las colonias en el invierno. Se concluye que en comparación con las otras regiones, las condiciones naturales de la región semiseca semicálida ofrecen mejores posibilidades de desarrollo para las colonias de abejas, particularmente durante el otoño, lo cual no necesariamente se traduce en mayor cantidad de miel almacenada, pero pudiera traducirse en mayor cantidad de cría y abejas con fines reproductivos para producir núcleos de abejas. También se concluye que en general, el tamaño de las poblaciones de abejas encontradas en las colonias estudiadas durante dos épocas de floración no son las óptimas para la producción de miel y se propone que pudieran incrementarse con medidas de manejo que sean validadas con estudios científicos.

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Agradecimientos

A Laura Espinosa, José Luis Uribe, Carlos Aréchiga y Ramón Gutiérrez por sus valiosas aportaciones sobre una versión anterior del manuscrito.

Literatura citada: 1.

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210

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211

http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4451 Nota de investigación

Composición botánica y valor nutritivo de la dieta consumida por bovinos en un área invadida por pasto rosado [Melinis repens (willd.) Zizka]

Obed Gabriel Gutiérrez Gutiérreza Carlos Raúl Morales Nietoa* José Carlos Villalobos Gonzálezb Oscar Ruíz Barreraa Juan Ángel Ortega Gutiérreza Jorge Palacio Nuñezc

Universidad Autónoma de Chihuahua. Facultad de Zootecnia y Ecología. Km 1 Perif. Francisco R. Aldama, 31453, Chihuahua, Chih. México. b

Texas Tech University. Lubbock Texas. USA.

Colegio de Posgraduados, Campus San Luis Potosí. México.

*Autor para correspondencia: cnieto@uach.mx

Resumen: Se evaluó la composición botánica y el valor nutricional de la dieta de ganado bovino en áreas invadidas por pasto rosado [Melinis repens (Willd.) Zizka]. La investigación se realizó en el Rancho Salinas, municipio de Satevó, Chihuahua, en un pastizal amacollado arbosufrutescente. La composición botánica del área se determinó por el método de línea de puntos. Los muestreos se realizaron de agosto de 2013 a febrero de 2014 y se utilizaron dos vaquillas fistuladas del esófago de la cruza Hereford-Angus de 350 ± 5 kg. La composición botánica de la dieta se obtuvo mediante la técnica microhistológica y su valor nutricional por análisis bromatológico. Los datos se sometieron a un análisis de varianza; los datos de calidad de la dieta se ajustaron a un modelo mixto mediante el procedimiento PROC MIXED del SAS. El promedio de forraje disponible durante las cuatro etapas fenológicas fue de 1,279 kg MS ha-1, con presencia del pasto rosado del 87.5 % (1,119.13 kg MS ha-1). La dieta seleccionada por el ganado bovino estuvo compuesta por 74 % de gramíneas, 19 % de 212

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arbustivas y 7 % de herbáceas. Las especies preferidas fueron Aristida divaricata (8.43) y Croton pottsii (12.95) durante la etapa de crecimiento; el menor índice de preferencia fue para Melinis repens (0.33 a 0.41). El mayor contenido de proteína cruda se obtuvo durante las etapas de crecimiento (13.23 %) y floración (10.71 %). La mejor calidad de la dieta se presentó durante las etapas de crecimiento y floración, y estuvo compuesta principalmente por Melinis repens en las cuatro etapas. Palabras clave: Índice de preferencia, Consumo voluntario, Melinis repens.

Recibido: 25/03/2017 Aceptado: 06/03/2018

La producción de carne en los sistemas extensivos depende principalmente de la cantidad y calidad de los pastos presentes en los agostaderos y representan el alimento más barato para el ganado. En el norte de México las precipitaciones se presentan por lo regular durante los meses de junio a septiembre (80 %), esto provoca que las mayores ganancias de peso y rentabilidad del sistema ocurran durante esta época(1). Una de las actividades económicas más importantes para los ganaderos en el estado de Chihuahua es el sistema vaca-cría, el cual consiste en la producción de becerros para exportación(2,3). Sin embargo, en los últimos años la ganadería ha sufrido pérdidas por sequía y mal manejo del pastizal; el resultado ha sido una pérdida en la producción del pastizal y una disminución del hato ganadero; esto debido a ventas forzadas y sacrificio del ganado en mala condición(4,5). Además, extensas áreas del pastizal han sufrido cambios en su estructura debido a la introducción e invasión de especies no nativas, las cuales están provocando un impacto ecológico por la pérdida de especies forrajeras nativas(6,7). El pasto rosado (Melinis repens) es una especie oportunista que se ha extendido en los últimos 30 años a lo largo del territorio mexicano(7), ya que se establece rápidamente y desplaza especies nativas de importancia ganadera, ecológica y económica(8). Su valor forrajero va de regular a malo durante la época de latencia, donde puede alcanzar valores de proteína cruda (PC) del 4 %(7). No obstante, se desconoce el grado de preferencia por los animales en pastoreo. En Chihuahua, esta especie se ha desplazado del centro-sur hacia el norte del Estado y se localiza principalmente en lugares que han sido degradados por el sobrepastoreo y en tierras abandonadas que fueron abiertas al cultivo. Los estudios de dietas de bovinos en pastoreo realizados en Chihuahua, datan de la década de los años 80s; dichos estudios se ubicaron en áreas de la región centro-norte y en épocas donde los procesos de invasión del M. repens estaban en una etapa incipiente o aún no se encontraba presente(9,10,11). El conocimiento de la composición de la dieta, así como el aporte 213

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nutricional de las plantas forrajeras en áreas invadidas, puede ayudar a diseñar y ejecutar esquemas de uso y manejo, tanto del pastizal como de los animales en pastoreo. Diversas técnicas se han utilizado para conocer la composición botánica de la dieta de ganado bovino en pastoreo. Una de estas técnicas es la microhistológica, que permite identificar y cuantificar la composición botánica de la dieta consumida(11,12). Además, el conocimiento del valor nutricional de la dieta del ganado bovino en pastoreo, es importante para establecer la suplementación necesaria durante la época crítica, que no cubre los requerimientos de los animales. Por lo anterior, y debido a que se carece de información sobre pastizales invadidos con M. repens(13), se planteó la presente investigación cuyo objetivo fue evaluar la composición botánica y valor nutricional en la dieta de bovinos en pastoreo en un área invadida por M. repens. La presente investigación se realizó en el Rancho “Salinas”, ubicado en el municipio de Satevó, Chihuahua, localizada a 27° 57’ 00” N y 106° 07’ 00” O y 1,540 msnm. Temperatura media anual de 18.1 °C y precipitación promedio anual histórica de 464 mm(14). Sin embargo, en el año 2013 de acuerdo a CONAGUA(15) hubo una precipitación promedio de 550 mm. La precipitación durante el año de estudio se distribuyó principalmente de julio a septiembre y noviembre (Figura 1). Su clasificación climática según Köppen es BWh(16). Los suelos son someros (0 a 25 cm), drenaje interno regular y pH de 5.3 a 6.6(16).

Figura 1: Precipitación (mm) promedio en el año 2013 durante el período de estudio(14) 250

Precipitación (mm)

200 150 100 50 0 E

Meses

El área de estudio tiene una extensión de 200 ha con un coeficiente de agostadero de 4 ha UA-1, el cual se determinó con base en la cantidad de forraje utilizable (1,470 kg ha-1) y los requerimientos del tipo de animal(10,17). Esta área se seleccionó por ser representativa de los pastizales invadidos con M. repens. El tipo de vegetación es un pastizal amacollado 214

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arborescente con invasión de M. repens y presencia de especies arbustivas como Mimosa biuncifera, Prosopis glandulosa y gramíneas como Bouteloua gracilis, Bouteloua curtipendula, entre otras (Cuadro 1)(16,18).

Cuadro 1: Composición botánica general en el área de estudio durante la etapa de crecimiento Gramíneas

Cobertura (%)1

Arbustivas

Cobertura (%)1

Herbáceas

Cobertura (%)1

Bouteluoa curtipendula

0.41

Aloysia wrightii

1.46

Bulbostilis juncoides

0.63

Bouteluoa gracilis

2.50

Calliandra eriophylla

9.60

Dichondria argentea

0.41

Melinis repens

63.72

Condalia sp. Juniperus monosperma

0.21

Mimosa biuncifera

1.67

Prosponis glandulosa

2.50

Macrosiphonia hypoleuca

0.21

Tecoma stands

0.21

Millia biflora

0.62

Sida procumbens

3.76

Croton pottsii

1.00

1.25

Euphorbia sp. Evolvolus alsynoides Haploppapues gracilis

0.21 9.60 0.21

Determinada mediante el método de puntos de intercepción (18).

Para determinar tanto la composición botánica de la dieta como la calidad de la misma, se realizaron cuatro muestreos (agosto de 2013 a febrero de 2014), correspondientes a las etapas fenológicas de las gramíneas (crecimiento, floración, madurez y latencia) presentes en el área (Cuadro 2). El primer muestreo se realizó durante la etapa de crecimiento (3 al 7 de agosto); el segundo durante la etapa de floración (1 al 5 de octubre); en la etapa de madurez el muestreo se realizó del 3 al 7 de diciembre; y el muestreo de la etapa de latencia se realizó del 1 al 5 de febrero del 2014. Para estos muestreos se utilizaron dos vaquillas con peso promedio de 350 ± 5 kg de la cruza Hereford y Angus, fistuladas (fístula marca Bar Diamond) del esófago(19,20,21). Holechek(12) menciona que en pastizales donde la vegetación es muy homogénea se puede obtener la composición botánica con dos animales durante dos a tres días; debido a lo anterior, se utilizaron dos animales fistulados y se dio un periodo de pastoreo de 5 días.

215

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Cuadro 2: ComposiciĂłn botĂĄnica (%) de gramĂneas presentes en el ĂĄrea de estudio Etapas de muestreo

Especies

Crecimiento

FloraciĂłn

Madurez

Latencia

0.571

--2

0.611

Bothriochloa barbinodis

4.12

1.15

0.81

Bouteloua chondrosioides

4.67

0.37

0.99

Bouteloua curtipendula

9.58

7.61

3.26

3.60

Bouteloua gracilis

10.15

7.35

4.89

3.49

Bouteloua hirsuta

2.44

1.75

1.32

Heteropogon contortus

1.01

1.48

Leptochloa dubia

1.11

0.90

Muhlenbergia phleoides

1.01

0.61

0.86

79.68

71.68

86.96

85.94

Aristida divaricata

Melinis repens 1

Valores calculados con base en la producciĂłn de biomasa. 2 No observado en la lectura.

A los animales se les dio un periodo de adaptaciĂłn de tres dĂas en el ĂĄrea de estudio antes de cada muestreo. Los animales se dietaron por la noche para evitar la contaminaciĂłn de muestras. Estos fueron colocados durante la maĂąana en el ĂĄrea de estudio durante 45 a 60 min; transcurrido este periodo las bolsas fueron retiradas con la muestra recolectada. Las muestras se trasladaron al laboratorio de nutriciĂłn animal de la Facultad de Zootecnia y EcologĂa; para su secado se colocaron en una estufa de aire forzado a 60 Â°C por 72 h, y se molieron en un molino WileyÂŽ con malla de 1 mm (Arthur H. Tomas, Philadelphia, PA, USA)(22,23). Rendimiento de materia seca. Para estimar el rendimiento de materia seca (kg MS ha-1) se seleccionaron al azar 25 puntos y se utilizĂł un cuadrante de 0.25 m2 para realizar los cortes de forraje. Las gramĂneas (se separaron por especie) que se encontraban dentro de cada cuadrante se cortaron a ras del suelo. Las muestras de forraje se colocaron en una estufa a 75 Â°C durante 72 h para su secado y posterior pesaje en el Laboratorio de NutriciĂłn Animal de la FZyE-UACH. Con los pesos obtenidos se calculĂł el porcentaje de cada especie, durante las cuatro etapas fenolĂłgicas. Para el pesaje se utilizĂł una bĂĄscula marca Tor Rey L-EQ y el peso seco obtenido se extrapolĂł a producciĂłn de MS por hectĂĄrea, utilizando la siguiente fĂłrmula: MS ha-1=

đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018; đ?&#x2018;&#x153; đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2019; đ?&#x2018;&#x2122;đ?&#x2018;&#x17D; đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;˘đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018; đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x17D; đ?&#x2018; đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x17D; (đ?&#x2018;&#x201D;)â&#x2C6;&#x2014;4 1000 đ?&#x2018;&#x201D;

216

â&#x2C6;&#x2014; 10,000

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ComposiciĂłn botĂĄnica del ĂĄrea. La composiciĂłn botĂĄnica se midiĂł de dos maneras: en el primer caso se realizĂł un estudio general de la vegetaciĂłn presente en el mes de julio mediante la tĂŠcnica de lĂneas de puntos(18), con la finalidad de tener una referencia de las especies presentes en el ĂĄrea de estudio. Lo anterior, debido a que las arbustivas no cambian su composiciĂłn durante las diferentes etapas, por lo cual, solo se midieron durante el mes de julio(17). En el segundo caso se midiĂł la presencia y ausencia de las gramĂneas durante cada fecha de muestreo, con la ayuda de un cuadrante de 0.25 m2. ComposiciĂłn botĂĄnica de la dieta. La identificaciĂłn de los tejidos vegetales de las especies presentes en la dieta del ganado, se realizĂł mediante el uso de la tĂŠcnica microhistolĂłgica modificada por PeĂąa y Habib(11); la cual considera la lectura de cinco laminillas y 20 campos en cada una de ĂŠstas. El trabajo se desarrollĂł en el laboratorio de Agua-Suelo-Planta del Colegio de Posgraduados (COLPOS), Campus SLP. Ă?ndice de preferencia. Para los animales en pastoreo, el Ăndice de preferencia de las especies presentes en el ĂĄrea de estudio, se estimĂł mediante la composiciĂłn botĂĄnica de la dieta y la composiciĂłn botĂĄnica del ĂĄrea y se utilizĂł la fĂłrmula propuesta por Van Dyne y Heady(24). IP =

