RMCP Vol. 9, Núm. 3 (2018): Julio-Septiembre by Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias

Edición Bilingüe Bilingual Edition

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 9 Núm. 3, pp. 408- 613, JULIO-SEPTIEMBRE-2018

ISSN: 2448-6698

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 9 Núm. 3, pp. 408-613, JULIO-SEPTIEMBRE-2018

Abejas obreras europeas del Banco de Germoplasma Apícola del INIFAP, Ajuchitlán, Qro. Fotografía tomada por: Claudia García Figueroa.

REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS Volumen 9 Número 3 julioseptiembre, 2018. Es una publicación trimestral de acceso abierto, revisada por pares y arbitrada, editada por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Avenida Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina, Delegación Coyoacán, C.P. 04010, Cuidad de México, www.inifap.gob.mx Distribuida por el Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal, Km 15.5 Carretera México-Toluca, Colonia Palo Alto, Cuidad de México, C.P. 05110. Editor responsable: Arturo García Fraustro. Reservas de Derechos al Uso Exclusivo número 04-2016-060913393200-203. ISSN: 2448-6698, otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor (INDAUTOR). Responsable de la última actualización de este número: Arturo García Fraustro, Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal, Km. 15.5 Carretera MéxicoToluca, Colonia Palo Alto, Ciudad de México, C.P. 015110. http://cienciaspecuarias. inifap.gob.mx, la presente publicación tuvo su última actualización en julio de 2018.

DIRECTORIO FUNDADOR John A. Pino EDITORES ADJUNTOS Oscar L. Rodríguez Rivera Alfonso Arias Medina

EDITOR EN JEFE Arturo García Fraustro

Microbiología: Epidemiología: Parasitología: Reproducción: Genética: Nutrición:

Apicultura: Socioeconomía: Forrajes y Pastizales:

Inocuidad: Inmunología:

EDITORES POR DISCIPLINA Elizabeth Loza Rubio INIFAP Juan Carlos Saiz Calahorra INIA María Cristina Schneider PAHO Ramón Molina Barrios IT Sonora Elisa Rubí Chávez UNAM Guillermina Ávila Ramírez UNAM Emmanuel Camus CIRAD Héctor Jiménez Severiano INIFAP José J. Hernández Ledesma Consultor Juan Heberth Hernández Medrano UNAM Sergio Román Ponce INIFAP Mauricio A. Elzo Univ. Florida Armando Partida de la Peña INIFAP José L. Romano Muñoz INIFAP Alejandro Plasencia Jorquera UABJ Juan Ku Vera UADY Ricardo Basurto Gutiéerez INIFAP Maria Salud Rubio Lozano UNAM Silvia Elena Buntinx Dios UNAM Yolanda B. Moguel Ordóñez INIFAP Fernando Cervantes Escoto UA Chapingo Adolfo G. Alvarez Macías UAM-Xochimilco José Alfredo Cesín Vargas UNAM Javier F. Enríquez Quiroz INIFAP Martha H. Martín Rivera Univ. Sonora URN Fernando A. Ibarra Flores Univ. Sonora URN James A. Pfister USDA Eduardo Bolaños Aguilar INIFAP Jesús Vázquez Navarrete INIFAP Sergio Rodríguez Camarena INIFAP

México España EE.UU. México México México Francia México EE.UU. México México EE.UU. México México México México México México México México México México México México México México EE.UU. México México México

TIPOGRAFÍA Y FORMATO Nora del Rocío Alfaro Gómez Indizada en el “Journal Citation Report” Science Edition del ISI (http://thomsonreuters.com/). Inscrita en el Sistema de Clasificación de Revistas Científicas y Tecnológicas de CONACyT; en EBSCO Host y la Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal (RedALyC) (www.redalyc.org); en la Red Iberoamericana de Revistas Científicas de Veterinaria de Libre Acceso (www.veterinaria.org/revistas/ revivec); en los Índices SCOPUS y EMBASE de Elsevier (www.elsevier. com).

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Se publican en la revista tres categorías de trabajos: Artículos Científicos, Notas de Investigación y Revisiones Bibliográficas (consultar las Notas al autor); la responsabilidad de cada trabajo recae exclusivamente en los autores, los cuales, por la naturaleza misma de los experimentos pueden verse obligados a referirse en algunos casos a los nombres comerciales de ciertos productos, ello sin embargo, no implica preferencia por los productos citados o ignorancia respecto a los omitidos, ni tampoco significa en modo alguno respaldo publicitario hacia los productos mencionados.

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Todas las contribuciones serán cuidadosamente evaluadas por árbitros, considerando su calidad y relevancia académica. Queda entendido que el someter un manuscrito implica que la investigación descrita es única e inédita. La publicación de Rev. Mex. Cienc. Pecu. es trimestral en formato bilingüe Español e Inglés. El costo

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The journal publishes three types of papers: Research Articles, Technical Notes and Review Articles (please consult Instructions for authors). Authors are responsible for the content of each manuscript, which, owing to the nature of the experiments described, may contain references, in some cases, to commercial names of certain products, which however, does not denote preference for those products in particular or of a lack of knowledge of any other which are not mentioned, nor does it signify in any way an advertisement or an endorsement of the referred products.

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REVISTA MEXICANA DE CIENCIAS PECUARIAS REV. MEX. CIENC. PECU.

VOL. 9 No. 3

JULIO-SEPTIEMBRE-2018

CONTENIDO ARTÍCULOS

Pág.

Detección de Neospora caninum en ganado lechero sacrificado en Aguascalientes, México Detection of Neospora caninum from slaughtered dairy cattle in Aguascalientes, Mexico Leticia Esperanza Medina Esparza, Ricardo de Luna Oseguera, Irene Victoria Vitela Mendoza, Carlos Cruz Vázquez .... 408

Frecuencia de casos e identificación molecular de Cryptosporidium spp en corderos lactantes mantenidos en pastoreo en el estado de Veracruz, México Cases frequency and molecular identification of Cryptosporidium spp in lactating lambs kept grazing in the State of Veracruz, Mexico Irene Vitela-Mendoza, Victor Guillen Lorenzo, Carlos Cruz-Vázquez, Leticia Medina-Esparza, Miguel Ramos Parra ....... 420

Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally-inoculated vampire bats Detección del virus de la rabia en órganos no relacionados con el sistema nervioso central de murciélagos vampiro experimentalmente infectados María Luisa Méndez-Ojeda, Edith Rojas-Anaya, José Francisco Morales Álvarez, Graciela Tapia-Pérez, Gererdo Suzán, Osiris Gaona Pineda, Rodrigo A. Medellín-Legorreta, Charles E. Rupprecht, Elizabeth Loza-Rubio ........ 435

Valorización de una Indicación Geográfica Protegida. El caso de la carne de la Sierra de Guadarrama, España Valuation of a Protected Geographical Indication. The case of the meat of the Sierra de Guadarrama, Spain Mario del roble Pensado-Leglise, Javier Sanz-Cañada ..................................................................................... 451 Metales pesados en leche de vacas alimentadas con alfalfa producida en suelos irrigados con aguas residuales en Puebla y Tlaxcala, México Heavy metals in milk from cows fed alfalfa produced in soils irrigated with wastewater in Puebla and Tlaxcala, Mexico Numa Pompilio Castro-González, Rafael Moreno-Rojas, Francisco Calderón-Sánchez, Alicia Moreno-Ortega, José Víctor Tamariz-Flores .................................................................................................................................. 466

Evaluación del rendimiento de materia seca y sus componentes en germoplasma de alfalfa (Medicago sativa L.) Performance of dry matter yield and its components in germoplasm of alfalfa (Medicago sativa L.) Milton Javier Luna Guerrero, Cándido López Castañeda, Alfonso Hernández Garay, Pedro Arturo Martínez Hernández, María Esther Ortega Cerrilla ............................................................................................................... 486

Eficiencia reproductiva de Ovsynch + CIDR en vacas Holstein bajo un esquema de inseminación artificial a tiempo fijo en el norte de México Reproductive efficiency of Ovsynch + CIDR in Holstein cows under a fixed time artificial insemination scheme in northern Mexico

III

Rafael Rodríguez-Martínez, Irene Concepción Chavarría Nerí, César A. Meza-Herrera, Alan Sebastian Alvarado-Espino, Juan Luis Morales Cruz, Vicente Homero González-Álvarez, Ma. Guadalupe Calderón-Leyva, Francisco G. Véliz Deras, Oscar Ángel-García ................................................................................................................................................................. 506

REVISIÓN BIBLIOGRAFICA Valor nutricional de la semilla de Mucuna spp. como complemento dietario en animales no rumiantes y rumiantes. Revisión Nutritional value of Mucuna spp. seed, as a dietary complement to non ruminant and ruminant livestock. Review Luis Gerardo Barriada-Bernal, Lilia Méndez-Lagunas, Juan Rodríguez-Ramírez, Sadoth Sandoval-Torres, Laura Aquino-González ....................................................................................................................................... 518

Síndrome de depresión de grasa láctea provocado por el isómero trans-10, cis-12 del ácido linoleico conjugado en vacas lactantes. Revisión Milk fat depression syndrome caused by trans-10, cis-12 isomer of conjugated linoleic acid in lactating cows. Review Lorenzo Danilo Granados-Rivera, Omar Hernández-Mendo..................................................................................... 536

NOTAS DE INVESTIGACIÓN Prevalencia de anticuerpos contra diarrea viral bovina en vacas no vacunadas en los estados de Puebla, Tabasco y Veracruz, México Prevalence of antibodies against bovine viral diarrhea in non-vaccinated cows from the States of Puebla, Tabasco and Veracruz, Mexico Jorge Víctor Rosete Fernández, Ángel Ríos Utrera, Juan Prisciliano Zárate Martínez, Sara Olazarán Jenkins, Lorenzo Granados Zurita, Abraham Fragoso Islas, Víctor Manuel Banda Ruiz, Guadalupe Asunción Socci Escatell ........ 555

Prevalencia de la acariosis traqueal y niveles de infestación de Acarapis woodi en colonias de abejas de Morelos, México Prevalence of honeybee tracheal mite disease and infestation levels of Acarapis woodi in honeybee colonies of Morelos, Mexico Claudia García Figueroa, Miguel Enrique Arechavaleta-Velasco ............................................................................... 567

Retención de membranas fetales y patologías uterinas en vacas lecheras tratadas con PGF2α después del parto Retention of fetal membranes and uterine pathologies in dairy cows treated with PGF2α after parturition Luis Ángel Valdés Pérez, Joel Hernández Cerón, Rodolfo Luzbel de la Sota, Carlos Fernando Aréchiga Flores, Eligio Gabriel Salgado, Antonio Romero Arredondo ................................................................................................ 576

In vitro ruminal degradation of neutral detergent fiber insoluble protein from tropical pastures fertilized with nitrogen

Degradación ruminal in vitro de la proteína insoluble en fibra detergente neutro de pastos tropicales fertilizados con nitrógeno Francisco Indalecio Juárez Lagunes, Alice N. Pell, Robert W. Blake, Maribel Montero Lagunes, Juan Manuel Pino Rodríguez ............................................................................................................................... 588

Oportunidades para caprinocultores de Guanajuato, México, en la comercialización de queso fino Opportunities for goat farmers in Guanajuato, Mexico, in the marketing of fine cheese Rodolfo Santos-Lavalle, Juan José Flores-Verduzco, Fernando Cervantes-Escoto, José María Salas-González, Leticia Myriam Sagarnaga-Villegas ............................................................................................................................................. 601

Actualización: enero, 2016

NOTAS AL AUTOR La Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias se edita completa en dos idiomas (español e inglés) y publica tres categorías de trabajos: Artículos científicos, Notas de investigación y Revisiones bibliográficas.

figuras. Las Revisiones bibliográficas una extensión máxima de 30 cuartillas y 5 cuadros. 6.

Los autores interesados en publicar en esta revista deberán ajustarse a los lineamientos que más adelante se indican, los cuales en términos generales, están de acuerdo con los elaborados por el Comité Internacional de Editores de Revistas Médicas (CIERM) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437. 1.

Todos los trabajos estarán sujetos a revisión de un Comité Científico Editorial, conformado por Pares de la Disciplina en cuestión, quienes desconocerán el nombre e Institución de los autores proponentes. El Editor notificará al autor la fecha de recepción de su trabajo.

El manuscrito deberá someterse a través del portal de la Revista en la dirección electrónica: http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, consultando el “Instructivo para envío de artículos en la página de la Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias”. Para su elaboración se utilizará el procesador de Microsoft Word, con letra Arial a 12 puntos, a doble espacio. Asimismo se deberá remitir una carta de presentación firmada por todos los autores, aceptando el orden de co-autoría, remitiéndola en forma digitalizada como archivo complementario; en ella se indicará el responsable de la correspondencia con la Revista, indicando dirección (no apartado postal), teléfono y dirección electrónica.

Página del título Resumen en español Resumen en inglés Texto Agradecimientos Literatura citada Cuadros y gráficas

Sólo se aceptarán trabajos inéditos. No se admitirán si están basados en pruebas de rutina, ni datos experimentales sin estudio estadístico cuando éste sea indispensable. Tampoco se aceptarán trabajos que previamente hayan sido publicados condensados o in extenso en Memorias o Simposio de Reuniones o Congresos (a excepción de Resúmenes).

Los manuscritos de las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. deberán contener los componentes que a continuación se indican, empezando cada uno de ellos en página aparte.

Por ser una revista con arbitraje, y para facilitar el trabajo de los revisores, todos los renglones de cada página deben estar numerados; asimismo cada página debe estar numerada, inclusive cuadros, ilustraciones y gráficas.

Página del Título. Solamente debe contener el título del trabajo, que debe ser conciso pero informativo; así como el título traducido al idioma inglés. En el manuscrito no es necesaria información como nombres de autores, departamentos, instituciones, direcciones de correspondencia, etc., ya que estos datos tendrán que ser registrados durante el proceso de captura de la solicitud en la plataforma del OJS (http://ciencias pecuarias.inifap.gob.mx).

Resumen en español. En la segunda página se debe incluir un resumen que no pase de 250 palabras. En él se indicarán los propósitos del estudio o investigación; los procedimientos básicos y la metodología empleada; los resultados más importantes encontrados, y de ser posible, su significación estadística y las conclusiones principales. A continuación del resumen, en punto y aparte, agregue debidamente rotuladas, de 3 a 8 palabras o frases cortas clave que ayuden a los indizadores a clasificar el trabajo, las cuales se publicarán junto con el resumen.

Resumen en inglés. Anotar el título del trabajo en inglés y a continuación redactar el “abstract” con las mismas instrucciones que se señalaron para el resumen en español. Al final en punto y aparte, se deberán escribir las correspondientes palabras clave (“key words”).

10. Texto. Las tres categorías de trabajos que se publican en la Rev. Mex. Cienc. Pecu. consisten en lo siguiente:

Los artículos tendrán una extensión máxima de 20 cuartillas a doble espacio, sin incluir páginas de Título, y cuadros o figuras (los cuales no deberán exceder de ocho). Las Notas de investigación tendrán una extensión máxima de 15 cuartillas y 6 cuadros o

a) Artículos científicos. Deben ser informes de trabajos originales derivados de resultados parciales o finales de investigaciones. El texto del Artículo científico se

divide en secciones encabezamientos:

que

llevan

Reglas básicas para la Literatura citada

estos

Nombre de los autores, con mayúsculas sólo las iniciales, empezando por el apellido paterno, luego iniciales del materno y nombre(s). En caso de apellidos compuestos se debe poner un guión entre ambos, ejemplo: Elías-Calles E. Entre las iniciales de un autor no se debe poner ningún signo de puntuación, ni separación; después de cada autor sólo se debe poner una coma, incluso después del penúltimo; después del último autor se debe poner un punto.

Introducción Materiales y Métodos Resultados Discusión Conclusiones e implicaciones En los artículos largos puede ser necesario agregar subtítulos dentro de estas divisiones a fin de hacer más claro el contenido, sobre todo en las secciones de Resultados y de Discusión, las cuales también pueden presentarse como una sola sección.

El título del trabajo se debe escribir completo (en su idioma original) luego el título abreviado de la revista donde se publicó, sin ningún signo de puntuación; inmediatamente después el año de la publicación, luego el número del volumen, seguido del número (entre paréntesis) de la revista y finalmente el número de páginas (esto en caso de artículo ordinario de revista).

b) Notas de investigación. Consisten en modificaciones a técnicas, informes de casos clínicos de interés especial, preliminares de trabajos o investigaciones limitadas, descripción de nuevas variedades de pastos; así como resultados de investigación que a juicio de los editores deban así ser publicados. El texto contendrá la misma información del método experimental señalado en el inciso a), pero su redacción será corrida del principio al final del trabajo; esto no quiere decir que sólo se supriman los subtítulos, sino que se redacte en forma continua y coherente.

