RMCP Vol. 11, Núm. 2 (2020): Abril-Junio [versión en español] by Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias

Edición Bilingüe Bilingual Edition

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 11 Núm 2, pp. 311-604, ABRIL-JUNIO-2020

ISSN: 2448-6698

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 11 Núm. 2, pp. 311-604, ABRIL-JUNIO-2020

Ganado caprino en Piedras Negras, Coahuila. Fotografía: INIFAP, Concurso de fotografía 2010.

REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS Volumen 11 Número 2, AbrilJunio 2020. Es una publicación trimestral de acceso abierto, revisada por pares y arbitrada, editada por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Avenida Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina, Delegación Coyoacán, C.P. 04010, Cuidad de México, www.inifap.gob.mx Distribuida por el Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad, Km 15.5 Carretera México-Toluca, Colonia Palo Alto, Cuidad de México, C.P. 05110. Editor responsable: Arturo García Fraustro. Reservas de Derechos al Uso Exclusivo número 04-2016-060913393200-203. ISSN: 2448-6698, otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor (INDAUTOR). Responsable de la última actualización de este número: Arturo García Fraustro, Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad, Km. 15.5 Carretera México-Toluca, Colonia Palo Alto, Ciudad de México, C.P. 015110. http://cienciaspecuarias. inifap.gob.mx, la presente publicación tuvo su última actualización en mayo de 2020.

DIRECTORIO EDITOR EN JEFE Arturo García Fraustro

FUNDADOR John A. Pino EDITORES ADJUNTOS Oscar L. Rodríguez Rivera Alfonso Arias Medina

EDITORES POR DISCIPLINA Dra. Yolanda Beatriz Moguel Ordóñez, INIFAP, México Dr. Ramón Molina Barrios, Instituto Tecnológico de Sonora, México Dra. Maria Cristina Schneider, PAHO, Estados Unidos Dra. Elisa Margarita Rubí Chávez, UNAM, México Dr. Feliciano Milian Suazo, Universidad Autónoma de Querétaro, México Dr. Javier F. Enríquez Quiroz, INIFAP, México Dra. Martha Hortencia Martín Rivera, Universidad de Sonora URN, México Dr. Fernando Arturo Ibarra Flores, Universidad de Sonora URN, México Dr. James A. Pfister, USDA, Estados Unidos Dr. Eduardo Daniel Bolaños Aguilar, INIFAP, México Dr. Sergio Iván Román-Ponce, INIFAP, México Dr. Jesús Fernández Martín, INIA, España Dr. Sergio D. Rodríguez Camarillo, INIFAP, México Dr. Martin Talavera Rojas, Universidad Autónoma del Estado de México, México Dra. Maria Salud Rubio Lozano, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dra. Elizabeth Loza-Rubio, INIFAP, México Dr. Juan Carlos Saiz Calahorra, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, España Dra. Silvia Elena Buntinx Dios, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dr. José Armando Partida de la Peña, INIFAP, México Dr. José Luis Romano Muñoz, INIFAP, México. Dr. Alejandro Plascencia Jorquera, Universidad Autónoma de Baja California, México Dr. Juan Ku Vera, Universidad Autónoma de Yucatán, México Dr. Ricardo Basurto Gutiérrez, INIFAP, México. Dr. Luis Corona Gochi, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dr. Juan Manuel Pinos Rodríguez, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, México Dr. Carlos López Coello, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México Dr. Arturo Francisco Castellanos Ruelas, Facultad de Química. UADY Dra. Guillermina Ávila Ramírez, UNAM, México. Dr. Emmanuel Camuus, CIRAD, Francia. Dr. Héctor Jiménez Severiano, INIFAP., México Dr. Juan Hebert Hernández Medrano, UNAM, México. Dr. Adrian Guzmán Sánchez, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, México Dr. Eugenio Villagómez Amezcua Manjarrez, INIFAP, CENID Salud Animal e Inocuidad, México Dr. Fernando Cervantes Escoto, Universidad Autónoma Chapingo, México Dr. Adolfo Guadalupe Álvarez Macías, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, México Dr. Alfredo Cesín Vargas, UNAM, México.

TIPOGRAFÍA Y FORMATO Nora del Rocío Alfaro Gómez Indizada en el “Journal Citation Report” Science Edition del ISI . Inscrita en el Sistema de Clasificación de Revistas Científicas y Tecnológicas de CONACyT; en EBSCO Host y la Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal (RedALyC) (www.redalyc.org); en la Red Iberoamericana de Revistas Científicas de Veterinaria de Libre Acceso (www.veterinaria.org/revistas/ revivec); en los Índices SCOPUS y EMBASE de Elsevier (www.elsevier. com).

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Se publican en la revista tres categorías de trabajos: Artículos Científicos, Notas de Investigación y Revisiones Bibliográficas (consultar las Notas al autor); la responsabilidad de cada trabajo recae exclusivamente en los autores, los cuales, por la naturaleza misma de los experimentos pueden verse obligados a referirse en algunos casos a los nombres comerciales de ciertos productos, ello sin embargo, no implica preferencia por los productos citados o ignorancia respecto a los omitidos, ni tampoco significa en modo alguno respaldo publicitario hacia los productos mencionados.

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REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS REV. MEX. CIENC. PECU.

VOL. 11 No. 2

ABRIL-JUNIO-2020

CONTENIDO ARTÍCULOS

Pág. Preliminary study of ivermectin residues in bovine livers in the Bogota Savanna Estudio preliminar de residuos de ivermectina en hígado de bovinos en la Sabana de Bogotá Carmen Teresa Celis-Giraldo, Diego Ordóñez, Leonardo Roa, Sergio Andrei Cuervo-Escobar, Dajane Garzón-Rodríguez, Milena Alarcón-Caballero, Luisa Fernanda Merchán……………………………………311

Eficacia de la ivermectina para el control de nematodos gastrointestinales en burros (Equus asinus) en el altiplano mexicano Ivermectin effectiveness for gastrointestinal nematode control in donkeys (Equus asinus) in the Mexican High Plateau Guadalupe Galicia-Velázquez, Arturo Villarreal-Nieto, Cristina Guerrero-Molina, Cintli Martínez-Ortizde-Montellano……………………………………………………………………………………………………….…..…326

Artemisia cina 30 CH homeopathic treatment against Haemonchus contortus Artemisia cina 30 CH como tratamiento homeopático contra el Haemonchus contortus Rosa Isabel Higuera-Piedrahita, María Eugenia López-Arellano, Raquel López-Arellano, César CuencaVerde, Jorge Alfredo Cuéllar-Ordac .................................................................................................. 342

Inclusión de harina de Tithonia diversifolia en raciones para gallinas ponedoras de primer ciclo y su efecto sobre la pigmentación de yema de huevo Tithonia diversifolia meal in diets for first-cycle laying hens and its effect on egg yolk color

María Elena Carranco-Jáuregui, Vilma Barrita-Ramírez, Benjamín Fuente-Martínez, Ernesto ÁvilaGonzález, Leonor Sanginés-García.................................................................................................... 355

Efecto de un complejo multienzimático y un probiótico en gallinas de postura alimentadas con dietas sorgo-soya-canola Effect of a multienzyme complex and a probiotic in laying hens fed sorghum-soybeanrapeseed diets Pedro Juárez Morales, Arturo Cortes Cuevas, José Arce Menocal, Juan Carlos Del Río García, Gabriela Gómez Verduzco, Ernesto Avila González ......................................................................................... 369

Tendencias genéticas y fenotípicas para pico productivo, rendimiento lechero y persistencia de lactación en la raza Murciano-Granadina Phenotypic and genetic trends for peak yield, milk yield, and lactation persistency in the Murciano-Granadina breed Judith Carmen Miranda Alejo, José Manuel León Jurado, Camillo Pieramati, Mayra Mercedes Gómez Carpio, Jesús Valdés Hernández, Cecilio José Barba Capote ............................................................. 380

III

Calidad seminal de ovinos de pelo suplementados con Moringa oleifera (Moringaceae) y Trichanthera gigantea (Acanthaceae) Semen quality of hair sheep supplemented with Moringa oleifera (Moringaceae) and Trichanthera gigantea (Acanthaceae) Marco A. Ramírez-Bautista, Julio P. Ramón-Ugalde, Edgar Aguilar-Urquizo, William Cetzal-Ix, Roberto Sanginés-García, Álvaro E. Domínguez-Rebolledo, Ángel T. Piñeiro-Vázquez……………………….……393

Use of a glycogenic precursor during the prepartum period and its effects upon metabolic indicators and reproductive parameters in dairy cows Uso de un precursor glucogénico en el preparto y su efecto sobre indicadores de energía y parámetros reproductivos en vacas lecheras Carlos Leyva Orasma, Jesus Jaime Benitez-Rivas, Juan Luis Morales Cruz, Cesar Alberto MezaHerrera, Oscar Ángel-García, Fernando Arellano-Rodríguez, Guadalupe Calderón-Leyva, Dalia Ivette Carrillo-Moreno, Francisco Veliz Deras……………………………………………………………………….…….408

Relationship of the compositional content and sanitary quality of Holstein cows’ milk of the high tropic of Nariño Relación entre la calidad composicional y sanitaria de la leche de bovinos Holstein del trópico alto de Nariño Henry Armando Jurado-Gámez, Carlo Eugenio Solarte-Portilla, Álvaro Javier Burgos-Arcos, Aldemar González-Rodríguez, Carol Rosero-Galindo ...................................................................................... 421

Caracterización de Aspergillus flavus y cuantificación de aflatoxinas en pienso y leche cruda de vacas en Aguascalientes, México Characterization of Aspergillus flavus and quantification of aflatoxins in feed and raw milk of cows in Aguascalientes, Mexico Erika Janet Rangel-Muñoz, Arturo Gerardo Valdivia-Flores, Onésimo Moreno-Rico, Sanjuana Hernández-Delgado, Carlos Cruz-Vázquez, María Carolina de-Luna-López, Teódulo Quezada-Tristán, Raúl Ortiz-Martínez, Netzahualcóyotl Máyek-Pérez ......................................................................... 435

Comparación de la castración quirúrgica al nacimiento versus inmunocastration sobre las características de la canal y carne en machos Holstein Comparison of surgical castration at birth versus immunocastration on carcass and meat traits in growing Holstein males Jorge A. Cervantes-Cazares, Cristina Pérez-Linares, Fernando Figueroa-Saavedra, Alma R. TamayoSosa, Alberto Barreras-Serrano, Francisco G. Ríos-Rincón, Eduardo Sánchez-López, Issa C. GarcíaReynoso, Pedro Mendoza Peraza, Angelina León Villanueva, Luis A. García-Vega ........................... 455

Ascosferosis en abejas melíferas y su relación con factores ambientales en Jalisco, México Ascospherosis in honey bees and its relationship to environmental factors in Jalisco, Mexico José María Tapia-González, Gustavo Alcazar-Oceguera, José Octavio Macías-Macías, Francisca Contreras-Escareño, José Carlos Tapia-Rivera, Tatiana Petukhova, Ernesto Guzmán-Novoa .......... 468

Desarrollo y validación de un patrón visual para la evaluación del color de la carne de bovino en México Development and validation of a visual pattern for evaluating beef meat color in Mexico Sara Salinas Labra, María Salud Rubio Lozano, Diego Braña Varela, Rubén Danilo Méndez Medina, Enrique Jesús Delgado Suárez .......................................................................................................... 479

REVISIONES DE LITERATURA

Bolos intrarruminales con liberación controlada de minerales traza. Revisión Trace mineral controlled-release intraruminal boluses. Review Misael León-Cruz, Efrén Ramírez-Bribiesca, Raquel López-Arellano, Leonor Miranda-Jiménez, Gabriela Rodríguez-Patiño, Víctor M. Díaz-Sánchez, Alma L. Revilla-Vázquez................................................ 498

Implicaciones, tendencias y perspectivas del transporte de larga distancia en el ganado bovino. Revisión Implications, trends, and prospects for long-distance transport in cattle. Review Marcela Valadez Noriega, Genaro Cvabodni Miranda de la Lama ..................................................... 517

NOTAS DE INVESTIGACIÓN

Growth, viability, and post-acidification of Lactobacillus plantarum in bovine transition milk Crecimiento, viabilidad y post-acidificación de Lactobacillus plantarum en la leche de transición bovina Hugo Calixto Fonseca, Eduardo Robson Duarte, Lívia Caroliny Almeida Santos Souza, Emanuelly Gomes Alves Mariano, Ana Clarissa dos Santos Pires, Tatiana Santos Lima, Maximiliano Soares Pinto .......................................................................................................................................................... 539

Caracterización de la leche y queso artesanal de la región de Ojos Negros, Baja California, México Characterization of the milk and artisanal cheese of the region of Ojos Negros, Baja California, Mexico Laura E. Silva-Paz, Gerardo E. Medina-Basulto, Gilberto López-Valencia, Martin F. Montaño-Gómez, Rafael Villa-Angulo, José C. Herrera Ramírez, Ana L. González-Silva, Francisco Monge-Navarro, Sergio A. Cueto-González, Gerardo Felipe-García ........................................................................................ 553

Factores asociados al decomiso de hígados positivos a Fasciola sp en una zona endémica del sureste de México Factors associated with the seizure of livers positive to Fasciola sp in an endemic area of southeastern Mexico Nadia Florencia Ojeda-Robertos, Roberto González-Garduño, Santiago Cornelio-Cruz, Jorge Alonso Peralta-Torres, Carlos Luna-Palomera, Carlos Machain-Williams, Heliot Zarza, Oswaldo Margarito Torres-Chablé, Enrique Reyes-Novelo, Carlos Baak-Baak, Alfonso Chay-Canul................................ 565

Análisis genético del desarrollo en peso vivo y tasa de gestación en primer parto en bovinos Brahman de Venezuela Genetic analysis of live weight and pregnancy rate at first calving in Brahman cattle from Venezuela Alejandro-Palacios-Espinosa, Omar-Verde, Narciso-Ysac-Ávila-Serrano, Alberto-Menéndez-Buxadera .......................................................................................................................................................... 576

Pedigree analysis of Santa Inês sheep and inbreeding effects on performance traits Análisis de pedigrí de las ovejas Santa Inês y los efectos de la endogamia en los rasgos de rendimiento Ana Carla Borges Barbosa, Gabrieli de Souza Romano, Jonatan Mikhail Del Solar Velarde, José Bento Sterman Ferraz, Victor Breno Pedrosa, Luís Fernando Batista Pinto ................................................ 590

Actualización: marzo, 2020 NOTAS AL AUTOR La Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias se edita completa en dos idiomas (español e inglés) y publica tres categorías de trabajos: Artículos científicos, Notas de investigación y Revisiones bibliográficas.

bibliográficas una extensión máxima de 30 cuartillas y 5 cuadros. 6.

Los autores interesados en publicar en esta revista deberán ajustarse a los lineamientos que más adelante se indican, los cuales en términos generales, están de acuerdo con los elaborados por el Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (CIERM) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437. 1.

Sólo se aceptarán trabajos inéditos. No se admitirán si están basados en pruebas de rutina, ni datos experimentales sin estudio estadístico cuando éste sea indispensable. Tampoco se aceptarán trabajos que previamente hayan sido publicados condensados o in extenso en Memorias o Simposio de Reuniones o Congresos (a excepción de Resúmenes).

Todos los trabajos estarán sujetos a revisión de un Comité Científico Editorial, conformado por Pares de la Disciplina en cuestión, quienes desconocerán el nombre e Institución de los autores proponentes. El Editor notificará al autor la fecha de recepción de su trabajo.

El manuscrito deberá someterse a través del portal de la Revista en la dirección electrónica: http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, consultando el “Instructivo para envío de artículos en la página de la Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias”. Para su elaboración se utilizará el procesador de Microsoft Word, con letra Times New Roman a 12 puntos, a doble espacio. Asimismo se deberán llenar los formatos de postulación, carta de originalidad y no duplicidad y disponibles en el propio sitio oficial de la revista.

Por ser una revista con arbitraje, y para facilitar el trabajo de los revisores, todos los renglones de cada página deben estar numerados; asimismo cada página debe estar numerada, inclusive cuadros, ilustraciones y gráficas.

Los artículos tendrán una extensión máxima de 20 cuartillas a doble espacio, sin incluir páginas de Título, y cuadros o figuras (los cuales no deberán exceder de ocho y ser incluidos en el texto). Las Notas de investigación tendrán una extensión máxima de 15 cuartillas y 6 cuadros o figuras. Las Revisiones

Los manuscritos de las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. deberán contener los componentes que a continuación se indican, empezando cada uno de ellos en página aparte. Página del título Resumen en español Resumen en inglés Texto Agradecimientos y conflicto de interés Literatura citada

Página del Título. Solamente debe contener el título del trabajo, que debe ser conciso pero informativo; así como el título traducido al idioma inglés. En el manuscrito no es necesaria información como nombres de autores, departamentos, instituciones, direcciones de correspondencia, etc., ya que estos datos tendrán que ser registrados durante el proceso de captura de la solicitud en la plataforma del OJS (http://ciencias pecuarias.inifap.gob.mx).

Resumen en español. En la segunda página se debe incluir un resumen que no pase de 250 palabras. En él se indicarán los propósitos del estudio o investigación; los procedimientos básicos y la metodología empleada; los resultados más importantes encontrados, y de ser posible, su significación estadística y las conclusiones principales. A continuación del resumen, en punto y aparte, agregue debidamente rotuladas, de 3 a 8 palabras o frases cortas clave que ayuden a los indizadores a clasificar el trabajo, las cuales se publicarán junto con el resumen.

Resumen en inglés. Anotar el título del trabajo en inglés y a continuación redactar el “abstract” con las mismas instrucciones que se señalaron para el resumen en español. Al final en punto y aparte, se deberán escribir las correspondientes palabras clave (“key words”).

10. Texto. Las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. consisten en lo siguiente: a) Artículos científicos. Deben ser informes de trabajos originales derivados de resultados parciales o finales

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de investigaciones. El texto del Artículo científico se divide en secciones que llevan estos encabezamientos:

Procure abstenerse de utilizar los resúmenes como referencias; las “observaciones inéditas” y las “comunicaciones personales” no deben usarse como referencias, aunque pueden insertarse en el texto (entre paréntesis).

Introducción Materiales y Métodos Resultados Discusión Conclusiones e implicaciones Literatura citada

Reglas básicas para la Literatura citada Nombre de los autores, con mayúsculas sólo las iniciales, empezando por el apellido paterno, luego iniciales del materno y nombre(s). En caso de apellidos compuestos se debe poner un guión entre ambos, ejemplo: Elías-Calles E. Entre las iniciales de un autor no se debe poner ningún signo de puntuación, ni separación; después de cada autor sólo se debe poner una coma, incluso después del penúltimo; después del último autor se debe poner un punto.

En los artículos largos puede ser necesario agregar subtítulos dentro de estas divisiones a fin de hacer más claro el contenido, sobre todo en las secciones de Resultados y de Discusión, las cuales también pueden presentarse como una sola sección. b) Notas de investigación. Consisten en modificaciones a técnicas, informes de casos clínicos de interés especial, preliminares de trabajos o investigaciones limitadas, descripción de nuevas variedades de pastos; así como resultados de investigación que a juicio de los editores deban así ser publicados. El texto contendrá la misma información del método experimental señalado en el inciso a), pero su redacción será corrida del principio al final del trabajo; esto no quiere decir que sólo se supriman los subtítulos, sino que se redacte en forma continua y coherente.

El título del trabajo se debe escribir completo (en su idioma original) luego el título abreviado de la revista donde se publicó, sin ningún signo de puntuación; inmediatamente después el año de la publicación, luego el número del volumen, seguido del número (entre paréntesis) de la revista y finalmente el número de páginas (esto en caso de artículo ordinario de revista). Puede incluir en la lista de referencias, los artículos aceptados aunque todavía no se publiquen; indique la revista y agregue “en prensa” (entre corchetes).

c) Revisiones bibliográficas. Consisten en el tratamiento y exposición de un tema o tópico de relevante actualidad e importancia; su finalidad es la de resumir, analizar y discutir, así como poner a disposición del lector información ya publicada sobre un tema específico. El texto se divide en: Introducción, y las secciones que correspondan al desarrollo del tema en cuestión.

En el caso de libros de un solo autor (o más de uno, pero todos responsables del contenido total del libro), después del o los nombres, se debe indicar el título del libro, el número de la edición, el país, la casa editorial y el año. Cuando se trate del capítulo de un libro de varios autores, se debe poner el nombre del autor del capítulo, luego el título del capítulo, después el nombre de los editores y el título del libro, seguido del país, la casa editorial, año y las páginas que abarca el capítulo.

11. Agradecimientos y conflicto de interés. Siempre que corresponda, se deben especificar las colaboraciones que necesitan ser reconocidas, tales como a) la ayuda técnica recibida; b) el agradecimiento por el apoyo financiero y material, especificando la índole del mismo; c) las relaciones financieras que pudieran suscitar un conflicto de intereses. Las personas que colaboraron pueden ser citadas por su nombre, añadiendo su función o tipo de colaboración; por ejemplo: “asesor científico”, “revisión crítica de la propuesta para el estudio”, “recolección de datos”, etc. Siempre que corresponda, los autores deberán mencionar si existe algún conflicto de interés.

En el caso de tesis, se debe indicar el nombre del autor, el título del trabajo, luego entre corchetes el grado (licenciatura, maestría, doctorado), luego el nombre de la ciudad, estado y en su caso país, seguidamente el nombre de la Universidad (no el de la escuela), y finalmente el año. Emplee el estilo de los ejemplos que aparecen a continuación, los cuales están parcialmente basados en el formato que la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos usa en el Index Medicus.

12. Literatura citada. Numere las referencias consecutivamente en el orden en que se mencionan por primera vez en el texto. Las referencias en el texto, en los cuadros y en las ilustraciones se deben identificar mediante números arábigos entre paréntesis, sin señalar el año de la referencia. Evite hasta donde sea posible, el tener que mencionar en el texto el nombre de los autores de las referencias.

VIII

Revistas

Loeza LR, Angeles MAA, Cisneros GF. Alimentación de cerdos. En: Zúñiga GJL, Cruz BJA editores. Tercera reunión anual del centro de investigaciones forestales y agropecuarias del estado de Veracruz. Veracruz. 1990:51-56.

XI)

Olea PR, Cuarón IJA, Ruiz LFJ, Villagómez AE. Concentración de insulina plasmática en cerdas alimentadas con melaza en la dieta durante la inducción de estro lactacional [resumen]. Reunión nacional de investigación pecuaria. Querétaro, Qro. 1998:13.

Artículo ordinario, con volumen y número. (Incluya el nombre de todos los autores cuando sean seis o menos; si son siete o más, anote sólo el nombre de los seis primeros y agregue “et al.”). I)

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

Sólo número sin indicar volumen.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domestic animals: strategies for conservation and development. In: Miller RH et al. editors. Proc XX Beltsville Symposium: Biotechnology’s role in genetic improvement of farm animals. USDA. 1996:13.

II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10. III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status ofthe use of artificial insemination in developing countries. World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

Tesis. XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989.

No se indica el autor. IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

Suplemento de revista.

XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

Organización como autor. XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984.

Organización, como autor. VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand. Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282-284.

XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996.

En proceso de publicación. VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000.

XVII) AOAC. Oficial methods of analysis. 15th ed. Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990.

Libros y otras monografías

XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988.

Autor total.

XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

Publicaciones electrónicas

Autor de capítulo. IX)

XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accessed Jul 30, 2003.

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor. Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

Memorias de reuniones.

XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicas para estimar la degradación de proteína y materia

orgánica en el rumen y su importancia en rumiantes en pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134. http://www.tecnicapecuaria.org/trabajos/20021217 5725.pdf. Consultado 30 Ago, 2003.

DL50 dosis letal 50% g gramo (s) ha hectárea (s) h hora (s) i.m. intramuscular (mente) i.v. intravenosa (mente) J joule (s) kg kilogramo (s) km kilómetro (s) L litro (s) log logaritmo decimal Mcal megacaloría (s) MJ megajoule (s) m metro (s) msnm metros sobre el nivel del mar µg microgramo (s) µl microlitro (s) µm micrómetro (s)(micra(s)) mg miligramo (s) ml mililitro (s) mm milímetro (s) min minuto (s) ng nanogramo (s)Pprobabilidad (estadística) p página PC proteína cruda PCR reacción en cadena de la polimerasa pp páginas ppm partes por millón % por ciento (con número) rpm revoluciones por minuto seg segundo (s) t tonelada (s) TND total de nutrientes digestibles UA unidad animal UI unidades internacionales

XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions. Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://www.sciencedirect. com/science/journal/03016226. Accessed Sep 12, 2003. 13. Cuadros, Gráficas e Ilustraciones. Es preferible que sean pocos, concisos, contando con los datos necesarios para que sean autosuficientes, que se entiendan por sí mismos sin necesidad de leer el texto. Para las notas al pie se deberán utilizar los símbolos convencionales. 14 Versión final. Es el documento en el cual los autores ya integraron las correcciones y modificaciones indicadas por el Comité Revisor. Los trabajos deberán ser elaborados con Microsoft Word. Las fotografías e imágenes deberán estar en formato jpg (o compatible) con al menos 300 dpi de resolución. Tanto las fotografías, imágenes, gráficas, cuadros o tablas deberán incluirse en el mismo archivo del texto. Los cuadros no deberán contener ninguna línea vertical, y las horizontales solamente las que delimitan los encabezados de columna, y la línea al final del cuadro. 15. Una vez recibida la versión final, ésta se mandará para su traducción al idioma inglés o español, según corresponda. Si los autores lo consideran conveniente podrán enviar su manuscrito final en ambos idiomas. 16. Tesis. Se publicarán como Artículo o Nota de Investigación, siempre y cuando se ajusten a las normas de esta revista. 17. Los trabajos no aceptados para su publicación se regresarán al autor, con un anexo en el que se explicarán los motivos por los que se rechaza o las modificaciones que deberán hacerse para ser reevaluados.

versus

gravedades

Cualquier otra abreviatura se pondrá entre paréntesis inmediatamente después de la(s) palabra(s) completa(s).

18. Abreviaturas de uso frecuente: cal cm °C

19. Los nombres científicos y otras locuciones latinas se deben escribir en cursivas.

caloría (s) centímetro (s) grado centígrado (s)

Updated: March, 2020 INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is a scientific journal published in a bilingual format (Spanish and English) which carries three types of papers: Research Articles, Technical Notes, and Reviews. Authors interested in publishing in this journal, should follow the belowmentioned directives which are based on those set down by the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437. 1.

Only original unpublished works will be accepted. Manuscripts based on routine tests, will not be accepted. All experimental data must be subjected to statistical analysis. Papers previously published condensed or in extenso in a Congress or any other type of Meeting will not be accepted (except for Abstracts).

All contributions will be peer reviewed by a scientific editorial committee, composed of experts who ignore the name of the authors. The Editor will notify the author the date of manuscript receipt.

Papers will be submitted in the Web site http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, according the â&#x20AC;&#x153;Guide for submit articles in the Web site of the Revista Mexicana de Ciencias Pecuariasâ&#x20AC;?. Manuscripts should be prepared, typed in a 12 points font at double space (including the abstract and tables), At the time of submission a signed agreement co-author letter should enclosed as complementary file; coauthors at different institutions can mail this form independently. The corresponding author should be indicated together with his address (a post office box will not be accepted), telephone and Email.

contain the following sections, and each one should begin on a separate page.

Title page Abstract Text Acknowledgments and conflict of interest Literature cited 7.

Title page. It should only contain the title of the work, which should be concise but informative; as well as the title translated into English language. In the manuscript is not necessary information as names of authors, departments, institutions and correspondence addresses, etc.; as these data will have to be registered during the capture of the application process on the OJS platform (http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx).

Abstract. On the second page a summary of no more than 250 words should be included. This abstract should start with a clear statement of the objectives and must include basic procedures and methodology. The more significant results and their statistical value and the main conclusions should be elaborated briefly. At the end of the abstract, and on a separate line, a list of up to 10 key words or short phrases that best describe the nature of the research should be stated.

Text. The three categories of articles which are published in Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias are the following:

a) Research Articles. They should originate in primary

works and may show partial or final results of research. The text of the article must include the following parts:

To facilitate peer review all pages should be numbered consecutively, including tables, illustrations and graphics, and the lines of each page should be numbered as well.

Research articles will not exceed 20 double spaced pages, without including Title page and Tables and Figures (8 maximum and be included in the text). Technical notes will have a maximum extension of 15 pages and 6 Tables and Figures. Reviews should not exceed 30 pages and 5 Tables and Figures.

Manuscripts of all three type of articles published in Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias should

Introduction Materials and Methods Results Discussion Conclusions and implications Literature cited In lengthy articles, it may be necessary to add other sections to make the content clearer. Results and Discussion can be shown as a single section if considered appropriate.

b) Technical Notes. They should be brief and be

d. In the case of a single author’s book (or more than one, but all responsible for the book’s contents), the title of the book should be indicated after the names(s), the number of the edition, the country, the printing house and the year.

evidence for technical changes, reports of clinical cases of special interest, complete description of a limited investigation, or research results which should be published as a note i n the opinion of the editors. The text will contain the same information presented in the sections of the research article but without section titles.

e. When a reference is made of a chapter of book written by several authors; the name of the author(s) of the chapter should be quoted, followed by the title of the chapter, the editors and the title of the book, the country, the printing house, the year, and the initial and final pages.

c) Reviews. The purpose of these papers is to

summarize, analyze and discuss an outstanding topic. The text of these articles should include the following sections: Introduction, and as many sections as needed that relate to the description of the topic in question.

f. In the case of a thesis, references should be made of the author’s name, the title of the research, the degree obtained, followed by the name of the City, State, and Country, the University (not the school), and finally the year.

10. Acknowledgements. Whenever appropriate, collaborations that need recognition should be specified: a) Acknowledgement of technical support; b) Financial and material support, specifying its nature; and c) Financial relationships that could be the source of a conflict of interest.

Examples The style of the following examples, which are partly based on the format the National Library of Medicine of the United States employs in its Index Medicus, should be taken as a model.

People which collaborated in the article may be named, adding their function or contribution; for example: “scientific advisor”, “critical review”, “data collection”, etc. 11. Literature cited. All references should be quoted in their original language. They should be numbered consecutively in the order in which they are first mentioned in the text. Text, tables and figure references should be identified by means of Arabic numbers. Avoid, whenever possible, mentioning in the text the name of the authors. Abstain from using abstracts as references. Also, “unpublished observations” and “personal communications” should not be used as references, although they can be inserted in the text (inside brackets).

Key rules for references a. The names of the authors should be quoted beginning with the last name spelt with initial capitals, followed by the initials of the first and middle name(s). In the presence of compound last names, add a dash between both, i.e. Elias-Calles E. Do not use any punctuation sign, nor separation between the initials of an author; separate each author with a comma, even after the last but one. b. The title of the paper should be written in full, followed by the abbreviated title of the journal without any punctuation sign; then the year of the publication, after that the number of the volume, followed by the number (in brackets) of the journal and finally the number of pages (this in the event of ordinary article). c. Accepted articles, even if still not published, can be included in the list of references, as long as the journal is specified and followed by “in press” (in brackets).

Journals

Standard journal article (List the first six authors followed by et al.) I)

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

Issue with no volume II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10. III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status of the use of artificial insemination in developing countries. World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

No author given IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

Journal supplement V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

Organization, as author

XII

VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand. Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282284.

In press VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide-treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000.

Books and other monographs

Author(s) VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

Chapter in a book IX)

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor. Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

Conference paper X)

XI)

Thesis XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989.

XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984. XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996. XVII) AOAC. Official methods of analysis. 15th ed. Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990. XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988. XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Electronic publications XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accesed Jul 30, 2003. XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicas para estimar la degradación de proteína y materia orgánica en el rumen y su importancia en rumiantes en pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134. http://www.tecnicapecuaria.org/trabajos/20021217 5725.pdf. Consultado 30 Jul, 2003. XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions. Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://www.sciencedirect.com/science/journal/030 16226. Accesed Sep 12, 2003. 12. Tables, Graphics and Illustrations. It is preferable that they should be few, brief and having the necessary data so they could be understood without reading the text. Explanatory material should be placed in footnotes, using conventional symbols.

13. Final version. This is the document in which the authors have already integrated the corrections and modifications indicated by the Review Committee. The works will have to be elaborated with Microsoft Word. Photographs and images must be in jpg (or compatible) format with at least 300 dpi resolution. Photographs, images, graphs, charts or tables must be included in the same text file. The boxes should not contain any vertical lines, and the horizontal ones only those that delimit the column headings, and the line at the end of the box.

XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

Organization as author

XIII

14. Once accepted, the final version will be translated into Spanish or English, although authors should feel free to send the final version in both languages. No charges will be made for style or translation services.

m Âľl Âľm mg ml mm min ng

meter (s) micro liter (s) micro meter (s) milligram (s) milliliter (s) millimeter (s) minute (s) nanogram (s) P probability (statistic) p page CP crude protein PCR polymerase chain reaction pp pages ppm parts per million % percent (with number) rpm revolutions per minute sec second (s) t metric ton (s) TDN total digestible nutrients AU animal unit IU international units

15. Thesis will be published as a Research Article or as a Technical Note, according to these guidelines. 16. Manuscripts not accepted for publication will be returned to the author together with a note explaining the cause for rejection, or suggesting changes which should be made for re-assessment. 17. List of abbreviations: cal cm Â°C DL50 g ha h i.m. i.v. J kg km L log Mcal MJ

calorie (s) centimeter (s) degree Celsius lethal dose 50% gram (s) hectare (s) hour (s) intramuscular (..ly) intravenous (..ly) joule (s) kilogram (s) kilometer (s) liter (s) decimal logarithm mega calorie (s) mega joule (s)

versus

gravidity

The full term for which an abbreviation stands should precede its first use in the text. 18. Scientific names and other Latin terms should be written in italics.

XIV

https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.4992 Artículo

Estudio preliminar de residuos de ivermectina en hígado de bovinos en la Sabana de Bogotá

Carmen Teresa Celis-Giraldo a* Diego Ordóñez a Leonardo Roa a Sergio Andrei Cuervo-Escobar b Dajane Garzón-Rodríguez a, Milena Alarcón-Caballero a Luisa Fernanda Merchán a

Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Bogotá, Colombia. b Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A. Facultad de Ciencias. Bogotá, Colombia.

*Autor de correspondencia: ccelis@udca.edu.co

Resumen: El objetivo fue determinar la presencia de residuos de ivermectina en hígado de bovinos utilizando la técnica de ELISA competitiva, y correlacionar las variables sexo y edad con la presencia de residuos. A su vez se describen los hallazgos histopatológicos en las muestras analizadas. Se muestrearon 90 hígados de bovinos, seleccionados aleatoriamente en una planta de beneficio en la Sabana de Bogotá. Se analizaron con la técnica de ELISA competitiva y se realizó estudio histopatológico con la técnica de H&E. Se detectó presencia de residuos de ivermectina en el 22 % (20/90) de las muestras analizadas. La mayoría de los individuos provenían de Cogua 35 % (7/20), Zipaquirá 30 % (6/20) y Sopó 20 % (4/20). Las razas fueron Mestizo 35 % (7/20), Cebú 25 % (5/20), Normando 20 % (4/20) y Jersey x Holstein 15 % (3/20). El 85 % (17/20) de los individuos fueron mayores a 1.5 años. En cuanto a la variable sexo, la mayoría de los animales fueron machos 65 % (13/20). El 3 % de los animales evaluados (3/90) excedió el límite máximo 311

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de residuos (>100 ppb). No se encontró asociación entre la presencia de residuos y las variables sexo y edad (P>0,05). La mayoría de los cambios histopatológicos fueron leves o moderados, sobresaliendo principalmente las alteraciones en arquitectura y cambios inflamatorios. Se encontró asociación entre la presencia de residuos y las variables alteración microcirculatoria, alteración inflamatoria y cambios similares a muerte celular (P<0.05). Como conclusión, la técnica de ELISA competitiva sirvió como método de tamizaje para detectar residuos de ivermectina en las muestras analizadas. Palabras clave: Antiparasitarios, Ivermectina, ELISA, Hígado, Lactonas macrocíclicas, Bovino.

Recibido: 17/07/2018 Aceptado: 03/04/02019

Introducción Las enfermedades parasitarias son una de las principales causas de pérdidas económicas para la industria ganadera en los sistemas de producción tropical y subtropical. Estas enfermedades tienen un impacto enormemente prevalente relacionado con factores de la cadena epidemiológica tales como la presencia de vectores y los cambios ambientales(1). La ivermectina es una lactona macrocíclica popular desde su introducción en el mercado(2,3). Este fármaco es una mezcla de dos homólogos, en una proporción de 80 % de 22,23-dihidroavermectina B1a (H2B1A) y no más de 20 % de 22,23-dihidroavermectina B1b (H2B1b)(4). En la comunidad europea se han determinado límites máximos de residuos (LMR) para el uso de la porción de B1A como indicador(5). Su destacado uso en la medicina veterinaria se deriva de la actividad espectral para el control de los nematodos y artrópodos, lo cual genera un marcado interés en el desarrollo de la investigación. Además, también se ha utilizado el grupo de las lactonas macrocíclicas en la agricultura para el control de plagas, y en la medicina humana, sobre todo para el tratamiento de la oncocercosis(6,7). Desde el punto de vista farmacocinético, los estudios han demostrado que el principal órgano en el que se detectan los residuos de la ivermectina es el hígado en casi todas las especies evaluadas(8,9,10). Por ello, debido a su excesivo uso en el campo, al consumo de vísceras y a su posible toxicidad, este órgano fue elegido como matriz para realizar este estudio. Se han desarrollado diversas metodologías para detectar los residuos, entre las cuales la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, en inglés) y la espectrometría de masas son las más recomendadas por su elevada sensibilidad y selectividad; sin embargo, también presentan ciertas desventajas, por ejemplo: el proceso de extracción es complejo y se requiere de un equipo costoso(11). Otras metodologías semi-cuantitativas tales como la prueba competitiva ELISA se utilizan como método de detección en 312

Rev Mex Cienc Pecu 2020;11(2):311-325

diversas matrices. Algunas ventajas son su bajo costo, su rapidez con una sensibilidad y especificidad relativamente buenas en comparación con la HPLC(4,12). El propósito de esta investigación fue determinar la presencia de residuos de ivermectina en hígados bovinos de la Sabana de Bogotá, D.C., utilizando la técnica de ELISA competitiva y correlacionando la presencia de residuos con las variables género y edad. Además, este estudio describe los cambios hisopatológicos en las muestras evaluadas.

Material y métodos Área de estudio Se obtuvieron muestras del rastro de Zipaquira, en el cual se sacrifica un total de 200 animales al día. Este rastro está clasificado como de tipo II, según el INVIMA (Decreto 1036 de 1991) y la Secretaría de Salud, y está certificado por las normas ISO 9001: 2008 y NTCGP1000: 2009.

Tamaño de la muestra Considerando un error del 10 % y un nivel de confianza de 99 %, se analizaron 89 hígados. Los animales fueron seleccionados al azar en el área de suspensión y posteriormente fueron identificados. Una vez en el área de evisceración, se recolectaron 100 g de hígado en bolsas estériles para aplicarles la prueba ELISA. Cada muestra fue marcada, debidamente etiquetada, refrigerada, transportada y posteriormente almacenada a -20 °C hasta el momento de realizar el análisis. Al mismo tiempo, se obtuvieron datos del origen, raza, género y edad de los animales evaluados.

En la fase de estandarización, se incluyó el hígado de un bovino como testigo negativo. Este animal no recibió ningún tratamiento previo con ivermectina. Previa autorización del Comité de Bioética de la U.D.C.A., se practicó la eutanasia a un becerro de 8 días de edad, utilizando Euthanex® (60 mg/kg, I.V) y se tomaron muestras de su hígado para fines de análisis. La vaca preñada pertenecía a la universidad y no recibió tratamiento antiparasitario con lactonas macrocíclicas durante la preñez.

Procedimiento Se utilizó la prueba de ELISA competitiva para detectar y cuantificar los residuos. Estas pruebas utilizan anticuerpos policlonales de conejo contra la ivermectina, y el proceso de análisis de cada muestra se llevó a cabo tomando en cuenta la información del proveedor del kit(13); la cantidad de ingrediente activo en las muestras fue expresado brevemente como equivalentes de ivermectina (ng/ml). En el caso del hígado, los valores que se 313

Rev Mex Cienc Pecu 2020;11(2):311-325

obtuvieron de la curva de calibración se multiplicaron por un factor de 5 para expresar la concentración en ng/g. Los equivalentes de ivermectina correspondieron al porcentaje máximo de absorbencia de cada extracto leído de la curva de calibración de los siete estándares (Cuadro 1). Se tomaron en cuenta los coeficientes de determinación obtenidos en cada curva de calibración para calcular la concentración de residuos específicos. Cuadro 1: Concentración de ivermectina en las soluciones estándar Estándar

ng/ml

1.25

2.5

Cada muestra fue descongelada y homogeneizada con un procesador de alimentos. El material así obtenido fue sometido a un proceso de extracción y por ende a la cuantificación de residuos basada en los parámetros del proveedor del kit. Las muestras se consideraron residualmente positivas cuando excedieron el límite de detección (LDD) reportado del kit de 8 ppb. El límite máximo de residuos (LMR) para el hígado fue de 100 ppb, considerando así los valores reportados en la Resolución 1,382 de 2013 de la Secretaría de Salud y Protección Social. Las muestras se analizaron por duplicado en el laboratorio de microbiología de la U.D.C.A.

Análisis histopatológico Además de la muestra tomada para el análisis ELISA, se obtuvieron 5 g de hígado para la evaluación histopatológica, conservándolos en formaldehido al 10 %. Se procesaron las muestras mediante la técnica de hematoxilina y eosina en el laboratorio de patología de la U.D.C.A. Se evaluaron tres zonas del lóbulo hepático como sigue: la zona 1 se localiza a una distancia mayor de la vena centrilobular, específicamente en la periferia del lóbulo; la zona 2 correspondió a la mitad de la periferia y la vena centrilobular, y la zona 3 es la más cercana a la vena centrilobular. En las áreas arriba mencionadas se evaluaron las siguientes variables: Alteraciones en la arquitectura: vacuolación, inversión lobular, hiperplasia canalicular y fibrosis parenquimal. Alteraciones microcirculatorias: en este caso, se tomaron en cuenta la congestión centrilobular, la congestión generalizada, la hemorragia focal y el edema. Alteraciones inflamatorias: presencia de células polimorfonucleares, mononucleares y mixtas. Se realizó una evaluación de las áreas lobulares. Cambios similares a la muerte celular: se consideraron la apoptosis y la necrosis.

314

Rev Mex Cienc Pecu 2020;11(2):311-325

Para cada una de las variables, el grado de la lesión se clasificó como sigue: (0) aparentemente normal, (1) leve, (2) moderada y (3) severa(14).

Análisis estadístico Este estudio fue observacional, con un muestreo aleatorio simple. Los datos se registraron en una hoja de cálculo de Excel 2016, de Microsoft Office, y se analizaron con el paquete estadístico STATA MP14. Se realizó un análisis descriptivo de las variables origen, raza, género y edad. A fin de analizar el efecto de las variables género, edad e histopatológicas con la concentración de ivermectina, se realizó una prueba de asociación de Ji 2 (P<0.05).

Resultados Los coeficientes de determinación obtenidos para calcular la concentración de residuos fueron, en promedio, de 97 %. La mayoría de los individuos presentaron niveles de menos de 8 ppb (78 %); el 19 % presentaron entre 8 y 100 ppb, y solamente el 3 % presentaron residuos de más de 100 ppb, los cuales rebasan los LMR (Figura 1). Figura 1: Distribución de residuos de ivermectina en la población evaluada

La población sin residuos (LDD <8 ppb) se originó principalmente en Zipaquira (44 %, 28/70), seguida de Cogua (26 %, 18/70) y a Sopo y Chiquinquira, respectivamente, correspondieron el 10 % restante (7/70) de los animales evaluados. Para la variable raza, la proporción más elevada de animales fue la Normanda (34 %, 24/70), seguida de Holstein 28 % (20/70) y Mestiza 23 % (16/70). En cuanto a la variable edad, sólo el 13 % (9/70) fueron animales de menos de 1.5 año de edad, y el 87 % eran mayores de 1.5 año. Para la variable género, se observó que el 59 % (41/70) de los animales muestreados fueron hembras, y el 41 % (21/70) fueron machos.

315

Rev Mex Cienc Pecu 2020;11(2):311-325

Los individuos con presencia de residuos se originaron sobre todo en Cogua (35 %, 7/20), Zipaquira (30 %, 6/20), Sopo (20 %, 4/20). Solamente un individuo de La Vega, Bogotá y Guasca, respectivamente, fue positivo. Las razas en las que se encontraron residuos fueron Mestiza (35 %, 7/20), Cebú (25 %, 5/20), Normanda (20 %, 4/20) y Jersey x Holstein (15 %, 3/20); para Holstein se registró solamente un individuo. El 85 % (17/20) de los animales fueron mayores de 1.5 año, y el 15 % restante (3/20) fueron menores de 1.5 año. En lo que se refiere al género, fueron sobre todo machos (65 %, 13/20); el 35 % (7/20) fueron hembras. Sólo el 3 % (3/90) de las muestras rebasó el LMR). Todos los animales positivos fueron machos; dos muestras provenían de Sopo y una de Cogua, y dos de ellos eran mayores de 1.5 año. Estos animales pertenecían a las razas Mestiza, Holstein y Jersey x Holstein (Cuadro 2). Cuando se realizó la prueba de asociación de Ji2 no se encontraron asociaciones entre las variables edad (P=0.84), género (P=0.06) y concentración de ivermectina. Cuadro 2: Estadísticas descriptivas de la población con presencia de residuos Muestras % Concentración (≥ 8 ppb) con residuos Muestras Muestras Variable \ Población con >LMR* total residuos Rango Promedio EE Género: Machos 13\42 31 8.40-154.72 58.50 14.71 3 Hembras 7\48 15 8.32-26.92 16.30 2.38 0 Origen: Cogua 7\25 28 8.86-154.72 37.86 19.58 1 Sopo 4\11 36 8.32-140.25 86.05 31.92 2 Zipaquira 6\34 18 8.40-87.65 32.75 10.50 0 Edad: < 1.5 años 3\12 25 8.86-154.72 60.98 46.96 1 ≥ 1.5 años 17\78 22 8.32-140.25 40.68 10.11 2 Raza ** Mestiza 7\23 30 8.32-136.40 33.74 17.45 1 Cebú 5\12 42 18.28-87.65 34.67 13.32 0 Normanda 6\28 14 8.40-59.22 31.43 8.87 0 Jersey x Holstein 3\4 75 15.12-140.25 61.53 39.56 1 *LMR= Límite Máximo de Residuos. **Sólo un individuo de la raza Holstein rebasó el LMR con 154.72 ppb.

Para el análisis histopatológico se evaluaron 86 muestras, y como se mencionó antes, 20 hígados presentaron residuos de ivermectina, y 66 hígados fueron considerados negativos. La Tabla 3 registra los datos por severidad de la lesión y según las diversas variables analizadas. Cabe mencionar que en las muestras analizadas no se observaron 316

Rev Mex Cienc Pecu 2020;11(2):311-325

inversiones lobulares ni lesiones compatibles con la necrosis. La mayoría de los cambios observados fueron leves en ambos casos. Para las muestras sin residuos, los principales cambios observados correspondieron al nivel inflamatorio, entre los cuales destaca una presencia de monocitos leve (28/66), moderada (6/66) y severa (3/66). También se describieron cambios leves en la vacuolización (41/66), hiperplasia (15/66), hiperplasia moderada (22/66), fibrosis leve (27/66) y fibrosis moderada (21/66). Encontramos asociación entre las variables alteración microcirculatoria, alteración inflamatoria y cambio similar a la muerte celular (P<0.05) (Cuadro 3).

Alteración en Arquitectura

Cuadro 3: Hallazgos histopatológicos en la población estudiada

Vacuolización

Hiperplasia

Fibrosis

Alteración Microcirculatoria

Congestión lobulillar

Congestión generalizada

Hemorragia Focal

Alteración inflamatoria

Edema

Polimorfonucleares

Monocitos

Grado de severidad

LOD < 8ppb

LOD ≥ 8ppb

Normal Leve Moderado Normal Leve Moderado Normal Leve Moderado Severo Normal Leve Moderado Normal Leve Moderado Severo Normal Leve Moderado Normal Leve Moderado Normal Leve Moderado Normal Leve Moderado

21 41 4 29 15 22 18 27 21 0 49 17 0 64 1 0 1 66 0 0 66 0 0 66 0 0 29 28 6

10 7 3 11 8 1 6 11 2 1 2 11 7 7 9 4 0 16 1 3 15 6 1 5 13 2 3 15 2

317

Valor p* 0.318

0.447

0.708

0.000*

0.006*

0.000*

0.027*

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Mixto

Similar a muerte celular

Zona 3 Apoptosis

Severo Normal Leve Moderado Normal Leve Normal Leve Moderado

3 66 0 0 33 33 66 0 0

0 7 12 1 17 3 12 7 1

0.000* 0.003*

0.000*

P<0.05.

Los animales con evidencia de residuos (20) presentaron alteraciones en las variables arquitectónicas: 10 muestras exhibieron cambios vacuolares (7, leves, y 3, moderados); 9 tuvieron hiperplasia canalicular (8, leve, y 1, moderada), y 14 tuvieron fibrosis portal (11, leve; 2, moderada, y 1, severa) (Figura 2). Dieciocho (18) muestras que contenían residuos de ivermectina presentaron congestión centrilobular (11, leve, y 7 moderada); 13 muestras presentaron congestión generalizada y dilatación sinusoidal (10, leves, y 4, moderadas), y 4 focos hemorrágicos (1, leves, y 3, moderados) (Figura 3). Figura 2: Hígado bovino sin residuos de ivermectina

A. Arquitectura normal en los hepatocitos (400X) y B. el área portal (100X). Cambios arquitectónicos en el parénquima hepático de ganado con residuos. C. Cambios vacuolares, obsérvese la presencia de vacuolas intracitoplásmicas (punta de la flecha) (400x). D. Fibrosis leve del área portal (flecha) (100X).

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Figura 3: Cambios microcirculatorios en el parénquima hepático de ganado con presencia de residuos de ivermectina. Se evidenciaron congestión leve y dilatación sinusoidal.

En relación con el infiltrado inflamatorio, 13 de los 20 animales presentaron infiltración mixta, predominantemente por células mononucleares (15, leve, y 1, moderada) en distribución centrilobular. En comparación, en ambos grupos se halló una amplia gama de cambios asociados a procesos microcirculatorios, arquitectónicos, inflamatorios y de muerte celular (apoptosis) (Figura 4). Y en cuanto a la última alteración, sólo ocho de las muestras analizadas mostraron alteraciones asociadas con cambio similar a muerte celular, caracterizados por una distribución multifocal en los tejidos con presencia de residuos de ivermectina (Cuadro 3). Figura 4: Cambios compatibles con la apoptosis, hígado de bovino con residuos de ivermectina obtenido de un rastro. Células con alteraciones relacionadas con muerte celular (flechas)

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Discusión La ivermectina es un compuesto activo que se ha utilizado durante casi 20 años en numerosos países y en diferentes sistemas de producción de animales. Como resultado de su uso, se realizan pruebas de control en productos alimenticios derivados del ganado a fin de armonizar los procesos de comercialización. Se han realizado varios estudios que reportan distintas metodologías para este propósito, tales como la técnica de ELISA competitiva. Este método se desarrolló antes(4), utilizando antisuero policlonal de conejo y el límite de detección (LDD), fue de 1.6 μg/kg, y los anticuerpos presentaron una reacción cruzada con la doramectina, pero no con la moxidectina. En ese estudio se analizaron muestras de hígados negativos (1.6 ng/g), hígados fortificados con 100 ng/g de ivermectina e hígados tratados tópicamente con 0.5 mg/kg, de animales sacrificados en los días 7, 14, 21 y 28. En este caso, los niveles de ivermectina fueron de 52.7 ng/g en el 7° día después del tratamiento y se redujeron a 4.1 ng/g en el 28° día. Los datos fueron confirmados mediante otra técnica complementaria, como la cromatografía líquida de alto desempeño (en inglés, HPLC). El rango de ambas pruebas fue de 1 a 58 ng/g con una correlación cercana (r = 0.99). En un estudio realizado por otros autores(12) en el que se desarrolló una prueba ELISA para la detección de múltiples avermectinas (abamectina, eprinomectina e ivermectina), la avermectina modificada 4C-O-succinil avermectina se conjugó con albúmina bovina y ovoalbúmina como inmunógenos para generar anticuerpos policlonales en preparación. El LDD para esta prueba fue de 1.06 ng/ml para las tres avermectinas. El porcentaje de recuperación osciló entre 53.8 % y 80.6 %, y fue similar al de reportes anteriores en los que se utilizó HPLC, lo que hace de esta técnica en un método rápido de tamizaje para detectar avermectinas en los hígados bovinos. En el presente estudio, el LDD de 8 ppb (reportado por el fabricante). 70 muestras se encontraron por debajo del mismo; 17, entre 8 y 100 ppb, y sólo 3 superaron los 100 ppb. Es importante tener en cuenta que en este caso no se realizaron pruebas confirmatorias adicionales; sin embargo, dados los datos obtenidos, sería pertinente extender este tipo de enfoque a otros sistemas de producción con un mayor uso de este compuesto activo, situación que se ha reportado en otras áreas del país. Volviendo al LMR, sólo el 3 % de las muestras rebasaron el valor máximo reportado por las autoridades colombianas (>100 ppb); este porcentaje puede considerarse como un nivel bajo. En Colombia se llevó a cabo un estudio para determinar la residualidad de los insecticidas organofósforo, carbamatos e ivermectina en la leche cruda de granjas ubicadas en zonas tropicales. De 609 muestras analizadas, 37.44 % contenían niveles de organofosfato por encima del LMR; la mayoría de las muestras positivas fueron encontradas en la Región de Magdalena. Sin embargo, se analizaron 180 muestras de leche para detector y cuantificar residuos ivermectina, y todas las muestras rebasaron el LMR(15). Los datos obtenidos en este estudio fueron similares a los observados en otros países como México, donde se evaluó la presencia de residuos de ivermectina debido al 320

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uso incrementado de esta molécula en las granjas. En este caso, se tomaron 234 muestras de hígados en el transcurso de un mes y se las analizó mediante HPLC. Sólo una muestra no estuvo dentro de los parámetros (149 μg/kg), situación similar a otra reportada anteriormente por un esquema de control para esta área(16). Estos datos arriba difieren de otro reportado en el Brasil. Debido a problemas de residualidad durante 2010, se desarrollaron varias técnicas de detección en matrices musculares, permitiendo el establecimiento del LMR, y se tomaron las medidas pertinentes para ejercer el control de los medicamentos dentro de los sistemas de producción(17). Algunas de las estrategias utilizadas correspondieron a campañas educativas para productores a fin de prevenir las enfermedades parasitarias mediante el manejo y el uso de medicamentos, tomando en cuenta varios factores que pueden ocasionar que se rebasen los niveles máximos de residuos, tales como la formulación del producto, las propiedades del ingrediente físicoquímico activo, sobredosis, método de administración, uso del producto en especies no recomendadas, lotes de animales heterogéneos y, por último, el incumplimiento de los tiempos de retiro(2,11). Por lo que respecta a las características epidemiológicas, no se observó ninguna asociación entre las variables género y edad y la presencia de residuos. Pese a este hecho, hubo una mayor presencia de residuos en los machos que en las hembras. Tomando en cuenta esto, los datos farmacocinéticos reportados muestran que hay diferencias relacionadas con el género y con la disposición plasmática del ingrediente activo. Estas características han sido estudiadas en diversas especies animales y específicamente en el ganado se han encontrado diferencias relacionadas con el género en función de la concentración en plasma cuando se evaluó la ivermectina y la doramectina; la biodisponibilidad de ambas moléculas fue 10 % más elevada en las novillas que en los cabestros(18). Esta diferencia se asoció a la cantidad de tejido adiposo en los machos y en las hembras, considerando las características del ingrediente activo, tales como la elevada liposolubilidad del agente endectocida que promueve su almacenamiento en este tejido y favorece su persistencia(9). Si bien se observaron residuos en las hembras, el porcentaje encontrado fue muy bajo (15 %). Posiblemente los animales evaluados se encontraban en un periodo de no lactancia (seco), lo que llevó a que fueran descartadas y sacrificadas, pero en todo caso superaron los límites, y los datos más relevantes se encontraron en los machos. Aun así, es importante tener en cuenta que la única avermectina aprobada para su uso en granjas lecheras es la eprinomectina y que otros factores, como la influencia de las hormonas, puede afectar el metabolismo del fármaco en lo relativo a su transformación y eliminación(15,19). La evaluación histopatológica de este estudio permitió una amplia gama de hallazgos de alteración hepática parenquimal, uniforme en los animales con y sin residuos. Cuando se evaluaron las alteraciones microcirculatorias, algunos animales con residuos presentaron un mayor grado tanto de cambios congestivos como de severidad de focos hemorrágicos, 321

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lo que sugiere una mayor susceptibilidad de desarrollar trastornos asociados con alteraciones de la red vascular del parénquima hepático; sin embargo, el número de animales que desarrollaron este tipo de trastornos no resulta ser significativo. Numerosas sustancias químicas sufren parte de su biotransformación en el tejido hepático; esto también significa que una parte considerable de estos compuestos podrían generar alteraciones celulares del parénquima y causar así posibles trastornos asociados a alteraciones de funciones hepáticas como la síntesis de proteínas, la transformación de los carbohidratos y el metabolismo de los lípidos. Entre las sustancias que el hígado procesa se encuentran los fármacos, las toxinas bacterianas y las plantas tóxicas. En este sentido, no se puede descartar el efecto, único o concomitante, de este tipo de compuestos en las muestras analizadas. Un estudio realizado en ratas para evaluar el efecto de tratamientos masivos y prolongados con ivermectina y otras moléculas contra diversos parásitos demostró algunas alteraciones clínicas compatibles con la hepatotoxicidad, y los cambios anatomopatológicos revelaron distorsión arquitectónica, necrosis hepatocelular e hiperplasia celular de Kupffer(20). En los casos hiperagudos de intoxicación en cabras, se reporta muerte repentina sin alteraciones patológicas sistémicas(21). En los seres humanos, un reporte de caso demostró el potencial hepatotóxico de la ivermectina después de su administración a un paciente con filariasis, puesto que se detectó infiltrado inflamatorio intralobular y acumulación de pigmento ceroide, así como necrosis perivenular, necrosis y apoptosis(22). Según las directrices internacionales, la ingesta diaria aceptable establecida para los seres humanos es de 10 μg/kg (600 μg/persona/d)(5); estos niveles no fueron observados en las muestras analizadas. Cabe señalar que, al igual que estos reportes, el presente estudio evidenció cambios similares a la apoptosis exclusivamente en animales con presencia de residuos; sin embargo, sería necesario efectuar otros estudios, por ejemplo, una inmunohistoquímica, a fin de clarificar la asociación entre los residuos y el desarrollo de lesiones hepáticas. Se ha asociado el envenenamiento con ivermectina con la sobredosis o con la presencia de una mutación de P-glicoproteína que promueve el desarrollo de síntomas neurológicos en varias especies animales. Se ha asociado la intoxicación humana con efectos leves a moderados de una reacción de Mazzotti y de una encefalopatía ligadas a un tratamiento microfilaricida o a la exposición a lactonas macrocíclicas(23).

Conclusiones e implicaciones En conclusión, la prueba de ELISA comparativa utilizada en este estudio sirvió como método de tamizaje para analizar los residuos de ivermectina en hígados bovinos. Sólo un 3 % de las muestras rebasó el LMR, y no se halló correlación entre la presencia de residuos y las variables género y edad (P>0.05). La mayoría de los cambios histopatológicos fueron leves o moderados, entre los cuales destacan las alteraciones en 322

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la arquitectura y los cambios inflamatorios. Existe una asociación estadística entre la presencia de residuos de ivermectina y las variables alteración microcirculatoria, alteración inflamatoria y cambios similares a la muerte celular (P<0.05).

Agradecimientos Los autores desean expresar su agradecimiento al rastro de Zipaquira y a la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales (U.D.C.A.) por todo su apoyo en la ejecución de este proyecto, así como a la compañía Basic Farm® por la orientación proporcionada. Agradecen también al Profesor Juan de Jesús Vargas por su apoyo en el análisis estadístico.

Conflicto de intereses Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses en la presentación de este documento.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5100 Artículo

Eficacia de la ivermectina para el control de nematodos gastrointestinales en burros (Equus asinus) en el altiplano mexicano

Guadalupe Galicia-Velázquez a Arturo Villarreal-Nieto a Cristina Guerrero-Molina a Cintli Martínez-Ortiz-de-Montellano a*

Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, Av. Universidad 3000. 04510, Ciudad de México, México.

*Autor de correspondencia: cintli@unam.mx

Resumen: El burro se ha empleado como animal de trabajo durante siglos y el 96 % de la población mundial se encuentra en países en desarrollo. Los nematodos gastrointestinales con resistencia antihelmíntica (RAH) son el problema parasitario más grave de los équidos. Este estudio analiza el fenómeno de RAH a la ivermectina (IVM) en burros, y se consideran umbrales económicos con la evaluación de las prácticas por parte de los propietarios a través de encuestas. Con 53 burros del Altiplano Mexicano, el experimento se dividió en dos etapas: 1) en 53 animales se determinaron umbrales económicos y se formaron los grupos experimentales. 2) se realizó la prueba de la eficacia de la IVM y se establecieron dos grupos experimentales (n= 30), grupo tratado y grupo testigo sin tratamiento. El umbral económico de huevos por gramo de heces fue de 600 y el umbral de la condición corporal (CC) del 91 % de los animales fue aceptable (2.5 a 3.5). A mayor CC, la descarga de huevos obtenida fue menor (P<0.05) de las 100 larvas identificadas, el 63 % fueron ciatostómidos, el resto fueron grandes estrongílidos. En esta población de nematodos, la eficacia de la IVM fue del 100 %. Con las encuestas, el 80 % de los propietarios admite utilizar como única estrategia 326

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el servicio de los médicos veterinarios zootecnistas voluntarios, el cual consiste en IVM al 1%. La IVM es un recurso todavía valioso y debe utilizarse adecuadamente para evitar RAH. Este es el primer paso para la desparasitación selectiva dirigida en équidos en México. Palabras clave: Burros, Equus asinus, Ciatostómidos, Nematodos, Ivermectina, Resistencia antihelmíntica.

Recibido: 05/10/2018 Aceptado: 05/04/2019

Introducción El burro (Equus asinus) se ha empleado como animal de trabajo durante 5,000 años(1) y más del 96 % de la población mundial se encuentra en países en desarrollo. En México, se calcula que existen alrededor de 3.3 millones de burros(2). En el altiplano mexicano, estos son mayoritariamente utilizados para las actividades agrícolas(2). En algunos casos estos burros sufren de una deficiente nutrición, ya que son alimentados con esquilmos agrícolas y suplementados con granos de baja calidad o concentrados comerciales(1-2). A su vez, el burro es hospedador de un gran número de parásitos y los ciclos de vida son similares a los presentes en caballos, por lo que estos pueden actuar como un significativo reservorio para la infección de otros équidos(3). Los parásitos de mayor importancia en el caso de los équidos, son algunos helmintos como Anoplocephala perfoliata o Parascaris equorum, pero los que tienen un mayor impacto debido a las implicaciones clínicas de la migración larvaria e hipobiosis que presentan(4,5), son los de la familia Strongylida, donde se ubica a los nematodos gastrointestinales (NGI) de la subfamilia Cyathostominae, también conocidos como pequeños estrongílidos, y los de la subfamilia Strongylidae (Strongylus spp), conocidos como grandes estrongílidos(6,7). Estas nematodosis gastrointestinales en burros son quizás uno de los más grandes retos en el manejo clínico, ya que los burros que presentan cargas significativamente altas de helmintos pueden estar aparentemente sanos y rara vez observarse los signos clínicos en comparación con los caballos(8). Se sabe que, entre caballos y burros, existen grandes diferencias en comportamiento y fisiología, y específicamente en el mecanismo por el cual metabolizan ciertas drogas y a su vez, responden de manera distinta a las patologías que los afectan(9). Esto no se ve reflejado en la industria farmacéutica, ya que los burros tienen un impacto económico limitado comparado con los caballos(9). Por lo tanto, debido a la subdosificación, existe la posibilidad de encontrar burros con NGI resistentes a los químicos, como se ha demostrado en otras especies domésticas(10,11). En los animales domésticos de todo el mundo, los NGI y su

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resistencia antihelmíntica (RAH), representan problemas de salud, económicos y productivos(12,13). El fenómeno de la RAH es ampliamente estudiado en México y América Latina sobre todo en rumiantes(12-14) y otros équidos(5) . Existen algunos estudios en algunas zonas ecológicas del altiplano y centro del país, donde se mide el efecto antiparasitario de la ivermectina (IVM) en équidos(15), pero nunca ha sido medida la eficacia en burros. En la región del Altiplano Mexicano, los médicos veterinarios en campo, desde hace más de 10 años proporcionan gratuitamente la desparasitación a burros en al menos dos veces al año con IVM al 1% oral (comunicación personal Prado-Ortiz, O.), por lo que el desarrollo de la RAH de la población parásita es inminente. Debido a estas prácticas es relevante la realización de estudios que revelen el panorama actual de la RAH en la región. Actualmente, cuando se quiere enfrentar la RAH, antes que nada, deben conocerse aspectos importantes de la epidemiología de la enfermedad de manera regional, local y particular(11,16,17). Para esto, el establecimiento de criterios propios de umbrales económicos como la distribución de la eliminación de huevos por gramo de heces (HPG), los valores de la condición corporal (CC) y la identificación de géneros de nematodos existentes en la zona ecológica a estudiar, son necesarios, así como la detección de posibles prácticas que indiquen fallas en el tratamiento y causen la RAH(18,19). En este estudio se analiza el fenómeno de RAH en burros y se consideran estos umbrales con la evaluación de las prácticas del propietario. Esto contribuye a la planeación de las distintas estrategias para retrasar la RAH y prolongar la efectividad de un fármaco, con miras en un futuro de lograr un Control Integrado Parasitario (CIP) en burros.

Material y métodos El estudio fue realizado en cuatro comunidades de los municipios de Tecozautla, Hidalgo (Aljibes y San Pedro) y San Juan del Río, Querétaro (Santa Rosa Xajay y Vaquerías), pertenecientes al altiplano mexicano.

Animales Se eligieron burros de estas comunidades mencionadas, porque reciben continuamente apoyo de médicos veterinarios zootecnistas (MVZ) voluntarios, los cuales proporcionaron información de los propietarios de burros y datos de protocolos de tratamiento de estos. El último tratamiento antihelmíntico aplicado fue con IVM al 1% vía oral, seis meses previos al experimento. Cabe mencionar que los burros de estas comunidades llevan más de 10 años siendo atendidos por estos médicos y ellos nunca han utilizado otra familia de antihelmínticos ni fármacos.

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Diseño experimental Se seleccionaron 53 burros (Equus asinus), sin diferencia de sexo, dentro de un rango de edad de 3 meses hasta 25 años. El experimento se dividió en dos etapas. En la 1ª etapa, los 53 animales permitieron la determinación de los umbrales económicos (explicados más adelante) en la zona ecológica y la formación de los grupos experimentales de la 2ª etapa, al día pre-tratamiento. En la 2ª etapa, se establecieron dos grupos experimentales de 15 animales cada uno, grupo tratado (gT) y grupo control sin tratamiento (gC). Siguiendo la metodología sugerida por la Asociación Mundial para los Avances en Parasitología Veterinaria WAAVP (por sus siglas en inglés the World Association for the Advancement Veterinary Parasitology)(20-22), los animales se seleccionaron al azar y como condición que tuvieran un mínimo de 150 HPG. Los rangos presentados en cada grupo fueron de 150 a 2,850 HPG para gC y 150 a 2,150 HPG para gT. Al día cero, al gT se administró IVM al 1% vía oral a la dosis recomendada de 0.2 mg/kg de peso vivo(21). Para calcular la dosis individual del fármaco, el peso corporal aproximado se obtuvo mediante el estimador de peso “The Donkey Sanctuary”(23,24). Se tomaron muestras fecales a ambos grupos los días 7 y 14 posttratamiento(21).