ComposiciĂłn botĂĄnica de la dieta ComposiciĂłn botĂĄnica del ĂĄrea

Los valores altos significan mayor preferencia por el ganado y valores pequeĂąos significa menor preferencia. ComposiciĂłn quĂmica de la dieta. Las muestras recolectadas se colocaron en una estufa para su secado y posterior molido. DespuĂŠs de la preparaciĂłn de las muestras (30 por cada periodo de muestreo), se realizaron anĂĄlisis quĂmicos para determinar proteĂna cruda y digestibilidad in vitro. Estos se realizaron en el laboratorio de nutriciĂłn animal de la FZyE-UACH. El contenido de proteĂna cruda (PC) se determinĂł por el mĂŠtodo Kjeldahl: la cantidad de nitrĂłgeno (N) en la muestra se multiplica por el factor 6.25(22). AdemĂĄs, la materia orgĂĄnica digestible in vitro se determinĂł en el analizador Daysi II, siguiendo la metodologĂa propuesta por AnkomÂŽ (Ankom Technology, Fairport, NY, USA)(23). Para las concentraciones de fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ĂĄcido (FDA) se utilizĂł la metodologĂa propuesta por Van Soest et al(25). Para realizar el anĂĄlisis estadĂstico de la composiciĂłn botĂĄnica de la dieta, se incluyĂł Ăşnicamente la categorĂa: gramĂneas, herbĂĄceas y arbustivas. Los datos se sometieron a un anĂĄlisis de varianza en un diseĂąo completamente al azar (Îą= 0.05), utilizando el procedimiento MIXED del programa SAS(26). La ecuaciĂłn del modelo estadĂstico utilizado fue: đ?&#x2018;Śđ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; = Âľ + đ?&#x2018;&#x192; đ?&#x2018;&#x2013; + đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014;

217

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Donde: 𝒚𝒊𝒋 = valor de la variable respuesta (cada especie y las agrupaciones) observado en el i-ésimo estado fenológico; µ= efecto de la media general; 𝑷 𝒊 = efecto fijo del i ésimo estado fenológico; 𝒆𝒊𝒋 = término del error aleatorio asociado a las observaciones, donde 𝑒𝑖𝑗 ~𝑁𝐼𝐼𝐷(0, 𝜎 2 ). Los datos de la composición química se analizaron por varianza, ajustando un modelo mixto mediante el procedimiento PROC MIXED del SAS(26), con la ecuación: 𝑦𝑖𝑗𝑘 = µ + 𝑃 𝑖 + 𝑉𝑗 + 𝜃𝑖𝑗 + 𝑒𝑖𝑗𝑘 Donde: 𝒚𝒊𝒋𝒌 = valor de la variable respuesta (MO, PC, DivMO, FDN, FDA) observado en el i-ésimo estado fenológico en el j-ésimo animal fistulado; µ= efecto de la media general; 𝑷 𝒊 = efecto fijo del i ésimo estado fenológico; 𝑽𝒋 = efecto aleatorio del j ésimo animal fistulado; 𝜽𝒊𝒋 = efecto aleatorio de la interacción entre el i ésimo estado fenológico y el j ésimo animal fistulado; 𝒆𝒊𝒋𝒌 = término del error aleatorio asociado a las observaciones, donde 𝑒𝑖𝑗𝑘 ~𝑁𝐼𝐼𝐷(0, 𝜎 2 ). Cuando se observó efecto significativo (P<0.05) del estado fenológico, la prueba de diferencia mínima significativa (LSD), se utilizó para la comparación (α = 0.05) de medias. Los rendimientos de materia seca fueron diferentes (P<0.05) entre etapas (Figura 2). En la etapa de latencia se presentó la mayor producción (2,119 kg MS ha-1), debido tal vez a la humedad residual de las precipitaciones ocurridas durante el mes de noviembre. Además, en la Figura 3 se presenta la información del rendimiento de forraje de M. repens, ya que fue la especie que presentó rangos desde 72.38 hasta 88.55 % en la composición botánica del área. Sin embargo, en otra investigación(27) reportan producciones de materia seca de 2,913 kg ha-1 en pastizales invadidos por M. repens en un año lluvioso en Aguascalientes, México; no obstante, durante años secos se obtuvieron producciones de 1,488 kg ha-1. Lo anterior demuestra que la cantidad de precipitación y humedad en el suelo son factores importantes a considerar. Durante el año de estudio se presentó una precipitación promedio en el área de 218

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estudio de 510 mm (considerada atípica), cuando el promedio histórico anual para estas áreas es de 462.4 mm(14). Figura 2: Medias de cuadrados mínimos para rendimiento total y rendimiento del Melinis repens (kg MS ha-1), durante las etapas fenológicas 2500.00

Total

Pasto Rosado

c d

Producción, Kg MS ha-1

2000.00

1500.00

c b

1000.00

500.00

0.00 1

Muestreo abcd

Literales diferentes entre columnas indican diferencia estadística (P<0.05).

En el Cuadro 3 se muestran las especies consumidas por el ganado en pastoreo en las diferentes etapas de muestreo; durante la etapa de latencia M. repens fue la especie de mayor contenido en la dieta (35.5 %), comparado con las etapas de crecimiento, madurez y floración (27, 29 y 29 %, respectivamente). El contenido de esta gramínea invasora en la dieta mostró diferencia (P<0.05); ello pudo deberse a que se presentó rebrote durante la época de latencia, el cual fue consumido por el ganado. Además, otros estudios reportan que la abundancia de una especie en un área determinada, puede tener influencia en la dieta de animales en pastoreo(28,29). La dieta consumida por el ganado bovino pastoreando áreas invadidas con M. repens, estuvo constituida principalmente por gramíneas (74.05 ± 1.66 %), durante las cuatro etapas fenológicas. Estos resultados son congruentes con lo reportado por otros autores(30), quienes señalaron que las gramíneas constituyen el alimento principal del ganado bovino en pastoreo.

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Cuadro 3: Composición botánica (%) de la dieta de ganado bovino en un área invadida con Melinis repens Especie

Etapas de muestreo Floración Madurez

Crecimiento

Gramíneas Aristida divaricata Bothriochloa barbinodis Bouteloua chondrosioides Bouteloua curtipendula Bouteloua gracilis Bouteloua hirsuta Heteropogon contortus Leptochloa dubia Muhlenbergia phleoides

Latencia

4.81a 0.74a 4.06a 8.84a 9.23a 2.38a 0.36a 0.36a 0.71a 26.67a

5.01a 3.29b 4.96a 10.14a 13.59b 4.24b 2.86b 3.72b 2.87a 29.27a

4.63a 3.39b 6.02a 11.19a 12.07ab 3.85b 3.01b 2.58b 1.77a 28.86a

58.16a

79.95b

77.37b

12.95a 12.95

5.54b 5.54

4.72b 4.72

4.19b 4.19

Arbustivas Calliandra eriophylla Prosopis glandulosa

15.85a 13.03a

Total

28.88a

8.58b 5.93b 14.51b

11.08ab 6.83b 17.91b

8.95b 6.13b 15.08b

Melinis repens Total Herbáceas Croton pottsii Total

3.17a 3.63b 4.97a 11.12a 10.87ab 4.08b 2.37b 2.71b 2.29a 35.53b 80.74b

Medias con diferente literal en hileras indican diferencia estadística (P<0.05).

Melinis repens fue la especie que presentó el menor índice de preferencia (desde 0.33 hasta 0.41) durante las cuatro etapas, a pesar de su alta densidad en el área de estudio. Sin embargo, Bouteloua chondrosioides presentó un índice alto (16.26) durante la madurez, mientras que Aristida divaricata presentó un índice de 8.43 durante la etapa de crecimiento (Cuadro 4). A pesar de la baja densidad de estas especies en el área de estudio, presentaron los índices de preferencia más altos. Este comportamiento es respaldado por estudios previos(28,31), donde se observa que las especies que presentaron mayor índice de preferencia, fueron las de menor presencia en el área de estudio.

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Cuadro 4: Índice de preferencia en un área invadida por Melinis repens Etapas de muestreo

Especie

Crecimiento

Floración

Madurez

Latencia

8.431a --0.92a 0.91a ----0.34a

--2 0.80a 1.06a 1.33a 1.85b 1.74a -3.36a 2.84a 0.41a

-2.95ab 16.26b 3.43b 2.47bc 2.20ab 2.98a -2.91a 0.33a

5.19a 4.49b 5.02a 3.09b 3.11c 3.09b 1.60a 3.01a 2.66a 0.41a

Herbáceas Croton pottsii

12.95a

5.54b

4.72b

4.19b

Arbustivas Calliandra eriophylla Prosopis glandulosa

1.65a 5.21a

0.89b 2.37b

1.15ab 2.73b

0.93ab 2.45b

Valores altos, representan alta preferencia por el ganado. No consumido por el ganado o no observado en la lectura. abc Medias con diferente literal en hileras indican diferencia (P<0.05). 2

El contenido de proteína cruda (PC) fue diferente (P<0.05) entre etapas fenológicas. Los mayores valores se encontraron durante la etapa de crecimiento y floración (13 y 11 %, respectivamente). En contraste, los valores más bajos se encontraron durante la etapa de latencia (6.5 %; Cuadro 5). Sin embargo, en otro estudio reportan valores de PC de 10.49 % durante el verano y 5.49 % durante la primavera; por lo que se puede atribuir que los animales no cubren sus requerimientos nutricionales(32). Además, otros autores reportan que el ganado bovino durante la época de lluvias, puede cubrir sus requerimientos mínimos de mantenimiento en el norte de México, esto debido a la fenología que presentan los pastos(33); sin embargo, durante el invierno los nutrientes disminuyen, lo cual provoca que no cumplan sus requerimientos durante esta época(34). Los valores de PC registrados en la presente investigación durante la etapa de crecimiento y floración, se debieron probablemente al consumo de especies con valores altos de PC, tales como Bouteloua gracilis y Bouteloua curtipendula; arbustivas como Prosopis glandulosa y Calliandra eriophylla y la herbácea Croton pottsii(35,36,37). Además, la temporada es otro factor a considerar en estudios de esta 221

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naturaleza(38). Por lo anterior, se puede asumir que los valores reportados de PC no se debieron al consumo de Melinis repens, ya que esta especie presenta valores de PC desde 4 hasta 6 %(7).

Cuadro 5: Medias (±EE) de la composición química de la dieta consumida por bovino en pastoreo en un área invadida por Melinis repens, durante las etapas fenológicas Etapa fenológica Floración Madurez

Variable (%)

Crecimiento

13.76±0.92ª

10.72±0.92b

8.61±0.92bc

6.559±0.92c

MO DivMO FDN FDA

85.86±0.607a 41.36±1.86a 70.71±1.54a 42.80±1.38a

85.95±0.607a 38.53±1.86a 71.19±1.54a 42.46±1.38a

81.39±0.607b 43.08±1.86a 71.02±1.54a 47.74±1.38a

81.10±0.607b 36.56±1.86a 72.64±1.54a 42.70±1.38a

Latencia

PC= proteína cruda; MO= materia orgánica; DivMO= digestibilidad in vitro de la materia orgánica. FDN: FDA= fibra detergente neutro y ácido. abc Medias con diferente literal en hileras indican diferencia (P<0.05).

La DivMO fluctuó entre 36.56 y 43.08 % (P>0.05; Cuadro 5). Lo anterior se puede deber al cambio estructural de las gramíneas, hierbas y arbustivas durante el desarrollo de las plantas, lo cual afecta la cantidad de tejidos digestibles(39). Otros autores han reportado valores desde 52.3 hasta 54.9 % en áreas invadidas por Melinis repens durante la época de latencia(13). Este resultado concuerda con lo reportado en otro trabajo, donde se reportan valores de DivMO de 67.34 y 58.23 % en verano y primavera, respectivamente(32). En el Cuadro 5 se muestran los datos obtenidos para fibra detergente neutro (FDN), donde no se encontraron diferencias (P>0.05); sin embargo, fueron diferentes a los obtenidos en otro estudio(32), donde se reportaron valores desde 64 hasta 74 % de FDN en un pastizal con presencia de Melinis repens. También, otros investigadores(40,41) reportaron valores desde 69.2 hasta 70.1 %, similares a los obtenidos en esta investigación. Además, Murillo(42) reporta valores de FDN (70.4 %) similares a los obtenidos en este estudio, durante la época de latencia. De la misma manera se obtuvo la FDA, donde no se encontraron diferencias (P>0.05). Sin embargo, otros autores reportan valores mayores a los obtenidos en este estudio(32). A mayor madurez el contenido de polisacáridos lignificados se incrementa y por tanto el valor de la FDA también se incrementa(43). Debido a lo anterior, probablemente los valores de FDA en la dieta obtenidos en la presente investigación, oscilaron desde 42.7 hasta 47.74 %. Un estudio reciente(41) reporta valores de FDA (42.3 %) similares a los obtenidos en este estudio.

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La composición botánica de la dieta estuvo constituida principalmente por Melinis repens durante las cuatro etapas fenológicas, ya que ésta fue la gramínea más abundante en el área de estudio. Las gramíneas fueron preferidas por los animales durante las cuatro fechas de muestreo y sólo se presentó una herbácea (Croton pottsii) durante el muestreo. Los mayores índices de preferencia para M. repens se obtuvieron durante las etapas de latencia y floración. El valor nutricional de la dieta de bovinos en pastoreo en áreas invadidas por Melinis repens, no satisface las necesidades requeridas para producción y mantenimiento durante las fechas de madurez y latencia. Es conveniente realizar estudios enfocados a la planeación y diseño de esquemas de utilización en pastizales invadidos con especies exóticas.

Agradecimientos

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), a la Universidad Autónoma de Chihuahua (UACH) y a la Fundación Produce Chihuahua por su apoyo financiero. Además, al Colegio de Posgraduados por permitir el uso de las instalaciones para la realización del trabajo de investigación.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4327 Nota de investigación

Dosis letal media (DL50) y reducción de crecimiento (GR50) por irradiación gamma en pasto garrapata (Eragrostis superba) Alan Álvarez-Holguína,b Carlos Raúl Morales-Nietob* Carlos Hugo Avendaño-Arrazatec Raúl Corrales-Lermab Federico Villarreal-Guerrerob Eduardo Santellano-Estradab Yaudiel Gómez-Simutad a

Instituto del Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Campo Experimental La Campana. Carretera Chihuahua-Ojinaga, Km 33.3. Aldama, Chihuahua, México. b

Universidad Autónoma de Chihuahua. Facultad de Zootecnia y Ecología. Perif. Francisco R. Almada, Km 1. 31000 Chihuahua, Chihuahua, México. c

Instituto del Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Campo Experimental Rosario Izapa, Chiapas. México. d

SENASICA. Departamento de Irradiación; complejo MOSCAMED-MOSCAFRUT, Metapa de Domínguez, Chiapas. México. *Autor de correspondencia: cnieto@uach.mx.