Puede incluir en la lista de referencias, los artículos aceptados aunque todavía no se publiquen; indique la revista y agregue “en prensa” (entre corchetes). En el caso de libros de un solo autor (o más de uno, pero todos responsables del contenido total del libro), después del o los nombres, se debe indicar el título del libro, el número de la edición, el país, la casa editorial y el año.

c) Revisiones bibliográficas. Consisten en el tratamiento y exposición de un tema o tópico de relevante actualidad e importancia; su finalidad es la de resumir, analizar y discutir, así como poner a disposición del lector información ya publicada sobre un tema específico. El texto se divide en: Introducción, y las secciones que correspondan al desarrollo del tema en cuestión.

Cuando se trate del capítulo de un libro de varios autores, se debe poner el nombre del autor del capítulo, luego el título del capítulo, después el nombre de los editores y el título del libro, seguido del país, la casa editorial, año y las páginas que abarca el capítulo.

11. Agradecimientos. Siempre que corresponda, se deben especificar las colaboraciones que necesitan ser reconocidas, tales como a) la ayuda técnica recibida; b) el agradecimiento por el apoyo financiero y material, especificando la índole del mismo; c) las relaciones financieras que pudieran suscitar un conflicto de intereses. Las personas que colaboraron pueden ser citadas por su nombre, añadiendo su función o tipo de colaboración; por ejemplo: “asesor científico”, “revisión crítica de la propuesta para el estudio”, “recolección de datos”, etc.

En el caso de tesis, se debe indicar el nombre del autor, el título del trabajo, luego entre corchetes el grado (licenciatura, maestría, doctorado), luego el nombre de la ciudad, estado y en su caso país, seguidamente el nombre de la Universidad (no el de la escuela), y finalmente el año. Emplee el estilo de los ejemplos que aparecen a continuación, los cuales están parcialmente basados en el formato que la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos usa en el Index Medicus.

12. Literatura citada. Numere las referencias consecutivamente en el orden en que se mencionan por primera vez en el texto. Las referencias en el texto, en los cuadros y en las ilustraciones se deben identificar mediante números arábigos entre paréntesis, sin señalar el año de la referencia. Evite hasta donde sea posible, el tener que mencionar en el texto el nombre de los autores de las referencias. Procure abstenerse de utilizar los resúmenes como referencias; las “observaciones inéditas” y las “comunicaciones personales” no deben usarse como referencias, aunque pueden insertarse en el texto (entre paréntesis).

Revistas

Artículo ordinario, con volumen y número. (Incluya el nombre de todos los autores cuando sean seis o menos; si son siete o más, anote sólo el nombre de los seis primeros y agregue “et al.”). I)

VII

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

Sólo número sin indicar volumen.

XII) Cunningham EP. Genetic diversity in domestic animals: strategies for conservation and development. In: Miller RH et al. editors. Proc XX Beltsville Symposium: Biotechnology’s role in genetic improvement of farm animals. USDA. 1996:13.

II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10. III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status ofthe use of artificial insemination in developing countries. World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

Tesis. XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989.

No se indica el autor. IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

Suplemento de revista. V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

Organización como autor. XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984.

Organización, como autor.

XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996.

VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand. Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282-284.

En proceso de publicación. VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000.

XVII) AOAC. Oficial methods of analysis. 15th ed. Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990.

Libros y otras monografías

XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988. XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Autor total. VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

Publicaciones electrónicas XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accessed Jul 30, 2003.

Autor de capítulo. IX)

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor. Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

XXI) Villalobos GC, González VE, Ortega SJA. Técnicas para estimar la degradación de proteína y materia orgánica en el rumen y su importancia en rumiantes en pastoreo. Téc Pecu Méx 2000;38(2): 119-134. http://www.tecnicapecuaria.org/trabajos/20021217 5725.pdf. Consultado 30 Ago, 2003.

Memorias de reuniones. X)

XI)

Loeza LR, Angeles MAA, Cisneros GF. Alimentación de cerdos. En: Zúñiga GJL, Cruz BJA editores. Tercera reunión anual del centro de investigaciones forestales y agropecuarias del estado de Veracruz. Veracruz. 1990:51-56.

XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions. Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://www.sciencedirect. com/science/journal/03016226. Accessed Sep 12, 2003.

Olea PR, Cuarón IJA, Ruiz LFJ, Villagómez AE. Concentración de insulina plasmática en cerdas alimentadas con melaza en la dieta durante la inducción de estro lactacional [resumen]. Reunión nacional de investigación pecuaria. Querétaro, Qro. 1998:13. VIII

13. Cuadros, Gráficas e Ilustraciones. Es preferible que sean pocos, concisos, contando con los datos necesarios para que sean autosuficientes, que se entiendan por sí mismos sin necesidad de leer el texto. Para las notas al pie se deberán utilizar los símbolos convencionales.

J joule (s) kg kilogramo (s) km kilómetro (s) L litro (s) log logaritmo decimal Mcal megacaloría (s) MJ megajoule (s) m metro (s) msnm metros sobre el nivel del mar µg microgramo (s) µl microlitro (s) µm micrómetro (s)(micra(s)) mg miligramo (s) ml mililitro (s) mm milímetro (s) min minuto (s) ng nanogramo (s) P probabilidad (estadística) p página PC proteína cruda PCR reacción en cadena de la polimerasa pp páginas ppm partes por millón % por ciento (con número) rpm revoluciones por minuto seg segundo (s) t tonelada (s) TND total de nutrientes digestibles UA unidad animal UI unidades internacionales

14 Versión final. Es el documento en el cual los autores ya integraron las correcciones y modificaciones indicadas por el Comité Revisor. Los trabajos deberán ser elaborados con Microsoft Word. Las gráficas y figuras se deberán elaborar en Word, Power Point, Corel Draw y enviadas en archivo aparte (nunca insertarlas como imágenes en el texto). Los cuadros no deberán contener ninguna línea vertical, y las horizontales solamente las que delimitan los encabezados de columna, y la línea al final del cuadro. 15. Una vez recibida la versión final, ésta se mandará para su traducción al idioma inglés o español, según corresponda. Si los autores lo consideran conveniente podrán enviar su manuscrito final en ambos idiomas. 16. Tesis. Se publicarán como Artículo o Nota de Investigación, siempre y cuando se ajusten a las normas de esta revista. 17. Los trabajos no aceptados para su publicación se regresarán al autor, con un anexo en el que se explicarán los motivos por los que se rechaza o las modificaciones que deberán hacerse para ser reevaluados. 18. Abreviaturas de uso frecuente: cal cm °C DL50 g ha h i.m. i.v.

caloría (s) centímetro (s) grado centígrado (s) dosis letal 50% gramo (s) hectárea (s) hora (s) intramuscular (mente) intravenosa (mente)

versus

gravedades

Cualquier otra abreviatura se pondrá entre paréntesis inmediatamente después de la(s) palabra(s) completa(s). 19. Los nombres científicos y otras locuciones latinas se deben escribir en cursivas.

Update: January, 2016

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias is a scientific journal published in a bilingual format (Spanish and English) which carries three types of papers: Research Articles, Technical Notes, and Reviews. Authors interested in publishing in this journal, should follow the belowmentioned directives which are based on those set down by the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) Bol Oficina Sanit Panam 1989;107:422-437. 1.

Only original unpublished works will be accepted. Manuscripts based on routine tests, will not be accepted. All experimental data must be subjected to statistical analysis. Papers previously published condensed or in extenso in a Congress or any other type of Meeting will not be accepted (except for Abstracts).

All contributions will be peer reviewed by a scientific editorial committee, composed of experts who ignore the name of the authors. The Editor will notify the author the date of manuscript receipt.

Papers will be submitted in the Web site http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx, according the â&#x20AC;&#x153;Guide for submit articles in the Web site of the Revista Mexicana de Ciencias Pecuariasâ&#x20AC;?. Manuscripts should be prepared, typed in a 12 points font at double space (including the abstract and tables), At the time of submission a signed agreement co-author letter should enclosed as complementary file; coauthors at different institutions can mail this form independently. The corresponding author should be indicated together with his address (a post office box will not be accepted), telephone and Email.

To facilitate peer review all pages should be numbered consecutively, including tables, illustrations and graphics, and the lines of each page should be numbered as well.

Research articles will not exceed 20 double spaced pages, without including Title page and Tables and Figures (8 maximum). Technical notes will have a maximum extension of 15 pages and 6 Tables and Figures. Reviews should not exceed 30 pages and 5 Tables and Figures.

Title page Abstract Text Acknowledgments References Tables and Graphics 7.

Title page. It should only contain the title of the work, which should be concise but informative; as well as the title translated into English language. In the manuscript is not necessary information as names of authors, departments, institutions and correspondence addresses, etc.; as these data will have to be registered during the capture of the application process on the OJS platform (http://cienciaspecuarias.inifap.gob.mx).

Abstract. On the second page a summary of no more than 250 words should be included. This abstract should start with a clear statement of the objectives and must include basic procedures and methodology. The more significant results and their statistical value and the main conclusions should be elaborated briefly. At the end of the abstract, and on a separate line, a list of up to 10 key words or short phrases that best describe the nature of the research should be stated.

Text. The three categories of articles which are published in Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias are the following:

a) Research Articles. They should originate in primary

works and may show partial or final results of research. The text of the article must include the following parts: Introduction Materials and Methods Results Discussion Conclusions and implications In lengthy articles, it may be necessary to add other sections to make the content clearer. Results and Discussion can be shown as a single section if considered appropriate.

b) Technical Notes. They should be brief and be

evidence for technical changes, reports of clinical cases of special interest, complete description of a limited investigation, or research results which should be published as a note in the opinion of the editors. The text will contain the same

Manuscripts of all three type of articles published in Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias should contain the following sections, and each one should begin on a separate page.

information presented in the sections of t he research article but without section titles.

e. When a reference is made of a chapter of book written by several authors; the name of the author(s) of the chapter should be quoted, followed by the title of the chapter, the editors and the title of the book, the country, the printing house, the year, and the initial and final pages.

c) Reviews. The purpose of these papers is to

summarize, analyze and discuss an outstanding topic. The text of these articles should include the following sections: Introduction, and as many sections as needed that relate to the description of the topic in question.

f. In the case of a thesis, references should be made of the author’s name, the title of the research, the degree obtained, followed by the name of the City, State, and Country, the University (not the school), and finally the year.

10. Acknowledgements. Whenever appropriate, collaborations that need recognition should be specified: a) Acknowledgement of technical support; b) Financial and material support, specifying its nature; and c) Financial relationships that could be the source of a conflict of interest.

Examples The style of the following examples, which are partly based on the format the National Library of Medicine of the United States employs in its Index Medicus, should be taken as a model.

People which collaborated in the article may be named, adding their function or contribution; for example: “scientific advisor”, “critical review”, “data collection”, etc. 11. References. All references should be quoted in their original language. They should be numbered consecutively in the order in which they are first mentioned in the text. Text, tables and figure references should be identified by means of Arabic numbers. Avoid, whenever possible, mentioning in the text the name of the authors. Abstain from using abstracts as references. Also, “unpublished observations” and “personal communications” should not be used as references, although they can be inserted in the text (inside brackets).

Journals

Standard journal article (List the first six authors followed by et al.) I)

Basurto GR, Garza FJD. Efecto de la inclusión de grasa o proteína de escape ruminal en el comportamiento de toretes Brahman en engorda. Téc Pecu Méx 1998;36(1):35-48.

Issue with no volume II) Stephano HA, Gay GM, Ramírez TC. Encephalomielitis, reproductive failure and corneal opacity (blue eye) in pigs associated with a paramyxovirus infection. Vet Rec 1988;(122):6-10.

Key rules for references a. The names of the authors should be quoted beginning with the last name spelt with initial capitals, followed by the initials of the first and middle name(s). In the presence of compound last names, add a dash between both, i.e. Elias-Calles E. Do not use any punctuation sign, nor separation between the initials of an author; separate each author with a comma, even after the last but one.

III) Chupin D, Schuh H. Survey of present status of the use of artificial insemination in developing countries. World Anim Rev 1993;(74-75):26-35.

No author given

b. The title of the paper should be written in full, followed by the abbreviated title of the journal without any punctuation sign; then the year of the publication, after that the number of the volume, followed by the number (in brackets) of the journal and finally the number of pages (this in the event of ordinary article).

IV) Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994;84:15.

Journal supplement V) Hall JB, Staigmiller RB, Short RE, Bellows RA, Bartlett SE. Body composition at puberty in beef heifers as influenced by nutrition and breed [abstract]. J Anim Sci 1998;71(Suppl 1):205.

c. Accepted articles, even if still not published, can be included in the list of references, as long as the journal is specified and followed by “in press” (in brackets).

Organization, as author

d. In the case of a single author’s book (or more than one, but all responsible for the book’s contents), the title of the book should be indicated after the names(s), the number of the edition, the country, the printing house and the year.

VI) The Cardiac Society of Australia and New Zealand. Clinical exercise stress testing. Safety and performance guidelines. Med J Aust 1996;(164):282284.

In press

responsables de establecimientos destinados al sacrificio de animales. México. 1996.

VII) Scifres CJ, Kothmann MM. Differential grazing use of herbicide-treated area by cattle. J Range Manage [in press] 2000.

XVII) AOAC. Official methods of analysis. 15th ed. Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemists. 1990. XVIII) SAS. SAS/STAT User’s Guide (Release 6.03). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1988.

Books and other monographs

XIX) SAS. SAS User´s Guide: Statistics (version 5 ed.). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 1985.

Author(s) VIII) Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics: A biometrical approach. 2nd ed. New York, USA: McGraw-Hill Book Co.; 1980.

Electronic publications XX) Jun Y, Ellis M. Effect of group size and feeder type on growth performance and feeding patterns in growing pigs. J Anim Sci 2001;79:803-813. http://jas.fass.org/cgi/reprint/79/4/803.pdf. Accesed Jul 30, 2003.

Chapter in a book IX)

Roberts SJ. Equine abortion. In: Faulkner LLC editor. Abortion diseases of cattle. 1rst ed. Springfield, Illinois, USA: Thomas Books; 1968:158-179.

Conference paper X)

XI)

XXII) Sanh MV, Wiktorsson H, Ly LV. Effect of feeding level on milk production, body weight change, feed conversion and postpartum oestrus of crossbred lactating cows in tropical conditions. Livest Prod Sci 2002;27(2-3):331-338. http://www.sciencedirect.com/science/journal/030 16226. Accesed Sep 12, 2003.

12. Tables, Graphics and Illustrations. It is preferable that they should be few, brief and having the necessary data so they could be understood without reading the text. Explanatory material should be placed in footnotes, using conventional symbols. 13. Final version. This is the document in which the authors have incorporated all the corrections and modifications asked for by the editors. Graphs and figures should be submitted separately in Microsoft Word, MS Power Point, or Corel Draw. Figures must not be inserted as images within the text. In Tables do not use internal horizontal or vertical lines.

Thesis XIII) Alvarez MJA. Inmunidad humoral en la anaplasmosis y babesiosis bovinas en becerros mantenidos en una zona endémica [tesis maestría]. México, DF: Universidad Nacional Autónoma de México; 1989. XIV) Cairns RB. Infrared spectroscopic studies of solid oxigen [doctoral thesis]. Berkeley, California, USA: University of California; 1965.

14. Once accepted, the final version will be translated into Spanish or English, although authors should feel free to send the final version in both languages. No charges will be made for style or translation services.

Organization as author

15. Thesis will be published as a Research Article or as a Technical Note, according to these guidelines.

XV) NRC. National Research Council. The nutrient requirements of beef cattle. 6th ed. Washington, DC, USA: National Academy Press; 1984.

16. Manuscripts not accepted for publication will be returned to the author together with a note explaining the cause for rejection, or suggesting changes which should be made for re-assessment.

XVI) SAGAR. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. Curso de actualización técnica para la aprobación de médicos veterinarios zootecnistas

XII

mm min ng

millimeter (s) minute (s) nanogram (s) P probability (statistic) p page CP crude protein PCR polymerase chain reaction pp pages ppm parts per million % percent (with number) rpm revolutions per minute sec second (s) t metric ton (s) TDN total digestible nutrients AU animal unit IU international units

17. List of abbreviations: cal cm Â°C DL50 g ha h i.m. i.v. J kg km L log Mcal MJ m Âľl Âľm mg ml

calorie (s) centimeter (s) degree Celsius lethal dose 50% gram (s) hectare (s) hour (s) intramuscular (..ly) intravenous (..ly) joule (s) kilogram (s) kilometer (s) liter (s) decimal logarithm mega calorie (s) mega joule (s) meter (s) micro liter (s) micro meter (s) milligram (s) milliliter (s)

versus

gravidity

The full term for which an abbreviation stands should precede its first use in the text. 18. Scientific names and other Latin terms should be written in italics.