Umbrales económicos Huevos por gramo de heces (HPG) Para conocer el número de HPG se obtuvieron muestras de heces directamente del recto de los burros(21,22). Las muestras se conservaron a 4 ºC hasta ser procesadas mediante la técnica de McMaster modificada(20-22) en el laboratorio de Investigación del Departamento de Parasitología de la FMVZ, UNAM. Condición corporal (CC) La CC se obtuvo a partir de la estimación visual del animal, en una escala del 1 al 5, con incrementos de 0.5, utilizando “Body Condition Score Chart” de The Donkey Sanctuary(23). Identificación de géneros de nematodos gastrointestinales Se realizaron coprocultivos, para la obtención de la larva infectante (L3) mediante la técnica de cultivo descrita por Figueroa et al(25) y la técnica de migración de las larvas con el dispositivo Baermann con una incubación de 10 días(25). Posteriormente, se recolectaron las L3 y se lavaron mediante la técnica para la limpieza de larvas de NGI por gradientes de densidad con sacarosa al 40%(25,26). Finalmente, se identificaron 100 L3 de los cultivos del día pre-tratamiento y de los días 7 y 14 post-tratamiento, respectivamente(25,26).

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Prueba de reducción en el conteo de huevos en heces (FECRT) Para determinar el porcentaje de eficacia del fármaco, se realizó la prueba de reducción en el conteo de huevos en heces, FECRT (por sus siglas en inglés Faecal Egg Count Reduction Test) bajo los lineamientos de la WAAVP (21,22, 27). A los grupos gT (n= 15) y gC (n= 15), se realizaron pruebas de McMaster de los días 1 pretratamiento, 7 y 14 postratamiento.

Encuestas a los propietarios de los burros Se realizó una encuesta exploratoria(28,29) a 25 propietarios de los burros. El cuestionario incluía preguntas acerca de la atención médica dada por los médicos, específicamente la desparasitación, así como el tipo de encierro y alimentación dado a sus animales, con el objetivo de detectar fallas en el manejo y causas que generen RAH. En caso de que el propietario proporcionara el tratamiento complementario al del MVZ, la encuesta consideró cuestiones como los criterios de la frecuencia, procedimientos de aplicación y aplicación de otros antihelmínticos(29).

Análisis estadístico Los datos de correlación de CC y HPG, se analizaron con el paquete estadístico R©(30).Los valores de FECRT se calcularon usando el programa RESO.exe©(31) de acuerdo con la fórmula: Eficacia (%)= (HPG pretratamiento gC – HPG post-tratamiento gT / HPG pretratamiento gC) x100(20-22). Se considera susceptible una población parásita a un AH cuando el porcentaje de eficacia es mayor al 95 % y el límite inferior del intervalo de confianza 95% es mayor de 90 %. Se considera sospechosa a RAH a una población cuando solo uno de los dos criterios se cumple(20-22,31).

Resultados Umbrales económicos Huevos por gramo de heces (HPG) En la 1ª etapa, el 98.1 % (n= 52) de las muestras de heces resultaron positivas a huevos tipo estrongílido. El rango de eliminación de HPG en esta etapa va desde los 0 hasta los 3,000 HPG, como se muestra en la Gráfica 1. De acuerdo con la distribución y los valores de la mediana de 350 HPG y el tercer cuartil de 600 HPG obtenidos (Figura 1), se determinó que el umbral económico de los burros en el Altiplano Mexicano es de 600 HPG.

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Figura 1: Distribución de la eliminación de huevos por gramo de heces (HPG), obtenida en burros del altiplano mexicano

Barras verdes= animales con <350 HPG; Barras naranjas= animales con 350 a 600 HPG; Barras rojas= animales con >600 HPG.

Condición corporal (CC) La CC que presentó la mayoría (91 %) de los animales fue aceptable (2.5 a 3.5) y 3 tuvieron valores de 4.5 (sobrepeso) y sólo 2 animales de 1.5 (pobre), según la carta de estimación de condición y peso referida(23). Además, se observó que existe una correlación negativa altamente significativa (P= 0.01), por lo que hay evidencia para suponer que, a mayor CC, la descarga de huevos obtenida es menor, con una P<0.05 con intervalo de confianza del 95% (0.07 a 0.56). El coeficiente de determinación fue de 0.1154 (Figura 2). Por lo tanto, por cada aumento en la CC de 0.5, la descarga de huevos se ve reducida 0.33 %. Sin embargo, esta disminución en la eliminación de huevos puede ser variable dentro de un rango del 0.07 a 0.56 %.

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Figura 2: Correlación entre la eliminación de huevos por gramo de heces (HPG) y la condición corporal (CC) evaluadas en burros del altiplano mexicano

Identificación de géneros de nematodos gastrointestinales Fueron identificadas 100 larvas infectantes, donde se observó que el 63 % de éstas corresponden a ciatostómidos (Figura 3). Dentro de los pequeños estrongílidos se encontraron los del género Poteriostomum spp, Gyalocephalus spp y Oesophagodontus spp. La especie con mayor frecuencia de los grandes estrongílidos fue Strongylus edentatus, seguido de S. equinus y S. vulgaris. Figura 3: Distribución de géneros de nematodos gastrointestinales presentes en burros del altiplano mexicano

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Prueba para determinar la eficacia de la ivermectina FECRT En la 2ª etapa del experimento, con la prueba FECRT, se obtuvo que los días 7 y 14 posttratamiento en el gT comparado con el gC, la IVM al 1% administrada vía oral tiene actualmente en esta población específica una eficacia del 99 y 100 % respectivamente, con un intervalo de confianza del 95%, por lo que se considera esta población de parásitos susceptible a la IVM al 1%. En contraste, el rango de eliminación para el gC fue de 100 a 850 HPG al día 14.

Encuestas a los propietarios de los burros La edad promedio de los animales es de 11.05 años, la mayoría machos (79 %). Solo el 40 % de los animales conviven en corrales, algunos en alojamiento en común en cada comunidad, durante la época de secas, temporada en la que estos no realizan actividades agrícolas cotidianas, aunque el resto indica que cuando éstas son realizadas en las épocas de siembra y cosecha, estos animales en su mayoría son alojados en corrales como encierro nocturno, posterior a la jornada laboral. En el caso de los animales que pastorean, el propietario comenta que es un predio propio, exclusivamente utilizado para la siembra de diversos productos como el maíz y frijol. El 80 % admite utilizar como única estrategia de control parasitario que es proporcionado por el servicio de los médicos voluntarios. El 20 % restante, desconocen el nombre del producto comercial, así como el principio activo y dosifican el producto sin conocer el peso del animal o la dosis. Los propietarios señalan que el tratamiento lo aplican durante la época previa a las lluvias, o hasta dos veces por año (Cuadro 1). Cuadro 1: Respuestas a la encuesta acerca de las prácticas de desparasitación realizada a propietarios de burros en el altiplano mexicano Pregunta ¿Qué manejo da a sus animales

¿Dónde pastorean? # animales/corral Además del servicio MMVVZZ voluntarios, ¿Desparasita a sus animales? ¿Qué producto utiliza?

(n)

Pastoreo Encierro nocturno Corral Predio exclusivo Predio compartido Promedio

36 24 40 36 20 NA

9 6 10 9 5 1.3

Si No

20 80

5 20

No recuerda “Pasta” (no sabe nombre)

8 12

2 3

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¿Verifica la caducidad? ¿A qué dosis aplica el producto?

Vía de Administración

¿Quién aplica el producto?

Pesaje Frecuencia

¿En qué momento realiza este manejo?

Si 4 No 16 No sabe/ no recuerda 12 Por “cm”/ Todo el 8 producto Oral 20 Intramuscular 0 Subcutánea 0 No sabe 0 MVZ 8 Propietario 12 Otro 4 Si 0 No 20 Cuando el MVZ indica 0 Semestral 12 Anual 8 Previo empadre 0 Previo parto 0 Previo a lluvias 20 Después de lluvias 0 Otro 0

1 4 3 2 5 0 0 0 2 3 1 0 5 0 3 2 0 0 5 0 0

Discusión En esta especie, en la actualidad, no existe información en el altiplano mexicano donde se conozca: la dinámica poblacional medida en la variación estacional de eliminación de HPG como los realizados anteriormente en Argentina(32), incluyendo la identificación de especies parásitas de la zona; o el umbral económico de HPG propio de la zona ecológica que indique si el animal es candidato o no a la desparasitación, como se ha hecho en otras especies(33,34); o la posible relación entre umbrales, como HPG y CC de los burros en la zona ecológica. El trabajo de diagnóstico parasitario en burros es pobre, por lo que el establecimiento de umbrales no ha sido prioridad. En trabajos previos(2), se observó una mediana de 600 HPG, y específicamente en una zona ecológica tropical se determinó una mediana de 1,000 HPG, lo que confirma las diferencias que existen entre cada zona. Estas variaciones hablan sobre todo de la epidemiología de los parásitos, de ahí la importancia de definir los umbrales económicos de HPG de manera específica.

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En este estudio, para determinar el criterio de umbral económico de HPG, se obtuvo la distribución donde la mediana fue de 350 HPG, lo que significa que de manera rutinaria sea desparasitado al 50 % de los animales. Esto implica un costoso programa de desparasitación innecesario, ya que algunos no necesitan el medicamento. El reto aquí comienza con el llamado fenómeno de la superdispersión en el que varios autores(35,36) coinciden en que sólo el 20 al 25 % de la población animal sufren una parasitosis (por ser grandes eliminadores) y son los probables candidatos al tratamiento. Además, se calculó el valor del tercer cuartil (75 %) el cual fue de 600 HPG, mismo que se tomó como umbral económico de HPG en burros del altiplano mexicano. Esto indicaría que sólo un 25 % de esta población sería candidata a tratamiento, siempre y cuando presentaran otros criterios de umbrales económicos que reflejen una aparente parasitosis. Otro aspecto para evaluar con este estudio de la dispersión de los NGI es que aquellos burros que se ubican en las barras verdes y naranjas representan a la población resistente a los NGI y aquellos animales que están en las barras rojas, pero no presentan signos clínicos y estado de ánimo decaído es la población resiliente a los NGI. Estas dos poblaciones resistentes y resilientes son muy probablemente la importante y rescatable población refugio ante el fenómeno de la RAH, conceptos muy importantes para entender el fenómeno del parasitismo y sus hospederos(37). Considerando también la zona ecológica, resalta el fenómeno de eliminación que se observa en el gC, el cual a los 14 días disminuyó el valor de HPG en un rango de 100 a 850 cuando al pretratamiento fue de 150 a 2,850. Una hipótesis ante esto es el rol de las plantas endémicas con componentes bioactivos contra los NGI, estudiado en otras especies(38) así como el fenómeno de hipobiosis que se discute más adelante. Los ciatóstomidos han ganado importancia debido al enquistamiento de las larvas en la submucosa intestinal y de las larvas hipobióticas(39-41). A su vez, es sabido que en países donde en el periodo de otoño e invierno es marcado, momento donde fue realizado este estudio, las larvas que podrían encontrarse enquistadas en la mucosa intestinal son indetectables(21,39), por lo que el conocer la dinámica de población parasitaria anual podría dar un mejor panorama de las nematodosis existentes y a su vez, desarrollar estrategias para su tratamiento. Es importante mencionar que la CC obtenida en el 91 % de los burros tiene valores aceptables de 2.5 a 3.5, lo que indica que los animales a pesar de sus condiciones medio ambientales expresan la rusticidad que los caracteriza y hacen frente a las parasitosis(3), fenómeno que ayuda a reafirmar por qué no todos los burros necesitan un tratamiento bajo esquemas fijos. Por otra parte, cuando se hizo la correlación entre la CC y el valor de HPG, se observó que existe una aparente reducción del 0.33 % de HPG, conforme el aumento de 0.5 en CC. Este estudio, definió que los HPG, la CC y su estrecha relación, son importantes umbrales en el manejo de las nematodosis gastrointestinales en burros. Es importante señalar que, aunque existen estudios donde no se observa una relación entre la CC y la carga parasitaria en burros(2,3,23), Yoseph et al(40) sugieren la medición de este umbral económico, siempre y 335

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cuando se cumpla con una alimentación basada en forraje de buena calidad y un adecuado manejo del tratamiento antihelmíntico. Dado que las parasitosis son unas de las enfermedades que pasan desapercibidas por el propietario, varios autores(41) mencionan la importancia de que se restablezca la asociación entre médico y productor/propietario para el diseño de estrategias de manejo y control parasitario, aunado con la creciente preocupación por la RAH en México, debido al uso constante e indiscriminado de los AH. Esto sucede principalmente con la IVM. En este estudio se comprobó que la efectividad de la IVM fue del 100 %. Sin embargo, existen estudios(42,43) en los que se menciona, que debido a que las pruebas para la efectividad de AH en équidos aún no se han estandarizado del todo, es posible que exista un margen donde la validación de una población resistente requiera de pruebas complementarias. También otros autores(44) reportan que es de importancia el desarrollo de pruebas comparativas como el LMIT (test de la inhibición de migración larvaria) en la que encontró que es posible conocer la sensibilidad a la IVM de la población de ciatostómidos presentes en équidos. Complementario a este estudio, se sugiere la evaluación del ERP (el periodo de reaparición de huevos por sus siglas en inglés) después del tratamiento, debido a que se ha observado que, aunque el FECRT indique que la población parásita es sensible en un 100 % al AH evaluado, este umbral puede exponer un proceso de resistencia latente. En équidos, el ERP que se observó es de 8 a 13 semanas para IVM. En burros de The Donkey Sanctuary en Reino Unido, este ERP en animales que han sido poco expuestos al fármaco, es de 6 semanas(44) y probablemente se ha visto reducido debido al desarrollo de especímenes “juveniles” que no fueron eliminados durante el tratamiento(45). La poca efectividad del fármaco contra larvas hipobióticas podría ser un detonante de RAH, debido a la exposición constante de éstas a la IVM, por lo que se ve aumentada la presión de selección del parásito, manifestándose en un corto ERP, y por lo tanto especies resistentes en la siguiente generación(44); sin embargo, más estudios son necesarios para corroborar esto. No se puede hablar de la efectividad de un fármaco o de RAH, si no se evalúa de manera paralela las prácticas que propietarios o veterinarios realizan con respecto a la actividad de desparasitación. En este estudio se detectaron probables causas de RAH y posibles fallas en la desparasitación a través de encuestas. Se daba tratamiento a toda la población de burros, incluso aquellos aparentemente sanos. Esto aumenta la presión de selección de los parásitos, haciendo que las generaciones siguientes sean resistentes y disminuyendo la existencia de hospederos refugio dentro de la población, por lo que la reserva de un valioso recurso, como lo es la IVM, para animales que realmente requieren tratamiento, evita la generación de nuevas especies no sensibles a ésta. Se dosificaba sin conocer el peso corporal exacto, así como un tratamiento sistemático o supresivo (p.ej. dos veces por año) de la misma AH. En este caso, los riesgos de estas 336

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acciones representan que los parásitos adquieran la RAH sin una eficiente eliminación o control y la hereden a su descendencia. Un ejemplo claro, es la reducida acción de la IVM contra larvas hipobióticas, en donde se ve aumentada la presión de selección en el parásito. El desconocimiento del propietario de los productos aplicados, así como de dosis correctas, objetivo del manejo y la correcta aplicación de este, ya que, como se menciona anteriormente, pueden ocurrir tratamientos inadvertidos y la subdosificación/ sobredosificación del fármaco. Por lo anterior, la implementación de nuevas herramientas de control parasitario, que tengan como objetivo disminuir la presión de selección de los parásitos a distintos AH, se ha convertido en una de las principales necesidades del manejo parasitario(41). Respondiendo a esta necesidad, surge la utilización de distintas herramientas que finalmente conforman un manejo y control que las integre. El CIP pretende retardar el aumento de poblaciones parásitas con mayor proporción de individuos genéticamente resistentes a uno o más AH(46). El esquema propone integrar distintos principios basados en la dinámica poblacional parásita de un hato o establo conocido. Dentro de este esquema se encuentra la DSD(16), la cual se percibe como viable en esta región.

Conclusiones e implicaciones Si bien el desarrollo de resistencia a la IVM aún no está presente, lo observado demuestra que estas comunidades se encuentran en un punto crítico, por lo que la corrección de las fallas en el tratamiento antihelmíntico y la prevención de causas probables de RAH pueden ayudar a los médicos, en conjunto con los propietarios, a cuidar un recurso único como lo es este AH a través de la utilización adecuada y racional de nuevas moléculas disponibles en el mercado, la evaluación y obtención de umbrales propios junto con el desarrollo de herramientas para el establecimiento de estos, dejando como precedente la concientización del uso correcto de los AH y, en consecuencia, el mejoramiento en la calidad del bienestar animal de los burros.

Agradecimientos Al MVZ. Omar Prado Ortiz por la valiosa ayuda técnica recibida durante el desarrollo de la investigación.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.4946 Artículo

Artemisia cina 30 CH como tratamiento homeopático contra el Haemonchus contortus

Rosa Isabel Higuera-Piedrahita a* María Eugenia López-Arellano b Raquel López-Arellano c César Cuenca-Verde c Jorge Alfredo Cuéllar-Ordaz c

Universidad Nacional Autónoma de México. Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal. Carr. Cuautitlán-Teoloyucan Km 2.5, Col. San Sebastián Xhala. Cuautitlán, Estado de México, México. b

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad (CENID-SAI). Jiutepec, Morelos, México. c

Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán. Cuautitlán, Estado de México, México.

*Autor de correspondencia: rositah_10@hotmail.com

Resumen: El problema de la resistencia a los antihelmínticos es ampliamente reconocido en la producción ovina. Por lo tanto, es necesario integrar nuevos métodos de control contra los nematodos gastrointestinales (NGI). El objetivo de este estudio fue evaluar la toxicidad de Artemisia cina 30 CH como un producto homeopático contra Haemonchus contortus en ensayos in vitro e in vivo; A. cina 30 CH se obtuvo de un laboratorio comercial, y la confirmación de la artemisinina como ingrediente clave se realizó con espectrometría de masas. A. cina 30 CH y la molécula registrada como antihelmíntica de la artemisinina se 342

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usaron para inhibir la eclosión del huevo (IEH) y la migración larval (L3) de H. contortus (IML). Además, tres grupos de 10 corderos infectados naturalmente con NGI se trataron con A. cina 30 CH y albendazol, y 10 fueron utilizados como control. La infección parasitaria se controló a los 0, 7, 14 y 28 días post-tratamiento (PT) para determinar el número de huevos por gramo (HPG) y el índice FAMACHA. Los datos in vitro mostraron 100 % de IEH y 64.7 % de IML por A. cina 30 CH, y se observó actividad no letal con la artemisinina. La toxicidad de A. cina 30 CH contra H. contortus en corderos infectados se observó después de 7 días de infección. La administración de A. cina 30 CH produjo una reducción de 69 % de EPG a los 28 días PT, similar al albendazol (P<0.05). En conclusión, A. cina 30 CH tuvo la capacidad de IEH e IML de H. contortus en ensayos in vitro y redujo el número de huevos de H. contortus, que es el nematodo parásito primario en corderos en pastoreo, con lo que se redujo la infección. Palabras clave: Artemisia cina 30 CH, Artemisinina, Haemonchus, Corderos.

Recibido: 14/06/2018 Aceptado: 04/03/2019

Introducción Los nematodos gastrointestinales (NGI), principalmente H. contortus, que es el nematodo más frecuente en las regiones tropicales, se encuentran entre los principales patógenos que reducen la producción animal(1). Durante mucho tiempo, los medicamentos antihelmínticos se han utilizado como el principal método tradicional de control, y solo uno está en el mercado(2). Sin embargo, el uso inadecuado de este medicamento ha causado problemas de resistencia en todo el mundo en varias especies de rumiantes(3,4). La alta prevalencia y la rápida dispersión de la resistencia antihelmíntica han aumentado en los rumiantes domésticos, que muestran resistencia a múltiples fármacos antihelmínticos en ciertas regiones(5). En México, se han presentado diversos informes sobre NGI y se están estudiando otras estrategias de control(6). El uso de diferentes métodos de control se ha denominado Control Integrado del Parásitos (CIP)(7). La estrategia de la mayoría de los estudios es centrarse en el control de nematodos altamente patógenos, como H. contortus y Teladorsagia, en pequeños rumiantes debido a sus hábitos de alimentación sanguínea. La rotación de la pradera, la selección de razas resistentes, el control biológico (es decir, hongos nematófagos y nematodos depredadores)(8), la desparasitación selectiva, las vacunas y los derivados de la herbolaria tradicional (esto es, 343

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productos homeopáticos) se consideran en el CIP(9). Sin embargo, se necesitan más estudios de métodos alternativos para reducir el HPG y los nematodos adultos durante los procedimientos de cría(10). Los compuestos homeopáticos son sustancias de diferentes orígenes, como vegetales o minerales, que tienen efectos terapéuticos. Los productos homeopáticos se preparan siguiendo las instrucciones de la Farmacopea Homeopática(10,11). Por ejemplo, los productos homeopáticos obtenidos de plantas se adquieren como extractos etanólicos (generalmente), y se diluyen en 99 partes de alcohol hasta alcanzar la concentración deseada (decimal y centesimal) por debajo del número de Avogadro 6.02214 * 1023. De esta forma, los medicamentos homeopáticos se obtienen con baja inversión y fácil extracción y representan un método seguro de control(12). Recientemente, varios informes sobre el posible uso de productos homeopáticos con un efecto nematicida han brindado la oportunidad de integrar A. cina como un nuevo método de control. A. cina es una planta que pertenece a la familia Asteraceae y contiene artemisinina como metabolito activo(13). Esta planta ha mostrado propiedades antihelmínticas y antipalúdicas(14). Por ejemplo, A. cina parece tener un efecto terapéutico potencial contra los parásitos, pero se requieren más estudios para determinar si la especie puede usarse, como un producto homeopático o en su forma natural, como un posible antihelmíntico contra la NGI. A. cina está conformada en la concentración de 30 centesimales hannemanianas (CH) según lo registrado por la farmacopea homeopática mexicana (concentración: 10-60M), que es la que se sugiere administrar en rumiantes. El objetivo de este estudio fue determinar la eficacia antiparasitaria de un producto homeopático basado en A. cina 30 CH en ensayos in vitro e in vivo contra una infección natural de pequeños rumiantes con NGI.

Material y métodos Localidad El análisis por espectrometría de masas se realizó en el laboratorio 5 de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria; el análisis in vitro, en los laboratorios 3 y 5 de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (FESC), UNAM, en el Municipio Cuautitlán, Estado de México, y el ensayo in vivo, en un rancho en el municipio Mixquiahuala, estado de Hidalgo a 2,100 msnm con un clima semiseco, una temperatura anual de 16.6 ° C y precipitación pluvial de 500 mm(15).

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Identificación de artemisinina en A. cina 30 CH Las moléculas de artemisinina se identificaron a partir de productos comerciales de A. cina 30 CH (Millenium Lab, México). Se utilizó cromatografía líquida de ultrarrendimiento con espectrometría de masas (UPLC / MS) con una columna de fase inversa en modo positivo. Todas las muestras se realizaron de acuerdo con las siguientes condiciones: velocidad de cono 70, Sm (Mn 2 * 0.75) y lectura de UPLC / MS de 200 a 300 m/z en el laboratorio 5 de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria. La concentración de A. cina 30 CH fue de 10-60M.

Parásitos Se recogieron heces positivas para huevos de nematodos parásitos de un cordero donador previamente infectado con 5,000 huevos de H. contortus L3, una cepa aislada y mantenida en el FESC, UNAM. Se usó la técnica cuantitativa de McMaster para determinar el número de HPG, y se realizaron técnicas de coprocultivo para recolectar H. contortus L3 a los 21 días después de la infección (PI). Las larvas se mantuvieron a -20 °C hasta su uso (las larvas recuperadas del cultivo larvario se criopreservaron en glicerol; para los bioensayos, las larvas se descongelaron a temperatura ambiente y se verificó 95 % de motilidad).

Bioensayos Se realizaron dos ensayos in vitro diferentes para determinar la inhibición de la eclosión del huevo (IEH) y la inhibición de la migración larval (IML)(16). Todas las técnicas se realizaron con 100 huevos o etapas infecciosas de larvas (L3) de H. contortus. Para cada ensayo, se prepararon tres réplicas y se aplicaron cinco tratamientos de la siguiente manera: 1) 20 µL de A. cina 30 CH (10-60 M); 2) 100 µl de agua destilada (AD, testigo); 3) 50 mg/ml de albendazol (ABZ, control) (Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.), solubilizado con 0.1 mg / ml de dimetil sulfóxido (DMSO); 4) 20 µl de etanol; y 5) 1 mg/ml de artemisinina (Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EE. UU.). El IEH se llevó acabo en placas ELISA que se incubaron a 28 °C durante 48 h. La lectura de IEH se realizó utilizando la solución de yodo de Lugol, que se agregó a cada envase después de la incubación. Se leyó el volumen total de cada envase ELISA para contar el número de H. contortus L1 e IEH activos por envase con un microscopio con aumento de 10 X (Olympus, modelo CK-2, Japón).

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El IML recibió un tratamiento similar al IEH, excepto que el ABZ fue reemplazado por levamisol (300 mg / ml). Las larvas también se leyeron usando la solución de lugol después de la incubación. Se leyó el volumen total por depósito para determinar el IML.

Ensayos in vivo Corderos Treinta corderos de raza Suffolk ―16 machos y 14 hembras―, de 3 meses de edad y 20 días después del destete, se infectaron naturalmente con NGI. Todos los corderos se mantuvieron en condiciones semi-estables, pastando en potreros durante el día y en establos por la noche. Los corderos fueron alimentados con concentrado comercial y agua a voluntad. No se aplicó tratamiento antihelmíntico a ningún cordero antes del presente estudio. Todos los corderos fueron positivos para huevos NGI, lo que fue confirmado por las técnicas de McMaster y de coprocultivo.

Diseño experimental Antes de los tratamientos, los corderos se aleatorizaron en tres grupos de 10 cada uno con el apoyo del paquete estadístico StatGraphics Centurion XV. Los tratamientos se diseñaron de la siguiente manera: el grupo A recibió 1 ml de A. cina 30 CH por cada 5 kg de peso corporal (PC) por vía oral (Millenium Laboratories, México) como una dosis única; la concentración de A. cina 30 CH fue de 10-60 M.(1) El grupo B se trató por vía oral con ABZ a 7.5 mg / kg de peso corporal, y el grupo C, sin tratamiento, se utilizó como testigo. Se recogieron muestras fecales y hematológicas a 1 día de pretratamiento (0 días) y a los 7, 14 y 28 días de postratamiento (PT). Además, se observaba el color de la mucosa ocular utilizando el índice FAMACHA.

Análisis estadístico Las medias de los huevos de H. contortus y las larvas L3 se compararon entre los tratamientos y los grupos testigo mediante el análisis ANOVA, complementario con la prueba de Tukey para identificar las diferencias entre los tratamientos, utilizando el software StatGraphics Centurion XV. El número de HPG se transformó en log10 HPG + 10 para estabilizar la varianza, y la prueba de diferencia menos significativa (DMS) se aplicó utilizando el software StatGraphics Centurion XV con un diseño completamente al azar que consideró mediciones repetidas a lo largo del tiempo y el tratamiento. Las diferencias con P<0.05 se consideraron significativas.

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Nota ética El manejo de los corderos se realizó de acuerdo con el Reglamento del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán-UNAM (CICUAE- FESC- UNAM) y está autorizado por el Protocolo No. DC2014-14.

Resultados Identificación de la artemisinina en A. cina 30 CH El análisis de espectrofotometría de masas mostró moléculas de artemisinina en los productos comerciales de A. cina 30 CH utilizados en el presente estudio. El análisis cromatográfico de A. cina 30 CH se realizó para comparar el perfil de los productos comerciales con el reactivo de artemisinina puro. La Figura 1 a-b mostró moléculas de artemisinina correspondientes a A. cina 30 CH y el reactivo de artemisinina puro con 279.20 m/z.

Intensidad relativa (%)

Figura 1a-b: Análisis de espectrofotometría de masas de reactivo puro (a) y A. cina 30 CH (b), que muestran similitudes entre 283 y 290 m/z a

Relación masa/carga

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Intensidad relativa (%)

Relación masa/carga

Ensayos in vitro IEH. Los datos obtenidos de la evaluación de A. cina 30 CH mostraron 100 % de IEH de H. contortus A. cina después de 48 h; Este resultado fue seguido por el tratamiento ABZ, con 93 %. En contraste, no se observó IEH de H. contortus con 80 % de etanol, el reactivo de artemisinina puro y los tratamientos DW no mostraron efecto (Figura 2). Figura 2: Inhibición de ensayos de eclosión de huevos contra huevos de Haemonchus contortus expuestos con Artemisia cina 30 CH y tratamientos con albendazol y testigos (artemisinina, agua y metanol)

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IML. La A. cina 30 CH mostró una inhibición de la migración del 65,7% de las larvas infecciosas de H. contortus. Se observaron diferentes resultados con el reactivo de artemisinina puro usado a 0.1 y 1 mg/ml con DW y etanol, con todos los grupos tratados que muestran una migración larval del 100 %, lo que indica que no se observó inhibición en los grupos testigo. El levamisol utilizado como antihelmíntico mostró una eficacia letal del 100 % contra las larvas; por lo tanto, no se observó migración (Cuadro 1). Cuadro 1: Porcentaje de inhibición de la migración larval (IML) contra Haemonchus contortus L3 (X±SE) Tratamientos

Migración (%) 35.0 + 8.1 0 92.0 + 12.4 86.6 + 11.5

Artemisia cina 30 CH Levamisol (300 mg/ml) Agua Etanol 80%

Eficacia nematicida de Artemisia cina La infección natural con NGI en corderos en pastoreo mostró dos especies principales de NGI: H. contortus (75 %) y T. circumcincta (25 %). Los corderos infectados para todos los grupos mostraron una media de aproximadamente 2,000 HPG antes del tratamiento (d-0). A través de los siguientes períodos, se observaron diferencias significativas en la reducción de HPG a los 7 y 14 d PT (P<0.05) (Figura 3). Además, también se identificaron diferencias significativas entre los grupos A (A. cina 30 CH) y B (ABZ) en comparación con el grupo C (testigo, P<0.05) a los 7 días. Figura 3: Huevos por gramo observado a -7, 0, 7, 14 y 28 días después del tratamiento de corderos infectados naturalmente con nematodos gastrointestinales * (P<0.05)

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Tarjeta de índice de FAMACHA. Para todos los grupos, se determinó que el índice de la tarjeta FAMACHA era de 3.0 a 5.0 en el estudio in vivo. Los valores de FAMACHA fueron variables para todos los grupos. Se observaron diferencias importantes a los 14 y 28 d PT para los tratamientos de A. cina 30 CH y ABZ (Cuadro 2). Cuadro 2: Índice FAMACHA de corderos infectados naturalmente con nematodos gastrointestinales y que recibieron Artemisia cina 30 CH o albendazol

Tratamiento Artemisia cina 30 CH

Días post-tratamiento 7 14

3.0 + 0.13a

4.0 + 0.44aA

3.0 + 0.52bB

2.0 + 0.31bA

0.44

Albendazol

5.0 + 0.26ª

3.0 + 0.21bB

2.0 + 0.30cA

1.0 + 0.22cA

0.19

Testigo

3.0 + 0.25b

2.0 + 0.29aB

1.0 + 0.20aA

3.0 + 0.71bB

0.62

Las letras minúsculas iguales no tienen significación estadística y las letras minúsculas diferentes tienen diferencias estadísticas dentro del grupo (P <0.05). Las letras mayúsculas iguales no tienen significación estadística y las letras mayúsculas diferentes tienen diferencias estadísticas entre grupos (P<0.05).

Discusión A. cina tiene compuestos químicos, como los terpenoides, que proporcionan actividad insecticida contra la capacidad reproductiva y causan estrés antioxidante en los patógenos(17,18,19). En los últimos años, resultados importantes identificaron que la artemisinina tiene un posible efecto antihelmíntico(20). Por ejemplo, Akkari et al.(21) informaron una dosis letal (DL) de Artemisia campestris de 0.8 mg / mL contra H. contortus cuando se usa un extracto etanólico. En el presente estudio, A. cina 30 CH mostró 100 % de IEH de H. contortus, además de eficacia para disminuir la migración larval, resultados similares a los consignados por otros(22). Bashtar et al.(22) describieron el extracto etanólico de A. cina como eficaz contra el cestodo Moniezia. Además, el presente estudio tuvo 64.7 % de IML de H. contortus usando A. cina 30 CH. Se informó una reducción en la tasa de larvas en ratas infectadas con el nematodo Trichinella spiralis cuando las ratas fueron tratadas con A. cina 30 CH, Podophyllum 0 y Santoninun 30 CH (productos homeopáticos) en 68.14%, 84.10 y 81.20 % respectivamente.(23) Por el contrario, se utilizó reactivo puro de artemisinina como control, y no se observó inhibición de la eclosión en huevos ni inhibición de en larvas. Estos resultados sugieren que la ausencia de actividad podría haber sido producida por la conformación química de A. cina 30 CH, y un solvente que utilizaba compuestos con hidrógenos y anillos de fenilo, permitiendo así un cambio rápido en la conformación.

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Con respecto a la infección natural con NGI y los tratamientos de A. cina 30 CH aplicados después de 2 semanas, el ABZ y A. cina 30 CH mostraron diferencias significativas (P<0.05) en las reducciones en el número de HPG. Estos hallazgos fueron similares a los reportados por Bashtar et al(22), quienes encontraron una reducción de los proglótidos de Moniezia sp. en animales tratados con A. cina. Sin embargo, se requieren más estudios para confirmar el posible efecto antihelmíntico de A. cina 30 CH contra las etapas de nematodos usando artemisinina de plantas nativas. Los tratamientos con A. cina 30 CH y ABZ contra la infección natural mejoraron los valores de FAMACHA derivados del hábito de alimentación de sangre de H. contortus a los 7 y 14 días después de la administración (P<0.05). Cala et al(1) encontraron resultados similares, con el apoyo de la artemisinina como un posible metabolito nematicida después de la infección. Demeler et al(24) mostraron que la anemia causada por la infección por H. contortus en corderos tratados con ABZ mostró eficacia nematicida. Una revisión realizada por Kerboeuf et al(25) sugiere que la actividad de los flavonoides en la estructura y el blanco celular es similar al efecto antioxidante causado por la artemisinina. Aunque se desconoce el mecanismo de acción antihelmíntico de A. cina, se necesita la determinación de este mecanismo para su aplicación a los nematodos que infectan a los huéspedes. Se demostró la estabilidad de la artemisinina en el rumen, que era detectable en muestras de sangre a 33 mg de artemisinina/kg de peso corporal(21). El estudio de A. cina 30 CH mostró la participación del fármaco como un antihelmíntico, y debe considerarse como un posible método para su uso en el control de los parásitos nematodos.

Conclusiones e implicaciones La A. cina 30 CH tuvo eficacia antihelmíntica contra la eclosión del huevo de H. contortus durante la infección natural. El índice FAMACHA sugiere una reducción de la actividad de los nematodos después del tratamiento con A. cina 30 CH y ABZ. Además, este producto demostró la inhibición de la eclosión del huevo y la migración larval, lo que indica su posible efecto antihelmíntico. Para optimizar el uso de este compuesto homeopático, se debe determinar el mecanismo de su acción.

Agradecimientos Este estudio fue apoyado por PAPIIT IN226217, llamado "Efecto antihelmíntico del extracto etanólico de Artemisia cina, semilla de papaya (Carica papaya) y taninos condensados sobre el nematodo hematófago Haemonchus contortus". Rosa Isabel Higuera-Piedrahita recibió el apoyo parcial de una beca de CONACYT, México. La cepa de Haemonchus contortus

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utilizada se aisló y se mantuvo en los laboratorios 1 y 3 de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM.

Declaración de conflicto de intereses Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5090 Artículo

Inclusión de harina de Tithonia diversifolia en raciones para gallinas ponedoras de primer ciclo y su efecto sobre la pigmentación de yema de huevo

María Elena Carranco-Jáuregui a Vilma Barrita-Ramírez b Benjamín Fuente-Martínez c* Ernesto Ávila-González c Leonor Sanginés-García a

Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, Departamento de Nutrición Animal Dr. Fernando Pérez-Gil Romo, Vasco de Quiroga No. 15, Col. Belisario Domínguez Sección XVI, Alcaldía Tlalpan 14000, Ciudad de México. México. b

Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Ciudad de México. México. c

Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Avícola, , Ciudad de México. México.

*Autor de correspondencia: benjaminfuente@yahoo.com.mx Resumen: Una consideración importante para la población mexicana es la pigmentación de la yema de huevo, siendo importante adicionar carotenoides en la dieta de las aves, lo que hace necesario explorar fuentes alternas que aporten pigmentos a los ya utilizados en la industria avícola, por lo que la harina de Tithonia diversifolia puede ser una alternativa viable de carotenoides. El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de incluir harina de Tithonia

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diversifolia (HTD) en dietas para gallinas ponedoras sobre variables productivas y color en yema de huevo. Se llevaron a cabo dos ensayos: 1) 3 semanas solo con xantofilas amarillas de HTD y 2) siguientes 3 semanas con HTD + xantofilas rojas. Un total de 240 gallinas se distribuyeron en cinco tratamientos: testigo; 1.77; 5; 10 y 15% de HTD. Se midieron: porcentaje postura, peso huevo, consumo alimento, conversión alimentaria y masa de huevo. Al finalizar cada ensayo se tomaron 20 huevos/tratamiento midiendo el color de yema con abanico DSM, colorimetría de reflectancia y cuantificación de xantofilas (HPLC). Se utilizó un diseño completamente al azar y las diferencias entre medias por prueba de Tukey. El peso de huevo y la conversión alimenticia no mostraron diferencias entre tratamientos (P>0,05). Porcentaje de postura y masa de huevo (10 y 15% HTD) y consumo de alimento (15% HTD) fueron menores al testigo (P<0,05). El color de yema fue más intenso para 10 y 15 % de HTD. Se concluye que HTD puede ser alternativa como pigmento amarillo hasta un 10 % de inclusión sin afectar variables productivas. Palabras clave: Tithonia diversifolia, Gallinas ponedoras, Huevo, Variables productivas, Pigmento.

Recibido: 02/10/2018 Aceptado: 20/03/2019

Introducción Actualmente, la industria avícola en México produce anualmente más de 5 millones de toneladas de alimento (huevo, pollo y pavo) para cubrir las demandas de la población, que representa un 63.8 % de la producción pecuaria y dentro de ésta el huevo constituye un 29 % con una proyección de producción en 2018 de 2.806 millones de toneladas y la alimentación dentro de la producción un 60 a 70 % de los costos de los insumos que se utilizan para la elaboración de los alimentos(1). El consumo de huevo tiene varias ventajas sobre otros alimentos, destacando su alto valor biológico, fácil manejo, varias formas de preparación y combinación con otros alimentos y de accesible en costo. Sin embargo una consideración importante para el consumidor es la pigmentación de la yema, por lo que dentro de la alimentación de las aves, la adición de pigmentos a la formulación de su raciones es indispensable y al mismo tiempo conlleva un costo económico importante que impacta en el precio del producto final que es el huevo(2,3). Uno de los principales insumos para la elaboración de alimento para gallinas productoras de

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huevo son los pigmentos amarillo y rojo y la pigmentación de la yema de huevo dependerá de los carotenoides que el ave consume en su alimento; sin embargo la producción intensiva de éstas impide que consuman pigmentos al aire libre, por lo que las dietas deben complementarse con fuentes naturales ricas en pigmentos(2,3), por lo que se hace necesario explorar nuevas fuentes de alimentos que aporten pigmentos que sean fáciles de utilizar, aporten carotenoides y sean de costo accesible que no impacte en el precio de producción de huevo. Dentro de este contexto, una fuente alterna natural de carotenoides viable de utilizarse para pigmentar la yema de huevo podría ser la Tithonia diversifolia también conocida como árbol maravilla, botón de oro, girasol mexicano, falso girasol, crisantemo de Nitobe, Quil Amargo y Wild Sunflower, que se localiza en áreas tropicales y subtropicales con casi 15,000 especies distribuidas por todo el mundo, principalmente en América Central y México(4). Crece al borde de los caminos de forma rápida, incluso bajo condiciones desfavorables y se multiplica fácilmente. Se conoce que dicha especie mejora el reciclaje de nutrimentos, previene la erosión, reduce los efectos del pisoteo animal sobre el suelo y ofrece una alta productividad de biomasa sin insumos agroquímicos(5,6) y como planta multipropósito: cerco vivo, abono verde, fuente de alimento en silvopastoreo de ganado bovino o forraje de corte en la alimentación de aves y rumiantes. Rosales(7) reporta que Tithonia diversifolia tiene valores (g/100g) de materia seca (23.0), proteína cruda (14.8-28.7), cenizas (21.4) y materia orgánica (78.6) y otros autores evaluaron la influencia de esta planta como fuente de pigmento en gallinas ponedoras, obteniendo un buen color en yema de huevo con una inclusión del 15%(8). Con estos antecedentes, el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de diferentes niveles de inclusión de harina de Tithonia diversifolia en raciones para gallinas ponedoras de primer ciclo de postura sobre la pigmentación de yema y calidad física del huevo.

Material y métodos Área de estudio, muestreo y determinación de pigmentos En la Unidad Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Nayarit, se llevó a cabo la recolección de Tithonia diversifolia. Esta Unidad se localiza en Compostela, Nayarit, México, cuenta con un clima tropical, los veranos son mucho más lluviosos que los inviernos, con temperatura media anual de 22.4 °C y precipitación media aproximada de 1,060 mm(9).

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Se cosecharon manualmente hojas y peciolos de Tithonia diversifolia a los 60 días de rebrote (644.5 kg/fresco), se eliminó todo material ajeno a la investigación y se llevó a cabo un presecado (hojas + peciolos) en sombra en el mismo lugar de la cosecha, se guardaron en bolsas de plástico negras y se transportaron al Departamento de Nutrición Animal Dr. Fernando Pérez-Gil Romo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán para terminar de secarse en estufa a 60 °C/24 h; se molieron en un molino de martillos con una malla de 1 mm y esta harina de Tithonia diversifolia (HTD) se guardó para su posterior análisis.

Cuantificación de pigmentos a la harina de Tithonia diversifolia Este análisis se llevó a cabo en Industrias VEPINSA, S.A. de C.V. (Dirección de Investigación y Desarrollo) por el método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)(10).

Elaboración de dietas y comportamiento de las aves Se realizó en el Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Avícola (CEIEPAv) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. Todos los procedimientos con las aves fueron aprobados por el Subcomité Institucional para el Cuidado y uso de Animales Experimentales (SICUAE), Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México, Norma Oficial Mexicana(11). Las dietas se formularon cumpliendo con las necesidades nutricionales de la estirpe de acuerdo a la fase de producción por medio del programa computacional Allix2. Ver. 5.37.1. En este ensayo se utilizaron 240 gallinas Bovans blancas de primer ciclo, fueron distribuidas en un diseño completamente al azar en cinco tratamientos con cuatro repeticiones de 12 aves cada uno: 1) Testigo con 15 ppm pigmento amarillo; 2) 1.77 % de HTD y 15 ppm de xantofilas totales; 3) 5 % de HDT y 42.5 ppm de xantofilas totales; 4) 10 % de HTD y 85 ppm de xantofila totales; 5) 15 % de HDT y 127.5 ppm de xantofilas totales. El agua y alimento se ofrecieron a libertad. La investigación se llevó a cabo en dos ensayos: las primeras tres semanas sin inclusión de pigmento rojo en sus dietas y el segundo, las siguientes tres semanas, con inclusión de pigmento rojo en sus dietas (Cuadros 1 y 2).

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Cuadro 1: Dietas experimentales del primer ensayo con harina de Tithonia diversifolia sin pigmento rojo (kg) Harina de Tithonia diversifolia (%) Ingrediente Testigo 1,77 5 10 15 Sorgo Pasta de soya Carbonato de Calcio Tithonia diversifolia Fosfato de calcio Sal Premezcla vit y min1 DL-Metionina 84% Aceite vegetal L-Lisina HCl Cloruro de colina 60% Pigmento amarillo2 Antioxidante3 Bambermicina Fitasa4 Total Análisis calculado Energía Met, kcal/kg Proteína cruda % Met + Cis total, % Lisina total, % Treonina total, % Triptófano total, % Fibra cruda, % Calcio total, % Fósforo disponible, % Sodio, % 1

660.500 221.390 101.791 0.000 4.568 3.026 2.400 2.289 1.482 1.179 0.500 0.500 0.150 0.125 0.100 1000

647.950 213.960 100.435 17.700 4.659 3.033 2.400 2.327 5.552 1.209 0.500 0.000 0.150 0.125 0.100 1000

621.800 202.402 98.000 50.000 4.553 3.046 2.400 2.401 13.277 1.246 0.500 0.000 0.150 0.125 0.100 1000

539.921 222.920 94.033 100.000 4.361 3.057 2.400 2.042 30.391 0.000 0.500 0.000 0.150 0.125 0.100 1000

456.946 242.914 90.112 150.000 4.183 3.068 2.400 1.704 47.798 0.000 0.500 0.000 0.150 0.125 0.100 1000

2800 17.400 0.730 0.860 0.622 0.205 2.446 4.100 0.420 0.180

2800 17.400 0.730 0.860 0.623 0.199 2.583 4.100 0.420 0.180

2800 17.400 0.730 0.860 0.625 0.189 2.831 4.100 0.420 0.180

2800 18.970 0.730 0.866 0.691 0.196 3.331 4.100 0.420 0.180

2800 20.480 0.730 0.967 0.754 0.201 3.824 4.100 0.420 0.180

Contenido por kilo: A. 4.0 MUI; D3. 666,666.7 UI; E. 10,000.0 UI; Rovimix HyD 5 kg: K 3. 1.67 g; B1. 0.83 g; B2. 2.33 g; B6. 1.17 g; B12. 6.666.67 mg; niacina. 10 g; ácido D-pantoténico. 3.33 g; ácido fólico. 0.33 g; biotina. 33.33 mg; colina. 100 g; Fe. 20 g; Zn. 26.67 g; Mg. 36.67 g; Cu. 5 g; I. 0.33 g; Se. 0.1 g. 2 Florafil 93 Powder (Vepinsa): 30 g/kg (mínimo) de xantofilas totales. 3 BHA 1.2 %. BHT 9.0 %. Etoxiquin 4.8 %. Agentes quelantes 10.0 %. 4 Quantum Blue 5000 FTU/kg derivada de E. coli.

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Cuadro 2: Dietas experimentales del segundo ensayo con harina de Tithonia diversifolia y pigmento rojo (kg) Harina de Tithonia diversifolia (%) Ingrediente Testigo 1.77 5 10 15 Sorgo 660.090 647.550 621.400 539.721 456.936 Pasta de soya 221.000 213.860 202.002 222.720 242.414 Carbonato de Calcio 101.791 100.435 98.000 94.033 90.112 Tithonia diversifolia 0.000 17.700 50.000 100.000 150.000 Fosfato de calcio 4.568 4.559 4.553 4.361 4.183 Sal 3.026 3.033 3.046 3.057 3.068 1 Premezcla vit y min 2.400 2.400 2.400 2.400 2.400 DL-Metionina 84% 2.289 2.327 2.401 2.042 1.704 Aceite vegetal 1.482 5.252 13.277 29.991 47.508 L-Lisina HCl 1.179 1.209 1.246 0.000 0.000 Cloruro de colina 60% 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 2 Pigmento rojo 0.800 0.800 0.800 0.800 0.800 3 Pigmento amarillo 0.500 0.000 0.000 0.000 0.000 4 Antioxidante 0.150 0.150 0.150 0.150 0.150 Bambermicina 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 5 Fitasa 0.100 0.100 0.100 0.100 0.100 Total 1000 1000 1000 1000 1000 Análisis calculado Energía Met, kcal/kg 2800 2800 2800 2800 2800 Proteína cruda % 17.400 17.400 17.400 18.970 20.480 Met + Cis total, % 0.730 0.730 0.730 0.730 0.730 Lisina total, % 0.860 0.860 0.860 0.866 0.967 Treonina total, % 0.622 0.623 0.625 0.691 0.754 Triptófano total, % 0.205 0.199 0.189 0.196 0.201 Fibra cruda, % 2.446 2.583 2.831 3.331 3.824 Calcio total, % 4.100 4.100 4.100 4.100 4.100 Fósforo disponible, % 0.420 0.420 0.420 0.420 0.420 Sodio, % 0.180 0.180 0.180 0.180 0.180 1

Contenido por kilo: A, 4,0 MUI; D3, 666,666.7 UI; E, 10,000.0 UI; Rovimix HyD 5 kg: K 3, 1.67 g; B1, 0.83 g; B2, 2.33 g; B6, 1.17 g; B12, 6,666.67 mg; Niacina, 10 g; ácido D-pantoténico, 3.33 g; ácido fólico, 0.3 g; biotina, 33.33 mg; colina, 100 g; Fe, 20 g; Zn, 26.67 g; Mg, 36.67 g; Cu, 5 g; I, 0.33 g; Se, 0.1 g. 2 Avired 5 g/kg (mínimo) de xantofilas de Capsicum annum. 3 Florafil 93 Powder (Vepinsa): 30 g/kg (mínimo) de xantofilas totales. 4 BHA 1.2 %, BHT 9.0 %, Etoxiquin 4,. %, Agentes quelantes 10,. %. 5 Quantum Blue 5000 FTU/kg derivada de E. coli.

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Durante las seis semanas de ensayo se llevĂł un registro semanal de las variables productivas porcentaje de postura, peso y masa de huevo, consumo de alimento y conversiĂłn alimentaria. Al final de las semanas 3 y 6 se colectaron 20 huevos por tratamiento y se midiĂł color de yema en un equipo automatizado marca TSS QCC Yolk Colour (Servicio TĂŠcnico y Suministros, Inc., Inglaterra, Reino Unido) con transformaciones a valores absolutos del abanico DSM, cuyos valores van de 1 (amarillos claro) hasta 15 (amarillo-anaranjado) y ocho huevos de cada ensayo para la cuantificaciĂłn de pigmentos por HPLC(10) para yema de huevo. AsĂ mismo se llevĂł a cabo una mediciĂłn por colorimetrĂa de refracciĂłn, aplicando una escala de definiciĂłn tridimensional en base al sistema CIE que detalla la luminosidad (L*), tonalidad amarilla (b*) y tonalidad rojiza (a*).

AnĂĄlisis estadĂstico Se utilizĂł un diseĂąo completamente al azar mediante el siguiente modelo(12): Yij = Âľ + Ti + ei(j) i = 1, 2, 3, 4 y 5

j = 1, 2, 3 y 4

Donde: Yij = Variable respuesta (porcentaje de postura, consumo de alimento/ave/dĂa (g), peso del huevo (g), masa de huevo ave/dĂa (g), conversiĂłn alimentaria (kg:kg), color de yema y cuantificaciĂłn de pigmentos); Âľ = Media general; Ti = Efecto de i-ĂŠsimo tratamiento; ei(j) = Error experimental. Las diferencias entre medias se analizaron con prueba de Tukey con nivel de significancia de 0.05 con el programa computacional SPSS, versiĂłn 21.0 para Windows. Se realizĂł una transformaciĂłn de las variables(12) de cuantificaciĂłn de pigmentos (carotenoides totales y luteĂna), para obtener homogeneidad de varianzas mediante las transformaciones Box-Cox: Carotenoides totales = LuteĂna =

(đ??śđ?&#x2018;&#x17D;đ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x203A;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018; đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x17D;đ?&#x2018;&#x2122;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018; đ?&#x2018;˘đ?&#x2018;&#x201D;â&#x2C6;&#x2019;0.04 )â&#x2C6;&#x2019;1 â&#x2C6;&#x2019;0.0001554438364

(đ??żđ?&#x2018;˘đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x2019;Ăđ?&#x2018;&#x203A;đ?&#x2018;&#x17D; đ?&#x2018;˘đ?&#x2018;&#x201D;â&#x2C6;&#x2019;0.đ?&#x2018;&#x153;4 )â&#x2C6;&#x2019;1 â&#x2C6;&#x2019;0.0002864746461

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Resultados Se observa en el Cuadro 3 que la mayor cantidad de pigmentos en HTD está representado por luteína (50.6 7%), menor para zeaxantina (0.65 %) y carotenoides totales de (0.92 %). En el Cuadro 4 se presentan los resultados promedio de 42 días de experimentación con la adición de HTD en diferentes niveles no observándose diferencia significativa (P>0.05) en peso de huevo y conversión alimenticia. En porcentaje de postura se observa que con la inclusión de 15% de HTD disminuyó (89.8 %) con respecto al testigo y los otros niveles de inclusión. El consumo de alimento ave/día disminuyó en 5 g promedio en la dieta con 15 % de HTD con relación a los demás tratamientos (P<0.05) y la masa de huevo fue menor en la inclusión de 15 % (52.5 g), con 10 % de HTD se encontró un punto medio (55.1 g) sin embargo los mejores resultados fueron para el testigo (56 g) y las inclusiones de 1.77 % (55.9 g) y 5 % (56.3 g) (P<0.05). Cuadro 3: Composición de pigmentos en harina de Tithonia diversifolia Base húmeda Base seca Pigmentos (g/kg) Carotenoides totales 0.85 0.92 Ésteres de carotenos 28.10 30.49 β-criptoxantina 5.90 6.40 Trans-luteína 46.70 50.67 Trans-zeaxantina 0.60 0.65 Trans-luteína Epoxi 1.80 1.95 Media de una n=3.

Cuadro 4: Variables productivas, color, pigmentos y valores colorimétricos en yema de huevo con inclusión de harina de Tithonia diversifolia Harina de Tithonia diversifolia (%) Testigo 1.77 5 10 15 EEM 1 Variables productivas Postura, % 94.8a 94.3a 94.8a 92.7ab 89.8b 0.52 Peso de huevo, g 59.1 59.2 59.4 59.5 58.5 0.24 a a a a b Consumo de alimento, 105 105 106 105 100 0.64 ave/ día/g Conversión 1.876 1.892 1.895 1.910 1.908 0.011 alimentaria, kg:kg

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Masa de huevo, 56.0a ave/día/g Color2 Color yema sin 9b pigmento rojo Color yema con 11a pigmento rojo Pigmentos (μg/100g)3

55.9a

56.3a

55.1ab

52.5b

0.44

10a

0.12

10b

11a

0.78

Carotenoides totales Luteína Zeaxantina Capsantina Valores colorimétricos2

235b 152b 16.5 5.5

142c 87c 9.75 5.25

269ab 173ab 13.25 5.25

367ab 245ab 13.0 6.5

440a 291a 11.75 5.5

31.66 21.06 0.92 0.49

L* a* b*

67.38ab -2.66bc 49.49ab

69.40a -4.29c 44.01c

66.02ab -2.71bc 47.47bc

65.21b -1..37b 49.28abc

64.30b 0.44a 5.53a

0.92 0.42 1.30

n=48 aves/tratamiento. n=20 huevos/tratamiento. 3 n=3 muestras/tratamiento. EEM= Error estándar de la media. abc Diferente letra en la misma fila muestra valores estadísticamente distintos (P<0.05). 2

Para el valor del color de yema (Abanico DSM), se observó que sin adición de pigmento rojo (Figura 1 A) fue menor para la dieta con 1.77 % de HTD (valor 8) y el más alto para 10 y 15 % (valor 10). Los datos para los huevos en donde se incluyó pigmento rojo en su dieta presentó la misma respuesta que sin pigmento rojo, observándose menor color para 1.77 % (valor 8) y las demás inclusiones incluyendo al testigo (valor 11) (P<0,05) (Figura 1 B). Los carotenoides totales en la inclusión de 1.77 % (142 μg/100 g) fue la de menor contenido y mayor para 15 % (440 μg), 10 % (367 μg) y 5 % (269 μg) con respecto al testigo (235 μg). De igual manera para los valores de luteína siendo menor para 1.77% (87 μg/100 g) y mayor para 15 % (291 μg) con respecto al testigo (P<0.05). No se presentaron diferencias para zeaxantina y capsantina.

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Figura 1: Yemas de huevos con inclusiones de harina de Tithonia diversifolia

B A= sin adición de pigmento rojo; B= con adición de pigmento rojo.

Discusión En general, los estudios relacionados entre forrajes y animales se han llevado a cabo principalmente en rumiantes para conformar lo que se conoce como agrosilvopastoreo, y a este respecto existe gran cantidad de literatura científica; sin embargo, no así en especies monogástricas, ya que su aparato digestivo no permite degradar altos porcentajes de fibra, pero sí se podría tener la posibilidad de utilizarlos como parte de su alimentación(13). Bajo este tenor existe poca literatura sobre la utilización de Tithonia diversifolia en aves vs rumiantes. De los resultados obtenidos en este trabajo, se observa que el porcentaje de postura, consumo de alimento y masa de huevo fue mejor para la inclusión de 5% de HTD siendo similar al testigo, sin embargo, la conversión alimentaria fue mejor para 10% de HTD. Estos datos coinciden con lo mencionado por Odunsi et al(8) que evaluaron harina de follaje de Tithonia diversifolia en gallinas ponedoras incluyendo en su formulación 5, 10, 15 y 20 % de esta harina y un control de alimento comercial, reportando que en la producción de huevo no tuvieron diferencias, el consumo de alimento fue menor para la dieta con 20 % de HTD (96.3 g/ave/día) en comparación con el testigo (107g/ave/día) y la conversión alimentaria fue mejor para la dieta con 15 % de HTD. Lo anterior se podría explicar que al incluir 20 % de HTD se afecta el aporte de nutrientes, principalmente de aminoácidos por las elevadas concentraciones de fibra y la presencia de factores antinutricionales, que como lo mencionan otros investigadores)(14,15), uno de estos factores son los taninos, que aparte de influir en la 364

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palatabilidad del alimento (sabores amargos) estos llegan a formar complejos con proteínas, almidón y enzimas digestivas, reducen el valor nutritivo de los alimentos, influyendo en crecimiento, digestibilidad y disponibilidad de proteínas y aminoácidos. Sin embargo, Yalcin et al(16) mencionan que al incluir 2 % de harina de hojas de Tithonia diversifolia en dietas para gallinas es suficiente para obtener mejor masa de huevo y conversión alimenticia. En cuanto a los resultados de la pigmentación de yema de huevo, se conoce que las aves no sintetizan los pigmentos que darán coloración a la yema de huevo o piel; estos deben ser incluidos en la formulación de las dietas. A este respecto los datos obtenidos de la cantidad de pigmentos presentes en la HTD darán la pauta para proponerla como fuente de xantofilas y así mejorar la coloración de yema de huevo. Las fuentes de carotenos utilizadas como pigmento para este mismo propósito son: harina de hojas de alfalfa (396 mg/kg), maíz amarillo (22 mg/kg), harina de trébol ladino deshidratado (490 mg/kg), harina de chile (187 mg/kg) y Tagetes erecta (flor de cempasúchil) (8,000 a 10,000 mg/kg), siendo esta flor la que mayor cantidad de xantofilas presenta (80 a 90 % de luteína). Estas xantofilas se incorporan a la sangre depositándose en piel, tejido graso, hígado y yema de huevo de gallinas ponedoras y los carotenos en menor cantidad siendo estos transformados en vitamina A(17). Odunsi et al(8) en su estudio en gallinas ponedoras incluyeron 5, 10, 15 y 20 % de HTD y concluyen que estos porcentajes como única fuente de pigmento amarillo (luteína y zeaxantina) sí pigmentaron la yema de huevo. En esta investigación cuando se adicionó pigmento rojo a la formulación del alimento, la dieta testigo y con 5, 10 y 15 % de HTD fueron más pigmentados y ligeramente menor para 1.77%, valores mayores que las yemas sin pigmento rojo. Esto posiblemente se debió a la combinación de colores amarillo y rojo, con lo que se obtuvo un color anaranjado. Sin embargo, debido a que conforme se aumentó la inclusión de HTD, se incrementó la cantidad de pigmento amarillo y el color rojo que se adicionó en la misma cantidad, ocasionó que el color alcanzado fuera el mismo debido a la dilución del pigmento rojo en distintas cantidades con respecto al amarillo, es por eso que la inclusión del 1.77 % fue menor. Las dos dietas con 1.77% de HTD tuvieron los valores más bajos, ya que se formuló con base en el cálculo de carotenoides totales para ajustarla a 15 ppm, la misma proporción que la dieta testigo, considerando en su totalidad como pigmento a los carotenoides totales. Por lo tanto, los resultados del contenido de pigmento en las yemas de huevo fueron directamente proporcionales conforme se aumentó la inclusión de HTD, observándose aumento de luteína que corresponde aproximadamente al 50 % de los carotenoides totales. Finalmente, los valores de colorimetría en la yema de huevo, el amarillamiento (b*) fue mayor en testigo y 15 % de HTD, confirmando la presencia de luteína principalmente en esta HTD.

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Finalmente, cabe mencionar que la diferencia de resultados reportados en esta investigación y lo reportado por otros autores, puede deberse a las condiciones de estudios de cada trabajo (edad y parte de la planta utilizada, condición de ensayo con aves, así como clima, temperatura, etc.).

Conclusiones e implicaciones Se concluye que la harina de hojas con peciolos de Tithonia diversifolia puede considerarse como una alternativa para la alimentación de las aves hasta un nivel de 10 % de inclusión sin afectar los parámetros productivos y aportando pigmentación a la yema de huevo. Así mismo se recomienda utilizar combinación con pigmento rojo natural (cantaxantina), el cual al combinarse con el pigmento amarillo aportado por la harina de Tithonia diversifolia se obtendrán yemas de huevo más anaranjadas.

Agradecimientos y conflicto de intereses Al CONACyT, al Sistema Nacional de Becas y a la Dirección General de Estudios de Posgrado de la Universidad Nacional Autónoma de México por el apoyo económico para la realización de este trabajo que formó parte de la tesis de grado Maestra en Ciencias de Vilma Barrita Ramírez. Así mismo al Ing. Gustavo Rodríguez y el Dr. Manuel Quiróz de Empresas VEPINSA S.A. de C.V., por su apoyo en los análisis de laboratorio. Por la presente confirmamos que este manuscrito no tiene ningún tipo de conflicto de intereses. Los autores corroboran la declaración anterior y aprueban el manuscrito final.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.4843 Artículo

Efecto de un complejo multienzimático y un probiótico en gallinas de postura alimentadas con dietas sorgo-soya-canola

Pedro Juárez Morales a Arturo Cortes Cuevas a* José Arce Menocal b Juan Carlos Del Río García c Gabriela Gómez Verduzco a Ernesto Avila González a

Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Avícola. Manuel M. López s/n Col. Zapotitlán, 13209, Tláhuac, Ciudad de México, México. b

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Morelia, Michoacán, México. c

Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán. Estado de México, México.

*Autor de correspondencia: cortesca68@gmail.com

Resumen: Se realizó un estudio con la finalidad de evaluar los parámetros productivos, concentraciones de IgA secretora intestinal, colesterol, LDL, HDL en suero, de gallinas de postura alimentadas con dietas sorgo + soya + canola con menor contenido de nutrientes adicionadas con un complejo multienzimático (proteasas, amilasas y xilanasas) y un probiótico (Bacillus subtilis). Se emplearon 180 gallinas Bovans White de 42 a 54 semanas de edad distribuidas en un diseño completamente al azar, con 3 tratamientos: 1) dieta testigo, 2) dieta reducida en energía metabolizable (50 kcal/kg y 2% de proteína y

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aminoácidos metionina y lisina) + enzimas, 3) dieta 2 + probiótico. Para los resultados de rendimiento productivo existió diferencia (P<0.05) en el peso de huevo con menor peso el tratamiento 2, pero con la adición de enzimas y probióticos, se incrementó. Para las variables inmunidad humoral, colesterol, LDL y HDL, no se observó diferencia estadística (P>0.05) entre tratamientos. Se puede concluir que la inclusión de enzimas y probiótico permitió reducir nutrientes (EM, proteína y aminoácidos lisina y metionina) con resultados similares en parámetros productivos respecto a la dieta testigo, y sin cambios en inmunidad intestinal, niveles de colesterol, lipoproteínas de alta y baja densidad en gallinas Bovans White. Palabras clave: Enzimas, Bacillus subtilis, Gallina de postura, Inmunidad, Colesterol.

Recibido: 05/04/2018 Aceptado: 26/06/2019

Introducción El empleo de enzimas exógenas en dietas para aves, se ha incrementado en la última década con el fin de incrementar la digestibilidad de la energía y la proteína(1,2). Los polisacáridos no amiláceos (PNA) son los componentes mayores de la fibra en los ingredientes tradicionales; estudios previos indican que el sorgo contiene alrededor de 6.5 % y la pasta de soya 3.3 % de estos polisacáridos(3). Los granos de cereales consisten en arabinoxilanos y glucanos; para la soya y canola en arabinos, arabinogalactanos, galactanos, mananos y pectinas(4,5). Los PNA de las paredes celulares, tales como los arabinoxilananos solubles e insolubles se degradan por las xilanasas, liberando nutrientes encapsulados dentro de la pared celular y con mejora en el acceso a las enzimas endógenas(6,7). Las enzimas son ampliamente utilizadas para degradar los PNA en la industria de los alimentos, son xilanasas y β-glucanasas(8) y reducen la pérdida de aminoácidos endógenos(9). Los productos con actividad multienzimática, han demostrado que la combinación de xilanasas, amilasas y proteasas mejoran la digestibilidad en dietas para aves(10,11,12). Amerah et al(9) informaron que el empleo de proteasas, amilasas y xilanasas en dietas maízpasta de soya mejoraron la digestibilidad ileal de proteína, energía y retención de nitrógeno en pollos de engorda, lo que se tradujo en un mayor rendimiento productivo. La inclusión en la dieta de las aves con bacterias benéficas como las del género Bacillus, es una alternativa al empleo de antibióticos promotores del crecimiento(13,14,15). 370

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Estudios recientes de un producto comercial basado en tres cepas de Bacillus, ha mostrado efectos positivos en dietas maíz-soya(16). Dado que enzimas exógenas y probióticos se incluyen en la dietas comerciales para aves, hay poca información de la interacción entre enzimas exógenas y probióticos; a las enzimas se les atribuye un efecto probiótico en el intestino del pollo(12,17). Además modulan la respuesta inmune y suprimen las reacciones inmunes inflamatorias en las paredes intestinales(18). Por otra parte, se ha informado que la adición de probióticos en gallinas ponedoras, mejoran la conversión alimenticia, calidad del huevo (disminución del nivel de colesterol en yema, incremento en el grosor de cascarón y peso del huevo), y disminución de las concentraciones de colesterol en sangre(19). El objeto de este estudio fue estudiar, el efecto de la inclusión solo o en combinación de un complejo multienzimático (xilanasas, proteasas y amilasas) y un probiótico (Bacillus subtilis) en dietas sorgo-soya-canola con menor contenido de energía y proteína para gallinas Bovans White, sobre los parámetros productivos, producción de IgA secretora intestinal y contenido de colesterol, LDL, HDL en suero.

Material y métodos El experimento se realizó en las instalaciones del Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Avícola (CEIEPAv) de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Se utilizaron 180 gallinas Bovans White de 42 semanas de edad, las cuales se distribuyeron en un diseño completamente al azar con tres tratamientos con 5 réplicas de 12 gallinas cada una, los cuales se distribuyeron de la siguiente manera: 1) dieta testigo, 2) dieta reducida en energía metabolizable (50 kcal/kg), así como en proteína y aminoácidos limitantes metionina y lisina (2% de lo empleado en la dieta testigo) + enzimas y 3) dieta 2 + enzimas + probiótico. Las dietas utilizadas muestran en el Cuadro 1. La dieta testigo positivo cumpliendo las recomendaciones de la estirpe Bovans White para la etapa productiva y otra dieta testigo reducida en energía metabolizable (EM), proteína y aminoácidos esenciales. Se nota que la reducción de dichos nutrientes disminuyó considerablemente la cantidad de pasta de soya y aceite vegetal en la dieta. Ambas dietas fueron tipo comercial e incluyeron fitasa. Se adicionaron dos productos comerciales a las dietas reducidas en nutrientes; un complejo enzimático (Axtra XAPR 101 TPT, Dupont, Animal Nutrition), a razón de 250 g/t de alimento, que contiene xilanasas (20,000 u/g derivados de Trichoderma longibrachiatum), proteasas (40,000 u/g derivados de Bacillus subtilis) y amilasas (2,000 u/g derivados de 371

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Bacillus licheniformis) y un probiótico que contiene tres cepas de B. subtilis (Enviva PRO 201 GTR, Dupont, Animal Nutrition 3E+08 ufc/g) a razón de 250 g/t de alimento. Cuadro 1: Composición y análisis calculados de dietas basales sorgo-pasta de soya-pasta de canola, en gallinas de postura de 42 a 54 semanas de edad, adicionadas con un complejo multienzimático y un probiótico Ingredientes

Testigo + (kg)

Sorgo Pasta de soya Canola Aceite vegetal Ortofosfato de calcio Carbonato de calcio Sal DL-Metionina 99% L-lisina HCl 78% Vitaminas y minerales * Bacitracina MD 10% Cloruro de colina 60% Pigmento rojo chile ** Larvicida Antioxidante BHT Apo-ester 10% Fitasa Total

653.780 148.520 58.160 13.720 9.190 105.530 4.320 1.340 0.470 2.400 0.500 0.500 0.800 0.500 0.150 0.050 0.045 1000

Energía metabolizable, kcal/kg Proteína cruda, % Lisina total, % Met+Cist total, % Calcio total, % Fósforo disponible, % Sodio, %

2800 15.79 0.73 0.67 4.25 0.46 0.18

Testigo – (kg)

675.850 136.950 58.160 3.000 9.200 105.560 4.320 1.310 0.670 2.400 0.500 0.500 0.800 0.500 0.150 0.050 0.045 1000 Análisis calculado 2750 15.41*** 0.71*** 0.66*** 4.25 0.46 0.18

* Vit A, 3000 000 UI; Vit D3,750 000 UI; Vit E, 6 000 UI; Vit K3, 1.0 g; niacina, 25 g; biotina, 0.063 g; cloruro de colina, 250 g; selenio, 0.2 g; cobalto, 0.1 g; yodo, 0.3 g; cobre, 10 g; zinc, 50 g; hierro, 100 g; manganeso, 100 g; vehículo c.b.p 1,000.00 g. **Pigmento rojo vegetal (avired en polvo) colorante de origen vegetal 5 g/kg, Capsicum. ***Reducción del 2 % respecto a lo contenido en la dieta testigo.