Resumen: La radiación gamma puede ser utilizada como agente mutagénico para inducir variabilidad genética en especies vegetales. No obstante, antes de comenzar un programa de mejoramiento mediante mutagénesis, es necesario establecer la dosis de irradiación adecuada. El objetivo fue determinar la dosis letal media (DL50) y de reducción media del crecimiento (RC50) en pasto garrapata (Eragrostis superba Peyr.). Para ello, se irradió semilla con dosis de 0 (tratamiento testigo), 100, 200, 300, 450, 600, 900, 1400, 2000 y 4000 Gray. Las variables evaluadas fueron porcentaje de germinación, índice de velocidad de germinación, longitud de plúmula, longitud de radícula, 227

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rendimiento de forraje, producción de semilla, proporción hoja-tallo e índice de concentración de clorofila. Los datos se analizaron por regresión y comparación de medias con la prueba de Dunnett. Con la ecuación de regresión resultante se calculó la DL50 y RC50 para cada variable. Con estos valores se obtuvo una media ponderada, donde la DL50 se ponderó con 30 % y las RC50 con 10 %. En general, todas las características evaluadas se vieron afectadas por la irradiación (P<0.05), y su comportamiento se ajustó a modelos lineales y cuadráticos (P<0.05), lo cual permitió determinar la DL50 y las RC50. Para el mejoramiento genético del pasto garrapata, se recomienda utilizar la ponderación de ambos parámetros, la cual se obtuvo a los 2,486 Gy. Los resultados de este estudio permitirán la implementación de programas de mejoramiento genético por mutagénesis en pasto garrapata. Palabras clave: Cobalto 60, Rayos gamma, Mutaciones, DL50, RC50.

Recibido: 15/11/2016 Aceptado: 01/05/2018

La dosis letal media (DL50) y la de reducción del crecimiento (RC50) son parámetros utilizados para seleccionar la dosis de irradiación adecuada, para inducir mutaciones en programas de mejoramiento genético vegetal. Lo anterior con la finalidad de inducir cambios genéticos y fenotípicos que permitan seleccionar plantas con características que no se encuentran en la naturaleza. Diversos investigadores concuerdan que en dosis donde muere el 50 % de los individuos irradiados, es donde existe mayor probabilidad de producir mutaciones útiles para programas de mejoramiento genético(1-4). Así mismo, otros investigadores han señalado que además de la DL50, otra dosis con alta probabilidad de producir mutaciones efectivas es donde se reduce el crecimiento en un 50 % (RC50)(5,6). Cabe señalar que ambos parámetros (DL50 y RC50) se basan en el supuesto de que en dosis bajas de radiación los impactos en el genoma son mínimos y difícilmente se reflejan en cambios fenotípicos, mientras que con dosis altas, el genoma sufre múltiples impactos que regularmente producen aberraciones o cambios negativos(7,8). Por lo anterior, el primer paso para el mejoramiento genético a través de mutagénesis con radiación gamma, es conocer la DL50 y la RC50. En México la mayor parte de los pastizales de zonas áridas y semi áridas se encuentran degradados debido al sobrepastoreo y otras prácticas antropogénicas(9). Lo anterior, ha provocado una disminución en la cobertura vegetal, grandes extensiones de suelo desnudo y pérdida de biodiversidad, lo cual ha menguado la funcionalidad y productividad de estos ecosistemas. Una alternativa para rehabilitar estos ecosistemas degradados es la resiembra de pastos, dentro de la cual se recomienda utilizar vegetación nativa. No obstante, en áreas con alto grado de degradación

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este tipo de vegetación tiene problemas para establecerse. Ante esto, una alternativa es utilizar especies introducidas de mayor rusticidad y capacidad de establecimiento, como es el pasto garrapata (Eragrostis superba). Esta especie es considerada como una de las de mayor potencial para ser utilizadas en programas de rehabilitación de pastizales(10), ya que posee mayor capacidad de establecimiento que especies nativas utilizadas en este tipo de programas, como el pasto banderita (Bouteloua curtipendula), navajita (Bouteloua gracilis) e incluso de introducidas como el llorón (Eragrostis curvula)(11). Sin embargo, presenta menor valor nutricional y rendimiento de forraje que otros pastos introducidos como buffel (Pennisetum ciliare), klein (Panicum coloratum) y el mismo llorón(12). Debido a esto, el pasto garrapata puede ser considerado para someterse a un programa de mejoramiento genético. No obstante, por ser una especie introducida, probablemente en México existe poca variabilidad genética de esta especie. En este sentido, la mutagénesis puede ser una alternativa para el mejoramiento genético del pasto garrapata, ya que ha demostrado ser una técnica viable para inducir variabilidad en gramíneas(13,14,15). Sin embargo, a la fecha se desconoce la dosis con mayor probabilidad de producir mutaciones efectivas en esta especie. Por lo anterior, el objetivo fue determinar la DL50 y la RC50 en pasto garrapata, para con esto establecer la dosis óptima de irradiación gamma para inducir mutagénesis en esta especie. El experimento se llevó a cabo en condiciones de laboratorio e invernadero. Se irradió semilla de pasto garrapata variedad Palar; importada de la empresa Curtis & Curtis, ubicada en Clovis, Nuevo México, EUA. Se evaluaron 9 dosis de irradiación y un testigo: 0 (testigo), 100, 200, 300, 450, 600, 900, 1400, 2000 y 4000 Gray (Gy). Los tiempos de exposición para las dosis evaluadas se determinaron utilizando el sistema Gafchromic dosimetry y una cámara de ionización marca RADCAL modelo Acudose No. de serie 4094118, USA. La irradiación de la semilla se realizó en el Complejo MOSCAFRUT SAGARPA//IICA en Metapa de Domínguez, Chiapas, México en colaboración con el Campo Experimental Rosario Izapa, Chiapas del INIFAP. Las dosis se aplicaron dentro de un irradiador panorámico tipo Gamma Beam Modelo GB-127 MDS Nordion, con fuente de almacenamiento en seco, con una actividad de 15,000 Curies de 60Co. El diseño experimental utilizado para esta prueba fue un completamente al azar con 10 tratamientos de irradiación y cuatro repeticiones por cada dosis, considerándose como unidad experimental cada caja Petri de 90 mm de diámetro provistas de algodón y papel filtro con 50 semillas por repetición. Las cajas Petri se humectaron con 25 ml de agua al inicio de la prueba, y posteriormente se suministraron riegos por aspersión de 2.0 ml cada dos días, durante los 15 días que duró la prueba. Las cajas Petri se colocaron en una incubadora Precision Scientific, modelo 6M a temperatura de 28 ± 2 °C. Se consideró semilla germinada aquella que alcanzó 0.5 cm de plúmula o de radícula(16). Las variables evaluadas fueron porcentaje germinación (PG), índice de velocidad de germinación (Vge), longitud de plúmula (LP) y de radícula (LR). Para obtener LR y LP se dejaron crecer tres plántulas por caja Petri durante siete días después de germinadas. La Vge se calculó mediante la ecuación(16): Vge=∑ ni/t

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Donde: Vge = velocidad de germinación, n¡ = número de semillas germinadas por día, t = día de la germinación. Para la evaluación de la emergencia y desarrollo de la planta se utilizó un diseño experimental de bloques al azar con 10 repeticiones por tratamiento, estableciendo los bloques perpendicularmente a la intensidad de luz solar durante el día. Se sembraron 20 semillas por maceta para asegurar emergencia y establecimiento; sin embargo, solamente se dejó una planta por maceta. La siembra se realizó en bolsas de polietileno negro de 26 cm de altura por 18 cm de diámetro, perforadas en la parte inferior. Las bolsas se llenaron con 23 cm de suelo franco-arenoso de origen aluvial. Los riegos se suministraron hasta punto de saturación cada dos o tres días, según el desecamiento del suelo. La prueba se realizó por 16 semanas durante los meses de abril a agosto. Las variables evaluadas fueron rendimiento de forraje (RF), producción de semilla (PS), proporción tallo hoja (PTH) e índice de concentración de clorofila (ICC). Para el PS se recolectó la totalidad de la semilla de cada planta y se colocó en bolsas de papel. Para el RF la biomasa se cortó a 5 cm del suelo. Posteriormente, se separaron los tallos y las hojas y se colocaron en bolsas de papel. Las muestras extraídas tanto de forraje como de semilla se secaron en una estufa a 65 °C durante 72 h. Una vez secas las muestras se pesaron en una balanza analítica de la marca Viper BC, Mettler. El ICC se midió en la parte media de cinco hojas seleccionadas al azar con un medidor de la marca OptiSciences, modelo CCM-200. Para asegurar los rangos de temperatura (T) y humedad relativa (HR) que requiere el pasto garrapata, se realizaron mediciones dentro del invernadero con una sonda modelo HMP60 (Vaisala, Woburn, MA, USA). Estos datos se registraron cada segundo y fueron promediados cada minuto en un datalogger CR1000 (Campbell Scientific Inc., Logan, UT, USA). La T media durante el experimento fue de 26.7 ± 5.6 °C, con una mínima de 17.1 y máxima de 44.7 °C. La HR media fue de 52.0 ± 16.8 %. Los datos se analizaron mediante análisis de regresión para cada variable. Con la ecuación de regresión resultante del porcentaje de germinación se estimó la dosis letal media (DL50). Por este mismo procedimiento, se estimó la reducción media del crecimiento (RC50) de las variables índice de velocidad de germinación, longitud de plúmula, longitud de radícula, rendimiento de forraje, peso de semilla, proporción tallo hoja e índice de concentración de clorofila. Adicionalmente, todos los datos se sometieron a un análisis de varianza y comparación de medias con la prueba de Dunnett, donde el factor de influencia fue la dosis de radiación con un nivel de significancia de 0.05 (α=0.05). Los análisis se realizaron con los procedimientos REG y GLM del paquete estadístico SAS 9.1.3(17). Con los resultados de la DL50 y las RC50 obtenidas de las ocho variables, se obtuvo una media ponderada. Ponderándose, la DL50 con un 30 % y las RC50 con un 10 % para las demás variables (PG, Vge, LP, LR, RF, PS, PTH e ICC). Esto para obtener un solo valor y con ello establecer la dosis optima de irradiación gamma para inducir mutagénesis en pasto garrapata. El porcentaje de 230

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germinación fue la variable a la que se le asignó mayor ponderación, debido a que la muerte del individuo indica el daño máximo que puede producir la radiación. El comportamiento del PG mostró una tendencia cuadrática (P=0.008). Además, todas las dosis de radiación presentaron diferencias (P<0.05) con respecto al tratamiento testigo (T-0). En términos generales el PG tendió a disminuir conforme aumentó la dosis de irradiación (Figura 1a). La ecuación de regresión indica que la DL50 en pasto garrapata se presenta a 1,529.1 Gy. De manera similar, la Vge mostró una tendencia cuadrática (P=0.001) y todos los tratamientos de irradiación presentaron diferencias (P<0.05) con el T-0. También, la Vge disminuyó conforme se incrementó la dosis de radiación (Figura 1b). De acuerdo con la ecuación de regresión, en esta variable la RC50 se encontró a los 805.3 Gy. Figura 1. Efecto de diferentes dosis de irradiación con CO60 sobre el porcentaje de germinación (a), índice de velocidad de germinación (b), longitud de plúmula (c) y longitud de radícula (d) de pasto garrapata (Eragrostis superba)

La LP presentó una tendencia lineal negativa (P<0.0001). No obstante, solamente las dosis de 2000 y 4000 Gy presentaron menor LP (P<0.05) que T-0 (Figura 1c). Según la ecuación de regresión, en esta variable la RC50 se ubicó en los 3,905.3 Gy. Así mismo LR mostró una tendencia cuadrática

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(P<0.0001). Para esta variable solamente los tratamientos 900, 1400, 2000 y 4000 Gy tuvieron menor LR (P<0.05) que el T-0 (Figura 1d). La ecuación indicó que en esta variable la RC50 se presentó a los 1,037.8 Gy. El comportamiento del RF mostró una tendencia cuadrática (P=0.0009). En esta variable se presentó un aumento (P<0.05) en las dosis de 450 y 600 Gy. Posteriormente, tendió a disminuir hasta los 4000 Gy, donde todas las plantas de esta dosis murieron antes de los 21 d de edad (Figura 2a). En esta variable, la ecuación de regresión indica que la RC50 se presentó a 2,262.8 Gy.

Rendimiento de forraje, g

y = -1E-06x2 + 0.0018x + 11.809 R² = 0.94

12 10 8 6 4 2

Producción de semilla, mg

Figura 2: Efecto de diferentes dosis de irradiación con CO60 sobre el rendimiento de forraje (a), producción de semilla (b), proporción hoja-tallo (c), índice de concentración de clorofila (d) de pasto garrapata (Eragrostis superba) 1800

1600 y = -0.0002x2 + 0.7417x + 719.06 R² = 0.75

1400 1200 1000 800 600 400 200

1000

2000

3000

4000

Dosis de iradiación, Gy

2.5

2000

3000

4000

Dosis de iradiación, Gy

y = -0.0006x + 2.2999 R² = 0.82

2 1.5 1 0.5

Índice de concentración de clorofila, ICC

Proporción hoja-tallo, PHT

1000

8 7

y = -0.0016x + 7.0164 R² = 0.83

6 5 4 3 2 1 0

1000

2000

3000

4000

Dosis de iradiación, Gy

1000

2000

3000

4000

Dosis de iradiación, Gy

El PS presentó una tendencia cuadrática (P<0.05). Sin embargo, los únicos tratamientos que mostraron diferencias (P<0.05) conforme al testigo fueron 1400 y 4000 Gy. En la dosis de 1400 Gy el PS aumentó (P<0.05; Figura 2b). De acuerdo con la ecuación de regresión y el PS la RC50

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se presentó a los 3,968.7 Gy. La PHT mostró una tendencia lineal (P<0.0001). El único tratamiento diferente (P<0.05) al testigo fue el de 4000 Gy. Lo anterior debido a que en este tratamiento todas las plantas murieron y por lo tanto presentó una PHT de 0. En esta variable la RC50 se obtuvo en 2,509.9 Gy. El ICC presentó un comportamiento lineal (P<0.0001). No obstante, al igual que en la variable anterior, el único tratamiento diferente (P<0.05) al testigo fue el de 4000 Gy. De acuerdo con la ecuación de regresión, la RC50 se presentó a los 2,486.6 Gy. La media ponderada de la DL50 y las RC50 resultantes de las ocho variables fue de 2,159.2 Gy. La germinación del pasto garrapata disminuyó conforme aumentó la dosis de irradiación. Este resultado concuerda con diversos autores, quienes encontraron que la germinación de diferentes especies de plantas tiende a disminuir a medida que aumenta la dosis de radiación(18-21). Esto se debe a que dosis altas de radiación pueden inhibir funciones vitales para las células, lo cual puede provocar la muerte de algunas células e incluso la del embrión en la semilla. Este fenómeno tiende a aumentar en frecuencia conforme se incrementa la dosis de irradiación y es la causa por la que la germinación disminuye(20). La radiación puede provocar daños en compuestos relacionados con el metabolismo de planta como auxinas, ácido ascórbico, clorofila y proteínas, lo cual puede inhibir el crecimiento de las plántulas(22,23). Debido a estos desórdenes se ha observado que la semilla irradiada con dosis altas no es capaz de germinar, o que sus plántulas no son capaces de sobrevivir más de unos cuantos días(24), lo cual ocurrió en este estudio en la dosis de 4000 Gy. Así mismo, la reducción de la germinación se ha atribuido a que la frecuencia en los daños cromosómicos aumenta con el incremento de la dosis(22). Lo anterior puede cambiar la expresión de proteínas e influir en el funcionamiento celular, lo que puede afectar al desarrollo de la plántula e impedir la germinación(25). Una de las gramíneas más estudias en cuestión de radiosensibilidad es el arroz (Oryza sativa). En un estudio realizado en esta especie expusieron 13 variedades a radiación gamma y encontraron que la DL50 varió según la variedad entre 345 y 423 Gy(26). En otro estudio realizado en dos variedades de arroz se estableció la DL50 en 288 y 354 Gy(27), mientras que otros investigadores establecieron la dosis letal media en esta especie a los 229 Gy(28). En otras gramíneas como Pennisetum glaucum y Pennisetum typhoides la DL50 se ha determinado en 669.3 y 200 Gy, respectivamente(28,29). En gramíneas forrajeras la DL50 se ha determinado en pasto sudán (Sorghum sudanense), donde la DL50 varió entre 307 y 342 Gy para diferentes variedades(3). Cabe mencionar que en los estudios anteriores se utilizó el mismo agente que en este estudio. No obstante, los resultados anteriores son inferiores a la DL50 del pasto garrapata, obtenida en este estudio. Este resultado probablemente se debe, entre otros factores, a las variaciones en el contenido de humedad de la semilla que se da entre especies. Esto debido a que la radiación ionizante puede provocar la ruptura de enlaces covalentes y descomposición de moléculas de agua. Lo anterior forma radicales libres que de manera indirecta pueden dañar los diferentes organelos de la célula e incluso las moléculas de ADN dentro de la célula(30).