XIII

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Editorial Como es una costumbre, la Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias brinda en éste número una variedad de temas de actualidad referidas a diferentes especies presentando resultados de investigación en parasitología, virología, aspectos reproductivos, alimentación y comercialización; en diferentes especies pecuarias, tales como ganado lechero, ganado de carne, ovinos, caprinos y abejas, lo que hace muy atractivo éste número a nuestro público lector. En particular la portada de éste número la dedicamos a la especie apícola debido a la investigación realizada por el grupo de investigadores del CENID-Fisiología y Mejoramiento Animal, que mantienen el Banco de Germoplasma Apícola del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias en Ajuchitlán, Querétaro. Por otro lado, en días pasados Scielo-México dio a conocer los resultados de la última evaluación de las Revistas Científicas Mexicanas que aparecen indizadas en el Journal Citation Reports; y según los resultados de esta última calificación, por séptimo año consecutivo nuestra revista tuvo un incremento en el Factor de Impacto alcanzando el puntaje de 0.768. Con este resultado nuestra revista ocupa el 12° lugar entre las Revistas Científicas Nacionales y alcanza el mejor Factor de Impacto entre las revistas de especialidad agropecuaria. Todas las personas que participamos de una u otra forma para la revista, recibimos esta noticia con agrado y nos motiva para impulsar nuevas energías para continuar con entusiasmo, ética y profesionalismo, con el afán de conservar el prestigio y calidad que desde hace mucho tiempo posee la Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias.

Arturo García Fraustro Editor en Jefe

XIV

https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4538 Artículo

Detección de Neospora caninum en ganado lechero sacrificado en Aguascalientes, México Detection of Neospora caninum from slaughtered dairy cattle in Aguascalientes, Mexico

Leticia Esperanza Medina Esparzaa* Ricardo de Luna Osegueraa Irene Victoria Vitela Mendozaa Carlos Cruz Vázqueza

Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes, Tel.: +52 449 962 11 00; fax: +52 449 962 11 00, Km 18 carretera Aguascalientes - San Luis Potosí, El Llano, 20330, Aguascalientes, México.

* Autor de correspondencia: lmedinaesparza@yahoo.com.mx

Resumen: Con el objetivo de detectar la presencia de Neospora caninum en tejidos, suero y sangre periférica de ganado lechero sacrificado en rastros de Aguascalientes, México, se colectaron muestras de médula espinal, corazón, hígado, sangre y suero sanguíneo de 71 animales adultos. Las muestras de suero se procesaron mediante la prueba de ELISA para detectar anticuerpos anti-N. caninum, mientras que las otras se sometieron a la prueba de PCR anidado para determinar la frecuencia de ADN del parásito en los diferentes tejidos, así como en sangre. La frecuencia general de animales seropositivos fue de 41 % (29/71; IC 95% 29-53) con un rango de 33 a 57 %. La frecuencia de detección de ADN de N. caninum en sangre fue 44 % (31/71; IC 95% 32-55), con un rango entre 38 y 50 %; en las muestras de médula espinal de 32 % (27/71; IC 95% 2750), con un rango de 2 a 38 %; en las muestras de corazón, 22 % (16/71; IC 95% 13 34), con un rango de 4 a 33 %; y en las de hígado, 32 % (23/71; IC 95% 22-44), con un

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rango de 28 a 57 %. La concordancia entre la prueba de ELISA y la de PCR en sangre fue k= 0.36, de ELISA y PCR en tejidos k= 0.07 y de PCR en sangre y PCR en tejidos k= 0.61. Únicamente 11 vacas fueron positivas a las tres pruebas. Palabras clave: Neospora caninum, Ganado lechero, ADN, PCR, Sangre, Tejidos.

Abstract: The objective was to detect the presence of Neospora caninum in tissues, serum and peripheral blood of slaughtered dairy cattle in abattoirs of Aguascalientes, Mexico. Samples of spinal cord, heart, liver, blood and blood serum were collected from 71 adult animals and were processed as follow. Serum samples were processed by ELISA to detect anti-N. caninum antibodies, while the others were subjected to the nested PCR test to determine the frequency of parasite DNA in different tissues as well as blood. Overall frequency of seropositive animals was 41 % (29/71, 95% CI 29-53) with a range of 33 to 57 %. The frequency of detection of N. caninum DNA in the blood was 44 % (31/71, 95% CI 32-55), with a range between 38 and 50 %; in spinal cord samples of 32 % (27/71, 95% CI 27-50), with a range of 2 to 38 %; in heart samples, 22 % (16/71, 95% CI 13-34), with a range of 4 to 33 %, and in the liver samples, 32 % (23/71, 95% CI 22- 44), with a range of 28 to 57 %. The concordance between the ELISA test and PCR in blood was k= 0.36, of ELISA and PCR in tissues k= 0.07 and of PCR in blood and PCR in tissues k = 0.61. Only eleven cows were positive for all three tests . Key words: Neospora caninum, Dairy cattle, DNA, PCR, Blood, Tissues.

Recibido 24/06/17. Aceptado 08/11/2017.

Introducción

Neospora caninum (Apicomplexa, Sarcocystidae), es un parásito protozoario que afecta a una amplia variedad de animales domésticos y silvestres; es particularmente importante en el ganado, ya que puede causar abortos, muerte neonatal, muerte fetal y reabsorción

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embrionaria temprana; afecta principalmente al ganado productor de leche y se encuentra ampliamente distribuido en Europa, Asia, África y en el Continente Americano, provocando cuantiosas pérdidas económicas. El ciclo de vida de N. caninum es heteroxeno, en el cual el perro doméstico y el coyote aparecen como los principales huéspedes definitivos, mientras que el ganado y un amplio rango de animales, tanto domésticos como silvestres, pueden actuar como huéspedes intermediarios. Los herbívoros pueden infectarse mediante la ingestión de alimento y agua contaminados con ooquistes excretados por el huésped definitivo, en tanto que las hembras crónicamente infectadas, así como las infectadas horizontalmente, pueden transmitir el parásito al feto a través de la placenta con una elevada eficiencia (1-4). La infección transplacentaria endógena puede causar muerte del feto en el útero, aborto o el nacimiento de crías clínicamente enfermas o clínicamente sanas pero persistentemente infectadas, siendo estas últimas las que en la edad adulta actúan como agentes que permiten el mantenimiento de la infección en el hato(5). Diversos estudios han documentado la respuesta inmune a N. caninum tanto a la infección aguda como a la crónica (recrudescencia), y mediante técnicas moleculares se ha detectado ADN del parásito en muestras de tejidos de fetos abortados(2,6); sin embargo, son limitados los estudios en donde se demuestra la presencia de ADN de N. caninum en muestras de tejidos provenientes de animales con infección natural asintomáticos, aunque ha sido posible aislar el parásito de becerros y vacas naturalmente infectados(2,7-9). El objetivo del presente estudio fue detectar la presencia de anticuerpos anti- N. caninum en suero, y de ADN en sangre periférica y tejidos de ganado lechero sacrificado en tres rastros de Aguascalientes, México.

Material y métodos

Sitio de estudio

El trabajo se desarrolló en tres rastros, uno municipal y dos particulares, localizados en el municipio de San Francisco de los Romo, en el estado de Aguascalientes, México, el cual se encuentra localizado en la región centro-norte de México; en estos

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establecimientos se sacrifica ganado bovino proveniente de los once municipios del mismo estado.

Colecta de muestras

Se asistió una vez por mes a cada uno de los rastros durante un periodo de tres meses; durante cada visita se seleccionaron al azar solamente las vacas adultas que de acuerdo con los registros del rastro provenían de establos lecheros ubicados en el estado de Aguascalientes. Antes del sacrificio se identificó a cada una de las vacas que se incluyó en el estudio y se procedió a colectar una muestra de sangre periférica con equipo Vacutainer nuevo sin anticoagulante y otra en tubos adicionados con EDTA. Después del sacrificio, se tomaron de manera aséptica muestras de médula espinal al momento de la decapitación, así como de corazón e hígado durante la evisceración de la canal. Todos los materiales usados en la colección de los tejidos se desinfectaron antes de cada toma de muestra con una solución de hipoclorito de sodio (2.5%) y se lavaron con agua destilada. Todas las muestras debidamente identificadas se transportaron en condiciones de refrigeración al laboratorio de Sanidad Fitopecuaria del Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes, en donde las muestras de tejido y sangre con EDTA se congelaron a -40 oC hasta su uso; en tanto que de las muestras de sangre sin anticoagulante, se obtuvo el suero sanguíneo mediante centrifugación a 1,000 xg por 15 min; el suero se colocó en viales Eppendorf y se congeló a -20 oC hasta su uso.

Prueba serológica

Un total de 71 muestras de suero sanguíneo se procesaron mediante la técnica de ELISA indirecta para detectar anticuerpos anti-N. caninum, empleando un paquete comercial (IDDEX Neospora X2, IDDEX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante; el punto de corte para considerar una muestra positiva fue de > 0.50. Los cálculos se realizaron con el software provisto por el fabricante. 411

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Extracción de ADN

La obtención de ADN de las muestras de sangre se realizó mediante el uso del paquete comercial Ultraclean DNA BloodSpin (MOBIO Laboratories Inc.), siguiendo las instrucciones del fabricante. En tanto que el ADN de las muestras de médula espinal, corazón e hígado se obtuvo mediante una extracción “in house”, de forma aséptica, de la siguiente forma: una muestra de aproximadamente 4 cm3 del tejido congelado se trituró en un mortero estéril, de aquí se tomó 1 ml y se colocó en un tubo Eppendorf al que se agregaron 500 µl de buffer de lisis (Tris 10 mM pH 8.0; NaCl 0.4 M; Na2EDTA 2 mM pH8.0), 50 µl de SDS 10% y 20 µl de proteinasa K (20 mg/ml); los tubos se incubaron a 55 oC durante 24 h y posteriormente se agregaron 20 µl de proteinasa K (20 mg/ml) y se incubaron por 3 h más. Al término de este tiempo se agregaron 200 µl de NaCl 5M y los tubos se centrifugaron a 1,300 xg por 15 min recuperando el sobrenadante y colocándolo en un tubo Eppendorf nuevo, al cual se añadieron 760 µl de isopropanol frío mezclando suavemente hasta homogenizar, dejando reposar 10 min a 4 oC. Luego se centrifugaron los tubos a 1,300 xg por 15 min descartando el sobrenadante. La pastilla obtenida se lavó con 1 ml de etanol al 70% y se centrifugó a 1,000 xg por 10 min, retirando con cuidado el etanol dejando secar la pastilla a temperatura ambiente durante 30 min; el ADN fue resuspendido en 100 µl del buffer TE.

Detección de ADN

Las muestras de ADN de los 71 animales, se procesaron mediante PCR anidado en un solo tubo, siguiendo el protocolo de Ellis et al(10) utilizando los iniciadores NF1, NS2, NR1 y SR1, con controles positivos y negativos (11). La concentración de ADN de cada muestra se verificó utilizando un espectrofotómetro de luz UV y 5 µl de la muestra conteniendo 2 µg de ADN se usó en la PCR. Los productos de la amplificación fueron resueltos en un gel de agarosa al 2.5% junto con un marcador de peso molecular (Phix 174 DNA, Invitrogen Inc.) para estimar el peso de los productos; los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron utilizando luz UV. Todos los procedimientos se llevaron

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a cabo en una cámara con luz UV utilizando material nuevo estéril en cada muestra. Se consideró como positiva una muestra si se amplificaba una banda de 146 pb.

Análisis de los datos

Se calculó la frecuencia de animales que resultaron positivos a la presencia de anticuerpos anti-N. caninum, así como la frecuencia de la detección de ADN en sangre periférica, médula espinal, corazón e hígado. Se calculó el coeficiente kappa con el objetivo de estimar la concordancia entre las pruebas (P<0.05).

Resultados

La frecuencia de casos positivos a la presencia de anticuerpos anti-N. caninum fue 41 % (29/71; IC 95% 29-53), con un rango de 33 a 57 %; estos animales provenían de establos lecheros de cuatro de los once municipios del estado. El 49 % de los animales procedían del municipio de Aguascalientes; sin embargo, la frecuencia más alta correspondió a los animales provenientes del municipio de Pabellón de Arteaga (Cuadro 1).

Cuadro 1: Detección de N. caninum en tejidos y suero sanguíneo de vacas sacrificadas en tres rastros del estado de Aguascalientes, México, mediante pruebas de PCR y ELISA Municipio Aguascalientes

Animales Frecuencia PCR sangre examinados (%) Frecuencia (%)

PCR médula Frecuencia (%)

PCR corazón PCR hígado Frecuencia (%) Frecuencia (%)

Pabellón de A.

San Francisco

Jesús María

Total

413

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La frecuencia de la detección de ADN de N. caninum en sangre fue de 44 % (31/71; IC 95% 32-55), con un rango entre 38 y 50 %; la frecuencia más alta se detectó en las vacas del municipio de Jesús María. Se examinaron 213 muestras de tejido provenientes de las 71 vacas incluidas en el estudio; ningún animal se encontró gestante. En las muestras de médula espinal, la frecuencia de detección de ADN del parásito fue de 32 % (27/71; IC 95% 27-50), con rango 2 a 38 %. En las muestras de corazón, la frecuencia fue de 22 % (16/71; IC 95% 13-34), con rango de 4 a 33 %, y en las muestras de hígado, la frecuencia fue 32 % (23/71; IC 95% 22-44) con rango de 28 a 57 %. La concordancia entre las pruebas de ELISA y PCR para la detección de ADN en sangre fue k= 0.36 (IC 95% 13-59); se encontró que 27 % (19/71; IC 95% 17-38) de las vacas resultaron positivas a ambas pruebas. La concordancia entre ELISA y PCR en tejidos fue k= 0.07 (IC 95% 15-30); el 20 % (14/71; IC 95% 11-31) de las muestras fueron positivas a la prueba serológica y al menos uno de los tejidos a PCR. La concordancia entre PCR en tejidos y en sangre fue k= 0.61 (IC 95% 40-83); 31 % (22/71; IC 95% 2043) fueron positivas a ambas pruebas. En los animales estudiados se observó que 15 % (11/71; IC 95% 8-26) fueron positivos a todas las pruebas, 1 % (1/71; IC 95% 0.07-8) a la prueba de PCR en tejidos, 28 % (20/71; IC 95% 18-40) a la prueba de PCR en sangre, 25 % (18/71; IC 95% 16-37) a la prueba de ELISA y 30 % (21/71; IC 95% 19-41) fueron negativos a las tres pruebas.

Discusión

En México, la neosporosis bovina es actualmente considerada endémica y con una amplia distribución geográfica (12,13), mientras que en el estado de Aguascalientes, México, se ha reportado en el ganado lechero una alta proporción de animales positivos a la presencia de anticuerpos anti-N. caninum, que ha estado en un rango de 30 a 59 %, mientras que en los perros asociados a los establos la proporción ha sido de 40 % (14-17); además, utilizando herramientas moleculares se ha confirmado una alta frecuencia en fetos abortados (80 %), así como una diversidad genética singular (11,18). La frecuencia general de animales seropositivos que se observó en el presente estudio fue 41 %, mientras que los resultados obtenidos en las pruebas de PCR en médula espinal e hígado mostraron que 32 % de los animales fueron positivos, en corazón el 22 %, en tanto que la frecuencia de detección de ADN en sangre fue de 44 %.

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La frecuencia general de animales seropositivos que se determinó en este trabajo, se ubica dentro del rango que históricamente se ha registrado en el estado de Aguascalientes, que ha sido entre el 30 y 59 % (14,15,17) y la también elevada frecuencia del hallazgo de ADN en las muestras de tejido analizadas y en sangre periférica, confirman que el ganado estuvo expuesto a la infección por N. caninum; es entonces evidente que la presencia de la infección por este parásito se ha mantenido elevada en los municipios que integran la cuenca lechera de Aguascalientes, y que por ello el riesgo de aborto así como de la transmisión endógena del parásito a las crías debe de considerarse importante como ha sido sugerido en la literatura (19) y en trabajos previos desarrollados en Aguascalientes (14,17). Las vacas lecheras incluidas en este trabajo, fueron enviadas al rastro por causas que no pudieron ser documentadas al llegar al mismo, pero todas ellas en la revisión ante-mortem se observaron clínicamente sanas y post-mortem no se encontraron gestantes, es decir, eran animales asintomáticos a la infección por N. caninum. Interesante, que en este estudio se identificaron animales seronegativos pero positivos a PCR en sangre (14 %) o en tejidos (24 %), lo que sugiere que la frecuencia de animales seropositivos a N. caninum puede estar subestimada. En un estudio desarrollado en vaquillas de carne, se encontraron resultados similares, animales seronegativos pero positivos a la detección de ADN en cerebro (7), y cuando en el rastro fueron estudiadas post-mortem vacas seronegativas, se encontraron sus fetos positivos a la presencia de ADN (20). La interpretación de este tipo de hallazgos sigue siendo controversial; la existencia de animales seronegativos pero positivos a la presencia de ADN en sangre sugiere una infección temprana o tolerancia inmunológica(21); la presencia de ADN del parásito en sangre es indicativo de una infección activa que puede inducir el aborto o la transmisión endógena del parásito a las crías independientemente del estatus serológico de los animales, es decir, que ganado seronegativo puede tener crías seropositivas debido a que sufren una infección crónica(20,22). La concordancia entre la prueba de ELISA y la de PCR en sangre fue k= 0.36, considerada mediana; en otros estudios este valor ha tendido a ser de pobre a moderado(21,23,24). En la literatura se ha documentado que la circulación de taquizoitos de N. caninum en sangre periférica es pulsatil (25,26), por lo que esta prueba debe de complementarse con alguna otra de tipo serológico. La concordancia entre la prueba de ELISA y PCR en tejidos fue k= 0.07, es leve; sin embargo, en la literatura se indica que vacas seropositivas tendrían fetos positivos a la prueba de PCR en tejido encefálico y más probabilidades de abortar (19,20). En cuanto a la concordancia entre las pruebas de PCR en sangre y PCR en tejidos el coeficiente fue k= 0.61, considerado moderado; como se comentó, cuando se detecta ADN en sangre es indicativo de una infección activa (25,26). Esta concordancia puede tomarse como un indicador para revalorar el uso de la detección de ADN en sangre en animales vivos como adecuado marcador de una infección activa, y que si se combina con la prueba serológica de IFI considerando títulos >1:1600(5),

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pueden indicar altas probabilidades de transmisión transplacentaria y eventualmente el riesgo de aborto. Finalmente, debe mencionarse que únicamente 15 % (11/71) de los animales resultaron positivos a las tres pruebas, dato que concuerda con los coeficientes de concordancia observados. Hasta donde se sabe, éste es el primer reporte sobre la detección de ADN de N. caninum en animales naturalmente infectados y asintomáticos después de su sacrificio, y se considera que los resultados obtenidos son un reflejo de la situación que guarda la infección por este parásito en los hatos lecheros del estado de Aguascalientes.