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Las aves se alojaron en una caseta de ambiente natural, en jaulas de tres gallinas cada una, por un periodo de 12 semanas. Se les proporcionó luz artificial y luz natural para un total de 16 h diarias. Se les alimentó con las dietas experimentales sorgo-soya-canola en forma de harina, a razón de 105 g/ave/día. La administración de agua fue a libertad. Semanalmente, durante las 12 semanas del estudio, se registraron y resumieron los datos de producción; peso del huevo, consumo de alimento por ave/día e índice de conversión. Al final del estudio, se utilizaron 20 huevos por tratamiento, a los cuales se les determinó el grosor de cascarón sin las membranas internas con un micrómetro manual, las unidades Haugh y color de yema; utilizando el sistema automatizado QCM+ de la empresa Technical Services y Supplies Inc (TSS). Para evaluar la respuesta de anticuerpos en intestino, al final de la prueba, se seleccionaron cinco gallinas por tratamiento y se procesaron en el rastro de acuerdo a lo establecido en la Norma Oficial Mexicana, NOM-033-ZOO-1995 Sacrificio humanitario de los Animales Domésticos y Silvestres. Se obtuvieron 10 cm de íleon, para posteriormente realizar lavados con 10 ml de solución salina isotónica SSI fría y estéril, pasando tres veces la SSI a través del lumen intestinal, la solución se recolectó y se congeló a -20 °C, hasta su posterior evaluación con la prueba de ELISA siguiendo el procedimiento descrito previamente por Gómez(20). A las 54 semanas de edad, se tomaron también muestras de sangre de 30 gallinas (10 gallinas por tratamiento), cada muestra se centrifugó a 3,000 rpm/10 min, posteriormente se obtuvo el suero, para determinar los niveles de colesterol sérico, LDL y HDL, en el Departamento de Patología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia UNAM. Los resultados obtenidos se transformaron de mmol/dl a mg/dl mediante el factor de conversión 0.0259. En variables de producción, colesterol en yema de huevo, colesterol sérico, LDL y HDL en suero, se analizaron mediante un diseño completamente al azar, por medio del paquete estadístico IBM SPSS Statistics v. 19(21), utilizando el análisis de varianza conforme a un diseño completamente al azar y las diferencias entre tratamientos, se compararon por medio de la prueba de Tukey.

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Resultados En el Cuadro 2, se muestran los datos obtenidos en 84 días de experimentación. Se puede apreciar que los resultados obtenidos para porcentaje de postura, consumo de alimento y conversión alimenticia fueron similares (P>0.05) entre tratamientos. Sin embargo; para el peso del huevo, se puede observar que este fue mayor (P<0.05) en las aves alimentadas con la dieta testigo (T1) y la dieta reducida con enzimas + probiótico (T3). Cuadro 2: Variables productivas de gallinas Bovans de 42-54 semanas de edad alimentadas con dietas sorgo-soya-canola Postura Peso de Consumo/ave/ Conversión Dietas (%) huevo (g) día (g) alimenticia (g/g) 1) Dieta testigo 92.2±1.9 60.0±0.4a 104±0.5 1.88±0.04 2) Dieta reducida + enzimas 92.8±1.7 58.9±0.7b 104±0.8 1.90±0.03 3) Dieta 2 + probiótico 91.5±1.7 59.2±0.4ab 104±0.8 1.91±0.03 a,b

Valores ± error estándar. Valores con distinta literales son diferentes (P<0.05).

En el Cuadro 3, se muestran datos obtenidos durante el experimento en la calidad del huevo. Los resultados de las Unidades Haugh, grosor del cascarón y color de la yema de huevo en base al abanico DSM, resultaron similares (P>0.05) entre tratamientos. Cuadro 3: Variables en la calidad de huevo de las gallinas de postura de 42 semanas de edad, alimentadas con dietas sorgo-pasta de soya-pasta de canola Dietas Grosor cascarón Unidades Color de la yema (µm) Haugh (abanico DSM) 1) Dieta testigo 337±7.7 90.8±2.8 9.4±2.8 2) Dieta reducida + Enzimas 352±7.2 92.2±2.5 9.2±0.4 3) Dieta 2 + Probiótico 347±9.2 91.2±1.8 9.4±0.5 Valores ± error estándar. (P>0.05).

En el Cuadro 4, se muestran los resultados promedio de los análisis de colesterol sérico, LDL, HDL y producción de IgA secretora en intestino. Se puede apreciar que no existió diferencia estadística (P>0.05) entre los tratamientos.

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Cuadro 4: Cambios ocurridos en el contenido de colesterol sérico, LDH, HDL y IgA secretora en gallinas Bovans con dietas sorgo-pasta de soya-pasta de canola de 42-54 semanas de edad Dietas Colesterol LDL HDL IgA secretora (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (%) 1) Dieta testigo 100.2±26.2 13.9±10.8 30.0±2.5 40.9±30.4 2) Dieta reducida+ enzimas 109.7±15.7 17.3±2.3 37.0±5.2 68.7±34.0 3) Dieta 2 + probiótico 122.9±21.1 16.2±0.9 35.7±5.0 63.0±27.9 Valores ± error estándar. (P>0.05).

Discusión Los resultados observados en el presente trabajo, coinciden con los de Wena et al(22) quienes evaluaron un cóctel enzimático en dietas maíz-soya con menor contenido de nutrientes, y encontraron que se mejoró el valor alimenticio del alimento; por esta razón son utilizados en la industria de los alimentos para reducir los costos de formulación sin afectar el comportamiento productivo(8); como lo realizado en este estudio, en donde las dietas reducidas en nutrientes bajo las recomendaciones nutricionales de la estirpe Bovans White, tuvieron menor contenido de pasta de soya y aceite. Sobczak y Kozlowski(23) evaluaron el efecto de adicionar Bacillus subtilis sobre la producción de huevo sin cambios significativos en el peso del huevo, porcentaje de postura, consumo de alimento y conversión alimenticia. Otros estudios también demuestran que el empleo de probióticos en dietas para gallinas, no tuvieron ninguna influencia sobre el rendimiento productivo(24). Se observó mayor peso del huevo en las dietas sin reducción de nutrientes, lo que sugiere probablemente que la reducción de 50 kcal de EM en dietas sorgo-soya-canola+enzimas, no aportó la suficiente cantidad de EM por el complejo multienzimático. Sin embargo, la adición de enzimas y el probiótico incrementó el peso del huevo; probablemente debido a que los Bacillus subtilis del producto empleado, promovieron un microbioma más favorable y una mejor salud intestinal. Lo anterior estaría en parte de acuerdo a lo informado por Amerah et al(9) que demostraron que las enzimas amilasas, xilanasas y proteasas solas o en combinación, incrementaron la digestibilidad de los polisacáridos no amiláceos contenidos en los ingredientes. No así, en otro trabajo(16) donde estudiaron en pollos de engorda y emplearon fitasas solas o en combinación con xilanasas, amilasas, proteasas y un probiótico a base de Bacillus amyloliqueciens, sin efecto positivo en el rendimiento productivo. Sin embargo, la combinación incrementó la digestibilidad ileal

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aparente de azúcares y grasa con aumento en EM, además de reducir las poblaciones bacterianas patógenas. Se ha estudiado(25), la inclusión de carbohidrasas y proteasas en dietas maíz-soya-pasta de canola, las cuales incrementaron la ganancia de peso y la conversión alimenticia, además de mejorar la digestibilidad de proteína y la energía metabolizable; los resultados no coinciden con los obtenidos en el presente estudio, ya que no se mejoraron dichos parámetros productivos. En cuanto a los datos obtenidos en concentración de colesterol, HDL y LDH, no mostraron diferencia en este estudio; sin embargo, Salma et al(26) emplearon un probiótico a diferentes concentraciones a base de Rhodobacter capsulatus en dietas maízsoya para gallinas, y reportaron que las dietas con la mayor concentración del probiótico, presentaron un aumento en las lipoproteínas de alta densidad HDL, colesterol e índice aterogénico en el suero. Recientemente, se ha reportado(3) que la inclusión de 0, 250, 450 y 900 U/kg de xilanasas derivadas de la fermentación de Bacillus subtilis en dietas maíztrigo-pasta de soya para gallinas Hy-Line Brown, no mejoraron los parámetros productivos, sin embargo hubo efecto en el grosor del cascarón y las unidades Haugh; información que no concuerda con la del presente estudio.

Conclusiones e implicaciones El empleo del complejo multienzimático compuesto de amilasas, proteasas y xilanasas y el probiótico a base de esporas de Bacillus subtilis incluido en dietas sorgo-soya-canola con las recomendaciones nutricionales de la estirpe Bovans White, permite reducir la EM en 50 Kcal/kg y la proteína y aminoácidos esenciales lisina y metionina en 2%, sin efecto perjudicial en el rendimiento productivo en gallinas Bovans White de 42 a 54 semanas de edad. No existieron cambios en los valores de IgA secretora intestinal ni de colesterol, HDL y LDH en suero al suplementar el complejo enzimático y el probiótico a base de Bacillus subtilis.

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Tendencias genéticas y fenotípicas para pico productivo, rendimiento lechero y persistencia de lactación en la raza Murciano-Granadina

Judith Carmen Miranda Alejo a,b José Manuel León Jurado b,e Camillo Pieramati c Mayra Mercedes Gómez Carpio b* Jesús Valdés Hernández d Cecilio José Barba Capote a

Universidad de Córdoba. Departamento de Producción Animal, Campus de Rabanales. Edif. de Producción Animal, Córdoba 14071, España. b

Universidad de Córdoba. Departamento de Genética. Campus de Rabanales. Córdoba, España. c

Università Degli Studi di Perugia. Dipartimento di Medicina Veterinaria. Perugia, Italy.

Universidad Autónoma de Barcelona. Departamento de Ciencia Animal y de los Alimentos. Centre for Research in Agricultural Genomics, Barcelona, España e

Delegación de Agricultura y Medio Ambiente. Centro Agropecuario Provincial. Diputación de Córdoba, Córdoba. España

* Autor de correspondencia: mayragomezcarpio@gmail.com

Resumen: El objetivo fue evaluar las tendencias genéticas (TG) y fenotípicas (TF) para los caracteres de pico productivo (PP), rendimiento lechero (RL) y persistencia de la lactación (P) en la curva de lactación de la raza Murciano-Granadina (MG). Para ello se utilizaron 180,872 lactaciones, de 85,404 cabras (registros históricos de 1990-2012). Para la obtención de los caracteres de interés (PP, RL y P) se realizó la biomodelación de curvas de lactación mediante el modelo Spline usando el software “R”. Los valores 380

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genéticos (VG) se obtuvieron mediante modelo animal univariado con observaciones repetidas, empleándose el paquete MTDFREML. Las TG y TF se estimaron vía mínimos cuadrados en una regresión del promedio de los VG e información productiva conocida según el año de nacimiento. En el cálculo de las TG y TF se obtuvieron coeficientes de regresión lineal (b), donde los valores b para PP, RL y P fueron de +0.00071, +0.00698; +0.00114, +0.01117 y +0.00002, -0.00076; respectivamente. El trayecto de TG, TF de PP y RL se comportó de la misma manera siguiendo una línea de tendencia ascendente con presencia de intervalos de crecimiento y decrecimiento. La TG de P mostró un comportamiento estacional y la TF fue descendente con puntos más consistentes en su recorrido; reforzando la idea de que altas producciones van en detrimento de la P. Estos resultados permiten informar a los criadores del comportamiento de estos caracteres y considerar la incorporación de la persistencia de la lactación como criterio de selección en el programa genético de la raza. Palabras clave: Programa de cría, Cabra, Leche, Valores genéticos.

Recibido: 19/11/2018 Aceptado: 19/03/2019

Introducción La especie caprina tiene una gran relevancia mundial, especialmente en los países en vías de desarrollo, donde son criados con criterios de multifuncionalidad(1). Sin embargo, las razas caprinas lecheras tienen un interés especial para la ganadería meridional europea, y aunque cuentan con censos reducidos respecto al efectivo total mundial; en Francia y España se han conseguido aumentos considerables de los rendimientos y períodos de lactancia más prolongados. Esta eficiencia productiva responde a las necesidades de proveer gran cantidad de leche a la industria de quesos de cabra de alta calidad, vinculada a las tradiciones culturales de gran arraigo en algunos países europeos, que siguen ofreciendo una perspectiva optimista para el sector caprino(2). La raza Murciano-Granadina (MG) forma parte de ese selecto grupo de razas caprinas lecheras especializadas, constituyéndose en una de las principales razas autóctonas lecheras de España, tanto en censo (104,000 hembras reproductoras inscritas en el libro genealógico) como en producciones (584.4 kg leche por lactación)(3). Esta información posiciona a la MG en primer orden, junto a las razas Florida y Malagueña, por su elevado potencial productivo respecto a otras razas autóctonas españolas como la cabra del Guadarrama, Majorera, Palmera, Payoya y Tinerfeña. La raza MG fue reconocida oficialmente en los años 70 del pasado siglo y desde entonces, se tiene referencias sobre el Esquema de Valoración Genético-Funcional de Machos Reproductores (Resolución de 28 de marzo de 1979 de la Dirección General de la 381

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Producción Agraria(4)). Hasta la fecha, se ha logrado obtener una robusta base de datos del registro genealógico y funcional de estos animales, lo que ha permitido desde entonces la evaluación genética de los reproductores. El actual programa de selección de las cabras MG está consolidado tras 29 años de selección haciendo énfasis en medidas como: producción de leche, grasa, proteína y rendimiento del extracto seco. Para esta instancia, las estimas de las tendencias genéticas (TG) son importantes para testear la eficacia de los esquemas de mejoramiento aplicados, y para proporcionar a los mejoradores información para desarrollar programas de selección más eficientes(5). También, las evaluaciones de TG y tendencias fenotípicas (TF) ayudan principalmente a entender y transmitir el efecto que tiene la selección respecto a las generaciones anteriores(6,7), así como contrastar los resultados obtenidos en función del esquema propuesto, de forma tal que nos permita corregir cualquier desviación de lo esperado. En estudios de referencia en especies lecheras, los investigadores se han centrado, de manera general, en TG y TF para rasgos de rendimientos lecheros (RL) y composición; sin embargo, no se ha reportado el comportamiento genético de otros caracteres relacionados con la curva de lactación (8). Asimismo, este es el primer estudio en cabras MG sobre TG de parámetros de la curva de lactación, en particular sobre el pico productivo (PP) y la persistencia (P). Este estudio se realiza con el fin de justificar la consolidación de estos caracteres para ser incluidos como criterios de selección en el programa de cría de la raza. Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar las TG y TF para los caracteres de PP, RL y P en la raza MurcianoGranadina (MG).

Material y métodos Datos y procedimientos de edición La información genealógica y funcional utilizada en el presente estudio pertenece a los archivos históricos del programa oficial de mejora de la raza caprina MG. La base de datos original contenía 180,872 lactaciones estandarizadas a 210 días de duración (método A4 del ICAR(9)), de 85,404 cabras pertenecientes a 229 ganaderías, cubriendo los años de nacimiento desde 1990 a 2012. Durante el análisis exploratorio, la base de datos fue editada y estandarizada para eliminar los datos considerados anómalos: datos repetidos, lactancias con menos de seis controles, rendimientos diarios que sobrepasen los 10 kg de leche o que estén por debajo de 0.2 kg y valores nulos; estando acorde a la normalización realizada por el programa de mejora de la raza MG.

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Análisis genético y modelos estadísticos Para la obtención de los caracteres PP, RL y P, se realizó la biomodelización de las curvas de lactación individualizadas por animal, usando el modelo Spline por su mejor R2, flexibilidad y bondades de ajuste para la raza(10). A su vez, para la resolución del modelo se utilizó el software estadístico “R“ versión 3.2.3(11). Particularmente, los valores de P de la lactancia son expresados como medidas adimensionales(12). Los valores individuales de los caracteres de la curva de lactación (PP, RL y P) se analizaron con un modelo animal con observaciones repetidas y la opción univariante (uni-carácter). El modelo uni-carácter usado se presenta en notación matricial(13). y = Xb + Zaa + Zpp + e Donde: y= es el vector de información fenotípica de los caracteres analizados PP, RL y P; b= vector de los efectos fijos (grupo de contemporáneas del rebaño-año-estación (RAEunificado), número lactación, tipo parto y edad (covariable)); a= vector del efecto aleatorio aditivo del animal; p= vector del efecto ambiental permanente; e= es el vector de efectos residuales para los caracteres analizados; X, Za y Zp: son las matrices de incidencia (conocidas) de los efectos fijos (X) y efectos aleatorios (Za y Zp), respectivamente. Los componentes de la varianza para todos los efectos aleatorios fueron estimados utilizando el programa Múltiple Trait Derivate Free Restricted MaximunLikelihood (MTDFREML)(14) y ajustando el modelo animal univariado (descrito previamente). Para testar las estimaciones lógicas, se utilizó un criterio de convergencia de Var [-2log(L)] < 1x10-9 (donde L representa la función de verosimilitud). Los valores genéticos (VG) de los animales para los caracteres de interés se estimaron mediante la metodología del mejor predictor lineal insesgado (BLUP)(15). Para la estimación de TG y TF, los VG estimados se ajustaron en un modelo de efectos fijos con el año de nacimiento como único efecto fijo. Alternativamente, también se estimaron las tendencias ambientales (TA) para los caracteres de interés. Para el cálculo de estas tendencias se realizaron predicciones mediante los coeficientes de regresión lineal (b) del promedio de los VG, expresados por año de nacimiento y de la información productiva conocida con respecto al año en cuestión. Estos procedimientos se llevaron a cabo utilizando el paquete estadístico R(11).

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Resultados Los estadísticos descriptivos para los caracteres analizados en este estudio revelaron una media y desviación típica de 1.05 ± 0.32 y 1.21 ± 0.35 kg de leche para RL y PP, respectivamente, así como de 1.03 ± 0.35 para P. Las TG y TF respecto al año de nacimiento para los caracteres analizados se muestran en las Figuras 1 a 6 con su respectivo coeficiente de regresión lineal (b). Estos resultados sugieren variaciones dinámicas para la población de cabras MG, detectándose un punto de rebote estacionario en 1999 coincidiendo con el inicio del esquema de selección moderno, basado en evaluaciones BLUP. Subsecuentemente, las oscilaciones alrededor del eje x para estos tres caracteres, revelan congruentemente que, en un período de 22 años, los caracteres de PP y RL presentaron un comportamiento de tendencia ascendente y magnitud similar; mientras que el carácter de P se mostró de estacionario a decreciente.

Figura 1: Tendencia genética pico productivo

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Figura 2: Tendencia genĂŠtica rendimiento

Figura 3: Tendencia genĂŠtica persistencia

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Figura 4: Tendencia fenotĂpica pico

Figura 5: Tendencia fenotĂpica rendimiento

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Figura 6: Tendencia fenotípica persistencia

Las TG para PP y RL a lo largo de los años analizados (1990 a 2012) mostraron un comportamiento irregular con presencia de intervalos de crecimiento y decrecimiento (Figuras 1 y 2), pero siguiendo una línea de tendencia ascendente con coincidencias en sus picos en los años 1992, 1996, 2004 y 2009. Para estos mismos caracteres, en las TF (Figuras 4 y 5), se muestran líneas de tendencia ascendente, también con fluctuaciones de los intervalos de ascenso/descenso regulares y consistentes (picos prominentes coincidentes en los años 1992 y 1998). La TG para el carácter P muestra un comportamiento irregular con presencia de intervalos de crecimiento, decrecimiento y picos prominentes en los años 1993, 1995, 2005, 2010 y 2012, a diferencia del comportamiento de los otros caracteres que muestran una línea de tendencia estacionaria (Figura 3). En particular, se observó una TG positiva PP y RL, así como desviaciones irregulares de la linealidad (Figura 1 y 2). El incremento para estos caracteres fue significativo (P<0.05) con un b de 0.00071 kg/año y de 0.00114 kg/año para PP y RL, respectivamente. De forma similar, la estima de TG para la P también fue positiva presentando picos prominentes (1993, 1995, 2005, 2010 y 2012) y declives notorios (1992, 1998, 2006 a 2009), mostrando fluctuaciones irregulares entre sí con un incremento no significativo (P>0.05) y b con valor 0.0000219 unidades/año con una línea de tendencia estacional (Figura 3). La dirección de TF para PP y RL, si bien muestra una línea de tendencia ascendente, también las fluctuaciones de los intervalos de ascenso/descenso se muestran regulares y consistentes por la proximidad entre puntos (picos prominentes coincidentes se dan en los años 1992 y 1998) y línea de tendencia (Figuras 4 y 5). Por otra parte, TF de P (Figura 6) fue descendente donde las fluctuaciones de los intervalos de ascenso y descenso se

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muestran regulares, consistentes en el tiempo con presencia de picos en los años 1991, 1993, 2002 y 2012. Consecuentemente, las TF fueron positivas para el PP y RL presentando un incremento significativo (P<0.05) en el promedio de las TF para estos caracteres, donde se estimó b con valor 0.0069821 kg/año y de 0.0111697 kg/año, respectivamente (Figuras 4 y 5). No obstante, aunque la estima de TF para P fue negativa observándose fluctuaciones regulares con una disminución significativa (P<0.05) y b con valor de -0.0007629 unidades/año (Figura 6); se aprecia también un ligero incremento en esta tendencia desde el año 2009, mismo que se estabiliza durante el 2010 mostrando un ascenso desde el año 2011. El análisis de TA para P indica una influencia negativa, aunque no significativa (P>0.05con b de -0.00000293 unidades/año).

Discusión Las estimaciones de las TG sirven para monitorizar y evaluar la eficiencia de los programas de selección(16). La evaluación de la TG de caracteres lácteos da una indicación de la dirección del vector de selección de la raza, así como de la tasa de mejora genética debida a la aplicación del programa de mejoramiento(17). A su vez, es importante para proveer a los mejoradores de información para desarrollar programas de selección más eficaces(5). En este estudio, las estimaciones directas de la TG indicaron que hubo una mejora genética significativa y positiva en todos los rasgos estudiados a excepción del carácter de P, indicando que la selección fue efectiva, tanto en el periodo que se basó en la selección masal (1990-1999), como cuando lo fue con información familiar (1999-2012). Por tanto, esta información pudiera ser útil respecto a la evaluación de esfuerzos previos para mejorar y preservar el potencial genético de esos caracteres, así como para determinar las próximas estrategias y el trabajo futuro en la población de cabras MG. Una importante consideración es que este es el primer estudio donde son evaluados en conjunto los caracteres de PP, RL y P, siendo el RL un carácter objeto de selección para la raza de forma rutinaria; mientras que el PP y P son caracteres candidatos para su posible inclusión en el esquema de selección. Los resultados indican que, en los 22 años analizados los caracteres de PP y RL presentaron un comportamiento similar y de tendencia ascendente; mientras que el carácter de P se mostró de estacionario a decreciente, reforzando el planteamiento de que altas producciones van en detrimento de la P. Los resultados de la presente investigación sugieren globalmente que, tanto las TG como TF, para los tres caracteres (PP, RL y P), indicaron un comportamiento irregular, teniendo intervalos de crecimiento y decrecimiento fluctuantes más notorios en los años previos a 1999, justificado porque la selección que se ejercía hasta ese año se basaba en los fenotipos de los animales (selección masal). Sin embargo, es a partir de 1999 cuando las

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tendencias de los VG medios anuales para los caracteres PP y RL presenten una evolución más constante-positiva, siendo consistente con el año donde se marcaron las directrices de trabajo para el esquema de selección de sementales caprino de aptitud lechera de raza MG(4), basados en información familiar y estimaciones BLUP, según las directrices publicadas en la Resolución de 12 de mayo de 1999 del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Además, los puntos de referencias de los VG medios se encuentran más próximos a la línea de tendencia, que presentaron picos prominentes en los años 2004, 2009 y declives notorios en los años 2005, 2006, 2011 y 2012, según MURCIGRAN(4), podrían estar relacionadas con la incorporación de animales al esquema de selección procedentes de ganaderías externas al núcleo selectivo en los años mencionados. Las TG tanto para PP y RL tienen un recorrido en simultáneo paralelo, donde los picos prominentes se hacen presentes en años anteriores a 1999; y el declive más notorio se hace presente en el 2012. Al respecto en diciembre del 2011 se llega a un acuerdo para fusionar, en forma oficial las asociaciones de CAPRIGRAN y ACRIMUR en MURCIGRAN(4), conllevando a gestionar un solo Libro Genealógico y por ende los datos y/o registros de los mismos, lo cual justificaría el declive notorio entre los años 2011 y 2012 tanto en las TG como TF. La TG para P a pesar de presentar picos prominentes (1993, 1995, 2005, 2010 y 2012) y declives notorios (1992, 1998, 2006 a 2009) además de alternantes e irregulares entre sí; muestra una línea de tendencia estacional positiva. En tanto, la TF se aprecia una línea de tendencia decreciente discreta apreciándose picos menos prominentes en los años 1991, 1993, 2002 y 2012. Esta información refuerza la idea de prestar atención a este carácter y su comportamiento en conjunto con otros por su impacto directo en las curvas de lactación, alargar la P permitiría aplanar la parte en declive de la curva de lactancia o al menos mitigar los picos críticos que afectan el sistema inmunológico (relación antagónica entre los rasgos de producción lechera y resistencia a las enfermedades) promoviendo una lactancia más eficiente con beneficios considerables como evitar riesgos en la salud del animal y los costos asociado(18,19). Al respecto, estudios específicos en caprino lechero concluyen que el realizar selección de animales por P como criterio y unido al valor del pico de lactancia es posible, sin alterar la cantidad de leche total(20), y con ello llegar incluso a modificar genéticamente la curva de lactación(19). Por ello una estimación temprana de la P en lactaciones en progreso puede representar una herramienta útil tanto para la cría como para las estrategias de manejo(21), especialmente en el caso de implementación de estrategias a favor de la reducción de la producción de gases de efecto invernadero derivadas en la lucha por la mitigación del cambio climático(22); La estimación de estas TG sirven para evaluar los resultados del programa e informar a los criadores de las decisiones de selección tomadas, permitiendo hacer los ajustes 389

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necesarios para optimizar el progreso genético de cada población(23); por tanto, los resultados obtenidos de esta evaluación permitirán proponer la incorporación del carácter P al programa de mejora. Finalmente, señalar que, de forma general, los fenotipos y los valores de cría para los caracteres de PP y RL se ven claramente incrementadas en el periodo estudiado; sin embargo, en contraste el carácter de P si bien genéticamente se mostró estacionario, fenotípicamente se aprecia un decremento, sugiriendo su justificación a factores ambientales, como una modificación del manejo. Estudios referidos al respecto indican que el ambiente no modifica de forma directa la constitución genética del individuo, pero sí determina la extensión con que se expresa y el potencial genético de los animales, mismo que se expresará en la medida que las condiciones ambientales lo permitan(24).

Conclusiones e implicaciones El análisis global de las TG y TF para los caracteres analizados demostró variaciones dinámicas irregulares con intervalos de crecimiento, decrecimiento y picos en puntos determinados a lo largo del periodo estudiado. El comportamiento genético y fenotípico de estos tres caracteres indica congruentemente que, en un periodo de 22 años, los caracteres de PP y RL presentaron un comportamiento de tendencia ascendente y magnitud similar, mientras que el carácter de P se mostró estacionario a decreciente, reforzando la idea de que altas producciones van en detrimento de la P. En todos los casos, eventos importantes en el programa de cría, como la federación de las asociaciones o la implantación de la selección familiar, dejaron su huella en las tendencias. Estos hallazgos permitirán informar a los criadores del comportamiento de estos caracteres y ponerle a consideración incorporar la P en el esquema de selección.

Agradecimientos y conflicto de interés Los autores agradecen a la Federación Española de Criadores de Caprino, Raza MurcianoGranadina (MURCIGRAN). Un agradecimiento especial para MsC. Bolívar Samuel Sosa Madrid por sus valiosos aportes al manuscrito. No existe conflicto de interés.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5010 Artículo

Calidad seminal de ovinos de pelo suplementados con Moringa oleifera (Moringaceae) y Trichanthera gigantea (Acanthaceae)

Marco A. Ramírez-Bautista a,b Julio P. Ramón-Ugalde a Edgar Aguilar-Urquizo a William Cetzal-Ix b* Roberto Sanginés-García a Álvaro E. Domínguez-Rebolledo c Ángel T. Piñeiro-Vázquez a

Tecnológico Nacional de México, Instituto Tecnológico de Conkal, División de Estudios de Posgrado e Investigación, Ave. Tecnológico s/n Conkal, 97345, Yucatán, México. b

Tecnológico Nacional de México, Instituto Tecnológico de Chiná, Campeche, México.

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Campo Experimental Mocochá, Yucatán, México.

*Autor de correspondencia: rolito22@hotmail.com

Resumen: Se evalúo el efecto de la inclusión de Moringa oleifera Lam. y Trichanthera gigantea (Bonpl.) Nees en la dieta de ovinos de pelo (Pelibuey) sobre su calidad seminal. Durante 90 días, las dietas de 15 ovinos (24 kg ± 3.95) se dividieron en tres tratamientos: T1: dieta integral con 40 % de M. oleifera + pasto Taiwán (Pennisetum purpureum Schumach.), T2: dieta integral con 40 % de T. gigantea + pasto Taiwán y T3: 40 % alimento comercial + pasto Taiwán. A estos ovinos se les determinó la ganancia diaria de peso (GDP), rendimiento

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de la canal (RC), desarrollo testicular (DT) (determinado por el diámetro (AE) y la circunferencia escrotal (CE)); y a sus muestras de esperma se les evalúo el volumen, concentración, motilidad (CASA), viabilidad (SYBR-14/IP), actividad mitocondrial (J-C1) e integridad acrosomal (FITC-PSA). No se encontraron diferencias (P>0.05) en la GDP y RC. Se encontraron diferencias (P˂0.05) en DT, T1 (AE= 48.84 ± 5.99 mm, CE= 26.48 ± 1.13 cm) y T3 (AE= 48.83 ± 4.34 mm, C = 26.62 ± 1.27 cm) presentaron valores más elevados que T2 (AE= 44.57 ± 5.59 mm, CE= 25.42 ± 1.50 cm); en la viabilidad, T2 (62.90 ± 6.10 %) y T1 (54.00 ± 6.61 %) poseen mayores porcentajes que T3 (24.45 ± 7.56 %); en la motilidad, T1 (93.9 ± 2.1 %) y T2 (88.6 ± 1.9 %) tuvieron mayor porcentaje que T3 (71.9 ± 4.0 %). La inclusión de M. oleifera y T. gigantea en la dieta permite obtener una GDP, RC y DT similar al alimento comercial e incrementa más del 20 % de las células espermáticas viables; también mejora algunos parámetros de motilidad, mejorando con esto el potencial reproductivo de los sementales. Palabras clave: Células espermáticas viables, Motilidad, Pennisetum purpureum, Rendimiento de canal.

Recibido: 03/08/2018 Aceptado: 06/05/2019

Introducción La elevada demanda de carne ovina obliga a los productores a mejorar todos sus procesos encaminados a reducir los costos de producción, a incrementar los parámetros productivos y reproductivos que permitan aumentar la productividad por unidad de superficie, mejorar el bienestar animal, y a anteponer un enfoque sustentable que asegure la permanencia del sistema a través del tiempo(1). En las zonas tropicales el ambiente es determinante en la producción pecuaria y en especial la producción ovina, debido a que enfrenta entre otros factores una marcada estacionalidad en la producción de forraje obligando a los productores a implementar estrategias de suplementación (principalmente con alimento comercial) para mantener niveles óptimos de producción, lo que ha generado una dependencia alimentaria y un considerable aumento en los costos de producción(2). Bajo este contexto, la utilización de especies arbóreas con potencial forrajero cobran relevancia en la alimentación animal(3,4,5), debido a que su implementación permite generar estrategias de sustitución parcial de granos en la dieta(6). Sin embargo, la utilización de especies arbóreas con potencial forrajero está condicionada por el elevado contenido de nutrimentos, tolerancia a la poda, producción constante de 394

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biomasa y contenido de compuestos secundarios que pueden afectar a los animales que los consumen(7,8). Esto último, es una de las principales razones que limitan su uso para la alimentación animal(9); ya que puede generar efectos estrogénicos que inhiben, entre otros, el crecimiento y el mantenimiento del sistema reproductivo. En el sistema reproductivo de los machos las afectaciones por presencia de compuestos secundarios pueden ser: mayor número de espermatozoides inmaduros con disminución significativa en la motilidad, disminución del lumen de los túbulos seminíferos, incremento del índice apoptótico de las células germinales, atrofia prostática y afección de la espermatogénesis(10,11). En este contexto, diversas especies como Moringa oleifera Lam. (Moringaceae) y Trichanthera gigantea (Bonpl.) Nees (Acanthaceae) son alternativas de suplemento alimenticio(8). A pesar de que se ha reportado en éstas la presencia de metabolitos secundarios; por ejemplo, García(12) registró la presencia de fenoles, flavonoides y taninos que precipitan la proteína y taninos condensados; por su parte, Balercia et al(13), Rajimakers et al(14) y Ghasi et al(15) observaron en M. oleifera y T. gigantea, la presencia de riboflavinas, ácido nicotínico, ácido fólico, piridoxina, proteínas, vitaminas A, B, C y E, así como aminoácidos y altos niveles de β-carotenos; el consumo de estos antioxidantes contribuye a mejorar la calidad seminal ya que eliminan radicales libres que se encuentran en el plasma seminal. Por tal razón, es necesario estudiar el efecto que estas plantas podrían generar en los animales que las consumen. Por lo anterior, el objetivo fue evaluar el efecto de la inclusión de M. oleifera y T. gigantea en la dieta de ovinos Pelibuey sobre la calidad seminal.

Material y métodos El trabajo se desarrolló en el área de producción e investigación agrícola y pecuaria del Instituto Tecnológico de Conkal, Yucatán, México (21°05’ N y 89°32’ O), que se encuentra a una altitud de 7 msnm, con clima tipo AW0, con precipitación de 900 mm anuales y temperatura promedio de 29 ºC.

Tratamientos, animales y manejo Se utilizaron 15 ovinos Pelibuey machos púberes (6 ± 0.5 meses de edad), con un peso promedio de 24 kg ± 3.95 distribuidos completamente al azar en tres tratamientos (n= 5): T1= dieta integral con 40% de M. oleifera + pasto Taiwán (Pennisetum purpureum Schumach.). T2= dieta integral con 40% de Trichanthera gigantea + pasto Taiwán. T3= dieta integral + pasto Taiwán. La cantidad de alimento ofertada fue del 4.7 % del peso vivo durante los 90 días que duro el experimento (los ajustes del consumo se realizaron cada siete días). El contenido de la composición porcentual de las dietas experimentales se puede observar en el Cuadro 1, y el análisis proximal en el Cuadro 2.

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Cuadro 1: Composición porcentual de las dietas experimentales Componente Moringa Trichanthera Melaza Minerales Canola Maíz Sorgo Pasto Taiwán

Dietas (%) T1 16 0 4.24 1.2 3.2 8.28 7.08 60.0

T2 0 16 3.72 1.08 5.88 8 5.32 60.0

T3 0 0 7 3 21 5 4 60.0

T1: dieta integral con 40% de M. oleifera + pasto Taiwán (Pennisetum purpureum Schumach.), T2: dieta integral con 40% de T. gigantea + pasto Taiwán, y T3: alimento comercial + pasto Taiwán.

Cuadro 2: Análisis químico proximal de las dietas ofertadas Dietas Fibra Fibra Materia Proteína y detergente detergente Cenizas seca cruda pasto neutra ácida T1 90.83 13.81 20.22 16.18 1.01 T2 91.54 14.01 26.27 14.21 0.95 T3 98.82 23.16 22.83 13.47 0.98 Pasto Taiwán 90.96 8.00 67.26 42.21 0.97 T1: dieta integral con 40% de M. oleifera + pasto Taiwán (Pennisetum purpureum Schumach.), T2: dieta integral con 40% de T. gigantea + pasto Taiwán, y T3: alimento comercial + pasto Taiwán

Desarrollo de corderos Para determinar el desarrollo de los corderos se realizó el pesaje de los animales cada siete días, previo a cada pesaje los animales se sometieron a un período de 18 h de ayuno, se pesaron en una báscula T31P (OHAUS) de plataforma electrónica con capacidad de 300 kg con un margen de error de 0.1 kg. Con el análisis de estos pesos se determinó la ganancia diaria de peso(16).

Desarrollo testicular La medición de la circunferencia escrotal se realizó empleando una cinta métrica de plástico, mientras que para el registro del diámetro testicular se utilizó un vernier digital de la marca TRUPER(17).

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Calidad seminal Para la evaluación de la calidad seminal, una vez transcurridos 70 días del periodo experimental (8 ± 0.7 meses de edad), se recolectaron seis muestras de semen por animal en cada tratamiento (dos por semana), utilizando una hembra estrogenizada como maniquí, empleando el método de vagina artificial provista de una camisa de caucho (Liner). Se introdujo agua caliente a 45 ⁰C y aire por insuflación a través de una válvula, para obtener la temperatura y la presión necesarias para estimular la eyaculación(18). Una vez obtenidos los eyaculados se transportaron al laboratorio en condiciones isotérmicas (35 a 37 ⁰C) para su evaluación. En el laboratorio las muestras se colocaron en un baño maría a 37 ⁰C para su inmediata evaluación. A las muestras recolectadas se les determinó: 1) El volumen del eyaculado con un tubo recolector graduado. 2) Con el sistema CASA (ISAS®v1 (Proiser R+D, Valencia, España), se determinó la concentración espermática diluyendo 5 µl de semen puro en 995 µl de agua destilada (1:200); después se colocaron 9 µl de la muestra diluida en una cámara de Bürker para su análisis. La motilidad espermática se evaluó depositando 5 µl de muestra diluida a una concentración de 30 x 106 espermatozoides/ml sobre una cámara Makler® (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel), y se realizaron cuatro grabaciones de cada muestra; la dilución se realizó con el diluyente comercial (Triladyl ® + agua destilada + 20 % de yema de huevo). Los parámetros evaluados para esta variable fueron: porcentaje de motilidad total (MT), porcentaje de motilidad progresiva (MP), velocidad curvilínea (µm/s) (VCL), velocidad rectilínea (µm/s) (VSL), velocidad media (µm/s) (VAP), índice de linealidad (LIN), índice de rectitud (STR), índice de oscilación (WOB), amplitud media del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH), frecuencia de batido de la cabeza espermática (FBC). 3) La viabilidad espermática se evaluó mediante tinción con el fluorocromo SYBR-14/IP (Live/Dead® kit L-7011, InvitrogenTM), se mezcló 1 µL de SYBR-14 (10 µM) y 1 µl IP (12 µM) en 100 µl de muestra espermática diluida; se mantuvo durante 10 min a 37 ⁰C; posteriormente se colocaron 5 µl de la muestra teñida sobre un portaobjeto precalentado a 37 ⁰C para su evaluación en un microscopio de fluorescencia (CX-31, Olympus, Tokio, Japón), con una longitud de onda 488 nm. 4) La actividad mitocondrial se determinó utilizando el fluorocromo J-C1 (153 µM, Molecular Probes® T-3168, InvitrogenTM), se mezcló 1 µl del fluorocromo en 100 µl de muestra espermática diluida; se mantuvo durante 10 min a 37 ⁰C; posteriormente se colocaron

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5 µl de la muestra teñida sobre un portaobjeto precalentado a 37 ⁰C para su evaluación en un microscopio de fluorescencia con una longitud de onda de 488 nm. 5) La integridad de los acrosomas se evaluó con el fluorocromo FITC-PSA (100µg/mL, L0770, Sigma-AldrichTM), añadiendo 5 µl del fluorocromo en 100 µl de muestra espermática diluida y se mantuvo durante 30 min a 37 ⁰C, posteriormente se colocaron 5 µl de la muestra incubada en un portaobjetos y se evaluaron en un microscopio de fluorescencia con una longitud de onda de 485nm. Los datos obtenidos se analizaron mediante el procedimiento PROC GLM del paquete estadístico SAS 9.4 para Windows (SAS Inst. Inc. Cary NC, USA), se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de medias repetidas para evaluar el efecto de la dieta sobre la calidad espermática y la comparación de medias por medio de la prueba de Tukey.

Resultados y discusión Comportamiento productivo Las ganancias diarias de peso de los animales en estudio, no presentaron diferencias (P˂0.05) entre tratamientos. Estas ganancias son mayores a las registradas por Madera-Solís et al(19), quienes con diferentes niveles de inclusión de Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit encontraron ganancias diarias de peso de 25, 41.67, 50 y 75 g en ovinos Pelibuey. Por su parte, Ríos et al(20), registraron ganancias de 54, 87 y 56 g/día, al evaluar el uso de Morus sp. y Gliricidia sepium Kunth ex Walp. como sustitutos del alimento concentrado para corderos en crecimiento. También se reportan(4), ganancias diarias de 45.5, 96.3, 124.5 y 106.4 g con diferentes niveles de inclusión de heno de Hibiscus rosa-sinensis L. en ovinos en crecimiento. Las ganancias obtenidas en este estudio son menores a los señalados por otros(16), quienes registraron ganancias diarias de 229 ± 10 g/día para animales PelibueyKatadin alojados en jaulas elevadas y alimentados con un concentrado comercial con un contenido de 16 % de proteína cruda y heno de Cynodon nlemfuensis Vanderyst. En la evaluación del rendimiento de la canal tampoco se encontraron diferencias (P˂0.05) entre los tratamientos: 50.79, 49.44 y 46.94 % para los tratamientos T1, T2 y T3 respectivamente siendo similares a los registrados por Magaña-Monforte et al(16), quienes obtuvieron un rendimiento de 49.1 ± 0.58 con animales cruzados de las razas PelibueyKatahdín. Los rendimientos de este estudio fueron inferiores a los encontrados en otro trabajo(21), donde registran 52.8 % de rendimiento de canal para machos enteros, 56.64 % para machos castrados y 55.87 para hembras. El adecuado balance nutricional presente en las dietas evaluadas generó una respuesta productiva similar en los animales de estudio y adecuada al compararse con otros trabajos realizados en condiciones similares. Estos 398

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resultados en las raciones evaluadas (Cuadro 2) pueden ser atribuidos al adecuado nivel de proteína y al mejor balance nutricional(22), lo que estimula un aumento en el nivel de eficiencia de los nutrimentos producida por una mayor actividad microbial en el rumen(23) y garantizando con esto una estabilidad metabólica(24), afectando positivamente los diferentes parámetros productivos evaluados en el presente estudio (ganancias diarias de peso y rendimiento de la canal).

Desarrollo testicular El volumen testicular es un indicador de la capacidad fecundante del macho, la fertilidad más alta, así como un menor número de espermatozoides anormales se ha observado en animales con mayor circunferencia escrotal. En los animales de estudio el desarrollo testicular determinado por medio del incremento de la circunferencia y el diámetro escrotal, presentaron diferencias (P˂0.05) entre los tratamientos evaluados para ambas variables (Cuadro 3). Para la variable circunferencia escrotal el tratamiento T3 mostró la mayor media con respecto al T2, mientras que el T1 no difirió (P>0.05) con los otros dos tratamientos. Para la variable de diámetro escrotal, no existió diferencia entre los tratamientos T1 y T3, pero ambos fueron mayores con respecto a T2. Cuadro 3: Circunferencia escrotal, diámetro escrotal, volumen y concentración seminal de ovinos de pelo suplementados con M. oleifera y T. gigantea (media ± error estándar) Diámetro escrotal (mm)

Tratamientos

Circunferencia escrotal (cm)

26.48±0.33ab

48.84±1.05a

25.42±0.33b

44.57±1.05b

26.62±0.33ª

48.83±1.05a

Volumen (ml) 0.70 0.05a 0.61 0.05a 0.63 0.06a

± ± ±

Concentración 1882.63 ± 202.66a x 106 1841.92 ± 182.34a x 106 1014.49 ± 482.44a x 106

T1: dieta integral con 40% de M. oleifera + pasto Taiwán (Pennisetum purpureum), T2: dieta integral con 40% de T. gigantea + pasto Taiwán, y T3: alimento comercial + pasto Taiwán. (a,b) Literales distintas entre columnas indican diferencias significativas (P<0.05).

Las medias para la circunferencia escrotal fueron: 26.4 ± 0.33, 25.4 ± 0.33 y 26.6 ± 0.33 cm para los tres tratamientos uno dos y tres, respectivamente (Cuadro 3), son menores a los registrados por Luna et al(25), quienes encontraron medias de 28.4 cm en ovinos suplementados con grasa animal y aceite de palma; al igual que los reportados en otros trabajos(26,27), con 29.4 y 36.5 cm, respectivamente. Las medias de diámetro escrotal fueron menores a las registradas por Ballín et al(26). El desarrollo testicular está determinado por 399

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diferentes factores, principalmente la edad, la raza y la nutrición(27), en este sentido los animales en estudio con una edad promedio de 7 ± 0.5 meses de edad, recibieron una dieta con niveles adecuados de proteína y además nutrientes necesarios para cubrir los requerimientos nutricionales de acuerdo a su etapa fisiológica, lo cual se refleja en las ganancias de peso y el desarrollo testicular obtenido.

Evaluación seminal Las variables de volumen del eyaculado y la concentración espermática no presentaron diferencias (P>0.05), entre tratamientos (Cuadro 3). El volumen en los tres tratamientos se encuentra dentro de los rangos considerados como normales, que van de 0.5 a 2.0 ml, y este volumen varía según la edad, tamaño, condición corporal del animal, frecuencia de recolección y destreza del operador(28). A pesar de esto, los valores reportados en este experimento fueron menores a los reportados por Mansano et al(29), quienes obtuvieron volúmenes de 1.3 ± 0.4 ml; Carrillo y Hernández(30) obtuvieron 1.41 ± 0.11 ml, por su parte Córdova-Izquierdo et al(31) obtuvieron 1.11 ml; sin embargo, estos dos trabajos se realizaron con machos maduros a diferencia de los machos púberes (7 ± 0.5 meses de edad) utilizados en el presente estudio. Los valores bajos de volumen del eyaculado obtenidos en este estudio, contienen una mayor concentración de espermatozoides por ml, por lo tanto, estos valores son superiores a los registrados en otros estudios, quienes indican rangos de 206.4 a 711.89 × 106(30,31), pero son similares a los encontrados por Domínguez et al(32), quienes registraron valores de 2.19 ± 0.04 y 108 ± 8.0 × 106 espermatozoides/ml, al evaluar la calidad seminal de corderos (F1) Katahdin × Pelibuey suplementados con alfalfa. En contraste los valores de concentración obtenidos aquí son menores a los encontrados por Quintero et al(33), quienes obtuvieron 2,628.2 × 106 al evaluar ovinos de pelo, de 2 a 5 años de edad. En los parámetros de motilidad se encontraron diferencias (P˂0.05), en motilidad total, velocidad curvilínea y ALH, donde los tratamientos T1 y T2 fueron mejores vs T3; y en las variables de VAP y VSL, el T1 presentó los mejores resultados respecto al T3, pero no se observaron diferencias entre T1 y T2. Para el resto de las variables analizadas (MP, LIN, STR, WOB y BCF) no se encontraron diferencias entre grupos experimentales (Cuadro 4).

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Cuadro 4: Parámetros de motilidad seminal de ovinos de pelo suplementados con M. oleifera y T. gigantea (media ± error estándar) Variables MT, % VAP, µm/s VCL, µm/s VSL, µm/s ALH, µm MP, % STR, % WOB, % BCF, Hz LIN, %

Tratamientos T1 93.9 ± 2.1a 100.4 ± 3.7a 157.8 ± 5.0a 70.3 ± 3.1a 4.8 ± 0.1a 30.79±2.64ª 64.72±1.31ª 61.96±1.63ª 10.32±0.25ª 42.27±1.9ª

T2 88.6 ± 1.9a 88.6 ± 3.2ab 146.6 ± 4.4a 61.3 ± 2.7ab 4.6 ± 0.1a 29.23±2.32ª 64.98±1.15ª 59.85±1.43a 10.57±0.22a 40.85±1.67a

T3 71.9 ± 4.0b 73.0 ± 6.8b 117.3 ± 9.2b 54.6 ± 5.8b 3.7 ± 0.3b 30.18±4.87ª 69.62±2.42ª 60.78±3.01ª 9.89±0.47ª 44.35±3.5a

T1= 40% de M. oleifera + Taiwán, T2= 40% de T. gigantea + Taiwán, T3= alimento comercial + Taiwán. MT= motilidad total; VAP= velocidad media; VCL= velocidad curvilínea; VSL= velocidad rectilínea; ALH= amplitud de desplazamiento; MP= motilidad progresiva; STR= índice de rectitud; WOB= índice de oscilación; BCF= frecuencia de batido; LIN= índice de linenealidad. a,b Valores con distinta literal en la misma fila son diferentes (P<0.05).

Los resultados en la variable de motilidad son superiores a los registrados por Mansano et al(29), quienes obtuvieron 52 % motilidad, pero son similares a los encontrados en otra investigación(32), donde encontraron 80 % de motilidad total y motilidad progresiva de más de 20 %; sin embargo, los resultados de este estudio son menores a los registrados por Quintero et al(33), quienes obtuvieron 90.69 % de motilidad progresiva. En el análisis de la variable de viabilidad de la membrana plasmática se encontraron diferencias (P˂0.05) entre los tratamientos evaluados (T1: 54 %, T2: 63 % y T3: 21 %) siendo el tratamiento T2 el que presentó mayor porcentaje de viabilidad, en contraste con T3 que obtuvo los porcentajes más bajos (Figura 1).

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Figura 1: Viabilidad, actividad mitocondrial e integridad del acrosoma de ovinos de pelo suplementados con Moringa oleífera y Trichanthera gigantea

T1: dieta integral con 30% de M. oleifera + pasto Taiwán (Pennisetum purpureum Schumach.), T2: dieta integral con 30% de T. gigantea + pasto Taiwán, y T3: alimento comercial + pasto Taiwán.

Las variables actividad mitocondrial e integridad del acrosoma no presentaron diferencias (P>0.05) entre ninguno de los tratamientos; aunque para la variable de actividad mitocondrial en el T1 presentó las medias más elevadas, mientras que el T3 presentó los mayores porcentajes para la variable actividad mitocondrial (Figura 1). La integridad de las membranas plasmática y acrosomal así como la actividad mitocondrial son un factor primordial para la fecundación, ya que una membrana plasmática intacta indica que el espermatozoide está vivo, una membrana acrosomal intacta permite la penetración del ovocito y la actividad mitocondrial asegura la presencia de energía necesaria para el desplazamiento del espermatozoide (Figura 2), por ello su inclusión en las evaluaciones sobre calidad seminal es imprescindible(31). Los resultados observados en este estudio concuerdan con los registrados por Córdova-Izquierdo et al(31) quienes obtuvieron 68.5% de integridad de la membrana plasmática al evaluar ovinos de la raza Suffolk. Asimismo, coinciden con los resultados de Rubio-Guillen et al(34), quienes registran 42 % al evaluar ovinos West African. Sin embargo, los porcentajes obtenidos en este estudio son menores a los encontrados en otras investigaciones(30,32,33); pero se concuerda con Domínguez et al(32) en los valores de la integridad acrosomal.

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Figura 2: Espermatozoides de ovinos alimentados con Trichanthera gigantea o Moringa oleifera

A. Espermatozoides teñidos con fluorocromos SYBER-14/IP, vivos (cabezas verdes) y muertos (cabezas rojas o naranjas); viabilidad del acrosoma ubicado en la región apical mediante el fluorocromo FITC-PSA (incolora viable y verde dañada). B. Actividad mitocondrial ubicado en la región intermedia de la cola teñidos con el fluorocromo JC1, con actividad (naranjas o amarillos) sin actividad (verdes).

Los parámetros registrados en la evaluación de la calidad seminal, así como el desarrollo testicular podrían atribuirse al adecuado balance nutricional de las dietas evaluadas, ya que la producción y la calidad espermática, así como el tamaño testicular están directamente influenciados por la nutrición. Un aumento en el nivel nutricional incrementa la frecuencia de pulsos de LH e incrementa los niveles de FSH(35), hormonas que promueven la espermatogénesis y la secreción de andrógenos(36). Los animales evaluados en el presente estudio son animales púberes, y animales en esta condición presentan una mayor cantidad de espermatozoides inmaduros, muertos o defectuosos, que a su vez producen altas cantidades de radicales libres que afectan a los espermatozoides que se encuentran en buen estado, ya que los radicales libres provocan una cascada de peroxidación lipídica afectando principalmente ácidos grasos no saturados de la membrana plasmática del espermatozoide, causando pérdida de la función espermática y apoptosis celular, lo cual los coloca entre las principales causas de muerte en las células espermáticas(37). Se ha observado que la inclusión de antioxidantes en la dieta mejora el porcentaje de células espermáticas vivas, debido a que los antioxidantes eliminan radicales libres que se encuentran en el plasma seminal y confieren protección a los espermatozoides(13,14); Priyadarshani y Varma(38), observaron un mayor porcentaje de células vivas cuando utilizaban harina de M. oleifera en la dieta de ratones. Esto es similar a lo observado en el presente estudio y podría atribuirse al aporte de antioxidantes (β-carotenos) que contienen M. oleifera y T. gigantea(15).

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Los compuestos secundarios presentes en las dos especies evaluadas podrían estar relacionados con los valores encontrados en el presente estudio, por lo tanto, estudios que determinen la presencia y la concentración de estos aportaría mayor evidencia al respecto.

Conclusiones e implicaciones La sustitución de 40 % de alimento comercial por M. oleifera o T. gigantea en la dieta de ovinos Pelibuey promueve un desarrollo testicular adecuado, mejora la viabilidad espermática en más de 20 % y algunos parámetros de motilidad como la motilidad total, velocidad media, velocidad curvilínea, velocidad rectilínea y la amplitud media del desplazamiento lateral de la cabeza espermática, lo que podría mejorar el potencial reproductivo de los sementales.

Agradecimientos Este trabajo fue financiado parcialmente por el proyecto CONACYT Ciencia Básica 164592 y por el proyecto 5304.14-P del Tecnológico Nacional de México. Agradecemos las sugerencias y comentarios al manuscrito por parte de los revisores anónimos.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5685 Artículo

Uso de un precursor glucogénico en el preparto y su efecto sobre indicadores de energía y parámetros reproductivos en vacas lecheras

Carlos Leyva Orasma a Jesus Jaime Benitez-Rivas b Juan Luis Morales Cruz c Cesar Alberto Meza-Herrera d Oscar Ángel-Garcíaa Fernando Arellano-Rodríguez c Guadalupe Calderón-Leyva c Dalia Ivette Carrillo-Moreno c Francisco Veliz Deras a*

Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Departamento de Ciencias Médico Veterinarias, Torreón, Coahuila, México. b

Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Posgrado en Ciencias en Producción Agropecuaria, Torreón, Coahuila, México. c

Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Departamento de Producción Animal, Torreón, Coahuila, México. d

Universidad Autónoma Chapingo. Unidad Regional Universitaria de Zonas Áridas, Bermejillo, Durango, México.

* Autor de correspondencia: velizderas@gmail.com

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Resumen: El objetivo fue evaluar si la suplementación del 1-2 propanodiol más propionato de calcio (precursores glucogénicos) durante el periodo de transición en vacas altas productoras disminuye la incidencia de enfermedades metabólicas y reproductivas durante el inicio de la lactancia. Las vacas se dividieron en dos grupos homogéneos respecto al número de lactancias, y condición corporal. 1) Grupo tratado (GG; n= 112): por 15 días durante el periodo de transición se les administraron 60 g/vaca/día del precursor glucogénico, el cual fue adicionado en la dieta. 2) Grupo control (GC; n= 90): no se le administro ningún tratamiento. Los niveles de beta hidroxibutirato (BHB) (GG= 0.9 ± 0.2 mmol/L vs GC= 1.3 ± 0.2 mmol/L; P<0.05), y ácidos grasos no esterificados (AGNES) (GG= 0.6 ± 0.1 mEq/L vs GC= 0.8 ± 0.1 mEq/L; P<0.05) posparto fueron más altos en el GC que en el GG. Igualmente el GC (23 %) tuvo mayor porcentaje de hembras con retención de placenta que el GG (GG= 13 %; P≤0.06). Mientras que no existió diferencia en metritis, distocia y aborto entre grupos (P>0.05). Sin embargo, la cetosis subclínica (GG= 10 %, GC= 56 %; P<0.05), y la mastitis (GG= 8 %, GC= 16 %; P<0.05) fueron más altas en GC que en el GG. Mientras que, para cetosis clínica, hipocalcemia y acidosis ruminal no existió diferencia entre los grupos (P>0.05). La administración del precursor redujo los niveles de BHB y AGNES, así como el porcentaje de cetosis subclínica y retención de placenta, lo cual puede ser una alternativa para para mejorar la eficiencia reproductiva. Palabras clave: BHB, AGNES, BEN, Cetosis subclinica, Posparto.

Recibido: 27/08/2018 Aceptado: 11/03/2019

Introducción Durante las primeras semanas de lactancia, las vacas con una elevada producción de leche enfrentan un balance energético negativo (BEN) debido que utilizan una gran cantidad de energía cuando tienen una adaptación inadecuada durante el periodo de transición y una baja ingesta de materia seca al comienzo de la lactancia(1,2). Esta situación favorece la movilización de los lípidos hepáticos que eleva los niveles en sangre de ácidos grasos no esterificados (AGNES) y de beta hidroxibutirato (BHB), los cuales se consideran indicadores sensibles de BEN(3,4). Esta condición fisiológica y metabólica puede dar lugar a lesiones hepáticas que conduzcan a una alta probabilidad de padecer otros trastornos relacionados con 409

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disfunciones metabólicas tales como cetosis, mastitis, metritis, hipocalcemia, desplazamiento de abomaso y retención de placenta(2). De hecho, al inicio de la lactancia, se registran concentraciones de BHB superiores a 1.2 mmol/L que se relacionan con la presencia de cetosis subclínica(5), y los niveles de AGNES permiten predecir problemas de salud posparto(6). Considerando todos los procesos que tienen lugar durante el periodo de transición y con el objeto de mantener la normoglucemia, se han utilizado diversas alternativas metabólicas para mantener la glucemia requerida para satisfacer los requisitos de los tejidos periféricos(7) esto último, durante todo el proceso de glucogénesis, que permite la producción de la glucosa a partir de los precursores glucogénicos tales como el propionato o el propilenglicol(8-11). Con base en los hallazgos previos, el propósito de este estudio fue evaluar el efecto del uso de un precursor glucogénico durante el periodo de transición en los niveles de BEN (AGNES y BHB) en sangre y la incidencia de enfermedades metabólicas y reproductivas al inicio de la lactancia en las vacas lecheras de alto rendimiento.

Material y métodos Sitio de estudio, animales y manejo La investigación se llevó a cabo de agosto a septiembre de 2015 en la Comarca Lagunera (25° 44 36 N, 103° 10 15 O; 1,111 msnm). Esta región norteña de México se caracteriza por un clima extremadamente cálido y seco, con temperaturas que van de 23 ºC a 43 ºC en el verano, y de 2 ºC a 9 ºC en el invierno, y con una precipitación anual promedio de 240 mm y una humedad relativa de entre 29 y 83 %. El estudio se realizó en un rebaño lechero comercial con un hato de 1,600 vacas Holstein, manejado con un sistema intensivo de producción en corral abierto. Las vacas fueron alimentadas con una dieta totalmente mixta (50 % de forraje y 50 % de concentrado, en base de materia seca 1.62 Mcal/Kg de ENL, 18 % PB), formulada para satisfacer los requerimientos nutricionales de las vacas en lactancia con una producción de leche > 33 kg/día(12). Se alimentó a las vacas con pienso cuatro veces al día (a las 0600, 1000, 1200 y 1600 h) y además se les ofreció un 10 % diario adicional para consumo a voluntad.

Salud y manejo reproductivo Todas las vacas recibieron cuatro infusiones intramamarias de 375 mg de cefalexina (Rilexine®, Virbac, México) durante el periodo seco. Asimismo, las vacas recibieron un bolo de liberación prolongada de microminerales y vitaminas A, D y E (Megabric®, Laboratorio Neolait, Francia). El control rutinario de la mastitis incluyó la desinfección de los pezones 410

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antes y despuĂŠs de la ordeĂąa, la aplicaciĂłn de la prueba de mastitis de California y un conteo regular de cĂŠlulas somĂĄticas. En este estudio se sometiĂł a vacas frescas a un manejo reproductivo desde el dĂa 0 hasta el dĂa 10; a fin de lograr una involuciĂłn uterina adecuada, se administrĂł una inyecciĂłn de 25 mg de PGF2Îą en los dĂas 35 y 47 posteriores al parto. AdemĂĄs, se vacunĂł a cada una de las vacas de acuerdo con el programa preventivo de vacunaciĂłn de rebaĂąo, enfocado principalmente en enfermedades como la diarrea viral bovina, la rinotraqueĂtis infecciosa bovina, el virus respiratorio sincitial bovino, la parainfluenza tipo 3 y la leptoespirosis (5 variedades).

DiseĂąo experimental y variables de respuesta Se seleccionaron vacas (n= 202) sin problemas reproductivos, las cuales fueron divididas en dos grupos homogĂŠneos en cuanto al nĂşmero de lactancias previas (3.2 Âą 1.17) y al puntaje de condiciĂłn corporal (3.3 Âą 0.5; en una escala de 1-5). Mientras que la producciĂłn promedio de leche en el dĂa 305 fue de 12,200 Âą 147 kg, el nĂşmero promedio de inseminaciones fue de 3.7 Âą 2.4 (en un rango de 1-10 inseminaciones). Un primer grupo de vacas (n= 112; GG; 41.1 Âą 0.7 L diarios) recibiĂł 60 g/vaca de un precursor glucogĂŠnico (1-2 propanodiol y propionato de calcio, LipofeedÂŽ, MĂŠxico), los cuales se aĂąadieron a la dieta, durante los primeros 15 dĂas del periodo de transiciĂłn, mientras que el segundo grupo (n= 90; GC; 40.1 Âą 0.7 L diarios) no recibiĂł ningĂşn tratamiento.

Ă cidos grasos y ĂĄcido beta hidroxibutĂrico Se determinaron las concentraciones sĂŠricas (media Âą EE) de ĂĄcidos grasos no esterificados (AGNES) recolectando una muestra de sangre de la vena coccĂgea con tubos de extracciĂłn vacĂos (BD VacutainerÂŽ) en los dĂas 7, 14 y 21 del posparto; las muestras obtenidas fueron identificadas y refrigeradas hasta que llegaron al laboratorio, donde se las centrifugĂł (450 gđ?&#x2018;Ľ 20 min) y posteriormente se las congelĂł y almacenĂł a -20 ÂşC hasta el momento de someterlas a anĂĄlisis. Se cuantificaron in vitro los AGNES en sangre utilizando un analizador automĂĄtico (Randox RX MonzaÂŽ, E.E.U.U.) y se determinaron las concentraciones (media Âą EE) de ĂĄcido beta-hidroxibutĂrico (BHB) en los dĂas 7, 14 y 21 dĂas despuĂŠs del parto, utilizando un medidor portĂĄtil de BHB (sistema de monitoreo Precision XtraÂŽ), el cual emplea tiras reactivas para cuantificar los cuerpos cetĂłnicos en la sangre(3,13).

411

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Enfermedades metabólicas Se calculó el porcentaje de vacas con cetosis clínica, la cual se diagnosticó con base en un bajo rendimiento de leche y una disminución del apetito, y se determinó el porcentaje de cetosis subclínica sumergiendo en la leche tiras reactivas durante los primeros 21 días. Además se evaluó su relación con otras enfermedades clínicas durante los primeros 35 días después del parto(14). Se detectó la presencia de mastitis clínica durante la ordeña con base en la determinación del calor y la inflamación, palpando la ubre y evaluando los cambios de consistencia de la leche (acuosa-sanguinolenta, secreciones y coágulos de sangre); esto se hizo diariamente durante las primeras tres semanas posteriores al parto(15).

Enfermedades reproductivas Se cuantificó en ambos grupos el porcentaje de vacas con retención de placenta (RP), la cual se definió como la incapacidad de expulsar las membranas fetales en las primeras 24 hs después del alumbramiento(16) y se diagnosticó mediante la observación de la presencia de membranas fetales sobresaliendo de la vulva durante más de 24 h después del parto. Se definió la metritis como la inflamación de toda la pared uterina(17). Ésta se confirmó al evaluar, mediante la palpación rectal, el tamaño del útero en relación con el momento del parto, el grosor de la pared uterina y la presencia de líquido en un cuerno uterino o en ambos. Se definió el aborto como la muerte y expulsión fetal entre los 50 y los 260 días de embarazo.

Análisis estadísticos Se analizaron las concentraciones de BHB y AGNES en la sangre utilizando el procedimiento GLM y la prueba t de comparación de medias de Student. El porcentaje de vacas que mostraron enfermedades reproductivas (retención de placenta, metritis, aborto y distocia) y metabólicas (cetosis clínica y subclínica, hipocalcemia, mastitis y acidosis ruminal) fue calculado y comparado mediante una prueba de Ji cuadrada. En todos los análisis se utilizó el programa SAS y se consideró un nivel de significancia de P<0.05, y de P>0.05 y P≤0.10 para la tendencia estadística.