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Al igual que el PG, la Vge del pasto garrapata tendió a disminuir conforme se incrementó la dosis de radiación. Este resultado concuerda con lo reportado en cacahuate (Arachis hypogaea), donde la velocidad de germinación disminuyó con el aumento de la dosis de radiación(31). El retraso en la germinación puede deberse a que se ha observado que dosis altas de radiación pueden inhibir procesos vitales para la célula, como son la síntesis de proteínas y la actividad enzimática, lo cual puede retrasar la división celular y por ende la germinación(20,32). Con respecto a la LP y LR se observó que éstas disminuyeron con el incremento de la dosis de irradiación. Este resultado concuerda con el encontrado en Eleusine coracana, donde la LP y la LR se vieron afectadas por el incremento en la dosis de radiación y se encontró la RC50 a los 500 Gy, para ambas variables(33). Este mismo efecto fue encontrado en arroz, donde encontraron la RC50 a los 250 y 450 Gy para ambas variables, respectivamente(34). La disminución en longitud de plúmula y radícula puede deberse a que la radiación ionizante comúnmente afecta al metabolismo y la división celular en plantas, lo cual inhibe o retrasa su crecimiento(20,31). Respecto a esto, Kiong et al(22) encontraron que la radiación gamma puede disminuir la cantidad de proteínas y compuestos clorofílicos, lo cual afecta al metabolismo de la plantas. Por otro lado, Preuss y Britt(35) encontraron que la radiación gamma puede inhibir el crecimiento de las plantas, debido a que estas tienen un mecanismo de señales de transducción que monitorea el daño celular. Este mecanismo detiene la división celular cuando se produce un daño en la estructura celular. El RF y la PS del pasto garrapata presentaron un incremento con dosis bajas de irradiación. Esto probablemente se debe a que la radiación gamma puede incrementar la cantidad de pigmentos fotosintéticos como las clorofilas a y b y los carotenos(22). Estos pigmentos son los encargados de captar fotones de luz solar para que la planta pueda convertirlos en compuestos ricos en energía, a través de la fotosíntesis(36). Por esta razón, un incremento en la concentración de estos pigmentos puede aumentar las tasas fotosintéticas, lo cual pudo ser la causa del incremento en el rendimiento de forraje y la producción de semilla en este estudio. El incremento en RF y PS también puede deberse a que la radiación gamma en algunas ocasiones incrementa la actividad de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa y la glutatión reductasa, lo cual disminuye el estrés oxidativo en la planta. Esto último ayuda a la planta a lidiar de manera más fácil con los factores de estrés a los que se enfrenta diariamente, como son las fluctuaciones de temperatura y luz solar que recibe, lo cual beneficia su crecimiento(37,38). No obstante, después del incremento en el RF y la PS se presentó un decremento. Esto se debe a que la radiación también puede causar efectos negativos, ya que la exposición a radiación gamma frecuentemente produce radicales libres durante el proceso de la radiólisis del agua. Estos radicales libres son especies químicas inestables pueden dañar organelos celulares. En un experimento realizado por Wi et al(39) se observó que la radiación gamma produjo importantes modificaciones en la estructura de algunos organelos en células de Arabidopsis thaliana. En este experimento, los 234

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tilacoides dentro de los cloroplastos mostraron dilatación y daños, las mitocondrias presentaron formas distorsionadas y el retículo endoplasmático presentó membranas distendidas. Además, como se menciona con anterioridad, la radiación puede provocar la destrucción de auxinas, ácido ascórbico, clorofila y proteínas, lo que afecta al metabolismo de las plantas(22,23). Es poca la probabilidad de que se presente alguno de estos fenómenos con dosis bajas de radiación; sin embargo, conforme se incrementa la dosis de radiación aumenta la probabilidad de que ocurran(22). Lo anterior, puede ser la causa por la que después de que se incrementó el rendimiento de forraje y la producción de semilla, se haya presentado una reducción en ambas variables. La DL50 y RC50 son parámetros utilizados para determinar la dosis óptima de irradiación para inducir mutaciones efectivas en programas de mejoramiento genético. Esto se debe a que se ha observado que con dosis bajas de irradiación, los impactos en el genoma pueden ser mínimos y difíciles de reflejarse fenotípicamente; mientras que con dosis altas el genoma puede sufrir múltiples impactos que regularmente producen aberraciones o cambios negativos(7,8). Además, las dosis bajas de irradiación pueden inducir un incremento en la división celular, actividad enzimática o cantidad de pigmentos fotosintéticos(31,34). En contraste, dosis altas de irradiación pueden también producir daños físicos en los organelos o químicos en las células, como la destrucción de enzimas y hormonas, entre otros. Sin embargo, por no haber sido producidos por modificaciones genéticas, estos cambios no pasarán a las siguientes generaciones. En este sentido, las dosis bajas y altas de radiación pueden generar cambios fenotípicos en las plantas que pueden ser confundidos con cambios genéticos. Por lo anterior, antes de iniciar un programa de mejoramiento genético por mutagénesis se debe establecer la dosis óptima de irradiación, lo cual incrementa la posibilidad de encontrar mutaciones efectivas. La dosis óptima de irradiación se establece a través de la dosis letal media o la dosis de reducción media del crecimiento(6,7). En este estudio, la reducción que se presentó en los valores de todas las variables por efecto de irradiación, permitió determinar la DL50 y RC50. No obstante, los valores de ambos parámetros en cada variable oscilaron entre 805 y 3,905 Gy. Debido a la amplitud de este rango, se calculó una media ponderada para establecer la dosis óptima de irradiación gamma en la semilla. A la variable que se le asignó mayor ponderación fue el porcentaje de germinación, ya que la muerte del individuo indica daño máximo que puede producir la radiación. Dosis bajas de radiación gamma puede producir un incremento en algunos atributos agronómicos en pasto garrapata. No obstante, en general todos los parámetros físicos evaluados se vieron afectados con dosis altas de irradiación gamma, lo cual permitió determinar la dosis media letal y reducción media del crecimiento. Para el mejoramiento genético del pasto garrapata, se recomienda utilizar la dosis óptima de radiación obtenida con la ponderación de ambos parámetros (2,486 Gy). Esto contribuirá para la obtención de nuevo material genético que pueda ser utilizado para rehabilitación de pastizales.

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http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4631 Nota de investigación

Rendimiento de forraje y sus componentes en variedades de alfalfa en el altiplano de México Adelaido Rafael Rojas Garcíaa Nicolás Torres Saladoa María de los Ángeles Maldonado Peraltaa Jerónimo Herrera Péreza Paulino Sánchez Santillána Aldenamar Cruz Hernándezb* Félix de Jesús Mayren Mendozaa Alfonso Hernández Garayc

a Universidad Autónoma de Guerrero. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Cuajinicuilapa, Guerrero, México. b Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. División Académica de Ciencias Agropecuarias. Carretera Villahermosa-Teapa, km 25. R/A La Huasteca, Tabasco, México. Tel. 01 (993) 3581500, ext. 6604. c Colegio de Postgraduados. Recursos Genéticos y Productividad Ganadería. Campus Montecillo. Texcoco. México. *Autor de correspondencia: ingaldecruz@gmail.com

Resumen: La alfalfa (Medicago sativa L.) es la leguminosa cultivada más usada para la producción de leche y carne en México, debido a su alto rendimiento y calidad nutrimental. El objetivo de este estudio fue evaluar el rendimiento de forraje y sus componentes en cinco variedades de alfalfa con intervalos de corte definidos estacionalmente. Las variedades Aragón, Valenciana, Chipilo, Milenia y Oaxaca se distribuyeron aleatoriamente en 20 parcelas experimentales de 12 x 9 m, de acuerdo a un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones. Las evaluaciones

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incluyeron rendimiento de forraje en base seca, peso por tallo, población de tallos m-2, población de plantas m-2, relación hoja:tallo, composición botánica y morfológica. El rendimiento mayor y menor la obtuvieron las variedades Milenia y Aragón con 20,643 y 14,488 kg MS ha-1. El peso por tallo fue mejor en Aragón, Chipilo y Milenia y menor en Valenciana y Oaxaca. Aragón obtuvo la mayor densidad de tallos con 634 tallos m-2 y Oaxaca con 512 tallos m-2 el menor. La relación hoja:tallo mayor la presentó Aragón con 1.31 y la menor Oaxaca con 1.13. En otoño e invierno se obtuvo mayor cantidad de hoja, independientemente de la variedad; y en verano, hubo incremento de maleza en todas las variedades. Existió estacionalidad en el rendimiento; primavera y verano son las épocas con producción mayor, debido a la temperatura y el peso por tallo mayor. La variedad con mayor rendimiento de materia seca fue Milenia y la menor Aragón. Palabras clave: Rendimiento de forraje, Relación hoja:tallo, Población de tallos.

Recibido: 18/09/2017 Aceptado: 07/05/2018

La alfalfa (Medicago sativa L.) tiene gran importancia por su alta producción por unidad de superficie y valor nutrimental del forraje(1), y porque es apetecible al ser consumida por animales diversos en estado fresco, henificada o ensilada(2). La alfalfa también se utiliza para mejorar la cobertura vegetal, evitar la erosión del suelo, prevenir la degradación de las praderas, y ayudar a la sostenibilidad de la agricultura y la ganadería(3). Al asociar esta leguminosa con alguna gramínea, la producción de la pradera aumenta, se minimiza la estacionalidad, el valor nutrimental mejora, y los costos de producción se reducen en comparación con las dietas balanceadas(4). Investigadores(5,6) evidenciaron que la frecuencia e intensidad de corte de alfalfa debe definirse con base en el estado de desarrollo de la planta y estación del año. Estos parámetros son importantes para lograr el equilibrio entre cantidad, calidad y persistencia de la pradera(7). Se han observado que el rendimiento de alfalfa es mayor en primavera - verano y menor en otoño e invierno(8,9). Además, Villegas et al(10) reportaron que el rendimiento de forraje de variedades de alfalfa fue mayor en la primavera, seguido de invierno y verano y el rendimiento menor se registró en otoño. Idris y Adam(11) obtuvieron rendimiento anual mayor y menor en la variedad Hagazi y Cuf 101, con frecuencias de cosecha de 25 y 30 días, respectivamente. Se menciona, que la densidad poblacional de tallos y peso de los mismos se han evaluado en varias partes del mundo, ya que son indicadores de la producción de forraje(12). En una investigación realizada por Chen et al(3) observaron que el aumento de la frecuencia de corte de la alfalfa tiene alta relación con la densidad de tallos, al aumentar hasta llegar un punto en declive, 240

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independientemente de la variedad y año de evaluación con 645, 734 y 688 tallos m -2 en la frecuencia a 30, 40 y 50 días. Estos mismos autores observaron el menor y mayor peso por tallo con 0.27 y 0.45 g para la menor y mayor frecuencia, respectivamente y relacionado con el rendimiento. En otras investigaciones(13) mencionan una alta relación entre el mayor peso por tallo con el mayor rendimiento y temperatura. Algunos autores(14) reportan el mayor rendimiento en alfalfa con una densidad de 25 plantas m-2. Morales et al(15) encontraron en 14 variedades de alfalfa una alta relación hoja:tallo con el mayor rendimiento total, tasa de crecimiento y densidad de tallos. También se indica(5), que en la estación de invierno se obtuvo mayor porcentaje de hojas, con un promedio de 65 % y en primavera el menor aporte. No obstante, en México existe poca información sobre estos parámetros de producción. El objetivo del presente estudio fue evaluar los componentes del rendimiento de cinco variedades comerciales de alfalfa, con intervalos de corte definidos estacionalmente, con los siguientes atributos: rendimiento de forraje, peso por tallo, densidad de tallos, densidad de plantas, relación hoja:tallo, composición botánica y morfológica. El estudio se realizó en el campo experimental del Colegio de Postgraduados, Montecillo, Texcoco, Estado de México (19º 29’ N y 98º 53’ O, y altitud de 2,240 msnm) de junio de 2010 a junio de 2011. El clima es templado subhúmedo, el más seco de los subhúmedos, con precipitación media anual de 636.5 mm, lluvias en verano (de junio a octubre) y temperatura promedio anual de 15.2 ºC (16). El suelo es un Typic ustipsamments de textura franco arenoso, con pH entre 7 y 8 y con 2.4 % de materia orgánica(17). Se utilizaron cinco variedades comerciales de alfalfa: Aragón, Valenciana, Chipilo, Milenia y Oaxaca, sembradas al voleo el 18 de abril de 2008. La densidad de siembra fue de 30 kg ha-1 de semilla pura viva, la cual se ajustó por el porcentaje de germinación de cada variedad. El área de estudio se dividió en 20 parcelas de 108 m2 (12 x 9 m). Al inicio del experimento (2 de junio de 2010) se realizó un corte de uniformización con un tractor-podador, a una altura promedio de 5 cm; la fase experimental concluyó el 21 de junio de 2011. El intervalo entre cortes varió de acuerdo a la estación del año: en primavera y verano las plantas se cortaron cada cuatro semanas; en otoño cada cinco e invierno cada seis semanas, de acuerdo a lo recomendado por Mendoza et al(5). Las praderas no se fertilizaron, y en las estaciones con mínima precipitación se proporcionaron riegos a capacidad de campo cada dos semanas. Para evaluar el rendimiento de forraje, en cada variedad, al inicio del estudio, se colocaron al azar dos cuadros fijos de 0.25 m-2 por repetición. El forraje presente dentro de cada cuadro se cosechó un día antes del corte, a una altura de 5 cm, se depositó en bolsas de papel etiquetadas y se secó en una estufa de aire forzado, hasta obtener un peso constante. Una vez seca, se registró el peso de la muestra para calcular el rendimiento de materia seca por unidad de superficie (kg MS ha-1). Un día antes de cada corte, se cortaron aleatoriamente 10 tallos en cada tratamiento y repetición a nivel del suelo y se secaron en una estufa de aire forzado, hasta peso constante. Posteriormente se 241