Conclusiones e implicaciones

Este trabajo permitió detectar en animales asintomáticos post-mortem la presencia de la infección por N. caninum, lo que contribuye a documentar la situación epidemiológica de la misma en una zona ganadera con alta exposición al parásito. La identificación de una alta proporción de animales positivos a la infección conlleva el riesgo de aborto y de transmisión endógena a las crías, lo que permite la perpetuación de la enfermedad en los hatos ganaderos.

Agradecimientos

Se agradece a las autoridades administrativas de los rastros en que se desarrolló el trabajo, así como al personal de los mismos por las facilidades otorgadas. Este proyecto fue financiado por el Tecnológico Nacional de México (4559.12-P).

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4364 Artículo

Frecuencia de casos e identificación molecular de Cryptosporidium spp. en corderos lactantes mantenidos en pastoreo en el estado de Veracruz, México Cases frequency and molecular identification of Cryptosporidium spp. in lactating lambs kept grazing in the State of Veracruz, Mexico

Irene Vitela-Mendozaa* Victor Guillen Lorenzoa Carlos Cruz-Vázqueza Leticia Medina-Esparzaa Miguel Ramos Parraa

El Llano Aguascalientes, Km. 18 carretera Aguascalientes-San Luis Potosí, 20330, El Llano, Aguascalientes, México. Tel. 449 962 1100.

* Autor de correspondencia: vitelairene@yahoo.com.mx

Resumen: El objetivo fue determinar la frecuencia de la infección por Cryptosporidium spp., y realizar la identificación de especie o genotipo de los ooquistes en corderos lactantes Pelibuey, Black Belly y Katahdin mantenidos en pastoreo en la región de la Huasteca Alta del estado de Veracruz, México. Las muestras de excremento se recolectaron de 210 corderos de 7 a 21 días de edad, procedentes de 21 granjas; se procesaron mediante frotis fecal teñido con Kinyoun y por PCR anidada para amplificar la región del gen 18S rARN del parásito (830 pb); las muestras positivas fueron secuenciadas. La frecuencia de corderos positivos a Cryptosporidium spp., por microscopía fue 19.5 % (41/210), con una escala entre rebaños de 10 a 50 %; en tanto que por técnicas moleculares fue de 26.8 % (11/41) con un intervalo de 14 a 50 %; las demás muestras fueron negativas a ambas pruebas. Las 11 muestras

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secuenciadas tuvieron una homología del 100 % con la región 18S rARN de C. parvum. Estos resultados confirman la importancia de C. parvum como principal agente de la criptosporidiosis en corderos lactantes y su amplia distribución en esta región de México. Esta identificación destaca que las ovejas pueden considerarse como una fuente potencial notable de criptosporidiosis humana, porque se considera una enfermedad zoonótica, principalmente para las personas que manipulan los rebaños. Palabras clave: Cryptosporidium parvum, Corderos, Frecuencia, Genotipificación.

Abstract: The objective was to determine the frequency of Cryptosporidium spp., and to identify the species or genotype of the oocysts found, in suckling lambs kept grazing in the Huasteca Alta region, State of Veracruz, Mexico. Fecal samples were collected from 210 lambs Pelibuey, Black Belly, and Katahdin, 7 to 21 d old from 21 sheep farms. Samples were stained with Kinyoun, nested PCR was used to amplify the 18S rRNA gene region of the parasite (830 bp), and positive samples were sequenced. The frequency of animals positive to Cryptosporidium spp by microscopy was 19.5 % (41/210), with a 10 to 50 % range among herds; with molecular techniques, the frequency of positive lambs was 26.8 % (11/41) with a 14 to 50 % range; all other samples were negative to both tests. All 11 samples sequenced showed 100 % homology with the 18S rRNA region of C. parvum. Results confirm the relevance of C. parvum as a major etiology of cryptosporidiosis in lactating lambs and show its broad distribution in this region of Mexico. This identification highlights that sheep can be considered as a significant potential source of human cryptosporidiosis, since it is considered a zoonotic disease, mainly for the people handling the flocks. Key words: Cryptosporidium parvum, Lambs, Frequency, Genotyping.

Recibido 07/02/2017 Aceptado 12/12/2017

Introducción

Cryptosporidium spp., es un parásito protozoario que causa infección entérica en varias especies animales, así como en los seres humanos, y es un importante problema de salud 421

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animal, así como de salud pública, principalmente en individuos jóvenes o inmunocomprometidos; los ooquistes del parásito son resistentes al medio ambiente y pueden contaminar agua y alimentos(1,2,3). En los ovinos, la criptosporidiosis se presenta con un cuadro de diarrea de leve a severa, de color amarillento con un fuerte olor, acompañada de dolor abdominal, pérdida de peso, depresión, y eventualmente la muerte; es más frecuente en corderos lactantes a partir de su nacimiento y hasta un mes de edad(4,5). Cryptosporidium spp., es uno de los principales patógenos entéricos asociados con diarrea neonatal y mortalidad en corderos; los borregos adultos asintomáticos son una importante fuente de infección para los animales jóvenes y la principal condición de diseminación dentro de la granja(6). Las especies de Cryptosporidium identificadas en ovinos son: C. parvum, C. xiaoi y C. ubiquitum, aunque C. andersoni y C. fayeri también se reportan(2,7,8); C. parvum es una especie zoonótica(9,10). A la fecha, no se han reportado tratamientos efectivos contra este parásito(3,11). El diagnóstico de la infección por Cryptosporidium mediante métodos moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido identificar especies y genotipos del parásito, así como caracterizar la dinámica de transmisión de la infección en los seres humanos y en los animales(10,12). Así, se conoce la distribución geográfica de las especies y la diversidad genética del parásito. En el ganado ovino se han reportado diferentes especies de Cryptosporidium en EUA, Reino Unido, Italia, Bélgica, España, Túnez, China, Australia y Brasil, principalmente(12,13). Los análisis moleculares han confirmado que C. parvum infecta de forma natural a corderos y cabritos(14). En México, este parásito se identificó por primera vez en bovinos lactantes en el año de 1983, mediante microscopía(15); sin embargo, en el país hay pocos estudios sobre la infección por Cryptosporidium spp., en ovinos(5,15). El objetivo de la investigación fue determinar la frecuencia de la infección por Cryptosporidium spp., en corderos lactantes de razas de pelo, mantenidos en pastoreo en la región de la Huasteca Alta del estado de Veracruz, México, y realizar la identificación de la especie de los ooquistes encontrados, utilizando herramientas moleculares.

Material y métodos

Sitio de estudio

El estudio se desarrolló en la región de la Huasteca Alta del estado de Veracruz, México, la cual se localiza en la zona norte del estado, en las coordenadas 21º46´ N y 98º27´ O, a una altura de 1 a 150 msnm. Está integrada por siete municipios: Pánuco, Tampico Alto,

422

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Tempoal, Ozuluama, Tantoyuca, Naranjos y Tamiahua (Figura 1). La temperatura media anual es 24.4 °C y la precipitación promedio anual es de 1,239 mm. La región cuenta con diversidad climática amplia, que va del clima cálido-extremoso al templado subhúmedo(16).

Figura 1: Región de la Huasteca Alta del estado de Veracruz, México, municipios incluidos en la investigación

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Panuco Tampico alto Tempoal Ozuluama Tantoyuca Naranjos Tamiahua

Granjas y manejo de animales

La región de la Huasteca Alta cuenta con 6,678 ovejas en etapa reproductiva y 1,991 corderos(17). El método epidemiológico de conveniencia de Thrusfield(18), se usó para seleccionar el 10 % de la población de corderos; 21 granjas de ganado ovino distribuidos en 423

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siete municipios de la región bajo estudio, Panuco, Tampico Alto, Tempoal, Ozuluama, Tantoyuca, Naranjos y Tamiahua, tres granjas por cada uno de ellos; la inclusión de las granjas fue en función de que contaran con ovinos encastados de razas de pelo, principalmente Pelibuey, Black Belly y Katahdin, y que los productores mostraran interés por participar en el estudio. Los ovinos se mantuvieron bajo un sistema de libre pastoreo en praderas naturales o cultivadas, o ambas, con pastos estrella (Cynodon plectostachyus), pangola (Digitaria decumbens), guinea (Panicum maximun) y brizantha (Brachiaria brizantha), sin ningún control reproductivo, y sin aplicar prácticas de manejo y control sanitario.

Toma de muestras

Las granjas se visitaron en una sola ocasión, eligiendo al azar diez animales clínicamente sanos de la población de corderos que tuviera entre 7 y 21 días de edad, ya que en este intervalo de edad son más susceptibles a la infección(11). Se tomaron muestras de excremento directamente del recto, anotando el nombre de la granja, identificación del animal y su edad; las muestras se conservaron a 4 °C, y se procesaron en el laboratorio dentro de 24 a 72 h después de colectada la muestra.

Limpieza y concentración de las muestras fecales

Previo al diagnóstico microscópico y molecular, se realizó la limpieza de las muestras fecales(2), tomando 15 g de heces de cada muestra que se transfirieron a tubos de 50 ml que contenían 35 ml de agua destilada (dH2O). El contenido de cada tubo se mezcló vigorosamente durante 2 min, pasando la muestra a través de una malla de poro de 50 mm a un segundo tubo de 50 ml, y el volumen final se ajustó a 50 ml con dH 2O. Los tubos se centrifugaron a 1,800 xg durante 15 min, y el sobrenadante se desechó; el sedimento se suspendió de nuevo en 25 ml de dH2O y se mezcló vigorosamente durante 2 min. Se añadieron 25 ml de cloruro de cesio (CsCl) a una concentración de 1.4 g L-1 en cada tubo y 424

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se centrifugó a 300 xg durante 20 min. Solamente 4 ml de sobrenadante se aspiraron de la parte superior de cada muestra, los cuales se transfirieron a un tubo de centrífuga, y se agregó dH2O hasta obtener un volumen final de 15 ml. Las muestras se centrifugaron a 1,800 xg durante 15 min y se lavó el material dos veces con dH2O, posteriormente el pellet final fue resuspendido en 500 µl de dH2O.

Diagnóstico microscópico

Un frotis fecal se realizó con 100 µl del material concentrado previamente con CsCl, diluyendo la muestra 1:1 con agua oxigenada. Después se dejó secar por 24 h a temperatura ambiente (25 °C), se procesaron mediante la técnica de tinción ácido-alcohol resistente de Kinyoun(19), y se observó el frotis en un microscopio (LCD Digital, Leica®) a 100X. La muestra se consideró negativa al no observar ningún ooquiste después de revisar seis campos microscópicos en cada portaobjetos (laminilla de vidrio 75 mm x 26 mm); con la finalidad de minimizar las lecturas de falsos positivos la muestra se consideró positiva cuando se observaron al menos ≥ 5 ooquistes de Cryptosporidium spp., los cuales se presentan de forma esférica y teñidos de color rosa brillante(20).

Extracción de ADN

La extracción de ADN total de cada muestra se realizó a partir del material concentrado previamente con CsCl, utilizando el paquete comercial DNeasy Tissue Kit (Qiagen®, Valencia, CA), de acuerdo a lo recomendado por el proveedor(11).

425

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Amplificación del Gen 18S rARN.

Un fragmento de la región 18S rARN del gen de Cryptosporidium spp., se amplificó utilizando una PCR anidada con los iniciadores descritos Xiao et al(21), (5'-TTCTAGAGC TAATACATGCG-3' y 5'- CCCTAATCCTTCGAAACAGGA-3' para la PCR primaria, y 5’GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3’ y 5’-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA3’ para la PCR secundaria. Para la primera PCR, la reacción contenía: buffer 1X de PCR (Sigma-Aldrich®); MgCl2, 3 mM (Sigma-Aldrich®); dNTP (Invitrogen® Life Technologies), 0.2 mM de cada uno; Taq polimerasa (Invitrogen® Life Technologies) 2.5 U; Albumina sérica bovina (BSA; Sigma-Aldrich ®) 2.5 ml (0.1 g/10 ml) y 1 µM de cada iniciador (New England Biolabs, Beverly, MA), en un volumen de 50 µl de reacción. La mezcla se sometió a 35 ciclos, cada uno de 94 °C durante 45 seg, 59 °C durante 45 seg, y 72 °C durante 1 min, un arranque en caliente a 94 °C durante 3 min. También se incluyó un paso de extensión final a 72 °C por 7 min. Para la segunda PCR la reacción fue idéntica a la primera, excepto que se utilizó una concentración de 1.5 mM de MgCl2. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 40 ciclos de 94 °C durante 30 seg, 58 °C durante 90 seg, y 72 °C durante 2 min, con un arranque en caliente a 94 °C durante 3 min y una etapa de extensión final de 72 °C durante 7 min, utilizando un Termociclador Bio-Rad® T100. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% en TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA). El marcador de peso molecular utilizado fue de 1 kb (Invitrogen®) para identificar la banda correspondiente a 830 pb. Controles positivos y negativos se incluyeron en todos los casos. Después se tiñó el gel con bromuro de etidio a una concentración de 5 mg ml-1 durante 15 min. Los resultados de esta fase se observaron en un Transiluminador Bio Doc.it Imagin System®.

Identificación molecular

Las muestras identificadas como positivas a Cryptosporidium spp., se purificaron con el paquete comercial Min Elute PCR Purification Kit, (Qiagen®, Valencia, CA). Las muestras purificadas se secuenciaron en ambos sentidos, utilizando los iniciadores ya descritos, con el sistema de secuenciación BigDye Terminator Cycle Sequencing utilizado en el equipo 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), en el Laboratorio Nacional de Genómica (CINVESTAV Unidad Irapuato, Guanajuato, México). Las secuencias obtenidas en el 426

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estudio fueron alineadas y comparadas por homología con las reportadas en el GenBank, empleando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tools)(22).

Análisis de la información

La frecuencia de corderos positivos a la presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp., se calculó en el total de las muestras, por municipio y por granja incluida en el estudio, así como por intervalo de edad de los corderos, considerando los resultados obtenidos por microscopia y por técnicas moleculares.

Resultados

La técnica parasitoscópica de frotis fecal teñido por el método de Kinyoun, permitió identificar 41 muestras positivas a Cryptosporidium spp. La frecuencia general de casos fue de 19.5 % (41/210; IC 95% 14-25). La frecuencia entre rebaños varió de 10 a 50 % (Cuadro 1), existiendo 62 % (13/21) de las granjas con al menos un cordero infectado. En el grupo de corderos de 7 a 14 días de edad se identificó una frecuencia de 10.4 % (22/210; IC95% 6-15) mientras que en el grupo de 15 a 21 días fue 9 % (19/210; IC95% 5-13). En los siete municipios estudiados se encontraron corderos positivos a la presencia de ooquistes del parásito; la frecuencia en los municipios se presentó en un rango de 6.7 % (2/30; IC95% 123) en Pueblo Viejo a 36.7 % (11/30; IC95% 20-56) en Tamiahua (Cuadro 2).