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Resultados Concentraciones de BHB y AGNES La Figura 1 muestra los resultados de las concentraciones de BHB y AGNES para ambos grupos en los días 7, 14 y 21 posteriores al parto. Los niveles de BHB durante las primeras tres semanas de lactancia fueron superiores en las vacas GC (1.3 ± 0.2 vs 0.9 ± 0.2 mmol/L; P<0.05). No se encontraron diferencias en el tiempo ni en el tratamiento al séptimo día después del parto. No obstante, se halló una diferencia entre el tiempo y el tratamiento en los días 14 y 21 posteriores al parto (P<0.05). Además, los niveles de AGNES fueron superiores para las vacas GC (0.8 ± 0.1 vs 0.6 ± 0.1 mEq/L; P<0.05). Se dio un efecto de la interacción entre el tratamiento y el tiempo en los días 7, 14 y 21 posteriores al parto (P<0.05). Figura 1: Niveles de ácidos grasos no esterificados (AGNES) y BHB (media ± EE) en vacas lecheras de alto rendimiento tratadas (GG) o no (GC) con precursor de glucosa durante 15 días en el periodo de transición

*Diferencia significativa (P<0.05)

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Incidencia de disfunción reproductiva y metabólica

El Cuadro 1 concentra el porcentaje de enfermedades reproductivas y metabólicas en ambos grupos experimentales. Se detectó retención de placenta en el 13 % de las vacas GG (15/112) y en el 23 % de las vacas GC (21/90), (P≥0.06). No se encontraron diferencias entre los grupos experimentales (P>0.05) en cuanto a porcentajes de metritis, distocia o aborto. En relación con las enfermedades metabólicas, se observó un porcentaje mayor (P<0.05) para la cetosis subclínica en las vacas GC (56 %; 50/90 vs 10 %; 12/112), así como para la mastitis (18 %; 16/90 vs 8 %; 9/112, respectivamente). No se observaron diferencias entre los grupos experimentales (P>0.05) para las demás enfermedades metabólicas. Tabla 1: Porcentaje de enfermedades reproductivas y metabólicas posparto de las vacas lecheras tratadas (GG) y no (GC) con un precursor de glucosa por 15 días durante el periodo de transición (%) Valor de P

Grupos Variables GG (n= 112)

GC (n =90)

Placenta retenida

13 (15/112)

23 (21/90)

0.067

Metritis

5 (6/112)

11 (10/90)

0.132

Distocia

7 (8/112)

11 (10/90)

0.325

Aborto

1 (1/112)

2 (2/90)

0.438

Cetosis clínica

1 (1/112)

3 (3/90)

0.216

Cetosis subclínica

10 (12/112

56 (50/90)

0.000

Hipocalcemia

1 (1/112)

1 (1/90)

0.864

Mastitis

8 (9/112)

18 (16/90)

0.037

Acidosis ruminal

6 (10/112)

10 (9/90)

0.467

Enfermedades reproductivas:

Enfermedades metabólicas:

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Discusión Los resultados demuestran que las vacas tratadas con un precursor glucogénico durante el periodo de transición presentaron un menor BEN que las vacas no tratadas. De hecho, las hembras que presentan BEN tienen niveles más elevados de BHB(18); al inicio de la lactancia, las vacas lecheras de alto rendimiento incrementan sus requerimientos de glucosa para la producción de lactosa y, cuando ésta falta, el animal moviliza los sustratos glucogénicos que dan origen a cuerpos cetónicos(19). Esto último puede deberse al hecho de que ese precursor glucogénico es un importante sustrato para la gluconeogénesis, que puede haber estimulado la dinámica del glucógeno hepático necesario para satisfacer los requerimientos de glucosa hepática durante el periodo de transición(19). De hecho, algunos estudios han demostrado que el uso de propionato(10,11) o de propilenglicol(8,9) estimula la síntesis de glucosa en las vacas lecheras al principio de la lactancia(20). Esto probablemente contribuyó a reducir los niveles de BHB en la sangre en las vacas GC; se ha afirmado que los precursores glucogénicos reducen la concentración de cuerpos cetónicos(20). Por otra parte, la administración de un precursor glucogénico redujo las concentraciones de AGNES en la sangre en las vacas GG (0.6 ± 0.1 mEq/L) en comparación con las vacas GC (0.8 ± 0.01 mEq/L), lo que sugiere que las vacas GG probablemente tenían un menor BEN que las vacas del grupo de testigo(6). Ciertamente, al comienzo de la lactancia, las vacas se enfrentan a un BEN debido a su elevado rendimiento de leche paralelo a una reducción del consumo de pienso, lo que provoca un incremento en la movilización de lípidos de la grasa corporal al hígado a fin de proveer los niveles de glucosa requeridos para compensar el déficit de energía observado durante el BEN(1,6,21). Por lo tanto, en las vacas tratadas con el precursor glucogénico durante el periodo de transición se redujo la incidencia de hembras con trastornos metabólicos. De hecho, las vacas GG tuvieron menos cetosis subclínica que las vacas del grupo testigo (10 % vs 56 %). Según McArt et al.(18), el nivel medio de BHB en la sangre que hace suponer la presencia de una cetosis subclínica es 1.2 mmol/L, el cual es cercano al promedio del grupo no tratado (1.3 mmol/L). En efecto, más del 50 % de las vacas del grupo de control, o GC, presentaron cetosis subclínica, misma que constituye un factor de riesgo para la salud de los animales y aumenta la incidencia de enfermedades reproductivas durante el periodo de frialdad. Además, la cetosis subclínica también incrementa el intervalo de retorno al estro y eleva la tasa de vacas de desecho en el hato a la vez que reduce la producción de leche, lo cual ocasiona pérdidas económicas(3,4,14). Esto se debe probablemente a que la administración del precursor glucogénico, que asimismo redujo las concentraciones circulantes de BHB (0.9 mmol/L en las vacas GG), lo que sugiere fallas en la capacidad de adaptarse durante el periodo de 415

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transición(22). Ciertamente, una vaca lechera de alto rendimiento requiere de una gran cantidad de glucosa para producir lactosa. Sin embargo, las vacas presentan una deficiencia de glucosa en la sangre, por lo que intentan compensar este reto metabólico movilizando lípidos desde el hígado. Es probable que este panorama fisiológico y metabólico haya provocado en las vacas del grupo de control un incremento del nivel de BHB en la sangre y que éste, a su vez, haya causado un alto porcentaje de cetosis subclínica(6,19,20). Esto último puede también haber favorecido un mayor riesgo de enfermedades como el hígado graso y la cetosis(6,10,20). Por otra parte, las vacas GG tuvieron 50 % menos mastitis que las vacas del grupo de control. Esto puede obedecer a que las vacas del grupo de control tenían concentraciones de BHB en la sangre de ≥ 0.6 mmol/L desde el preparto hasta el inicio de la lactancia, lo cual ha sido reportado como un factor que incrementa la probabilidad de que las vacas presenten enfermedades preparto y por consiguiente una reducción en la producción de leche(6,23). Es probable que esto haya ocurrido porque la cetosis se ha asociado como un factor que incrementa el riesgo de mastitis clínica(14,24). Es más, el incremento de los AGNES (≥ 0.8 mEq/L) es otro factor de riesgo asociado con otras enfermedades como la metritis, la mastitis y la cetosis clínica(4,6). Ciertamente, cualquier desequilibrio en los niveles de energía y la condición de salud reduce la respuesta inmune compensatoria de las vacas y puede impedir que contrarresten suficientemente cualquier agravio a la salud que las ponga en riesgo(25). Hay estudios que han demostrado una relación entre las concentraciones altas de AGNES y ciertas enfermedades metabólicas e inflamatorias que afectan al sistema inmune(26,27). Por otra parte, el reducido porcentaje de vacas que presentaron retención de placenta, comparado con el de las vacas del grupo de control, podría explicarse por el hecho de que las vacas tratadas tuvieron un metabolismo energético mejor, lo cual a su vez incrementó la funcionalidad de su sistema inmune y, por ende, llevó a una reducción de los procesos inflamatorios(28). Se sabe que las bajas concentraciones de AGNES de las vacas GG elevan el contenido de lípidos en la sangre, mientras que las concentraciones altas de AGNES en la sangre se asocian con una mayor incidencia de enfermedades del periparto (retención de placenta y desplazamiento de abomaso), así como con una predisposición a las enfermedades inflamatorias (mastitis y metritis)(29,30); esto puede haber elevado el porcentaje de incidencia de retención de placenta(22,31). Además, una mayor concentración de BHB en la sangre incrementa el riesgo de enfermedades reproductivas en las vacas(3,4).

Conclusiones e implicaciones Las vacas tratadas con un precursor glucogénico durante el periodo de transición redujeron el impacto del balance energético negativo y, en consecuencia, disminuyeron algunos 416

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problemas de salud, tales como retención de placenta, cetosis subclínica y mastitis al inicio de la lactancia. Los resultados también indican que esa estrategia de suplementación podría ser una alternativa interesante para influir de manera positiva en el equilibrio energético durante el periodo de transición de las vacas lecheras y a la vez mejorar su condición de salud. Todas estas respuestas metabólicas y sanitarias deben contribuir a mejorar la eficiencia reproductiva de las vacas lecheras de alto rendimiento.

Agradecimientos Los autores desean expresar su agradecimiento al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada para cursar la Maestría en Ciencias, y a los estudiantes del Programa de Posgrado en Ciencias de la Producción Agrícola por el apoyo técnico durante la realización de la presente investigación.

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420

https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5118 Artículo

Relación entre la calidad composicional y sanitaria de la leche de bovinos Holstein del trópico alto de Nariño

Henry Armando Jurado-Gámez a* Carlo Eugenio Solarte-Portilla a Álvaro Javier Burgos-Arcos b Aldemar González-Rodríguez b Carol Rosero-Galindo b

Universidad de Nariño. Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia., Cll 18 N° 50-02 Torobajo, Municipio de Pasto, Nariño, Colombia. b

Universidad de Nariño. Colombia.

* Autor de correspondencia: henryjugam@gmail.com

Resumen: La producción agropecuaria necesita obtener productos de alta calidad e inocuos para el consumo humano, lo que constituye una preocupación para la cadena láctea. En la presente investigación se buscó identificar la correlación entre la calidad composicional y la calidad sanitaria de la leche cruda (RCS/ml). La investigación se ejecutó en tres distritos del Departamento de Nariño, Colombia. Para tal efecto el muestreo y la información se recolectaron a lo largo de los años 2016 y 2017. Para determinar la relación se realizó un análisis de componentes principales y luego un diseño de modelos mixtos con las variables seleccionadas. El análisis de componentes principales demostró que existe relación entre las variables composicionales; y el modelo mixto indicó que existe una relación significativa entre el recuento de células somáticas y la calidad de la leche en el trópico alto de Nariño. Se concluyó que un conteo de células somáticas por encima de los 500,000 UFC/ml tiene efectos negativos sobre la proteína, la caseína y la producción de leche. Palabras clave: Inocuidad alimentaria, Salud animal, Salud pública.

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Recibido: 17/11/2018 Aceptado: 29/04/2019

Introducción La producción agrícola mundial requiere de productos seguros de alta calidad para el consumo humano, una búsqueda constante que concierne a todos los componentes de la cadena lechera. Este proceso se inicia en la granja, y se lo debe llevar a efecto a fin de garantizar las mejores condiciones para obtener un producto de calidad óptima(1). En Colombia, las industrias lecheras especializadas están situadas en las zonas altas tropicales como el Altiplano Cundíboyacense, el Altiplano Nariñense y los altos del norte y noreste de Antioquia. Estos sistemas se caracterizan por la presencia de ganado bovino (Bos Taurus), por el uso intensivo de factores de producción (tierra, capital y mano de obra), por el uso de fertilizantes, riego y rotación de pasturas, por el uso de suplementos alimenticios y por dos ordeñas diarias. La mejora de la cualidad higiénica de la leche se efectúa mediante un proceso simple, con el cual se obtienen resultados rápidos que comienzan con la mejora de las prácticas de ordeña para evitar la contaminación de la leche y a la vez mantener perfectamente higienizados los botes lecheros o los tanques de almacenamiento de la leche(2). Este tipo de actividad ganadera debe adherirse al Decreto 616 de 2006 de las regulaciones colombianas, el cual resume los requisitos que deben cumplir las leches de bovino, búfalo y cabra destinadas al consumo humano, a fin de proteger la vida, la salud y la seguridad y prevenir prácticas que puedan desorientar, confundir o engañar a los consumidores(2). En este sentido, Benbrook et al(3) define la leche de alta calidad como aquella que tiene una excelente composición (grasa, proteína, lactosa, vitaminas y minerales), un conteo bajo de microbios (higiénica) y está libre de patógenos y de contaminantes físico-químicos. La leche de calidad es un requisito indispensable para obtener productos de buena calidad, y por lo tanto el rebaño es la primera condición para lograr buenos productos. Según la Resolución 000017 del Ministerio de Agricultura, del año 2012(4), la cualidad higiénica de la leche se refiere al nivel de higiene del proceso mediante el cual se obtiene y se maneja la leche. En este orden de ideas, en la mayoría de los casos el conteo de células somáticas por mililitro (CCS/ml) puede estar asociado con enfermedades como la mastitis, una reacción inflamatoria de la glándula mamaria que produce alteraciones físicas y químicas en la leche, un incremento en el número de células somáticas debido a la presencia de microorganismos patógenos, y cambios tales como la pérdida de la funcionalidad(1).

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Por este motivo, el conteo de células somáticas (CCS) es uno de los parámetros que más influyen en determinar la salud de las ubres y la calidad de la leche. El CCS en la leche aumenta en proporción directa a la gravedad de la enfermedad infecciosa. En una leche que no contiene mastitis subclínica, el CCS es bajo (<100,000 CCS/ ml). El aumento del CCS depende del patógeno que ocasiona la mastitis(5). Un CCS elevado se asocia con inflamación de las ubres, lo cual da lugar a problemas bacteriológicos en la leche, a una alteración en su composición y a cambios en las características de los productos lácteos en comparación con los valores normales(6). Sin embargo, además de su función inmune en la ubre y de las funciones protectoras en la leche, recientemente se ha demostrado que el CCS ejerce una influencia positiva en la composición y en las propiedades tecnológicas de los productos lácteos, que influyen en la calidad final de éstos a través de sus enzimas endógenas(7). En Nariño, como en el resto de América Latina, hay poca información sobre la calidad composicional y sanitaria de la producción y la comercialización de la leche cruda. Este hecho, y la falta de responsabilidad de los productores de leche por la calidad de su producto (pese a la ley colombiana que establece regulaciones de salud y seguridad) aumentan la incertidumbre con respecto a las variables de la calidad de los productos producidos en la región. Con base en lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la calidad composicional e higiénica de la leche cruda recibida de los diversos distritos evaluados del Departamento de Nariño, así como observar la relación entre la calidad sanitaria de la leche y su perfil composicional.

Material y métodos Localización Se evaluó información de 87 granjas especializadas en la producción de leche. Estas granjas están distribuidas entre tres distritos que pertenecen al Departamento de Nariño: 39, en el distrito de Guauchucal, 24 en Pasto y 24 en Pupiales. Estas áreas geográficas están ubicadas a una altitud de entre 2,527 y 3,180 msnm, y su temperatura promedio anual oscila entre 8 y 12 ºC(8).

Selección de las muestras Las granjas seleccionadas manejan un sistema estandarizado de registro de información sobre las ordeñas (dos veces al día) y aplican un programa de manejo rutinario de la prueba CMT. Se evaluaron un total de 11,293 muestras de 1,659 lactancias de vacas Holstein de los distritos de Guachucal, Pasto y Pupiales. Se determinaron diversas variables, incluyendo la precipitación (mm/mes), la producción de leche (kg), la densidad de ésta (g/ml), los días de lactancia, el intervalo entre partos, la edad de la vaca (en años), el número de partos, los kilogramos de grasa, proteína, caseína, los sólidos totales y el conteo de células somáticas (CCS/ml).

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Las muestras se tomaron en el momento de la ordeña, y fueron identificadas, conservadas y transportadas de acuerdo con el protocolo establecido por CORPOLAC. Se realizaron muestreos cada tres semanas en cada una de las granjas. Se las analizó a nivel composicional y sanitario en los laboratorios del grupo de investigación MEGA (Mejoramiento Genético Animal), ubicados en la sede Torobajo de la Universidad de Nariño. Las muestras de leche se analizaron en un equipo MilkoScan® FT1, y el perfil composicional de la leche se determinó según el protocolo establecido por el fabricante del equipo. Para este proceso se utilizó una muestra de 100 ml de leche cruda de vaca (procedimiento diario SGC-PR-04 para el manejo del equipo MilkoScan FT1). El análisis del perfil sanitario se creó utilizando equipo EkoMilk Scan®, de acuerdo con el protocolo establecido por el fabricante (procedimiento diario SGCPR-05 para la operación del equipo EKOMILK SCAN; SGC-FT-02, datos técnicos de EKOMILK SCAN). Para el conteo de células somáticas se utilizó una prueba PortaSCC®.

Análisis estadístico Los datos se evaluaron mediante estadísticas descriptivas. Se determinó mediante una correlación de Pearson la relación entre las variables tras la estandarización de las mismas a fin de garantizar un mejor ajuste de los resultados. Los valores de grasa, proteína, sólidos totales y caseína se convirtieron a kilogramos utilizando la fórmula propuesta en la resolución 000017 emitida en 2012 por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR)(4): Valor en kg valor % ∗ densidad de la leche ∗ 10 Se utilizó la densidad para convertir a kilogramos el valor de la producción, la cual se expresa en litros. Kg de leche densidad ∗ volumen (l) La variable conteo de células somáticas se transformó en puntaje de células somáticas utilizando la fórmula propuesta por Ali y Shook(9), a fin de corregir la normalidad de la variable puntaje de células somáticas (PCS): PCS ((log 2 (CCS/100.000)) + 3 La relación entre las variables se determinó mediante un análisis de componentes principales (ACP) con rotación (método varimax) a fin de identificar los grupos relacionados. Con las variables seleccionadas mediante el ACP se creó un modelo mixto que utilizó la granja y el animal anidado en ésta como factores aleatorios, y la precipitación con los niveles de la temporada de lluvias y la de secas y el conteo de células somáticas como factores fijos. El CCS se dividió en cuatro categorías como sigue: <2’000,000, 201,000 a 5000,00, 501,000 a 999,000 y >1’000,000. La proteína, la grasa, la caseína, los sólidos totales y la producción se consideraron como variables dependientes(10). Se llevaron a cabo análisis estadísticos con el paquete estadístico SPSS(11).

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Resultados El Cuadro 1 muestra la media y el error estándar de la media de las variables, y los Cuadros 2, 3 y 4, la correlación. Las medias para los tres distritos indican que la densidad fue la misma. Los resultados para la precipitación, los sólidos totales, los días de lactancia, el intervalo entre partos, la edad y el número de partos fueron similares. Por el contrario, los datos recopilados para la producción, la grasa, la proteína y la caseína variaron; los valores más altos se encontraron en el distrito de Pupiales, seguido del distrito de Pasto y, por último, del de Guachucal. Cuadro 1: Estadísticas descriptivas de los parámetros composicionales y de producción Guachucal Pasto Pupiales Media EEM Media EEM Media EEM Precipitación, mm/mes 101.691 0.5511 99.749 0.9630 101.980 1.4078 Producción, kg 16.592 0.0730 19.621 0.1366 20.673 0.1951 Densidad, g/ml 1.031 0.0001 1.031 0.0002 1.031 0.0001 Días de lactancia, 182.427 1.2939 173.892 1.9738 163.128 2.9465 Intervalo entre partos, 452.668 1.3196 431.900 1.9461 431.901 3.0784 días Años 5.754 0.0258 5.635 0.0467 5.593 0.0653 Número de partos 2.918 0.0195 3.034 0.0376 3.020 0.0482 Grasa, kg 0.653 0.0030 0.755 0.0054 0.775 0.0075 Proteína, kg 0.560 0.0023 0.640 0.0042 0.693 0.0064 Sólidos totales, kg 2.133 0.0092 2.130 0.0220 2.585 0.0253 Caseína, kg 0.426 0.0018 0.831 0.0153 0.557 0.0056 CCS/ml 3.313 0.0104 3.209 0.0141 3.350 0.0261 EEM= error estándar de la media; CCS= conteo de células somáticas por mililitro.

La correlación muestra que las variables composicionales y de producción están altamente relacionadas y que este conjunto de variables tiene una relación negativa con los días de lactancia. También hay una relación altamente significativa (P<0.01) entre los días de lactancia y el intervalo entre partos, así como entre el número de partos y la edad. Por último, el conteo de células somáticas muestra una relación significativa (P<0.05) con la producción, la proteína y la caseína. Las demás variables muestran una baja correlación.

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Cuadro 2: Matriz de correlación de Guachucal Pr1 Pr1 Pr2 D Dl

1 0.02 0.01 7 0.00 4

Iep

0.02

0.01

Pr2

Iep

Pr3

CC S

1 0.009 .458* .291* 0.068

1 0.031 0.129 0.171

1 .694* *

0.129

1 0.156 *

0.01

0.111

0.02

.852*

Pr3

C CC S

0.01 6 0.01 9 0.02 7 0.01 2

.949* *

.974* *

.962* *

0.254 *

0.116

.229*

0.05 5

0.13 2

0.063

.335*

.231*

0.05 9

0.13 7

.864* *

0.036

.418*

.278*

0.04 6

0.13 2

.934*

.967*

0.053

.342*

.236*

0.06 3

0.14 2

.861*

.996*

.971*

0.123

0.14 5

0.12 8

0.02 9

0.386

0.05 4

0.048

0.357

0.135

0.059

.922* *

0.019

0.015

1 0.394

Pr1= precipitación, Pr2= producción, D= densidad, Dl= días de lactancia, Iep= intervalo entre partos, A= años, Np= número de partos, G= grasa, Pr3= proteína, St= sólidos totales, C= caseína, CCS= conteo de células somáticas.

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Cuadro 3: Matriz de correlación de Pasto Pr1

Pr2

Pr1

Pr2

0.007

-0.011 -0.023

Dl Iep

Iep

Pr3

CCS

-0.009 -0.455

0.036

0.054

0.081

0.566*

-0.240

-0.012 -0.017

-0.047 0.180

o.020

0.073

-0.088 0.045

0.007

0.830** -0.061 -0.381* -0.224 -0.040 **

Pr3

0.017

0.944

0.012

0.970** 0.002

1 *

0.011

0.907

CCS -0.008 -0.234

0.048

-0.352

0.174

0.105

0.910** 1 0.019 1 0.022 0.839** 1

-0.220 -0.048

-0.439* -0.257 -0.054

0.042

-0.324

-0.006 0.125

0.026 0.922** 0.962

0.102

0.032 0.785** 0.942

-0.205 -0.029 0.131

0.106 -0.117

-0.206

0.891 *

-0.112 -0.213* 1

Pr1= Precipitación, Pr2= producción, D= densidad, Dl= días de lactancia, Iep= intervalo entre partos, A= años, Np= Número de partos, G= grasa, Pr3= proteína, St= sólidos totales, C= caseína, CCS= conteo de células somáticas.

Cuadro 4: Matriz de correlación de Pupiales Pr1

Pr2

Pr1

Pr2

0.021

0.106

0.063

-0.046 -0.389

Iep

-0.013 -0.253* 0.165*

-0.020 -0.040 -0.010 0.070

0.080

Pr3

CCS

1 *

Iep

0.024

1 0.651** 1

-0.180* 0.159* -0.185

0.786** 0.076 **

0.002

0.179*

0.069

0.871** 1

-0.312* -0.264* -0.001

0.075 1

Pr3

0.022

0.949

0.126

-0.263* -0.203* -0.064

0.047 0.790** 1

0.081

0.947** 0.124

-0.344* -0.272* -0.087

0.030 0.884** 0.942** 1

-0.125 0.659** 0.038

-0.230* -0.085

0.142 0.512*

CCS -0.001 -0.183

-0.055

0.069

0.070

0.122 0.232

0.134 -0.071

0.670** 0.509 -0.189

-0.106 -0.207* 1

Pr1= Precipitación, Pr2= producción, D= densidad, Dl= días de lactancia, Iep= intervalo entre partos, A= años, Np= Número de partos, G= grasa, Pr3= proteína, St= Sólidos totales, C= caseína, CCS= conteo de células somáticas.

Los Cuadros 5 y 6 muestran los resultados del análisis de componentes principales. Para los tres distritos se analizaron cuatro componentes, que representan 79.97, 77.04, y 75.53 % de la variabilidad explicada, para Guachucal, Pasto y Pupiales, respectivamente. Como en el análisis de correlación, los resultados muestran que la grasa, la proteína, la caseína y los sólidos totales están altamente relacionados y representan el primer eje (composicional). La edad y el número de partos constituyen el segundo eje, y el tercer eje está formado por las variables días de

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lactancia e intervalo entre partos. No obstante, la relación entre los últimos dos ejes puede ser una consecuencia del tiempo. Cuadro 5: Resultados de la varianza observada en los ejes utilizados Extracción Inicial Guachucal Pasto Pupiales Precipitación 1.000 0.856 0.881 0.856 Producción 1.000 0.953 0.946 0.935 Densidad 1.000 0.361 0.313 0.473 Días de lactancia 1.000 0.772 0.704 0.741 Intervalo entre partos 1.000 0.810 0.738 0.820 Años 1.000 0.928 0.935 0.901 Número de partos 1.000 0.910 0.937 0.868 Grasa 1.000 0.853 0.823 0.785 Proteína 1.000 0.965 0.959 0.939 Sólidos totales 1.000 0.991 0.980 0.930 Caseína 1.000 0.969 0.894 0.624 CCS 1.000 0.223 0.133 0.172 CCS= conteo de células somáticas.

Cuadro 6: Variabilidad de los componentes Matrices de componentes rotados Guachucal Pasto Pupiales 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2

Precipitación

0.086

-.091

.916

-.168

.019

.397

.435

Producción Densidad Días de lactancia

0.026 0.951

-.032

.086

.062

.918

.029

-.043

.052

.936

.956

.054

-.188

.008

.956

.026

-.180

.003

.138

-.368

.398

.219

.096

-.214

.399

-.316

-.323

.090

.806

-.095

-.327

.087

.767

.041

-.263

0.036 0.311 0.091

.812

-.070

0.123

.887

.007

0.172

Intervalo entre partos

-.168

.084

.879

-.043

-.126

.098

.833

.139

-.136

Años

.050

.954

.122

-.010

-.007

.958

.133

-.006

0.026

0.939

.116

-.063

0.114

0.924

-.021

-.042

0.862

0.002 0.064 0.087 0.106

-.167

.121

-.056

.032

-.158

.132

.012

-.238

0.012

0.046

.248

Número de partos

.128

.945

.025

.009

.056

.966

.019

.032

.917

.034

-.102

-.004

.893

-.007

-.162

.023

.980

.026

-.064

.006

.975

-.028

-.080

-.008

.985

.021

-.141

.013

.975

-.020

-.169

.002

Caseína

.981

.031

-.075

-.002

.943

-.014

-.064

-.011

0.745

CCS

0.18 4

-.226

0.071

Grasa Proteína Sólidos totales

0.08 9

.036

-.345

0.152

.196

0.062

0.964 0.938

El cuarto eje está representado por la precipitación. Es necesario señalar que el conteo de células somáticas no está bien representado en algunos de los cuatro componentes evaluados; sin

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embargo, se observa que contribuye a los componentes uno y cuatro en los tres distritos, lo cual indica cierto grado de relación entre estos componentes. El Cuadro 7 muestra los resultados del análisis del modelo mixto. Las variables grasa y sólidos totales no se vieron afectadas por la temporada ni por el CCS (P>0.05). En el caso de la producción, la proteína y la caseína, los resultados muestran que el conteo de células ejerce una influencia significativa (P<0.05).

Parámetro Producción Grasa Proteína Sólidos totales Caseína

T 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1

Cuadro 7: Coeficientes del modelo mixto CCS (rango) Valor de P ≤200 201-500 501-999 ≥ 1000 T CCS 18.02 16.92 15.93 14.84 0.755 0.048 17.97 17.05 15.76 14.21 0.684 0.672 0.673 0.672 0.315 0.123 0.692 0.683 0.685 0.681 0.597 0.577 0.559 0.541 0.757 0.011 0.591 0.573 0.555 0.545 2.216 2.122 2.197 2.181 0.248 0.148 2.168 2.131 2.148 2.105 0.530 0.483 0.446 0.424 0.103 0.022 0.543 0.494 0.450 0.429

T*CCS 0.444 0.355 0.827 0.328 0.201

T= temporada (1: de secas, 0: de lluvias); CCS= conteo de células somáticas; T*CCS: Efecto de la interacción.

Discusión Los resultados se interpretaron tomando en cuenta las regulaciones colombianas actuales, que giran en torno al Decreto 616(12) y Resolución 000017(4), responsable de garantizar la seguridad del consumo humano de leche y la calidad composicional y sanitaria de la leche. Con base en la información proporcionada por el análisis estadístico, se puede establecer que la calidad composicional está estrechamente relacionada con la producción de leche. También se observó que el CCS no afecta la calidad composicional de ésta, y tampoco hay evidencia que apoye esta premisa. En este sentido, diversos autores encontraron valores de 24.28 kg de leche, que son superiores a los hallados en los tres distritos(13). Manterola(14) reporta una producción promedio de leche de 20 kg/d/vaca y señala que la edad es un factor menor cuando la tasa de remplazo es normal, pero tiene un efecto mayor sobre el volumen de producción y, por ende, sobre el contenido de sólidos totales. Esto fue comprobado mediante la elevada correlación ente la producción y los parámetros composicionales de la leche. Diversos autores mencionan también que la producción lechera de una vaca es resultado de la relación entre el medio ambiente y la herencia(15). No obstante, la precipitación no mostró relaciones significativas con estas

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variables; como se observa en el diagrama de los dos componentes del ACP, la precipitación está muy cerca del punto de corte de los dos ejes de coordenadas. El Ministerio de Protección Social ha establecido, mediante el Decreto 616, que la densidad de la leche cruda a 15 ºC oscila entre 1.030 y 1.033 g/cm3. En este sentido, la densidad de la leche de las muestras evaluadas se encuentra dentro del marco normativo. Otros autores encontraron un valor promedio de 1.032 g/cm3 en las muestras de leche evaluadas y concluyeron que la leche de animales sanos no presenta variación en el valor de densidad con respecto a la de los animales con mastitis subclínica(2). Sin embargo, en los animales con mastitis la densidad reflejada se ve afectada por valores inferiores a 1.029 g/ml. Un estudio indica que la composición de la leche determina su calidad nutricional e industrial, la cual afecta directamente la rentabilidad y competitividad de los sistemas de producción lechera(16). La composición depende de la disponibilidad de los precursores de la sangre que llegan a la glándula mamaria, los cuales pueden ser manipulados mediante la nutrición para alterar los componentes de la leche, si bien este factor no fue evaluado en la presente investigación. Se encontró que la leche cruda recibida de los tres distritos cumple con los parámetros establecidos por el Decreto 616 de 2006 en lo que concierne a la grasa. El valor promedio de los distritos supera el reportado por otros autores con un promedio de 0.577 kg de grasa, lo que implica un valor óptimo de óptimo de grasa en la leche para los productos lácteos de vacas Holstein(17). Por otra parte, Gallego-Castro et al.(13) reportaron valores de 0.84 kg de proteína de leche para las vacas Holstein, y Manterola(14) reportó 0.90 kg de leche por vaca por día. Un estudio sugiere que las variaciones en la producción de grasa de la leche en un grupo de vacas alimentadas bajo condiciones similares dependen de la capacidad metabólica individual de cada animal(18). No obstante, hay que tener en cuenta que los valores observados en los distritos de Pasto y Pupiales exhiben niveles de grasa por día por vaca superiores a los del distrito de Guauchucal. Estas diferencias pueden ser resultado del manejo de los rebaños en el área, si bien el presente estudio no puede corroborar esta hipótesis, puesto que no fue posible incluir variables de manejo en el análisis. Por otra parte, las adaptaciones bioquímicas del metabolismo de los lípidos dependieron directamente de la etapa de lactancia de las vacas. Los elevados valores de grasa en la leche durante las etapas tempranas de la lactancia (5.49 %) sugieren una movilización de los lípidos a partir de los depósitos de grasa corporal, un factor que no se observa en la presente investigación. Los valores proteicos cumplen con los parámetros establecidos por el Decreto 616 de 2006. Otros autores reportan un menor contenido de proteína por día por vaca, con un valor promedio de 0.451 kg de proteína(17). A este respecto, otros artículos encontraron valores de 0.67 y 0.7 kg de proteína(13,14); estos valores se aproximan a los hallados en la presente investigación. Varios autores afirman que la concentración de proteína en la leche no presenta cambios notorios con el manejo nutricional(19). Sin embargo, se ha evaluado el efecto de la harina de soya sobre el

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uso del nitrógeno y la producción de la vacas Holstein, y se ha llegado a la conclusión de que la suplementación con harina de soya no ha incrementado el rendimiento de leche y proteína por encima del nivel de 16.5 %. Se ha analizado el efecto de las variantes genéticas y haplotipos sobre la composición proteica de la leche como una alternativa al manejo nutricional. En un estudio realizado en 1,912 vacas Holstein, los autores indicaron una asociación entre los genotipos β-CN y κ-CN halotipo A2B y el rendimiento proteico y la concentración de proteína por cada litro de leche, respectivamente(20). Los autores mencionaron que la selección de estos genotipos y haplotipos daría como resultado vacas productoras de una leche más adecuada para la elaboración de quesos. El autor de otra investigación sugirió que podría ser útil conocer la variabilidad genética cuando se altera la composición de la proteína de la leche, ya que los parámetros genéticos de las seis proteínas principales de la leche, determinados mediante electroforesis capilar en zona, están muy relacionados con dicha alteración(21). Según García et al.(19), esta información sugiere la posibilidad de modificar la composición proteica de la leche de vaca mediante la cría selectiva, que a su vez ofrece la oportunidad de satisfacer las nuevas demandas de los consumidores. Los resultados de la caseína arrojaron un valor promedio de 0.454 kg, valor deseable en la producción lechera y superior a los hallados por otros autores, del 2.4 %(22). Investigaciones recientes señalan que la caseína constituye aproximadamente un 78 % de las proteínas de la leche y se precipita cuando ésta se acidifica a un pH de 4.6(19). También afirman que la caseína está ligada principalmente al fosfato de calcio Ca3(PO4)2 en una estructura sólida y esponjosa llamada micela de caseína, un importante componente para la elaboración de quesos. El tratamiento de la leche con la enzima quimosina del cuajo de ternera desestabiliza la micela a medida que la κ-caseína (κ-CN) pierde su región hidrofílica por proteólisis en el segmento caseinomacropéptido, facilitando la adición del fragmento para-κ-CN(23). Dado que este componente proteico es fundamentalmente hidrofóbico, el contenido de caseína influye directamente en el tiempo de coagulación de todos los quesos y, por lo tanto, en la calidad y el rendimiento de estos(24). En cuanto a los sólidos totales, se encontró que la leche cruda proveniente de los tres distritos cumple con los parámetros establecidos por el Decreto 616 de 2006, lo que indica una excelente calidad de la leche(4,12). De manera similar, otros autores reportaron un valor de los sólidos totales de 1.351 kg, inferior al encontrado en este estudio(25). No se adoptó un conteo estándar de células somáticas, ya que éste es inexistente en la legislación colombiana. Según el Decreto 616 de 2006 y la Resolución 00017 de 2012 del MADR, los beneficios del CCS son voluntarios y discrecionales para aquellas compañías que deseen mejorar este aspecto de la calidad de la leche. Aun así, algunas compañías, como Colanta, reportan que los valores por debajo de 400,000 CCS/ml y por encima de 200,000 CCS/ml son recompensados con 0.007 USD por litro. Además, cuando los valores son menores

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de 200,000 CCS/ml, el incentivo se incrementa a 0.01 USD. Cuando exceden los 1,000,000 CCS/ ml, no se recibe la leche y se hace una deducción(24). Actualmente, se considera que una cuarta parte de la glándula mamaria está sana !—aquella que no muestra ningún cambio patológico externo — cuando la leche está libre de microorganismos patógenos y tiene un nivel de células somáticas de <100,000 CFU/ml(26). Los resultados del modelo mixto indican que los conteos superiores a 500,000 CFU/ml afectan la calidad composicional de la leche, reduciendo la producción y los contenidos de proteína y caseína de la leche. En este sentido, otros estudios encontraron resultados similares en las vacas Holstein canadienses, lo que demuestra que la mastitis subclínica afecta la calidad composicional de la leche(27).

Conclusiones e implicaciones El conteo de células somáticas afecta las variables proteína, caseína y producción en los sistemas especializados de Guachucal, Pasto y Pupiales.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5686 Artículo

Caracterización de Aspergillus flavus y cuantificación de aflatoxinas en pienso y leche cruda de vacas en Aguascalientes, México

Erika Janet Rangel-Muñoz a Arturo Gerardo Valdivia-Flores a* Onésimo Moreno-Rico b Sanjuana Hernández-Delgado c Carlos Cruz-Vázquez d María Carolina de-Luna-López a Teódulo Quezada-Tristán a Raúl Ortiz-Martínez a Netzahualcóyotl Máyek-Pérez e

Universidad Autónoma de Aguascalientes, Centro de Ciencias Agropecuarias, Av. Universidad 940, Col Cd. Universitaria, 20131, Aguascalientes, México. b

Universidad Autónoma de Aguascalientes. Centro de Ciencias Básicas. Aguascalientes, Aguascalientes, México. c

Instituto Politécnico Nacional. Centro de Biotecnología Genómica. Reynosa, Tamaulipas, México. d

Instituto Tecnológico El Llano, Municipio de El Llano, Aguascalientes, México.

Universidad México Americana del Norte A. C. Coordinación de Investigación. Reynosa, Tamaulipas, México.

Autor de correspondencia: avaldiv@correo.uaa.mx

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Resumen: La contaminación de productos agrícolas y pecuarios con aflatoxinas (AF) está distribuida mundialmente. Las AF son tóxicas, inmunodepresoras y carcinogénicas, pero en México es escasa la información sobre Aspergillus flavus, principal hongo que las produce. El objetivo fue caracterizar morfológica, molecular y aflatoxigénicamente aislados de A. flavus y cuantificar AF en pienso y en leche de vacas Holstein en Aguascalientes (México). Se seleccionó por conveniencia una unidad de producción lechera (2,749 vacas) y se recolectaron muestras mensuales (24 meses) de ingredientes alimenticios y ración total mezclada (n= 267), leche cruda (n= 288) y suelo agrícola (n= 40), las cuales se cultivaron (PDA) mediante vaciado en placa con diluciones seriadas. Los hongos se caracterizaron mediante MEB, TLC y vapores de amonio en agar coco; se secuenciaron los genes de calmodulina y regulador de la ruta biosintética de AF, así como la región de los espaciadores internos de la transcripción. Se cuantificaron AF en pienso con HPLC y en leche con ELISA. Se caracterizaron molecularmente 283 aislados fúngicos; 88 resultaron ser Aspergillus spp, de los que 5 fueron A. flavus con capacidad aflatoxigénica y uno no aflatoxigénico. El 99.3 % de las muestras de alimento y 39.9 % de las muestras de leche presentaron niveles detectables de AF (14.8 y 0.021 µg/kg). Las vacas ingirieron diariamente 621 µg de AF y eliminaron el 0.09 % como aflatoxina M1 en leche. Lo anterior sugiere que la ocurrencia A. flavus aflatoxigénico en el alimento de vacas lecheras conduce a una amplia contaminación por AF de las dietas y de la cadena alimenticia. Palabras clave: Aflatoxinas, A. flavus, Alimentos lácteos, Gen de calmodulina, Gen regulador de aflatoxinas.

Recibido: 04/09/2018 Aceptado: 29/04/2019

Introducción La lechería bovina mexicana se desarrolla especialmente en una provincia biogeográfica denominada Altiplano central mexicano(1). En el interior de esta región, las unidades de producción lechera (UPL) enfrentan problemas de insuficiencia en la producción, rentabilidad económica y de inocuidad de los productos(2). Dentro de los problemas de inocuidad se ha resaltado la presencia de aflatoxinas (AF) porque ocasionan un fuerte impacto económico asociado a la contaminación de las cosechas agrícolas, al deterioro de la salud de los animales, la disminución de su productividad, así como a la contaminación de alimentos de origen animal(3). Las AF tienen propiedades hepatotóxicas, nefrotóxicas e

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inmunosupresoras, y son consideradas como los carcinógenos naturales más potentes que se conocen(4). Las AF se han cuantificado en piensos, leche y productos lácteos destinados para la alimentación de la población humana mexicana(5-7). Lo cual sugiere que la presencia de AF en el pienso de las vacas es un problema usual en las UPL que induce a la contaminación de la leche con los metabolitos de AF. Cuando las vacas lecheras ingieren productos agrícolas contaminados con AF, los mecanismos enzimáticos bioactivan la micotoxina mediante la formación de un epóxido que reacciona con las estructuras celulares y ácidos nucleicos dañando su integridad(4). El epóxido reactivo puede también neutralizarse mediante su conjugación con glutatión o su excreción como un metabolito que se elimina en la leche principalmente como aflatoxina M1 (AFM1); también AFM1 es considerada como un agente tóxico y carcinogénico para los humanos(4). Las AF son metabolitos secundarios de varios hongos filamentosos del género Aspergillus, los cuales se encuentran distribuidos mundialmente y contaminan una gran variedad de productos agrícolas, especialmente los cereales(8). También A. flavus ha sido identificado en México, tanto en suelo agrícola y como en grano de maíz(9,10). La reproducción asexual del género Aspergillus ha sido descrita previamente(11,12), así como también su filogenia, morfología y ciclo biológico(8,13). Aunque Aspergillus flavus es considerado la especie con mayor capacidad de producción de aflatoxinas(14), también hay cepas de A. flavus sin capacidad aflatoxigénica, así como otras especies de Aspergillus que producen AF (A. parasiticus, A. nomius, A. pseudonomius, A. arachidicola, A. bombycis, A. pseudotamarii, A. minisclerotigenes y A. togoensis)(15). La capacidad aflatoxigénica se expresa principalmente bajo condiciones de estrés ambiental(16,17), siempre y cuando su genotipo incluya la información involucrada en la cadena metabólica de producción de AF(18,19). Una estrategia para la identificación molecular de las diferentes especies del género Aspergillus es el empleo del gen de la calmodulina (CaM), los fragmentos correspondientes a la región de los espaciadores internos de la transcripción (ITS) y el gen regulador de la ruta biosintética de aflatoxinas (aflR)(8,20). El objetivo de este trabajo fue caracterizar morfológica, molecular y aflatoxigénicamente aislados de Aspergillus flavus obtenidos de unidades de producción lechera del altiplano central mexicano.

Material y métodos Lugar de estudio El estudio se realizó con un diseño descriptivo, longitudinal y no experimental. Se seleccionó una unidad de producción lechera con el método no probabilístico por conveniencia y se le 437

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dio seguimiento por 24 meses. La UPL se ubicó en el Altiplano Central Mexicano (21°48’N, 102°03’ O; 1986-2008 msnmm), con clima templado-seco y semicálido-semiseco, con lluvias en verano, temperatura promedio de 18.4 º C, precipitación pluvial anual de 518.4 mm y altitud máxima de 2,300 msnm. En el periodo de observación, la UPL contó con un promedio de 2,749 vacas Holstein, alojadas en estabulación libre dentro de corrales limitados con cercas metálicas, áreas sombreadas y comederos al libre acceso. El proceso de ordeño de las vacas se realizó con equipo automatizado obteniendo una producción promedio diario por vaca de 28.1 litros. La producción láctea se destinó a plantas agroindustriales de la región. Las dietas alimenticias se elaboraron como una ración total mezclada (RTM) en una fábrica de piensos, donde el ensilaje de maíz y el concentrado se incorporaron en carros mezcladores. La RTM se formuló para satisfacer los requerimientos nutricionales de las vacas lecheras. El maíz para ensilaje se obtuvo directamente de las áreas agrícolas de la UPL, mientras que el concentrado proteico-energético se adquirió en la Asociación Local de Ganaderos Lecheros de Aguascalientes; empleando como principales ingredientes canola, soya, maíz rolado, sorgo, pasta de soya, grano de maíz seco destilado, semilla de algodón, heno de alfalfa y avena, así como premezcla de vitaminas y minerales.

Obtención y manejo de muestras Se obtuvieron un total de 288 muestras alimenticias (1.0 kg): ración total mezclada (RTM), alimento concentrado y ensilaje de maíz; se secaron en una estufa con circulación forzada de aire (OF-22G JEOI-TECH, Lab Companion, Corea). Las muestras se pulverizaron (500-800 µm) en un molino universal de funcionamiento continuo (MF series 10 Basic, IKA®-Werke, Alemania) y se almacenaron en refrigeración (4-5 °C) hasta su procesamiento (< 7 días). Durante el ordeño (matutino y vespertino) se obtuvieron un total de 288 muestras de leche cruda, directamente del tanque recolector (500 ml), por cada lote productivo (altas, medias y bajas). Las muestras se transportaron en refrigeración y se conservaron en congelación (-20°C) hasta su procesamiento (< 7 días). Con ayuda de un sacabocado para suelo, se muestrearon cinco parcelas agrícolas, eligiendo cuatro puntos de muestreo sobre la superficie de cada parcela y tomando cinco sub-muestras de 100 g en cada punto, a 3-30 cm de profundidad. Las cinco sub-muestras se reunieron en una bolsa con cierre hermético. Finalmente se tamizaron (500-800 µ) y se conservaron en refrigeración hasta su procesamiento.

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Cuantificación de aflatoxinas Las muestras de alimento se analizaron de acuerdo con el método oficial 990.33 de la AOAC(21), empleando columnas de fase sólida (SPE; SupelcleanTM LC-18 SPE tube, SigmaAldrich, EUA). El eluato extraído de las muestras derivatizadas con ácido trifluoroacético se analizó mediante HPLC (Límite mínimo de detección 2 µg/kg) con detector de fluorescencia (Bomba binaria Varian Pro Star; FP detector 2020, Varian Associates Inc., Victoria, Australia), columna C18 y guarda columna (LC-18 y LC-18; Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA). Los datos de cuantificación se obtuvieron a través del software Galaxie (Ver. 1.9.302.530) y las concentraciones de AF se calcularon mediante curvas estándar de AF purificadas (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). La AFM1 se cuantificó en la leche cruda con la técnica de ELISA competitivo empleando un kit comercial (Ridascreen fast® aflatoxin M1 R-1121, R-Biopharm, Alemania; rango de detección 0.005-0.08 µg/kg). De acuerdo a las instrucciones del fabricante, las muestras se homogeneizaron y se centrifugaron. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector de microplacas de ELISA (BioTek Instruments, Inc., USA). Los resultados se interpretaron con base a la curva de calibración realizada con AFM1 purificada (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Aislamiento y caracterización fúngica Los hongos se aislaron empleando la técnica de vaciado en placa con cuatro diluciones seriadas en agua peptonada estéril(22); las muestras se sembraron en agar papa y dextrosa (PDA), extracto de malta con rosa de Bengala y Czapeck; se incubaron (28 °C) en oscuridad durante 7 días. Se aislaron y purificaron las colonias y se identificaron las características morfológicas microscópicas congruentes con la descripción del género(13). Los aislados congruentes con A. flavus(8,13) se sometieron al proceso de fijación con glutaraldehído (2%), deshidratación con alcoholes graduales y acondicionamiento con un secador de punto crítico (Samdri 795, Tousimis Research Rockville, Meryland) y un metalizador (Desk II, Denton Vacuum, EUA); se digitalizaron en un microscopio electrónico de barrido (JSM-5900 LV, JEOL, EUA) y se realizaron diez mediciones de cada estructura (estípite, vesícula, espora, esclerocio y fiálide) mediante un software (JEOL Scanning Electron Microscope). Las estructuras morfológicas de los aislados identificados se compararon contra cepas conocidas de A. flavus, denominadas AF-36, AF-Cuatitlán (AF-C) y AF-Tamaulipas, (AF-T)(14,23). Las cepas obtenidas en este estudio fueron registradas en el NCBI (National Center for Biotechnology Information) con las claves de accesión respectivas. La capacidad aflatoxigénica de los aislados se caracterizó mediante cromatografía en capa fina (TLC)(24); se usaron placas de sílica gel sin indicador de fluorescencia (Z265829, SigmaAldrich, EUA) activadas en una estufa de alta temperatura (OF-22G JEOI-TECH, Lab

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Companion, Corea). Las placas con estándares purificados de AF (A6636-50MG, Sigma Aldrich, EUA) se colocaron dentro de una cámara cromatográfica con fase móvil cloroformo:acetona:isopropanol (85:10:5, v/v/v) durante hora y media. Finalmente, las placas secas se visualizaron en un transiluminador. También se utilizó la técnica de vapores de amonio en agar coco de acuerdo a la metodología descrita anteriormente(25). Se inocularon aislados monospóricos en agar coco estéril y se dejaron incubar en oscuridad (30 °C, 5-7 días). Posteriormente, se agregó hidróxido de amonio (200 µl; J.T. Baker, México) al 25% en la tapa de las cajas Petri y se observó la distribución y la intensidad del color. La presencia de color se tomó como indicativo de producción de AF.

Análisis molecular La extracción de ADN genómico de cultivos monospóricos de Aspergillus spp. se realizó siguiendo métodos estandarizados previamente(26). La calidad de ADN obtenido se visualizó con electroforesis (45 min a 85 volts) en gel de agarosa (1%) con amortiguador TAE 1X y se cuantificaron comparando contra concentraciones conocidas de ADN de fago λ (Thermo Fisher Scientific, MA USA). La visualización del ADN se realizó en un fotodocumentador (Bio-Rad Molecular Imagen®- Gel Doctm XR, CA EUA) con el software Quantity One versión 4.6.7. Siguiendo los protocolos descritos previamente(27,28), se realizó la amplificación de un fragmento correspondiente a la región de espaciadores internos de la transcripción (ITS; ITS1-5.8S-ITS2 RNAr) con los iniciadores universales ITS1 (5´TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATG -3´); se amplificó el gen de la calmodulina (CaM) con los iniciadores CMDA7F (5´GCCAAAATCTTCATCCGTAG-3´) y CMDA8R (5´-ATTTCGTTCAGAATGCCAGG3´) y se amplificó el gen regulador de la ruta biosintética de aflatoxinas (aflR) empleando los iniciadores aflR-F (5´-GGGATAGCTGTACGAGTTGTGCCAG-3´) y aflR-R (5´TGGKGCCGACTCGAGGAAYGGGT-3´) de Eurofins Genomics, Lousville KY, USA. Para la amplificación fue utilizada la enzima Go-Taq polimerasa (Promega, Madison, WI USA) y un termociclador (modelo 9700 Applied Biosystems). Los productos de PCR obtenidos (ITS, calmodulina y aflR) se separaron por electroforesis en gel de agarosa (1%) y para observarlos se emplearon como intercalantes los reactivos SYBR® Gold y Orange DNA Loading Dye (Thermo Fisher Scientific, MA USA); las bandas resultantes se observaron en un fotodocumentador de imágenes (BIO-RAD Molecular Imagen®- GEL DOCTM XR CA, EUA) con el software Quantity One (versión 4.6.7.). Se incluyeron escaleras marcadoras de peso molecular (Axygen Biosciences, CA, EUA). Los productos de PCR se purificaron con el reactivo ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Afflymetrix, Thermo Fisher Scientific Inc. Santa Clara, California, EUA). Los productos de PCR purificados se secuenciaron en cadenas forward y reverse con el método dideoxi(29). Las muestras se inyectaron en un secuenciador

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(ABI 3730XL Genetic Analyzers) y las secuencias resultantes se registraron en un electroferograma. Los electroferogramas fueron visualizados con el software Chromas Lite y se compararon con los registros del NCBI usando la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).

Análisis estadístico Los datos de cantidad de ración total mezclada, producción lechera, concentración de AF en pienso y leche, así como de las mediciones de las estructuras de cada aislado se sometieron a un análisis de varianza de una vía (ANDEVA) considerando separadamente como factores la época del año y el nivel de producción de leche (alta, media o baja) en el cual se tuvieron lotificadas las vacas. Para determinar las diferencias entre las medias y los intervalos de confianza al 95% se realizó el procedimiento de diferencia honestamente significativa (HSD) de la prueba de Tukey; P<0.05 fue considerado como significativo para todos los análisis estadísticos.

Resultados

Frecuencia de Aspergillus spp Se identificaron un total de 283 aislados fúngicos, 56.8 % provinieron de muestras del pienso de las vacas lecheras y el resto de suelo agrícola (Cuadro 1). Un total de 88 aislamientos (31.1 %) mostraron características morfológicas correspondientes a las descritas para el género Aspergillus; En la Figura 1 se observan los conidióforos, los conidios y las métulas características. También se encontraron aislamientos con morfología compatible con los géneros Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Mucor, Cladosporium, Trichoderma, Alternaria, Curvularia y Bipolaris. Las proporciones respectivas de cada género se muestran en el Cuadro 1.

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Cuadro 1: Géneros fúngicos identificados en muestras mensuales * de una unidad productora lechera en el altiplano central mexicano Género Muestras Aspergillus Penicillium Fusarium Rhizopus Mucor Cladosporium Trichoderma Alternaria Curvularia Bipolaris Total

Suelo

Ensilaje de maíz

Alimento concentrado

Ración total mezclada

Total

No.

40 30 23 20 15 15 5 10 4 0 0 122

-24.6 18.9 16.4 12.3 12.3 4.1 8.2 3.3 0.0 0.0 100

96 16 3 3 4 6 4 0 2 0 0 38

-42.1 7.9 7.9 10.5 15.8 10.5 0.0 5.3 0.0 0.0 100

96 19 4 11 7 4 10 0 1 2 0 58

-32.8 6.9 19.0 12.1 6.9 17.2 0.0 1.7 3.4 0.0 100

96 23 9 2 8 9 10 0 2 1 1 65

-35.4 13.8 3.1 12.3 13.8 15.4 0.0 3.1 1.5 1.5 100

328 88 39 36 34 34 29 10 9 3 1 283

-31.1 13.8 12.7 12.0 12.0 10.2 3.5 3.2 1.1 0.4 100

* Muestras de ingredientes alimenticios: 24 meses, por cuadruplicado. Muestras de suelo: 5 parcelas, por cuadruplicado, 2 temporadas.

Figura 1: Estructuras morfológicas del género Aspergillus

Páneles: A) Conidióforo: Cc = Cabeza conidial, Ee = Estípite, Pe = Célula pie, Mo = Micelio. B) Cabeza conidial uniseriada: Co = Conidio o espora; Fe = Fiálide, Va = Vesícula. C) Cabeza conidial biseriada: Co = Conidio, Fe = Fiálide, Va = Vesícula, Me = Métula.

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Solamente seis aislamientos mostraron una morfología coincidente con A. flavus y provinieron del alimento concentrado (AC1, AC2 y AC3) y del ensilaje de maíz (EM1, EM2, EM3); al ser cultivados en PDA, mostraron una coloración verde olivo con la periferia blanquecina. La mayoría de los aislados (5/6) mostraron presencia de esclerocios de color marrón oscuro, mientras que sólo uno no presentó estas estructuras. Microscópicamente, los conidióforos de A. flavus presentaron cabezas conidiales irradiadas y uniseriadas, el estípite con paredes rugosas, la vesícula esférica, los conidios tenían forma globosa con irregularidades en la superficie y el micelio septado y blanquecino (Figura 2).

Figura 2: Estructuras morfológicas de Aspergillus flavus

Páneles: A) Cc = cabeza conidial, Ee = estípite. B) Va = vesícula. C) conidióforo. Fe = fiálides, Co = conidio. D) Cc = conidio, Fe = fiálide. E) Mo = micelio, So = septo. F) Esclerocio = Eo.

Los seis aislados de A. flavus provenientes de pienso mostraron diferencias significativas en la morfometría de sus estructuras al ser comparadas contra las cepas control (AF-C y AF-T; Cuadro 2). Estas cepas presentaron cabezas conidiales radiadas, con estípite rugosa y vesícula de forma esférica, mientras que AF-C sólo presentó fiálides (uniseriadas) y AF-T fiálides y métulas (biseriadas); la forma de las conidias era globosa con irregularidades en la superficie. Cuatro aislados se clasificaron como cepas L (esclerocios largos > 400 µm), uno como cepa S (esclerocio corto <400 µm) y otro sin esclerocio.

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Cuadro 2: Comparación de las dimensiones de las estructuras morfológicas de aislados de Aspergillus flavus obtenidos de ensilaje de maíz (EM) y alimento (AC) integral de vacas lecheras, así como de las cepas Cuautitlán (C) y Tamaulipas (T) Aislado

Estípite Media

Vesícula LS

Media

Espora LS

Media

Esclerocio

LI LS

Media

Fiálide Media

LI LS

AF-C

237

183 291

33.6

27.5 39.7

3.3

3.1 3.4

418

353 483

5.9

4.9 6.9

AF-T

646

564 727

76.6

67.7 85.5

2.8

2.7 2.9

453

361 545

6.4

4.9 7.8

AF-AC1

313

241 386

54.3

46.3 62.2

3.1

3.0 3.3

592

516 667

5.1

4.4 5.8

AF-AC2

373

292 454

58.2

49.3 67.0

3.0

2.8 3.1

428

352 503

5.1

4.3 5.8

AF-AC3

441

347 534

47.8

37.5 58.0

3.1

2.9 3.3

6.6

5.5 7.7

AF-EM1

331

255 407

50.5

42.1 58.8

3.5

3.4 3.7

4.1 5.5

AF-EM2

218

115 320

38.8

27.6 50.1

3.2

AF-EM3

320

239 401

47.3

38.4 56.2

3.6

268

193 344

4.8

3.1 3.4

672

597 748

5.4

4.1 6.6

3.5 3.8

561

505 617

6.9

6.0 7.9

-- Sin esclerocio- LI, LS Límite inferior y superior de los intervalos de confianza. abcd Medias de columnas con diferente literal muestran diferencias estadísticas significativas (P<0.05).

Los aislados identificados como A. flavus se analizaron por la técnica de TLC y de vapores de amonio en agar coco para identificar la presencia de aflatoxina (Figura 3). Cinco aislamientos (AF-AC1, AF-AC2, AF-AC3, AF-EM2 y AF-M3) tuvieron una reacción positiva a la presencia de AF y el otro (AF-EM1) fue negativo a la producción de aflatoxina en ambas técnicas. Estos resultados coincidieron con la amplificaron del gen aflR. Figura 3: Intensidad de color en medio agar coco al contacto con vapores de amonio de aislamientos Aspergillus flavus a los 4 días de crecimiento

Páneles: A) AF-36, no aflatoxigénico (AF-). B) AF-Cuatitlán y C) AF-Tamaulipas, aflatoxigénico (AF+). D) AF-EM1, AF- aislado de ensilaje de maíz. E) AF-AC2, AF+ aislado de alimento concentrado. F) AF-EM3, AF+ aislado de ensilaje de maíz.

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Análisis molecular

De los 88 aislados identificados morfológicamente como Aspergillus spp., el 49 % amplificó para el gen calmodulina y el 31 % amplificó para el ITS (Figura 4). Los análisis de las secuencias obtenidas mostraron que las especies fueron A. oryzae (45.5 %), A. niger (10.2 %), A. ochraceus (3.4 %), A. pseudodeflectus (4.5 %), A. ustus (10.2 %), A. flavus (6.8 %), A. versicolor (5.6 %), A. nidulans (5.6 %), A. sublatus (4.5 %) y A. sydowii (3.4 %).

Figura 4: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR amplificados del gen calmodulina (Panel A), región de espaciadores internos de la transcripción 5.8S rDNAITS2 (Panel B) y gen regulador de la ruta biosintética de aflatoxinas, aflR (Panel C)

Carriles: MPM) Marcador de peso molecular (100pb). Controles: A. flavus no aflatoxigénico (AF-36) y aflatoxigénicos (Cuautitlán, AF-C; Tamaulipas, AF-T). A. flavus aislados de ensilaje de maíz (EM1, EM2 y EM3) y de alimento concentrado (AC1, AC2 y AC3) destinado a las vacas lecheras

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Los cinco aislados locales identificados como A. flavus aflatoxigénico amplificaron el fragmento de 796 pb para el gen aflR. El análisis de las secuencias de las cepas testigo (AF36, AF-C y AF-T) y de los seis aislados de A. flavus (AF-AC1, AF-AC2, AF-AC3, AF-EM1, AF-EM2 y AF-EM3) mostraron tener un porcentaje de identidad mayor al 90% con aislamientos de A. flavus registrados en la base de datos del NCBI (Cuadro 3).

Cuadro 3: Identidad de los aislados de Aspergillus flavus obtenidos de las dietas alimenticias para vacas lecheras en Aguascalientes, México, al compararlos con secuencias existentes en el Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCBI)a ID del Aislado

Origen

Iniciadorb

Clave de accesión

Coincidencia (%)

Control- AF-36

Control

ITS1

LN482513.1

ITS4

KX550912.1

CMDA7F

AY974341.1

CMDA8R ITS1 ITS4 AFLRF AFLRR

AY974340.1 LC105688.1 KT254587.1 FN398160.1 L32576.1

96 100 99 100 100

ITS1

KX015990.1

100

ITS4 AFLRF AFLRR

KF221065.1 XM_002379905.1 AF441435.2

99 100 99

ITS1

KF434090.1

100

ITS4 AFLRF AFLRR

KF434090.1 AF441434.1 XM_002379905.1

99 100 99

CMDA7F

AY974341.1

ITS1 ITS4 AFLRF AFLRR

KM285408.1 EF409812.1 XM_002379905.1 FN398160.1

100 95 100 93

CMDA7F

XM_002374071.1

CMDA8R ITS1 ITS4 AFLRF AFLRR

XM_002379905.1 KF434090.1 KT356196.1 AF441435.2 AF441434.1

99 99 97 99 99

CMDA7F

AY510451.1

CMDA8R ITS1 ITS4 ITS1

XM_002374071.1 HQ010119.1 KX641192.1 KT356196.1

100 99 99 98

Control+ C (AHY255)

Control+ T (AHY256)

AC1 (AHY257)

AC2 (AHY258)

AC3 (AHY259)

EM1 (AHY195)

Maíz (Cuatitlán)

Maíz (Tamaulipas)

Alimento concentrado

Ensilaje de maíz

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Rev Mex Cienc Pecu 2020;11(2):435-454 ITS4

LN482513.1

100

EM2 (AHY203)

Ensilaje de maíz

AFLRF AFLRR

MH752566.1 KY769955.1

100 100

EM3 (AHY204)

Ensilaje de maíz

CMDA7F CMDA8R ITS1 ITS4 AFLRF AFLRR

XM_002374071.1 XM_002374071.1 KX572367.1 KT356196.1 L32577.1 MH752564.1

100 100 99 99 100 100

NCBI (National Center for Biotechnology Information): https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ CMDA = calmodulina; ITS = espaciadores internos de la transcripción; AFLR = regulador de la ruta biosintética; R = reversa; F = hacia adelante.

Aflatoxinas detectadas en pienso y en leche De las 288 muestras obtenidas de alimento, 286 (99.3 %) presentaron niveles detectables de AF (18.5 ± 3.7 µg/kg); de las cuales el 10.4 % sobrepasaron los límites máximos permisibles por la legislación mexicana (20 µg/kg). En las 183 muestras de leche cruda, la presencia de AFM1 (0.021 µg/kg) se detectó en el 39.9 % y el 12.0 % rebasó el límite máximo permisible utilizado como norma por la agroindustria que adquiría la leche cruda (0.050 µg/kg). La mayor incidencia de AF en pienso se presentó en verano y otoño (P<0.01) en comparación con primavera e invierno (17.4ª ± 3.2 y 14.8 ab ± 1.6 vs 8.1 bc ± 0.5 y 5.9 c ± 0.5, µg/kg, respectivamente). A su vez, la concentración de AFM1 se correlacionó de manera directa con la concentración de AF en la RTM en un modelo doble cuadrado (P<0.01; R2= 30.5 %). También la presencia de AFM1 en leche se correlacionó significativamente con el nivel de producción de leche y con el consumo de RTM; en promedio, las vacas consumieron diariamente 621 µg de aflatoxinas en 42 kg de RTM, produjeron diariamente 26.2 L de leche con una carga total de 0.603 µg de AFM1, lo que representó una gran capacidad de las vacas lecheras para metabolizar las AF y solamente eliminaron una fracción mínima (0.09 %; Cuadro 4); en general, los lotes productivos de vacas con alta producción se expusieron a la ingestión de mayores cantidades de AF (658 µg/vaca/día) y la presencia y eliminación de AFM1 en la leche de las vacas altas productoras fue mayor al lote de vacas de mediana y de baja producción (0.22 µg/vaca/día).

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Cuadro 4: Exposición promedio (± EE) de las vacas lecheras a la contaminación natural por aflatoxinas en la ración total mezclada (RTM y eliminación promedio de AFM1 por lote productivo Vacas

Producción de leche

RTM

Ingestión AF

(No)

(kg/vaca/día)

(µg/vaca/día)

Altas

1760

32.0a

44.7a

658a

± 97.0

0.024a

Medias

606

20.2b

36.4c

546a

± 83.4

Bajas

388

14.8c

38.4b

568a

Total

2754

28.0

42.0

621

Lote

Eliminación AFM1 (µg/kg)

(µg/vaca/día)

(%)

± 0.005

0.72

0.11

0.022a

± 0.005

0.44

0.08

± 82.6

0.015b

± 0.004

0.22

0.04

± 92.0

0.021

± 0.005

0.58

0.09

Literales diferentes indican diferencia significativa entre lotes productivos P<0.05.

Discusión En este estudio longitudinal de dos años de duración se demostró la presencia de Aspergillus flavus en pienso de las vacas lecheras del Altiplano Central Mexicano. Estos aislados mostraron características morfológicas, toxicológicas y moleculares congruentes con las cepas que poseen la capacidad de producir aflatoxinas. Además, se corroboró la acumulación de AF en el pienso y en la leche que produjeron las vacas. Aunque ya se contaba con información de la existencia en México de poblaciones indígenas de A. flavus con y sin capacidad de producir aflatoxinas, en nuestro conocimiento, este estudio agrega por primera vez la identificación molecular, toxicológica y morfométrica de A. flavus a la cuantificación de aflatoxinas en la lechería, lo cual es de importancia para la producción animal y la salud pública.

Frecuencia de Aspergillus spp. y A. flavus Aspergillus fue el género micótico con mayor ocurrencia en la UPL (31 %) seguido de Penicillium (13.8 %) y Fusarium (12.7 %). Estos géneros ya han sido identificados en México en maíz amarillo almacenado(9) y en híbridos de maíz destinados al consumo humano y animal(30). Se ha sugerido que la presencia frecuente de hongos micotoxigénicos y sus toxinas en maíz es debida al manejo inadecuado del cultivo y a la falta de aplicación efectiva de estrategias de control de la infección(5,31). En este estudio, A. flavus se aisló de pienso para vacas lecheras en una proporción del 6.8 % del total de los Aspergillus identificados (6/88). En suelo agrícola destinado a la producción alterna de maíz forrajero con avena no se identificó esta especie. En México, A. flavus ha sido identificado en suelo para cultivos de maíz de grano(10) en granos de maíz comercial(32).

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Lo anterior sugiere que las poblaciones fúngicas de esta especie se encuentran distribuidas en las zonas agrícolas de México. En este estudio, el análisis morfométrico mostró que la tercera parte de los aislados de A. flavus contenía abundantes esclerocios cortos (< 400 µm) por lo que se clasificaron como cepas S, mientras que el resto fueron denominadas como cepas L con escasos esclerocios, pero de tamaño mayor (>400 µm). Ya se señalado la importancia de esta morfología y su asociación con la aflatoxigenicidad de las cepas S, mientras que las cepas L contienen tanto aislados atoxigénicos como toxigénicos(33,34).

Análisis molecular Todas las 25 secuencias obtenidas de los aislados identificados morfológicamente como A. flavus mostraron un gran porcentaje de identidad (> 90%) con secuencias registradas de cepas A. flavus. También se obtuvieron fragmentos amplificados para el gen CaM de 468 pb, para el gen aflR de 796 pb y para los ITS con un rango de 600-800 pb (ITS1-5.8S-ITS2). Se ha señalado que la región rADN de los espaciadores internos de la transcripción es el código de barras oficial de ADN para hongos porque es el marcador secuenciado con mayor frecuencia y es una herramienta de gran utilidad para la descripción de especies de A. flavus(8). También se ha referido que el gen CaM es capaz de distinguir entre casi todas las especies de Aspergillus(8). Por otra parte, el gen aflR es necesario para la transcripción de la mayoría de los genes involucrados en la activación de las reacciones enzimáticas necesarias para la formación de las aflatoxinas(35-37). Con base a lo anterior este trabajo integra la identificación molecular a la identificación morfológica de seis aislamientos de A. flavus obtenidos de la cadena productiva lechera en la región del Altiplano Central Mexicano.

Capacidad aflatoxigénica Los seis aislados identificados como A. flavus se evaluaron con TLC y vapores de amonio en agar coco para identificar su capacidad de producir aflatoxinas, cinco se clasificaron como aflatoxigénicos y uno se clasificó como negativo a la producción de aflatoxinas. Estos resultados mostraron un comportamiento comparable a los obtenidos en otros estudios realizados en México(10) en que identificaron aislamientos de A. flavus relacionados genéticamente con A. flavus AF-36(32). Esta cepa no aflatoxigénica ha sido empleada en el desarrollo de estrategias de control biológico para reducir la producción de aflatoxinas de cepas aflatoxigénicas en campos productores de algodón(15). Lo anterior sugiere que las poblaciones mayoritarias de A. flavus aflatoxigénicas se distribuyen en ecosistemas agrícolas alrededor del mundo y que coexisten con cepas sin capacidad de producir aflatoxinas.

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Aflatoxinas detectadas en pienso y en leche El 99.3 % (286/288) de las muestras de alimento de las vacas lecheras presentaron niveles detectables de AF (18.5 ± 3.7 µg/kg) de las cuales el 10.4 % sobrepasaron los límites máximos permisibles por la legislación mexicana (20 µg/kg); además el 39.9 % (73/183) de las muestras de leche cruda mostraron la presencia de AFM1. Proporciones comparables de contaminación con AF han sido detectadas en piensos balanceados producidos en México(5), en la ración total mezclada de establos de México(38); así como en muestras de alimento de origen asiático(39). En México se han reportado la incidencia de AFM1 en leche cruda de vaca(6,7); también en diversos países se ha identificado incidencia de AFM1 en la leche destinada al consumo humano(3,40-42). Lo anterior sugiere que la contaminación por aflatoxinas de alimento destinado al consumo humano y animal es una problemática mundial de salud pública. En este estudio se mostró una asociación entre el nivel de producción de leche de las vacas con la cantidad y de la concentración de AFM1 eliminada en la leche, de tal forma que las vacas altas productoras consumieron una mayor cantidad de alimento y se expusieron a cantidades más grandes de aflatoxinas en su pienso; por consiguiente, fue mayor la cantidad total, así como la concentración de AFM1 en la leche cruda (P<0.05). Se ha señalado que la tasa de eliminación de AFM1 en leche se ve influenciada por la cantidad de pienso ingerido al día por cada animal, la cantidad de leche que produce al día y la etapa de lactación en la que se encuentra(43).