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calculó el peso promedio por tallo. Al inicio del experimento se colocaron al azar en cada unidad experimental dos cuadros fijos de 20 x 20 cm, los tallos presentes dentro de cada cuadro se contaron mensualmente y posteriormente se calculó el promedio por estación. Cuando el experimento inició, se colocó en una caja experimental un cuadro fijo, de 1 m2, a nivel del suelo, en donde mensualmente se contó el número de plantas de alfalfa presentes y se registraron los cambios en densidad poblacional promediándolos estacionalmente. La relación hoja:tallo se calculó al dividir el peso seco de cada fracción (hoja/tallo), expresado en kg ha-1, obtenidos de la submuestra tomada para estimar la composición botánica y morfológica. Para obtener la composición botánica, un día antes de cada corte se tomó una submuestra de aproximadamente 20 % de las muestras del forraje cosechado para estimar el rendimiento, y cada submuestra se separó en alfalfa y maleza. Cada componente se secó en una estufa de aire forzado, hasta peso constante y se registró su peso seco, posteriormente los rendimientos por estación se promediaron. Los datos de temperatura máxima, mínima, precipitación acumulada durante el periodo de estudio se obtuvieron de la estación agro-meteorológica del Colegio de Postgraduados, ubicado a 100 m del área experimental (Figura 1). La temperatura máxima se observó en julio de 2010 y de marzo a junio de 2011 con un promedio de 28 oC que corresponden a la estación de primavera y verano, principalmente. La temperatura mínima se registró en diciembre de 2010, enero y febrero de 2011 con un promedio de -1 oC, correspondiente a la estación de invierno. La precipitación mayor (mm) se concentró en julio, agosto, septiembre y noviembre de 2010 y junio de 2011 con una acumulación de 404 mm, representando las estaciones de verano y otoño principalmente. En las estaciones de invierno y primavera se proporcionaron riegos a capacidad de campo, cada 15 días. El efecto de los factores en estudio en las variables de respuesta se evaluó mediante un análisis de varianza (ANOVA) con el procedimiento de Modelos Mixtos(18), con un diseño en bloques completos al azar con cuatro repeticiones. La comparación de medias se realizó mediante la prueba de Tukey (ɑ= 0.05).

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Figura 1: Temperatura media mensual máxima, mínima, precipitación acumulada mensual y riegos a capacidad de campo durante el periodo de estudio (junio 2010 a junio 2011)

No se encontraron interacciones significativas (P>0.05) entre los factores en estudio. En general, el aporte promedio al rendimiento anual fue: verano 35 %, primavera 28 %, otoño 24 % e invierno 13 %. El rendimiento promedio de forraje de las variedades de alfalfa en otoño disminuyó (P<0.05) en relación al registrado en verano; a su vez, el rendimiento en invierno fue menor (P<0.05) al obtenido en las otras tres estaciones del año (Cuadro 1). Estos resultados coinciden con las temperaturas mayores registradas en primavera-verano (Figura 1), que favorecieron el desarrollo de la alfalfa(19); ya que, la temperatura óptima de crecimiento de la alfalfa, fluctúa entre 15 y 25 °C. Por otra parte, el rendimiento de materia seca de la variedad Milenia solamente fue superior (P<0.05) al de la variedad Aragón (Cuadro 1). Villegas et al(10) reportan en las variedades Oaxaca y Valenciana rendimientos similares con esta evaluación (21,600 y 20,000 kg MS ha-1). Sin embargo, independientemente de la variedad de alfalfa y frecuencia de corte en promedio se obtuvieron 10,552 kg MS ha-1 de rendimiento anual(11).

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Cuadro 1: Rendimiento estacional y anual (kg MS ha-1) de variedades de alfalfa Variedad

Verano

Otoño

Invierno

Primavera

EEM

Anual

Aragón

5188 Ba

3334 Bb

1717 Bc

4248 Aab

456

14488 B

Valenciana

6407 Aa

4093 Ab

2035 ABc

4293 Ab

398

16828 AB

Chipilo

6162 ABa

4386 Ab

2412 ABc

5072 Aab

402

18034 AB

Milenia

7148 Aa

4898 Ab

2776 Ac

5819 Aab

434

20643 A

Oaxaca

6298 ABa

4512 Ab

2217 ABc

4911 Aab

521

17939 AB

EEM

345

432

355

456

Promedio

6241 a

4244 b

2231 c

4869 ab

abc

897

Medias con la misma literal minúscula en una misma hilera, no son diferentes (P>0.05). ABC= medias con la

misma literal mayúscula en una misma columna, no son diferentes (P>0.05). EEM= error estándar de la media.

Otros investigadores(1) obtuvieron resultados parecidos en dos variedades y once líneas de alfalfa con un promedio de 20,615 kg MS ha-1. Mientras que Abusuwar y Daur(20) determinaron en alfalfa en variedades Cuf 101 y Hegazi el rendimiento mayor y menor con 18,065 y 17,545 kg MS ha-1. En el valle de México reportaron en alfalfa la mayor producción de forraje total acumulado con 33,864 y 34,457 kg MS ha-1, respectivamente y con una distribución estacional mayor en primavera y verano y menor en otoño e invierno, con los mismos intervalos de corte de esta investigación(5,8). No obstante, rendimientos inferiores fueron observados en esta investigación y se pueden atribuir a que las variedades tenían más de 2 años de establecidas (abril 2008), por lo que la persistencia del forraje y su rendimiento va en decremento conforme aumenta el tiempo después de la siembra(4). El análisis de varianza no reveló interacciones (P>0.05) entre los factores en estudio. Se encontraron diferencias (P<0.05) en el peso promedio anual por tallo entre las variedades de alfalfa: Aragón, Milenia y Chipilo produjeron tallos más pesados (0.71 g en promedio) que Valenciana y Oaxaca con 0.67 y 0.68 g respectivamente (Cuadro 2). En todas las variedades hubo un efecto estacional (P<0.05), el peso promedio por tallo fue mayor en primavera y menor en invierno, en relación al resto de las estaciones. Los mayores valores observados en primavera estuvieron asociados a las temperaturas máximas registradas durante el estudio (Figura 1). No obstante, se menciona que tales diferencias también se pueden deber a las frecuencias de corte(3); estos autores obtuvieron al evaluar la frecuencia de corte en alfalfa el menor y mayor peso por tallo con 0.27 y 0.45 g, para la menor y mayor frecuencia, respectivamente. 244

Rev Mex Cienc Pecu 2019;10(1):239-253

Cuadro 2: Cambios estacionales en el peso por tallo (g) de variedades de alfalfa Variedad

Verano

Otoño

Invierno

Primavera

EEM

Promedio

Aragón

0.83 Aa

0.69 Aab

0.36 Bb

0.94 Aa

0.11

0.71 A

Valenciana

0.80 Aa

0.69 Ab

0.33 Bc

0.86 Ba

0.16

0.67 B

Chipilo

0.72 Ba

0.70 Aab

0.45 Ab

0.93 Aa

0.12

0.70 A

Milenia

0.75 Bb

0.71 Ab

0.34 Bc

1.04 Aa

0.21

0.71 A

Oaxaca

0.74 Ba

0.67 Aab

0.45 Ab

0.86 Ba

0.15

0.68 B

EEM

0.9

0.7

0.6

0.9

Promedio

0.75 b

0.69 b

0.39 c

0.93 a

0.8

abc

= Medias con la misma literal minúscula en una misma hilera, no son diferentes (P>0.05). ABC= medias con la misma literal mayúscula en una misma columna, no son diferentes (P>0.05). EEM= error estándar de la media.

Meuriot et al(21) al evaluar la frecuencia e intensidad de corte de alfalfa, el peso de tallo fue mayor (1.1 g por tallo) conforme aumentó la frecuencia y con una intensidad de corte de 15 cm, relacionado con el mayor índice de área foliar y rendimiento. Avci et al(13) reportaron que el mayor peso por tallo estuvo asociado con un rendimiento mejor, como se observó en la primavera durante esta investigación. El aumento en el peso por tallo coincide con la disminución en la densidad de tallos principalmente en la estación de primavera, comportamiento reportado por otros autores(22), quienes señalan que el aumento en la densidad de tallos por unidad de área ocasiona una disminución en el peso individual de los tallos, explicado por la ley de auto-aclareo(23) y confirmado por otros autores(24,25,26).

Las interacciones entre las variedades de alfalfa y las épocas del año no fueron significativas (P>0.05) con relación a esta variable de respuesta. Sí se presentaron diferencias (P<0.05) entre las variedades, ya que Aragón registró la mayor densidad promedio anual de tallos con 634 tallos m-2, mientras que Oaxaca con 512 tallos m-2 fue la de menor densidad (Cuadro 3). Además, existieron diferencias (P<0.05) entre las estaciones del año, ya que la densidad de tallos promedio en el verano superó a la registrada en el invierno; sin embargo, la menor densidad de tallos se registró en la primavera.

245

Rev Mex Cienc Pecu 2019;10(1):239-253

Cuadro 3: Cambios estacionales en la densidad de tallos (tallos m-2) de variedades de alfalfa Variedad

Verano

Otoño

Invierno

Primavera

EEM

Promedio

Aragón

715 Aa

660 Aab

585 Ab

577 Ab

234

634 A

Valenciana

708 ABa

684 Ab

483 Bd

503 Bc

145

595 B

Chipilo

739 Aa

692 Aa

525 ABb

318 Cc

124

568 B

Milenia

666 BCa

592 BCb

528 ABbc

496 Bc

571 B

Oaxaca

623 Ca

537 Cb

518 ABb

372 Cc

134

512 C

EEM

102

Promedio

690 a

633 ab

528 b

453 c

abc

En otra investigación(27) con cuatro variedades de alfalfa, los autores observaron el mismo comportamiento que en este estudio, ya que la densidad de tallos disminuyó con forme el estudio avanzó. Ellos registraron la densidad mayor de tallos en el primer año de evaluación y menor en el cuarto año con un promedio de 518 y 140 tallos m-2, respectivamente. No obstante, Chen et al(28) indicaron que conforme la frecuencia de corte disminuyó, la densidad de tallos se incrementó hasta llegar un punto en declive, independientemente de la variedad y año de evaluación: 645, 734 y 688 tallos m-2 para las frecuencias de corte cada 30, 40 y 50 días, respectivamente, lo cual está altamente relacionado con el rendimiento. La temperatura y la humedad en el suelo son los principales factores climáticos que influyen en la densidad y el peso de tallos; cuando estos son favorables, existe una constante producción de tallos, dando como resultado una producción mayor de biomasa en la pradera(29). Sin embargo, se menciona(22) que existe una relación inversa entre la densidad de tallos y la producción de materia seca, señalan que un mayor número de tallos resulta en un menor rendimiento de forraje, debido posiblemente al bajo peso individual de cada uno de ellos.

El análisis de varianza no mostró interacciones significativas (P>0.05) entre los factores en estudio. De igual forma que la densidad de los tallos, la densidad promedio de plantas disminuyó (P<0.05) en todas las variedades de alfalfa conforme el estudio transcurrió (Cuadro 4), de 33 plantas m-2 en verano a 22 plantas m-2 en primavera. La mayor densidad promedio anual de plantas se registró en Milenia con 33 y la menor en Aragón con 21 plantas m-2. Ambas perdieron 9 y 11 plantas, entre el 246

Rev Mex Cienc Pecu 2019;10(1):239-253

inicio y el final del estudio, respectivamente. Otros autores(30) mencionan que, en una pradera de alfalfa, la cobertura y densidad de plantas se estabiliza conforme aumenta el tiempo de establecida; sin embargo, llega un tiempo en que éstas disminuyen, dependiendo de la variedad y el sitio. Cuadro 4: Cambios estacionales en la densidad de plantas (plantas m-2) de variedades de alfalfa Variedad

Verano

Otoño

Invierno

Primavera

EEM

Promedio

Aragón

26 Ca

22 Db

20 Cb

17 Cc

21 C

Valenciana

34 Ba

32 ABb

26 Bc

22 Bd

29 B

Chipilo

33 Ba

29 BCab

26 Bbc

23 Bc

28 B

Milenia

38 Aa

36 Ab

31 Ac

27 Ad

33 A

Oaxaca

31 Ba

27 Cb

25 Bbc

22 Bc

26 B

EEM

Promedio

33 a

29 b

26 c

22 d

abc

= Medias con la misma literal minúscula en una misma hilera, no son diferentes (P>0.05). ABC= medias con la

misma literal mayúscula en una misma columna, no son diferentes (P>0.05). EEM= error estándar de la media.