427

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Cuadro 1: Frecuencia de Cryptosporidium spp., en la región de la Huasteca Alta de Veracruz, México, distribuida por granja y grupo de edad Frecuencia por grupo de edad (%) 7-14 15-21

Frecuencia por granja (%)

Granja

Edad 7-14 días +

Naranjos

1 2 3

0 4 3

10 6 7

0 3 1

0 1 2

13.3

10.0

0 40 30

Ozuluama

1 2 3

4 0 4

6 10 6

2 0 1

2 0 3

16.6

40 0 40

Pánuco

1 2 3

3 0 1

7 10 9

2 0 0

1 0 1

6.6

30 0 10

Pueblo viejo

1 2 3

0 2 0

10 8 10

0 0 0

0 2 0

6.6

0 20 0

Tamiahua

1 2 3

3 3 5

7 7 5

2 2 2

1 1 3

16.6

30 30 50

Tantoyuca

1 2 3

2 4 0

8 6 10

2 3 0

0 1 0

3.3

20 40 0

Tempoal

1 2 3

0 3 0

10 7 10

0 2 0

0 1 0

6.6

3.3

0 30 0

Total

41 169

10.4

9.0

Municipio

Edad 15- 21 días -

16.7

Cuadro 2: Frecuencia de Cryptosporidium spp., detectada por microscopía y de identificación de C. parvum mediante PCR, en corderos n

Cryptosporidium spp. (microscopía)

Frecuencia (%)

C. parvum (PCR)

Frecuencia (%)

Naranjos Ozuluama

30 30

7 8

23.4 26.6

7 8

1 2

14.2 25.0

Pánuco

13.3

25.0

Pueblo viejo

6.7

Tamiahua

36.7

36.3

Tantoyuca

20.0

50.0

Tempoal

10.0

Total

210

19.5

Municipio

428

26.8

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Del total de muestras recolectadas, 11 resultaron positivas por microscopía y por la prueba de PCR anidada, mientras que 30 muestras positivas por microscopía no amplificaron el segmento en la prueba de PCR anidada; el resto de las muestras fueron negativas en ambas pruebas, arrojando una frecuencia de 26.8 % (11/41; IC95% 4-43) de muestras que amplificaron el segmento, observándose que por municipios se tuvo un rango de 14.3 % (1/7; IC95% .07-58) a 50 % (3/6; IC95% 13-86) (Cuadro 2). La identificación de la especie de Cryptosporidium presente en las muestras de ADN de los corderos positivos por microscopía, mostró que tuvieron una homología del 100 % para C. parvum (Accesión GenBank AF093493). Seis muestras positivas a C. parvum correspondieron al grupo de corderos de 7 a 14 días de edad y cinco al grupo de 15 a 21 días de edad. No fue posible identificar alguna otra especie o genotipo en las muestras.

Discusión

La infección por Cryptosporidium spp., se caracteriza por afectar primordialmente a los animales neonatos y se ha estudiado en bovinos, pero en ovinos está poco documentada, en particular en sistemas de pastoreo(23). Algunos estudios han mostrado la frecuencia de Cryptosporidium utilizando diversas técnicas de diagnóstico. En México la información sobre la frecuencia de la infección en ovinos es escasa; un estudio desarrollado en el Estado de México realizado en 37 granjas con corderos estabulados se identificó una prevalencia de 34.3 %(15), y en el municipio de Perote, Veracruz, México, en ovinos de razas de pelo mantenidos en sistemas de pastoreo se identificó, una prevalencia de 67.5 %, mientras que en los corderos menores de un mes fue de 88.2 %, todos las granjas fueron positivas al parásito, identificado mediante la técnica de microscopia mediante la cual sólo es posible identificar el género Cryptosporidium(5); siendo el diagnóstico molecular la manera más certera de identificar especie(9,11). En el presente estudio, la frecuencia general de casos fue de 19.5 % y por grupo de edad, 10.5 % en los de 7-14 días de edad y 9 % en los de 15-21 días, valores menores que los reportados en los estudios desarrollados en México; solo el 62 % de los rebaños presentaron ovinos positivos, aunque en todos los municipios hubo al menos una granja con casos positivos a Cryptosporidium spp. Las diferencias entre estos estudios son comprensibles porque cada uno de ellos se desarrolló bajo condiciones particulares de tiempo, diseño del 429

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muestreo, diversidad en las prácticas de manejo, y en última instancia a la competencia de la persona que realiza el diagnóstico microscópico, así como al criterio para considerar una muestra positiva. En la literatura hay estudios desarrollados con la misma finalidad que el presente. Así, en Bélgica se reporta una prevalencia en corderos menores de un mes de vida de 13.1 % (18/137), identificando positivos solo en el 40 % de los diez rebaños estudiados(22); mientras que en Zambia, la prevalencia fue de 12.5 % en corderos menores de un mes(14). En Turquía(24), indican en corderos de esta misma edad una prevalencia de 38.8 % (155/400), distribuida en el 90 % (18/20) de las granjas observadas, mostrando que de acuerdo con los grupos de edad, la frecuencia en corderos de una semana de edad fue 44.4 % (67/151), en corderos de dos semanas fue 37.5 % (39/104), en los de tres semanas 40 % (38/95) y 22 % (11/50) en los de cuatro semanas de edad. En la India, se identificó una infección de 65 % en corderos de menos de un mes de edad(25); en Zaragoza, España, Cryptosporidium spp., se presentó en corderos de 14 días de edad(26). La comparación entre estudios desarrollados en otros países con el nuestro es difícil; la información generada en ellos permite confirmar que este parásito infecta con mayor frecuencia a corderos menores de 30 días de edad, como se reporta en la literatura(11), y la prevalencia es tan diversa como los sistemas de producción. La frecuencia de la infección por Cryptosporidium spp., puede ser influenciada por diferentes factores en mayor o menor intensidad, tales como el sistema de crianza, estado nutricional, el estado inmunológico de los animales, la estación del año y el manejo sanitario en las granjas. Sin embargo, la edad es un factor considerado como marcador de riesgo a contraer la infección; los animales jóvenes, en especial los lactantes, son los más propensos a sufrir esta enfermedad, y a ello se le adicionan al menos otros dos factores de riesgo, el estado inmunológico de los animales y el manejo sanitario(25-28). La exposición inicial de los neonatos a la infección ocurre en las áreas de parición, como consecuencia de la eliminación de ooquistes por parte de las borregas gestantes; por lo general los ooquistes contaminan la ubre, el agua, el alimento y las áreas donde habitan los corderos; así, el sistema de manejo interviene en la probabilidad de transmisión del protozoario entre animales infectados y susceptibles(27). La infección en el hospedador inmunocompetente es autolimitada y deja en el sujeto una inmunidad sólida ante la re-infección; lo contrario, ocurre en sujetos con deficiencias linfocitarias o de gammaglobulinas; hay que recordar que los ooquistes son infectantes al momento de excretarse de su hospedero(2). La resistencia de los ooquistes en el medio ambiente también es importante, ya que sobreviven en camas, paredes, comederos, bebederos y utensilios, y mantienen su capacidad infectante durante largos periodos de tiempo; además, el contacto entre los animales recién nacidos y los adultos representa una importante fuente de contaminación y de dispersión del parásito en su fase infectante(12,29). La diseminación del parásito ocurre cuando el excremento contaminado se deposita en el suelo, de tal forma es factible que los ooquistes se transporten por agua o aire a los sitios o materiales que actúan como vehículos de contagio(17,10). En sistemas de producción

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intensivos se detecta una prevalencia más alta que en los manejados en pastoreo(4,15), probablemente debido a que las condiciones de confinamiento favorecen la presencia de la infección como se ha demostrado en becerros lactantes(2,26,30). En la presente investigación, C. parvum fue la única especie identificada en las muestras procesadas; esta especie es la que se presenta con mayor frecuencia en los rumiantes domésticos, particularmente en animales jóvenes(31-34), además de ser una especie con capacidad zoonótica(9,17). En México, C. parvum ha sido identificada mediante biología molecular en ganado bovino lechero(33); el hallazgo de su presencia en el ganado ovino incluido en el presente estudio, representa el primer reporte en el país para esta especie animal.

Conclusiones e implicaciones

Los resultados observados en este estudio muestran que la frecuencia de la infección por Cryptosporidium spp., en corderos es moderada en la población estudiada; sin embargo, denota la amplia distribución del parásito en la región. La identificación de C. parvum como única especie presente en las muestras estudiadas, confirma que la misma es de carácter cosmopolita y la más frecuente en rumiantes; así, este hallazgo es de importancia epidemiológica, porque sugiere que los animales infectados pueden actuar como diseminadores del parásito para otros animales domésticos y silvestres, e incluso para los seres humanos, particularmente para los manejadores de ganado.

Agradecimientos

Se agradece a los ovinocultores que participaron en este estudio por su amplia colaboración. Este proyecto (4559.12-P) fue financiado por el Tecnológico Nacional de México.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4247 Artículo

María Luisa Méndez-Ojedaa,b Edith Rojas-Anayaa José Francisco Morales Álvareza Graciela Tapia-Pérezc Gerardo Suzánd Osiris Gaona Pinedae Rodrigo A. Medellín-Legorretae Charles E. Rupprechtf Elizabeth Loza-Rubioa*

Departamento de Biotecnología en Salud Animal, Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias, Ciudad de México. México. b

Instituto de Neuroetología - Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz. México.

Departamento de Genética y Bioestadística, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México. México. d

Departamento de Etología, Fauna Silvestre y Animales de Laboratorio, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad de México. México. e

Departamento de Ecología y Conservación de Vertebrados, Instituto de Ecología, Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad de México. México.

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Lyssa LLC. Lawrenceville, Atlanta, Georgia. USA.

* Autor de correspondencia: loza.elizabeth@inifap.gob.mx

Abstract: The aim of this research was to detect rabies virus in peripheral tissues in captive vampires. Vampire bats were inoculated with 106 MICLD50 of homologous rabies virus. Bats displayed clinical signs of rabies beginning on d 8 until the 19th d post-inoculation (pi). Rabies virus antigens were found in the brain of all rabid bats. Viral RNA was detected in brain, salivary gland and tongue tissue by RT-PCR and nested PCR (nPCR). Viral genome was also detected in organs unrelated to the central nervous system. Rabies virus was not detected in saliva nor documented from any tissues without occurrence of viral antigens in the brain. Host humoral response was most pronounced via the induction of viral neutralizing antibodies (VNA) from d 8 to 20 pi, having a peak at d 14 with 0.9 IU. Antibody levels were variable, but tended to remain high after inoculation, showing significant differences to the negative control group (P=0.001). This research is one of the few recent studies focused upon Desmodus rotundus and contributes to the basic knowledge of rabies virus pathogenesis, which is required for an understanding of perpetuation in a major viral reservoir in Latin America. Key words: Desmodus rotundus, Pathogenesis, Rabies, Vampire bat, Zoonosis.

Resumen: El objetivo de esta investigación fue detectar el virus de la rabia en tejidos periféricos en vampiros en cautiverio. Los vampiros se inocularon con 106 MICLD50 de un virus de rabia homólogo. Los murciélagos mostraron signos clínicos de la enfermedad desde el día 8 hasta el día 19 postinoculación (pi). Los antígenos del virus de la rabia fueron encontrados en el cerebro de todos los murciélagos infectados. El ARN viral fue detectado en cerebro, glándulas salivales y lengua por RT-PCR y PCR anidado (nPCR). El genoma viral fue también detectado en órganos no relacionados con el sistema nervioso central. El virus de la rabia no se detectó en la saliva ni se documentó en ningún tejido sin la presencia de antígenos virales en el cerebro. La respuesta humoral fue más pronunciada después de la inducción de anticuerpos neutralizantes virales (VNA) desde el día 8 a 20 pi, teniendo un pico en el día 14 con 0.9 UI. Los niveles de anticuerpos fueron variables, con tendencia a permanecer altos después de la inoculación, mostrando diferencias significativas con el grupo control negativo (P= 0.001). Esta investigación es uno de los pocos estudios recientes enfocados en Desmodus rotundus que contribuye al conocimiento básico de la patogénesis del virus de la rabia, que

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es necesaria para comprender la perpetuación en un importante reservorio viral en América Latina. Palabras clave: Desmodus rotundus, Patogénesis, Rabia, Murciélagos vampiro, Zoonosis.

Recibido 14/08/2016. Aceptado 04/10/2017.

Introducción

Within the Americas, rabies is characterized in two major epidemiologic forms, domestic animal rabies and wildlife rabies. In the former, dogs are the main viral reservoir and for the latter, several species of wild carnivores and bats maintain largely independent enzootic rabies virus (RABV) cycles. Domestic animals rabies is managed typically through widespread vaccination of dogs. In contrast, no effective methods have been developed for the long-term effective prevention and control of rabies among bat populations. Although RABV may perpetuate among all major New World bat taxa, one species has special prominence. In the tropical and subtropical areas from Mexico to Northern Argentina, RABV is transmitted to humans, domestic animals, bats and other wildlife by the common vampire bat, Desmodus rotundus(1,2). Anthropogenic changes have caused deforestation and fragmented landscapes and has exacerbated the vampire bat rabies problem. Such actions may impact vampire bats directly, with the need to seek alternative refugia (e.g., wells, sewers, etc.), and by altering foraging strategies(3). Vampire bats consume the blood of most available mammals, but feed readily on cattle(4), which are a more common prey source than wildlife or humans(2,5). Throughout Latin America, a broad circulation of homologous RABV among vampire bats has been shown by extensive reported infections in other wildlife, livestock and companion animals(6,7,8). Recently, several studies have been published in Europe and North America concerning experimental inoculation of insectivorous bats, using homologous RABV(9,10,11), Irkut virus (IRKV)(12) as well as heterologous viruses (European bat lyssavirus 1 (EBL-1) and European

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bat lyssavirus 1 (EBL-2)(11-16). By comparison, only a few studies have been conducted on hematophagous bats (17-20), in an attempt to understand the transmission and perpetuation of RABV in wild populations of D. rotundus. Therefore, the aim of this study was to detect RABV in peripheral tissues in experimental infected vampires in captivity by molecular techniques.

Material and methods

Vampire bats

Thirty-three (33) female adult hematophagous bats (D. rotundus) with an average weight of 30 g were captured in summer using mist nets in Veracruz, Mexico. During the capture, only apparently healthy individuals were taken. Bats were transported in cages to the INIFAP, CENID Microbiology laboratory animal BSL-2 facility and were kept in captivity for 40 d before use. The animals were housed in two different and separated cages. In the first one inoculated bats were housed and in the second one control animals were housed. The animal room was maintained at an average of 26 Â°C and a relative humidity of 60 %. Bats were fed daily with 20 ml/each of defibrinated bovine blood. These bats were seronegative for virus neutralizing antibodies (VNA) tested by the rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) (<0.06 IU/ml, as described Turmelle et al(10).

Ethics statement

All bats were collected in recognition with Mexican regulation NOM-062-ZOO-1999(21), under the sample collection permit Num/SGPA/DGVS: 03173/14 given by the Servicio

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Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. This study was carried out in strict accordance with the recommendations for the use of animals and was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (Approval #001-2013). The animals were euthanized by cervical dislocation, according to the guidelines of the Mexican Regulation NOM-033-ZOO-1995(22), for the euthanasia of domestic and wild animals.

Virus

A homologous RABV (CASS-88 passage 2) was isolated from a naturally infected vampire bat(23) and replicated in BHK-21 cells. Virus stock, supernatant of homogenized infected mouse brains, for inoculation of vampires in this experiment was prepared as described previously(24). The inoculum before and after administration to the vampires was used for RNA extraction, cDNA and PCR(25) to sequence the RABV N gene (Genbank KP202393).

Experimental infection

As mentioned, all individuals used in this study were seronegative during the quarantine period. Subsequently, 22 bats were chosen to be inoculated intramuscularly (IM) in the gluteus muscle with 50 µl containing 106 MICLD50 doses of the homologous RABV CASS88(23). A control group consisted of 11 individuals and were inoculated with a supernatant of homogenized non-infected mouse brains.

Clinical signs

Bats were observed at least twice daily to distinguish their behavior and record characteristic signs of RABV infection (e.g., inappetence, lack of grooming, partial or generalized paralysis, coma, etc.). When signs appeared, the sick bat was separated from the group, 439

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sedated and bled to obtain serum to detect RABV VNA. Thereafter, bats were euthanized according with the NOM-033-ZOO-1995(22) protocol for experimentation with animals. The euthanized animals were submitted to necropsy for organ extraction. A sampling schedule was established for the routine collection of two inoculated vampires and one control animal post inoculation (pi). The sampling days are listed in Table 1. On the days where an animal of the inoculated group died naturally, it was necessary to sacrifice an animal of the control group to compare the results.

Table 1: Antibodies, fluorescent antibody test (FAT) and molecular assays in organs from inoculated vampires with homologous rabies virus nPCR FAT in brain Muscle Heart Lung Liver Stomach Spleen Kidney S.G Tongue Brain

Sampling days

Bats dying/day

0.027

0.042

0.065

0.25

10*

0.56

0.77

0.73

13*

0.74

0.92

15*

0.80

17*

0.71

19*

0.66

0.83

total

VNA IU/ml

16 VNA: Mean of virus neutralizing antibodies when two animals were sampled. (+) Positive test is the result obtained by animals death mentioned on 2nd column. (-) Negative test. S.G= salivary glands.