Conclusiones e implicaciones En este estudio se demostró morfológica, toxicológica y molecularmente la ocurrencia de A. flavus en ensilaje de maíz y en la ración total mezclada, lo cual condujo a la contaminación por aflatoxinas de casi la totalidad de las dietas de las vacas lecheras, así como a la presencia residual de AFM1 en la leche cruda. Las vacas lecheras lograron metabolizar y eliminar por vías diferentes a la leche más del 99 % de las aflatoxinas presentes en su dieta.

Agradecimientos Se reconoce el apoyo financiero del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (Proyecto Ciencia Básica: 178546 y Beca 514818) y de la Universidad Autónoma de Aguascalientes (proyecto PIP / SA 15-1). Se agradece el apoyo técnico de Araceli Adabache Ortiz y Marcelo Silva Briano.

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Conflictos de interés Los autores declaran que no existe ningún conflicto de interés potencial con respecto a la presente investigación, autoría y / o publicación de este artículo.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.4885 Artículo

Comparación de la castración quirúrgica al nacimiento versus inmunocastration sobre las características de la canal y carne en machos Holstein

Jorge A. Cervantes-Cazares a Cristina Pérez-Linares a* Fernando Figueroa-Saavedra a Alma R. Tamayo-Sosa a Alberto Barreras-Serrano a Francisco G. Ríos-Rincón b Eduardo Sánchez-López a Issa C. García-Reynoso a Pedro Mendoza Peraza a Angelina León Villanueva a Luis A. García-Vega c

Universidad Autónoma de Baja California, Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, A. Obregón y J. Carrillo s/n Col. Nueva, Mexicali, Baja California, 21100, México. b

Universidad Autónoma de Sinaloa. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Sinaloa, México. c

Ganadera Mexicali, S.A. de C.V, Baja California, México.

*Autor de correspondencia: cristinapl@yahoo.com

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Resumen: El objetivo fue comparar el efecto de la castración quirúrgica al nacimiento vs immunocastración, sobre las características de la canal y carne en machos Holstein en engorda; se utilizaron 720 machos Holstein aproximadamente de 7 a 8 meses de edad con peso inicial de 240.82 kg. Se formaron 2 tratamientos con 4 corrales de 90 animales en cada uno: toros castrados quirúrgicamente que fueron castrados 24 h después del nacimiento y toros inmunocastrados vacunados con Bopriva aplicando cuatro dosis, al día 1, 21, 101 y 181 de engorda. Se tomaron pesos individuales en cada vacunación. Los animales se sacrificaron a los 242 días de engorda. A partir de la segunda vacunación se observaron diferencias (P<0.05) en pesos, presentando valores mas altos los animales castrados quirúrgicamente. El peso final al sacrificio, peso de la canal caliente, peso de la canal fría, espesor de grasa dorsal y área del ojo de la costilla fueron diferentes (P<0.05) entre tratamientos, observando valores más altos en los machos castrados quirúrgicamente. En la carne, el pH y EC fueron similares (P>0.05) entre tratamientos mientras que los valores de b*, C* y H* fueron más altos (P<0.05) en los animales inmunocastrados. Para fines de producción, el sacrificar los machos Holstein al nacimiento, se obtienen animales más pesados y con mejores características en la canal; sin embargo es importante evaluar el impacto del bienestar animal por la castración al nacimiento. Palabras clave: Inmunocastración, Machos Holstein, Evaluación de la canal.

Recibido: 07/05/2018 Aceptado: 11/04/2019

Introducción En la producción del ganado de carne, la castración es frecuentemente utilizada como una herramienta de manejo que proporciona grandes ventajas, incluyendo una reducción en el comportamiento agresivo y sexual, lo que resulta en un fácil y seguro manejo, lo cual promueve una mejor calidad de las canales através del incremento de la deposición de grasa de cobertura y menos daño en las canales por efecto de montas o agresiones en el corral de finalización, influyendo favorablemente en bienestar animal(1-5). Sin embargo, la castración quirurgica requiere un trabajo y costo adicional, y provoca dolor prolongado en el animal(6,7), infecciones y sangrados(8) y en algunos casos la muerte(9).

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La inmunocastración es un método no quirúrgico enfocado a preservar el bienestar de los bovinos que ingresan al corral de finalización intensiva(10); mediante este procedimiento, los machos inmunocastrados producen un anticuerpo contra GnRh y en consecuencia reduce las concentraciones de testosterona(11) y disminuye la actividad física(12). En años recientes, en los corrales de engorda se han incluido a machos de la raza Holstein como una alternativa productiva; este grupo racial muestra características que lo hacen diferente de las razas productoras de carne tradicionales, ya que tiene un temperamento amigable y juguetón, pero pueden tornarse mayormente agresivos si se conservan como toros enteros(13) . El uso de la inmunocastración se ha probado en diferentes razas, con diferentes programas de vacunación, dietas y programas de implante(14-17), sin embargo, es necesario evaluar la aplicación de programas de castración inmunológica bajo diferentes sistemas de producción (razas, dietas, implantes), en particular al ganado Holstein bajo un sistema de producción comercial donde se exige pesos finales mayores a 550 kg para su sacrificio. Por lo anterior el objetivo de este estudio fue comparar el efecto de la castración quirúrgica al nacimiento vs. immunocastración sobre las características de la canal y carne en machos Holstein en engorda.

Material y métodos Localización geográfica El estudio se llevó a cabo en la ciudad de Mexicali, Baja California, el cual se encuentra ubicada a una 32o 32´00 N, 115º 12’41 O. La región está caracterizada por un clima seco desértico con una temperatura media de 34.7 °C (-5 ºC invierno y 50 ºC verano), con una precipitación pluvial de 37 mm, y una humedad relativa de acerca del 50 %(18).

Diseño del estudio Se utilizaron 720 machos Holstein de un mismo origen, con una edad de entre 7 y 8 meses a la llegada a la engorda y un peso vivo promedio de 240 kg. Para el estudio se consideraron dos tratamientos: machos castrados quirúrgicamente (T1) y machos inmunocastrados (T2), donde fueron asignados aleatoriamente en cada tratamientos ubicando 90 animales por corral con cuatro corrales por tratamiento. Los animales se castraron a las 24 h después del nacimiento en los corrales del establo lechero.

Manejo del ganado a la recepción de la engorda A las 24 h de la recepción de los animales, todos los animales fueron vacunados, desparasitados, y se aplicó un implante (un producto a base de acetato de trenbolona, estradiol 457

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y tylosina). A los animales inmunocastrados se les aplicó Bopriva® (Laboratorios Zoetis, Salud Animal, México) administrando 1 ml subcutáneamente en cuatro ocasiones: (24 h después de la recepción y en los días 21, 101 y 181 del experimento), mientras que a los animales castrados quirúrgicamente se les administró 1 ml de solución salina en los mismos días. Se registró el peso vivo de cada animal durante los días 1, 21, 101 y 181 del experimento y antes del sacrificio. Los animales se alimentaron dos veces al día, siguiendo un programa de seis dietas típicas de la region norte del país compuesta de heno de trigo, sudán, sebo, DDG (granos secos de distelería), y una premezcla de minerales.

Niveles de testosterona sérica Se seleccionaron aleatoriamente a 10 animales por corral para medir los niveles de testosterona sérica y se identificaron con un arete adicional. Las muestras de sangre se tomaron en los mismos días de aplicación de Bopriva y una muestra más durante el sacrificio de los animales, en la estación de desangrado en la línea de producción en la planta de sacrificio. Aproximadamente 5 ml de sangre fue extraída de la vena coccígea; las muestras se centrifugaron a 3,500 rpm para obtener el suero, usando la centrifuga TRIAC (Clay Adams, Modelo 0200, New Jersey, U.S.A.), y almacenadas a -20 °C hasta que fue medida la concentración de testosterona, la cual se determinó usando el kit ELISA Testosterona (Bovina) ELISA Kit (Abnova Corporation, Taipei City, Taiwan), de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Sacrificio de los animales Los animales se sacrificaron a los 242 días de engorda, una vez que alcanzaron un peso promedio de 607.85 ± 12.89 kg. El día de sacrificio los animales se arrearon por un vaquero a caballo cerca de 1.5 km hasta la planta de sacrificio. Los animales se mantuvieron en los corrales de reposo con acceso a agua por 5 h aproximadamente. Los animales se sacrificaron en una planta de sacrifico Tipo Inspeccion Federal (TIF), siguiendo la metodología descrita en la Norma Oficial Mexicana NOM-033-SAG/ZOO-2014, “Métodos para dar muerte a los animales domésticos y silvestres”.

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Evaluación de la canales

Las canales de ambos tratamientos se almacenaron a 2 °C por 24 h y se realizó el corte entre la 12.a y 13.a costilla para obtener los datos de las canales. En un total de 120 canales por tratamiento (grupo de machos castrados e inmunocastrados) fueron disponibles por la planta de sacrificio para ser considerados para el estudio de las variables en la canal. Se midió el peso de la canal caliente y peso de la canal fría, deposición de grasa dorsal, grasa pélvica renal y del corazón (KPH), marmoleo, área del ojo de la costilla (AOC), pH y color (L*, a*, b*, C* y H*). La grasa dorsal fue medida en mm utilizando una regla métrica(19). El área del ojo de la costilla se evaluó usando una plantilla de plástico de acuerdo al método sugerido por Iowa State University. La cantidad estimada de grasa pélvica, renal y del corazón (KPH) se determinó subjetivamente y expresada como un porcentaje del peso de la canal caliente (PCC), y el marmoleo (en escala de trazas, ligero, pequeño, modesto, moderado, ligeramente abundante y moderadamente abundante)(20).

Calidad de la carne A las 48 h postmortem, un total de 80 muestas de carne de aproximadamente 1,000 g se obtuvieron del músculo Longissimus dorsi, 10 muestras aleatorias por cada corral en ambos tratamientos. Las muestras fueron empacadas al vacío, refrigeradas y enviadas al Laboratorio de Calidad de Productos de Origen Animal del Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias de la Universidad Autónoma de Baja California. El pH se determinó usando un potenciometro (HANNAH INSTRUMENTS Inc. pH 101): los valores de color (L*, a*, b*, C*, H*) fueron medidos en la superficie del corte del músculo Longissimus dorsi usando un espectofotómetro MINOLTA CM-2002 (Minolta camera, Co., Ltd., Japan) con un componente especular íncluido (SCI), un iluminante D65, y un observador de 10°, donde L* es el índice de luminosidad, a* es la intensidad de color rojo y b* es la intensidad de color amarillo. El esfuerzo al corte se obtuvo usando piezas de carne de previamente cocidas obtenidas en forma perpendicular a las fibras musculares através de un sacabocado de 1 cm2 de diametro, utilizando un texturómetro (Lloyd Instruments, England) equipado con cuchillas Warner-Bratzler. Todas las mediciones se hicieron por triplicado.

Análisis estadístico El modelo lineal estadístico utilizado para analizar la variación total en el estudio fue: Yij =µ+ τi + ξij con i = 1, 2 y j = 1, 2, . . ., r

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Donde: Yij corresponde a los valores de pH, color y esfuerzo al corte registrados en la carne, como variables de respuesta; Âľ es la media general, Ď&#x201E;i es el efecto fijo del tratamiento (castrados vs inmunocastrados); Îžij es el efecto aleatorio del residual [Îžij ~ NI(0, đ?&#x153;&#x17D;đ?&#x2018;&#x2019;2 )]. Cuando los tratamientos resultaron una fuente de variaciĂłn significativa (Pâ&#x2030;¤0.05), se compararon los valores medios de los tratamientos utilizando el procedimiento de Tukey. El anĂĄlisis se realizĂł utilizando el procedimiento GLM del paquete estadĂstico SAS(21) . Para comparar los niveles medios de testosterona entre tratamientos, incluyendo su comportamiento en el tiempo (dĂa 1, 21, 101,181 y al desangrado), se utilizĂł el modelo lineal mixto: Yijk = Âľ+ Ď&#x201E;i +Ak(i) + Dj + (Ď&#x201E;D)i j + Îžijk con i = 1, 2 ; j = 1, 2, ..., 5, y k = 1, 2, â&#x20AC;Ś, r Donde: Yijk es la concentraciĂłn de testosterona del k-ĂŠsimo animal tomado en el j-ĂŠsimo tiempo y perteneciente al i-ĂŠsimo tratamiento, como variable de respuesta; Âľ es la media general, Ď&#x201E;i es el efecto fijo del tratamiento; Ak(i) es el efecto aleatorio del animal dentro de tratamiento [Ak(i) ~ NI(0, đ?&#x153;&#x17D;đ?&#x2018;&#x17D;2 )]; Dj es el efecto fijo del tiempo, en dĂas, (Ď&#x201E;D)i j es el efecto de interacciĂłn tratamiento Ă&#x2014; tiempo; Îžijk es el efecto aleatorio del residual [Îžij ~ NI(0, đ?&#x153;&#x17D;đ?&#x2018;&#x2019;2 )]. El anĂĄlisis se efectuĂł empleando el procedimiento MIXED utilizando el enunciado REPEATED, del paquete estadĂstico SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC). Para el anĂĄlisis de los registros repetidos, el cual incluyera las correlaciones entre los registros del mismo animal y las varianzas heterogĂŠneas entre registros en el tiempo, se evaluaron las estructuras de covarianzas: no-estructurada (NE), simetrĂa compuesta (SC) y autorregresiva de primer orden (AR1), a travĂŠs de los criterios de Akaike y de Schwartz, seleccionando como la mejor aquella con los menores valores para estos dos indicadores. En este anĂĄlisis la estructura de covarianza seleccionada fue la no-estructurada (NE). Cuando la interacciĂłn tratamiento x tiempo resultĂł una fuente de variaciĂłn significativa (Pâ&#x2030;¤0.05), se compararon las medias 460

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mínimo cuadráticas entre tratamientos, por cada nivel del factor tiempo, utilizando el procedimiento Tukey-Kramer(22).

Resultados y discusión Ganancia de peso de los animales: Los pesos promedios registrados durante los días de vacunación se muestran en el Cuadro 1. A partir de la aplicación de la segunda vacuna (día 21) se observaron diferencias significativas (P<0.05) por tratamiento, presentando valores mas altos los machos castrados, observándose este patrón hasta el día del sacrificio. Cuadro 1: Valores medios ± error estándar (EE) de peso (kg) de los animales por tratamiento en los días de vacunación hasta el sacrificio

Día de engorda 1 21 101 181 Sacrificio

Castrados 243.25 278.30 394.94 520.80 620.74

Immunocastrados 238.39 269.70 379.53 509.52 594.95

EE 2.50 2.49 2.51 2.54 6.90

P> t 0.052 NS 0.006* 0.001* 0.001* 0.002*

Se han reportado diferencias (P>0.05) en el peso vivo de los animales con mayor peso en los machos tratados con bopriva que los castrados quirúrgicamente durante los 280 días de engorda, cuando la castración fue realizada a los 91 días de engorda(10). En otro estudio(9) reportaron pesos similares (P>0.05) al sacrificio entre machos castrados quirúrgicamente e inmunocastrados con bopriva, realizando la castración dentro del periodo de la primera y segunda aplicación de los machos tratados con bopriva (15, 16 y 17 días después de la vacunación). Sin embargo, en el presente estudio, los animales se castraron al nacimiento, por lo que el tiempo de recuperación por alguna infección y pérdidas de peso ocasionadas por la castración no tuvieron repercusión a los 7 meses de edad, tiempo en que llegaron los animales de los corrales del establo a los corrales de la engorda.

Concentraciones de testosterona sérica Los resultados de concentración de testosterona para ambos tratamientos se detectaron en niveles por debajo de 1 ng/ml durante todos los días de vacunación hasta el final del periodo de engorda. Los resultados confirman el efecto que tiene la vacuna en suprimir la 461

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concentración de testosterona sérica en el ganado, similar a lo reportado en otras investigaciones(4,9). Algunos autores sugieren que a los 7 meses puede ser la edad óptima para la inmunización contra GnRH y generar la máxima producción de anticuerpos en machos Bos taurus(22), como así fue llevado a cabo en este estudio.

Calidad de la canal y carne En el Cuadro 2 se presentan los valores medios de las características de las canales por tratamiento. Los resultados de PCC y PCF fueron diferentes entre tratamientos (P<0.05) observando valores mas altos en las canales de machos castrados, otros estudios han observado que el PCC fueron similares en las canales de ambos tratamientos(14). El EGD y AOC fueron diferentes (P<0.05) entre tratamientos, los valores más altos se observaron en las canales de machos castrados; mientras que el KPH fue similar (P>0.05) entre tratamientos. En otros estudios se han reportado valores similares (P>0.05) de EGD y AOC en canales de machos Nellore castrados e inmunocastrados(14); mientras que los resultados de EGD del presente estudio han sido observados en machos castrados e inmunocastrados de animales de razas Nellore y Nellore x Angus(15). Los valores de AOC se han reportado más bajos a los observados en este estudio(15) (castrados: 81.06 ± 1.78 cm2 vs inmunocastrados: 83.61 ± 1.73 cm2); estas diferencias pudieron deberse al tipo de razas en los animales utilizadas en el estudio. Algunos autores afirman que el ganado Holstein son de una estructura corporal más grande y más largos, y tienen un periodo mayor de días de engorda, lo que le permite desarrollar canales de mayor tamaño que razas de ganado de carne(23). Cuadro 2: Valores medios ± error estándar (EE) de las variables de calidad de la canal por tratamiento Variable PCC, kg PCF, kg EGD, cm AOC, cm2 KPH, %

Castrados 376.60a 374.87a 0.65a 91.41a 1.49a

Immunocastrados 362.61b 361.38b 0.55b 86.83b 1.60a

EE 4.14 4.09 0.33 1.54 0.09

P> f 0.0009 0.0011 0.0042 0.0048 0.2473

PCC= peso de la canal caliente; PCF= peso de la canal fría; EGD= espesor de grasa dorsal; AOC= área del ojo de la costilla; KPH= grasa pélvica, renal y del corazón. a,b Literales diferentes en el mismo renglón son diferentes (P<0.05).

Se han reportado valores similares (P>0.05) en machos castrados e inmunocastrados de EGD y AOC en ganado Holstein x Cebu(24) y en ganando Nellore(10,14). En un estudio donde los animales se sacrificaron a un peso promedio mas bajo, 477 kg (castrados) y 486 kg (inmunocastrados)(9), no observaron diferencias (P>0.05) en PCC, EGD y AOC en machos 462

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Holstein, mientras que en este estudio los animales fueron sacrificados a pesos arriba de 600 kg los machos castrados y 594 kg los machos inmunocastrados. Es importante destacar, que las diferencias reportadas en este estudio con respecto a las variables de calidad de la canal de otros estudios(10,14,15) pueden deberse a que la castración quirúrgica en estos estudios se realizó días antes o dentro del tiempo de la aplicación con Bopriva y en el presente estudio la castración fue a las 24 h del nacimiento y, a los 7 meses de edad, tiempo de llegada a los corrales de engorda, ya estaban totalmente recuperados de las implicaciones de una castración quirúrgica. El número de canales que fueron clasificadas por marmoleo según la categoría de clasificación son descritas en el Cuadro 3; las frecuencias por categorías fueron similares (P>0.05) en ambos tratamientos. El mayor número de canales en ambos tratamientos se clasificaron en las categorías “ligero” y “pequeño” para marmoleo. Estos resultados son similares (P>0.05) a los reportados en otras investigaciones(25) entre canales de machos inmunocastrados y castrados; mientras que, en otro estudio no reportaron diferencias (P>0.05) en el porcentaje de grasa intramuscular entre canales de machos Holstein castrados e inmunocastrados(9). Cuadro 3: Clasificación del marmoleo en las canales por tratamiento

Trazas Ligero Pequeño Modesto Moderado

Castrados (n= 126) 3 67 46 9 1

Immunocastrados (n= 126) 0 66 50 0 10

Pr > X2 -0.9309 0.6831 ---

No se observaron diferencias (P>0.05) entre tratamientos para las categorías Ligero y Pequeño en prueba de hipótesis para igualdad de proporciones.

En el Cuadro 4, se observan los valores de las características físico-químicas de la carne de ambos tratamientos, los valores de pH de la carne fueron similares (P>0.05) en canales de machos castrados e inmunocastrados, observando valores similares a rangos de una carne con pH normal de 5.5 a 5.8(26); estos resultados fueron también han sido reportados con pH de 5.57 a las 24 h en canales de ganado Holstein(27).

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Cuadro 4: Valores medios ± error estándar (EE) de las variables físico-químicas de la carne Variables pH L* a* b* C* H* EC (N)

Castrados 5.54a 32.14ª 11.97ª 7.93b 14.63b 33.23b 52.17ª a,b

Immunocastrados 5.56a 32.74ª 10.70b 12.86ª 16.87ª 49.28ª 56.38a

± EE 0.04 0.43 0.33 0.47 0.48 1.21 0.24

P> f 0.7163 0.1731 0.0002 0.0001 0.0001 0.0001 0.0919

EE= error estándar; EC= esfuerzo al corte. Literales diferentes en el mismo renglón son diferentes (P<0.05).

Los valores de color (a*, b*, C* y H*) fueron diferentes por tratamiento. El valor de L* no mostró diferencias (P>0.05) entre castrados e inmunocastrados. Se han reportado valores de L* similares (P>0.05) en carne de machos castrados e inmunocastrados(10,15). Lo mismo fue observado en investigaciones recientes(9) donde registraron valores similares en valores de L*, a* y b* en canales de machos castrados (L*=33.9; a*=17.1; b*=2.6) e inmunocastrados (L*=34.0; a*=16.9; b*=2.4). A pesar de que la carne mostró un pH normal, los valores observados de color en este estudio son similares a los reportados de una carne DFD de una carne DFD (L*:34.8; a*:18.8; b*: 6.7)(28), lo que indica que los animales estuvieron expuestos a agentes estresantes previo al sacrificio. No se observaron diferencias (P<0.05) en SF en las canales entre machos castrados e inmunocastrados. En concordancia con criterios ya establecidos(29), la blandura de la carne correspondió a una blandura intermedia (blanda: 22.26-35.10N; intermedia: 40.01-52.95N; dura: 57.85-70.60N). Lo mismo fue observado por otras investigaciones(10,16), donde no se observaron diferencias en los valores de esfuerzo al corte en la carne de animales castrados quirúrgicamente e inmunocastrados. A su vez, no se han reportado(15) diferencias en los valores de esfuerzo al corte debido a la condición sexual (machos castrados quirúrgicamente: 56.60 ± 0.36N; immunocastrados:53.37 ± 0.35N y machos enteros: 48.85 ± 0.35N). En un estudio donde evaluaron el EC en machos, no reportaron diferencias entre castrados (51.9N) e inmunocastrados (52.9N) sacrificados a los 11 meses de edad(9).

Conclusiones e implicaciones Para fines de producción, con la castración quirúrgica a las 24 h de nacimiento en los machos Holstein, se pueden lograr animales mas pesados y con mejores características en la canal que las canales de machos inmunocastrados durante periodos de más de 200 días de engorda; 464

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sin embargo, es necesario evaluar el impacto del bienestar animal en becerros tras la castración.

Agradecimientos Nuestro agradecimiento por el apoyo proporcionado para la realización de este proyecto al personal de Ganadera Mexicali S.A. y de la planta de sacrificio TIF No. 511, así como también a la MVZ. Priscila Castro Osuna por su colaboración como asesor técnico del Laboratorio Zoetis.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.4926 Artículo

Ascosferosis en abejas melíferas y su relación con factores ambientales en Jalisco, México

José María Tapia-González a Gustavo Alcazar-Oceguera a José Octavio Macías-Macías a* Francisca Contreras-Escareño b José Carlos Tapia-Rivera a Tatiana Petukhova a,c Ernesto Guzmán-Novoa a,d

Universidad de Guadalajara. Centro Universitario del Sur. Departamento de Ciencias Económicas Administrativas y Departamento de Ciencias de la Naturaleza. Centro de Investigaciones en Abejas (CIABE). Av. Enrique Arreola Silva no. 883. CP 49000. Cd. Guzmán, Jalisco. México. b

Universidad de Guadalajara. Departamento de Producción Agrícola. Centro de Investigaciones en Abejas (CIABE). Centro Universitario de la Costa Sur. México. c

University of Guelph. Department of Population Medicine. Guelph, Ontario, Canada.

University of Guelph. School of Environmental Sciences. Guelph, Ontario, Canada.

*Autor de correspondencia: joseoc@cusur.udg.mx

Resumen: La ascosferosis o cría de cal, es una enfermedad infecciosa de las abejas melíferas (Apis mellifera) causada por el hongo Ascosphaera apis que ocasiona la muerte a sus larvas. En casos severos puede

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causar disminución de la población de abejas adultas y de productividad de la colonia. Este es el primer estudio que se realiza en México con la finalidad de determinar la prevalencia de A. apis en colonias de abejas melíferas en una región apícola. Se llevó a cabo en nueve municipios del sur de Jalisco, distribuidos en dos zonas climáticas (cálida subhúmeda y templada subhúmeda) y se analizó la relación del hongo con factores como altura sobre el nivel del mar, precipitación pluvial y temperatura ambiental. Se tomaron muestras de cría de abejas de 365 colonias, de las cuales, el 74.1 % fueron positivas a ascosferosis mediante análisis microscópico. El 75.6 % de las colonias de la zona cálida y el 72.2 % de la templada resultaron positivas a A. apis, respectivamente, y no fueron significativamente diferentes en la prevalencia de este hongo (P>0.05). El análisis de regresión logística indicó que al incrementarse la precipitación pluvial también se incrementa significativamente el número de colonias infectadas por A. apis (odds= 3.53; P<0.01). Hubo una correlación significativa entre precipitación pluvial y proporción de casos positivos a ascosferosis (r= 0.87, P= 0.003). Los otros factores estudiados no tuvieron relación significativa con casos de ascosferosis. Debido a los altos porcentajes de colonias infectadas con A. apis encontrados en este estudio, debieran considerarse investigaciones posteriores para determinar cuáles son las causas de la alta prevalencia de este hongo en colonias de abejas del estado de Jalisco. Palabras clave: Ascosphaera apis, Apis mellifera, Efectos ambientales, Jalisco.

Recibido: 05/06/2018 Aceptado: 18/04/2019

Introducción La ascosferosis o cría de cal es una enfermedad fúngica de la abeja melífera (Apis mellifera L.) causada por el hongo Ascosphaera apis(1). El hongo que causa la ascosferosis afecta principalmente a larvas, pero también a las pupas de las abejas. Las dos vías principales de contagio son digestivas a través del consumo de alimentos contaminados con esporas del hongo, o éste puede penetrar a través de la cutícula de las crías mediante el tubo germinativo que sale de las esporas. Ambas formas de infección producen micelios que penetran el cuerpo de las larvas, ocasionando su muerte y confiriéndoles la característica de momias(2). Existen factores predisponentes que favorecen la presentación de brotes de ascosferosis, como son el exceso de humedad en el interior de la colmena, bajas temperaturas o el manipular las colonias más de lo necesario(3). Observaciones empíricas sugieren que la ascosferosis se incrementa con el estrés causado por la frecuente transportación de colmenas para polinizar cultivos agrícolas, por la exposición a los pesticidas usados en los sitios

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de polinización y por los nuevos patógenos que afectan a las abejas. Todos estos factores deprimen el sistema inmune de la abeja y favorecen el desarrollo de patógenos como A. apis(4). La mortalidad por ascosferosis en las crías de las abejas generalmente es baja, pero hay ocasiones en que llega a sobrepasar el 30 %(5). La enfermedad se ha reportado en casi todos los países en el mundo, incluyendo México(5-9). Es importante resaltar que la prevalencia de la ascosferosis en algunos países aumentó considerablemente, al grado que se ha llegado a considerar una amenaza casi tan seria como la infestación del acaro Varroa destructor(10). La ascosferosis en México ha sido poco estudiada y no se le ha dado la importancia que requiere. Sin embargo, Medina y Mejía(11) en Yucatán, encontraron que la ascosferosis está asociada al colapso de colonias. Fuera de estudios aislados como el realizado en Yucatán, puede decirse que no hay datos para saber qué tan prevalente y generalizada está la ascosferosis en México, ya que nunca se ha llevado a cabo un estudio epizootiológico para determinar su prevalencia en el país o en algún estado del país. Además, no se conoce cuál es la situación de la ascosferosis y las relaciones que puede tener con variables geográficas y climáticas en apiarios de México, por lo que el objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia de la enfermedad en colonias de abejas melíferas y determinar su relación con variables geográficas y climáticas en los municipios de la región sur-sureste del estado de Jalisco, México.

Material y métodos El trabajo se realizó en nueve municipios ubicados en dos zonas climáticas consideradas templada y cálida (climas templado subhúmedo y cálido subhúmedo, respectivamente) con el fin de determinar la prevalencia de A. apis y si existe una relación entre el clima y prevalencia del hongo en colonias de abejas melíferas. Los municipios se ubican en el occidente de México (19º 24’, 21º 14’ N; 101º 59’, 104º 5’ O). Los municipios de Gómez Farías, Zapotlán el Grande, Tapalpa y Unión de Guadalupe, tienen clima templado sub-húmedo y los municipios de Tecalitlán, Tamazula, Zacoalco de Torres, Sayula, y Cocula, presentan clima cálido subhúmedo(12). Los municipios con clima cálido subhúmedo tienen una temperatura media anual de 21 °C. Este clima no presenta cambio térmico invernal bien definido(13). El régimen de lluvias se registra de junio a septiembre, con una precipitación promedio de 801 mm y la altitud promedio es de 1,495 msnm(12). Los municipios con clima templado subhúmedo presentan un cambio térmico invernal bien definido; la temperatura media anual es de 14.4 °C y la precipitación media anual de 1,117 mm; la altitud promedio es de 1,711 msnm(13). En las dos zonas geográficas se tomaron al azar entre marzo y mayo, muestras de 365 colonias de abejas melíferas ubicadas en 145 apiarios. El tamaño de la muestra se calculó con base de 4,950 colmenas de las regiones seleccionadas del estado de Jalisco. De ellas se tomaron para su análisis 365 colmenas (13.56 %). Este cálculo se realizó con la fórmula de estudios transversales y se utilizó un muestreo aleatorio estratificado desproporcionado a un nivel de confianza del 95% y poder estadístico del 80 %. El resultado fue 21 muestras por municipio

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incluyendo 15 % por pérdidas, para un total de 160 colmenas. Sin embargo, se decidió tomar un total de 365 colmenas para tener una mayor precisión en el análisis (Cuadro 1).

Cuadro 1: Número de apiarios y colonias muestreadas para diagnóstico de Ascosphaera apis por municipio y zona climática, en el sur de Jalisco Municipio Cocula Sayula Tamazula Tecalitlán Zacoalco de Torres Gómez Farías Tapalpa Unión de Guadalupe Zapotlán el Grande Total

Apiarios

Colonias

17 21 36 21 14 6 12 8 10 145

41 52 93 54 39 15 37 20 14 365

Zona climática Cálida subhúmeda Cálida subhúmeda Cálida subhúmeda Cálida subhúmeda Cálida subhúmeda Templada subhúmeda Templada subhúmeda Templada subhúmeda Templada subhúmeda

Se obtuvieron muestras de panal de los bastidores centrales de la cámara de cría donde se encontraba cría sin opercular de las abejas y en algunos casos se observaron signos de ascosferosis (momificación de las crías). Se cortó un trozo de panal de 10 x 10 cm de cada colonia evaluada, que fueron envueltos en hojas de papel y mantenidos en cajas de cartón para ser transportadas al laboratorio donde fue realizado el diagnóstico. De cada apiario se registró la siguiente información: altitud (msnm), con un GPS (Sportrack-color, Magellan, USA), mientras que los datos de la temperatura ambiental (ºC) y precipitación pluvial (mm), se tomaron de los registros de la Comisión Nacional del Agua para cada municipio(14). Las crías contenidas en las muestras de panales se procesaron en el Laboratorio de Microbiología del Centro Universitario del Sur (CUSur) de la Universidad de Guadalajara, en donde se utilizó la técnica de azul de lactofenol para el diagnóstico de hongos. Los portaobjetos utilizados se limpiaron con solución de éter etílico y una vez secos, se les agregó una gota de solución salina fisiológica, donde se colocó un pequeño trozo de una larva sospechosa de ascosferosis. La muestra larvaria se expandió con un palillo, hasta que ésta absorbió la gota de agua, después se depositó sobre la muestra de la larva una gota de azul de lactofenol y se cubrió con un cubreobjetos. Posteriormente, se buscaron micelios y esporocistos de A. apis bajo el objetivo seco débil de un microscopio (40 X). La presencia de A. apis se determinó con base en el hallazgo de esporocistos típicos del hongo en las muestras analizadas(15) y se calculó el porcentaje de colmenas con ascosferosis para cada uno de los municipios.

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En el análisis estadístico, la variable de respuesta fue el número de colonias de abejas infectadas con el hongo A. apis entre diferentes municipios. Los predictores (variables explicativas) incluidos en el análisis fueron: temperatura ambiental, precipitación pluvial y altura sobre el nivel del mar. Para reducir problemas de multicolinealidad, las variables explicativas fueron estandarizadas. El análisis estadístico se efectuó empleando las siguientes técnicas. Las proporciones de colonias infectadas entre municipios y entre zonas fueron comparadas utilizando la prueba de Ji-cuadrada con ajuste de Bonferroni para identificar diferencias significativas. Con el propósito de identificar factores asociados con la infección del hongo, se llevó a cabo un análisis de regresión logística múltiple siguiendo los criterios de Hosmer y Lemeshow(16); este análisis permitió obtener el radio de probabilidad de encontrar colonias positivas a ascosferosis (odds) y su correspondiente intervalo de confianza (IC) al 95%. También se hizo una correlación de Pearson entre la proporción de casos positivos a ascosferosis y los factores. Los análisis estadísticos fueron realizados con el paquete R versión 3.3.2(17).

Resultados De 365 muestras evaluadas, el 74.1 % resultaron positivas a A. apis. Los municipios con porcentajes más altos de muestras positivas fueron Gómez Farías y Zacoalco de Torres, con 93.3 y 92.3 %, respectivamente, mientras que los que tuvieron porcentajes más bajos, fueron Zapotlán el Grande, Unión de Guadalupe y Tecalitlán, con 57.1, 60.0 y 61.1 %, respectivamente (Cuadro 2). Cuadro 2: Porcentajes promedio de colonias de abejas melíferas positivas a Ascosphaera apis en nueve municipios de dos zonas climáticas del sur de Jalisco Municipio Cocula Sayula Zacoalco Tamazula Tecalitlán Tapalpa Gómez Farías Unión de Gpe. Zapotlán el Grande Total

Porcentaje promedio 82.93 73.08 92.31 68.82 61.11 78.38 93.33 60.00 57.14 74.10

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Zona climática Cálida subhúmeda Cálida subhúmeda Cálida subhúmeda Cálida subhúmeda Cálida subhúmeda Templada subhúmeda Templada subhúmeda Templada subhúmeda Templada subhúmeda

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Se encontraron apiarios con el 100 % de colonias positivas a A. apis en los municipios de GĂłmez FarĂas, Cocula, Sayula, Tamazula, Tapalpa, TecalitlĂĄn, ZapotlĂĄn el Grande y Zacoalco de Torres, pero en UniĂłn de Guadalupe, el porcentaje de colonias positivas mĂĄs alto en un apiario fue de 60 %. La distribuciĂłn del porcentaje de colonias infectadas entre los nueve municipios fue examinada por medio de un diagrama de cajas (Figura 1). La figura muestra que la mediana del porcentaje de colonias infectadas fue de 71 %. Considerando todas las colonias muestreadas, la mitad de ellas tuvo valores de prevalencia de ascosferosis de entre 57 y 82 %.

Figura 1: Diagrama de caja representando la distribuciĂłn del porcentaje de colonias de abejas positivas a la infecciĂłn por el hongo Ascosphaera apis

Los valores mostrados incluyen el porcentaje mĂnimo, el mĂĄximo, cuartil 1 (25% de los datos), media (50% de los datos), cuartil 3 (75% de los datos) y el rango entre cuartiles.

En total se realizaron 36 comparaciones de las proporciones de colonias de abejas infectadas con A. apis entre los nueve municipios. Al ajustarse el ĂĄrea crĂtica para comparaciones mĂşltiples, las diferencias entre proporciones no fueron significativas (P>0.05). En cuanto a zonas, los resultados indican que la prevalencia de ascosferosis entre la zona cĂĄlida (75.6 %) y la templada (72.2 %) no fue significativamente diferente (x2 = 0.86, n= 209, P= 0.35). Los resultados del anĂĄlisis de regresiĂłn logĂstica se presentan en el Cuadro 3. La ecuaciĂłn del modelo completo (el modelo incluyendo todos los predictores) de regresiĂłn logĂstica fue la siguiente: log đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018; = 1.04141 â&#x2C6;&#x2019; 0.03434 Temperatura + 1.2188 Precipitacion pluvial â&#x2C6;&#x2019; 0.02706 Altura sobre el nivel del mar

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Cuadro 3: Predictores de la infección de colonias de abejas melíferas con el hongo Ascosphaera apis del análisis de regresión logística (modelo completo) Variables Temperatura Precipitación pluvial Altura sobre el nivel del mar

Probabilidad (Odds ) *0.97 *3.38

IC 95% (0.69 - 1.37) (1.73 - 7.48)

*0.97

(0.64 - 1.50)

p 0.84 <0.01 0.89

*Colonias de Ascosphaera apis.

Este análisis indicó que la precipitación pluvial se asoció significativamente a la infección de colonias con el hongo. Al incrementarse la precipitación pluvial también se incrementó significativamente el número de colonias infectadas por A. apis (odds = 3.53; P<0.01; Figura 2). Asimismo, se encontró una correlación significativa entre precipitación pluvial y proporción de casos positivos a ascosferosis (r= 0.87, n= 9, P= 0.003). Los otros factores estudiados no tuvieron relación significativa con casos de ascosferosis. Figura 2: Relación entre precipitación pluvial y proporción de casos positivos a la infección por el hongo Ascosphaera apis en nueve municipios evaluados en Jalisco, México

Discusión Este es el primer estudio que se realiza en México con la finalidad de determinar la prevalencia de A. apis en colonias de abejas melíferas en varias regiones apícolas de un estado. En un trabajo similar realizado en la región semidesértica de los Altos de Jalisco, México, durante los meses de

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julio a octubre (época de lluvias), en el que se monitorearon 42 colonias distribuidas a lo largo de solo 12 km dentro de esta región, se encontró un 67.1 % de muestras positivas a A. apis(18). El estudio de la región semidesértica de los Altos de Jalisco representa una muestra muy pequeña (42 colonias) de un área restringida del estado de Jalisco a diferencia de este estudio que incluyó 365 colonias en las dos regiones más productoras de miel del estado de Jalisco. Sin embargo, es importante observar que aun cuando el estudio de los Altos de Jalisco fue llevado a cabo en época de lluvias, el porcentaje de muestras positivas fue similar al encontrado en este trabajo realizado en época de sequía (74.1 %). Lo anterior refuerza la hipótesis de que la prevalencia de ascosferosis en colonias de abejas del estado de Jalisco es alta en diferentes épocas del año. La temperatura ambiental influye en la temperatura y humedad de la colonia, pero las abejas crean su propio microclima interno de humedad y temperatura(19), por lo que es difícil determinar cómo afecta el clima medioambiental externo en épocas de lluvia y sequía. Sin embargo, otras investigaciones mencionan que una reducción de 35 °C a 30 °C en la temperatura interna de la colonia aumenta la prevalencia de A. apis(20). Con respecto a la humedad, otros estudios concuerdan con lo encontrado en este trabajo en cuanto a que la precipitación pluvial está relacionada con una alta prevalencia de ascosferosis. Por ejemplo, en una investigación reciente se determinó que humedades relativas de 85 a 90 %, así como temperaturas internas de 25 a 30 °C en colonias de A. mellifera favorecen la presencia y proliferación de esporas de A. apis(21). En cambio, colonias que mantienen caliente (> 35 °C) y relativamente seco el nido de cría, limitan significativamente la infección por A. apis. También Bamford y Heath(22) determinaron que la temperatura y la humedad interna del nido de cría son factores predisponentes para la presencia de A. apis en la colonia. Estos autores evaluaron el enfriamiento de la colonia a 25 °C, lo que resultó en un 95 % de momias de cría de cal, mientras que con 30 °C, la momificación disminuyó a 43 %, y con 35 °C, bajó a 29 %. En relación a la humedad relativa, cuando esta superó el 87 % a una temperatura de 30 °C, la momificación aumentó en 7.75 % en relación a solo el efecto de la temperatura a 30 °C. De la misma forma, a 68 % de humedad y 30 °C, las momificaciones de larvas de la colonia solo aumentaron en 0.95 %. Claramente, bajas temperaturas y humedad elevada, favorecen la presencia de ascosferosis. Otros investigadores han encontrado que otros factores contribuyen a la transmisión y desarrollo de la enfermedad de la cría de cal en las colonias de abejas, como por ejemplo la cera estampada y el polen(5,23). También, una disminución en la proporción de abejas adultas con relación a crías contribuye a la prevalencia de la enfermedad(24). Quizá algunos de estos factores estén contribuyendo a la alta prevalencia de ascosferosis en Jalisco. Sin embargo, solo futuros estudios podrán determinar si estos u otros factores son responsables de esta alta prevalencia de la enfermedad.

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Conclusiones e implicaciones Se encontró un 74.1 % de muestras positivas a A. apis de 365 muestras evaluadas, lo que constituye una elevada prevalencia del hongo en colonias de abejas del sur de Jalisco. La prevalencia de A. apis fue particularmente alta en algunos municipios, donde el promedio de muestras positivas alcanzó más del 90 % y no hubo diferencias en prevalencia entre zonas. El factor climático que tuvo una asociación significativa con la presencia de A. apis y que muy probablemente influyó en una mayor presencia del hongo en las colonias de abejas, fue la precipitación pluvial. La altitud y la temperatura ambiental no tuvieron efectos significativos sobre la prevalencia de A. apis en este estudio. Debido a los altos porcentajes de presencia de A. apis en las colonias evaluadas, deben considerarse estudios posteriores para determinar cuáles son las causas (además de la precipitación pluvial), de la alta prevalencia de A. apis en colonias de abejas del sur de Jalisco.

Agradecimientos y conflictos de interés

Se agradece a las asociaciones de apicultores de la Federación Mexicana de Apicultores, Delegación Jalisco, por las facilidades otorgadas en la realización de este trabajo. En este trabajo ningún investigador participante manifiesta algún conflicto de interés.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5181 Artículo

Desarrollo y validación de un patrón visual para la evaluación del color de la carne de bovino en México

Sara Salinas Labra a María Salud Rubio Lozano b Diego Braña Varela c Rubén Danilo Méndez Medina b Enrique Jesús Delgado Suárez b*

Zoetis México.

Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Ciudad de México, México. c

Elanco Animal Health.

Autor de correspondencia: enriquedelgado.suarez@gmail.com

Resumen: El objetivo fue desarrollar una escala visual para la evaluación del color en carne de bovino. Se analizaron 1,165 lomos, a las 24 h post mortem, en cuatro rastros de la República Mexicana. En cada muestra se evaluó el color con ayuda de un patrón visual y con un espectrofotómetro (escala CIELAB), tomándose una fotografía de cada lomo. Por el método visual se identificaron siete categorías, (de rojo muy pálido a rojo muy oscuro) y las variables instrumentales del color (L*, a*, b*, C* y h*) se usaron para generar modelos de predicción de las categorías visuales. La escala se construyó utilizando L* como único predictor, pues este modelo explicó >90 % de la variación observada. El patrón se ilustró con fotos de las muestras con valor de L* dentro del intervalo de confianza al 95% de la media en cada categoría, desde rojo muy pálido (48.1<L*<48.8) hasta rojo muy oscuro (32.7<L*<33.4). La diferencia total de color entre categorías fluctuó entre 2.8 y 5.5, lo que sugiere que éstas son 479

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diferenciables a simple vista. La escala se validó mediante pruebas con un panel sensorial entrenado y otro de consumidores. Los jueces entrenados calificaron correctamente las muestras en el 92.6 % de las evaluaciones. En carne con apariencia de corte oscuro (CO), el panel entrenado tuvo 100 % de aciertos y el de consumidores 85.3 %. El patrón visual propuesto se sustenta en mediciones instrumentales y mostró ser técnicamente viable para la evaluación del color en carne de bovino por personal entrenado y por consumidores. Palabras clave: Carne de res, Bovino, Calidad, Color, Visual, Instrumental, Patrón.

Recibido: 05/12/2018 Aceptado: 30/07/2019

Introducción El color de la carne fresca se encuentra dentro de los principales atributos de calidad que influyen en la decisión de compra del consumidor(1,2). Es un hecho que los defectos en la coloración de la carne causan cuantiosas pérdidas económicas, debido a que provocan penalizaciones en su precio(3-5). Por ello, el color es uno de los principales atributos empleados para evaluar la calidad de canales y de carne en países que son grandes comercializadores, como Estados Unidos, Japón, Canadá y Australia(6-9). Estos esquemas de valoración se realizan con la ayuda de escalas visuales, las cuales están altamente correlacionadas con la decisión de compra del consumidor(10). Además, la detección temprana de defectos en el color permite segregar la carne con apariencia indeseable y redirigirla a procesos de manufactura en los que este atributo tiene menor relevancia(7). La razón de que se desarrollen patrones visuales para el mismo fin en diferentes naciones, radica en que el color de la carne es un fenómeno multifactorial. Por ejemplo, se conoce que factores como la raza, el sistema de producción, la dieta, así como el manejo previo y posterior a la matanza, los cuales varían de un país a otro, constituyen importantes fuentes de variación en el color de la carne(11,12). Por tanto, el empleo de estas herramientas por parte de la industria cárnica debe basarse en evidencias científicas generadas a partir del ganado local. Lo anterior cobra especial relevancia en el ganado bovino, especie que suele presentar una alta variación en sus atributos de calidad(13). En México, la ganadería bovina de carne está entre las actividades pecuarias de mayor importancia económica(14). Además, la carne de res goza de amplia popularidad en el país, con un consumo per capita anual de 17.40 kg(15); sin embargo, no se cuenta con herramientas científicamente sustentadas para la segregación de la carne según el color. La norma 480

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mexicana de clasificación de canales incluye al color como uno de los atributos que determinan el grado de calidad de éstas(16). Sin embargo, propone su evaluación a partir de una escala de colores sólidos de apenas tres niveles, del sistema pantone, que asocia con carne de color rojo-cereza, rojo intenso y rojo oscuro. Tal escala no es representativa de toda la gama de tonalidades que puede tener la carne de bovino y tampoco describe la apariencia asociada con defectos de calidad, como el corte oscuro (CO). Además, no toma en cuenta que la superficie de la carne es irregular, con fibras musculares en diferentes direcciones, presencia de tejido conectivo y grasa entreverada. Es por ello que el empleo de patrones fotográficos se considera una mejor alternativa para la evaluación subjetiva del color de la carne(17). Aunque actualmente existen algunas iniciativas privadas y se han realizado varios estudios de alcance regional(18-22), hasta el momento no se ha desarrollado un patrón visual que sirva de referencia para la industria nacional. Tal carencia representa una desventaja comercial para los productores locales, que pueden recibir penalizaciones en el precio de la carne con base en valoraciones subjetivas por parte de sus clientes. Por tanto, el objetivo del presente trabajo es desarrollar y validar un patrón para la evaluación visual del color de la carne de bovino a escala industrial en México. Con ello, se espera contribuir al ordenamiento del mercado, a mejorar la comunicación entre los distintos eslabones de la cadena de valor, así como a generar un método de evaluación subjetivo del color de la carne, científicamente sustentado, que subsane las deficiencias que presenta el sistema considerado en la normatividad vigente

Material y métodos Universo muestral Se utilizó un plan de muestreo no probabilístico, en el que se aplicaron los siguientes criterios para seleccionar los rastros que participaron en el estudio: 1) empresas ubicadas en alguna de las tres zonas ecológico-ganaderas de México (árida y semi-árida, trópico húmedo y trópico seco), 2) que las medias canales se cortaran entre la doceava y treceava costillas, 3) que fuera un rastro Tipo Inspección Federal (TIF) y 4) que existieran las condiciones técnicas de iluminación, espacio, acceso a los cortes primarios y área de cortes con temperatura de refrigeración de 6-8 ºC para realizar los trabajos. Con base en estos criterios, se seleccionaron cuatro rastros TIF, ubicados en Baja California, Sinaloa, Querétaro y Tabasco, en los que se analizó un total de 1,165 muestras (Figura 1). Como la carne fue sometida a un tiempo de oxigenación de 30 min antes de evaluar el color, esto obligaba a trabajar a un ritmo mucho más lento en comparación con el flujo de proceso. Por ello, no fue posible analizar todas las canales procesadas en un día. Entonces, se fijó 481

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como meta tomar al menos 170 canales por rastro, que fue el tamaĂąo de muestra mĂnimo determinado, considerando un nivel de confianza del 95%, una precisiĂłn de 0.5 unidades en las variables instrumentales del color y una varianza de 10.69, estimada a partir de pruebas preliminares. AsĂ, mediante la fĂłrmula đ?&#x2018;&#x203A; =

đ?&#x2018;?đ?&#x203A;ź2 â&#x2C6;&#x2014;đ?&#x2018;&#x2020; 2 đ?&#x2018;&#x2018;2

, se obtuvo un tamaĂąo de muestra de 164, el

cual se redondeĂł a 170. Sin embargo, con el fin de obtener la mayor variaciĂłn posible, en cada establecimiento se analizaron todos los lomos que fue posible recolectar en un turno de 8 h durante un perĂodo de 3 o 4 dĂas. Por ello, el tamaĂąo de muestra real por rastro fluctuĂł entre 172 y 405, segĂşn el volumen de matanza en cada establecimiento. Figura 1: NĂşmero de muestras de lomo analizadas en rastros TIF de cuatro estados de la RepĂşblica Mexicana entre noviembre de 2012 y julio de 2013

La poblaciĂłn de animales de la que se obtuvieron los datos estaba constituida, en cerca de un 80 %, por machos enteros sin castrar y el porcentaje restante por hembras. Como la investigaciĂłn se realizĂł en rastros, no siempre fue posible conocer la edad al sacrificio. No obstante, en una muestra de alrededor de 300 animales en que se disponĂa de este dato, el 86 % tenĂa 24 meses o menos. En general, cabe esperar que estas caracterĂsticas fueran predominantes en la muestra estudiada, tomando en cuenta reportes previos que documentan la preponderancia de toros jĂłvenes en la poblaciĂłn de matanza de bovinos de carne en MĂŠxico(23).

MediciĂłn del color Las mediciones de color, tanto visuales como instrumentales, se realizaron segĂşn los lineamientos de la AsociaciĂłn Americana de Ciencia de la Carne(24). Las lecturas se realizaron a las 24 h post mortem, en el ĂĄrea de corte y deshuese de cada rastro TIF, con temperatura ambiente controlada de 6 a 8 ÂşC. Para ello, se recolectaron los lomos completos (mĂşsculo Longissimus dorsi), reciĂŠn separados de la canal y con una temperatura no mayor a 3 ÂşC. Las piezas asĂ seleccionadas se dejaron reposar durante 30 min en una mesa de acero

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inoxidable, con el área del ojo de la chuleta entre las costillas doceava y treceava expuesta al aire, para permitir una óptima oxigenación de la mioglobina previo a las lecturas. La evaluación visual del color se realizó bajo condiciones estandarizadas. Se utilizó como fuente de luz una lámpara incandescente Osram de calidad fotográfica, con una intensidad de 150 candelas (1,614 luxes) y una temperatura del color de 3,200 ºK, colocada en un ángulo de 45º con respecto a la superficie de la chuleta. A cada chuleta evaluada se le tomó una foto de alta resolución, con ayuda de un fotógrafo profesional, que empleó para este fin una cámara Nikon D300S de 12 megapixeles, con lente Zoom de 24-70 f. 2.8 marca Sigma. Las fotos se tomaron contra un fondo negro, para eliminar diferencias de color asociadas con la superficie de la carne. Las fotografías se tomaron con el fin de contar con imágenes ilustrativas de las diferentes tonalidades de la carne, mismas que podrían ser incluidas en la escala visual de color que se estaba desarrollando. Posteriormente, el color se evaluó de manera visual, con el patrón para carne de bovino de Estados Unidos (Figura 2), que consta de ocho niveles(9). Esta actividad se realizó por un investigador experimentado en evaluación de canales bajo el esquema norteamericano, con el fin de tener una referencia preliminar sobre el número de categorías visuales que podrían presentarse en la muestra estudiada. Figura 2: Escala visual para la evaluación del color en canales de bovinos desarrollada en Estados Unidos de América(9)

Para las mediciones instrumentales se empleó un espectrofotómetro Hunter MiniScan EZ modelo 4500L, con geometría 45/0 y un tamaño de apertura del puerto de 25 mm (Hunter Associates Laboratory, Inc, Reston, Virginia, Estados Unidos). El instrumento se configuró con iluminante A, observador a 10° y el componente especular excluido. Además, se operó en modo remoto, por medio del programa OnColor QC Lite, versión 6 (CyberChrome, Inc., New Paltz, New York, Estados Unidos), para la captura de los datos en computadora. Se realizaron calibraciones previo al inicio de las mediciones y posteriormente cada 100 lecturas 483

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o despuĂŠs de 1 hora (lo que ocurriera primero), empleando la trampa negra y el azulejo blanco suministrados por el fabricante. En cada chuleta se tomaron cuatro lecturas, las cuales se promediaron para obtener los valores de luminosidad (L*), intensidad de rojo (a*), intensidad de amarillo (b*), tonalidad (h*) e Ăndice de satuaciĂłn (C*) de cada chuleta en la escala CIELAB. Junto con estos datos se recolectaron tambiĂŠn las curvas espectrales, mismas que constituyen la huella de color y que fueron necesarias para realizar la impresiĂłn profesional de la escala.

AnĂĄlisis de datos y conformaciĂłn de la escala visual Para el anĂĄlisis estadĂstico se empleĂł el software Statgraphics XV Centurion para Windows (Statpoint, Inc., The Plains, Virginia, Estados Unidos). Se compararon las medias de los valores instrumentales del color entre las categorĂas de calidad asignadas visualmente. Para ello, se realizĂł un anĂĄlisis de varianza (ANOVA) de clasificaciĂłn simple, mediante el procedimiento de Modelos Lineales Generalizados (MLG). Como se tenĂa un nĂşmero diferente de observaciones por nivel, cuando se encontraron diferencias significativas, las medias se discriminaron mediante el procedimiento de comparaciĂłn mĂşltiple de Bonferroni. Para la construcciĂłn de la escala, se probaron distintos modelos de predicciĂłn, tambiĂŠn con el procedimiento MLG, utilizando la categorĂa visual como variable dependiente y diferentes combinaciones de las variables instrumentales y sus interacciones como variables explicativas (ver Cuadro S1 en informaciĂłn suplementaria). Entre los modelos generados, se eligiĂł el que explicara el mayor porcentaje de la variaciĂłn observada entre categorĂas visuales, que resultĂł ser el que utiliza L* como Ăşnica variable explicativa. Por ello, se construyeron los intervalos de confianza al 95% de L* dentro de cada categorĂa visual. Para ilustrar la escala, se seleccionaron las fotos que correspondĂan a chuletas cuyos valores de L* se encontraban dentro del intervalo de confianza de la media en cada categorĂa. Por Ăşltimo, era necesario determinar si las categorĂas asĂ definidas podrĂan ser diferenciables de manera visual. Para este fin, se calculĂł la diferencia total de color (â&#x2C6;&#x2020;đ??¸*ab ), la cual se define como la suma de las diferencias modulares de L*, a* y b* entre dos muestras: (â&#x2C6;&#x2020;đ??¸*ab = â&#x2C6;&#x161;Î&#x201D;L*2 + Î&#x201D;a*2 + Î&#x201D;b*2 ). A mayor â&#x2C6;&#x2020;đ??¸* , mĂĄs fĂĄcil es distinguir la diferencia de color entre ab dos muestras de manera visual. No obstante, por lo general muestras con valores de â&#x2C6;&#x2020;đ??¸*ab >2 unidades se consideran fĂĄcilmente diferenciables a simple vista(25).

Experimento de validaciĂłn preliminar Con el fin de validar la escala visual previamente generada, el patrĂłn se desafiĂł a escala industrial, bajo las condiciones que a continuaciĂłn se describen. Se trabajĂł en un rastro que no participĂł en el muestreo inicial. Para la validaciĂłn, se conformĂł un panel sensorial 484

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entrenado, con seis personas familiarizadas con el patrón de color propuesto. Entre los candidatos a conformar el panel, los integrantes fueron seleccionados a partir de la prueba de Farnsworth-Munsell (http://www.color-blindness.com/farnsworth-munsell-100-hue-colorvision-test/#prettyPhoto), la cual permite descartar a las personas con deficiencias en la apreciación del color. El panel se conformó únicamente con jueces que tuvieron un resultado de deficiencia en la visión del color de “ninguna” o “ligera” (0 a 70 puntos). Se partió de un grupo inicial de 20 candidatos, los cuales se seleccionaron con base en lineamientos generalmente aceptados para la planificación y selección de jueces entrenados(26). Como resultado de este proceso, el panel sensorial quedó conformado por seis integrantes, con los cuales se realizaron seis sesiones de evaluación, en las que cada juez evaluó 6 muestras de carne (2 de carne de color normal (N), 2 de CO moderada y 2 de CO extrema), para un total de 36 mediciones por juez. Para las evaluaciones se utilizó una escala estructurada de 10 cm de longitud, acotada desde rojo muy pálido (L*=50) hasta rojo muy oscuro (L*=30) y que fue previamente explicada a los jueces: Rojo muy oscuro (L*=30)

Rojo muy pálido (L*=50)

Según la escala visual desarrollada, la carne CO extrema tiene valores de L* entre 30 y 34; la CO moderada, de 35-37 y la carne N, 38 o más. Se pidió a cada juez que marcara con una cruz en la escala, para indicar el color que correspondía a la muestra evaluada. La posición señalada por los jueces se midió con una regla para obtener el valor de L* estimado. Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza de 3 factores (juez, muestra, sesión y sus interacciones). Esto permitió verificar que la única fuente de variación significativa en las evaluaciones era la muestra. Por último, se realizó un análisis de correlación entre los valores de L* estimados a partir de la calificación del color realizada por los jueces y los valores de L* reales medidos con el espectrofotómetro. Para considerar la escala visual como válida para evaluar el color de la carne de bovino, se requirió obtener un poder discriminatorio significativo de los jueces, una correlación significativa de alta magnitud entre los valores de L* reales de las muestras y los valores de L* estimados por los jueces, así como un porcentaje de aciertos >80%, por parte de los jueces, al asignar la categoría de color a cada muestra. En trabajos previos con jugo de naranja y con vinos, las diferencias visuales de las muestras se han validado con un porcentaje de aciertos mucho menor del panel sensorial (ej. >50%)(27,28). No obstante, en la presente investigación se utilizó un punto de quiebre más alto, con el fin de determinar si la escala visual funcionaba para la mayor parte de las personas, razón por la cual también se solicitó a un panel de personas no entrenadas (n=6), que dictaminaran si existía diferencia entre muestras de carne N y CO. Ello con el fin de comprobar la confiabilidad de la escala, en caso de ser utilizada por personas sin entrenamiento en evaluación del color. Las muestras fueron seleccionadas y presentadas bajo las mismas condiciones descritas anteriormente para el panel entrenado. No obstante, al panel

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no entrenado solamente se le presentaron pares de muestras y se pidió a los jueces que eligieran la muestra que preferían según el color.

Resultados Definición de categorías visuales y su relación con mediciones instrumentales La evaluación visual permitió identificar en la muestra estudiada siete de las ocho clases representadas en el patrón norteamericano. Lo anterior debido a que ninguna de las muestras tuvo apariencia similar a la categoría 5 (ligeramente rojo oscuro). La distribución de las muestras en cada una de las siete clases identificadas se presenta en la Figura 3. Figura 3: Distribución de muestras (n=1,165) en cada una de las categorías visuales identificadas con ayuda del patrón norteamericano para la evaluación del color en carne de bovino (la descripción de cada categoría es igual que en la Figura 2).

La proporción de carne asociada con defectos de calidad (categorías 7 y 8, que representan diferentes grados de la apariencia CO) fue relativamente baja (7 %). Por el contrario, más del 70 % de las muestras se ubicó entre las categorías 2 a 4, apariencia que típicamente se asocia con carne de calidad normal. Por otra parte, el ANOVA resultó significativo (P<0.0001) para todas las variables instrumentales del color (Cuadro 1). No obstante, L* fue la única que presentó diferencias significativas entre las medias de todas las categorías. Además, el ANOVA de L* fue el único que tuvo un alto coeficiente de determinación (R2=0.9171), mientras que en las otras variables osciló entre 0.2744 y 0.4284.

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Cuadro 1: Medias de mĂnimos cuadrados de las variables instrumentales del color en carne de cada una de las categorĂas visuales identificadas en la muestra CategorĂas visuales Variable 1 2 3 4 6 7 8 EEď&#x201A;ą1 R2 n 30 62 283 264 314 144 68 a b c d e f L* 48.8 46.7 44.4 42.1 40.1 37.7 34.8g 0.94*** 0.9171 a* 27.4a 27.8a 27.5a 27.1ab 26.3b 25.1c 22.6d 2.04*** 0.2744 b* 20.1a 20.2a 19.1b 18.3c 17.3d 16.0e 13.5f 2.12*** 0.3522 C* 34.1a 34.3a 33.4ab 32.7b 31.5c 29.8d 26.3e 2.21*** 0.3082 h* 36.3a 35.9a 34.7b 33.9c 33.2d 32.4e 30.7f 1.41*** 0.4284 1

a,b,c,d,e,f,g

Error estĂĄndar del estimador. Medias con letras diferentes en una misma fila difieren (P<0.05). ***P<0.0001.

Aunque se probaron otros modelos de predicciĂłn (ver Cuadro S1 en informaciĂłn suplementaria), ninguno de ellos mejorĂł el que se obtuvo con L* como Ăşnica variable explicativa y, por tanto, fueron descartados. Por ello, se utilizaron los intervalos de confianza al 95% de la media de L* como criterio para seleccionar las fotos representativas de cada una de las categorĂas visuales que conformaron la escala de color desarrollada (Figura 4). Un rasgo notorio de esta Ăşltima es que la apariencia de la carne en algunas categorĂas adyacentes es muy parecida. Por ejemplo, las categorĂas 1 y 2 son representativas de carne pĂĄlida. De igual forma, las categorĂas 3 y 4 son representativas del tono rojo-cereza brillante, que suele ser el mĂĄs atractivo para los consumidores en el punto de venta. Por ello, en un principio se considerĂł fusionar ambos pares de categorĂas en una sola. Sin embargo, el â&#x2C6;&#x2020;đ??¸*ab entre estos pares de categorĂas fue de casi 3 unidades CIELAB, lo que indica que son claramente diferenciables entre sĂ a simple vista. Por tanto, en lugar de fusionarlas, lo que se hizo fue utilizar una denominaciĂłn que permitiera al usuario identificar que ambas categorĂas estĂĄn asociadas con carne de tonalidad similar. AsĂ, las categorĂas 1 y 2 fueron renombradas como 1A y 1B, respectivamente, mientras que 3 y 4 fueron denominadas 2A y 2B. Estos ajustes obligaron a modificar tambiĂŠn la denominaciĂłn de las categorĂas restantes (5, 6 y 7), quedando ĂŠstas como 3, 4 y 5, cuya apariencia es claramente diferenciable entre sĂ, con un â&#x2C6;&#x2020;đ??¸*ab entre estas clases mucho mayor (3.3 a 5.5 unidades CIELAB).

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Figura 4: Escala visual para la evaluaciĂłn del color de la carne de bovino en MĂŠxico

Los valores de L* que se indican corresponden al intervalo de confianza al 95% de la media para cada categorĂa. En la parte inferior, se seĂąalan las diferencias totales de color (â&#x2C6;&#x2020;đ??¸*ab ) entre categorĂas adyacentes.

ValidaciĂłn preliminar de la escala descriptiva en condiciones industriales El primer criterio de validaciĂłn de la escala de color fue que el panel sensorial detectara las diferencias entre las muestras. En este sentido, se obtuvieron resultados satisfactorios, pues tanto los jueces en lo individual, como el panel como grupo, mostraron un poder discriminatorio suficiente (ANOVA significativo, P<0.0001) para detectar las diferencias entre las muestras. AdemĂĄs, se comprobĂł que el Ăşnico factor que incidĂa significativamente (P=0.0002) en la puntuaciĂłn de los jueces era la muestra (ver Cuadros S2 a S4 en informaciĂłn suplementaria). La correlaciĂłn entre los valores reales de L* de las muestras y los asignados por los jueces (Figura 5), que fue el segundo criterio de validaciĂłn, fue significativa y de alta magnitud (r=0.9338, P<0.0001). Estos resultados se corresponden con el porcentaje de aciertos por parte de los jueces, tercer y Ăşltimo criterio de validaciĂłn de la escala, los cuales, en promedio, asignaron correctamente las muestras a la categorĂa visual del patrĂłn en el 92.6 % de las evaluaciones. En cuanto a detecciĂłn de CO, la escala mostrĂł un desempeĂąo aun mejor, pues las muestras que presentaban esta condiciĂłn fueron correctamente asignadas en el 100 % de los casos por todos los jueces. TambiĂŠn se comprobĂł que es posible distinguir los diferentes grados del defecto CO, ya que los jueces entrenados sĂłlo confundieron la CO moderada con la extrema en el 5 % de las evaluaciones. Por Ăşltimo, en la evaluaciĂłn realizada por el panel no entrenado, se comprobĂł la pertinencia de las categorĂas que describen el defecto CO. Lo anterior en virtud de que en el 85.3 % de las evaluaciones realizadas por los panelistas no entrenados, se prefiriĂł el color de la carne N sobre la CO. En general, los resultados de las pruebas sensoriales demuestran la viabilidad tĂŠcnica de la escala de color propuesta, toda vez que tanto personal entrenado como consumidores fueron capaces de utilizarlo para dictaminar de manera correcta la apariencia de la carne. 488

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Figura 5: Análisis de regresión entre L* estimada por el panel sensorial entrenado y L* real de las muestras medido con el espectrofotómetro (n=108)

El modelo incluye los límites de predicción bilaterales. ***P<0.0001.