En otro estudio(31) mencionan la importancia de la distancia entre plantas de alfalfa, encontraron en la estación de primavera el mayor rendimiento, relacionado con la mayor radiación interceptada (95 %), en todas las distancias entre plantas (10, 15, 20, 25 y 30 cm); mientras que, en verano e invierno solo se alcanzó el 95 % de radiación interceptada a 10 y 15 cm de distancia entre plantas ya que el crecimiento de la alfalfa está relacionado con la temperatura. Varios autores(27,32) indican que entre menor sea la separación entre plantas mayor es el rendimiento, lo que coincide con los resultados obtenidos en este estudio. No se registró interacción entre las variedades de alfalfa y las épocas del año para esta variable de respuesta. Sin embargo, la relación hoja:tallo fue diferente (P<0.05) entre las estaciones del año (Cuadro 5): en otoño e invierno se presentó la mayor relación hoja:tallo promedio (1.52), que fue diferente significativamente en comparación con verano y primavera (0.92). Por otra parte, las variedades Aragón y Valenciana obtuvieron la mayor relación hoja:tallo (1.30) comparadas con Chipilo y Oaxaca (1.14). En un estudio realizado por Rojas et al(33) observaron que independientemente de la variedad, en otoño e invierno la relación hoja:tallo fue mayor con un valor de 1.49, comparada con la registrada en verano y primavera con 0.92 y 0.94, respectivamente, Villegas et al(34) observaron que, con dos intensidades de corte, la variedad Moapa y Tlacolula obtuvieron la mejor y peor relación hoja:tallo con 1.4 y 1.1, respectivamente. Mientras tanto, otros 247

Rev Mex Cienc Pecu 2019;10(1):239-253

autores(8) reportaron valores muy por debajo de los anteriores y los del presente estudio, pues el promedio anual observado en cinco variedades de alfalfa fue de 0.79, con variaciones a través del año, y los valores mayor y menor (P<0.05) se observaron en enero y noviembre con 1.05 y 0.62, respectivamente. De igual forma, Morales et al(15) registraron en catorce variedades de alfalfa una relación hoja:tallo promedio anual de 0.68. Cuadro 5: Cambios estacionales en la relación hoja:tallo de cinco variedades de alfalfa Variedad

Verano

Otoño

Invierno

Primavera

EEM

Promedio

Aragón

0.94 Ab

1.65 Aa

1.66 Aa

0.99 Ab

0.23

1.31 A

Valenciana

0.92 Ab

1.59 Aa

1.69 Aa

0.96 Ab

0.32

1.29 A

Chipilo

0.84 Bb

1.40 ABa

1.44 Ba

0.94 Ab

0.21

1.15 B

Milenia

0.95 Ab

1.49 ABa

1.50 ABa

0.97 Ab

0.19

1.23 AB

Oaxaca

0.87 Bb

1.38 Ba

1.44 Ba

0.83 Bb

0.18

1.13 B

EEM

0.7

0.15

Promedio

0.90 b

1.50 a

1.55 a

0.94 b

0.13

abc

Hernández-Garay et al(23) mencionan que la relación hoja:tallo de los forrajes puede considerarse una medida indirecta de la calidad, ya que valores mayores a uno indican una mejor calidad del forraje al tener mayor cantidad de hoja. En forma similar, en este estudio se registraron índices mayores a 1 en otoño e invierno. Sin embargo, aun cuando en estas dos estaciones del año las plantas de alfalfa produjeron la relación hoja:tallo mayor, el rendimiento de materia seca tendió a ser menor en otoño y fue el menor en invierno, en comparación con la primavera y el verano (Cuadro 1). Rojas et al(4) mencionan que en los forrajes se debe obtener la mejor relación entre el rendimiento y la calidad, siendo cuando existe mayor cantidad de hojas. Independientemente de la variedad, la alfalfa constituyó más de 90 % de la especie deseable en la pradera durante todo el periodo de estudio (Figura 2). Se observaron diferencias entre estaciones en el porcentaje de hoja, obteniendo en otoño e invierno el mayor aporte con 59 % de hoja y primavera y verano el menor con 45 %. Mientras que en el porcentaje de tallo en primavera y verano se encontró el mayor aporte y otoño e invierno el menor. No se presentó material muerto en todo el periodo experimental, ya que la alfalfa tiende a tirar las hojas senescentes. De igual forma no se encontraron inflorescencias debido a que los cortes se realizaron antes de que la 248

Rev Mex Cienc Pecu 2019;10(1):239-253

floración ocurriera. Varios investigadores(5,6,8) reportan comportamiento similar en la cantidad de hoja de alfalfa teniendo en la época con menor temperatura el mayor aporte. Figura 2: Cambios estacionales en la composición botánica y morfológica (%) de cinco variedades de alfalfa, ɪ= error estándar de la media

Sólo en la estación de verano hubo mayor (P<0.05) presencia de maleza en comparación con las otras estaciones del año, y predominaron Aristida stricta, Bromus inermis y Malva neglecta. El porcentaje mayor de maleza en verano podría ser por la mayor temperatura y lluvia registradas en esa estación (Figura 1), apropiadas para la maleza existiendo una competencia intraespecifica con la alfalfa por luz, agua y nutrimentos(30). Las variedades que presentaron mayor invasión por maleza fueron Valenciana y Oaxaca con 9 %. El mayor aporte de maleza en estas variedades se le puede atribuir al tener menor densidad de plantas (Cuadro 4), lo cual provocó mayor invasión de hierbas no deseadas, como lo reportan otros trabajos(5,14). Se concluye que las variedades de alfalfa presentaron diferente comportamiento y el mejor rendimiento se mostró en Milenia, Chipilo, Oaxaca y Valenciana. De acuerdo a las diferencias estadísticas entre los promedios generales de cada estación, el rendimiento de materia seca en verano fue mayormente aportado por la densidad de tallos y plantas; de igual forma un mayor peso de los tallos contribuyó al mayor rendimiento de materia seca en primavera. Sin embargo, es 249

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necesario seguir realizando investigaciones e incluir otros parámetros de producción; como la altura de la planta, la radiación interceptada y el índice de área foliar, lo que podría explicar mejor el comportamiento productivo de la alfalfa en cada época del año, lo que puede contribuir al mejor manejo del cultivo.

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Rev Mex Cienc Pecu 2019;10(1):239-253

9. Rojas GAR, Hernández-Garay A, Joaquín CS, Maldonado PMA, Mendoza PSI, Álvarez VP, Joaquín TBM. Comportamiento productivo de cinco variedades de alfalfa. Rev Mex Cienc Agr 2016;7(8):1855-1866. 10. Villegas AY, Hernández-Garay A, Pérez PJ, López CC, Herrera HJ, Enríquez QJ, Gómez VA. Patrones estacionales de crecimiento de dos variedades de alfalfa (Medicago sativa L.). Téc Pecu Méx 2004;42:145-158. 11. Idris AE, Adam MMA. Effect of cutting intervals on yield and yield components of three alfalfa (Medicago sativa L.) genotypes. Adv Environ Biol 2013;7:4677-4681. 12. Matthew C, Hernández-Garay A, Hodgson J. Making sense of the link between tiller density and pasture production. Proc N Z Grassland Ass 1996;57:83-87. 13. Avci MA, Ozkose A, Tamkoc A. Determination of yield and quality characteristics of alfalfa (Medicago sativa L.) varieties grown in different locations. J Anim Vet Adv 2013;12:487-490. 14. Celebi SZ, Kaya I, Saharand AK, Yergin R. Effects of the weed density on grass yield of Alfalfa (Medicago sativa L.) in different row spacing applications. African J Biotechnol 2010;9:68676872. 15. Morales AJ, Jiménez VJL, Velasco VVA, Villegas AY, Enríquez VJR, Hernández-Garay A. Evaluación de 14 variedades de alfalfa con fertirriego en la mixteca de Oaxaca. Téc Pecu Méx 2006;44:277-288. 16. García E. Modificaciones al sistema de clasificación climática de Koppen. 4 ed. Universidad Nacional Autónoma de México. México, DF. 2004. 17. Ortiz SC. Colección de Monolitos. Depto. Génesis de Suelos. Edafología. IRENAT. Colegio de Postgraduados. Montecillo, Texcoco, Estado de México 1997. 18. SAS INSTITUTE. SAS/STAT® 9.2. Use´s Guide Release. Cary, NC 2009. 19. Guimire R, Norton JB, Pendall E. Alfalfa-grass biomass, soil organic carbon, and total nitrogen under different management approaches in an irrigated agroecosystem. Plant Soil 2014;374:173-184. 20. Abusuwar AO, Daur I. Effect of poultry and cow manures on yield, quality and seed production of two alfalfa (Medicago sativa L.) cultivars under natural saline environment of western Saudi Arabia. J Food Agr Environ 2014;12:747-751.

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Rev Mex Cienc Pecu 2019;10(1):239-253

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253

http://dx.doi.org/10.22319/rmcp.v10i1.4727 Nota de investigación

Evaluación de los hallazgos clínicos, radiológicos, ultrasonográficos y microbiológicos de la artritis séptica en 50 becerros

İbrahim Yurdakul* Department of Surgery, Faculty of Veterinary Medicine, Cumhuriyet University, Sivas, TURKEY.

Autor de correspondencia: ibrahimyurdakul5858@hotmail.com

Resumen: El propósito de este estudio evaluar los hallazgos clínicos, radiológicos, ultrasonográficos y microbiológicos de becerros con artritis séptica. El material de estudio consistió en 50 becerros con artritis de distintos estables, sexos y razas, de entre 4 y 150 días de edad, traídos a la clínica entre 2016 y 2017 y aquejados de cojera. Después de obtener las historias clínicas, se realizaron exámenes físicos y microbiológicos de las muestras sinoviales clínicas, radiográficas y ultrasonográficas. A nivel clínico, se detectó monoartritis en 37 becerros, y poliartritis en 13. La mayoría de las leisones se observaron en las articulaciones carpales y tarsales. En los resultados de las radiografías se encontró una opacidad incrementada en las articulaciones con artritis, estrechamiento intraarticular y degeneración en la superficie articular. En los exámenes ultrasonográficos, se observó una apariencia hiperecogénica heterogénea del líquido sinovial y una cápsula articular suave y de hiperecóica en la superficie de los cartílagos articulares en 43 casos. El mircoorganismo más comúnmente detectado en el examen microbiológico de líquido sinovial fue Staphylococcus aureus, en 13 casos; Trueperella pyogenes, en 8 casos; Streptococcus pluranimalium, en 8 casos, Mycoplasma bovis en 5 casos; Escherichia coli, en 5 casos; Saprophyte spp., en 1 caso, y Acinetobacter spp., en 1 caso. En conclusión, la evaluación conjunta de los hallazgos clínicos, radiológicos, ultrasonográficos y microbiológicos en el diagnóstico de la artritis séptica que se encuentra con frecuencia en los becerros y que provoca graves pérdidas económicas con altos índices de mortalidad, sería un enfoque más efectivo para los médicos veterinarios clínicos en términos de tratamiento y de prognosis. Palabras clave: Artritis, Becerro, Clínico, Microbiología, Radiología, Ultrasonografía.

254

Rev Mex Cienc Pecu 2019;10(1):254-266

Recibido: 19/12/2017 Aceptado: 18/06/2018 Se ha visto que las enfermedades de las patas que se presentan en la ganadería provocan graves pérdidas económicas, tales como una disminución en la producción de leche, pérdida de peso, la reducción del desempeño reproductivo, gastos en tratamientos y una separación temprana de los bovinos del rebaño debido a estas enfermedades(1-5). La causa más común de cojera en el ganado son los problemas ungulares. Según los reportes, la segunda causa de cojera por enfermedad son las artritis(4,6). Entre 47 y 72.2 % de los casos son provocados por padecimientos de las extremidades por enfermedades de las articulaciones y ligamentos(6). Las artritis son inflamaciones de componentes de una articulación que se presentan acompañadas de fiebre, dolor, hinchazón y síntomas de cojera en diversos niveles(7,8). Durante una artritis, el líquido sinovial, que en general es transparente o de un color amarillo ligeramente pálido, tiene la apariencia de una clara de huevo, e incluye proteínas, es anormal que este fluido contenga un gran número de leucocitos y de patógenos microbianos(7,9). La artritis puede afectar a uno o varios de los componentes de una articulación. La artritis se puede presentar en una sola articulación (monoartritis), en varias articulaciones (polyartritis), en ligamentos articulares y su área periférica (periarthritis) y también en todos los componentes de las articulaciones (panarthritis) (2,10,11). Se la clasifica como aguda o crónica según su curso clínico, y como aséptica o séptica, según las características de la inflamación(2,9,12). En las artritis aséptica y séptica se presentan diversos niveles de deformación de los componentes que constituyen la articulación, lo cual ocasiona trastornos funcionales. Cojera, dificultad para pararse, tensión en la cápsula articular debido a un incremento del líquido sinovial, hinchazón, dolor y aumento de la temperatura local son las manifestaciones clínicas más comunes(12-14). Se suele considerar que las inflamaciones asépticas de las articulaciones son resultado de distorsiones y sobreextensiones del área de las articulaciones de la pata afectada por un tirón aplicado a los becerros durante el parto. Por otra parte, la causa de las inflamaciones sépticas de las articulaciones es la presencia directa de factores de infección en las regiones articulares debidos a un trauma o al remplazo a través de la hematogénesis como resultado de enfermedades tales como la septicemia, la onfalitis y la pulmonía(8,11,14-17). En especial en los animales jóvenes, pueden presentarse infecciones articulares después de una bacteremia o una sepsis. Además, se ha visto que los becerros que padecen hipogammaglobulinemia son más sensibles a la bacteremia y a la artritis séptica(7). La artritis séptica es una enfermedad muy común que afecta con frecuencia a los becerros recién nacidos(18). Esta enfermedad suele requerir un largo tratamiento y genera gastos médicos elevados. Debido a esto último, en ocasiones no resulta económico aplicar el tratamiento(7,18). Además, éste puede fallar como consecuencia del uso de antibióticos inadecuados, de una demora en el inicio del tratamiento, o de la formación de lesiones irreversibles en tejidos y en estructuras 255

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articulares(7,8,11). Por ende, el diagnóstico y el tratamiento tempranos son muy importantes para reducir la prevalencia de esta enfermedad y los gastos económicos que ocasiona(1,14). Se han reportado varios patógenos como causantes de artritis en becerros en distintas regiones del mundo. Algunas especies de Mycoplasma, como M. bovis, M. canadense, M. alkalenscens y M. bovigenitalium, desempeñan un papel constructivo en la formación de artritis en el ganado. Según los estudios, M. bovis es la especie aislada más común hallada en casos de artritis en el ganado. Sin embargo, también otros patógenos, como Trueperella pyogenes, Actinomyces pyogenes, E. coli, S. aureus, Streptococcus spp. y Salmonella spp., ocupan un lugar importante en la formación de esta enfermedad(13,18,19). Este estudio tuvo como objetivo evaluar los hallazgos clínicos, radiológicos, ultrasonográficos y microbiológicos de los casos de artritis, que ocasionan grandes pérdidas económicas y graves problemas de salud en los becerros. El material del estudio consistió en 50 becerros de diferentes razas y sexos (33 machos y 17 hembras), de entre 4 y 150 días de edad, traídos a la clínica de cirugía de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Cumhriyet, en Sivas, Turquía, entre 2016 y 2017, con inflamación de las articulaciones y cojera. El lugar en el que se llevó a cabo el trabajo tiene un clima continental (caliente y seco en verano, frío y nevado en el invierno) y se localiza a una altitud de 1,285 msnm. Las historias clínicas de los becerros con artritis se obtuvieron de sus propietarios. Después de examinar los casos, se realizaron exámenes radiológicos y ultrasonográficos de las articulaciones afectadas. Por último, para los exámenes microbiológicos de los becerros con artritis se tomó líquido sinovial de la articulación o las articulaciones utilizando un método aséptico. Los principales exámenes clínicos generales practicados fueron los siguientes: examen de la temperatura corporal, del ritmo respiratorio, del ritmo cardiaco, del color de la membrana mucosa, del tiempo de llenado capilar y de los nódulos linfáticos locales de los becerros con artritis. Se examinó la región umbilical para detectar una posible onfalitis. Una vez que se detectó la cojera mediante la inspección de los becerros con artritis estando parados y caminando, se determinaron la marcha y el estado de la espina lumbar; se examinó el incremento de la temperatura local, la hinchazón y la sensibilidad a la flexión en el área de la articulación afectada. Se obtuvieron radiografías de la articulación afectada en las posiciones mediolateral (ML) y anteroposterior (AP). Para el examen ultrasonográfico, se colocó a los becerros sobre la mesa de operaciones, ajustando la posición de modo que la articulación afectada quedara arriba. Después de rasurar el pelo de la articulación afectada, se examinó la articulación longitudinal y transversalmente. Se sedó a los becerros aplicándoles hidrocloruro de xilacina en una dosis de 0.05 mg/kg. Posteriormente, se aseguró la antisepsia en la región de la articulación en la que se aplicó después una artrocentesis con solución de cloruro de sodio (Batticon). Se determinó la dirección específica de entrada en la articulación, se insertó en la articulación una cánula de tamaño 18 y se aspiraron aproximadamente 4 ml de líquido sinovial. Se tomaron aproximadamente 2 ml del líquido 256