* mice succumbed with signs rabies related. The days marked in bold represent bats that died from rabies, whereas others were euthanized in the schedule.

The gluteus muscle (site of inoculation), heart, lung, liver, stomach, spleen, kidney, salivary glands, tongue and brain were preserved in ‘RNA later’ at -70 °C until use. In the case of the muscle, salivary gland, heart and brain, the whole organs were used for the extraction, while the remaining organs a macerated was performed to use the supernatant in the RNA

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extraction. Additionally, a portion of the brain was used to conduct the direct fluorescent antibody test (FAT) test for detection of RABV antigens, as described(26).

Determination of RABV antibodies

Bats were bled to detect virus neutralizing antibodies (VNA) in serum using the RFFIT(27,28). Bat-origin RABV was used as a positive control and rabbit hyperimmune serum with 2 IU/ml. A negative rabbit serum was used as a negative control. The samples were taken before challenge and on the same days that those organs were obtained. The cutoff level used to discriminate positive VNA titers was  0.06 IU/ml(10).

Oral swabs

Oral swabs were obtained during each scheduled time point from each bat and placed into 0.5 ml of MEM for the mouse isolation test (MIT)(24) or in ‘RNA later’ for the molecular test described, with the samples stored at -70 ºC until use. The oral swabs were used in the MIT for intra cranial inoculation in suckling mice.

RNA extraction, cDNA Synthesis, RT-PCR and nPCR

Total RNA was extracted directly from tissues using the trizol reagent® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), according to the manufacturer’s instructions. The RNA pellet was diluted in DEPC-water and quantified with a spectrophotometer (NanoDrop 2000, Thermo441

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Scientific) and stored at -70 °C. Synthesis of complementary DNA (cDNA) and RT-PCR was performed(25) to detect 761 bp of N gene. Additionally, in-house nPCR primers were designed using RABV vampire sequences to an amplified 162 bp of same gene in order to enhancer sensitivity and specificity: For: 5´GCCGCRATGCAGTTGTTTGA 3´, Rev: 5´ACAGTRGGGTCCCTTGTCA 3´.

Statistical analysis

Analysis of detection of RABV in organs was conducted by Log Rank analysis Kaplan– Meier(29). Levels of VNA in serum were analyzed using a logarithmic sequence estimation (regression curve fit of SPSS). The analysis were conducted using the statistical package SPSS 2.0.

Results

Serology

After inoculation, the VNA titers were detected from d 9 to 20, in which all bats had either succumbed or were euthanized (Table 1). The VNA peak appeared at d 14 with 0.9 IU/ml. Non-inoculated bats showed values less than the cut-off considered negative, while levels in inoculated ones showed a rising trend. The predicted logarithmic model (ln) observed values for 60 % of the data (P= 0.001).

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Survival

Some bats succumbed naturally to infection at d 9, 10, 11, 13, 15, 17 and 19. Animals showed a short period of depression, hyperactivity and anorexia, but no aggressive behavior. The remaining bats were euthanized at d 0, 4, 8, 12, 14, 16 and 20 according to the schedule (Table 1). The 95% confidence interval for the survival of inoculated vampires was 12.5, 16.4 % with a mean of 14.4 %. All uninoculated control vampires survived, as expected. The mortality per day in vampires after inoculation with RABV was different (P=0.02), compared to all animals not inoculated. The non-infected animals were negative by both assays for every sample.

Detection of RABV antigens

Of the 22 bats inoculated with RABV signs of rabies were identified in 16, (72 %). These 16 animals were confirmed by FAT. The mean incubation period was 13 d, with a range of 9 to 19 d pi. Clinical signs included: inappetence, lack of grooming, partial or generalized paralysis, coma and acute death, but no aggressive behavior. Presence of RABV was detected in brains of vampires from d 9 (Table 1). No RABV was detected in the control group. Moreover, all oral swabs were negative via the MIT.

RT-PCR and nPCR

Brains were positive from d 9 pi until d 19, compatible with the same results as observed with FAT. Additionally, the RT-PCR was capable of detecting RABV in tongue on d 9 and 12 of all evaluated animals. In other individuals, no other positive organ was found by RTPCR. However, when analyzed by nPCR, some other organs, such as salivary glands, lung, 443

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liver, kidney and spleen, were positive between d 11 and 19, demonstrating the presence RABV in organs unrelated to the CNS. A Log Rank analysis (Kaplan–Meier) showed highly significant differences in the dispersion of the appearance of RABV among organs (P= 0.001), showing a higher probability of being expressed in the brain. (Table 1). No RABV nucleic acids were detected in any saliva samples. Analysis of probability of occurrence of RABV in organs for each day showed highly significant differences in the spread of virus to first appearance among the other organs (P= 0.001). In analyzing the brain, it had the highest probability of occurrence, while muscle tissue was least likely.

Discussion

Data obtained from experimental studies of etiological agents in relevant susceptible hosts should provide insights for understanding pathogen transmission and perpetuation among reservoirs in nature. As such, several investigations on vampires have been conducted to study RABV pathobiology in these unique hematophagous species(17-20). Throughout such studies, comparative levels of the presence of VNA were determined. Despite the recognition that induction of VNA is a critical effector mechanism and the established international standard of 0.5 IU/ml selected as evidence of an adequate immunological response following vaccination, apparently there are no proven levels of “protection” against a RABV infection, considering the vagaries of virus, dose, route, severity and species dynamics. In this study, once infection was initiated, RABV antibodies were detected from d 8 at 0.07 IU up to d 20 at 0.8 IU/ml, with a peak at d 14 with 0.9 IU. obviously, the degree of resistance indicated by the presence of VNA does not necessarily always correlate with protective immunity. This has been observed under both free-living and experimental conditions(19,30,31). In this work as in others, a modification of the RFFIT was used to determine the VNA in the animals before the experiment. To verify that the animals to be used were seronegative at the time of initiation of the experiment, they were kept in quarantine and were determined to maintain a titer <0.06 IU/ml, considered negative; even though the animals come from an area that is reported in the literature as endemic for the virus. Specifically, in this study, the presence of VNA was not correlated with survivorship due to RABV infection because even animals showing antibody titers above 0.9 IU/ml succumbed to the infection. The above was probably due to the time when virus has reached the CNS and thus VNA in the periphery were unable to clear the virus. The statistical analysis

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predicted that the VNA would increase gradually with the increasing day of infection. However, in some individuals the presence of VNA was unable to skew the progression towards survivorship, as at d 13 in which three individuals succumbed, marking a peak of clinical manifestation. Using an insectivorous species, Jackson et al(9) determined titers that ranged from 0.3 to 8 IU/ml in Eptesicus fuscus, inoculated IM with a RABV at 103.2MICLD50 dose. In another study, rabies VNA titers in big brown bats fluctuated through time, indicating repeated RABV exposure and that antibodies are not related with virus clearance(10,32). According to Turmelle et al(10), antibody presence may be transitory. Our sampling protocol was determined with the purpose of determining the presence of RABV within organs before death occurred. In this research, signs began at d 9 through d 19 pi, while in other studies deaths occurred earlier using the same dosage, although our sampling schedule was located inside the range of other studies, with variation possibly due to differential individual response of bats to these pathogens(18,33). Vampire susceptibility in prior studies reached 79 and 84 % at a dose of 106MICLD50, and other authors have reported a susceptibility on average of 60 % using lower dosages (18,19,33). Although one study carried out experimental inoculation in a different host (E. fuscus), 75 % of the inoculated bats presented clinical signs at d 12 with an incubation period between 13 and 17 d(9). Using conventional molecular tools to identify RABV targets, this study detected nucleic acids in the brain and tongue. However, the nPCR designed using Mexican bat RABV sequences was more sensitive than RT-PCR alone, since various temporal stages were detected in organs unrelated to the brain, including lung, liver, kidney, spleen and even muscle and stomach (at d 19 pi). These results agree with those obtained elsewhere(7), who detected RABV genome in various tissues, including reproductive organs, when using real time PCR. Considering potential portals of exit, it was found RABV in the salivary glands at d 11 pi, although some results(19) reported that RABV fragments could only be detected in some individuals. Moreno and Baer(20), when inoculating vampire bats via intracranial injection, found RABV at high percentages in parotid, submaxillary and sublingual glands. By contrast, when injecting IM, RABV was detected in only 57 % of the salivary glands. These studies provide evidence of the high variability of detection of RABV after primary replication in the brain(19). The time schedule may have been inadequate to detect RABV in a more dynamic manner. To allow a better understanding of the perpetuation of infection in this species, considering their highly gregarious lifestyle, a daily sampling protocol should be considered in different fluids, tissues and organs using several routes of administration and doses. Specific viral detection in rabid bats varies by species and the particular methods used in regards to dose and route. For example, some researchers(11) detected a fragment of RABV

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in insectivorous bats only in salivary glands and nervous tissue, but they also reported differing results using PCR and isolation with these same tissues. In the present study, it was not possible to detect RABV in saliva either by molecular tools or biological tests, which could be related to the inoculation pathway used. Some reports(18), detected RABV in saliva in surviving individuals at 6 and 21 d by cell culture, while in this study MIT was used, which is a historical test for isolation and at least as sensitive as cell culture. Davis et al(11) were unable to detect RABV in saliva of the insectivorous bat Myotis lucifugus subcutaneously inoculated. Other work(9), detected RABV in only 10 % of E. fuscus, which had been inoculated IM with a homologous RABV, although positive samples were detected before the onset of disease and none of the survivors showed viral excretion. Likely, the immune system of bats plays an important role in limitation of viral tropism and could be capable of allowing individuals to elude a productive viral infection, in contrast to many other mammalian taxa, in which apparent herd immunity is limited. One hypothesis suggests that the innate immune system rapidly controls viral replication to very low levels, limiting clinical consequences in bats, but still resulting in viral shedding and subsequent spillover to other species(34,35). To date, these have not been described in hematophagous bats, but this could be a possible explanation for not detecting genome or virus in saliva samples.

Conclusions and implications

Primary RT-PCR was incapable of detecting RABV N gene in tested organs, except in the brain. Using a novel nPCR implemented in-house using Mexican vampire sequences, RABV was detected in organs unrelated to the central nervous system of vampire bats experimentally inoculated. Overall, this study contributes to the knowledge on the pathogenesis of RABV in one of the major primary reservoirs in Latin America.

Acknowledgments

This study was partially financed by grant 80275 (CONACyT-Mexico).

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4329 Artículo

Mario del roble Pensado-Leglisea* Javier Sanz-Cañadab

Instituto Politécnico Nacional, IPN, Ciudad de México, México.

Centro Superior de Investigaciones Científicas, CSIC, Madrid, España.

* Autor de correspondencia: mpensado@ipn.mx

Resumen: En este trabajo se analiza la relación entre la calidad y el valor de un bien de indicación geográfica protegida (IGP) con respecto a su precio, tomando la experiencia de veinte años de los productores de carne de la Sierra de Guadarrama. Mediante una investigación cualitativa a través de la técnica de enfoque grupal “focus group” y del uso del software Atlas.ti, se encontró que la carne de la Sierra de Guadarrama cuenta con varios factores que fortalecen la confianza del consumidor de la Comunidad de Madrid al bien de especialidad, como son: la identidad cultural, el apego por ser un producto local, buenas prácticas de sanidad animal y de inocuidad de la carne. Pese al prestigio social del bien de especialidad, existen limitaciones para alcanzar mejores precios pagados a los ganaderos, debido a una falla de mercado basada en la falta de información completa al consumidor (sobre la importancia de la ganadería para la conservación del patrimonio paisajístico ambiental); así como existir una ventana de oportunidad para mejorar la organización de la asociación y mayor acción colectiva de los productores que redunde en mejorar su forma de gobernanza, en particular su capacidad de negociación con los demás actores de la fase de

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comercialización, y con ello pueda haber un mejor equilibrio entre la calidad, valor y precio para el ganadero participante en la IGP. Palabras clave: Indicaciones Geográficas Protegidas, Bienes de especialidad, Calidad, Precios, Denominación de origen, Fallas de mercado.

Abstract: This paper analyzes the relationship between the quality and value of a well-Protected Geographical Indications (PGI) with respect to its price, taking the experience of 20 yr of beef producers of the Sierra de Guadarrama. Through a qualitative research through the focus group technique and the use of the software Atlas.ti, it was found that the meat of the Sierra de Guadarrama has several factors that strengthen consumer confidence in the Autonomous Community of Madrid to the good and specialty, such as: cultural identity; the attachment to be a local product; good practices of animal health and meat safety. Despite the social prestige of the specialty, there are limitations to achieve better prices paid to farmers due to a market failure based on the lack of complete information to the consumer (importance of livestock to the preservation of the heritage landscape assessment), as well as a window of opportunity to improve the organization of the association, greater collective action of producers which helps to improve the form of governance, in particular their capacity to negotiate with other actors in the marketing phase and this may be a better balance between the quality, value and price to the farmer of the PGI. Key words: Protected Geographical Indications, Goods specialty, Quality, Prices, Protected designation of origin, Market failures.

Recibido 17/11/2016. Aceptado 09/11/2017.

Introducción

La calidad de un bien se reconoce por medio de una convención o de un acto social entre concurrentes que acuerdan, aceptan la calidad y reconocen el valor de un bien que se traduce a un precio. Salais y Thevenot(1) y otros(2,3) estudiaron la relación entre la calidad de un bien

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alimentario según el tipo de convenciones sociales que la rigen. En un bien con Indicación Geográfica Protegida (IGP), el valor corresponde a la calidad(4), tipicidad(5) y a las convenciones(6) inherentes a un proceso histórico de construcción social de la calidad de un producto con sello de exclusividad a un lugar geográfico(7). IGP, es “el nombre de un lugar determinado, que sirve para designar un producto agrícola o alimenticio originario de dicha región, lugar o país, que posea una cualidad determinada, una reputación u otra característica que pueda atribuirse a dicho origen geográfico, y cuya producción, transformación o elaboración se realice en la zona geográfica”(8,9). Para ser un bien IGP basta que alguna de las fases de la producción esté vinculada al área geográfica(10,11). En la globalización, los cambios en el patrón de consumo alimentario expandieron la demanda de bienes de especialidad(12), y se crearon nuevos nichos de mercado para productos locales en el mercado global(13-16). La nueva demanda de bienes IGP, con reputación social de calidad territorial(17) multiplicó las marcas colectivas: en el comercio justo, de bienes “slow food”(18); bienes de circuitos cortos; de bienes con buenas prácticas ambientales o de agricultura orgánica(19); ligados a la acción colectiva y a capital relacional basado en la proximidad(20). Su dinamismo hizo incluirlos en las negociaciones comerciales multilaterales desde los 80s a la fecha(21). El bien IGP distingue a un sistema agroalimentario local (SIAL)(22) pero no garantiza mejor precio al productor. Requiere de una estrategia eficaz de acción colectiva local que facilite, gestione, coordine e innove con nuevos arreglos institucionales entre productores y consumidores. En un bien IGP, la renta absoluta para el productor es parte del precio productivo que incluye el pago por el usufructo de los derechos de exclusividad(23,24) y es similar a la naturaleza de un bien-club (bien con precio especial, de un grupo de productores con certificado de usufructo de sus derechos exclusivos). Si hay falla de mercado o si el grupo que reclama su renta absoluta posee insuficiencia organizativa, no hay capacidad de mejorar los precios a productores. En España, los bienes IGP/DOP crecieron de 12 en 1987 a 168 en 2012(25) debido a los incentivos de los apoyos al Desarrollo Rural de la Política Agrícola Común (PAC) otorgados desde 1992, pero no todos mejoraron los precios a productores de manera sustantiva. De la carne vacuna española, un estudio de 2017(26) indicó que el 89 % de consumidores españoles la aprecia por su sabor, ser fuente de proteínas y con valor nutricio; el 52.4 % del total considera la carne de vacuno española como la mejor (por la crianza, la alimentación, la calidad de la carne y su inocuidad). El 90 % de los españoles consideró al origen y a la alimentación como principales factores para que la carne sea jugosa. El 48 % aprecian mucho se identifique el origen de la carne. El 60 % de españoles la consumen al menos una vez a la semana; el 63 % está conforme con la cantidad consumida y el 73 % está conforme con la relación calidad-precio. En los factores que influyen en la compra, el precio está en cuarto lugar y en cambio el 51 % lo hace por su propio gusto. La carnicería de barrio y el

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supermercado son predilectos para compra de carne de vacuno y al 90 % le gusta comprar en fresco al mostrador. La carne de la Sierra de Guadarrama significó alrededor de 2.3 % de las unidades de explotación ganadera bovina españolas de carne IGP; el 4.5 % en volumen producido y el 5 % en valor de ventas con respecto al total de bienes cárnicos IGP nacional (27). La IGP inició en 1994, por el interés de los ganaderos aprovechando la oportunidad de un programa de fomento a dar una marca de calidad a su carne por la Comunidad de Madrid. Luego, se logró el reconocimiento oficial de la Unión Europea y para 2016 había 368 unidades de explotación. Dentro de los productores hay 239 que tienen cebaderos y vacas nodrizas en la sierra y 129 solo incluyen el libre pastoreo y las vacas nodrizas. No obstante, los ganaderos de tiempo completo son menos de un centenar(28). En 2016, eran cuatro los mataderos supervisados por la IGP y ocho salas de despiece; había 146 puntos de venta registrada por la IGP de los cuales el 52 % del total eran carnicerías y tiendas locales, y el resto eran sucursales de supermercados, tiendas de autoservicio e hipermercados. El total de animales sacrificados fue 5,176 cabezas (1,566.7 t de carne); es decir, en promedio 302.70 kg de carne en canal producida en 15 meses. Otros actores de la IGP son el entradero (comisionista), el matadero (maquila independiente) y la sala de despiece de distribuidora o autoservicio. El consumo no es exclusivo de Madrid (Ciudad), sino también la venta se hace en localidades de la Sierra, donde hay carnicerías, tiendas y restaurantes. El precio de la carne de IGP pagado al ganadero es mayor al 2 % con respecto al de la carne vendida en la lonja regional (bolsa comercial de productos cárnicos en físico), lo cual es poco para el ganadero, dado el mayor tiempo dedicado y el pago del costo adicional de la certificación IGP. Además, no se reconoce el valor del servicio ambiental de la práctica ganadera serrana, que contribuye a conservar en buen estado el pastizal y disminuir los riesgos de incendios forestales. Esto es porque al ser la zona de la IGP de la Comunidad de Madrid: una parte corresponde al Parque Nacional Sierra de Guadarrama (ubicada en la Comunidad de Madrid), que posee gran riqueza de paisaje y patrimonio histórico cultural(29), y la otra es una zona del occidente de la Comunidad de ganadería extensiva. Este trabajo tiene por objeto analizar los aspectos de valorización que limitan un mejor precio a los ganaderos de la IGP de la carne de la sierra de Guadarrama.