Discusión En esta investigación se presenta el primer patrón visual para la evaluación del color de la carne de bovino en México, sustentado científicamente con datos tomados en el ganado que se produce en el país. La escala desarrollada contiene categorías que describen carne de apariencia pálida, rojo-cereza, rojo fuerte, rojo oscuro y rojo muy oscuro. Estas tonalidades son claramente diferenciables de manera visual y, además, muestran una alta correlación con variables instrumentales del color, particularmente con L*. Esto coincide con lo observado en estudios anteriores, en los que L* ha sido la variable mejor relacionada con la apariencia visual de la carne(29,30). En algunos estudios realizados en México, se ha utilizado la saturación del color (C*<30) como uno de los criterios para identificar carne CO(3). Aunque en este estudio se utilizó un instrumento y condiciones de medición diferentes, se observaron también valores de C* inferiores a 30 en carne con apariencia de cortes oscuros. No obstante, C* sólo explicó cerca del 30 % de las diferencias entre los distintos niveles de la escala, mientras que para L* el coeficiente de determinación fue superior al 90 %. De hecho, la alta correlación entre L* y la apariencia visual que se observó en este estudio sugiere que las mediciones instrumentales se pueden usar ya sea para orientar a los evaluadores que utilizan la escala visual, o bien, para sustituir el empleo de esta última en empresas que cuenten con tecnología instrumental para medir el color. Por otra parte, las categorías o clases incluidas en la escala se pueden asociar con determinadas ventajas comerciales o con defectos de calidad. Por ejemplo, la carne 489

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representada en las categorías 1A y 1B posee una apariencia similar a la que se describe en carne pálida, suave y exudativa (PSE)(31). Este defecto se asocia con propiedades funcionales deterioradas, especialmente con una reducida capacidad de retención de agua. Se sabe, no obstante, que el fenómeno PSE ocurre con muy poca frecuencia en la especie bovina y por lo general sólo se presenta cuando se aplica un enfriamiento muy lento de las canales(32). Aun así, 46 unidades (3.9 %) de la muestra analizada presentaron una apariencia extremadamente pálida y otras 150 (12.9 %) se clasificaron como moderadamente pálidas. Probablemente esto se deba a deficiencias en la velocidad de enfriamiento de las canales, o a una muscularidad excesiva que limite o retrase la pérdida de calor y promueva una caída más rápida del pH muscular, condiciones que podrían ser comunes en muchos rastros TIF en México. No obstante, investigaciones recientes sugieren que el color rojo claro es percibido como indicador de calidad en carne de bovino por los consumidores mexicanos(33), lo que implica que la carne fresca con esta apariencia no debe sufrir penalizaciones en precio. Las siguientes dos categorías (2A y 2B), representan la apariencia típica (rojo-cereza brillante) que los consumidores aprecian en la carne fresca(4). Al parecer, cabe esperar que una buena parte de la carne de bovino que se produce en el país cumple con esta demanda, ya que 60 % de las muestras analizadas presentaron estas tonalidades. Por tanto, la identificación de este tipo de carne constituye un apoyo para explotar al máximo las ventajas competitivas que ofrece su favorable apariencia para las ventas al detalle. La categoría 3, por su parte, describe la carne que se encuentra en el límite de calidad aceptable. Su apariencia es un poco más oscura, determinada por los valores más bajos de L*, lo que la pone en desventaja con respecto al rojo-cereza, que se asocia con animales más jóvenes. Es conocido que, a medida que los animales envejecen, la luminosidad de la carne se reduce, lo que resulta en una apariencia más oscura de esta(34). No obstante, la categoría 3 guarda una diferencia total de color bastante segura (3-5 unidades CIELAB) con respecto a las categorías que describen el defecto CO (4 y 5). Por último, las categorías 4 y 5 son representativas del defecto CO, el cual provoca pérdidas millonarias a la industria y es, por mucho, a escala global, el defecto de calidad de mayor importancia en carne de bovino(7). Aunque se han descrito diferentes grados de la condición CO (ej. clásica, ligera y atípica), estudios recientes han demostrado que todas ellas tienen en común una apariencia oscura indeseable y atributos de calidad deteriorados(5,35), por lo que ameritan penalización económica. En México, se ha estimado que el valor de las canales CO se reduce en aproximadamente 85 USD(3). Aunque la proporción de unidades con apariencia CO en la muestra analizada es aparentemente baja (7 %), el impacto económico de esta tasa, si se presentara a escala nacional, puede representar millones de dólares, tomando en cuenta que la matanza anual es de 4 millones de cabezas, tan solo en rastros TIF(36). Por ello, la descripción de carne CO en la escala propuesta es de gran relevancia, puesto que provee las bases para la detección temprana de este defecto, ofreciendo la posibilidad de segregar la 490

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carne defectuosa y, ademĂĄs, gestionar los procesos asociados con la matanza, para reducir su incidencia. El cĂĄlculo de â&#x2C6;&#x2020;đ??¸*ab demostrĂł que las categorĂas representadas en la escala pueden ser fĂĄcilmente diferenciadas de manera visual. En algunos estudios se ha sugerido que el ojo humano puede percibir diferencias en el color a partir de valores de â&#x2C6;&#x2020;đ??¸*ab >1(25), cifra muy inferior a las que se observaron en este trabajo entre las categorĂas visuales propuestas (2.85.5). Por otra parte, la validaciĂłn demostrĂł la pertinencia de la estrategia seguida para desarrollar la escala, con una alta correlaciĂłn entre las evaluaciones del panel sensorial entrenado y la variable predictiva utilizada (L*). Sin duda, esto contribuyĂł a que mĂĄs del 90 % de los jueces entrenados asignaran correctamente la categorĂa visual a las muestras evaluadas. De igual forma, se comprobĂł que las categorĂas asociadas con CO, que es el principal defecto de calidad en carne de bovino, son fĂĄcilmente identificadas tanto por personas entrenadas como por consumidores. Ello abre la posibilidad de emplear la escala visual de forma generalizada en el entorno industrial, como alternativa a las mediciones instrumentales, pues el uso de estas Ăşltimas requiere inversiones econĂłmicas que estĂĄn fuera del alcance de la mayor parte de la industria. No obstante lo analizado hasta el momento, se debe seĂąalar que el presente estudio no propone el uso del patrĂłn visual como Ăşnico criterio para determinar la calidad de la carne. Aunque se ha documentado ampliamente que el color es un factor clave en la decisiĂłn de compra por parte del consumidor, se sabe que ĂŠste no se correlaciona con la suavidad o con la aceptaciĂłn sensorial de la carne(4). Por tanto, si se pretende evaluar la calidad de las canales, serĂĄ preciso complementar la evaluaciĂłn del color con la de otros atributos de calidad (ej. pH final, madurez fisiolĂłgica de los animales, marmoleo, entre otros)(7). Adicionalmente, la escala que aquĂ se presenta se basa en mediciones realizadas a las 24 h post mortem. Por tanto, su aplicaciĂłn en el contexto de la cadena de distribuciĂłn podrĂa no ser del todo consistente, pues la temperatura de almacenamiento, el tipo de empaque, la bioquĂmica del mĂşsculo, entre otros factores, pueden modificar el color de la carne y la estabilidad del mismo(11,37). Por otra parte, aunque es posible optar por el uso exclusivo de la mediciĂłn instrumental para evaluar el color, se deben tomar ciertas precauciones. En primer lugar, los valores de L* tĂpicos que se reportan para cada categorĂa se midieron con un espectrofotĂłmetro cuya configuraciĂłn (apertura del puerto, geometrĂa, iluminante, etc.) puede ser diferente a la de otros equipos. Por tanto, el uso de otros instrumentos o configuraciones distintas a las aquĂ empleadas pueden hacer variar los resultados.

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A pesar de lo anterior, la escala desarrollada puede ser muy útil para estimar, desde los rastros, si la apariencia de la carne pudiera repercutir positiva o negativamente en la decisión de compra por parte de los clientes. Además, su empleo puede facilitar una comunicación más eficiente, por el uso de un descriptor técnico objetivo, al momento de comercializar la carne. Particularmente, la escala demostró funcionar muy bien en lo que respecta a la identificación de carne con apariencia de corte oscuro, cuya temprana detección en los rastros es de gran importancia económica.

Conclusiones e implicaciones La escala descriptiva desarrollada en este estudio provee ilustraciones típicas de la apariencia que puede tomar la carne de bovino en México, así como de los intervalos de L* asociados con cada una de ellas. La concurrencia de criterios visuales e instrumentales en la herramienta permite su puesta en práctica de manera versátil, ya sea con paneles sensoriales, con mediciones instrumentales o mediante la combinación de ambos. La escala está concebida como herramienta para la evaluación del color en el rastro, a las 24 h post mortem y ha mostrado un excelente desempeño para la detección de carne con apariencia de corte oscuro en pruebas de validación realizadas en el entorno industrial. En empresas que realicen evaluación de canales, esta herramienta podría integrarse como un criterio más para definir la calidad de las mismas.

Agradecimientos Este estudio fue realizado con recursos del fondo sectorial SAGARPA-CONACYT, proyecto 109127. Los autores agradecen al profesor Melvin C. Hunt, por su asistencia técnica para la revisión y puesta a punto de la metodología de trabajo empleada en el presente trabajo

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(Información suplementaria) Cuadro S1: Modelos de predicción de la categoría visual, ensayados en una estrategia de selección paso a paso, utilizando la categoría visual como variable dependiente y las variables instrumentales del color y sus interacciones, como variables explicativas (n=1165) en el procedimiento de Modelos Lineales Generalizados de Statgraphics XV Centurion Variables explicativas incluidas en el ES1 modelo P R2 L* 0.40 <0.0001 0.9145 a* 1.22 <0.0001 0.2134 b* 1.13 <0.0001 0.3269 C* 1.18 <0.0001 0.2651 h* 1.05 <0.0001 0.4172 L*, a*, b*, C*, h* 0.40 <0.0001 0.9168 L*, a*, b*, C* 0.40 <0.0001 0.9153 L, a*, b* (L* x a* x b*) 0.40 <0.0001 0.9163 L*, a*, (L* x a*) 0.40 <0.0001 0.9165 L*, b*, (L* x b*) 0.40 <0.0001 0.9159 L*, C*, (L* x C*) 0.40 <0.0001 0.9160 L*, h*, (L* x h*) 0.40 <0.0001 0.9156 1

Error estándar del estimador.

Cuadro S2: Valor F y nivel de significación estadística (P) del ANOVA realizado con los datos de calificación del color emitidos por cada juez entrenado (n=36) en muestras de carne con apariencia rojo pálida, normal, CO moderada y CO extrema Juez FANOVA P 1 193.3 <0.0001 2 139.1 <0.0001 3 138.3 <0.0001 4 116.5 <0.0001 5 103.9 <0.0001 6 91.9 <0.0001

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Cuadro S3: ANOVA realizado con los datos de calificación del color emitidos por el panel sensorial entrenado en muestras de carne con apariencia rojo pálida, normal, CO moderada y CO extrema Fuente Suma de GL1 Cuadrado medio Razón-F Valor-P cuadrados Entre grupos 141.022 3 47.0074 639.52 0.0000 Intra grupos 7.64444 104 0.0735043 Total (Corr.) 148.667 107 1

Grados de libertad.

Cuadro S4: ANOVA multifactorial1 para la calificación del color Efecto Razón-F Valor-P Juez 0.95 0.4491 Muestra 7.04 0.0002 Sesión 0.89 0.4919 Juez x Muestra 0.86 0.6126 Juez x Sesión 0.68 0.8701 Muestra x Sesión 1.03 0.4254 Juez x Muestra x Sesión 0.92 0.9860

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5349 Revisión bibliográfica

Bolos intrarruminales con liberación controlada de minerales traza. Revisión

Misael León-Cruz a Efrén Ramírez-Bribiesca a* Raquel López-Arellano b Leonor Miranda-Jiménez a Gabriela Rodríguez-Patiño b Víctor M. Díaz-Sánchez b Alma L. Revilla-Vázquez b

Colegio de Postgraduados. Programa de Ganadería. Campus Montecillo. Km. 36.5 Carr. México-Texcoco. 56230, Estado de México. México. b Universidad

Nacional Autónoma de México, FES Cuautitlán, Cuautitlán Izcalli, Estado de

México.

* Autor de correspondencia: efrenrb@colpos.mx

Resumen: Los minerales traza son nutrientes esenciales para el mantenimiento de la vida, el crecimiento y la reproducción. Las deficiencias de minerales en rumiantes afectan las funciones fisiológicas y metabólicas que con frecuencia causan enfermedades. El diseño y uso de los bolos intrarruminales de liberación controlada (BILC) es una alternativa para corregir la falta de los microelementos en el organismo. El propósito de esta revisión es evidenciar la información disponible sobre los diferentes tipos de BILC de minerales traza, así como de los métodos de fabricación que incluye: técnicas de extrusión en caliente,

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granulación por fusión y fusión directa. Además, se describen los efectos de BILC relacionados en la salud, en los parámetros productivos y reproductivos en rumiantes. Palabras clave: Bolos intrarruminales, Mecanismos de liberación, Concentración mineral, Cinética de liberación.

Recibido: 24/04/2019 Aceptado: 21/05/2019

Introducción La deficiencia de minerales traza en los pastos y forrajes de diversas regiones ganaderas son comunes en el mundo y en México. Las principales causas son la baja concentración mineral en los suelos y el antagonismo entre minerales que dificulta su disponibilidad para las plantas y animales(1). Los minerales traza como el cobre (Cu), zinc (Zn), cobalto (Co), selenio (Se) y yodo (I) son deficientes en rumiantes(2-5) y ocasionan trastornos en los parámetros productivos y reproductivos(1). Ante esta problemática la industria alimentaria y farmacéutica veterinaria han desarrollado productos con suplementos de minerales traza en forma de: premezclas minerales, bloques y soluciones inyectables, pero se requieren dosificaciones frecuentes, y el consumo es variable cuando se suministran a libre acceso(6,7). Los bolos intrarruminales de liberación prolongada (BILC) son dispositivos diseñados para ser administrados por vía oral y deben permanecer en el retículo-rumen por periodos de tres meses o hasta un año(8,9), considerado el método más indicado para corregir deficiencias de los minerales traza en rumiantes en pastoreo(6,10,11). El diseño de BILC se puede realizar con los siguientes criterios básicos: las dimensiones, la geometría de los sistemas de liberación y la densidad. Estos criterios determinan la forma de liberación de los minerales; para ello se han utilizado materiales (excipientes) que mediante diversos mecanismos controlan la velocidad de dosificación(8,9). En esta revisión se describen los diferentes tipos de BILC de minerales traza, así como los métodos de fabricación, considerando la extrusión en caliente, granulación por fusión y fusión directa. Además, se discuten los efectos de BILC en la salud, en los parámetros productivos y reproductivos de rumiantes.

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Bolos intrarruminales de liberación controlada Los BILC son dispositivos sólidos que pueden liberar minerales traza, fármacos, promotores de crecimiento y nutrientes en el retículo-rumen de los rumiantes(8,9). Deben cumplir con ciertas características para permanecer en el retículo-rumen y liberar la dosis correcta, de manera inmediata o controlada. En el diseño se consideran tres criterios básicos(8,9,12,13): Dimensiones. El diámetro de los bolos debe ser alrededor de 25 mm con longitud variable de 40 a 100 mm. Geometría de los sistemas de liberación. Comúnmente la forma es cilíndrica o esférica, con puntas redondas y superficie lisa o con forma de cápsula, de manera que se pueda administrar por vía oral. Sin embargo, existen diseños con alas plegables, hojas y anillos compresibles que se convierten en forma expandida, para evitar la regurgitación y permanecer en el retículo-rumen durante el tratamiento. Densidad. Debe ser superior a 2.0 g cm-3 para garantizar la permanencia del bolo en el retículo-rumen. Esta puede lograrse al incluir en la formulación un agente densificador como el hierro (Fe) o vidrio soluble.

Bolos comprimidos Este tipo de bolo está compuestos por una matriz comprimida que contiene fármacos o minerales traza, y pueden estar recubiertos por membranas poliméricas(14). Se diseñaron para disolverse o desgastarse por acción mecánica del rumen(8), por lo tanto, la liberación del fármaco o minerales traza ocurre mediante la erosión o difusión del bolo durante periodos predeterminados(14). Se determinó que densidades superiores a 2.0 g cm-3 es suficiente para asegurar la retención del bolo en el retículo-rumen y evitar la regurgitación(15). Por ejemplo en Australia desarrollaron un bolo erosionable a base de óxido cobáltico (Co3O4) y otros diluyentes para suministrar Co a rumiantes en pastoreo(16). Los bolos contenían entre 30 a 90 % de Co3O4, con peso variable de 5.5 a 30 g, y resultaron eficaces para proporcionar Co hasta por más de un año(16,17). A pesar que los bolos tenían un peso específico entre 3.5 y 4.1(17), presentaron problemas de regurgitación, así como de formación de una capa de fosfato de calcio en la superficie, que impidió la correcta disolución del bolo(7,17). Para disminuir la incrustación de fosfato de calcio en el bolo se optó por administrar un tornillo de acero que al hacer contacto con el bolo las abrasiones desintegran los fosfatos de calcio(17,18). Este problema también se observó en bolos de pellets de Se formulados con 5 o 10 % de Se y 90 o 95 % de Fe, los cuales tenían un peso aproximado de 10 g, con 12 mm de diámetro y 15 mm de largo(19). Sin embargo, algunas 500

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formulaciones resultaron poco efectivas, aseverando que el tamaño de la partícula de Se utilizada en la fabricación de los pellets fue el factor limitante en la liberación de Se a largo plazo(18,20). De manera similar desarrollaron bolos de pellets de Zn a base de la mezcla de 5 g de Zn y 5 g de limadura de Fe. Los bolos presentaron tasas de liberación de 10 mg de Zn día-1(21). Varios autores han desarrollado bolos comprimidos diseñados para suministrar Se a caprinos(22) y ovinos(23,24). Por ejemplo, en un estudio demostraron la efectividad de bolos de 10 g para corregir la deficiencia de Se en ovejas. El bolo se fabricó con 5.23 % de selenito de sodio, 68.77 % de Fe, 25 % de cutina y 1 % de estearato de magnesio(24). Sin embargo, con esta estrategia de suplementación se presentaron problemas de regurgitación, por ello en el diseño se debe considerar la forma geométrica y la densidad del bolo. Para lo anterior, se diseñó un bolo que posee alas poliméricas y se expanden al entrar en contacto con el fluido ruminal, esto evita la regurgitación del bolo. El dispositivo contiene en su interior un resorte que actúa sobre un pistón y que a su vez ejerce presión sobre la matriz erosionable que puede contener fármacos o minerales traza. La liberación se da cuando la matriz entra en contacto con el medio exterior a través de un portal en uno de los extremos del bolo(8). Con un enfoque diferente(23), se diseñó un bolo para el tratamiento de la coccidiosis en corderos. El bolo consistió en una matriz que contiene 30 % de sulfametazina sódica, 54.4 % de Fe reducido, 15 % de aceite de ricino hidrogenado y 0.5 % de estearato de magnesio. El peso promedio del bolo fue de 18.5 g y la densidad de 2.3 g cm-3. La liberación de la sulfametazina se produce a través de difusión y erosión de la matriz. Además determinaron que dosis de 800 mg kg-1 PV y la fuerza de compresión superior a 2,160 kg cm-2 es suficiente para mantener liberaciones sostenidas y concentraciones plasmáticas de sulfametazina (>25 µg ml-1) hasta por 100 h, siempre que la resistencia mecánica de los bolos sea de 33.5 ± 1.2 kg(23). Los bolos formulados con selenito de sodio y sulfametazina tienen peso promedio de 20.13 g, densidad de 2.0 g cm-3, longitud de 52.05 y 21.22 mm de ancho. Estos bolos resultaron eficaces para controlar la coccidiosis y mantener el contenido adecuado de sulfametazina y selenio en cabritos(22). En la fabricación de los bolos se han utilizado diferentes polímeros insolubles en fluidos ruminales, como revestimiento de matrices que contienen fármacos o minerales traza. Los polímeros forman una membrana quebradiza que permite la erosión de la matriz y la liberación de fármacos o minerales traza(25). Un ejemplo de este enfoque es el bolo AllTrace® compuesto de una mezcla comprimida de 30 g que contiene sales inorgánicas (óxido de cobre, selenito de sodio, sulfato de cobalto, yoduro de potasio, sulfato de manganeso, óxido de zinc (ZnO), sulfato de zinc) y vitaminas A, D3 y E. En un extremo tiene un contrapeso de 18 g que asegura la permanencia del bolo en el retículo-rumen, al final de su vida útil se disuelve totalmente sin dejar residuos. El bolo es recubierto por una 501

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resina de polímero inerte que controla la liberación durante un periodo aproximado de 240 días, excepto el extremo superior que va a estar en contacto con el ambiente ruminal(26,27).

Bolos extruidos Este tipo de bolo se obtiene por extrusión de la formulación de minerales traza y excipientes poliméricos(14), el proceso se describe en la sección de métodos de fabricación de bolos. Este bolo fue desarrollado en Nueva Zelanda para el tratamiento del eccema facial. El bolo consiste en una matriz extruida de ZnO cubierta con un material ceroso e impermeable al fluido ruminal, excepto un extremo que al entrar en contacto con el líquido ruminal se erosiona para liberar el microelemento. A medida en que la matriz se erosiona, el recubrimiento ceroso se desintegra; esto garantiza la exposición constante de una parte de la matriz al medio ruminal(14,28,29).

Bolos de vidrio soluble Los bolos de vidrio soluble (BVS) fueron diseñados para suministrar Cu, Zn, Co, Se y I a rumiantes en pastoreo(6,11,30-35). La composición consta de pentaoxido de fosforo (P2O5), óxido de sodio (Na2O) y óxido de calcio (CaO), como óxidos formadores y modificadores del vidrio. Esta composición permite una tasa de liberación en el retículo-rumen de no más de 25 mg cm-2 día-1(36), lo que hace posible que puedan administrarse a los rumiantes para liberar minerales traza hasta por más de un año(30,31). La liberación de los microelementos ocurre por difusión o disolución del vidrio, y en mayor proporción por erosión(8,13,30,36,37). Los bolos para ovejas tienen peso variable de 30 a 35 g, una longitud de 40 a 50 mm, un diámetro de 14 a 19 mm y densidades de 2.7 a 4.0 g cm-3, mientras que los bolos para bovinos son de mayor dimensión; pesos de 100 g, diámetro de 24 a 26 mm y longitud de 80 mm(36). Otros aspectos que se deben considerar en el diseño de los bolos son el tamaño de la partícula y el pH del medio de alojamiento(37);esto con el propósito de lograr la tasa de liberación antes citada. Los BVS presentan múltiples ventajas, entre ellas incluyen una menor formación de fosfato de calcio en el bolo(1), lo que facilita la disolución, mejores perfiles plasmáticos(30,31,35), mayores índices productivos y reproductivos(32,35,38,39), así como beneficios económicos(6,11). Sin embargo, durante el proceso de fabricación de BVS no es posible incluir materiales (excipientes o fármacos) sensibles o inestables a las altas temperaturas de formación del vidrio. No obstante, la incorporación de fármacos u otros componentes en el vidrio puede ser mediante procesos de sinterización mediada por presión(37).

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Bolos de magnesio Los bolos de magnesio (Mg) consisten en un cilindro formados por aleación de Mg, aluminio y Cu (86, 12 y 2 %, respectivamente), contienen Fe disperso en la matriz del bolo para aumentar la densidad. Los bolos para ovejas pesan alrededor de 35 g y se erosionan por influencias electroquímicas en el rumen, liberando el Mg en un periodo aproximado de tres semanas(40). Otro ejemplo de bolo de Mg consiste en dos mitades cilíndricas ligadas con una goma para facilitar su administración, cuando el bolo llega a rumen, se abre para evitar la regurgitación y libera por acción electrolítica una tasa aproximada de 2 g Mg por dispositivo durante un periodo de tres meses(41).

Cápsulas con alambre de óxido de cobre Los alambres de óxido de cobre (CuO) se han utilizado para corregir deficiencias de Cu en ovinos(21,42,43) y bovinos(44). Miden entre 3 y 12 mm de largo, 0.5 a 1 mm de diámetro y tienen gravedad especifica de 6.1 a 6.4(42,45,46), generalmente son recubiertos por una mezcla de óxido cúprico y cuproso(21) o contenidos en cápsulas de gelatina(42,46). Los alambres de CuO se depositan en el retículo-rumen y luego fluyen al abomaso, en donde el ácido clorhídrico los disuelve para liberar iones de Cu que se absorben en procesos bioquímicos normales(41,46). La administración de cápsulas de alambres de CuO aumentan la concentración de Cu hepático durante 6 a 12 meses; esto se debe a la inercia relativa de las partículas en el retículo-rumen y a la retención en el abomaso(21).

Métodos de fabricación de BILC Extrusión en caliente Esta técnica se emplea para elaborar productos farmacéuticos como tabletas, cápsulas, películas e implantes para la administración de fármacos por vía oral, transdérmica y transmucosa(47,48). El proceso consiste en el bombeo de materias primas a través de un tornillo que gira a temperaturas de 30 hasta 250 °C dentro de un troquel; consiguiendo una mezcla homogénea de los compuestos activos y aglutinantes (termoplásticos y polímeros). El equipo utilizado comúnmente se denomina extrusora, consta de un barril que contiene bandas que calientan, reblandecen la mezcla de compuestos químicos y la comprime. Finalmente el extruido es conducido hacia la matriz para darle la forma y las dimensiones requeridas(47,49).

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Granulación por fusión La granulación por fusión es una técnica basada en la utilización de agentes aglutinantes sólidos, que se funden a temperaturas entre 50 a 80 °C. Esto permite emplearse para la formulación de fármacos o minerales traza sensibles a la humedad, evitando el uso de solventes acuosos u orgánicos(50). El proceso de granulación puede consistir de un solo paso; para lo anterior el agente aglutinante se añade junto con el resto de los componentes de la mezcla a un mezclador granulador de alta velocidad. La fusión del agente aglutinante se da por el calor generado con la corriente de aire durante la fase de mezclado, amasado y secado. Finalmente el granulado se obtiene de la unión entre el aglutinante fundido y las partículas de polvo, una vez seco debe tamizarse con el fin de obtener el tamaño de gránulo deseado(51). Dependiendo de la finalidad farmacéutica, el granulado se puede encapsular para la liberación inmediata del fármaco o comprimir para formar bolos intrarruminales de liberación controlada.

Fusión directa Esta técnica consiste en fundir la mezcla de componentes activos con los excipientes a temperaturas entre 500 a 1,100 °C. La masa fundida se vierte en moldes para formar un producto final, por ejemplo, varillas de vidrio, tubos de vidrio, discos de vidrio, granulados y bolos monolíticos de liberación controlada. Generalmente se emplean componentes formadores de vidrio de alta solubilidad como óxidos formadores de vidrio (vitrificantes) y óxidos modificadores (fundentes y estabilizantes) que permitan la formación correcta de la red del vidrio(36,37).

Diseño de bolos con minerales traza Nuestro grupo de investigación propone un procedimiento simple y económico para elaborar bolos intrarruminales con minerales traza de liberación controlada. Por ejemplo, en el diseño de bolos de selenio, el procedimiento consiste en adicionar cantidades de selenito de sodio, 13 %, cutina, 32 %; Fe, 54 % y estearato de magnesio, 1 % (Figura 1). Los bolos para corderos pueden tener peso promedio de 8 g, dureza de 21.17 kp y densidad de 2.08 g cm-3. Los valores recomendados de densidad para su retención en el rumen deben ser superior a 2.0 g cm-3(8,9,15). El excipiente utilizado para formar la matriz de liberación ha resultado adecuado para liberar Se.

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Figura 1: Diagrama del proceso de elaboración de bolos intrarruminales de selenio por el método de granulación por fusión

Suplemento de minerales traza con BILC El Cu, Zn, Co, Se y I son minerales traza que se han usado para elaborar BILC(6,11,21,24,30). Existen varios tipos de bolos comerciales con diferentes diseños, forma, tamaño, peso, concentraciones variables de minerales traza (Cuadro 1) y tasas de liberación. Esta última característica es indispensable en el diseño de los bolos; a través de ella se conoce la liberación diaria del mineral y la duración del bolo. En el Reino Unido se ha desarrollado un BVS para corregir las deficiencias de Cu, Co y Se en ovinos, el bolo fue diseñado para tener una velocidad de liberación en el rumen de 2.53 mg cm-2 día-1 y proporcionar 11 mg de Cu, 0.5 mg de Co y 0.21 mg de Se, hasta por seis meses(30,31). Los requerimientos de Cu, Co y Se en un ovino que consume 1.5 kg MS son de 10.5, 0.3 y 0.3 ppm, respectivamente. La deficiencia de Zn en ovinos ha sido tratada con un BVS que contiene 15.2 % de Zn, 0.5 % de Co y 0.15 % de Se(32,39). El requerimiento diario es de 20 a 33 mg Zn kg-1 MS(52). De acuerdo al fabricante del bolo la liberación de Zn durante 180 días es de aproximadamente 28 mg día-1(32), considerando el ejemplo anterior, el ovino demandaría un consumo entre 30 y 49 mg de Zn, con un faltante de 2 y 21.5 mg, el cual puede cubrirse con el aporte de la dieta. En otro estudio, se reportó una velocidad de disolución de 326 mg día-1, equivalente a liberaciones diarias de 49.3 mg de Zn, 1.7 mg de Co y 0.5 mg de Se, de modo que el bolo fue capaz de cubrir el requerimiento diario de los ovinos (11). Sin embargo se debe considerar que la tasa de disolución depende de las condiciones en el rumen como el pH, tipo de alimento, sitio de alojamiento del bolo, contracciones ruminales y de los 505

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efectos de las abrasiones de otros materiales presentes en el retículo-rumen(8,11,13). Otro tipo de bolo diseñado para ovinos presentó una tasa de liberación promedio en el rumen de 103.55 mg día-1, equivalente al suministro diario de 23.01 mg de Zn, 0.535 mg de Co y 0.258 mg de Se(53). Con la tecnología del vidrio soluble se han diseñado bolos de 100 g con 13.4 % de Cu, 0.5 % de Co y 0.30 % de Se para el ganado bovino en pastoreo; de acuerdo con el fabricante, dos bolos liberaron 156, 5.9 y 3.4 mg día-1 de Cu, Co y Se, respectivamente(33). El requerimiento de un bovino de 500 kg que consume 10 kg MS es de 100, 2.5 y 3 mg día-1 de Cu, Co y Se respectivamente(54); por lo tanto, los BVS son efectivos para tratar las deficiencias de minerales traza(55,56,57). La liberación diaria reportada de dos bolos comerciales All-Trace® con minerales traza y vitaminas fue de 138 mg de Cu, 113 mg de Zn, 71 mg de Mn, 2.1 mg de I, 2.0 mg de Co, 2.0 mg de Se, 4,644, 929 y 9 UI de vitaminas A, D y E durante un periodo de ocho meses(58); estos bolos fueron diseñados para ser utilizados en ganado bovino con más de 150 kg de PV. Mientras que la liberación diaria de dos bolos para becerros en crecimiento fue de 60 mg de Cu, 1.0 mg de Co, 0.6 mg de Se, 36.8 mg de Mn, 53.3 mg de Zn, 1.25 mg de I, 3033 UI de vitamina A, 607 UI de vitamina D y 9.1 UI de vitamina E(26). Aproximadamente la mitad del peso de la matriz (30 g) del bolo se libera en las primeras seis semanas y posteriormente la velocidad de liberación disminuye hasta los 7 meses(27). Cuadro 1: Concentración de minerales traza en diferentes tipos de bolos intrarruminales de liberación controlada Producto Cosecure*(34,38) Zincosel(11,32,35,53) Cosecure**(33,55) All-Trace(58) smAll-Trace(26,27) Tracesure(59) Ferrobloc(60) BILC+ (61) BILC++ (62)

Cobre (mg) 4356-4900 / 13400 16200 5300-5427 / 333 3944 /

Zinc (mg) / 3764-5040 / 13320 4700-4797 7 36 4366 /

Cobalto (mg) 165-220.5 94.1-171.6 500 236 90 1000 60 95 582

Selenio (mg) 49.5-92.75 43.29-49.5 300 251 50-54 1000 8 45 148

Yodo (mg) / / / 497 100-225 6800 24 330 2908

Manganeso (mg) / / / 8280 3200-3312 / 160 3013 11853

*BVS para ovinos; **BVS para bovinos; +BILC para ovinos; ++BILC para bovinos.

Algunos trabajos indican que el suministro de minerales traza mediante BILC aumentan la concentración de minerales en la sangre(30,31,35), mejoran los parámetros productivos y reproductivos(32,35,38,39) y favorecen la respuesta inmune humoral en los rumiantes(11). Estudios han confirmado la efectividad de los BVS en el suministro de Cu, Co y Se para 506

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corregir y prevenir la deficiencia de estos elementos en ovejas en pastoreo hasta por un año(30,31). Además incrementaron el contenido de Se en el feto y en los corderos recién nacidos(38). Los comprimidos con 25 % de CuO, equivalente a 19.3 % de Cu en la matriz activa, aumentaron las concentraciones de Cu en sangre de 10.4 a 14.0 µmol L-1 y en hígado de 120 a 684 mg kg-1 MS en ovinos en crecimiento(45). Corderas en semi-estabulación se le administró comprimidos de 5 g con 1 y 4.6 % de Se, los cuales fueron efectivos hasta por 90 días; sin embargo, se encontró en promedio mayor concentración de Se en sangre (182.01 ng g-1) en las corderas que recibieron el bolo con 4.6 % de Se(10). Se ha descrito que los comprimidos fabricados con cemento pega-azulejo con 5 y 10 % de Se, mantienen concentraciones adecuadas de Se en sangre (148.49 y 158.48 ng g-1) hasta por 120 días(63). En otro estudio, la predicción de liberación del Se de un bolo con 5.23 % de selenito de sodio fue de 0.177 mg día-1. Los bolos incrementaron el contenido de Se hemático en las ovejas después de 30 días de su aplicación(24). En ovejas Afshari, Abdollahi et al(60) observaron aumentos de Cu, Se y I el día del apareamiento y a los 90 y 100 días de la gestación, usando BILC con múltiples minerales (Ca, Mg, Na, Cu, Mn, I, Fe, Co, Zn y Se). Se ha sugerido que el Se, I, Fe, Zn y Mn son esenciales para la supervivencia del embrión y el desarrollo del feto(64). En general la administración de un BILC con múltiples minerales traza a ovejas gestantes incrementa los contenidos de Zn, Cu, Co y Se en los corderos nacidos (61). El uso de BVS que contienen Cu, Zn, Co y Se han sido utilizados ampliamente para corregir la deficiencia de minerales traza en corderos semiestabulados(6,32,39), ovejas en pastoreo(34), cabras en condiciones de traspatio(65,66), camellos en crecimiento(55,67) y en bovinos en pastoreo(30,68,69).

Efecto de los BILC sobre los parámetros productivos y reproductivos Existen pocos trabajos publicados sobre los efectos de los BILC sobre los parámetros productivos y reproductivos de los rumiantes. En un estudio realizado con becerros Holstein-Friesian destetados y alimentados con una dieta balanceada, recibieron dos bolos con múltiples minerales traza y vitaminas. Los becerros obtuvieron mayor ganancia diaria de peso (0.59 kg) respecto a los que no recibieron bolo (0.53 kg)(26). Resultados similares se obtuvieron con inyecciones de Cu (25 mg de Cu ml-1) y bolos de 20 g con micropellets de CuO. Los autores no encontraron diferencias en la ganancia diaria de peso (564.2 g día-1) en becerros de la raza Aberdeen Angus y Hereford, sin embargo sugirieron que los bolos de CuO son una alternativa para prevenir las deficiencias de Cu(70). Los corderos que recibieron suplemento de Zn, Co y Se con BVS presentaron mejor ganancia diaria de peso (153.22 g) respecto al grupo testigo (136.61 g), con diferencias significativa en la última fase de engorda(11). Por otra parte, se ha reportado que BILC con múltiples minerales han 507

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mejorado el rendimiento y la calidad nutritiva del calostro (6.70 % proteína, 6.92 % grasa y 0.59 % materia inorgánica) de las ovejas de la raza Najdi; lo anterior se reportó con mejor salud y crecimiento de los corderos hasta el destete(61). Aliarabi et al(53) reportaron pesos al nacimiento de 4.63 kg y ganancia diaria de peso de 0.243 kg en corderos nacidos de madres tratadas con un bolo que contenía 20 % de Zn, 0.50 % de Co y 0.23 % de Se. El suplemento de minerales traza y vitaminas mediante un BILC aumentó la producción láctea con 8.19 kg día-1 vaca-1(62). Las ovejas tratadas con un BILC de minerales traza y vitaminas presentaron tasas de nacimientos gemelares de 65.5 %, mientras que las ovejas que recibieron una inyección de Cu (12.5 mg Cu) presentaron 44.8 % de nacimientos gemelares. En busca de confirmar el efecto de los bolos, los autores dosificaron un BILC a ovejas con deficiencia de Cu y Se, mejorando los nacimientos gemelares en 59 %, mientras que el grupo sin dosificación presentó 11 % de ovejas estériles(27). En otro estudio obtuvieron 80 % de nacimientos múltiples por efecto de la administración de dos BILC a ovejas previo a la sincronización(60). El ganado lechero en pastoreo suplementado con dos BVS que contenía 13.4 % de Cu, presentó disminución en el número de servicio a la concepción (2.5 ± 0.3 a 1.7 ± 0.2) y el intervalo de parto se redujo de 407 a 371 días(68). El suplemento de Zn, Co y Se a través de BVS han mejorado la motilidad y la proporción de espermatozoides vivos, así como la integridad de las membranas espermáticas(35,39). El Zn está involucrado en el catabolismo de los lípidos localizados en la parte intermedia del esperma, para generar la energía que se necesita para la movilidad de los espermatozoides(71). El Cu, Zn y Se tienen propiedades antioxidantes y pueden actuar para reducir las especies de oxígeno reactivo y evitar el daño a los espermatozoides(72,73). En otra investigación se evaluó el efecto de un bolo con 500 mg de Se sobre la calidad del semen de ovinos Hampshire y Suffolk; los bolos aumentaron la actividad de GSH-Px, la movilidad, el número de espermatozoides vivos y la viabilidad del eyaculado de los sementales(74).

Efecto de los BILC sobre la sanidad animal La deficiencia de Se es un problema grave que afecta la producción animal. Especialmente en los ovinos la tasa de mortalidad de corderos durante la etapa perinatal y neonatal es de 62 %(75), principalmente son evidentes los signos de la enfermedad del músculo blanco o distrofia muscular nutricional(4). En un estudio con ovejas suplementadas con un BVS antes del parto, se logró disminuir la incidencia de signos de la enfermedad del músculo blanco en los corderos nacidos(31). El bolo liberó 0.21 mg de Se día-1, cantidad suficiente para ser transferido a la placenta o al calostro que recibieron los corderos en las primeras horas de vida(31,56). La concentración de Se en la leche proveniente de vacas suplementadas con un 508

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BVS fue mayor (0.0658 µg g-1) respecto al grupo testigo (0.0374 µg g-1) durante siete meses(56). Otro estudio con corderos nacidos de ovejas tratadas con un BVS que contenía 20 % de Zn, 0.50 % de Co y 0.23 % de Se, no presentaron incidencia de la enfermedad del músculo blanco, mientras que los corderos nacidos de las madres no tratadas alcanzaron una tasa de mortalidad de 10.3 % y signos de la enfermedad del músculo blanco por 18 %(53). Con respecto al papel de los minerales traza en la función inmune, se ha demostrado que los bolos de Zn provocan efecto positivo en los corderos sobre su respuesta inmune humoral ante el antígeno hemocianina de lapa californiana -KLH. Sin embargo se cree que la respuesta inmune fue favorecida por acción conjunta del Zn, Co y Se presentes en el bolo(11). En camellos, se encontró efecto similar en la respuesta inmune humoral a la inyección intravenosa de 2 mL de suspensión de glóbulos rojos de ovejas al 20 %. Además, se informó que el BVS mejoró la inmunidad mediada por células, incrementando el grosor de los pliegues cutáneos después de 24 h de la inyección de fitohemaglutinina (PHA)(67). En cabritos se ha demostrado que el tratamiento con un bolo de selenito de sodio y una inyección de Se (0.25 mg kg-1 PV) mejoraron la respuesta inmune humoral a la inmunización con una bacteria-toxoide (Toxo Bac Neumonias)(76). Munday et al(28) desarrollaron un bolo de Zn para proteger a los corderos contra el eccema facial. El bolo consiste en un núcleo de 43 g de ZnO cubierto por un revestimiento impermeable al agua, excepto un extremo que al entrar en contacto con el líquido ruminal se erosiona para liberar una dosis de Zn de 20 mg kg-1 día-1. Las cantidades de inclusión de 54, 81 y 108 g Zn en los bolos para ovejas presentaron beneficio protector contra la esporidesmina producida por el hongo Pithomyces chartarum(77). La administración de bolos de ZnO a becerros expuestos a la esporidesmina, presentaron menor actividad sérica de la gama-glutamiltransferasa respecto al grupo testigo; esto demostró la efectividad de los bolos para reducir la incidencia y la gravedad del eccema facial(29).

Conclusiones Las innovaciones tecnológicas que se utilizan en los procesos de elaboración de productos farmacéuticos de uso veterinario pueden contribuir a mejorar los métodos de suplementación mineral. Los BILC son el método más eficaz para proporcionar minerales traza hasta por más de un año. Los mecanismos de liberación controlada que presentan los bolos intrarruminales son prácticos para corregir y prevenir las deficiencias de minerales traza en los rumiantes en pastoreo. Hay evidencias positivas donde los BILC mejoran los parámetros productivos y reproductivos, así como la actividad inmune humoral de los rumiantes. El uso de BILC disminuye el manejo de los animales, el estrés y la disminución de los costos económicos. Sin embargo, en América Latina no es un método común para 509

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suministrar los minerales traza, por ello es necesario más investigación en el desarrollo de los BILC de acuerdo con el perfil deficiente de los suelos y forrajes dedicados al pastoreo.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.4767 Revisión bibliográfica

Implicaciones, tendencias y perspectivas del transporte de larga distancia en el ganado bovino. Revisión

Marcela Valadez Noriega a* Genaro Cvabodni Miranda de la Lama b

Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Coyoacán, Ciudad de México, México. b

Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Lerma. Departamento de Ciencias de la Alimentación. Estado de México, México.

* Autor de correspondencia: mvz.mvaladez@outlook.com

Resumen: El creciente comercio internacional, el crecimiento poblacional y su consecuente demanda de proteínas de origen animal en los países en vías de desarrollo y emergentes, han dado lugar a un considerable aumento en el número de animales criados, transportados y procesados en todo el mundo. Esto ha derivado en un aumento de la distancia recorrida y el tiempo de viaje, estimulando ciertas mejoras en la infraestructura ganadera; camiones con mayor autonomía; capacidad de carga y adaptados a las necesidades biológicas de los animales; reducción de costos de operación; y liberalización de restricciones zoosanitarias que facilitan el comercio internacional. La presente revisión hace un análisis pormenorizado y actualizado del transporte de larga distancia con una visión de conjunto. Si se toma en cuenta que la tendencia actual es aumentar el tiempo del transporte, escalas logísticas y transportes mixtos, es necesario desarrollar sistemas de evaluación y toma de decisiones con herramientas y protocolos que minimicen el coste biológico en el ganado bovino. Palabras clave: Bienestar animal, Transportes larga distancia, Bos indicus, Bos taurus, Calidad de carne.

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Recibido: 14/02/2018 Aceptado: 24/07/2019

Introducción El transporte es una etapa inevitable en la vida de un animal de producción con fines diversos como la cría, engorda, venta, matanza, reproducción y espectáculo(1). Numerosas evidencias indican que el transporte es un procedimiento novedoso, invasivo, aversivo y muy exigente en términos físicos para los animales(2). Incluyendo estímulos novedosos como señales sonoras, visuales y olfativas; mezcla social; vibración; variaciones de temperatura; riesgo de lesión, restricción espacial, ayuno y acceso limitado al agua(3). El efecto directo del transporte tiene implicaciones en el bienestar, salud animal y calidad de la carne(4). Actualmente existe un interés creciente de la cadena de producción de carne por la inocuidad y calidad de los alimentos, se busca incorporar compromisos de producción sostenible y promover el bienestar animal en la búsqueda del nuevo concepto de calidad(5,6).La globalización actual del comercio y la creciente demanda de proteínas de origen animal, han dado lugar a un considerable aumento en el número de animales criados, transportados y procesados para matanza en todo el mundo(7). El comercio internacional se facilita desarrollando cadenas de suministros más completas y eficientes, gracias a mejoras en la infraestructura ganadera; camiones más autónomos y diseños especializados; reducción de costos de operación; y liberalización de restricciones zoosanitarias(8).En este contexto, el transporte de larga distancia es un elemento estratégico de la industria ganadera. En algunos países debido a las condiciones climáticas, la producción interna es limitada y la importación de ganado en pie es necesaria para abastecer a los mercados cárnicos. En otros, los centros de cría y engorda se encuentran distantes unos de otros, debido a la disponibilidad de alimento y condiciones climáticas, en donde los animales nacen y son criados en zonas de pastoreo debido a la disponibilidad de forraje a bajo costo, y son enviados para su finalización a centros de engorda intensiva. Otros países prefieren la importación de ganado en pie, ya que por motivos religiosos los animales deben estar vivos al momento del sacrificio Halal o Kosher(9,10).Otros flujos transfronterizos de ganado tienen lugar debido a la atracción del valor agregado, tal es el caso de la certificación que ofrece el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) mediante un etiquetado de “carne de vacuno mejorada”, lo que promueve la exportación de ganado en pie desde Canadá para su matanza en los Estados Unidos de América (EUA), con recorridos muy prolongados que resultan en pérdidas elevadas(11). Adicionalmente, la especialización por especie de muchos rastros que están situados en puntos estratégicos cercanos a los canales

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de comercialización, ha dado lugar a recorridos muy prolongados desde la granja hacia estos rastros(12). Es indispensable señalar la importancia económica que representa el comercio de exportación de animales en pie, el cual proporciona gran cantidad de empleos directos e indirectos, en el sector del transporte, logística y acopio. Sin embargo, es muy probable que una planificación regional a gran escala permitiría la redistribución de los centros de matanza cercanos a los lugares de producción, de tal manera que el tiempo de transporte fuera reducido, además de buscar la sustitución paulatina de la exportación de ganado en pie a exportación de carne(13). Debido a la geografía, las condiciones comerciales y la distribución de los centros de producción ganadera en América Latina, los viajes de larga distancia son más una regla que una excepción. Las normativas de estos países suelen ser mucho más laxas en términos de distancia en comparación con las normativas europeas. El presente trabajo hace una revisión actualizada sobre el transporte de larga distancia de ganado desde una perspectiva de distintos países con situaciones muy particulares dadas por diferentes factores que serán mencionados como la ubicación geográfica del país; procesos previos al transporte; diseño, densidad de carga y micro-ambiente de los vehículos; así como las investigaciones actuales de los riesgos asociados al conductor y los efectos que pueden tener cada uno de estos factores sobre la cadena de la carne bovina.

Tipología de los viajes de larga distancia Los viajes de larga distancia pueden clasificarse en viajes de repoblación o de vida y viajes para matanza. Históricamente, el ganado para matanza inmediata había dominado el comercio, pero en el nuevo siglo ha habido un rápido crecimiento en la cantidad de ganado de “media engorda” al que se le busca dar valor agregado antes de la matanza mediante su engorda y finalización, incluyendo los machos del sector lechero. Por ello, es cada vez más común que el ganado sea transportado varias veces durante su vida(14), estimando 296 millones de cabezas de ganado bovino para carne transportadas a nivel mundial para el año 2005, algunos de ellos transportados más de una vez(11); las razones principales incluyen: venta para repoblación de hatos, cambio de dueño, búsqueda de fuentes de suministro más baratas o abundantes (pastos y agua), cría o remplazo de ganado para reproducción, abastecimiento de unidades de engorda intensivas, subastas, espectáculos y ferias ganaderas(1). El agrupamiento y el manejo inapropiado del ganado, sobre todo en aquellos extraídos de sistemas extensivos, resulta en animales con altos niveles de estrés al inicio del viaje. Si el agrupamiento es prolongado, es conveniente darles tiempo para recuperarse en el corral pre-carga. Es importante destacar que animales con poco contacto con el humano o temperamento agresivo, tendrán mayores posibilidades de estresarse y lesionarse a los manejadores, debido a la respuesta excesiva o a la agresión inducida por el miedo(9,15).Si bien no existen suficientes datos, se ha propuesto que la experiencia previa puede afectar la 519

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respuesta de miedo de un animal y puede ser responsable de los resultados variables reportados en los estudios de transporte(15); aunque otros estudios han demostrado que el ganado más dócil pierde menos peso durante el transporte y tiende a una recuperación más rápida una vez que continúa con su ciclo productivo(16). Antiguamente el transporte de ganado con fines reproductivos era una necesidad para el mejoramiento genético, sin embargo, con las nuevas biotecnologías este transporte se volvió poco práctico. El punto de partida fue la inseminación artificial en especies domésticas, la cual toma origen en 1779, mientras que a partir de 1890 otra técnica reportada como exitosa es la transferencia de embriones(17) y la fertilización in vitro en 1973(18). A nivel mundial, más de 750,000 embriones se producen anualmente a partir de donantes superovuladas y más de 450,000 embriones se producen utilizando técnicas in vitro(17). Si bien el desarrollo de estas tecnologías fue realizado con fines de mejoramiento genético, la cantidad de ganado que no debió ser transportado con fines de reproducción debe haber disminuido notablemente a partir del siglo XVIII, en el cual comenzaba tan solo la inseminación artificial. Por otra parte, las exposiciones, ferias y subastas siguen teniendo como esquema la presencia física del ganado, lo que hace que el transporte sea una constante; a nivel internacional existen esfuerzos para eliminar esta práctica usando un sistema vía internet o televisión(19), ejemplo de ello son las subastas en Europa, EUA y recientemente en Argentina, Brasil y Colombia; en estas subastas, el transporte de los animales únicamente se realiza una vez que se tiene un comprador asegurado, sin embargo, este campo aún no ha sido estudiado y la información disponible es escaza por lo que representa un área importante de estudio al formar parte de la industria ganadera actual, en donde el uso de la tecnología facilita la comercialización del ganado y se tiene la tendencia a disminuir o desaparecer manejos que sean innecesarios para los animales. Los viajes de repoblación incluyen movimientos entre países, entre granjas del mismo país o dentro de una misma propiedad(20). Por ejemplo, México es el mayor socio comercial de EUA introduciendo animales en pie, el comercio consiste en animales con un mínimo de sangre de razas cebuinas para abastecer unidades de engorda o “feedlots” de dicho país(21). Por otro lado, el abasto y consumo interno de México depende del ganado originario de la región tropical y subtropical del sureste y países de América Central(22), dicho abasto consiste en el traslado de animales en viajes de larga distancia de los cuales aún existe poca información. Es necesario profundizar más en la investigación de los viajes de repoblación sobre todo por las repercusiones en la salud y bienestar de los animales; de esta forma las autoridades competentes contarán con un antecedente para establecer reglas y regulaciones sobre las condiciones antes, durante y después del transporte, además de considerarse aspectos como el estado ideal de un animal para ser transportado, tiempos máximos de transporte y de restricción de agua y alimento dependiendo de la región(23).

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Tendencias normativas internacionales El transporte de ganado es una parte importante de las preocupaciones de los gobiernos, las organizaciones de protección animal y consumidores en general, debido a la percepción de una ausencia de bienestar en este eslabón de la cadena, así como las posibles consecuencias en la calidad e inocuidad del producto(24). Una mala imagen durante los viajes o el manejo de accidentes hacen que la percepción sobre las actividades de transporte sean adversas (25). Existe legislación bien intencionada que puede tener consecuencias negativas para los animales, las regulaciones en el transporte de ganado no siempre se desarrollan tomando en consideración aspectos básicos para su bienestar(26). Por ejemplo, bajo la regulación de Canadá, el ganado puede ser privado de agua hasta por 57 h. También es posible que a los animales se les prive de alimento hasta por 81 h totales en un viaje a un rastro federal(11). La Comunidad Europea tiene la legislación más exigente del mundo, en lo que se refiere al transporte de ganado bovino en términos de bienestar animal, estableciendo una duración máxima de 14 h de viaje, seguido de una hora de descanso para beber agua, pudiendo continuar con otro viaje de 14 h más. La secuencia anterior puede repetirse cuando los animales hayan sido descargados, alimentados, provistos de agua y hayan tenido un descanso de al menos 24 h(27,28).A pesar de lo anterior, más de un millón de ciudadanos de la Comunidad Europea pidieron, exigieron, un límite general de 8 h de transporte. El Parlamento Europeo adoptó una declaración que sostiene un límite de 8 h para transporte del ganado(3). La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), desarrolló lineamientos para el bienestar en el transporte de ganado; sin embargo, los países signatarios y el sector exportador de ganado no están obligados a cumplirlos(29). Con panoramas muy opuestos, países como Sudáfrica, Kenia y algunos países de la comunidad Europea tienen legislación bien desarrollada en materia de bienestar y transporte de ganado; por otra parte países de Centro y Sudamérica poseen un marco legislativo deficiente, con un nivel de cumplimiento bajo en donde el conocimiento de la legislación está ausente, incluso en las partes interesadas(30).

Factores de estrés asociados a viajes largos Factores asociados al proceso pre-transporte Las actividades asociadas al transporte inician con el acopio de animales, en algunos países el agrupamiento puede comenzar 48 h previas a la carga del ganado debido a que debe ser agrupado a lo largo de grandes extensiones territoriales. La cantidad y duración de diversas prácticas de manejo previas a la carga del ganado como la mezcla de animales, privación de comida y agua representa un desafío que predispone a la deshidratación y gasto de energía(31). 521

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Los animales en malas condiciones, no tienen la misma capacidad para soportar largas duraciones de transporte. Para la evaluación de animales que sí pueden ser transportados han sido desarrolladas algunas directrices similares a las utilizadas en Europa, éstas establecen que un animal puede viajar si: puede caminar normalmente, soportando peso en las 4 patas; no padece ninguna enfermedad o lesión visible que pudiera dañarlo durante el transporte; puede mantenerse con el grupo tanto en la carga como en la descarga; puede ver con por lo menos 1 ojo; y si no se encuentra en el último tercio de gestación(15).El proceso de carga es más estresante que la descarga, pero los riesgos en la integridad física del animal son similares en ambos casos(32). La carga de animales y las primeras etapas del transporte causan altos niveles de estrés; después de este periodo los animales son capaces de adaptarse al viaje, sin embargo a las 12 h los animales se fatigan y comprometen su salud, por lo que el viaje debería de interrumpirse(33,34). Los estresores iniciarán una cascada de reacciones en el organismo, con la activación del sistema simpático-adrenomedular y eje hipotalámico-pituitario-adrenal, provocando un incremento en los niveles de catecolaminas y glucocorticoides(35), además de marcados efectos sobre el sistema inmune, claramente visibles en los animales de viajes para repoblación. Otras repercusiones se pueden manifestar varias semanas después de viaje, como ausencia de crecimiento, baja ganancia de peso y mortalidad, sobre todo en animales jóvenes o recién destetados(36). La mayoría de las investigaciones sobre los efectos del transporte y su normatividad se han orientado a la distancia del viaje, por ejemplo, las 52 h máximas de viaje permitidas en Canadá antes del desembarque; las 28 h permitidas en EUA o las 30 h permitidas en la Unión Europea; sin embargo, es poco estudiado el tiempo total en que los animales se encuentran confinados en los vehículos, tiempo de espera antes de partir, tiempo de viaje, tipo de camino, cantidad y duración de paradas, tiempo de espera para descarga, entre otros(37,38). Factores como el costo del transporte; especificaciones y diseño del camión; densidad de carga, vibraciones y movimiento; condiciones del micro-clima; condiciones climáticas y geográficas; planeación de rutas; factores asociados al conductor y riesgo de accidentes deben considerase como un todo dentro de la logística del transporte(8).

Diseño del transporte Los vehículos para ganado deben ser diseñados, construidos y mantenidos de manera que protejan a los animales de las inclemencias del tiempo, temperaturas extremas, cambios adversos en las condiciones climáticas y lesiones. En general, se utilizan cuatro tipos de vehículos especializados: camiones pequeños (≤3t), unidades individuales (>13 m de longitud), semirremolques y doble semirremolque(3). Para garantizar mayor confort durante el transporte son recomendables sistemas de bebederos y de ventilación, rampas personalizadas de acuerdo a la especie, techo, pisos antideslizantes, paredes laterales que eviten que cualquier parte del animal salga del camión, separaciones abatibles que permitan la separación de grupos más pequeños y fáciles de manejar, puertas laterales de inspección 522

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y control de temperatura(39), sin embargo, el diseño del camión y su impacto en el bienestar ha sido pobremente estudiado(40). En Centro y Sudamérica los camiones pueden ser articulados o no, generalmente sin techo, con estructuras metálicas o de madera(13). En países latinoamericanos existen leyes que pretenden evitar la crueldad hacia los animales, sufrimientos innecesarios y protegerlos. También existe una legislación sobre el transporte de animales para el consumo en la mayoría de los países, pero se ocupa principalmente de los requisitos sanitarios y de salud pública (limpieza de vehículos, inspección de salud animal ante mortem e inspección de carne post mortem), en lugar del bienestar de animales, tal es el caso de Paraguay, Perú, Colombia, Ecuador, Argentina, Venezuela y Uruguay(13). En Brasil no existe legislación específica que regule el transporte de animales de granja, aunque la mayoría de las agencias gubernamentales y las grandes empresas de mataderos conocen las recomendaciones de la OIE. En México existe la “Norma Oficial Mexicana NOM-051-ZOO-1995, Trato humanitario en la movilización de animales”, la cual abarca diferentes especies animales, pero no está actualizada y cuyas especificaciones son pobres y poco específicas en cuanto al diseño del transporte. En Norte América, incluido México, el transporte de ganado generalmente se realiza en camiones con remolque conocidos como “pot-belly”(41), poseen cubierta de aluminio y se encuentra dividido en cinco compartimentos: compartimento 1(nariz), compartimento 2 (panza), compartimento 3 (cola o parte trasera), compartimento 4 (cubierta) y compartimento 5 (perrera o cocineta)(42). En Europa, lo más común son los camiones simples o con semi-remolque(43).La elección del camión dependerá en forma general del tipo y cantidad de ganado, las demandas específicas del mercado, duración del viaje y región geográfica(3).

Densidad de carga Desde el punto de vista económico, la densidad de carga puede incrementar o reducir los costos de operación por unidad(44). El espacio requerido por animal durante el transporte puede ser representado de tres formas: (m2/100 kg), (kg/m2) y por la cantidad de superficie utilizada por cada uno (m2/animal). En otros estudios(45), concluyeron que el Espacio Disponible (ED=m2/animal), y un coeficiente alométrico que incluye el peso vivo del animal (k=ED/PV0.6667) era un mejor indicador sobre la disponibilidad de espacio para realizar comparaciones entre estudios en lotes con un peso homogéneos. El área utilizada por animal es proporcional a su área de superficie, un bovino de 400 kg debería transportarse en un área de 1.16 m2(45). Los conductores u operarios de la unidad deben de ser cuidadosos en cuanto a disponibilidad de espacio en sus camiones y tener conocimiento de las características de la especie a transportar (con cuernos o sin cuernos, animales de desecho, engorda, lecheros, recién destetados, etc.); lo anterior en conjunto con las limitaciones debidas al clima, permiten definir o alterar la densidad recomendada de carga(46).Cuando la densidad de carga es de menos animales por metro cuadrado, estos tienen más espacio para echarse, 523

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pero si la forma de conducir o las condiciones del camino son pobres, será más fácil que los animales pierdan el equilibrio(47). En un estudio, se observó que al permitir 170 kg/m2 (densidad situada por debajo de lo recomendado por el Consejo de Bienestar de los Animales de Granja de la USDA 360 kg/m2), los animales tienden a echarse durante el viaje(48).Eldridge y Winfield(49)examinaron los efectos de diferentes densidades sobre viajes largos, y aunque no se observaron efectos en el pH último de la carne (pHu), la incidencia de hematomas fue mayor con las densidades más bajas y más altas.

Vibración, movimiento y fatiga del ganado Durante el viaje, los animales se encuentran expuestos a vibraciones verticales, laterales y horizontales. Los caminos sin pavimento o con fuertes corrientes de viento transmiten una mayor cantidad de vibraciones a los animales y la sensibilidad a éstas aumenta después de largos periodos de pie(50), produciendo fatiga, pérdida del centro de gravedad y resultando en caídas y lesiones(51), además de realizar un mayor esfuerzo buscando apoyarse en el camión durante el frenado(52). Los viajes de larga distancia son tan demandantes en términos fisiológicos, que suelen tener efectos en la relación neutrófilo/linfocito (N/L), elevando la probabilidad de que los animales padezcan infecciones oportunistas(53). Gebresenbet et al(50)colocaron sensores de vibración en un camión con sistema de suspensión de aire y encontraron que los mayores niveles de vibración en los animales fueron de 2.27 ± 0.33 m/s2 sobre caminos con grava a 70 km/h. Las vibraciones en dirección horizontal y lateral fueron menores en los animales ubicados en posición perpendicular a la dirección del camino. La exposición a vibraciones se puede reducir al evitar rutas en mal estado, caminos de grava o terracería, utilizar un camión que reciba mantenimiento y que sea operado por conductores entrenados. Las etapas previas al viaje producen un gasto de energía adicional para hacer frente a las exigencias durante el transporte; sin embargo, los largos periodos de ayuno a los que son sometidos los animales, tendrá efectos negativos en la concentración de glucógeno muscular, dando lugar a un pHu elevado, que resultará en carne oscura, firme y seca o “dark, firm and dry” (DFD)(34,54,55). En reportes recientes, se ha descrito el síndrome de fatiga del ganado o “fatigue cattle syndrome” (FCS), animales que desarrollan problemas de movilidad poco después de llegar a un matadero, similar al reportado en porcinos. El ganado manifiesta signos clínicos de taquipnea y dificultad respiratoria, pueden presentar cojeras, marcha rígida o posición de decúbito en ausencia de evidencia que indique lesión o enfermedad, además de concentraciones elevadas de lactato y de creatina quinasa (CK)(56).

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Temperatura, micro-clima y ventilación Estimaciones teóricas indican que en un remolque típico con densidad recomendada para bovinos de 500 kg, el calor producido en el interior sería de 13,400 watts, por lo que un sistema de ventilación es necesario(4). Existen dos sistemas de ventilación: la ventilación pasiva (aberturas) y la activa (ventiladores). La pasiva está dada por aberturas a lo largo del camión y dependerá del movimiento y velocidad del camión(57). La activa, está controlada mediante sensores y utiliza ventiladores de extracción en entradas y salidas de aire(7). El micro-clima del camión (temperatura, humedad relativa e índice de temperatura y humedad) es afectado por el macro-clima, densidad de carga, flujo del aire, respiración, transpiración y secreciones de los animales, y tiene un amplio y potencial impacto en el bienestar, especialmente en condiciones ambientales adversas. En transportes de larga distancia aumenta la posibilidad de que los animales atraviesen distintas regiones climáticas(58). Por ejemplo, durante el transporte entre Canadá y EUA el rango de variación climática se encuentra entre −42 y 45 °C(37). En condiciones climáticas extremas, la temperatura dentro del camión tiene fuertes variaciones, por lo que el conductor debe estar pendiente de abrir o cerrar las aberturas de ventilación. En climas cálidos, la ventilación se dificulta por la densidad del aire y se recomienda la colocación de dispositivos que registren temperatura y humedad para que el conductor pueda tomar decisiones durante el viaje(36), así como evitar detener el camión por largos periodos, pues la temperatura interna aumenta rápidamente debido a la temperatura externa, falta de ventilación y la temperatura emitida por el ganado. En viajes de más de un día en estas condiciones de temperatura, las pérdidas de peso del ganado son muy evidentes(59). En climas fríos puede aumentar la incidencia de morbilidad post-transporte y lesiones en tránsito ocasionadas por congelación de partes del cuerpo más susceptibles(46).En climas fríos, el uso de paja como material de cama se recomienda para mejorar el confort de los animales y para mantener una temperatura más cálida. Condiciones de humedad alta deben ser evitadas durante climas fríos o cálidos, ya que tiene efectos negativos en la capacidad de termorregulación de los animales(60,61). Según el aumento en la temperatura corporal, el punto crítico superior de las ovejas y del ganado es de alrededor de 24 a 26 °C. La mayoría de los mamíferos mueren cuando la temperatura corporal alcanza los 42 a 45 °C, lo que supera la temperatura corporal normal en unos 3 a 6 °C(62). La acumulación de amoniaco representa un riesgo en altas densidades y malas condiciones de ventilación, ya que se correlaciona con la temperatura y humedad presente en el aire(62).

Factores de riesgo asociados al conductor La habilidad del conductor para controlar el camión afecta la calidad de la conducción. La aceleración, frenado, manejo en las curvas y forma de conducir afecta la habilidad de los 525

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animales para mantener una postura estable, incrementando la excitabilidad, reactividad y lesiones en los animales(63). Por otra parte, las principales causas de accidentes en carretera durante el transporte de ganado en España, EUA y México están relacionada con la fatiga y mala toma de decisiones del conductor, resultado de largas jornadas laborales, mal diseño de las rutas y alteraciones de los ciclos del sueño(25). Un análisis sobre las fallas y accidentes de camiones articulados identificó que la forma más común de accidentes asociada al conductor, está relacionada con un error en la toma de decisiones durante la conducción(64), por ejemplo, el número de accidentes durante el transporte de ganado en México es desconocido; se ha observado que los conductores en este país, frecuentemente viajan a altas velocidades que influyen en el fracaso para lidiar con el control del camión en las curvas y en otros obstáculos que pueden presentarse en el camino(11). Otros factores incluyeron la edad de conductor, debido a la combinación de experiencia y buena salud, la edad ideal para conducir camiones es entre los 28 y 54 años, conductores menores de 27 años obtuvieron mayores rangos de accidente/fatalidad, rango que vuelve a incrementarse en conductores mayores de 63 años(65). El consumo de alcohol, fatiga, y problemas crónicos de salud como el sobrepeso o la obesidad, son otros factores asociados con el conductor(66,67). En un estudio realizado en España la mayoría de los accidentes involucraron el transporte de porcinos (57 %), bovinos (30 %), aves (8 %) y ovejas (5 %)(25); mientras que en otro estudio en EUA y Canadá, Woods y Grandin(68),se encontró que la especie más afectada eran los bovinos (56 %) y los porcinos (27 %). El 59 % de los accidentes ocurrieron entre las 2400 y las 0900 h y la mayoría fueron volcaduras, de manera similar a lo observado en un estudio realizado en México, en donde las volcaduras fueron el tipo de accidente más común (58.8 %) en transportes de larga distancia de ganado bovino(67);este tipo de estudios de realizan de manera retrospectiva y se basan en el análisis de reportes de periódicos, noticias, así como la aplicación de encuestas a conductores(67,68). En este tipo de accidentes, los animales sobrevivientes suelen encontrarse aturdidos, desorientados y pueden sufrir dolor, estados de miedo y ansiedad, lo que vuelve más complicado su manejo y aumenta el riesgo de generar accidentes secundarios(3). Por lo anterior, el entrenamiento de los conductores debería ser una prioridad para la cadena logística, cubriendo aspectos de comportamiento y bienestar de los animales y factores relacionados con el funcionamiento mecánico de sus camiones(46). La industria ganadera debe tomar acciones para reducir la fatiga y por consiguiente el riesgo de accidentes, los cuales resultan en pérdida de vidas humanas y animales e importantes pérdidas económicas en la cadena logística del transporte de animales. La única estrategia efectiva para prevenir la acumulación de fatiga es una interacción ergonómica del diseño del vehículo, y asegurarse que los conductores obtengan constantemente un sueño adecuado y de buena calidad(66).

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Rutas y geografía Las condiciones geográficas tienen fuerte influencia en los sistemas de producción de ganado y en las oportunidades de comercializarlo. En algunos casos, la localización geográfica de un país permite o dificulta intercambios internacionales y requiere de una variedad de transportes diferentes(69). En países como Chile, el tiempo de transporte del ganado no puede ser reducido debido a la típica geografía chilena y a la escasez de rutas apropiadas, encontrando tiempos de transporte de hasta 63 h(36). Brasil es otro ejemplo, con periodos muy prolongados de transporte debido a la extensión territorial(6) y a la tendencia mundial de la reducción y especialización de las plantas de matanza(12). Su sistema de redes de carreteras tiene más de 1.6 millones de km, y las condiciones del transporte varían dependiendo de las características geográficas. Gran parte de las carreteras se encuentran sin pavimentar y con frecuencia en malas condiciones, situación que se agrava sobre todo en época de lluvias, incrementando la duración del viaje, el número de camiones descompuestos, puentes rotos y accidentes en el camino(13).

Impactos en el bienestar y la productividad El efecto de los viajes prolongados sobre el ganado, es un tema de importancia en materia económica y de salud animal. Se ha demostrado que este tipo de viajes, como ocurre en la Patagonia Chilena, provocan pérdida significativa de peso corporal(36), prolongando la recuperación física del ganado en el destino final.

Pérdida de peso vivo, morbilidad y mortalidad La pérdida de peso vivo en el ganado es probablemente el efecto económico más significativo del transporte. En un estudio con un grupo de novillas transportadas 518 km (8 h), con una temperatura ambiente máxima de 32.2 °C, se redujo el peso vivo en un 6 % luego del transporte(48). La pérdida de peso es el efecto más notorio en primera instancia; pero un factor elemental es el tiempo de recuperación transcurrido antes de comenzar a generar ganancia de peso en los animales trasladados a centros de engorda. Loerch y Fluharty(70) reportaron que un periodo de privación de alimento y agua por encima de las 72 h aunado a 8 h de transporte, reduce el total de protozoarios ruminales. Por otra parte, la deshidratación puede aparecer en animales transportados por largas distancias sobre todo en climas cálidos-secos o muy fríos, cuando el flujo del aire a través del camión es alto. La provisión de pequeñas cantidades de nutrientes o de electrolitos con una tonicidad correcta inmediatamente antes y después del transporte, reduce la deshidratación del tejido y el catabolismo de las proteínas musculares, el glucógeno y los lípidos, además de reducir los desequilibrios ácido-base y electrolíticos(71).