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sinovial aspirado y se introdujeron en un tubo estéril para realizarles un examen físico (de color, volumen, viscosidad y fibrina), y los 2 ml restantes se colocaron en otro tubo estéril para someterlos a un examen microbiológico. El líquido sinovial de los animales con artritis fue enviado a un laboratorio microbiológico privado para que se analizara el agente, puesto que no hubo posibilidad de practicar un análisis microbiológico en el hospital veterinario. Después de la asepsia de la articulación afectada, se lavó la articulación interna con 500 ml de solución salina fisiológica al 0.9 %, utilizando la técnica de “probar hasta acertar” como tratamiento, dado que, según los propietarios de los becerros con artritis, ellos mismos o los médicos veterinarios habían administrado a los animales diversos antibióticos. Este proceso se repitió hasta que el líquido aspirado se volvió transparente. Después de la irrigación, se les sugirió a los propietarios de los animales que aplicaran en la articulación afectada una compresa antiséptica impregnada con una solución de cloruro de sodio al 0.1 % cada 24 h durante 15 días. Se suministró el antibiótico parenteral Ceftiofur Sodio (Ecosert6-IE) en una dosis de 1 ml im por cada 50 kg de peso vivo durante cinco días hasta identificar la bacteria en el líquido sinovial. Se seleccionó el antibiótico apropiado para combatir al microorganismo aislado en el examen microbiológico de líquido sinovial obtenido de la articulación, y se administró el antibiótico por vía parenteral durante 10 días. Además, se administró flunixina megalumina (Flumeglin-Teknovet) durante tres días para el control del dolor postoperativo, en una dosis de 2.2 ml im por cada 50 kg de peso vivo. Se garantizó la comunicación continua con los propietarios de los animales durante el periodo de tratamiento en cuanto a la recuperación. Veinticuatro (24) de los 50 becerros con artritis eran de la raza Montofon, 23 eran de la raza Simmental, 2 eran becerros indígenas, y 1 era una becerra Holstein. De los becerros Montofon, 6 eran machos y 8 eran hembras; 15 de los becerros Simmental eran machos y 8 eran hembras; todos los becerros criollos eran machos, y la becerra Holstein era hembra. En total, fueron 33 becerros machos y 17 hembras. En términos clínicos, en todos los becerros se identificaron síntomas generales tales como la fiebre alta, fatiga, pérdida de apetito, reducción de la movilidad, cojera, dolor en la flexión de la articulación afectada, incremento de la temperatura local, hinchazón y sensibilidad en diversos niveles. Además, se detectó onfalitis en 22 casos; neumonía en 2 casos, diarrea sanguinolenta en 1 caso y neumonía y diarrea en 2 casos. Treinta y siete (37) becerros fueron diagnosticados con monoartritis, y 13 becerros con poliartritis. Cuarenta y dos (42) de las lesiones se encontraron en las articulaciones carpales, 12 en las tarsales, 3 en rodilla con malformación (genu), 3 en articulaciones metacarpo-falángicas, 2 en las coxas y 1 en la articulación cubital. El Cuadro 1 muestra la ubicación y los síntomas clínicos de la lesión con artritis.

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Cuadro 1: Localización y síntomas clínicos de lesiones en becerros con artritis No. Protocolo Edad Sexo 1

10 63 11 64 12 69

1 mes F 10 días 25 días

Raza Simmental

Montofon

2 M meses

Montofon

8 días M

Montofon

4 meses 1.5 meses 1.5 meses 1.5 meses

Simmental

Montofon

Simmental

1 mes F 5 M meses 2 M meses

Montofon Simmental Montofon

13 78

4 días M

Montofon

14 84

10 días

Simmental

10 días

15 85

16 87

17 89 18 90 19 91 20 101

1.5 M meses 1 mes F 15 M días 2 F meses 1.5 F meses

21 104

1 mes M

22 105

15 días

Simmental

Holstein Montofon Simmental Simmental Montofon Criollo

Localización de la lesión Art. de carpo izquierdo Art. de carpo izquierdo Art. de carpo derecho Art. de carpo y tarso der. e izq. Art. de carpo izquierdo Art. de carpo izquierdo Art. de carpo derecho Art. de carpo derecho Art. de tarso izquierdo Art. de coxa derecha Art. de carpo derecho Art. de carpo izquierdo Art. de carpo der. e izq. Art. de carpo y de tarso der. e izq. Art. de carpo derecho e izquierdo Art. de carpo y tarso der. e izq. y art. de cúbito der. Art. Ccarpo izquierdo Art. de carpo izquierdo Art. de carpo derecho Art. de carpo izquierdo Art. de carpo derecho e izquierdo Art. de carpo izquierdo 258

Reducción de la movilidad

Cojera

Dolor Inflama- Sensibi- Incremento en la ción lidad del calor flexión

+++

+ +

+++

+ + ++ +++ ++ + + ++ +

++ +++

+++

++ +++

+++

+ ++

+++

+ +++ + +++

++ +++

+++

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23 108

1 mes M

Montofon

24 109

1.5 F meses

Montofon

25 110

1 mes F

Montofon

26 113

1 mes M

Simmental

27 117 28 119 29 128 30 129 31 130 32 132 33 135 34 136

12 días 2 meses 1.5 meses 15 días 20 días 2 meses 2 meses 1.5 meses

Montofon

Simmental

Montofon

Simmental

Native race

Montofon

35 138

1 mes M

Simmental

36 140

2 M meses

Montofon

37 141 38 144 39 145

40 146

41 149 42 153

2 M meses 3 M meses 25 M días 1.5 M meses 2 M meses 20 M días

Simmental Montofon Montofon

Simmental

Montofon Montofon

43 155

1 mes M

Montofon

44 159

15 días

Simmental

45 166

15 días

Simmental

Art. de carpo izquierdo Art. de carpo izquierdo Art. de carpo derecho Art. de genu derecho Art. de carpo izquierdo Art. de carpo izquierdo Art. de tarso izquierdo Art. de tarso izquierdo Art. de carpo derecho Art. de genu derecho Art. de carpo derecho Art. de carpo izquierdo Art. de carpo derecho Art. de tarso derecho e izqhierdo Art. de carpo derecho Art. de carpo izquierdo Art. de carpo izquierdo Art. de carpo derecho y art. tarso izquierdo Art. de carpo izquierdo Art. de carpo izquierdo Arts. de carpo y tarso derechos y metacarpofalángica derecha Arts. de carpo y tarso der. e izq. Art. de metacarcarpofalángica 259

+++

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46 169

1.5 F meses

Montofon

47 181

2 M meses

Simmental

48 182

1 mes M

Simmental

49 190

2 F meses

Simmental

50 191

2 F meses

Simmental

derecha Art. de carpo derecho Art. de carpo der., art. de genu izq., art. de coxa izq. Arts. de carpo, tarso y metacarpofalángicas der. e izq. Art. de carpo derecho e izquierdo, art. de tarso derecho Art. de carpo derecho

+++

En el examen radiológico, se detectó un incremento de la opacidad, así como tensión articular debida a una purulencia incrementada, o al aumento de la purulencia con gas en 18 casos (Figura 1, a,b); estrechamento intraarticular y degeneración de la superficie articular en 6 casos. No se detectó anormalidad en el tejido óseo en 26 casos.

Figura 1: a) Incremento de la radioopacidad en la apariencia radiolucente punteada alrededor de la articulación tibiotarsal debida a artritis purulenta en un caso de tarsitis; b) Apariencia radioluciente formada debido a una posible actividad microbiana en las articulaciones fémoropatelar y fémorotibial en un caso de gonitis a

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Al realizarse el examen ultrasonográfico, se detectó en 18 casos un incremento del espacio articular, y los cuerpos corpusculares reflectantes (depósitos de fibrina o residuos de tejido) mostraron una hiperecogenicidad intensa en el aspecto anecoico del líquido sinovial; el líquido sinovial tenía un aspecto hiperecogénico y heterogéneo (Figura 2a). En seis casos, la superficie del cartílago articular tenía una apariencia lisa con una línea hiperecoica de aspecto agudo (Figura 2b). No se detectó ninguna anormalidad en 26 casos. Siete líquidos sinoviales tomados de los becerros con artritis eran móviles, transparentes y de aspecto normal; 25 líquidos sinoviales eran turbios y variaban de color desde un amarillo claro hasta un café-amarillo oscuro y la viscosidad del líquido sinovial disminuía a varios niveles; el líquido sinovial resultó completamente purulento en 18 casos. Se obtuvo un resultado bacteriológicamente positivo de 38 de los líquidos sinoviales, y un resultado negativo de 12 de ellos.

Figura 2: a) Aspecto hiperecogéneo y heterogéneo del espacio sinovial en un caso de artritis (becerro Simmental macho de 10 días de edad); b) Ecogenicidad compleja y aspecto heterogéneo del espacio sinovial y manchas corpusculares en el líquido sinovial en un caso de artritis purulenta (becerro Simmental macho de 36 días de edad) a

Según los resultados de los análisis microbiológicos, se detectó S. aureus en 13 casos; Trueperella pyogenes en 8 casos, S. pluranimalium en 8 casos, Mycoplasma bovis en 6 casos, E. coli en 5 casos, especies Saprophyte en 1 caso y bacterias Acinetobacter en 1 caso (Cuadro 2). La artritis es una enfermedad común que se detecta con frecuencia en becerros recién nacidos que ocasiona grandes pérdidas económicas y que presenta síntomas de fiebre, dolor, hinchazón y cojera en diversos grados(7,8,18). A nivel crítico, las artritis se clasifican como asépticas o sépticas, y las artritis sépticas son importantes(9,12).

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En este estudio, la detección de onfalitis en 22 casos, de neumonía en 2 casos, de diarrea sanguinolenta en 1 caso y de neumonía y diarrea en 2 casos sugiere que el calostro suministrado a los becerros tras el parto no fue suficiente, y por ende la infección se propagó rápidamente, causando una artritis séptica y otras formas clínicas(9,17,20).

Cuadro 2: Hallazgos microbiológicos en el líquido sinovial de becerros con artritis No.

Protocolo

Edad

Sexo

Raza

Localización de la lesión

Microorganismo aislado Streptococcus pluranimalium E.coli Mycoplasma bovis Staphylococcus aureus

1 mes

Simmental

Articulación del carpo izquierdo

2 3 6

47 53 57

M F F

Montofon Montofon Simmental

Articulación del carpo izquierdo Articulación del carpo derecho Articulación del carpo izquierdo

Montofon

Articulación del carpo derecho

Montofon

Articulación del carpo derecho

10 días 25 días 4 meses 1.5 meses 1.5 meses 1.5 mes

Simmental

10 días

Simmental

1.5 meses

Simmental

17 18 19

89 90 91

F M F

Holstein Montofon Simmental

101

1 mes 15 días 2 meses 1.5 meses

Mycoplasma bovis, Staphylococcus aureus Articulación del tarso izquierdo E.coli Articulaciones del carpo y del tarso Streptococcus derechos e izquierdos pluranimalium Articulaciones del carpo derecho e izquierdo, del tarso derecho y del cúbito Trueperella pyogenes derecho Articulación del carpo izquierdo Trueperella pyogenes Articulación del carpo izquierdo Trueperella pyogenes Articulación del carpo derecho Trueperella pyogenes

Simmental

Articulación del carpo izquierdo

104

1 mes

Montofon

22 23 25

105 108 110

15 días 1 mes 1 mes

M M F

Criollo Montofon Montofon

119

2 meses F

Simmental

128

1.5 meses

Montofon

Articulación del tarso izquierdo

129

15 días

Simmental

Articulación del tarso izquierdo

130

20 días

Simmental

Articulación del carpo derecho

132

2 meses M

Simmental

Articulación del genu derecho

135

Criollo

Articulación del carpo derecho

136

Montofon

Articulación del carpo izquierdo

Staphylococcus aureus

138

2 meses F 1.5 F meses 1 mes M

Trueperella pyogenes, Staphylococcus aureus, E coli Mycoplasma bovis Streptococcus pluranimalium Trueperella pyogenes

Simmental

140

2 meses M

Montofon

Articulación del carpo derecho Staphylococcus aureus Articulaciones del tarso derecho e Streptococcus izquierdo pluranimalium

Mycoplasma bovis

Trueperella pyogenes

Articulaciones del carpo derecho e Acinetobacter towner, izquierdo Staphylococcus aureus. Articulación del carpo izquierdo Trueperella pyogenes Articulación del carpo izquierdo Staphylococcus aureus Articulación del carpo derecho Staphylococcus aureus Streptococcus Articulación del carpo izquierdo pluranimalium

262

Staphylococcus aureus

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141

2 meses M

Simmental

Articulación del carpo derecho

144

3 meses M

Montofon

Articulación del carpo izquierdo

145

25 días

Montofon

Articulación del carpo izquierdo

146

Simmental

153

1.5 meses 20 días

Montofon

159

15 días

Simmental

166

15 días

Simmental

169

1.5 meses

Montofon

181

2 meses M

Simmental

182

1 mes

Simmental

190

2 meses F

Simmental

191

2 meses F

Simmental

Streptococcus pluranimalium Staphylococcus aureus Sstreptococcus pluranimalium

Articulación del carpo derecho y E.coli articulación del tarso derecho Articulación del carpo izquierdo E.coli Articulaciones del carpo derecho e izquierdo y articulación del tarso Staphylococcus aureus izquierdo Articulación metacarpofalángica Staphylococcus aureus derecha Articulación del carpo derecho

Trueperella pyogenes

Art. del carpo derecho, art. del genu Mycoplasma bovis izquierdo, art. de la coxa izquierda Articulaciones del carpo, arts. del tarso y Mycoplasma bovis, arts. metacarpofalángicas derechas e Streptococcus izquierdas pluranimalium Art. del carpo derecho e izquierdo, Staphylococcus aureus articulación del tarso derecho Articulación del carpo derecho Saprophyte spp.