Material y métodos

La métodología fue de carácter cualitativo, y consistió en entrevistas guiadas o dirigidas por medio de un cuestionario y la realización de un taller de enfoque grupal. La actividad está

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concentrada en poco menos de 20 grandes productores que participan en forma decisiva en la asociación de la IGP, por lo cual, se omiten nombres de personas y lugares por ser información reservada. En primer lugar, se efectuaron diecinueve entrevistas semidirigidas a los diversos actores participantes de la cadena de valor y se completaron alrededor de catorce horas de grabación. Ocho de cada diez entrevistados eran mayores de 55 años, por lo que se observa la necesidad de un cambio generacional en aquellos que intervienen en la cadena de valor. Por grupos de actividad, se entrevistaron a productores pequeños, productores grandes, “entraderos” (tipo de comisionista acopiador), personal técnico y administrativo de carnicerías independientes y tiendas de autoservicio, así como también a personal técnico que labora para la IGP y funcionarios responsables de la Comunidad de Madrid. Luego, se procedió a la transcripción de las entrevistas se editaron y se sistematizó la información y se analizó con la técnica de análisis heurístico mediante el manejo del Atlas.ti., versión 7.5.15.(30). En segundo lugar, se utilizó la técnica de enfoque grupal(31) con una pequeña muestra representativa de ganaderos. La sesión se realizó con cinco actores: dos grandes productores (participantes en las dos cooperativas que existen), un pequeño productor, el presidente de la Asociación de ganaderos de la IGP y el Gerente de la IGP. La importancia de los actores participantes en el enfoque grupal, es que ellos tenían injerencia en el manejo de las unidades de producción asociadas, que significaba alrededor de la mitad del valor de ventas anual de la IGP o eran protagonistas institucionales y sociales.

Resultados

Análisis con Atlas.ti

A partir de la información recabada con las entrevistas que arrojaron frases con ideas claves y de acuerdo a su sitematización con la Figura 1 (obtenida del análisis con Atlas.ti), se desprendió la existencia de cinco elementos determinantes en la trayectoria de IGP de la carne de la Sierra de Guadarrama, a saber: 1) identidad cultural con la Comunidad de Madrid por ser un bien de especialidad típico; 2) calidad sanitaria (certificación de calidad que requiere altos estándares en todas las fases de la cadena de valor); 3) subvenciones de la PAC (inversión en equipo e infraestructura y promoción comercial), mejorando la cadena de valor

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y el reconocimiento social en la comunidad de Madrid; 4) manejo productivo que combina razas; 5) prácticas productivas semi-intensivas; 6) prácticas sociales productivas amables con el ambiente, contribuyendo a la disminución de riesgos de incendios.

Figura 1: Dinámica de la IGP de la carne de la Sierra de Guadarrama en Altas.ti

Fuente: elaboración de MRPL y JABD en software Atlas ti

El reconocimiento de estos elementos, como puntos principales en la construcción social de calidad de la IGP de la carne de la Sierra de Guadarrama se valorizan y forman parte del precio (la intermediación comercial está relacionada tanto con la certificación de la IGP,

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como con la calidad de la carne). Así, el importe se basa tanto en el precio de carne de vacuno regional, como en las negociaciones relacionadas con el sobreprecio pagado al ganadero de la IGP. En la zona, se pueden encontrar algunos productores que producen de manera simultánea, tanto ganado vacuno sin registro como con registro de IGP, así la intermediación comercial es el nudo crítico de la cadena que puede limitar o impulsar (Figura 1).

Resultados con el método de enfoque grupal

El taller de enfoque grupal se realizó con cinco participantes; se presentó un diagnóstico general de la cadena y se hicieron preguntas para establecer dos momentos en la discusión; en la primera ronda de discusión, hubo consenso al identificar como los principales problemas para mejorar la rentabilidad de los productores, tanto los altos costos productivos como la debilidad de la asociación de productores en la negociación de precios con el mercado, básicamente por el predominio de la venta individual a intermediarios. También se señaló la necesidad de mejorar la eficacia y cantidad de los apoyos oficiales, y deficiencias en el manejo de los animales (Cuadro 1). Entre las principales soluciones se mencionaron mejorar el funcionamiento de la asociación, integrar verticalmente la cadena (desde la producción hasta la carnicería), mejorar el circuito de comercialización incluyendo ventas directas o por internet, mayor apoyo gubernamental para la promoción comercial, fomentar el circuito de proximidad en la comercialización, controlar la fauna salvaje, mejorar la regulación del uso turístico urbano de la Sierra, y establecer un pago por conservación del medio ambiente.

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Cuadro 1: Resultados de rondas de participación del enfoque grupal I Cómo jerarquizas problemas actuales de la asoc de productores y Cuáles consideras que son sus soluciones? A

Problemas Cebo en Común de Animales

Comercialización

Fallas Comercialización

Los terneros salen a la Sierra

Cuesta mucho cebar

Comercialización conjunta

Cebo para animales

Falta Publicidad

Pastos de la Comunidad son muy caros

Cuesta vender

Falta apoyo oficial de la Comunidad de Madrid

Mal manejo de animales al destete

Duplicación de socios

Pocos cebadores

Deberían apoyar más a los cebaderos

Excesiva Fauna Salvaje

Problemas sanitarios

Evitar intermediarios en la venta de producto

Piensos Caros

es dificil cebar

1 2 3 4 Excesiva burocracia apra el ganadero

NO tener que pagar gastos de comunidad

Incluir una vía de venta en internet Problemas dentro de la venta general medioambientales

Está dficil para los jóvenes

5 6 Soluciones

Cebadero común

Comercialización conjunta

Compras en común para unificar Mas promoción publicitaria la alimentación

1 2 3 4 5 6

Mas recursos oficiales de la Comunidad de Madrid Control de Fauna Salvaje

ND Control Fauna Salvaje

Comercialización irregular Unirse para cebo en común

Pastos gratis

Unión para compras comunes Mejor Manejo Animal en la Unión para Sierra comercialización conjunta

Mejor situación económica del páis incrementa consumo

Por falta de compras comunes

Venta de proximidad y directa

apoyar a la gente joven

Reducir papeleo a gandaderos

Eliminar los pliegos a pastos de la comunidad de Madrid

II Cómo mejorar la asociatividad para beneficio y sostenibilidad de la IGP? Cebadero Común

Constituir una asociación que unifique la alimentación y la compras conjuntas

Comercialización conjunta

Constituir una comercializadora La IGP tendría que incluir entre sus Compra en común que Considerar a los jóvenes que maneje todo el ganado de socios a los comercializadores reduzca precios de piensos en todos los programas la IGP (carnicerías y supermercados, etc) así se conseguiría fidelidad de los puntos de venta

Mas presupuesto para promoción de marca de la IGP

Reforzar promoción de la Marca

Reducir papeleo para el ganadero

Ayudas de la administración, en cuanto el fondo de extensión es realmente el principal responsable de la cadena

5 6

La asociación se mejoraría con Mejorar la mayor implicación de los socios y comercialización para esto se puede conseguir con ganar ingresos mejoría económica que conlleve mejora de la comercialización

Necesidad de solo una dirección Medio ambiental General de Ganadería ND

Asociación para comercialización

Fuente: elaboración propia con base en resultado de Taller Focus Group, mayo, 2015

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En la segunda ronda de discusión (cómo mejorar la asociación), dos fueron los temas centrales: tener un proyecto industrial de cebadero común y que la asociación pueda funcionar con mayor dinamismo (compra de insumos y venta asociativa), para posicionarse mejor en el mercado. Otras propuestas fueron incluir a otros actores como son los comercializadores, mejorar los apoyos a jóvenes productores, aumentar recursos para la conservación medio ambiental, mayor promoción oficial de la marca, así como impulsar una simplificación administrativa.

Discusión

La etiqueta de calidad y origen que ofrece la IGP, son los principales atributos de la certificación(32). En diversos estudios europeos se indica que las nuevas familias jóvenes de menor tamaño y mayor educación tienen preferencia por las carnes de IGP (33). Si bien la valorización es importante, no hay que perder de vista que la certificación implica un costo por lo que el margen de ganancia es mínimo. De acuerdo con Gracia y Pérez (34) dichos atributos generaban elasticidades bajas; en 2002 encontraron que un aumento de 1 % por concepto del origen geográfico, en la importancia asignada por tener una Denominación de Origen Protegida (DOP) se traducía a pagar 0.105 % más por la carne de ternera, de suerte que los consumidores que adquirían carne de ternera con DOP pagaban solo un 2.6 % más que el precio medio de la carne de ternera. En otro estudio de carne de oveja (marca Ternasco de Aragón), se observa la competencia desleal entre la carne producida con registro de IGP y aquélla en la que se publicita su procedencia pero no tiene certificación(35). En este caso, la falla de mercado radica en una información incompleta al consumidor(36), lo que es posible también sea el caso para la carne de la Sierra de Guadarrama; al respecto, la importancia del capital social y de la acción colectiva en la valorización es fundamental para la distinción de la calidad y su aporte a los bienes públicos territoriales. Por otra parte, el capital social en la valorización es fundamental para la distinción de la calidad y su aporte a los bienes públicos territoriales. Barjolle y Sylvander(37) indican que la coordinación en la gestión del mercado es la relación entre la acción colectiva y el ámbito de cada empresa para variar la calidad del producto y adaptarla a su propia estrategia, ya que esto permite a las empresas manejar la competencia en los mercados segmentados. Por eso, la coordinación efectiva de los ganaderos de la Sierra de Guadarrama puede convertirse en una ventaja competitiva y dota de mayor tipicidad social al producto IGP. Belletti et al(38) plantean que es útil la cohesión organizativa de los productores de la IGP porque permite

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mostrar la calidad de su producto, capitalizando su reputación social de calidad como recurso intangible colectivo frente a los consumidores. En este caso, el funcionamiento del producto IGP es como bien club(39) pero dentro de un ambiente de heterogeneidad económica productiva, lo cual es otra condicionante en las posibilidades de éxito o fracaso de cohesionar al esfuerzo organizativo y de coordinación de los ganaderos. La valoración del IGP genera o fortalece bienes públicos territoriales, pues como sello de calidad colectiva se distingue por una tipicidad, pero también representa un recurso intangible territorial que patrimonializa el paisaje natural y sociocultural. Linck, et al40) plantean que la valoración del bien público generado por la IGP se basa en ofrecerles las dimensiones patrimoniales del territorio visto como un recurso complejo - que asocia recursos producidos y ambientales con conocimientos técnicos y relacionales específicos - y compartido en su ámbito espacial y social. Desde la óptica de las políticas públicas, se podría proponer subsidios específicos para las prácticas diferenciales de manejo del ganado que pasta en las zonas incluidas en el Parque Nacional de Guadarrama y su área de influencia. Belleti, et al(41) indican que la valoración del bien IGP como impulsor de la patrimonialización del bien público territorial, juega un papel importante en activar y apoyar procesos de desarrollo sostenible en áreas rurales, pero tiene sus riesgos, y los resultados están en función de diferentes áreas de intervención para la acción colectiva y su relación con las políticas públicas de un producto IGP como bien con naturaleza multifuncional(42). Los resultados obtenidos a partir de un análisis empírico, coinciden con otros trabajos científicos de indicaciones geográficas españolas y europeas, que señalan al déficit de innovación social en la gobernanza territorial como un factor adicional que impide generar una suficiente renta a pesar del esfuerzo en la construcción de instituciones colectivas en sistemas agroalimentarios locales(43).

Conclusiones e implicaciones

Después de 20 años la IGP de la carne de la Sierra de Guadarrama posee reputación social por ser un bien saludable, con calidad local e identidad cultural territorial. Sin embargo, este aprecio social no se traduce en mejor precio para los ganaderos, y ello pone en riesgo a la actividad a largo plazo. Un aspecto del problema es la falla de mercado, porque no se reconoce a los servicios ambientales de la ganadería serrana en conservar la biodiversidad y el valor del patrimonio cultural de la Sierra de Guadarrama. Otro aspecto son las fallas 460

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organizativas, lo que puede ser superado con asociatividad en la comercialización e innovación social en las relaciones entre productores y consumidores; ello implica fortalecer el capital relacional, mejorar la coordinación y elevar su capacidad de negociación en el mercado. Resolver ambos aspectos es esencial para dar sostenibilidad a la actividad en armonía con buenas prácticas ambientales e inocuidad alimentaria, que ofrezca un bien de especialidad para el consumidor de la Comunidad de Madrid.

Agradecimientos

A CONACYT por la estancia de año sabático del Dr. Mario del Roble Pensado-Leglise en el IEGD-CCHS del CSIC, Madrid, España, en el marco del Proyecto SIP 20151928 del Instituto Politécnico Nacional, CIIEMAD, México. La redacción final se hizo con el Proyecto SIP 20181987. Se agradece al M. en C. Juan Antonio Bautista Dávila por su labor técnica en el ejercicio de Atlas.ti.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4358 Artículo

Metales pesados en leche de vacas alimentadas con alfalfa producida en suelos irrigados con aguas residuales en Puebla y Tlaxcala, México Heavy metals in milk from cows fed alfalfa produced in soils irrigated with wastewater in Puebla and Tlaxcala, Mexico

Numa Pompilio Castro-Gonzálezab* Rafael Moreno-Rojasb Francisco Calderón-Sánchezc Alicia Moreno-Ortegab José Víctor Tamariz-Floresd

Facultad de Ingeniería Agrohidráulica. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Av. Reforma 167, 73900, Tlatlauquitepec, Puebla, México. b

Departamento de Bromatología y Biotecnología de alimentos, Universidad de Córdoba. Córdoba, España. c

Colegio de Postgraduados Campus-Puebla. Puebla, México.

Departamento de Investigación en Ciencias Agrícolas. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Puebla, México.

* Autor de correspondencia: numa.castro@correo.buap.mx

Resumen: El objetivo fue determinar la presencia de Cd, Pb, Ni, Cu, Cr, Zn y As en la cadena alimentaria de la leche de vaca, producida en zonas donde la alfalfa es cultivada en suelos irrigados con aguas residuales de procedencia industrial, doméstica y agrícola. Se muestrearon suelo y alfalfa de 16 sitios ubicados en cuatro zonas; la leche se colectó de 160

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vacas, correspondiendo a 40 vacas de cuatro hatos diferentes por zona, todo en dos épocas del año y por triplicado. Se calculó el factor de bioacumulación (BCF), el factor de translocación (TF) y el valor de transferencia de los metales de la planta a la leche. Las plantas tuvieron un BCF <1, indicando que la alfalfa es resistente a los metales pesados. Sin embargo, el TF >1 en orden decreciente quedó de la siguiente manera: Zn; Cu; Ni; Pb y Cr, lo que muestra la existencia de gran movilidad de los metales dentro de la planta. La leche tuvo un contenido de Pb en un rango de 0.039 ± 0.02 a 0.059 ± 0.05 mg kg-1, valores por arriba del límite internacional permitido. Sin embargo, los niveles de Pb y As fueron inferiores a los valores permisibles por la Norma Oficial Mexicana. Se concluye que la alfalfa es una planta acumuladora y resistente a los metales pesados, y cuando es cultivada en suelos contaminados, se convierte en un medio importante para la trasferencia de metales pesados a los animales y son eliminados a través de la leche. Palabras clave: Bioacumulación, Translocación, alimentaria, Leche.