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Otra preocupación, es el riesgo que tienen los animales de enfermar o morir debido a la variabilidad de condiciones climáticas y exposición toxinas, entre otros factores(5). La muerte o enfermedad de los animales puede experimentarse durante el transporte con efectos incluso varias semanas después de haber llegado al lugar de destino. Una de las afecciones más importantes en el ganado bovino en sistemas intensivos es la enfermedad respiratoria del bovino o “bovine respiratory disease”. Esta enfermedad se presenta de forma más común en ganado joven, pero también se incrementa por el proceso de transporte a las unidades de engorda. En EUA se ha determinado que afecta al 14.4 % del ganado que entra a las unidades de engorda(72). La respuesta inmune del ganado transportado generalmente se encuentra suprimida por las altas concentraciones de cortisol asociadas al estrés(73), por lo que la enfermedad suele manifestarse días o semanas posteriores a la llegada. Se debe tener especial cuidado con las lesiones que el ganado pudo haber sufrido durante el transporte, debiendo cuidar heridas abiertas y mantener en observación a los animales que presentan dificultad para desplazarse que deberán ser tratados con antiinflamatorios y analgésicos para facilitar su recuperación. El síndrome de fatiga del ganado antes mencionado, debe ser considerado en el caso de animales con problemas de movilidad inmediatamente después del transporte(56); este síndrome se acentúa en el ganado Bos indicus, que es más temperamental y tiende a echarse y “rendirse” en camiones con alta población de ganado(1), presentando mayor dificultad para adaptarse a las condiciones de confinamiento; sin embargo, hay poca información en la literatura sobre este síndrome y los trabajos realizados no muestran información consistente, por lo que se necesita mayor información al respecto. La mortalidad durante el transporte es el reflejo de un problema grave de bienestar, incluyendo no sólo animales muertos a la llegada (Death on arrival DOA) sino también todos aquellos animales que aparentemente no presentan lesiones (Non ambulatory, non injured – NANI) que mueren posteriormente(74). Registros de mortalidad durante el transporte en condiciones comerciales y experimentales han demostrado que ésta puede incrementarse por temperaturas altas o muy bajas, viajes de larga distancia o en el transporte de animales muy jóvenes(75,76). La mortalidad en el transporte es variable y dependiente de distintos factores. Animales que llegan a perder 10 % de su peso corporal durante el transporte tienen mayor probabilidad de morir o convertirse en animales no ambulatorios. La mortalidad también aumenta con menor disponibilidad de espacio en el transporte(37,38).

Hematomas Las lesiones y daños a la canal ocasionados por prácticas inadecuadas de transporte, o viajes de larga distancia afectarán la severidad de los hematomas y, por tanto, el grado de calidad de la canal y de la carne. De acuerdo a los requerimientos actuales del mercado, los animales deben ser transportados de una manera que evite este tipo de daños. La reducción 528

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en los daños a la canal sugeriría mejores condiciones de bienestar y por ende una mayor calidad ética del producto. La presencia de hematomas en la canal puede estar asociada a diferentes factores; durante un experimento, la cantidad de hematomas fue mayor en hembras que en machos, asimismo, las lesiones más severas se encontraron en vacas viejas y no en novillas, lo que podría deberse a que la mayoría de estas vacas tienen una condición corporal más baja (menos cantidad de músculo y grasa subcutánea); en este estudio lo hematomas relacionados al transporte se observaron en color “rojo oscuro” y por tanto considerados de una edad menor o igual a 24 h y fueron encontrados a los costados, alrededor de los huesos de la cadera (tuberosidad isquiática) lo cual puede relacionarse con el contacto que tienen el ganado con las paredes laterales del vehículo, hematomas que además se vieron incrementados conforme se incrementó la densidad animal(31). En el caso de machos, el comportamiento de monta y “cabezazos” que son conductas comunes en el ganado de carne, se relacionan con un incremento en los hematomas sobre todo en los corrales de espera(77); para el estudio en cuestión, la aparición de este comportamiento no pudo relacionarse con hematomas.

Estrategias para disminuir el estrés en viajes de larga distancia La producción y transporte de ganado en pie continuarán siendo estimulados por la creciente población humana(78), pero si se lograra la integración de las actividades dentro de la cadena logística se tendrían las siguientes ventajas: 1) reducción de distancia y tiempo mediante optimización de rutas; 2) mejorar el bienestar animal; 3) expandir el área de mercado para los productores; 4) disminuir los costos de operación e incrementar la competitividad; 5) reducir emisiones de dióxido de carbono (CO2); 6) mejorar la trazabilidad para las autoridades y el consumidor; 7) estrechar la participación entre productores, distribuidores, comerciantes y consumidores; 8) promover el intercambio de conocimiento, experiencia e información(79). Miembros importantes de la industria han comenzado a introducir sus propias políticas que permitan disminuir el estrés y mejorar las condiciones de bienestar para los animales destinados al abasto.

Farmacología aplicada al transporte Diversos estudios han permitido la implementación de estrategias que mejoran las condiciones de los animales durante los transportes de larga distancia. Existen investigaciones que consideran la importancia del uso de algunos ingredientes y medicamentos como la dexametasona como apoyo en el tratamiento de algunos problemas asociados al transporte(34,80). Se ha demostrado que la suplementación con Mg puede reducir los efectos del estrés pre-matanza y mejorar la calidad de la carne, debido a que suprime la estimulación neuromuscular(81) y al adicionarse en la dieta, resulta en la atenuación de la secreción de glucocorticoides y catecolaminas(82). El triptófano (Trp) es el 529

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precursor de la serotonina, el cual regula un gran número de funciones biológicas incluyendo la temperatura, sensibilidad al dolor, comportamiento de alimentación, comportamiento sexual y de agresión(83); si bien sus efectos no han sido estudiados durante el transporte, cabe mencionar que las preparaciones que contienen triptófano se comercializan en todo el mundo como agentes calmantes para tratar caballos excitables(84). La terapia de líquidos y electrolitos durante y después del transporte son importantes(1), incluso se ha demostrado que el proporcionar electrolitos al ganado antes de la matanza mejora el rendimiento de la canal, sin haber encontrado efectos sobre el pHu, color o capacidad de retención de agua(85), también reducen la deshidratación y la pérdida de peso asociada al transporte(86). Por otra parte, se ha comprobado que el uso de moduladores alostáticos (MA) podría mitigar el estrés causado por la captura y manejo del ganado durante el transporte; estos contienen sustancias como ácido ascórbico, ácido acetoxibenzóico, cloruro de sodio y cloruro de potasio, que adicionados 10 g por animal durante 30 días antes de la matanza mostraron propiedades antiinflamatorios, disminución de estrés evaluado mediante parámetros fisiológicos y mayor estabilidad en el color de la carne a las 24 h y 28 días post mortem(87).

Conclusiones Es claro que la distancia en el transporte es un componente estratégico de la economía agroalimentaria y producción cárnica global. Sin embargo, es necesario el desarrollo lineamientos y tecnologías en materia de manejo, operaciones y logística tendientes a mejorar las condiciones de bienestar y la salud del ganado. El impacto del estrés en el funcionamiento biológico, el comportamiento y el sufrimiento de los animales fue subestimado en el pasado. Sin embargo, en el presente existe surge una visión en la producción animal orientada a una visión holística dirigida a integrar el bienestar animal en un concepto amplio de calidad. Para lo cual, es imprescindible invertir en mejoras dirigidas al establecimiento de programas logísticos que tengan al bienestar animal como eje de un programa de calidad operativa, además de legislación que regule los viajes de larga distancia basada en evidencias científicasy la utilización de vehículos con diseños que puedan ajustarse a diferentes condiciones climáticas y a las características y comportamiento de cada especie.

Agradecimientos Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el financiamiento del proyecto número 259327, dentro de la Convocatoria de Investigación Científica Básica 2015.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.4912 Nota de investigación

Crecimiento, viabilidad y post-acidificación de Lactobacillus plantarum en la leche de transición bovina

Hugo Calixto Fonseca a Eduardo Robson Duarte a* Lívia Caroliny Almeida Santos Souza a Emanuelly Gomes Alves Mariano a Ana Clarissa dos Santos Pires b Tatiana Santos Lima a Maximiliano Soares Pinto a

Instituto de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Minas Gerais, Montes Claros, MG, Brasil. b

Universidade Federal de Viçosa, Campus Universitário, Viçosa. Departamento de Tecnologia de Alimentos. Grupo de Termodinâmica Molecular Aplicada, MG, Brasil.

* Autor de correspondencia. duartevet@hotmail.com

Resumen: En este estudio se analizaron cuatro sustratos de la leche para evaluar la viabilidad de la cepa de Lactobacillus plantarum de origen bovino después de 24 y 48 horas de fermentación. Además, se evaluó la viabilidad celular y la post-acidificación en la leche de transición fermentada por estas bacterias durante un periodo de almacenamiento de 60 días a 4 y 25 °C. Se observó una reducción significativa (de 30.9 %) de la viabilidad celular después de 48 horas de fermentación para la formulación con leche entera. Sin embargo, en la leche de transición fermentada almacenada a 4 °C, la viabilidad celular y la acidez se mantuvieron en niveles aceptables a lo largo del periodo de 60 días. La viabilidad de L. plantarum en la leche de transición fermentada permaneció aceptable hasta los 50 días, y se analizaron los valores de pH mínimo después de 38 días de almacenamiento y los niveles máximos de acidez después de 56 días. Tomando en

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cuenta estos resultados, la leche de transición puede ser conservada mediante la fermentación con L. plantarum como un sustituto de la leche en la alimentación artificial para terneros como alimento funcional. Palabras clave: Salud animal, Alimentación de los terneros, Fermentación, Conservación de alimentos, Probióticos.

Recibido: 23/05/2018 Aceptado: 04/06/2019

El uso de probióticos en el alimento para animales promueve la salud animal y mejora la productividad(1) y, por ende, representa una posible estrategia para controlar y prevenir la colonización del tracto gastrointestinal por bacterias patógenas(2). Se ha caracterizado el potencial probiótico de las bacterias de ácido láctico, y las especies del género Lactobacillus han revelado efectos benéficos in vitro e in vivo en el control de la diarrea en los terneros(3). El principal reto que presenta la creciente demanda de probióticos en el mercado mundial es que una cepa probiótica se debe cultivar en las concentraciones adecuadas en un producto determinado, y la viabilidad celular se debe mantener durante toda la vida útil de éste(4,5). Se evaluaron los alimentos que contienen probióticos en tanto tecnologías para el suministro de probióticos, así como la incorporación de estos microorganismos a la leche fermentada ha dado como resultado productos con una viabilidad celular y una funcionalidad elevadas(1,6). Se puede utilizar calostro fermentado (del primer al tercer día del posparto) o la leche de transición (hasta el séptimo día de posparto) como sustitutos de leche para la alimentación artificial, con lo cual se reducen los costos y se promueve el desarrollo saludable de los terneros(7,8). Se han sugerido estas secreciones iniciales del periodo de lactancia como sustitutos para la producción de probióticos animales(6), dado que no tienen ningún valor comercial, pese a su elevado contenido de proteínas y vitaminas(9,10). Además, las células de inmunoglobulina en el calostro fermentado tienen la misma viabilidad que el calostro in natura y son capaces de transferir inmunidad pasiva a los terneros recién nacidos(11). No obstante, se han registrado pérdidas por putrefacción durante la fermentación. Éstos pueden asociarse con la proliferación de organismos patógenos o de descomposición(7). Se considera que los productos lácteos son las mejores matrices portadoras de bacterias de ácido láctico, que son el principal grupo de especies probióticas(12). En este estudio preliminar fue selecionada una cepa de Lactobacillus del tracto intestinal de un ternero que presentaba efectos inhibitorios de las cepas de Escherichia coli que provocan 540

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diarrea a los terneros. Además, se observó un mayor aumento de peso diario en terneras alimentadas con la leche fermentada que contenía la cepa de especies de Lactobacillus(13). Sería pertinente realizar un análisis más profundo de esta cepa de probióticos en la leche de transición y de los tiempos de almacenamiento adecuados, con lo cual se reducirían los costos de la alimentación artificial y mejoraría la salud de los terneros. En este estudio se evaluó el potencial de cuatro sustratos lácteos para el crecimiento de Lactobacillus plantarum durante dos periodos de fermentación. Además, se evaluó la viabilidad celular y la post-acidificación en la leche de transición fermentada por esta bacteria en un periodo de almacenamiento de 60 días a dos temperaturas diferentes. La cepa de bacterias analizada se aisló de las heces de un ternero ¾ Holstein y ¼ Gyr destetado de 4 meses de edad. La bacteria se seleccionó por tener una mayor resistencia al pH ácido y a las sales biliares in vitro; ambas son características importantes de los probióticos para demostrar un efecto antagónico mayor entre dos cepas de Escherichia coli que provocan colibacilosis en los terneros(13). A fin de llevar a cabo la identificación molecular de estas bacterias, se extrajo ADN y se lo amplificó mediante la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) mediante el uso de los cebadores 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) y 1492R (5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) como lo describe Lane(14), y se secuenció el gen 16S ARNr(15) con el secuenciador automático MegaBACE® 1000 (GE Life Sciences, Chicago, EEUUA) en el Laboratorio Biotecnológico Myleus (Belo Horizonte, Brasil). La secuencia del gen 16S ARNr fue verificada con el software SeqScanner® versión 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, EEUUA) y cotejada con la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica de Estados Unidos (NCBI) mediante el servidor BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Se reconoció la cepa como Lactobacillus plantarum, considerando un umbral de similitud del 99 %. Además, la cepa de bacterias tuvo puntajes de identificación superiores a 2.0 cuando se la analizó mediante una espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización por desorción con láser asistida por matrices (MALDI-TOF MS), utilizando el software MALDIBiotyper v2.0(16). Las bacterias se conservaron en congelación (a -18 °C) en tubos con una mezcla de caldo de cultivo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) y 20% (m/m) de glicerol. A fin de activar los microorganismos, se añadieron 0.2 mL de cultivos congelados a 10 mL de MRS y se incubaron durante 24 h a 37 °C. Posteriormente se realizaron dos inoculaciones sucesivas en tubos de ensayo que contenían 10 ml de la leche descremada reconstituida a una concentración de 10 % de sólidos no grasos. Por cada inoculación se incubaron los tubos durante 24 h a 37 °C. Principalmente, se probó la viabilidad de esta bacteria en dos periodos de fermentación diferentes y en cuatro formulaciones distintas de sustratos: (1) leche descremada 541

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reconstituida (LDR), que constó de la leche descremada en polvo (Molico, Nestlé) reconstituida en agua destilada a una concentración de 10% (m/v) sólidos no grasos, (2) leche de transición (LT) de vacas Holstein al tercer día después del parto, (3) leche entera (LE) de animales de la misma raza y granja lechera que los de la formulación de LT, y (4) mezcla de 50 % de LE y 50 % de LT (LET). Se vertió cada formulación (25 ml) en tubos de ensayo, y a cada tubo se le añadió un 0.3 % (m/v) de citrato de sodio como estabilizador. Luego se pusieron los tubos en una autoclave a 121 °C durante 15 min. Después, se los enfrió hasta alcanzar la temperatura ambiente (25 ± 2 °C) y se añadió a cada formulación 2 % (v/v) de cultivo de L. plantarum (8 log UFC ml-1), puesto que las primeras concentraciones fueron de 6.6 log UFC·ml-1. Los tubos fueron agitados e incubados en una incubadora BOD a 37 °C durante 24 y 48 h. La Figura 1 muestra el flujograma de producción para cada formulación. Figura 1: Flujograma del proceso de producción de cuatro productos lácteos fermentados con Lactobacillus plantarum con potencial probiótico LDR: Leche descremada en polvo reconstituida al10%(m/v)

LT: Leche de transición del tercer día del posparto

LE:

LET:

Leche Entera

50% LT + 50%LE

Adición del citrato de sodio 0.3% (m/v)

Tratamiento térmico(121 oC/15 minutos)

Enfriamiento em la temperatura ambiente (25 ± 2 °C) Almoça

Inoculación de 2% (v/v) del Passea cultivo con Lactobacillus sp.

Janta Incubacióna 37 oC durante 24 h

Incubacióna 37 oC durante 48 h

En un segundo ensayo, se evaluó la viabilidad de las bacterias, así como la postacidificación de la leche de transición fermentada preparada como se describe arriba, pero incubada solamente durante 24 h a 37 °C. Después de la fermentación, se

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almacenaron las muestras a 4 y 25 °C para someterlas a análisis microbiológicos y fisicoquímicos, como puede verse en la Figura 2. Figura 2: Flujograma del proceso de producción de leche de transición fermentada con Lactobacillus plantarum con potencial probiótico LT: Leche de transición del tercer día del posparto

Adición del citrato de sodio 0.3% (m/v)

Tratamiento térmico (121 oC/15 minutos)

Enfriamiento en la temperatura Almoça ambiente (25 ± 2 °C)

Passea Inoculación de 2% (v/v) del cultivo con Lactobacillus sp.

Janta Incubación a 37 oC durante 24 h

Dormi Almacenamiento a 25 oC

Almacenamiento a 4 °C S Dormi

Los conteos de bacterias viables para las cuatro fermentaciones se hicieron Dormi inmediatamente después de las 24 o 48 h de incubación. Para la leche de transición fermentada a dos temperaturas diferentes, los conteos de células viables se evaluaron a los 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 días de almacenamiento. Los sustratos fermentados se diluyeron serialmente a 10-7 en 0.1 % (m/v) de agua de peptona estéril, y se transfirieron porciones alícuotas de 1 ml a cajas de Petri esterilizadas. Luego se añadió medio de agar MRS (HiMedia, Mumbai, India), y se homogeneizó el material mediante el método de vertido en placa. Éste se aplicó dos veces para todos los análisis. Las placas fueron incubadas a 37 °C durante 72 h bajo 543

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condiciones aeróbicas, y se realizó un conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC). Los resultados se expresaron como log UFC por mililitro de sustrato fermentado. El pH de los sustratos fermentados se midió utilizando un potenciómetro digital con un electrodo de vidrio combinado (marca Hanna, modelo pH21). La acidez titulable, expresada como % (m/v) de ácido láctico, se determinó mediante titulación ácido-base. Ambos análisis se realizaron después de 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 días de almacenamiento. Los datos se sometieron a un análisis de varianza, y se evaluó la significancia de las diferencias entre las medias usando la prueba de Tukey con un intervalo de confianza del 95 % (P<0.05). Se llevaron a cabo análisis de regresión para describir la viabilidad celular, el pH y la acidez titulable como una función del tiempo de almacenamiento a cada temperatura de almacenamiento. Ambos experimentos utilizaron un esquema factorial con cuatro réplicas para cada condición, y el diseño experimental fue totalmente aleatorizado. Los análisis se realizaron usando el Sistema de Análisis Estadístico SAS versión 9.4 (SAS, 2014). La viabilidad de los microorganismos en los alimentos probióticos es el principal determinante de la funcionalidad de estos productos. En este estudio, los conteos de células viables de los cultivos probióticos fueron superiores a 8.40 log UFC·ml-1 (Cuadro 1). No hubo diferencia significativa en la concentración de L. plantarum en los cuatro sustratos lácteos después del mismo periodo de incubación. La leche de transición permitió el crecimiento viable de las células probióticas a las mismas concentraciones que la leche entera, lo cual sugiere que se debe elegir ésta como sustrato de crecimiento puesto que carece de valor comercial para la industria de los lácteos. Cuadro 1: Conteos de células viables (log UFC ml-1) de Lactobacillus plantarum en la leche descremada reconstituida (LDR), la leche de transición (LT), la leche entera (LE), y la mezcla de 50 % de LT + 50 % de LE (LET) después de 24 y 48 h de fermentación a 37 °C Sustrato Tiempo de fermentación LDR LT LE LET Aa Aa Aa 24 h 8.77 8.67 8.91 8.62Aa 48 h 8.58Aa 8.82Aa 8.40Ab 8.64Aa Coeficiente de variación: 2.61 %. Las letras mayúsculas en la misma fila y las letras minúsculas para los valores de la misma columna indican diferencias significativas (P<0.05).

Para la formulación de LE, hubo una reducción significativa (de 30.9 %) en los conteos de células viables entre las 24 y las 48 h de fermentación. En contraste, para las formulaciones de LDR, LT y LET, los conteos de células viables de L. plantarum fueron similares después de 24 y 48 h de fermentación, lo que indica que sólo se 544

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requieren 24 h para que el microorganismo alcance concentraciones elevadas en estos sustratos. En otro estudio, se analizó el crecimiento de las cinco cepas de probiótico en la leche UHT suplementada con triptona y fructuosa, y todas las cepas alcanzaron conteos máximos de células viables de 8.7 a 9.2 log UFC ml-1 después de 6 a 16 h de incubación. Sin embargo, tres cepas presentaron una reducción de 0.4 a 1.1 log UFC en el conteo de células viables a entre 24 y 72 h de incubación(17). También se evaluó la fermentación de seis cepas de probióticos durante un periodo de 48 h a diferentes temperaturas con un sustrato de la leche UHT. El máximo crecimiento y los conteos más altos de células viables (8.65 a 9.21 log UFC ml-1) para todas las cepas de Lactobacillus spp. evaluadas se obtuvieron a una temperatura de 37 °C y un tiempo de incubación de 12 a 24 h(18). El sustrato, la cepa y su adaptación al medio de cultivo influyen fuertemente en la tasa de fermentación y la duración de la fase de crecimiento celular. El crecimiento más rápido ocasiona un consumo de nutrientes y una producción de ácido más rápidos, los cuales tienen un impacto ambiental negativo que conduce a una rápida progresión a la fase de disminución. En general, la duración de la fermentación está determinada por el pH; la fermentación continúa hasta que el pH alcanza un valor de 4.5 a 4.6. En la producción de yogurt con diversas especies de probióticos, se reportó una fermentación más rápida en la leche entera que en la leche descremada(19). En otro estudio, el tiempo total de fermentación de la leche entera osciló entre 16 y 31 h, dependiendo de la especie evaluada de Lactobacillus spp(20). En este estudio, todas las formulaciones arrojaron conteos de células viables superiores a 6 log UFC g-1 (Cuadro 1), que es el conteo mínimo de células viables requerido para que los productos de Lactobacillus spp. funcionen como probióticos(21). Los fabricantes de cultivos de probióticos también recomiendan un conteo mínimo de células viables de 6 log UFC g-1 en la leche fermentada por estas bacterias(22). Los resultados de este estudio fueron similares a los reportados por Coman et al(23), quienes citan conteos de células viables por encima de 8 log UFC·ml-1 de L. rhamnosus y Lactobacillus paracasei, individualmente o en combinación, al final de la fermentación de la leche entera. Se considera que la viabilidad y la estabilidad duraderas son prerrequisitos fundamentales para los productos probióticos. Por lo tanto, se midió la viabilidad celular, el pH y la acidez titulable en la leche de transición fermentada durante un periodo de almacenamiento de 60 días a 4 y 25 °C. Como era de esperarse, cada parámetro dependió de la temperatura de almacenamiento (Cuadro 2). Después de 40 días de almacenamiento, los conteos de células viables de la leche de transición fermentada almacenada a 25 °C fueron significativamente inferiores a los del producto almacenado a 4 °C. Asimismo, el almacenamiento de la leche de transición fermentada a 25 °C arrojó un pH significativamente menor después de 10 días y una acidez titulable 545

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significativamente mayor después de 20 días, comparada con el almacenamiento a la temperatura de 4 °C. Cuadro 2: Conteo de células viables, pH y acidez titulable (expresada como % de ácido láctico) de la leche de transición fermentada y almacenada durante 60 días a 4 y 25 °C Células viables Ácido láctico pH -1 (log UFC ml ) (%) Tiempo (días) Temperatura Temperatura Temperatura 4 °C 25 °C 4 °C 25 °C 4 °C 25 °C Aa Aa Aa Aa Aa 0 8.89 8.89 5.70 5.70 0.37 0.37Ac 10 8.72Aa 8.56Aa 5.52Aab 5.01Bb 0.42Aa 0.73Ab 20 8.79Aa 8.02Aab 5.47Aab 4.78Bb 0.53Aa 0.90Bab 30 8.50Aa 7.63Abc 5.36Ab 4.85Bb 0.55Aa 0.98Bab 40 8.71Aa 7.63Bbc 5.36Ab 4.86Bb 0.53Aa 1.03Bab 50 8.67Aa 6.88Bc 5.43Aab 4.89Bb 0.48Aa 1.14Ba 60 8.48Aa 5.65Bd 5.37Ab 4.95Bb 0.55Aa 1.19Ba Las letras mayúsculas diferentes para los valores de cada parámetro en la misma fila y las minúsculas diferentes para los valores de la misma columna indican diferencias significativas (P<0.05). Coeficientes de variación: 4.47% (Conteo de células viables); 2.36% (pH); 19.41% (ácido láctico).

El conteo de células viables fue de 8.48 log UFC ml-1 después de 60 días de almacenamiento a 4 °C y se mantuvo sin cambios significativos (P>0.05) durante el periodo de almacenamiento. Sin embargo, cuando el producto se almacenó a 25 °C, hubo una reducción significativa en la viabilidad celular de > 1 ciclo log después de 30 días de almacenamiento. Sin embargo, la reducción fue más pronunciada después de 60 días de almacenamiento, y mostró un conteo de células viables de 5.65 log UFC·ml-1 al final del periodo de almacenamiento (Cuadro 2). La disminución de la viabilidad celular a esta temperatura de almacenamiento podría justificarse por un pH más bajo y una mayor acidez. Utilizando el análisis de regresión, se infiere que el conteo de células viables del producto permaneció dentro de los límites aceptables (>6.5 log UFC ml-1) durante más de 50 días en refrigeración y hasta 50 días a 25 °C (Cuadro 2 y Figura 3). Para un producto probiótico, la estabilidad del conteo de células viables a lo largo de su vida útil es esencial, y la estabilidad de los probióticos a temperatura ambiente es particularmente relevante porque permite a los productores ahorrar energía al almacenar la leche de transición para la alimentación artificial de los terneros.

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Figura 3: La regresión cuadrática de la viabilidad (---) y la acidez (---) del Lactobacillus plantarum de la leche de transición fermentada como una función del tiempo de almacenamiento (hasta 60 días) a 25 °C. R2: coeficiente de determinación; y: viabilidad o acidez; t: tiempo de almacenamiento

Se han utilizado diferentes tiempos de almacenamiento en refrigeración antes de evaluar la viabilidad de los microorganismos probióticos en los productos fermentados. En el desarrollo de una leche fermentada con L. plantarum, hubo una reducción de 1.2 log UFC en los conteos de células viables cuando el producto se almacenó durante 70 días a 10 °C, lo cual es un resultado satisfactorio(24). El análisis de ensilajes de calostro y de la leche de transición demostró que las muestras fermentadas adecuadamente tuvieron una concentración promedio de Lactobacillus spp. de 5.15 log UFC después de 33 días de almacenamiento a 25 °C(7). La leche probiótica fermentada puede ser almacenada durante varias semanas con una pérdida mínima de viabilidad si se logra reducir la acidificación por medio de la refrigeración(25). En este estudio, el pH del producto disminuyó significativamente después de 30 días de almacenamiento a 4 °C, llegando a un valor de 5.36 después de ese periodo (Cuadro 2). Cuando el producto se almacenó a 25 °C, su pH bajó de 5.70 a 5.01 después de 10 días de almacenamiento. Según las ecuaciones de regresión, la leche de transición fermentada podría alcanzar su valor mínimo de pH después de 44 y 38 días de almacenamiento a 4 °C y a 25 °C, respectivamente (Figura 4).

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Figura 4: Regresión cuadrática del pH de la leche de transición fermentada como una función del tiempo de almacenamiento (hasta por 60 días) a 25 °C (---) y 4 °C (—). R2: coeficiente de determinación, y: pH; t: tiempo de almacenamiento

El pH afecta la conformación de las proteínas, la actividad de las enzimas y la disociación de los ácidos, y por ende es el parámetro más importante para caracterizar la acidez de la leche y los productos lácteos. Coman et al(23) demostraron que, después de la fermentación y del almacenamiento durante 4 semanas a 4 °C, la leche entera fermentada con L. paracasei y L. rhamnosus alcanzó valores mínimos de pH de 5.60 y 4.31, respectivamente(26). Otro hecho que debe tomarse en consideración es la disponibilidad de los nutrientes; por ejemplo, la leche fermentada presentó valores de pH de 5.81 para la muestra testigo (sin nutrientes añadidos) y 3.82 para las muestras con nutrientes añadidos (aminoácidos, vitaminas, minerales y nucleótidos) después de 72 h de fermentación(27). La reducción del pH ocasiona un flujo pasivo de protones hacia las células microbianas, que exportan protones de manera activa. El influjo incontrolado de protones debería reducir el pH celular interno, inhibiendo la síntesis de los componentes celulares y la multiplicación de las células. El ácido láctico no disociado puede penetrar la membrana celular y contribuir a la acidificación del citoplasma bacteriano(28). El pH inicial y final, así como otros factores como la producción de ácido orgánico y la exposición a diferentes temperaturas durante el almacenamiento pueden afectar la viabilidad celular durante la fermentación. El crecimiento de los microorganismos indeseables se reduce en los productos con un pH menor de 5.0(26). En este estudio, el pH de la leche de transición fermentada a 25 °C permaneció por debajo de ese nivel desde los 20 hasta los 50 días (Figura 4). 548

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Ferreira et al(29) observaron una rápida reducción del pH cuando el calostro se fermentó naturalmente a 32.5 °C; los productos con valores de pH por debajo de 4.5 se obtuvieron a los 35 días de fermentación. En estudios anteriores, los calostros bovinos, desde la segunda ordeña después del parto, presentaron un valor medio de pH de 5.41 después de 33 días de fermentación a 25 °C(7). En este estudio, la acidez titulable de la leche de transición fermentadas no cambió significativamente (P>0.05) durante el periodo de almacenamiento en refrigeración. Sin embargo, cuando el producto se almacenó a 25 °C, la acidez titulable casi se duplicó después de 10 días, aumentando de 0.37 a 0.73 % de ácido láctico; otro incremento significativo en la acidez ocurrió después de 50 días, llegando al 1.14 %. El análisis de regresión indicó que la leche de transición fermentada almacenada a 25 alcanzó valores máximos de acidez titulable después de 56 días (Figura 4). Estos resultados demuestran que la estabilidad y la viabilidad del producto pueden ser influidas por la acidez, puesto que la cepa utilizada en este estudio es sensible a los ácidos. La cepa de L. plantarum con potencial probiótico evaluada mostró un crecimiento satisfactorio en cada una de las formulaciones a base de la leche que se sometieron a prueba, dando como resultado altas concentraciones de células viables (> 8 log UFC·ml1 ). La leche de transición del tercer día después del parto representa un sustrato útil para el crecimiento de esta bacteria y se puede almacenar hasta por 50 días a temperatura ambiente. Por ende, se ha demostrado que la fermentación de la leche de transición con la cepa L. plantarum es un método viable para producir esos probióticos.

Agradecimientos Se agradece al Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq) y a la Fundación de Apoyo a la Investigación de Minas Gerais (Fundação de Apoio à Pesquisa de Minas Gerais, FAPEMIG) por su apoyo financeiro.

Declaración de conflicto de intereses

Los autores de este manuscrito no tienen relación financiera ni personal con personas ni con organizaciones que pudieran influir de alguna manera inapropiada o sesgar el contenido de este trabajo.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5084 Nota de investigación

Caracterización de la leche y queso artesanal de la región de Ojos Negros, Baja California, México

Laura E. Silva-Paz a Gerardo E. Medina-Basulto a Gilberto López-Valencia a* Martin F. Montaño-Gómez a Rafael Villa-Angulo b José C. Herrera Ramírez a Ana L. González-Silva a Francisco Monge-Navarro a Sergio A. Cueto-González a Gerardo Felipe-García a

Universidad Autónoma de Baja California. Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias. Fracc. Laguna Campestre carretera a San Felipe km 3.5, Mexicali, Baja California. México. b

Universidad Autónoma de Baja California. Instituto de Ingeniería. México.

*Autor de correspondencia: gilbertolopez@uabc.edu.mx

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Resumen: La comunidad de Ojos Negros está ubicada en el municipio de Ensenada Baja California, México. Desde 1930, los residentes locales fabrican un queso artesanal muy apreciado en la región; sin embargo, la leche cruda y el queso nunca han sido analizados por la calidad microbiológica y de higiene del producto final. El objetivo del presente estudio fue evaluar la calidad microbiológica, física y química de la leche cruda utilizada para producir queso, y el queso artesanal producido en las 22 unidades de producción individuales. Se tomaron muestras de queso y leche de las unidades de producción para realizar pruebas microbiológicas. Se realizaron determinaciones físicas y químicas de proteínas, grasas y lactosa utilizando un analizador LACTOSCAN-S. Los resultados del análisis de la leche mostraron un contenido de proteína (33.11 g/L) y grasa (39.89 g/L) dentro de los parámetros de la normatividad. Para la calidad microbiológica de la leche, los resultados del recuento de mesófilos aeróbicos mostraron un cumplimiento del 64 % con las regulaciones; sin embargo, el mismo conteo de mesófilos aeróbicos en las muestras de queso resultó en solo el 4 % de cumplimiento con las regulaciones. No hubo detección de Salmonella spp. o Listeria monocytogenes en cualquiera de las muestras de leche o de queso probadas. Se deben incorporar buenas prácticas sanitarias y de fabricación para mejorar la calidad sanitaria y de higiene para la producción de queso artesanal en la comunidad de Ojos Negros. Palabras clave: Ojos Negros, Queso artesanal, Composición química, Calidad microbiológica.

Recibido: 28/09/2018 Aceptado: 29/04/2019

En México la elaboración de queso artesanal por parte de medianos y pequeños productores se estima en alrededor del 25 % del total producido al año(1). La elaboración y venta de quesos artesanales constituye una de las principales fuentes de ingresos para pequeños ganaderos a pesar de la baja rentabilidad de su actividad(2,3). En la región de Ojos Negros del municipio de Ensenada Baja California México desde 1930 se elabora en forma artesanal el llamado “queso prensado de Ojos Negros”. Actualmente la producción de este queso (producido a partir de leche sin pasteurizar) alcanza las 30 t mensuales, mismas que sustentan aproximadamente a 65 familias(4). Sin embargo, los productores de queso se enfrentan a un nuevo reto ya que las regulaciones mexicanas establecen que la leche utilizada para producción de queso debe ser pasteurizada(5). Adicionalmente deben instrumentarse prácticas sanitarias para garantizar un producto inocuo y no represente un riesgo para el consumidor(6). En 2010 los productores regionales organizaron una asociación afín de buscar asistencia técnica, logrando el desarrollo de 554

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unidades de producción; sin embargo, la calidad microbiológica del producto es cuestionable dada la utilización de leche sin pasteurización, aunado a la ausencia de un sistema apropiado de buenas prácticas de manufactura(7). Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue realizar un análisis situacional la calidad microbiológica y fisicoquímica de la leche y queso producido en las 22 unidades queseras de dicha región. El estudio se llevó a cabo en 22 unidades de producción (UP) de queso artesanal situadas en la localidad de Ojos Negros Municipio de Ensenada Baja California México (31°45' y 32°04' N y 116°06' y 116°27' O). El total de las UP se encuentran dentro del programa de control de tuberculosis y brucelosis. El sistema de producción es semi-extensiva (libre pastoreo y estabulación), poseen infraestructura y equipo adecuado para producir leche y quesos a escala familiar. En promedio cada hato produce 450 L diarios de leche mismos que son destinados a la elaboración de queso artesanal. Los productores se encuentran en la fase inicial de instrumentar un programa de buenas prácticas de manufactura e higiene. Las muestras de leche de todas las UP se colectaron el mismo día de acuerdo a las especificaciones de la NMX-F-718-COFOCALEC(8). De cada UP se obtuvieron 100 ml de la leche del tanque para determinar su calidad sanitaria; la toma de muestras de queso se realizó siguiendo las directrices de la NOM-109-SSA(9). De cada UP se recolectó una pieza de queso entero de aproximadamente 2.5 kg, en una sola ocasión. Las muestras de leche y queso se trasladaron en hielera portátil a una temperatura de entre 7 y 10° C al Laboratorio de Análisis de Leche del IICV de la UABC, para su posterior procesamiento. Los análisis microbiológicos para leche y quesos, se realizaron de acuerdo al procedimiento descrito en los apéndices B10, B16, B17 de la NOM-243-SSA1(5). Requiriendo para leche y queso 1 ml y 10 g de muestra disueltos en 9 ml y 90 ml de agua peptonada bufferada 1% (Difco, New Jersey) respectivamente. Para el conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) de cada muestra, se realizaron cinco diluciones depositando 1 ml en placas por duplicado para bacterias mesófilas aerobias en Agar Cuenta Estándar (MCD Lab, Tlalnepantla, México), las placas que registraron entre 25 a 250 colonias fueron seleccionadas para conteo. Para determinar coliformes se seleccionaron aquellas placas con registro de 30 a 300 colonias, y para el conteo de hongos y levaduras, 1 ml de cada dilución fueron sembradas y analizadas a los cinco días. Para el análisis de Salmonella 10 ml de leche y 10 g de queso fueron pre-enriquecidos en 90 ml de agua peptonada (Difco, New Jersey) y después de 24 h de incubación a 35 ± 2 °C se enriquecieron en caldo Tetrathionato (Difco, New Jersey) y RappapotVassilidis (Difco, New Jersey) para posteriormente enriquecer la muestra, sembrando en medios agar XLD (Difco, New Jersey), Hecktona (Difco, New Jersey) y Verde Brillante (Difco, New Jersey). Procediendo a identificar mediante pruebas bioquímicas TSI (BD Bioxon, Cuautitlán Estado de México), LIA (BD Bioxon, Cuautitlán Estado de México), Urea (Difco, New Jersey) y RMVP (Difco, New Jersey).

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Para el análisis de Listeria monocyogenes 25 g de muestra de queso fueron homogenizados en 225 ml de caldo UVM (Difco, New Jersey) e incubando a 30 °C por 24 h, para posteriormente enriquecer en 10 ml de caldo Fraser (Difco, New Jersey) por 24 h a 35 ± 2 °C. Se realizaron siembras en placas agar Oxford (Difco, New Jersey), las colonias con pigmentación color café con un halo se aislaron para su purificación e identificación en agar Infusión Cerebro Corazón (Difco, New Jersey) mediante morfología de cocobacilo en cadena Gram positivo, motilidad positiva a 20-25 °C, prueba de oxidasa negativa, catalasa positiva y prueba API-Listeria (bioMérieux, St. Louis, MO) respectivamente para su confirmación, siguiendo los procedimiento respectivos del apéndice B13 y B12 de la NOM-243-SSA(5). La acidez en la leche se realizó de acuerdo al procedimiento descrito en la NOM-155-SCFI(10), y el pH se evaluó con un potenciómetro (Hanna Instruments, Carrolton TX). La determinación fisicoquímica se realizó utilizando el analizador LACTOSCAN-S (Milk Analyzer LTD modelo LS 90, Bulgaria) para determinar el porcentaje de proteína, grasa, lactosa en la leche. Para cada una de las variables analizadas se calculó la media ± error estándar. Se utilizó la prueba t de student para detectar diferencias (P<0.05) entre los promedios de cada parámetro comparado con los parámetros deseables de las NOM que apliquen. Los resultados de la calidad fisicoquímica y nutricional de leche utilizada en la elaboración de queso artesanal se presentan en el Cuadro 1. Se observaron diferencias significativas (P<0.05) entre los promedios detectados de proteínas para cada clase (A, B y C) con respecto al parámetro de referencia que indica la normatividad NMX-F-700-COFOCALEC(11). Con respecto a la grasa, la clase A no mostró diferencia (P>0.05) entre el parámetro deseable de la NOM y el valor promedio. Sin embargo, cuando se comparó el promedio para la clase C contra el parámetro deseable se identificaron diferencias significativas (P<0.05). En este estudio las cifras para las clases A de proteínas (32.98 g/L) y de grasa (35.62 g/L) fueron mejores que los reportados por Bernal(12) en pequeños hatos lecheros procedentes del Estado de México y de Oliszewski(13) en hatos lecheros de la región rural de Cuenca de Trancas en Argentina, donde se aprecian menor cantidad de proteína (30.55 g/L) y de grasa (34.0 g/L), sin embargo ambas cifras son consideradas leche de buena calidad. Una posible explicación a estas variaciones pudiera ser el manejo alimenticio de la vaca con respecto al racionamiento de nutrientes, libre pastoreo o a factores genéticos en las razas de animales como lo señala De la Cruz(14).

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Cuadro 1: Calidad fisicoquímica y nutricional de leche utilizada en la elaboración de queso artesanal en 22 UP de la región de Ojos Negros, México Indicador* Valores de Referencia** g/L N (%) Media (DE) Proteína, g/L

Grasa, g/L

Lactosa, g/L Ácido láctico, g/L

Clase A deseable ≥ 31a Clase B mínimo 30 -30.9 Clase C mínimo 28 a 28.9 Clase A deseable ≥ 32a Clase B mínimo 31 Clase C mínimo 30 Deseable 47.5 a No deseable < 44

14 (63) 6 (27) 2 (10) 10 (46) 1 (4) 11 (50) 15 (73) 7 (27)

32.98 b (0.287) 30.46 a (0.116) 28.10 b (0.100) 35.62 a (3.949) 31.50 a 27.01 b (1.138) 47.74a (0.495) 42.80b (0.728)

No deseable ≥ 1.9 Deseable 1.3 – 1.8 a No deseable ≤ 1.29 No deseable ≥ 6.9 Deseable 6.5-6.8 a No deseable ≤ 6.4

15 (68) 4 (18) 3 (14) 4 (18) 15 (68) 3 (14)

2.438b (0.076) 1.720 b (0.080) 1.153 b (0.016) 6.95 b (0.016) 6.70 a (0.045) 6.33 a (0.066)

DE= desviación estándar. NMX-F-700-COFOCALEC-2012. ab valores promedios de cada variable comparado con los parámetros deseables que muestren literales diferentes son significativos (P<0.05). *

Con respecto a la lactosa el 73 % de las UP presentaron un nivel deseable y no fue diferente (P>0.05) con el parámetro deseable de la NOM. Con respecto al 27 % de las UP que fueron identificados con bajos niveles de lactosa una posible explicación es que también fueron identificadas con casos de mastitis, pues es conocido que esta enfermedad propicia una reducción en la secreción de lactosa en la leche (15,16). Con respecto al ácido láctico solo el 18 % de las UP se encontraron en niveles aceptables de acuerdo la norma. Además, el 68 % de las UP superaron el parámetro de la norma (P<0.05). Una posible explicación es que las poblaciones bacterianas degradan lactosa a medida que trascurre el tiempo de almacenamiento, desarrollando progresivamente acidez en la leche(17,18,19). Por otra parte el 68 % de las UP presentaron un promedio de pH deseable, mientras que el 18 % de las UP mostraron un promedio de pH > 6.95 (P<0.05) esto puede ser explicado en parte porque la leche la mantienen en almacenamiento más de 6 h a temperatura ambiente (entre 15 a 32 °C); esto propicia un incremento de los microorganismos lácticos y sobre todo coliformes y con ello un incremento en su acidez(19,20). Al comparar el promedio observado de acidez titulable (1.720 g/L) y pH (6.70) se aprecian valores

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similares al informado en la región de Argentina por Oliszewski(13), con una acidez de 1.726 g/L y 6.75 de pH. El Cuadro 2, muestra la calidad microbiológica de la leche utilizada en la elaboración de queso artesanal. El 64 % de las UP obtuvieron promedios entre deseables (50 %) y aceptables (14 %) con respecto a la NMX-F-700-COFOCALEC(11) para mesófilos aerobios. Estas cifras son similares a lo reportado por Oliszewski (4.94 log UFC/ml)(13). Con respecto a los promedios de las clases no deseables (3 y 4) al compararlos con el parámetro de referencia se detectó diferencia significativa (P<0.05). Resultados similares fueron obtenidos por Perkins(21) y De la Cruz(14), mismos que señalaron que cuentas de mesófilos >6 log indican problemas sanitarios del hato. Una posible explicación es que los hatos no cuentan con un programa de medicina preventiva secundaria que permita identificar problemas sanitarios, entre ellos mastitis subclínica, lo que se refleja en altos niveles de mesófilos.

Cuadro 2: Calidad microbiológica de la leche utilizada en la elaboración de queso artesanal en 22 UP de la región de Ojos Negros, México Valores de Indicador referencia N (%) Media (DE) (log10 CFU/ ml−1) * Cuenta mesófilos aerobios /ml

Salmonella spp 25 g

≤100,000 UFC/ml ( ≤5.0 ) a 101,000-300.000 ( 5.1 – 5.47 ) ≥301,000 – 599,000 ( ≥5.48 – 5.77 ) ≥600,000 – 1,200,000 ( ≥5.78 ) ≤10 UFC/ml (≤1)a <11-100 UFC/ml ( 1.04-2.0 ) ≥101 UFC/ml ( ≥2.1 ) Ausencia

Listeria monocytogenes 25 g

Ausencia

Clase 1 Clase 2 Clase 3 Clase 4 **

Coliformes UFC/ml

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11 (50) Deseable 3 (14) Aceptable 1 (4) No deseable 7 (32) No deseable ND Deseable 1 (5) No deseable 21 (95) No deseable 22 (100) 22 (100)

1.67 b (0.189) 5.11 a (0.110) 5.60 a 7.53 b (0.348)

2.00 b 5.589 b (0.384)

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DE= desviación estándar. NMX-F-700-COFOCALEC-2012. ** NOM-243-SSA1-2010. Métodos de prueba: coliformes totales <10 UFC (≤1 log 10 CFU ml−1). ND= no detectado. ab valores promedios de cada variable comparado con el parámetro deseable que muestren literales diferentes son significativos (P<0.05). *

Además el 100 % (22) de las UP presentaron un promedio de coliformes no deseables (P<0.05) por encima de la normatividad (NOM-243-SSA1)(5). Aunque los resultados se aprecian más bajos a los reportados por Oliszewski(13) con 5.64 log UFC/ml. El incremento de mesófilos y coliformes no necesariamente indica una contaminación fecal directa en la leche, pero si precisan deficiencias de higiene y rutinas de ordeña sin buenas prácticas de manejo durante la obtención y almacenamiento de la leche(14,22,23). Otro aspecto relevante fue que en ninguna de las UP se identificó Salmonella spp, ni Listeria spp, lo cual es deseable, ya que estas bacterias representan un riesgo para la salud del consumidor(24) . La calidad microbiológica del queso producido en las 22 UP se muestra en el Cuadro 3 donde se observa que únicamente el 18 % de las UP presentaron conteos similares (P>0.05) al parámetro deseable de mesófilos aerobios. El resto de las UP mostraron promedios no deseables (P<0.05) de mesófilos por encima de la normatividad (NOM-243-SSA1)(5). Con respecto a coliformes el 100 % de las UP presentaron cifras promedio por encima del parámetro establecido por normativa (P<0.05). La alta incidencia de coliformes y de mesófilos en los quesos de las UP indica deficiencias en las prácticas de higiene y manufactura. Una posible explicación es que el queso se elabora con leche conservada a una temperatura promedio de 20 °C. Diversos estudios muestran que la temperatura de conservación es un factor importante que puede contribuir en el incremento de microorganismos alterantes dañando su estabilidad, mismos que de no ser controlados podrían tener un efecto directo sobre la calidad y la vida útil del queso (19,23,25,26). Es importante destacar que valores superior a ≥6 log10 mesófilos y ≥5 log10 de coliformes también fueron reportados en otros estudios(27-30). Torres(31) menciona que el incremento de mesófilos aerobios se considera un proceso normal en los primeros 30 días de su elaboración, debido a que se presentan reacciones químicas que acompañan la multiplicación de microorganismos durante la coagulación y drenaje del suero, debido a la presencia de bacterias acido lácticas (BAL). En relación a bacterias patógenas como Salmonella spp y Listeria monocytogenes no se detectaron en el queso prensado cumpliendo con lo establecido en la regulación mexicana.

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Cuadro 3: Calidad microbiológica del queso artesanal de 22 UP de la región de Ojos Negros, México Indicador Valores de referencia2 (log10 CFU/ g−1) N (%) Media (DE) Cuenta mesófilos aerobios ≤100,000 UFC/ml 4 (18) Deseable 4.65 a (0.472) (≤5) a 3 (14) 101,000-2,430,000 No deseable 6.43 b (0.115) (5.1 – 6.4) 15 (68) >3,120,000 No deseable 7.26 b (0.420) ( ≥6.5) Coliformes <100 UFC ND -a (≤ 2.0) Deseable

Salmonella spp 25 g

990 – ≥184,000 (3 – ≥5) Ausencia

Listeria monocytogenes 25 g

Ausencia

Mohos y levaduras

5.20 b (0.182)

500 UFC/g (2.7) a

22 (100) No deseable 22(100) Deseable 22 (100) Deseable 1 (4) Deseable

>500 UFC/g ( >2.71)

21 (96) No deseable

4.57 b (0.230)

2.70 a

DE= desviación estándar. NOM-243- SSA1-2010 coliformes totales <100 UFC (≤ 2.0 Log10 CFU ml−1) ab Valores promedio de cada variable comparados con el parámetro que muestre literales diferentes son significativos (P<0.05). *

Conclusiones e implicaciones Los resultados muestran que algunos parámetros de calidad fisicoquímica tales como la proteína, grasa y lactosa superan a los parámetros deseables de la normatividad. Otro aspecto relevante fue que en ninguna de las UP se identificó Salmonella spp, ni Listeria spp, lo cual es deseable, ya que estas bacterias representan un riesgo para la salud del consumidor. La calidad sanitaria de la leche y el queso en algunos indicadores se encuentra por encima de los parámetros que exige la normatividad. Por lo anterior, es imperativo que estas UP continúen trabajando sobre la

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instrumentación de un programa de medicina preventiva que atienda los casos de mastitis infecciosa, y sobretodo continuar con la capacitación a los productores para mejorar la calidad microbiológica de la leche y queso a fin de mejorar indicadores fuera de norma. La producción artesanal del queso de Ojos Negros tiene en la región una notable importancia cultural, socio económica y gastronómica; sin embargo, deberá mejorar sus procesos para cumplir con los requisitos establecidos por la legislación actual, y con esto evitar problemas de salud pública y de comercialización de sus productos.

Agradecimientos Este trabajo es parte de los requisitos para obtener el grado de Doctor en Ciencias Agropecuarias del actual primer autor (Universidad Autónoma de Baja California). Se agradece la asistencia técnica en los muestreos a Gabriela Venegas, Cristina Flores, Dalia Gómez, Carolina Trillo, Ramón Valenzuela, Martha Solorio y Fernando Inzunza. Este trabajo fue apoyado en parte por la Secretaría de Fomento Agropecuario del Estado B.C y SAGARPA, a través del proyecto de Extensionismo. Y queseros del municipio de Ojos Negros en Ensenada BC por el apoyo brindado, a la Universidad Autónoma de Baja California a través del Sindicato Único de Trabajadores Universitarios, y al Laboratorio de Calidad de Leche del Instituto de Investigación en Ciencias Veterinarias por brindar instalaciones y equipo. Los autores declaran que no existe ningún conflicto de interés.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.5173 Nota de investigación

Factores asociados al decomiso de hígados positivos a Fasciola sp en una zona endémica del sureste de México

Nadia Florencia Ojeda-Robertos a Roberto González-Garduño b Santiago Cornelio-Cruz a Jorge Alonso Peralta-Torres a Carlos Luna-Palomera a Carlos Machain-Williams c Heliot Zarza d Oswaldo Margarito Torres-Chablé a Enrique Reyes-Novelo c Carlos Baak-Baak c Alfonso Chay-Canul a*

Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. División Académica de Ciencias Agropecuarias. Villahermosa, Tabasco, México. b

Universidad Autónoma Chapingo, URUSSE. Teapa, Tabasco, México.

Universidad Autónoma de Yucatán. Centro Regional de Investigaciones “Dr Hideyo Noguchi” Mérida, Yucatán. c

Universidad Autónoma Metropolitana. Departamento de Ciencias Ambientales, CBS, Unidad Lerma, Estado de México, México.

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Autor de correspondencia: aljuch@hotmail.com

Resumen: El objetivo fue determinar la frecuencia por decomiso de hígados con daños atribuidos a la presencia de Fasciola sp y los factores de riesgo asociados. Se realizó un estudio prospectivo observacional en el que se efectuaron visitas diarias durante un periodo de 12 meses, a un rastro municipal en la zona Sierra del estado de Tabasco. El 25.8 % de los hígados fueron positivos a la presencia del parásito, siendo el decomiso por sexo igual para machos y hembras (X2 = 0.011, gl= 1, P<0.05). La mayor proporción de decomiso, se concentró en la época de lluvias (9.36 %). Se concluye que la prevalencia de la fasciolosis en la zona de Jalapa no ha disminuido en los últimos años y está relacionada con el origen del animal. La fasciolosis es una enfermedad que debe ser monitoreada para detectar los factores que permiten su permanencia en una región geográfica, con el fin de poder establecer y plantear medidas estratégicas de control y de prevención adaptadas a las condiciones particulares de las zonas endémicas. Palabras clave: Decomiso, Fasciola sp., Hígado, Tabasco.

Recibido: 03/12/2018 Aceptado: 02/04/2019

La fasciolosis es una enfermedad parasitaria zoonótica, causada por la presencia de trematodos del género Fasciola sp en los conductos hepáticos de rumiantes(1,2). Es una enfermedad de importancia económica, ya que afecta especies productivas como el ganado bovino, ovino, equino y porcino además de animales silvestres(3). Se estima que los costos económicos asociados a su presencia ascienden a los 3 millones de dólares en todo el mundo(4). En México, las pérdidas ascienden a 130 mil dólares(5), además de que es una enfermedad parasitaria, que está incluida en la lista de investigación prioritaria de las enfermedades tropicales negadas(1). En los últimos años, la prevalencia de la fasciolosis en animales domésticos y en seres humanos, se ha incrementado, debido al cambio climático, al movimiento de animales de unas áreas a otras, así como al tráfico de viajeros y de migrantes(6,7). En Tabasco, una de las principales actividades agropecuarias es la ganadería bovina, basado en sistemas de pastoreo intensivo o extensivo, condición que favorece la presencia y transmisión de la enfermedad en los rumiantes de la región. La enfermedad se produce cuando los animales,

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ingieren los estadios infectantes (metacercarias), que se localizan enquistadas en los pastos, por lo que de ahí la importancia de esta enfermedad en el sistema de producción. La fasciolosis ha sido reportada como un parasitismo común en la población animal con una prevalencia estatal del 19.7 %(8), encontrándose variación dependiendo de la zona y de las características de cada región. Rangel y Martínez(8), identificaron zonas de alta, mediana y baja prevalencia, lo cual clasifica al estado en una zona endémica de la enfermedad junto con Chiapas y Veracruz. Ante la falta de una técnica diagnóstica sensible y específica para la detección de animales positivos, una forma de determinar la prevalencia verdadera, es mediante el monitoreo en rastros, ya que puede proporcionar información epidemiológica relevante a relativamente bajo costo(9), por lo que, el análisis de esta información puede ser utilizada para determinar el comportamiento y significancia de la enfermedad en una región(9). La inspección sanitaria es un procedimiento que se realiza rutinariamente en el proceso de sacrificio de bovinos que son destinados para carne de abasto para consumo humano y es una pieza clave para realizar estudios epidemiológicos que permitan vislumbrar el escenario de la enfermedad. La presencia de hígados positivos a Fasciola es causa de decomiso inmediato, sin embargo, aún falta por conocer más acerca de los factores que están relacionados con la presencia de la enfermedad. El objetivo del presente trabajo fue determinar la prevalencia en rastro, así como los factores asociados al decomiso de hígados en una zona endémica del sur de México. El trabajo se realizó en el Estado de Tabasco, en el rastro municipal de Jalapa, el cual está ubicado en la región del Rio Grijalva, subregión Sierra del estado. La zona se caracteriza por tener un clima cálido húmedo con lluvia todo el año (Af), según la clasificación climática de Koppen modificada por García(10). Se registra una temperatura media de 24.9 0C y precipitación pluvial anual de 3,711 mm(11). El municipio de Jalapa cuenta con cuerpos de agua que están conformados por dos grandes ríos, el Rio de la Sierra y Puente Grande, así como con arroyos y lagunas, este complejo sistema orográfico durante las épocas de lluvias se desborda causando inundación en la zona. Se realizó un estudio prospectivo observacional durante un periodo de 12 meses (enero a diciembre 2014) en el que se realizaron visitas diarias al rastro municipal. Las inspecciones se realizaron siguiendo los procedimientos de sacrificio del rastro, los cuales se apegan a las normas de sacrificio NOM 033-ZOO-1995. Después del sacrifico y una vez que el paquete visceral fue separado de la canal, se procedió a la inspección de los órganos, la cual se realizó según la norma zoosanitaria NOM-194-SSA-2004, que especifica que, la revisión de las vísceras se realiza en búsqueda de presencia de parásitos y estos deben estar ausentes.

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Cuando se detectó la presencia de un hígado con lesiones sugerentes a la presencia del parásito, se separó para ser inspeccionado minuciosamente. Los hígados decomisados se inspeccionaron en búsqueda de lesiones y de parásitos adultos o de formas migratorias, para lo cual se realizaron incisiones en el tejido parenquimatoso y se clasificaron en positivos y negativos a la presencia de Fasciola. Los positivos fueron los que cumplieron cualquiera de las condiciones: la presencia de lesiones macroscópicas como abscesos y engrosamiento de las paredes de los conductos biliares, la presencia de los parásitos adultos o en desarrollo vivos o muertos en los conductos hepáticos o en el parénquima. Un hígado negativo fue aquel en que no se encontraron lesiones, ni parásitos. De cada animal, independientemente si fueron positivos o no, se colectaron los datos que incluyeron fecha de sacrificio (día y mes), sexo (macho o hembra), localidad de procedencia del introductor (localidad) y decomiso del hígado (positivo o negativo). Se calculó la cantidad y frecuencia de hígados decomisados en el periodo de estudio, por mes y por época del año. La frecuencia de hígados decomisados se calculó usando la fórmula para determinar prevalencia descrita por Thrusfield(12) y fue expresado como el porcentaje del número total de bovinos sacrificados respecto del número de animales que ingresaron al rastro para sacrificio. Los datos se agruparon por sexo, mes de decomiso, época del año (lluvia, seca y norte) y por población de procedencia para determinar su asociación con el decomiso de hígados positivos a Fasciola sp. En el caso de los datos de los meses, estos se agruparon en tres epocas, en secas (marzo-junio), lluvias (julio-octubre) y nortes (noviembre-febrero). Los datos agrupados por sexo se analizaron por medio de Ji cuadrada en una tabla de contigencia 2 x 2. Para detectar diferencias por mes, los datos se analizaron por medio de Kruskal-Wallis. Se realizaron análisis de asociación, por medio de una prueba de correspondencia, para la época del año y localidad. Se utilizaron tablas de contingencia 3 x 2 y 27 x 2 respectivamente. Los análisis se realizaron usando el programa estadístico SPSS versión 8. La cantidad de animales que ingresaron al rastro municipal durante el año varió mensualmente, entre 42 a 108 para el mes enero y mayo respectivamente. Aun así y dentro de este contexto, el número de hígados positivos que fueron detectados fue de 278, lo que representó el 25.8 % del total de decomisados (Cuadro 1), lo cual se encuentra dentro del rango de prevalencia reportada para el Estado de Tabasco(8,13,14) porcentaje que sigue sin cambio aparente desde los primeros estudios realizados en rastros tabasqueños(8).

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Cuadro 1: Número de bovinos sacrificados e hígados decomisados durante un año en un rastro municipal de la zona sureste, Jalapa, Estado de Tabasco, México

Bovinos Hembras Machos Total

n 1025 53 1078

Hígados decomisados Positivos Negativos 264 761 14 39 278 800

% de Positivos Valor de P 25.7 26.4 0.005 25.8

Los factores de riesgo, que han sido ligados a la prevalencia de la enfermedad en los bovinos son los relacionados con el medio ambiente, como la temperatura y humedad, medios hídricos como los ríos; la presencia del hospedero intermediario y los factores ligados al hospedero definitivo como son la edad, raza, especie animal y el sistema de explotación y manejo de la alimentación. Así mismo, la ubicación del rancho y las condiciones microclimáticas predominantes en el área de pastoreo de los animales son de gran importancia en la epidemiología de la enfermedad(15). En este estudio, independientemente de la cantidad de animales que llegaron al rastro, la probabilidad de que los machos fueran positivos fue la misma que para las hembras, ya que no existió relación entre el decomiso de hígados positivos a la presencia del parasito y el sexo (X2=0.011, gl=1, P<0.05), lo cual coincide con lo reportado por Ticona(16) quien menciona que el sexo no fue un factor de riesgo para la presencia de la enfermedad en Perú, siendo la edad un factor de riesgo más asociado a la presencia de la enfermedad(17,18). Un factor que puede ser confundido con el sexo y la edad, es el sistema de producción en el que son criados los animales, ya que, por lo general, son las hembras las que son criadas fundamentalmente bajo condiciones de pastoreo(19), además de que permanecen por un periodo mayor de tiempo en los ranchos, situación que difiere de los machos que generalmente son vendidos para ser engordados bajo sistemas intensivos; sin embargo, los machos también son susceptibles de parasitarse cuando son manejados bajo sistema de pastoreo. En el presente trabajo, la variación mensual en el decomiso de positivos varió de 3.6 a 12.3 %, y se encontró que en todos los meses se detectó la presencia de Fasciola sp. encontrándose diferencias entre meses (X2=51.918, gl=11, P=0.000). Sin embargo, el mes con mayor porcentaje de higados positivos fue febrero con 17.3 % y el menor fue noviembre con 3.6 % (Figura 1). La época con mayor porcentaje de hígados positivos fue la de lluvias con un 9.36 % (junio a octubre), seguida por la seca con 8.34 % (marzo-mayo) y la de norte con un 8.07 % (noviembre a febrero). Se determinó que existió relación entre la época de muestreo y el decomiso (X2=6.511, gl 2, P=0.039). Lo anterior, coincide con lo señalado por Feunmayor y Ojeda-Robertos(14,19) quienes encontraron relación entre la época del año y la presencia de animales postivos a 569

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Fasciola, ambos autores utilizaron la técnica de sedimentación para determinar la prevalencia en animales bajo pastoreo. Figura 1: Porcentaje de hígados positivos a Fasciola sp por mes y por época del año

En este estudio, la detección de los hígados positivos y con daños hepáticos posmortem, es la evidencia de que los animales en algún momento de su vida estuvieron en contacto con el estadio infectante de la Fasciola sp. y que adquirieron la enfermedad cuando las condiciones medioambientales externas fueron propicias para el desarrollo de estas fases exógenas en los ranchos donde se criaron. Lo cual, se confirma al encontrar los parásitos con diferentes estadíos de desarrollo en los conductos hepáticos; sin embargo, no se realizó un conteo de los estadios de desarrollo parasitario encontrados en los hígados positivos. La influencia de la época es determinante para el mantenimiento de las fases exógenas del trematodo, ya que se relaciona directamente con el desarrollo y sobrevivencia del hospedero intermediario y las fases infectantes del parásito(20). La Fasciola hepatica posee un ciclo complejo que incluye la presencia de dos hospederos obligatorios, el definitivo (rumiantes y humano) y el intermediario (moluscos del género Fossaria y Pseudosuccinea de la familia Lymnaeidae). En ambos hospederos, la eliminación de los estadios parasitarios permiten que se cumpla con el ciclo del vida del parásito, ya que los huevos, se eliminan con las heces del hospedero definitivo al medio ambiente, mientras que las cercarias son expulsadas por el caracol, las cuales se enquistan sobre la vegetación acuática o lado de los cuerpos de agua o el pasto, transformándose en metacercarias (fase infectante)(21,22). 570

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La metacercaria, al ser ingerida junto con los pastos o agua contaminada, por el hospedador definitivo, se desarrolla hasta el estadio juvenil, la cual tiene la capacidad de migrar atravezando la pared intestinal, alojándose posteriormente en la cavidad abdominal, peritoneo, cápsula de Glisson, y el parénquima hepático; luego se establece en los conductos biliares, alcanza su etapa adulta y la madurez sexual para dar inicio a la ovoposición de huevos fértiles, los cuales son eliminados junto con las heces al medio externo(15). Al examen postmortem, se detecta el hígado con hipertrofia, hemorrágico, con diferentes grados de fibrosis, calcificación e hiperplasia de los conductos biliares, así como la presencia de las formas parasitarias en el tejido hepático, lo cual es un motivo de decomiso independientemente del grado de afectación del hígado(23). En un estudio realizado en el noreste de Nigeria en el continente Africano, se determinó el grado de daño de hígados decomisados por la presencia de Fasciola y obtuvieron que la mayor frecuencia fue de hígados con daños severos, (55.3 %) seguido por daños moderados, esos daños incluyeron desde fibrosis hasta daño total del hígado y atrofia(24). En este trabajo se realizó la descripción del grado del daño de los hígados positivos, lo cual pudiera ser un tema a investigar para futuros estudios. En el presente trabajo, la época del año en la que se detectó mayor cantidad de hígados decomisados se relacionó posiblemente con la mayor cantidad de animales que provinieron de una localidad donde las prevalencias y las probabilidades de enviar a un animal positivo al rastro son más altas, debido a que las condiciones del lugar favorecen la presencia de los estadios infectantes dadas las condiciones propias del lugar (suelos inundables, cercanía con el río y mantos de agua). La procedencia del total de decomisos (n= 1,078), independientemente de la causa, se distribuyeron en 27 poblados pertenecientes al municipio de Jalapa. Del total de localidades registradas, siete contribuyeron con más de la mitad del total de positivos (89.2 %, 248/278), diez localidades aportaron el 10.8 % restante (30/278) y en las diez restantes no se detectaton decomisos. El aporte de las siete localidades varió de 16 a 45 hígados positivos, en las segundas de 1 a 7 hígados positivos y en las 10 restantes cero. De cada poblado, la cantidad de animales que se recepcionaron para sacrificio fue variable y dependió de las necesidades de los productores para enviar animales a sacrificio. La prevalencia ajustada a la población fue del 16.19 % (Huapacal) para la más alta y de 5.40 % para la más baja (Figura 2); se determinó que existió relación entre las localidades de procedencia y la presencia de hígados positivos (X2=59.621, gl 26 P=0.000). El origen de los animales es un factor importante que está relacionado con el decomiso, ya que las condiciones regionales

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ambientales de la localidad, así como el manejo en el sistema producción, se reflejan en el número de animales positivos, y es muy problable que los animales de estas regiones hayan tenido un mayor contacto con los estadios infectantes del parásito por las condiciones particulares de la región de crianza(24). Figura 2: Frecuencia de decomiso de hígados positivos por población en el rastro municipal de Jalapa, Tabasco, México

Se concluye que la prevalencia de la fasciolosis en la zona de Jalapa, Tabasco, no ha disminuido en los últimos años, a pesar de las medidas de control tradicionales, entre las que se encuentran el uso de fasciolicidas para el control de los estadios inmaduros y adultos, así como la restricción para pastorear zonas cercanas a los ríos, para evitar la ingestión de las metacercarias. La prevalencia de la enfermedad está relacionada con la localización u origen del animal, aunque existen otros factores que influencian la presencia de la enfermedad que deben ser estudiados, entre los que se encuentran, el tipo y sistema de producción pecuaria, el manejo de los productos fasciolicidas y las condiciones microclimáticas de cada lugar donde se crían a los animales. La fasciolosis como enfermedad que afecta animales y humanos debería ser monitoreada para aumentar el conocimiento de su epidemiología para proponer medidas de control y prevención dependiendo de las condiciones microclimáticas. Ante los cambios climáticos, se recomienda un monitoreo estatal y nacional que pudiera aportar información para entender mejor la ecología de la enfermedad y la presentación de la Fasciolosis en animales rumiantes.

Agradecimientos Al fondo PFI 2013-UJAT por el financiamiento del proyecto clave UJAT-2013-IA-10. En memoria del Pasante de MVZ Santiago Cornelio Cruz, quien fue pieza clave y determinante en la

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gran labor de la colecta diaria de los datos en el rastro. Al MVZ Juan Felipe Jiménez por su gran apoyo, disposición y paciencia para ayudarnos en el rastro. Al Laboratorio de Parasitología Animal del Centro de Investigación Ciencias Agropecuarias–UJAT por las facilidades otorgadas durante las inspecciones de los hígados.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.4813 Nota de investigación

Análisis genético del desarrollo en peso vivo y tasa de gestación en primer parto en bovinos Brahman de Venezuela

Alejandro-Palacios-Espinosa a Omar-Verde b Narciso-Ysac-Ávila-Serrano c* Alberto-Menéndez-Buxadera d

Universidad Autónoma de Baja California Sur, Departamento de Ciencia Animal y Conservación del Hábitat, La Paz, B.C.S., México. b

Unidad Territorial Yaracuy. Ministerio del Poder Popular para Ciencia, Tecnología e Innovación. Venezuela. Universidad del Mar, Cuerpo Académico “Ciencias Agropecuarias”, Puerto Escondido, Oaxaca. México. c

Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, España.