Es posible hacer un diagnóstico definitivo temprano de la artritis mediante exámenes clínicos, radiológicos y ultrasonográficos, así como con exámenes físicos y microbiológicos del líquido sinovial(10,21,22). En este estudio se garantizó el diagnóstico temprano de las enfermedades articulares con una anamnesis y exámenes clínicos, radiológicos y ultrasonográficos y estuvo apoyado por exámenes físicos y microbiológicos del líquido sinovial. Se han reportado en los becerros con artritis hallazgos clínicos tales como cojera en diversos grados, inflamación sensible a la palpación, dolorosa y edematosa, con fiebre alta y restricción del movimiento de flexión(6,8,11). En el estudio se observó una cojera severa en 30 casos, moderada en 11 casos y leve en 9 casos. Además se detectó monoartritis en 37 becerros y poliartritis en 13. Según los reportes, con frecuencia se presentan casos de artritis en las articulaciones carpales y en genu en los animales jóvenes, y en las articulaciones tarsal y de la cuartilla en animales adultos. El hecho de que en este estudio se haya detectado artritis en la articulación carpal de 42 de los 50 becerros con artritis, y en la articulación tarsal en 12 becerros, confirma esta información. Los primeros hallazgos radiográficos en la artritis son inflamación de los tejidos suaves y dilatación del espacio articular 24 h después de la formación de la enfermedad, debido a la acumulación de gas. Se ha reportado que los principales hallazgos radiográficos aparecen aproximadamente de 10 a 14 días de progreso de la enfermedad. En los casos crónicos se observa una reducción del espacio articular debido a una lisis del hueso subcondral, a una periostitis, a una osteomielitis y a formaciones osteofíticas(2,6,9). En el examen radiológico, se detectó un incremento de la opacidad, así como tensión capsular debida a un aumento de la purulencia sola o con gas en 18 casos, y

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estrechamiento intraarticular y degeneración de la superficie articular en seis casos, mientras que en 26 casos no se observó ninguna anormalidad en el tejido óseo ni en la articulación. En los casos de artritis, es sumamente difícil hacer un diagnóstico temprano antes de que se presenten los síntomas clínicos; sin embargo, es posible diagnosticar la artritis sin síntomas clínicos, por medio de la ultrasonografía diagnóstica. Según se reporta, con el examen ultrasonográfico ocurrirán varios cambios en el volumen del líquido sinovial, el aspecto ecogénico de éste, en la membrana sinovial, en la superficie articular y en la relación entre la articulación y el tejido periférico(6,22). En este estudio, el ultrasonográfico de los casos de artritis séptica reveló que el líquido sinovial tenía un aspecto hiperecogénico y una estructura heterogénea, y que había cuerpos reflexivos corpusculares que presentan una hiperecogenicidad intensa en el líquido sinovial en 18 casos, mientras que la superficie del cartílago articular formó una línea hiperecóica y presentó una superficie lisa en seis casos. En 26 casos de artritis no se detectó ninguna anormalidad. El líquido synovial es un plasma normalmente transparente o de un color amarillo ligeramente pálido con aspecto de clara de huevo y con baja fluidez, y contiene proteínas(7,9). Se reporta que el líquido sinovial en los casos de artritis es turbio, de un color que va del amarillo claro al caféamarillo oscuro, con menor viscosidad y mayor volumen, y que el líquido articular contiene coágulos de fibrina y en la mayoría de los casos es purulento(11,19). En este estudio, el líquido sinovial presentó movilidad y un aspecto normal y transparente en 7 casos, en 25 casos la viscosidad del líquido sinovial fue menor y los colores de éste variaron de amarillo claro a caféamarillo claro, y en 18 casos el líquido sinovial presentó purulencia. Se reporta que el M. bovis es el microorganismo más común aislado del líquido sinovial en los casos de artritis séptica(6,7,13). Otros(7,22) han indicado que el S. aureus es el microorganismo aislado más común en los casos de artritis séptica. Según Mulon et al. (17), el microorganismo más común fue Trueperella pyogenes en 172 casos de artritis séptica, y Dogan et al. (18) han señalado que los organismos aislados más comunes en becerros con artritis séptica eran Trueperella pyogenes y E. coli. En este estudio, el más común (n= 13) fue S. aureus. Los otros microorganismos identificados fueron Streptococcus pluranimalium (n= 8), Trueperella pyogenes (n= 8), M. bovis (n= 6), E. coli (n= 5) Saprophyte spp. (n= 1) y Acinetobacter spp. (n= 1) según la prevalencia de los aislamientos. Como resultado, se concluye que los exámenes clínicos, radiológicos, ultrasonográficos y físicos y microbiológicos del líquido sinovial proporcionan información detallada durante el diagnóstico de la artritis séptica en los becerros, y que los hallazgos de los exámenes microbiológicos brindan información importante sobre todo en el diagnóstico temprano de la enfermedad y contribuyen en gran medida al tratamiento. Se sugiere comentar que en este estudio el agente más frecuentemente aislado fue S. aureus (n= 13).

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Los autores declaran que no tienen relaciones financieras ni personales que puedan haberlos influido de maneras inapropiada al escribir este artículo.

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13. Shoieb SM, Sayed M, Ahmed M. Clinical and clinicopathological findings of arthritic camel calf associated with mycoplasma infection (Camelus dromedarius). J Dairy Vet Anim Res 2016;3(1):68. 14. Landerer MCH, Habermacher J, Wenger B, Suter MM, Steiner A. Slow release antibiotics for treatment of septic arthritis in large animals. The Vet J 2010;184:14-20. 15. Rohde C, Anderson DE, Desrochers A, St-Jean G, Hull BL, Rings DM. Synovial fluid analysis in cattle: A review of 130 cases. Vet Surg 2000;29:341-346. 16. Jackson P. Treatment of septic artritis in calves. Farm Anim Pract 1999;596-601. 17. Mulon PY, Desrochers A, Francoz D. Surgical management of septic arthritis. Vet Clin Food Anim 2016;32:777-795. 18. Dogan E, Yanmaz LE, Okumus Z, Kaya M, Senocak MG, Cengiz S. Radiographic, ultrasonographic and thermographic findings in neonatal calves with septic arthritis: 82 cases (2006-2013). Atatürk Üniversitesi Vet Bil Derg 2016;11(1):6-12. 19. Gharagozlou MJ, Najafi J, Tabatabayi AH, Khazrainia P. Apathologic and microbiologic study on bovine arthritis associated with mycoplasma spp. Arch Razi Ins 2004;58:97-104. 20. Arican M, Elma E, Ozkan K. Clinical evaluation of infectious arthritis in extremities in calves. Turkish J Vet Surg 1998;4(1-2):5-7. 21. Bumin A, Temizsoylu MD, Kibar M, Alkan Z. Clinical, radiographic and arthroscopic evaluation of prulent arthritis in calves. Ankara Üniv Vet Fak Derg 2001;48:183-187. 22. Gorgul OS, Salci H, Özakin C, Cilo BD, Seyrek-Intas D, Celimli N, Cecen G. Arthroscopic diagnosis and comparison of arthroscopic lavage and intraarticular antibiotic applications in the treatment of experimentally induced different stage septic arthritis in goats. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2010;16(6):957-967.

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Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias

Edición Bilingüe Bilingual Edition

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 10 Núm. 1, pp. 1-266, ENERO-MARZO-2019

ISSN: 2448-6698

CONTENIDO CONTENTS Pags. Frecuencia de Cryptosporidium en perros asociados a establos lecheros y en áreas urbanas del estado de Aguascalientes, México

Distribución potencial de Musca domestica en el municipio de Jesús María, Aguascalientes, con el uso de escenarios de cambio climático

Potential distribution of Musca domestica in Jesús María Municipality, Aguascalientes, Mexico, based on climate change scenarios Antonio de Jesús Meraz Jiménez, Armando López Santos, Carlos Alberto García Munguía, Jorge Alejandro Torres González, Alberto Margarito García Munguía..........................14

Control de la helmintiasis en becerros criados en una región semiárida cálida de Brasil

Helminthiasis control in calves raised in a hot Semi-arid area Ludmilla de Fá�ma Leal Pereira, Eduardo Robson Duarte, Gabriela Almeida Bastos, Viviane de Oliveira Vasconcelos, Evely Giovanna Leite Costa, Laydiane de Jesus Mendes, Idael Matheus Góes Lopes, Iara Maria Franca Reis..........................................................................................................................................................30

Importancia de la jerarquía social sobre los comportamientos alimenticios y parasitarios de ovinos criados en dos sistemas pastoriles

Importance of sheep social hierarchy on feeding behavior and parasite load in silvopastoral and grass monoculture grazing systems Carolina Flota-Bañuelos, Juan A. Rivera-Lorca, Bernardino Candelaria-Mar�nez........................................................................................................................................................52

Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico para becerros del altiplano mexicano

Isolation and identification of potentially probiotic lactic acid bacteria for Holstein calves in the Mexican Plateau Patricia Landa-Salgado, Yesenia Caballero-Cervantes, Efrén Ramírez-Bribiesca, Ana María Hernández-Anguiano, Luz Mariana Ramírez-Hernández, David Espinosa-Victoria, David Hernández-Sánchez..............................................................................................................................................68

Efecto de monensina intraruminal sobre el β-hidroxibutirato, enfermedades del periparto, producción de leche y sus componentes en ganado Holstein Effect of an intraruminal monensin bolus on blood β-hydroxybutyrate, peripartum diseases, milk yield and solids in Holstein cows Pedro Melendez, Alejandra Arévalos, Mario Duchens, Pablo Pinedo..........................................................................................................................................................................84

Evaluación y análisis sensorial del Queso Bola de Ocosingo (México) desde la perspectiva del consumidor

Consumer evaluation and sensory analysis of Queso Bola de Ocosingo (Mexico) Mónica Agudelo-López, Alfredo Cesín-Vargas, Angélica Espinoza-Ortega, Benito Ramírez-Valverde........................................................................................................................104

Factors affecting the ruminal microbial composition and methods to determine microbial protein yield. Review

Factores que afectan la composición microbiana ruminal y métodos para determinar el rendimiento de la proteína microbiana. Revisión Ezequias Cas�llo-López, María G. Domínguez-Ordóñez............................................................................................................................................................................................120

Dinámica de infección por Cystoisospora suis (Isospora suis) en una granja piloto ubicada en el estado Carabobo, Venezuela

Infection dynamics of Cystoisospora suis (Isospora suis) on a pilot swine farm in Carabobo State, Venezuela Juan Carlos Pinilla León, Natalia Da Silva Borges.......................................................................................................................................................................................................149

Design of an electrochemical prototype to determine relative NaCl content and its application in fresh cheeses

Desarrollo y evaluación de un prototipo electroquímico para determinar el contenido relativo de NaCl y su aplicación en quesos frescos Rubén Cázares-Gallegos, Juan Antonio Vidales-Contreras, Alejandro Isabel Luna-Maldonado, Michael E. Hume, Ramón Silva-Vázquez, Armando Quintero-Ramos, Gerardo Méndez-Zamora 161

La calidad sanitaria del chorizo rojo tradicional que se comercializa en la ciudad de Toluca, Estado de México

Hygienic quality of the traditional red chorizo commercialized in the city of Toluca, State of Mexico Ana Laura Becerril Sánchez, Octavio Dublán García, Aurelio Domínguez-López, Daniel Arizmendi Cotero, Baciliza Quintero-Salazar....................................................................172

Impacto de la vigilancia sanitaria del clembuterol en Guerrero, México: Resultados de 2011 a 2015

Impact of health monitoring of clenbuterol in Guerrero, Mexico: Results from 2011 to 2015 Luis Alberto Chávez-Almazán, Jesús Antonio Díaz-Or�z, Diana Garibo-Ruiz, Mario Alberto Alarcón-Romero, Miguel Angel Mata-Diaz, Beatriz Pérez-Cruz, Elizabeth Godoy-Galeana..................................................................................................................................................................186

Composición botánica y valor nutritivo de la dieta consumida por bovinos en un área invadida por pasto rosado [Melinis repens (willd.) Zizka] Botanical composition and nutritive value of the diet consumed by cattle in an area invaded by natal grass [Melinis repens (Willd.) Zizka] Obed Gabriel Gu�érrez Gu�érrez, Carlos Raúl Morales Nieto, José Carlos Villalobos González, Oscar Ruíz Barrera, Juan Ángel Ortega Gu�érrez, Jorge Palacio Núñez.............212

Dosis letal media (DL50) y reducción de crecimiento (GR50) por irradiación gamma en pasto garrapata (Eragrostis superba)

Mean lethal dose (LD50) and growth reduction (GR50) due to gamma radiation in Wilman lovegrass (Eragrostis superba) Alan Álvarez-Holguín, Carlos Raúl Morales-Nieto, Carlos Hugo Avendaño-Arrazate, Raúl Corrales-Lerma, Federico Villarreal-Guerrero, Eduardo Santellano-Estrada, Yaudiel Gómez-Simuta...............................................................................................................................................................................................227

Rendimiento de forraje y sus componentes en variedades de alfalfa en el altiplano de México

Yield of forage and its components in alfalfa varieties of the Mexican high plateau Adelaido Rafael Rojas García, Nicolás Torres Salado, María de los Ángeles Maldonado Peralta, Jerónimo Herrera Pérez, Paulino Sánchez San�llán, Aldenamar Cruz Hernández, Félix de Jesús Mayren Mendoza, Alfonso Hernández Garay............................................................................................239

Evaluation of clinical, radiological, ultrasonographic and microbiological findings of septic arthritis in 50 calves

Evaluación de los hallazgos clínicos, radiológicos, ultrasonográficos y microbiológicos de la artritis séptica en 50 becerros İbrahim Yurdakul..................................................................................................................................................................................................................................................... 254

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 10 Núm. 1, pp. 1- 266, ENERO-MARZO-2019

Cryptosporidium infection frequency in dogs on dairy farms and in urban areas of the state of Aguascalientes, Mexico Irene Vitela-Mendoza, Kenia Padilla Díaz, Carlos Cruz-Vázquez, Le�cia Medina-Esparza, Miguel Ramos-Parra...........................................................................................................1

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 10 Núm. 1, pp. 1-266, ENERO-MARZO-2019