*Autor de correspondencia: reval1997@hotmail.com

Resumen: El peso vivo (PV) de 2,777 animales (1,377 hembras y 1,400 machos con 53,258 datos individuales entre 30 y 600 días de edad), nacidos entre febrero de 2000 y junio del 2011, se analizaron con un modelo de regresión aleatoria (RA) para estimar los componentes genéticos de (co)varianza a lo largo de la escala edad-sexo. La tasa de gestación (TG) junto con el peso vivo ajustado a 548 días de edad (PA548) se estudiaron mediante un modelo multicaracter (MT) obteniéndose un incremento en los estimados de heredabilidad (h2) para TG respecto al clásico modelo univariado (0.08 ± 0.03 vs 0.11 ± 0.02), aumentando la precisión del valor genético (VG) para TG en 15.7 %. La correlación genética (rg) entre TG y PA548 fue 0.31 ± 0.11. El RA mostró que el PV a través de la edad no puede considerarse 576

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como expresión del mismo rasgo en ambos sexos, ya que las rg fueron inferiores a 0.60. El análisis de componentes principales mostró que existen cambios importantes en la forma de crecimiento de los animales en la escala de edad representada en estos datos. Se manifestó un importante dimorfismo de origen genético, estimado como diferencia de los VG de machos y hembras en PV, el cual presenta una relación positiva con los VG de la TG. Palabras clave: Heredabilidad, Correlaciones genéticas, Modelos multivariados, Regresión aleatoria, Dimorfismo sexual.

Recibido: 16/03/2018 Aceptado: 21/03/2019

En la estación experimental ‘La Cumaca’ de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Central de Venezuela, se lleva a cabo un programa general de mejoramiento genético para características productivas de la raza Brahman, representando una importante fuente de genes para esta población(1). En la metodología aplicada para la realización de evaluaciones genéticas existen diferentes elementos críticos. En primer lugar, el PA548, con base en los cuales se estiman los valores genéticos (VG) de los animales puede estar sesgado, ya que se asume que el crecimiento es lineal. Resultados publicados(2,3,4,5) en animales B. indicus, demuestran que existen variaciones en la forma de crecimiento a través de la trayectoria de las pruebas de comportamiento. En segundo lugar, generalmente el sexo del animal se considera como efecto fijo en el modelo, lo cual asume implícitamente que los componentes de (co)varianza son los mismos en ambos sexos. Este enfoque puede incorporar otra fuente de sesgo sobre las estimaciones de los VG, disminuyendo su precisión y por consiguiente, afectándose la marcha del programa de mejora(6,7,8). Los elementos expuestos, pueden afectar las correlaciones genéticas del mismo rasgo entre ambos sexos (rHM), pudiéndose manifestar efectos de interacción genotipo-sexo. El PV se ha expresado generalmente a un punto fijo, aunque parece muy lógico examinar estas relaciones a lo largo de la edad. Si la información está disponible, los componentes de (co)varianza pueden estimarse mediante modelos multivariados (MT) o, preferiblemente, por medio de regresión aleatoria (RA). Se han publicado resultados comparando modelos MT y RA para PV en ganado Bos indicus(2,4), que demuestran las ventajas de RA. Sin embargo, en este enfoque longitudinal no se han examinado las relaciones entre los sexos de los animales. Por lo anterior, se requieren más evidencias, particularmente si se toma en cuenta posibles relaciones entre PV y comportamiento reproductivo (CR) de las hembras.

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Existe consenso sobre la importancia del CR para la economía del rebaño de carne. Sin embargo, la aparente baja h2 de la mayor parte de los rasgos reproductivos(9,10,11) ha sido un factor limitante para su utilización como criterio de selección directa. Como alternativa, se han publicado resultados sobre la circunferencia escrotal (CE) o el PV medido en los machos jóvenes, y su respuesta correlacionada con el CR de las hembras medido por servicios por gestación; días al parto y TG al primer servicio. Aun cuando los resultados son alentadores(12,13), estos se han expresado a una edad fija, manteniéndose la interrogante de la evolución de estas tendencias a lo largo de la edad hasta el primer parto. Los objetivos de este estudio fueron: estimar las heredabilidades y las correlaciones genéticas entre el PA548 y la TG de las novillas en primera temporada de reproducción, mediante un MT; estimar los componentes de (co)varianza genética del PV de ambos sexos a lo largo de la edad mediante RA; comparar los valores genéticos para cada ith edad (VGi), estimados según RA, con los VG según MT. La Estación Experimental La Cumaca, ubicada a 472 msnm cerca de la ciudad de San Felipe, estado Yaracuy, Venezuela, tiene una extensión de 433 ha, de las cuales 300 ha son cultivadas con pastos guinea, estrella, swazzi, pará y alambre. La precipitación anual promedio es de 1,650 mm con una temperatura promedio de 24 a 31.9 ºC y una humedad relativa promedio de 84 %(14). Cuenta con un rebaño de ganado Brahman puro, registrado, de alrededor de 180 vacas en producción. El peso vivo ajustado a 548 días de edad (PA548) de 3,120 animales nacidos entre febrero del 2000 y junio del 2011 se editó eliminando aquellos registros con incoherencias en el pedigrí, ausencia o problemas en la fecha de nacimiento. Finalmente, quedaron disponibles los registros de 2,777 animales (1,377 hembras y 1,400 machos). Estos animales eran hijos de 984 madres (729 en el vector de datos) y 107 sementales (48 en el vector de datos). El archivo de pedigrí incluyó 3,977 animales. Un total de 94,752 registros de PV individual, provenientes de 1,776 hembras y 1,864 machos, nacidos entre febrero del 1978 y junio del 2011 fueron utilizados. Estos animales eran hijos de 1,291 madres (929 en el vector de datos) y 128 sementales (58 en el vector de datos), y el archivo de pedigrí contó con 4,070 animales. Estos datos fueron editados, eliminado aquellos registros con incoherencias en el pedigrí, ausencia o problemas en la fecha de nacimiento y datos registrados a menos de 30 o más de 570 días de edad. Se eliminaron datos fuera del rango de ±3.2 desviaciones estándar dentro de clases de edades de 30 días de rango. Finalmente, quedaron disponibles un total de 53,258 datos individuales de 1,737 hembras y 1,803 machos. Se corrieron varios modelos utilizando el procedimiento GLM de SAS(15). El Cuadro 1 presenta algunos indicadores de los datos estudiados.

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Cuadro 1: Indicadores de peso vivo de animales Brahman en la estación experimental La Cumaca, Venezuela

Característica

Tamaño de muestra en hembras

Hembras

Tamaño de muestra en machos

Machos

Peso al nacer Peso al destete Peso a 365 días Peso a 450 días Peso a 548 días

1,776 1,639 1,396 1,378 1,340

29.5 ± 4.5 165.8 ± 26.2 209.9 ± 29.8 235.6 ± 32.0 290.0 ± 34.1

1864 1630 1410 1392 1385

31.9 ± 4.9 177.3 ± 28.3 231.8 ± 34.9 271.2 ± 38.9 326.3 ± 42.2

Número de registros de peso vivo

25,781

25781

27477

Tasa de Gestación

1,377

0.67 ± 0.37

Tres bloques de análisis fueron realizados utilizando el programa Asreml3(16): Bloque 0. Modelo multivariado (MU) para PA548 y TG.

y 1  X 1 y    0  2 

0  b 1   Z 1  X 2  b 2   0

0  a 1  e 1   Z 2  a 2  e 2 

Donde: yi

es un vector correspondiente a PA548 y TG analizados al mismo tiempo;

bi es un vector de efectos fijos de la jkth combinación del sexo-año-mes (con 275 niveles para PA548 y 124 para TG). ai es un vector aleatorio correlacionado debido al efecto genético aditivo del ith animal con datos y sus antecesores sin registros (4,070 niveles) para PA548 y TG; eil

es un vector residual aleatorio correlacionado entre los rasgos 1 y 2;

XyZ son matrices de incidencia que conectan los efectos fijos y aleatorios con el vector de observaciones. En este modelo se asume que: a i 

G

0

Var     i   0 Ri  e i 

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 σ2 En la cual Gi =  a1 σ a 21 para ambos rasgos y contiene

2 σe 1

2 σe

σa



12 A 2 σ a2  

σa

donde

2 σa 1

2 σa

representan las varianzas genéticas

 σ e2 su covarianza. Las (co)varianzas residual Ri =  1 σ e 21

que representan las varianzas para ambos rasgos y

σe

σ e 12  , σ e22  12

es su

covarianza. A es la matriz de parentesco entre todos los animales y  es el símbolo de producto. Con estos parámetros se estimó la h2 para cada rasgo ( h a2 ) y las correlaciones i

genéticas (rgi), entre ambos caracteres, mediante funciones lineales de los correspondientes componentes y utilizando fórmulas clásicas(17). Los VG para cada rasgo se estimaron como solución del modelo descrito, y la exactitud (Accij) de tales estimaciones según:

Accij =

1

Pev * 100  i2

Donde: Pev es la varianza del error de predicción (valor propio para cada animal para el carácter estudiado), y  i : es la varianza genética del carácter en la población estudiada. Este 2

mismo modelo fue aplicado en forma univariada, para presentar parámetros similares a los aplicados con el programa original de la Estación Experimental.

Para el análisis de PV a lo largo de la trayectoria de la edad se aplicó RA, utilizando varios modelos y sin considerar los efectos maternos, los cuales variaron en el orden de ajuste del polinomio para los efectos aleatorios, así como las estimaciones de componentes de (co)varianza total o intra sexo del animal. En total se realizaron dos bloques de modelos: Bloque 1- Se asume que los componentes de (co)varianza son los mismos en ambos sexos.

3 1 1 y ijkl  fixed i  sex j   Φr b1r   Φr a kr   Φr p i r  Z1q m  R  Model 1 r0 r0 r0 3 2 1 y ijkl  fixed i  sex j   Φr b1r   Φr a kr   Φr p i r  Z1q m  R  Model 2 r0 r0 r0 3 3 1 y ijkl  fixed i  sex j   Φr b lr   Φr a kr   Φr p i r  Z1q m  R  Model 3 r0 r0 r0

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Bloque 2- Se asume que los componentes de (co)varianza no son los mismos en ambos sexos.

 3   1   1  y ijkl  fixedi  sex    Φ b      Φ a     Φ p   Z q  R  model 4 r 1r r kr r ir j 1 m :j r  0 : j r  0 : j r  0 : j  3   2   1  y ijkl  fixedi  sex j    Φr b1r     Φr akr     Φr pir   Z1q m  R: j  model 5 r  0 : j r  0 : j r  0 : j  3   3   1  y ijkl  fixedi  sex j    Φr b1r     Φr akr     Φr pir   Z1q m  R: j  model 6 r  0 : j r  0 : j r  0 : j En ambos bloques Yijkl representa las diferentes estimaciones de PV en el l ak ésimo animal, del j ésimo sexo. Los efectos fijos (fixedi) fueron año-mes de control con 674 niveles: sexoedad al parto de la vaca con 18 niveles representados en todos los modelos, de manera que los resultados pueden compararse aplicando los criterios informativos LogL; BIC y AIC. Los seis modelos solo se diferencian en el orden de ajuste del polinomio de Legendre ( Φi ) para los efectos aleatorios y la varianza residual (R) que se considera homogénea para el bloque 1 e intra jth sexo en el bloque 2. La estrategia aplicada en el bloque 2 fue la de hacer estimaciones de componentes de (co)varianza entre e intra sexo del animal. La matriz de incidencia Z1 contiene como elementos 1 ó 0 para conectar cada observación con los efectos aleatorios de ambiente permanente maternal (qm) con 91 niveles. Para ambos bloques, la curva de crecimiento de la población fue modelada por un coeficiente de regresión (b1) de la edad sobre el peso vivo, mediante los coeficientes de Φi de orden 3, mientras que fue de orden r =1, 2, 3 para los efectos aleatorios genéticos y de orden 1 para el efecto permanente individual (pi), debido a repeticiones del mismo rasgo en los animales a lo largo de la escala de edades. Los componentes de varianza esperados en ambos bloques fueron los siguientes: y ~ N [0, (σ 2y  Φi * [G 0  (A  K G )] * Φ'  I pσ i2  I qσ m2 I n σ e2 ] bloque 1 2 y ~ N [0, (σ 2y  Φ i * [G 0  (A  K G: j )] * Φ'  Φ i * [P0  (Ip  K P: j )] * Φ'  I q σ m  I n σ e2: j ] bloque 2

donde A es el numerador de la matriz de parentesco entre los animales con datos y sus antecesores sin registros (n= 4,070 animales totales). Ip es la matriz de identidad para los efectos aleatorios de ambiente permanente individual (dimensión p=3540 para el bloque 1 con varianza σ i2 , ph= 1,737 y pm=1,803 niveles para las hembras y machos respectivamente en el bloque 2 con varianzas contenidas en la matriz de regresión aleatoria de efectos permanente individual intra jth sexo del animal ( K P:j ). Iq es la matriz de incidencia para 2 ambiente permanente materno (dimensión q=1,291 madres y varianza σ m ). R es el error

residual con In como matriz de incidencia (n=53,258 registros en el bloque 1 y varianza σ e2 y

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nh= 25,781 y nm=27,477 para hembras y machos en el bloque 2 con varianza σ e2:j , respectivamente). G0 contienen una matriz de regresión aleatoria (KG) de dimensión (r+1)*(r+1), en los modelos más complejos del bloque 2 los elementos serán:

  σ2  σ hmo σ hmos  σ hos   K   K h   ho hm  2  σ hso σ hs   σ hmso σhdms    KG    2  σ mo σ σ mhso  σ mos   K mh   mho   K  m  σ  2    mhos σ mhs   σ mso σ ms    La versión empleada del asreml produce automáticamente el análisis de componentes principales de esta matriz, la cual facilita la interpretación de las trayectorias de las (co)varianzas estimadas. En este caso, KG es una matriz simétrica conformada por cuatro sub matrices con los mismos componentes que contiene las (co)varianzas para efectos genéticos en las hembras (Kh); machos (Km) y sus covarianzas (Khm) con sus respectivas varianzas del 2 2 2 2 intercepto ( σ ho y σ mo ); pendiente ( σ hs y σ ms ) y sus covarianzas ( σ hso ; σ mso ; σ mhs y

σ hmos ). En estos casos los subíndices o y s indican intercepto y pendiente, respectivamente. Esta matriz descrita es aplicable a un orden de ajuste r=1. Es por ello por lo que cada sub matriz es de dimensión 2x2; para r =2 será de 3x3 y para orden r=3 será de 4x4 y los componentes adicionales serán los términos cuadrático y cúbico, respectivamente. Para el bloque 1 la matriz KG no presenta los estimados de cada sexo. Para ambos bloques, manipulando los elementos de estas matrices, así como los coeficientes del polinomio de Legendre ( Φi ) de orden r se pueden estimar los componentes de (co)varianza a lo largo de la ' 2  Φ K Φ' σ 2  Φ K Φ' trayectoria de edad y cada sexo(18): σhi i h i ; mi i m i y σ hmij  Φi K hmΦ j .

En general, los parámetros genéticos de h2 y rg se estiman aplicando fórmulas clásicas(17). Los estimados de VG del PV para cada sexo se estiman mediante la solución del mejor modelo donde, para el kth animal se tendrá: VG i  ak Φ'i k

y donde  i son los correspondientes coeficientes del polinomio de Legendre para cada ith punto de la escala de edad. En este modelo, cada animal (total; hembra o macho) estará expresado por una función genética (ak) vinculada a los efectos del intercepto, pendiente y otros términos de acuerdo al orden de ajuste del polinomio seleccionado. Los parámetros genéticos resultantes del bloque 0 se presentan en el Cuadro 2, donde se incorporaron las correlaciones entre los VG estimados por MU y MT.

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Cuadro 2: Componentes de (co)varianza y heredabilidad del peso vivo ajustado a 548 días y la tasa de gestación al primer parto (Modelos del bloque 0) Parámetro genético

Tasa de gestación (d)

Peso vivo (kg)

Varianza genética-MU

369.9

0.017588

Varianza genética-MT

375.3

0.02335

Heredabilidad- MU

0.337±0.11

0.084±0.03

Heredabilidad- MT

0.349±0.10

0.109±0.02

Corr genética- Peso y tasa de gestación

0.309±0.11

Precisión, % del valor genético (VG) MU

63.5±12.1

34.2±8.9

Precisión, % del valor genético MT

64.1±12.1

39.6±9.8

0.996

0.8971

Corr entre valores genéticos MU x MT Corr VG tasa de gestación MU x VG peso MU Corr VG gestación MU x VG peso MT

0.286 0.570

Para PA548 no hubo diferencias entre MU y MT. Para TG, el MT incrementó la h2, mejorando las precisiones de los VG. La rg entre ambos caracteres fue positiva (rg =0.309), indicando ausencia de antagonismo en la mejora de los dos rasgos. Las correlaciones entre los VG según ambos modelos fueron superiores a 0.897, de lo que se infiere que no existirán cambios en el orden de mérito por ambos procedimientos. El modelo MT tiene ventajas adicionales, manifestadas en una mayor correlación con el VG para TG, así como mayor precisión en los estimados de VG para este último rasgo, cuyo valor de h2 fue bajo. La bondad de ajuste de los seis modelos de los bloques 1 y 2 se determinó mediante los criterios LogL, AIC y BIC, los tres coincidieron en que el polinomio de tercer orden para el efecto genético es el de mejor ajuste a los datos. En particular, los modelos del bloque 2 presentan mejores resultados, que demuestran que existe una significativa variación entre sexos para los componentes genéticos de (co)varianza. La h2 del PV a lo largo de la edad para ambos sexos, así como la correlación genética entre ellos se presentan en la Figura 1. Las tendencias de h2 presentan ligeros aumentos conforme avanza la edad, siendo superiores para las hembras. Las rg reflejan un patrón inverso con valores entre 0.25 a 0.35. Por otro lado, la distribución de frecuencia de los VG para PA548, estimados según el modelo del bloque 0 y según RA se muestran en la Figura 2, en donde puede observarse una superposición en los tres estimados de VG. El análisis de componentes principales de la matriz KG del modelo 6 seleccionado, indica que el primer (vp1) y segundo vector propio (vp2) explicaron el 57 y 31% de la variación genética, respectivamente. Los VG de los mejores 200 animales del MU (método oficial actualmente en uso) y de la RA a lo largo de la edad y para cada sexo, se muestran en la Figura 3. En ella se visualiza que la 583

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tendencia en todos los machos es positiva, mientras que en las hembras se pueden encontrar animales con VG negativos.

Figura 1: Estimados de heredabilidad y correlación genética para el peso vivo de hembras y machos a lo largo de la escala de edad en animales Brahman (modelo 6)

Figura 2: Distribución de frecuencia de los valores genéticos para peso a 548 días de edad según modelo actualmente en uso y mediante regresión aleatoria (modelo 6)

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Figura 3: Evolución de los Valores genéticos de animales Brahman de cada sexo a lo largo de la trayectoria de edad, seleccionados según modelo actual de evaluación

La evolución del mérito respecto al año de nacimiento de los animales se muestra en la Figura 4. El progreso genético anual fue de 0.933 ± 0.021 kg/año para PA548 el carácter principal en el programa de mejora aplicado, mientras que para TG fue de 0.354 ± 0.010 %/año.

Figura 4: Evolución del Mérito genético para peso vivo y tasa de gestación en animales Brahman de la estación experimental La Cumaca

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Los valores de h2 para PA548 coinciden con varias referencias en este tipo de animales publicados en Venezuela(19,20), así como con los publicados en ganado B. indicus en diferentes países de América Latina(21). El progreso genético para PA548, fue inferior a lo publicado por otros autores(20,22). Los estimados de h2 con MU para TG fueron bajos, lo cual es coherente con la mayor parte de las publicaciones sobre caracteres reproductivos(10,23). Sin embargo, los niveles de h2 para TG con MT aumentaron (h2=0.109 vs 0.087), incrementándose la precisión promedio de los VG en 15.7 %. Los niveles de rg entre ambos rasgos sugieren ausencia de antagonismo, de manera que un proceso de selección por PV y TG pueden llevarse a la práctica, enfoque ya sugerido en otras publicaciones(11,12,24). La mayor variabilidad genética (Figura 2) y diferentes niveles de h2 y rg para PA548 a lo largo de la trayectoria de la edad-sexo (Figura 1) indican que la manifestación de este rasgo no debe considerase como expresión del mismo carácter en ambos sexos. Lo anterior coincide con otros resultados publicados(7,8). El dimorfismo sexual (DS) muy evidente en estos datos se ha estudiado en detalle en el contexto evolutivo de las poblaciones, existiendo debate sobre la importancia de la heterogeneidad de varianzas entre sexos y sus efectos sobre la especialización y adaptabilidad de las poblaciones(25), mientras que existen planteamientos previos sobre cambios en DS como respuesta correlacionada a la selección por fertilidad. Relacionado con este último punto de vista, los resultados de este trabajo permiten presentar un enfoque novedoso ya que disponemos de los VG en cada sexo para PA548M y PA548H (resultados de la solución del modelo seis, bloque dos), de manera que se puede estimar un DS de origen genético como DSg= VGPA548M - VGPA548H y estos estimados de Dsg se pueden relacionar con los VG de los mismos animales para TG (solución del modelo MT del bloque 0). Los resultados del análisis indicaron que una ecuación cuadrática (TG= 0.574 + 0.1045*DSg + 0.000765*DSg2 - 0.0000244*DSg3 y R2= 96.1 %) fue la de mejor ajuste a los datos, manifestándose un incremento del orden de +1.2% en TG por cada 10 kg de DSg, con un punto máximo cuando 40>DSg<60 con TG= +4.4 %. Por el contrario, cuando -10>DSg<0, la TG fue de -1.4 %. Estos resultados son alentadores, pero se requieren mayores investigaciones sobre esta temática que pueden tener una importante aplicación práctica en los sistemas de producción del ganado de carne. En este trabajo se detecta una amplia variabilidad genética tanto en PV como en TG de animales del tipo Brahman. Se sugiere utilizar modelos MT, que posibilita incrementos sustanciales en los valores de h2 y en la precisión de los VG estimados, particularmente en TG. El análisis de RA ha indicado que tanto los niveles de h2 como de las rg entre el PV de hembras y machos varían a lo largo de la trayectoria de la edad, de manera que no se deben considerar como expresiones del mismo rasgo. Finalmente, y como tendencias adicionales, se ha podido identificar una importante variabilidad genética en dimorfismo sexual, la cual está relacionada con la TG, aunque esta sugerencia requiere de otras investigaciones con mayor número de animales. 586

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v11i2.4899 Nota de investigación

Análisis de pedigrí de las ovejas Santa Inês y los efectos de la endogamia en los rasgos de rendimiento

Ana Carla Borges Barbosa a Gabrieli de Souza Romano a Jonatan Mikhail Del Solar Velarde a José Bento Sterman Ferraz b Víctor Breno Pedrosa c Luís Fernando Batista Pinto a*

Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Av. Adhemar de Barros, 500, Ondina, Salvador – BA, 40170-110 . Brazil. b

Universidade de São Paulo. Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos. Brazil. c

Universidade Estadual de Ponta Grossa. Departamento de Zootecnia. Av. Brazil.

*Autor de correspondencia: luisfbp@gmail.com

Resumen: Los parámetros de la población, como el tamaño efectivo de la población y los coeficientes de endogamia, son información importante de una población, pero rara vez se han estudiado en ovejas Santa Inês. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo estimar los parámetros de población en un rebaño de ovejas Santa Inês y el efecto de la endogamia en los rasgos de rendimiento. Se registró un conjunto de datos con 11,564 animales nacidos entre 2003 y 2011, para los pesos corporales al nacer (PC1) y a los 60 (PC60), 180 (PC180) y 270 (PC270) días de edad, y para la ganancia de peso diario desde el nacimiento hasta los 60 d (GDP1), de 60 a 180 d (GDP2) y de 60 a 270 d (GDP3). Los porcentajes de animales con pedigrí conocidos disminuyeron de generación en generación, de 70 % en la primera generación a menos de 5 % en la tercera. El tamaño efectivo de la población disminuyó de 665 en 2004 a 45 en 2010. El número efectivo de fundadores y ancestros fue de 285 y 273, respectivamente. Además, el coeficiente de

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relación promedio fue de 0.47 %. La frecuencia más alta de animales endogámicos se concentró entre 0 y 10 % del coeficiente de endogamia y solo 263 animales mostraron F> 10 %. El coeficiente de endogamia tuvo su valor más bajo en 2004 (0.19 %) y un valor más alto en 2008 (2.86 %). Se encontró un efecto de endogamia significativo para el PC1 (0.0054 ± 0.0015), la GDP2 (-0.9837 ± 0.3025) y la GDP3 (-0.5628 ± 0.2377), mientras que el análisis de los valores de reproducción indicó una depresión endogámica significativa para todos los rasgos, excepto la GDP1. Los resultados sugirieron que la endogamia tuvo un efecto negativo en los rasgos de crecimiento. Para evitar pérdidas de este tipo, es necesario aparear machos y hembras no emparentados. Palabras clave: Ancestros, Tamaño población, Parentesco, Variabilidad.

Recibido: 16/05/2018 Aceptado: 23/03/2019

Todos los programas de reproducción dependen de la variabilidad genética en la población, pero con frecuencia ésta se ignora. Uno de los métodos utilizados para evaluar el impacto de la selección en la variabilidad genética es estudiar la estructura genética de la población, lo que se puede hacer a través del análisis de pedigrí(1). El tamaño efectivo de la población (Ne) es un parámetro ampliamente utilizado para indicar el riesgo de depresión endogámica o incluso el riesgo de extinción. En los últimos 50 años, el tamaño efectivo de la población de varias razas de ovejas ha disminuido drásticamente, lo que lleva en algunos casos a la depresión endogámica(2,3,4). Además, varias razas de ovejas se extinguieron en el siglo XX debido a la reducción de Ne. De las 1,495 razas de ovejas registradas hasta diciembre de 1999, solo 656 no estaban en riesgo de extinción hasta ese momento(5). Otro parámetro importante de la población genética es el número de ancestros a los que se debe la variabilidad genética de una raza, porque muchas razas comerciales generalmente tienen un número reducido de sementales en el apareamiento. Hay estudios previos que describen grandes diferencias entre el número total de ancestros y el número de ancestros a los que se debe el 50% de la variabilidad genética en diferentes razas de ovejas(6-9). Además, la relación entre el número efectivo de fundadores (fe) y el número efectivo de ancestros (fa) indica si una población que está bajo el efecto de cuello de botella. Se han observado ejemplos de un intenso efecto de este tipo en algunas razas de borregos.(1,9). El coeficiente de endogamia expresa la probabilidad de que dos alelos en un locus sean idénticos por descendencia(10). La endogamia causa una reducción en el mérito genético individual de algunos rasgos productivos, posiblemente debido al aumento de genotipos homocigotos para alelos recesivos perjudiciales o una reducción de genotipos heterocigotos(10). Sin embargo, el efecto depresivo es relativamente menor a los bajos 591

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niveles de endogamia. Por lo tanto, se recomienda el monitoreo de la endogamia para el mantenimiento o la reducción del nivel de endogamia de una población(11). Se ha observado un aumento en el coeficiente de endogamia promedio a lo largo de las generaciones en algunas razas de ovejas(6,8), y la forma más eficiente de controlar la endogamia a largo plazo es utilizar rebaños reproductores con bajo parentesco promedio (AR). Por lo tanto, AR es otro parámetro importante en la genética de poblaciones. Rara vez se han registrado estimaciones de los parámetros de la población de ovejas Santa Inés(12,13) y el único estudio consignó estimaciones del efecto de la endogamia en los rasgos fenotípicos(12). Estos autores estimaron los efectos de la endogamia solo para los rasgos de peso corporal, pero no estimaron dichos efectos en los valores de reproducción. Por lo tanto, el efecto de la endogamia en muchos rasgos y sus valores de cría sigue siendo desconocido para las ovejas de esta raza. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la estructura genética de la población de los rebaños Santa Inés a través de información genealógica, y estimar el efecto de la endogamia en los rasgos de crecimiento, así como para los valores de reproducción. Conjunto de datos Un conjunto de datos inicial fue previamente depurado con base en un archivo que contenía 11,781 animales con información productiva y 12,322 animales en el pedigrí, pertenecientes a 16 rebaños diferentes. Después del análisis de consistencia, se descartaron los ejemplares carentes de información productiva o sin conexión genética entre, al menos, dos rebaños diferentes. Se eliminaron los registros con errores o información incompleta o grupos contemporáneos (GC) con menos de cinco animales con mediciones válidas, además de los GC en los que los animales eran descendientes de un solo padre y la información estaba fuera del rango aceptable, es decir, también se eliminaron tres desviaciones estándar por encima o por debajo de la media del rasgo. Adicionalmente, se revisaron los datos para garantizar que: no hubiera registros duplicados; ninguna progenie nació antes que ninguno de sus dos padres; la progenie solo apareció como progenie, pero no como padre y/o madre en el mismo registro; los sementales solo aparecieron como tales, pero no como reproductoras; las reproductoras solo aparecieron como tales, pero no como sementales. El conjunto de datos final incluyó 11,564 animales en el pedigrí, nacidos entre 2003 y 2011, que es mantenido por la Asociación Estatal de Criadores de Cabras y Ovejas de Sergipe (Associação Sergipana de Criadores de Caprinos e Ovinos - ASCCO). Los rasgos registrados fueron: peso al nacer (PC1) y a los 60 (PC60), 180 (PC180) y 270 (PC270) días de edad. Las ganancias diarias de peso se calcularon desde el nacimiento hasta los 60 días (GDP1), de los 60 a los 180 (GDP2) y de los 60 a los 270 (GDP3) días de edad. Parámetros poblacionales El software ENDOG(14) se usó para estimar el coeficiente de endogamia(F)(15), el tamaño efectivo de la población (Ne)(14) y el coeficiente de consanguineidad promedio (AR). POPREP(16) se utilizó para estimar el número efectivo de fundadores (fe), ancestros (ƒa), 592

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nĂşmero efectivo de genomas de fundadores (fge) y nĂşmero de generaciones rastreadas (g). AdemĂĄs, se estimĂł el promedio de pĂŠrdida de diversidad genĂŠtica debido a cuellos de botella y deriva genĂŠtica. Una descripciĂłn completa de estos parĂĄmetros se puede encontrar en GutiĂŠrrez y Goyache(14). PredicciĂłn del valor genĂŠtico y anĂĄlisis del efecto de la endogamia Todos los rasgos fueron probados para la normalidad de los datos aplicando la prueba de Shapiro-Wilk, con un nivel de significancia de 5%, utilizando el sistema de anĂĄlisis estadĂstico SAS(17), antes de estimar los parĂĄmetros genĂŠticos. Las estimaciones de los componentes de varianza y los valores de reproducciĂłn se obtuvieron mediante la mĂĄxima verosimilitud restringida (MVR), con un modelo multitrasgo animal, mediante el software VCE6(18) (para componentes de varianza) y PEST(19) (para valores de reproducciĂłn). En este anĂĄlisis, el modelo matricial se puede describir de la siguiente manera: y = Xb + Za + Mm + e Donde: y es el vector de valores fenotĂpicos; b es el vector de efectos fijos del grupo contemporĂĄneo, y la edad del reproductor covariable y la edad del animal; X es la matriz de incidencia que relaciona las observaciones en y con los efectos fijos en b; a es el vector de efecto aleatorio aditivo directo; Z es la matriz de incidencia que relaciona las observaciones en y con los efectos aleatorios aditivos directos en a; m es el vector del efecto aleatorio aditivo materno; M es la matriz que relaciona las observaciones en y con el efecto aditivo materno en m; e es el vector de tĂŠrmino residual aleatorio. El componente materno Mm se ajustĂł solo para los rasgos PC1, PC60 y GDP1. El conjunto de datos utilizado en este estudio tenĂa un nĂşmero bajo de terneros por oveja. Por lo tanto, el efecto materno permanente y el efecto ambiental de la camada fueron probados pero presentaron problemas tales como la no convergencia o estimaciones inconsistentes de los parĂĄmetros. Por lo tanto, se eligiĂł no incluir esos efectos en el modelo final. AdemĂĄs, el conjunto de datos mostrĂł un bajo nĂşmero de reproductoras endogĂĄmicas y, por lo tanto, no se incluyĂł este efecto en el modelo. Los supuestos de los modelos para anĂĄlisis podrĂan representarse simplemente de la siguiente manera: đ?&#x2018;&#x2039;đ?&#x2018;? đ?&#x2018;Ś đ?&#x2018;&#x17D; đ??ş đ??şđ?&#x2018;Ľđ?&#x2018;&#x20AC; 0 0 đ?&#x2018;&#x17D; đ?&#x2018;&#x161; đ??¸ [ ] = [ ] ; đ?&#x2018;&#x2019; đ?&#x2018;&#x2030; [ ] = [đ??şđ?&#x2018;Ľđ?&#x2018;&#x20AC; đ?&#x2018;&#x20AC; 0] 0 đ?&#x2018;&#x161; đ?&#x2018;&#x2019; 0 0 đ?&#x2018;&#x2026; đ?&#x2018;&#x2019; 0

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La matriz de (co) varianza para efectos genĂŠticos aditivos es G = G A, donde A es la matriz de relaciĂłn y G es la matriz de (co) varianza genĂŠtica aditiva. La matriz de (co) varianza para los efectos genĂŠticos maternos es M = M A, donde M es la matriz de (co) varianza genĂŠtica materna. R = I R0 I R0 es la matriz de (co) varianza residual entre los siete rasgos. GxM es la covarianza entre el aditivo genĂŠtico y los efectos maternos. El grupo contemporĂĄneo (CG) estaba formado por animales de la misma granja (45 niveles), sexo (machos o hembras), tipo de nacimiento (solteros o gemelos), aĂąo (2003 a 2011) y estaciĂłn de nacimiento (seca o lluviosa). Los grupos contemporĂĄneos con menos de tres animales fueron eliminados del anĂĄlisis. El Cuadro 1 muestra el nĂşmero de GC por rasgo y estadĂsticas descriptivas para todos los rasgos. Cuadro 1: TamaĂąo de muestra (N), nĂşmero de grupos contemporĂĄneos (GC), media y desviaciĂłn estĂĄndar (DE) de los rasgos Rasgos1

Peso al nacer Peso a los 60 dĂas (destete) Peso a los 180 dĂas Peso a los 270 dĂas Ganancia diaria de peso desde el nacimiento hasta los 60 dĂas Ganancia diaria de peso desde los 60 a los 180 dĂas Ganancia diaria de peso desde los 60 a los 270 dĂas Reproductoras Sementales 1

Media

10232 6277 4541 3328 5786

291 319 403 374 319

3.63 15.94 31.9 39.7 171.73

0.80 5.77 11.16 14.5 64.87

3229

403

149.43

67.84

1863

374

69.17

26.83

4742 391

-------

El peso y la ganancia de peso se midieron en kilogramos.

El modelo mixto se utilizĂł para probar el efecto de la endogamia en los valores fenotĂpicos: đ?&#x2018;Śđ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; = đ?&#x153;&#x2021; + đ??śđ??şđ?&#x2018;&#x2013; + đ?&#x203A;źđ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; (đ??ź) + đ?&#x203A;˝đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; (đ??ˇ) + đ?&#x203A;żđ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; (đ??´) + đ?&#x203A;žđ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; (đ??ş) + đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; Donde: đ?&#x2019;&#x161;đ?&#x2019;&#x160;đ?&#x2019;&#x2039; es el valor fenotĂpico del rasgo; đ?? es la media global; đ?&#x2018;Şđ?&#x2018;Žđ?&#x2019;&#x160; es el efecto fijo del grupo contemporĂĄneo; đ?&#x153;śđ?&#x2019;&#x160;đ?&#x2019;&#x2039; (đ?&#x2018;°) es el efecto fijo del nivel del coeficiente de la endogamia covariable; đ?&#x153;ˇđ?&#x2019;&#x160;đ?&#x2019;&#x2039; (đ?&#x2018;Ť) es el efecto fijo de la edad de las reproductoras covariables; đ?&#x153;šđ?&#x2019;&#x160;đ?&#x2019;&#x2039; (đ?&#x2018;¨) es el efecto fijo de la edad del animal covariable; đ?&#x153;¸đ?&#x2019;&#x160;đ?&#x2019;&#x2039; (đ?&#x2018;Ž) es el efecto aleatorio del valor de la crĂa covariable; đ?&#x2019;&#x2020;đ?&#x2019;&#x160;đ?&#x2019;&#x2039; es el tĂŠrmino residual aleatorio. Para la GDP2 y la GDP3 ambos de las edades inicial y final se incluyeron en el modelo como efecto fijo. 594

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AdemĂĄs, el efecto de la endogamia sobre los valores de crĂa tambiĂŠn se probaron y el modelo fue el siguiente: đ?&#x2018;Śđ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; = đ?&#x153;&#x2021; + đ?&#x203A;źđ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; (đ??ź) + đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x2014; Donde: đ?&#x2019;&#x161;đ?&#x2019;&#x160;đ?&#x2019;&#x2039; es el valor del rasgo de crĂa; đ?? es la media global; đ?&#x153;śđ?&#x2019;&#x160;đ?&#x2019;&#x2039; (đ?&#x2018;°) es el efecto fijo del nivel del coeficiente de la endogamia covariable; đ?&#x2019;&#x2020;đ?&#x2019;&#x160;đ?&#x2019;&#x2039; es el tĂŠrmino residual. El procedimiento mixto del software SAS(17) se usĂł para estimar los coeficiente de regresiĂłn de la endogamia para todos los rasgos. El nivel de significancia para declarar el efecto de la endogamia fue 5%. Integridad del pedigrĂ Los porcentajes de animales con pedigrĂ conocidos disminuyeron con el paso de las generaciones, de mĂĄs de 70 % en la primera generaciĂłn a menos de 5 % en la tercera (Figura 1). Este resultado puede ser una consecuencia de que ASCCO habĂa iniciado recientemente los registros fenotĂpicos y del pedigrĂ (aproximadamente 3ÂŞ y 4a generaciones), lo que puede explicar la ascendencia poco conocida de los animales estudiados aquĂ. La pĂŠrdida de informaciĂłn de una generaciĂłn a otra en el presente estudio fue mayor que la reportada en estudios previos con rebaĂąos Santa InĂŠs(12,13). Pedrosa et al(12) encontraron ascendencia conocida de padres a bisabuelos de 77, 59.5 y 38.75 %, mientras que Teixeira Neto et al(13) registraron 80.84, 73.78 y 67.75 %. Estudios previos sobre otras razas de ovejas revelaron niveles variados de integridad de pedigrĂ. Se consignaron niveles altos para las ovejas Bharat Merino, con valores de 91.01, 82.63, 74.91, 67.10 y 57.78 % para la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta generaciĂłn, respectivamente(8). Sin embargo, para otras razas de ovejas, se informĂł que la integridad del pedigrĂ es menor que las observadas en el presente estudio, especialmente en la primera generaciĂłn (11.88 % para el padre y 69.38 % para la madre) en ovejas Guilan(20) y (57 % para el semental y 15 % para la hembra) en ovejas Mehraban(21). Figura 1: PedigrĂ y nivel de identificaciĂłn de los ancestros hasta la tercera generaciĂłn

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El parámetro que mejor describe la calidad de un pedigrí es el número de generaciones equivalentes, y un valor más alto para este parámetro indica un pedigrí más completo. En el presente estudio, dicho valor fue bajo (Cuadro 2), lo que supone que, incluso con una cantidad razonable de información (11,564 individuos), la relación promedio fue menor en el conjunto de datos de Santa Inés. En estudios previos con ovejas de esta raza, se calcularon valores más altos, 2.26(12) y 4.67(13) debido a la mayor integridad del pedigrí. Un bajo número de generaciones equivalentes es común en las razas de ovejas con programas tempranos de conservación y reproducción(6), lo que resulta en un pedigrí con información incompleta y un bajo grado de profundidad. Por esta razón, también se registró un número reducido de generaciones equivalentes en varias razas de ovejas(2,6,9,21). Cuadro 2: Parámetros genéticos del origen de los rebaños Santa Inés del Noreste de Brasil Parámetros genéticos

Valor

Población de referencia Número de ancestros Número efectivo de fundadores (fe) Número de animales fundadores Número efectivo de ancestros (fa) Número de ancestros que explican 50% Número efectivo de genomas fundadores (fge) Promedio de pérdida de diversidad genética Endogamia (F) Promedio del coefciente de consanguineidad (AR) Número promedio de generaciones equivalentes Número promedio de generaciones completas Número promedio de generaciones máximas Incremento de endogamia (ΔF) en generaciones equivalentes Incremento de endogamia (ΔF) en generaciones completas Incremento de endogamia (ΔF) en generaciones máximas Tamaño efectivo de la población (Ne) en generaciones equivalentes Tamaño efectivo de la población (Ne) en generaciones completas Tamaño efectivo de la población (Ne) en generaciones máximas Intervalo de la generación Padre-Hijo Intervalo de la generación Padre-Hija Intervalo de la generación Madre-Hijo Intervalo de la generación Madre-Hija

11,564 3,984 285 486.84 273 146 35.71 0.0094 1.40 % 0.47 % 0.94 0.83 1.09

596

0.95 0.97 0.73 52.62 51.28 68.83 3.46 3.33 3.40 3.28

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Estructura y diversidad genĂŠtica El tamaĂąo efectivo de la poblaciĂłn (Ne) cambiĂł con el tiempo (Figura 2), siendo el mĂĄs alto en 2004 (665) y el mĂĄs bajo en 2010 (45). Se observĂł el tamaĂąo efectivo mĂĄs grande para la generaciĂłn mĂĄxima (Cuadro 2). La variaciĂłn en el tamaĂąo efectivo de la poblaciĂłn (Ne) a lo largo del tiempo tambiĂŠn se ha observado en otras razas de ovejas. Los valores de Ne varĂan de 41.8 a 31.3 en ovejas Morada Nova(22), mientras que tambiĂŠn se han consignado cifras de 280.2 a 12.4 para ovejas SegureĂąa(6). Por lo tanto, el tamaĂąo Ě&#x2026;đ?&#x2018;&#x2019; ) ) es una mejor referencia y fue cercano a 50 promedio efectivo de la poblaciĂłn (đ?&#x2018; cuando se calculĂł para generaciones completas y equivalentes en el presente estudio (Cuadro 2) y superior a 60 para las generaciones mĂĄximas. SegĂşn la FAO(23), el tamaĂąo efectivo deseado de la poblaciĂłn es de aproximadamente 50 animales por generaciĂłn, para restringir una tasa de endogamia de 1% por generaciĂłn. Por lo tanto, los valores de Ne por aĂąo observados para los rebaĂąos de Santa InĂŠs en el presente estudio (Figura 2), Ě&#x2026;đ?&#x2018;&#x2019; (Cuadro 2) indican una situaciĂłn de riesgo; pero los aumentos de asĂ como el đ?&#x2018; endogamia fueron inferiores a 1% para generaciones completas, equivalentes y mĂĄximas (Cuadro 2), lo cual es consistente con las recomendaciones de la FAO para evitar el riesgo de extinciĂłn. La disminuciĂłn de Ne y el aumento simultĂĄneo de F (Figura 2) pueden deberse al registro de animales sin informaciĂłn de pedigrĂ o al uso intensivo de algunos sementales en las granjas ASCCO, ya que los valores promedio de reproducciĂłn para GDP3 tienden a aumentar a medida que Ne disminuye y F aumenta (nĂłtese las curvas de lĂnea similares de GDP3 y F en la Figura 2). Figura 2: Endogamia promedio (F), tamaĂąo efectivo de la poblaciĂłn (Ne) y valores promedio de endogamia para la DWG3 por aĂąo de nacimiento

Se evaluĂł una poblaciĂłn de referencia de 11.564 ovejas Santa InĂŠs, con 3.984 ancestros. En esta poblaciĂłn, el nĂşmero efectivo de fundadores (Ć&#x2019;e) fue de 285, mientras que el nĂşmero de animales fundadores fue de 486.84. El nĂşmero de ancestros a los que se debe 50 % de la variaciĂłn genĂŠtica fue 146 y el nĂşmero efectivo de ancestros fue 273. El nĂşmero efectivo de genomas fundadores (fge) fue 35.71. Por lo tanto, algunos sementales 597

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de Santa Inés se usaron más intensamente, en detrimento de otros, lo que puede haber contribuido a la pérdida de variabilidad genética. Todos los ancestros contribuirían de la misma manera a lo largo de las generaciones, pero para muchas razas de ovejas, el número total de ancestros es mucho mayor que el número de ancestros a los que se debe el 50 % de la variabilidad genética(8,9,22). El mayor incremento de endogamia se observó en la generación equivalente (Cuadro 2). El mayor número de animales consanguíneos se concentró entre 0 y 10 % del coeficiente de consanguineidad y solo 263 animales mostraron F> 10 %. El intervalo de generación para cada una de las cuatro rutas padre-hijo demostró un promedio de 3.37 (Cuadro 2). Las estimaciones del coeficiente de endogamia promedio oscilaron entre cero y 6.25 % a lo largo de la generación (Cuadro 3) y la endogamia promedio fue de 1.40 % cuando solo se consideraron los animales endogámicos. Las estimaciones del coeficiente de consanguineidad promedio oscilaron entre 0.22 y 0.52 % a lo largo de la generación (Cuadro 3) y el coeficiente de consanguineidad promedio general fue 0.47 %. El coeficiente de endogamia tuvo su valor más bajo en 2004 (0.19 %) y alcanzó un valor más alto en 2008 (2.86 %) (Figura 2). Cuadro 3: Número de animales (N) por generación con su respectivo coeficiente de endogamia promedio (F) y coeficiente de consanguineidad promedio (AR) Generaciones

F (%)

AR (%)

7,562

0.00

0.22

2,901

0.88

0.45

844

2.42

0.51

210

3.81

0.51

3.82

0.52

6.25

0.43

Idealmente, el fe equipara al fa, o la diferencia siempre es tan baja como sea posible. Las proporciones mucho más altas que 1.0 indican un fuerte efecto de cuello de botella, que puede deberse a que se utilizó un número pequeño de sementales en la cruza. Esta proporción en el presente estudio (1.04 %) sugiere que la mayoría de los ancestros fueron fundadores y un cuello de botella genético insignificante. A pesar de la buena proporción fe/fa en el estudio actual, los valores de fe y fa fueron mucho más bajos que los de la población de referencia y los ancestros (Cuadro 2), lo que indica que los animales que fueron evaluados aquí tienen un origen genético reducido. Otro estudio con borregos Santa Inés reportó una proporción fe/fa superior (1.35)(12), demostrando así una reducción en la variabilidad genética causada por el desequilibrio entre los ancestros y los fundadores y un efecto de cuello de botella más alto. Para otras razas de ovejas, también se reportó un fe/fa cercano a 1, por ejemplo: de 1.0 para los borregos Morada Nova(22), de 1.8 para los borregos negros de Irán(7), y de 0.12 para las ovejas Segureñas(6). Sin embargo 598

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también se registraron cifras altas en ovejas Xald (2.02)(1) y en ovejas Kermani (2.07)(9). Finalmente, se detectó una pérdida de diversidad genética promedio de 0.0094 durante el periodo de estudio, lo que demuestra que la deriva genética fue significativa para el resultado de pérdida de diversidad genética en esta población. Los valores de endogamia superiores a 10 % se asocian con una disminución del rendimiento en las ovejas(24). Se observaron pocos animales (2.27 %) con consanguineidad por encima de 10 % y un valor máximo de F de 37.5 %, mientras que varios animales (97.73 %) no eran endogámicos o mostraban un coeficiente de endogamia inferior a 10 %. Estos números son similares a los reportados para otras razas de ovejas(8,25). En un estudio con ovejas Bharat Merino, el 97.62% de los animales no eran endogámicos ni mostraban una F <10%, y la endogamia individual más alta fue de 32.81 %(8). En las ovejas Shal iraníes, el 93.72 % no son endogámicas o F <10 %, con una endogamia individual máxima del 31.25 % (25). La baja integridad del pedigrí puede haber subestimado los coeficientes individuales de endogamia en el presente estudio. Trabajos previos sobre ovejas de Santa Inés, con mejor integridad de pedigrí, calcularon una endogamia máxima de 41.02 %(12) y 54.83 %(13), respectivamente; ambas investigaciones han demostrado que el número de animales endogámicos aumenta significativamente después de los primeros años de control de pedigrí. El coeficiente de endogamia promedio de la población (animales endogámicos y no endogámicos) fue de 0.36 %, pero el mismo coeficiente para los animales endogámicos fue de 1.41 %. Se reportaron valores más altos de endogamia promedio de la población de 2.33% (12) y 6.92 %(13) para las ovejas Santa Inés. En estos estudios, los coeficientes de endogamia promedio fueron 10.74 %(12) y 12.57 %(13) cuando solo se usaron animales endogámicos. El valor más bajo encontrado en el presente estudio puede deberse a la baja integridad del pedigrí, especialmente en los primeros años, lo que dificulta el cálculo del coeficiente de endogamia. Se registraron pequeños coeficientes de endogamia promedio en otras razas de ovejas con baja integridad de pedigrí. Estudios anteriores determinaron coeficientes de endogamia promedio de 0.15, 1.6 y 0.60 % para el pedigrí analizado completo de las razas de ovejas Guilan(20), Baluchi(2) y Segureñas(6), respectivamente. El incremento de la endogamia a través de las generaciones (Cuadro 3) puede estar reflejando un mejor control del pedigrí del rebaño y, consecuentemente, una calidad superior de la base de datos porque el coeficiente de endogamia depende del número de generaciones conocidas. El incremento de la endogamia (ΔF) en el presente estudio fue reducido para todas las generaciones rastreadas (Cuadro 2), lo que sugiere que los rebaños de Santa Inés bajo investigación estaban en buenas condiciones. También se observó un aumento en el coeficiente de endogamia promedio a lo largo de las generaciones en otras razas de ovejas(6,8). Se consignó un incremento de 0 a 7.09 (desde la primera generación hasta la cuarta generación) en ovejas Segureñas(6), mientras que un aumento de 0 a 1.54 (desde la generación inicial hasta la sexta generación) se determinó para las ovejas Bharat Merino(8). Los valores bajos de AR obtenidos en el presente estudio (Cuadro 3) muestran que los rebaños están en buenas condiciones, lo que favorece la probabilidad de 599

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apareamiento entre individuos no emparentados. Otro conjunto de datos de Santa Inés(12) también registró una estimación baja de AR (0.73 %), lo que evidencia la gran variabilidad de esta raza. Efecto de la endogamia sobre el fenotipo y los valores genéticos. Para los valores fenotípicos, la endogamia individual no tuvo efecto (P>0.05) en el PC60, PC180, PC270 y GDP1 (Cuadro 4), pero se observaron efectos significativos (P<0.05) para PC1 (0.0054 ± 0.0015), GDP2 (- 0.9837 ± 0.3025) y GDP3 (-0.5628 ± 0.2377). Para los valores genéticos, el efecto de la endogamia por depresión fue significativo (P<0.05) para todos los rasgos, excepto GDP1. Para las ovejas Santa Inés, solo un estudio previo(12) probó el efecto de endogamia en los rasgos fenotípicos, pero se evaluaron solo PC1, PC60 y PC180. Observaron una reducción de 34, 52 y 204 g por porcentaje de ∆F (equivalente a un coeficiente de endogamia tradicional de 2.2 % cuando se conocen 2.26 generaciones en el pedigrí) en el peso de las ovejas Santa Inés para PC1, PC60 y PC180, respectivamente. El presente análisis para los rasgos de registro no confirmó estos hallazgos, porque se encontró un efecto positivo de la endogamia en el PC1, en el que cada 1 % de la endogamia aumentó 5.4 g en este peso, y no se reconocieron efectos significativos para el PC60, PC180 y PC270 (Cuadro 4 ). Varias investigaciones anteriores con otras razas de ovejas dieron a conocer un efecto de endogamia depresiva sobre el peso al nacer(21,26,27), en el que cada 1 % de la endogamia resultó en disminuciones desde -0.7 g por 1% F en ovejas Olkuska polacas(26) hasta -51 g por 1 % F en ovejas Thalli(27). Para otros pesos corporales antes y después del destete, también hay muchos resultados que indican efectos depresivos en diferentes razas de ovejas. Se registró el efecto de la endogamia por depresión para el PC60, con valores que varían de -33 a -48 g por 1 % de F(27,28). Sin embargo, los estudios con ovejas Shal iraníes(25) y ovejas Segureñas(6) no tuvieron ningún efecto significativo de la endogamia en el peso corporal. Cuadro 4: Coeficientes de regresión de los efectos de la endogamia en el rendimiento de los rasgos Valor del fenotipo

Valor de cría

Rasgo

Estimación

Error Error Valor de Valor de P estandar Estimación estandar P

PC al nacer PC a los 60 días PC a los 180 días PC a los 270 días GDP desde el nacimiento hasta los 60 días GDP de 60 a 180 días GDP de 60 a 270 días

0.0054 0.0252 -0.0568 -0.0623 -0.2318

0.0015 0.0132 0.0299 0.0430 0.2200

-0.9837 -0.5628

0.3025 0.0012 0.2377 0.0180

0.0004 0.0555 0.0575 0.1469 0.2921

-0.0049 -0.0162 -0.0347 -0.0448 -0.0461

0.0006 0.0030 0.0104 0.0131 0.0573

-0.2846 -0.0524

0.0868 0.0011 0.0212 0.0137

PC= peso corporal; GDP= ganancia diaria de peso.

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<0.0001 <0.0001 0.0009 0.0006 0.4213

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En algunos trabajos previos, muchas veces se atribuyen los efectos no significativos al bajo nivel de endogamia de los animales como consecuencia de la baja integridad del pedigrí. En el presente estudio, el conjunto de datos también tenía una baja integridad del pedigrí (Figura 1); en consecuencia, un gran número de animales (7,562) mostró F cerca de 0. Otra hipótesis para dicho efecto es que el número reducido de animales mostró tanto F> 0 como registro fenotípico. Para evitar este segundo problema, se decidió evaluar el efecto de la endogamia en los valores de reproducción. Los resultados (Cuadro 4) indicaron un efecto significativo de endogamia en estos valores en todos los pesos corporales (PC1, PC60, PC180 y PC270). Además, los coeficientes de regresión fueron negativos, lo que es más consistente con estudios previos reportados en ovejas(26,27,28). Los coeficientes de regresión para la GDP2 y la GDP3 fueron más altos que los (−0.263 ± 0.116) reportados para la ganancia diaria de peso de 90 a 365 en ovejas Sandyno(4) e inferiores a los calculados para la ganancia diaria de peso de 90 a 180 (−1.810 ± 0.017 ) y de 90 a 365 (−1.345 ± 0.083) en ovejas Baluchi(2). El que se haya encontrado un efecto para la ganancia diaria de peso y ninguno para el peso corporal parece incoherente, pero es fácil de explicar. El número de animales con registros para PC60, PC180 y PC270 fue diferente del número de animales con registros para GDP2 y GDP3, porque para calcular el aumento de peso diario es necesario tener cuatro datos del mismo animal (el PC inicial y final y las edades inicial y final). Esto no ocurrió con todos los animales del conjunto de datos con el cual se trabajó. Cuando se usaron valores de reproducción, este problema se resolvió, porque todos los animales tienen las estimaciones de los valores de reproducción para todos los rasgos. Es posible observar en el Cuadro 4 que esta incoherencia prácticamente no existió cuando se estimó el efecto de la endogamia en los valores de reproducción (Tabla 4), lo que sugiere un resultado más consistente. Se pudo observar que la población evaluada tenía una baja integridad de pedigrí y una endogamia promedio pequeña. Esta población presentó una disminución en el tamaño efectivo de la población a lo largo de las generaciones y un aumento de la endogamia, lo que puede comprometer su variabilidad genética. La endogamia tuvo un efecto significativo en el PC1, la GDP2 y la GDP3 cuando se evaluaron los registros fenotípicos. Al abordar los valores de reproducción, el efecto de endogamia fue significativo para todos los rasgos, excepto para la GDP1. Los coeficientes de regresión obtenidos para los valores reproductivos sugirieron un análisis más robusto, porque fueron negativos y significativos tanto para el PC (todas las edades) como para la GDP post-destete. Por otro lado, se encontraron coeficientes de endogamia de regresión positiva y significativa solo para el PC1 (en análisis fenotípico), pero no hubo resultados similares para este rasgo en el análisis del valor de mejoramiento. En ambos análisis, el efecto de la endogamia en los rasgos de crecimiento fue principalmente negativo, lo que implica la necesidad de evitar el apareamiento relacionado en los rebaños estudiados de ovejas Santa Inés.

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Agradecimientos A ASCCO por la base de datos; a FAPESB por la beca otorgada a Ana Carla Borges Barbosa, y a CNPQ por la Beca de Productividad otorgada a José Bento Sterman Ferraz, a Victor Breno Pedrosa y a Luís Fernando Batista Pinto.

Literatura citada: 1. Goyache F, Gutiérrez JP, Fernández I, Gomez E, Alvarez I, Díez J, Royo LJ. Using pedigree information to monitor genetic variability of endangered populations: the Xalda sheep breed of Asturias as an example. J Anim Breed Genet 2003;120:95– 103. 2. Gholizadeha M, Ghafouri-Kesbi F. Inbreeding depression in growth traits of Baluchi sheep. Small Ruminant Res 2016;144:184–190. 3. Yeganehpur Z, Roshanfekr H, Fayazi J, Beyranvand MH. Inbreeding depression on growth traits of Iranian Lori sheep. Rev Colomb Cienc Pec 2016;29:264-273. 4. Venkataramanan R, Subramanian A, Sivaselvam SN, Sivakumar T, Sreekumar C, Iyue, M. Effect of inbreeding and individual increase in inbreeding on growth in Nilagiri and Sandyno breeds of sheep. Anim Genet Resour 2016;58:63-71. 5. Scherf BD. World watch list for domestic animal diversity. 3rd ed., Italy, AO, 2000. 6. Barros EA, Brasil LHA, Tejero JP, Delgado-Bermejo JV, Ribeiro MN. Population structure and genetic variability of the Segureña sheep breed through pedigree analysis and inbreeding effects on growth traits. Small Ruminant Res 2017;149:128– 133. 7. Mokhtari MS, Shahrbabak MM, Esmailizadeh AK, Shahrbabak HM, Gutierrez JP. Pedigree analysis of Iran-Black sheep and inbreeding effects on growth and reproduction traits. Small Ruminant Res 2014;116:14– 20. 8. Gowane GR, Prakash V, Chopra A, Prince LLL. Population structure and effect of inbreeding on lamb growth in Bharat Merino sheep. Small Ruminant Res 2013;114:72–79. 9. Mokhtari MS, Shahrbabak MM, Esmailizadeh AK, Abdollahi-Arpanahi R, Gutierrez JP. Genetic diversity in Kermani sheep assessed from pedigree analysis. Small Ruminant Res 2013;114:202–205. 10. Lynch M, Walsh B. Genetics and analysis of quantitative traits. 1st Ed., USA, Sinauer Associates, 1998.

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Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias

Edición Bilingüe Bilingual Edition

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 11 Núm 2, pp. 311-604, ABRIL-JUNIO-2020

ISSN: 2448-6698

CONTENIDO CONTENTS Pags. Preliminary study of ivermectin residues in bovine livers in the Bogota Savanna

Eficacia de la ivermectina para el control de nematodos gastrointestinales en burros (Equus asinus) en el altiplano mexicano

Ivermectin effectiveness for gastrointestinal nematode control in donkeys (Equus asinus) in the Mexican High Plateau Guadalupe Galicia-Velázquez, Arturo Villarreal-Nieto, Cris�na Guerrero-Molina, Cintli Mar�nez-Or�z-de-Montellano……………………………………………………………………………………………………………………….…....…326

Artemisia cina 30 CH homeopathic treatment against Haemonchus contortus

Artemisia cina 30 CH como tratamiento homeopático contra el Haemonchus contortus Rosa Isabel Higuera-Piedrahita, María Eugenia López-Arellano, Raquel López-Arellano, César Cuenca-Verde, Jorge Alfredo Cuéllar-Ordaz………………………………………………………………………………………………….342

Inclusión de harina de Tithonia diversifolia en raciones para gallinas ponedoras de primer ciclo y su efecto sobre la pigmentación de yema de huevo

Tithonia diversifolia meal in diets for ﬁrst-cycle laying hens and its eﬀect on egg yolk color María Elena Carranco-jauregui, Vilma Barrita-Ramírez, Benjamín Fuente-Mar�nez, Ernesto Ávila-González, Leonor Sanginés-García……………………………………………………………………………..………………………….355

Efecto de un complejo multienzimático y un probiótico en gallinas de postura alimentadas con dietas sorgo-soya-canola

Effect of a multienzyme complex and a probiotic in laying hens fed sorghum-soybean-rapeseed diets Pedro Juárez Morales, Arturo Cortes Cuevas, José Arce Menocal, Juan Carlos Del Río García, Gabriela Gómez Verduzco, Ernesto Avila González……………………………………………………………………………...…………369

Tendencias genéticas y fenotípicas para pico productivo, rendimiento lechero y persistencia de lactación en la raza Murciano-Granadina

Phenotypic and genetic trends for peak yield, milk yield, and lactation persistency in the Murciano-Granadina breed Judith Carmen Miranda Alejo, José Manuel León Jurado, Camillo Pierama�, Mayra Mercedes Gómez Carpio, Jesús Valdés Hernández, Cecilio José Barba Capote………………………………………………………………380

Calidad seminal de ovinos de pelo suplementados con Moringa oleifera (Moringaceae) y Trichanthera gigantea (Acanthaceae)

Semen quality of hair sheep supplemented with Moringa oleifera (Moringaceae) and Trichanthera gigantea (Acanthaceae) Marco A. Ramírez-Bau�sta, Julio P. Ramón-Ugalde, Edgar Aguilar-Urquizo, William Cetzal-Ix, Roberto Sanginés-García, Álvaro E. Domínguez-Rebolledo, Ángel T. Piñeiro-Vázquez…………………………….…....…393

Use of a glycogenic precursor during the prepartum period and its effects upon metabolic indicators and reproductive parameters in dairy cows

Uso de un precursor glucogénico en el preparto y su efecto sobre indicadores de energía y parámetros reproductivos en vacas lecheras Carlos Leyva Orasma, Jesus Jaime Benitez-Rivas, Juan Luis Morales Cruz, Cesar Alberto Meza-Herrera, Oscar Ángel-García, Fernando Arellano-Rodríguez, Guadalupe Calderón-Leyva, Dalia Ive�e Carrillo-Moreno, Francisco Veliz Deras…………………………………………………………………………………………….…….………………………………………………………………………………………408

Relationship of the compositional content and sanitary quality of Holstein cows’ milk of the high tropic of Nariño

Relación entre la calidad composicional y sanitaria de la leche de bovinos Holstein del trópico alto de Nariño Henry Armando Jurado-Gámez, Carlo Eugenio Solarte-Por�lla, Álvaro Javier Burgos-Arcos, Aldemar González-Rodríguez, Carol Rosero-Galindo…………………………………………………………………………………………421

Caracterización de Aspergillus flavus y cuantificación de aflatoxinas en pienso y leche cruda de vacas en Aguascalientes, México

Characterization of Aspergillus flavus and quantification of aflatoxins in feed and raw milk of cows in Aguascalientes, Mexico Erika Janet Rangel-Muñoz, Arturo Gerardo Valdivia-Flores, Onésimo Moreno-Rico, Sanjuana Hernández-Delgado, Carlos Cruz-Vázquez, María Carolina de-Luna-López, Teódulo Quezada-Tristán, Raúl Or�z-Mar�nez, Netzahualcóyotl Máyek-Pérez…………………………………………………………………………………………………………………………………………….435

Comparación de la castración quirúrgica al nacimiento versus inmunocastration sobre las características de la canal y carne en machos Holstein

Comparison of surgical castration at birth versus immunocastration on carcass and meat traits in growing Holstein males Jorge A. Cervantes-Cazares, Cris�na Pérez-Linares, Fernando Figueroa-Saavedra, Alma R. Tamayo-Sosa, Alberto Barreras-Serrano, Francisco G. Ríos-Rincón, Eduardo Sánchez-López, Issa C. García-Reynoso, Pedro Mendoza Peraza, Angelina León Villanueva, Luis A. García-Vega………………………………………………………………………………………455

Ascosferosis en abejas melíferas y su relación con factores ambientales en Jalisco, México

Ascospherosis in honey bees and its relationship to environmental factors in Jalisco, Mexico José María Tapia-González, Gustavo Alcazar-Oceguera, José Octavio Macías-Macías, Francisca Contreras-Escareño, José Carlos Tapia-Rivera, Ta�ana Petukhova, Ernesto Guzmán-Novoa…………………………468

Desarrollo y validación de un patrón visual para la evaluación del color de la carne de bovino en México

Development and validation of a visual pattern for evaluating beef meat color in Mexico Sara Salinas Labra, María Salud Rubio Lozano, Diego Braña Varela, Rubén Danilo Méndez Medina, Enrique Jesús Delgado Suárez………………………………………………………………………………………………………………479

REVISIONES DE LITERATURA Bolos intrarruminales con liberación controlada de minerales traza. Revisión

Trace mineral controlled-release intraruminal boluses. Review Misael León-Cruz, Efrén Ramírez-Bribiesca, Raquel López-Arellano, Leonor Miranda-Jiménez, Gabriela Rodríguez-Pa�ño, Víctor M. Díaz-Sánchez, Alma L. Revilla-Vázquez……………………………………………….498

Implicaciones, tendencias y perspectivas del transporte de larga distancia en el ganado bovino. Revisión

Implications, trends, and prospects for long-distance transport in cattle. Review Marcela Valadez Noriega, Genaro Cvabodni Miranda de la Lama…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………517

NOTAS DE INVESTIGACIÓN Growth, viability, and post-acidification of Lactobacillus plantarum in bovine transition milk

Crecimiento, viabilidad y post-acidificación de Lactobacillus plantarum en la leche de transición bovina Hugo Calixto Fonseca, Eduardo Robson Duarte, Lívia Caroliny Almeida Santos Souza, Emanuelly Gomes Alves Mariano, Ana Clarissa dos Santos Pires, Ta�ana Santos Lima, Maximiliano Soares Pinto........539

Caracterización de la leche y queso artesanal de la región de Ojos Negros, Baja California, México

Characterization of the milk and artisanal cheese of the region of Ojos Negros, Baja California, Mexico Laura E. Silva-Paz, Gerardo E. Medina-Basulto, Gilberto López-Valencia, Mar�n F. Montaño-Gómez, Rafael Villa-Angulo, José C. Herrera Ramírez, Ana L. González-Silva, Francisco Monge-Navarro, Sergio A. Cueto-González, Gerardo Felipe-García…………………………………………………………………………………………553

Factores asociados al decomiso de hígados positivos a Fasciola sp en una zona endémica del sureste de México

Factors associated with the seizure of livers positive to Fasciola sp in an endemic area of southeastern Mexico Nadia Florencia Ojeda-Robertos, Roberto González-Garduño, San�ago Cornelio-Cruz, Jorge Alonso Peralta-Torres, Carlos Luna-Palomera, Carlos Machain-Williams, Heliot Zarza, Oswaldo Margarito Torres-Chablé, Enrique Reyes-Novelo, Carlos Baak-Baak, Alfonso Chay-Canul……………………………………………………………….565

Análisis genético del desarrollo en peso vivo y tasa de gestación en primer parto en bovinos Brahman de Venezuela

Genetic analysis of live weight and pregnancy rate at first calving in Brahman cattle from Venezuela Alejandro-Palacios-Espinosa, Omar-Verde, Narciso-Ysac-Ávila-Serrano, Alberto-Menéndez-Buxadera…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………576

Pedigree analysis of Santa Inês sheep and inbreeding effects on performance traits

Análisis de pedigrí de las ovejas Santa Inês y los efectos de la endogamia en los rasgos de rendimiento Ana Carla Borges Barbosa, Gabrieli de Souza Romano, Jonatan Mikhail Del Solar Velarde, José Bento Sterman Ferraz, Victor Breno Pedrosa, Luís Fernando Ba�sta Pinto…………………………………………………590

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 11 Núm 2, pp. 311-604, ABRIL-JUNIO-2020

Estudio preliminar de residuos de ivermectina en hígado de bovinos en la Sabana de Bogotá Carmen Teresa Celis-Giraldo, Diego Ordóñez, Leonardo Roa, Sergio Andrei Cuervo-Escobar, Dajane Garzón-Rodríguez, Milena Alarcón-Caballero, Luisa Fernanda Merchán………………………………….....….…...311

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 11 Núm. 2, pp. 311-604, ABRIL-JUNIO-2020