Metales pesados, Contaminación

Abstract: The objective was to determine the presence of Cd, Pb, Ni, Cu, Cr, Zn and As in the food chain of cow's milk, produced in areas where alfalfa is cultivated in irrigated soils with industrial, domestic and agricultural wastewater. Soil and alfalfa were sampled from 16 sites located in four zones; milk was collected from 160 cows, corresponding to 40 cows from four different herds per zone, all in two seasons of the year and in triplicate. The bioaccumulation factor (BCF), the translocation factor (TF) and the transfer value of the metals from the plant to the milk were calculated. The plants had a BCF <1, indicating that alfalfa is resistant to heavy metals. However, the TF >1 in decreasing order was left as follows: Zn; Cu; Ni; Pb and Cr, which shows the existence of great mobility of metals within the plant. The milk had a Pb content in a range of 0.039 ± 0.02 to 0.059 ± 0.05 mg kg-1, values above the international allowed limit. However, the levels of Pb and As were lower than the permissible values by the Official Mexican Standard. It is concluded that alfalfa is an accumulator plant and resistant to heavy metals and when it is cultivated in contaminated soils, it becomes an important medium for the transfer of heavy metals to animals and they are eliminated through milk. Key words: Bioaccumulation, Translocation, Heavy metals, Food contamination, Milk.

Recibido 29/01/2017 Aceptado 19/12/2017

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Introducción

Los forrajes cultivados en suelos contaminados con metales pesados pueden traer consecuencias graves de salud y seguridad alimentaria. La contaminación ambiental por metales pesados producida por la industria y el crecimiento urbano afecta el aire, agua y suelos(1); pudiéndose acumular a largo plazo a niveles tóxicos en los suelos, donde permanece por largos periodos debido a que no son degradados y pueden biotransformarse en la cadena alimentaria(2,3). Esta acumulación puede provocar graves trastornos de salud en la población humana(4,5,6). Los metales pesados y el As son acumulados en órganos importantes del cuerpo humano y el de los animales cuando son ingeridos en alimentos y agua de bebida(7,8,9). La alfalfa (Medicago sativa) es considerada como planta acumuladora con buen efecto remediador(10,11). Es utilizada para la alimentación de bovinos lecheros, debido a que es una leguminosa de gran aporte nutricional(12,13). Por tanto esta leguminosa al ser cultivada en suelos irrigados con aguas procedentes de los ríos Atoyac, Zahuapan y la presa Manuel Ávila Camacho que reciben las descargas de las diferentes industrias ubicadas en los estados de Puebla y Tlaxcala, podrían contener metales pesados, los cuales pueden ser biotransformados a los animales que la consumen, originando acumulación en algunos órganos, y en parte ser excretados a través de la leche, poniendo en riesgo de salud a las personas que la consumen. Por tales razones, el objetivo de este trabajo fue determinar los factores de bioacumulación y translocación en alfalfa (Medicago sativa), así como el contenido Cd, Pb, Ni, Cu, Cr, Zn and As en la leche de vacas alimentadas con alfalfa producida en suelos agrícolas de cuatro zonas irrigadas con aguas residuales en dos épocas del año; así como determinar los valores de biotransferencia de dichos metales de la alfalfa a la leche.

Material y métodos

Área de estudio

Se consideraron suelos y plantas de áreas que son irrigadas con aguas residuales procedentes de la industria, retornos agrícolas y de los hogares, así como la leche de las vacas que consumen dichos forrajes. Por ello se muestrearon cuatro zonas (Figura 1); la zona 1

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correspondió al municipio de Tepetitla de Lardizábal, la zona 2 a Nativitas (en ambas se aprovecha el río Atoyac), la zona 3 en Santa Isabel Tetlatlahuca irrigada por el río Zahuapan; estas tres zonas pertenecen al estado de Tlaxcala y la zona 4 en Tecamachalco, Puebla, donde se riega con aguas de la presa Manuel Ávila Camacho (canal de Valsequillo).

Figura 1: Localización de los sitios de muestreo de suelo, alfalfa y leche en las áreas irrigadas con aguas residuales en el estado de Puebla y Tlaxcala, México

En las zonas de muestreo prevalece un clima templado húmedo con lluvias en verano, donde las principales actividades agropecuarias son la siembra de maíz y alfalfa, asociados a la producción de bovinos lecheros. Se localiza en la porción central del estado de Tlaxcala entre los paralelos 19°06’ y 19°40’ N y 97°58’ y 98°03 O; cubre total o parcialmente 50 de los 60 municipios, representando el 52 % de la superficie total del estado. Por otra parte, Tecamachalco, Puebla que se ubica en los paralelos 18° 52´ 57" N y a 97° 43´ 49" O(14,15).

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Muestreo de suelo, alfalfa y leche

El muestreo se realizó en dos épocas del año, comprendidas en julio 2014 (verano) y marzo de 2015 (primavera). Las muestras de suelo se recolectaron en cuatro zonas definidas por la fuente del agua de riego, formando un total de 16 sitios, correspondientes a cuatro muestras por zona (Figura 1). Las muestras se tomaron de la capa superficial del suelo (0 a 30 cm) debido a que los metales en los suelos cultivados se encuentran distribuidos de manera homogénea a este nivel, como consecuencia de la aplicación de abonos, fertilizantes y el contenido de materia orgánica del suelo(16). Se colectaron 10 sub muestras en cada sitio, las cuales se mezclaron para formar una muestra compuesta de cada sitio. Estas se colocaron en bolsas de polietileno negro, que se cerraron evitando la presencia de aire, y llevadas al laboratorio, donde se secaron en bandeja de papel, alcanzando una profundidad máxima de 2.5 cm, una temperatura no superior a 35 °C y una humedad relativa entre 30 y 70 % a la sombra durante ocho días, con el fin de hacer un mejor manejo y homogeneización de las muestras. Se removieron las rocas y material orgánico, luego las muestras se trituraron utilizando un mazo de madera, y se realizó el tamizado en un tamiz de nylon de <2 mm de diámetro, y se conservaron en bolsas de nylon perfectamente cerradas hasta su digestión de acuerdo con la norma NOM-021-SEMARNAT-2000(17). La alfalfa utilizada se colectó por triplicado al inicio de la floración, de los mismos sitios de donde se extrajo el suelo, a una profundidad de 0 a 30 cm(18) y se trasportaron en bolsas oscuras al laboratorio, donde se les lavó con agua desionizada hasta eliminar todo tipo de residuos de suelo, al mismo tiempo que fueron pesadas en su totalidad y por partes, siendo separadas en parte comestible (hoja-tallo) y raíz(19,20), congelándolas para luego ser liofilizadas. Posterior a ello se molieron, tamizaron y almacenaron en bolsas de nylon hasta su digestión. La leche se colectó de 160 vacas, correspondiendo a 40 vacas de cuatro hatos diferentes por zona, todas alimentadas con alfalfa cultivada en los suelos muestreados. Para ello se utilizaron tubos Falcón de 50 ml, previamente lavados con HNO3 al 10% v/v y fueron enjuagados por tres veces con agua desionizada para eliminar los residuos ácidos y evitar alteraciones en la leche. El muestreo se realizó una sola vez por la mañana al inicio del ordeño, directamente de la ubre, transportándolas en neveras al laboratorio, donde se congelaron a -65 ºC y posteriormente liofilizadas. Para la liofilización de la alfalfa y leche se utilizó un equipo de liofilización LABCONCO Freezone de 4,5 litros (Kansas City, Missouri).

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Determinación de metales pesados

Todas las muestras de suelo, planta y leche fueron previamente digeridas en un horno de microondas (CEM-MarsX, CEM corporation Mathews, Notrh Carolina). Para el suelo, se realizó una digestión bajo el protocolo EPA 3051, pesando 0.5 g de suelo y se añadieron 10 ml de ácido nítrico (HNO3), se utilizó una potencia de 1,600 W, con una rampa de 5 min, presión de 350 psi, temperatura de 175 ºC y un intervalo de 5 min. Para la alfalfa se utilizó la parte comestible y la raíz, de cada uno, y por separado se pesaron 0.3 g y se agregaron 5 ml de HNO3 más 5 ml de peróxido de hidrógeno al 30% w/v a 1,600 W de potencia, con un tiempo de rampa de 15 min, presión de 800 psi, 200 0C de temperatura y 10 min de espera. La digestión de la leche liofilizada se realizó utilizando 0.5 g, a la cual se le agregaron 10 ml de HNO3, colocándola a una potencia de 1,600 W, rampa de 5 min, presión de 350 psi, temperatura de 175 ºC y un intervalo de 5 min. Una vez digeridas cada una de las muestras se filtraron sobre papel Whatman grado 42, se aforaron a 50 ml con agua desionizada y se refrigeraron hasta su análisis. El ácido nítrico utilizado para cada digestión fue HNO3 High purity (65%, Suprapur, Merck, Darmstadt, Germany). Los metales pesados Cd, Pb, Ni, Cu, Cr, Zn y As se determinaron por medio de espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP – OES, Varian 730 – ES). Todos los productos químicos utilizados fueron de grado reactivo analítico. Se prepararon las soluciones en agua desionizada 18.2 MΩ cm. Los estándares de calibración para cada metal se prepararon utilizando solución patrón ICP multielemento standard XVI, compuesta de 21 elementos en HNO3 Suprapuro 6%, con densidad de 1.032 g/cm³ y 20 °C de Merck KGaA, Frankfurter Str. 250, 64293 Darmstadt, Germany. Los niveles de precisión y exactitud se realizaron con cinco blancos y diez repeticiones. El valor de recuperación analítica se determinó en 106 % en promedio, el coeficiente de correlación (r2) fue 0.9999 para todos los metales. Los límites de detección y los límites de cuantificación (LOD - LOQ) se calcularon con 3 y 10 veces la desviación estándar del blanco.

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Factor de bioconcentraciĂłn (BCF) y factor de translocaciĂłn (TF)

Con los valores de suelo y planta se realizaron los cĂĄlculos para determinar el factor de bioconcentraciĂłn (BCF), que indica la capacidad o eficiencia que poseen las plantas para acumular metales pesados en la raĂz con relaciĂłn a la concentraciĂłn de metales existente en el suelo o sustrato, calculĂĄndose en base a peso seco(21,22); y el factor de translocaciĂłn (TF) que indica la absorciĂłn de metales pesados que ejercen las plantas a los diferentes Ăłrganos vegetativos con respecto a la raĂz(23,24,25). Ambos factores se calcularon siguiendo las siguientes ecuaciones, las cuales han sido utilizadas por varios autores(26-29): đ??ś

đ??ľđ??śđ??š = đ??ś đ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x17D;Ăđ?&#x2018;§

đ?&#x2018; đ?&#x2018;˘đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018;&#x2122;đ?&#x2018;&#x153;

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đ??ś đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x17D;đ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x2019; đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x161;đ?&#x2018;&#x2019;đ?&#x2018; đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x2122;đ?&#x2018;&#x2019; đ??śđ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x17D;Ăđ?&#x2018;§

Donde BCF es el factor de bioconcentraciĂłn, TF es el factor de translocaciĂłn y C es la concentraciĂłn del metal (suelo, raĂz y parte aĂŠrea o comestible).

AnĂĄlisis estadĂstico

La informaciĂłn obtenida de cada componente se analizĂł bajo un diseĂąo completamente al azar con arreglo factorial, en el que los factores fueron: la estaciĂłn del aĂąo y las zonas, utilizando un modelo lineal generalizado (GLM), y para la comparaciĂłn de medias se efectuĂł la prueba de Tukey con el paquete estadĂstico SAS Ver. 9(30). Con los valores obtenidos del contenido de metales en la alfalfa y la leche se determinĂł el valor de biotransferencia de metales de la planta hacia los animales, utilizando la ecuaciĂłn propuesta por Stevens(31); BTF (kg dĂa â&#x2C6;&#x2019;1) = ConcentraciĂłn del metal en leche (mg kgâ&#x2C6;&#x2019;1) / Consumo promedio diario del metal (mg dĂaâ&#x2C6;&#x2019;1); y para ello se considerĂł que son vacas de la raza Holstein, con un peso promedio de 600 Âą 34 kg y que tienen una ingesta de 10 kg de alfalfa al dĂa en base seca.

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Resultados y discusión

Suelo

Por zonas, el suelo agrícola mostró diferencias significativas (P<0.01), para Ni y Cr, siendo la zona 4 la que tuvo los valores más bajos (Cuadro 1). En cuanto a la época del año, no existió diferencia significativa en el contenido de metales en el suelo. Siebe(32) en un trabajo realizado en suelos del estado de Hidalgo, irrigados con aguas residuales procedentes de la ciudad de México, reportó niveles de 24, 20, 52 y 77 mg kg-1 de Pb, Cu, Cr y Zn respectivamente, los cuales son superiores a los encontrados en este trabajo y para Cd 0.57 mg kg-1 siendo un nivel más bajo que el detectado en esta investigación. Sin embargo, los suelos analizados por Siebe(32) estuvieron irrigados por más de 80 años, a diferencia de los de este trabajo que tienen 40 años de irrigación con las aguas residuales de procedencia industrial.

Cuadro 1: Contenido de metales pesados por zona (mg kg-1) en suelos agrícolas irrigados con aguas residuales en Puebla y Tlaxcala, México Zona

1.16±0.2a

14.79±1.2a

15.40±1.5ab

12.19±1.6a

19.04±3.3ab

25.33±1.5a

5.16±1.1a

1.15±0.3a

13.03±4.8a

14.70±3.6ab

11.24±3.1a

17.35±3.2ab

20.72±3.5a

5.91±2.2a

1.42±0.5a

17.67±7.1a

16.69±4.6a

14.20±4.7a

20.25±5.8a

25.23±4.9a

5.70±1.2a

1.22±0.2a

13.60±2.6a

12.40±2.0b

14.62±3.6a

14.37±2.2b

20.29±3.4a

4.51±2.6a

ab Diferentes literales representan diferencias entre zonas (P≤0.05).

Alfalfa

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El contenido de metales en la parte comestible (hoja – tallo) (Cuadro 2) no evidenció diferencia significativa entre zonas. Sin embargo, por época del año el Pb, Ni y Zn fueron diferentes (P<0.01) mostrando valores más altos en el verano, caso contrario para el Cr que tuvo nivel más alto en primavera.

Cuadro 2: Contenido de metales pesados (mg kg-1 MS) en alfalfa (raíz y parte comestible) por zona y época en zonas irrigadas con aguas residuales en Puebla y Tlaxcala, México Cd

0.05±0.03a

1.86±1.0a

3.06±2.0a

2.39±0.9a

1.56±0.6a

10.68±4.6a

1.25±0.6a

0.09±0.04a

2.04±0.4a

3.15±0.7a

3.74±1.9a

2.13±1.6a

14.20±4.3a

0.88±0.6a

0.07±0.05a

2.26±1.4a

4.36±3.3a

3.27±1.2a

1.79±0.9a

15.26±7.7a

1.12±0.8a

0.07±0.03a

1.96±1.3a

4.23±2.4a

3.40±1.3a

2.82±1.5a

11.20±8.2a

0.80±1.5a

Verano

0.06±0.04a

2.69±0.9a

5.06±2.4a

2.66±1.2a

1.36±0.9b

15.92±6.5a

1.31±0.5a

Primavera

0.08±0.04a

1.36±0.7b

2.34±0.9b

3.74±1.5a

2.78±1.2a

9.75±4.8b

0.71±0.7a

0.04±0.03a

1.42±0.1a

2.04±1.2a

1.40±0.4b

1.18±0.7b

3.90±1.6a

0.16±2.0b

0.10±0.06a

1.53±0.1a

3.97±2.2a

2.90±1.3ab

2.64±0.9a

7.81±3.4a

0.62±0.9b

0.06±0.03a

2.07±2.1a

3.22±1.5a

2.17±0.9ab

1.28±0.7b

7.08±4.5a

0.80±2.2b

0.13±0.1a

2.67±2.2a

2.82±0.7a

4.06±0.9a

1.85±0.8ab

9.27±4.7a

2.54±2.6a

Verano

0.09±0.08a

2.88±1.6a

3.85±1.7a

3.19±0.9a

1.34±0.9b

5.43±3.2a

1.48±2.5a

Primavera

0.08±0.06a

0.96±0.9b

2.17±0.9b

2.16±2.2a

2.14±0.8a

8.59±5.8a

0.19±0.3a

Zona

Parte comestible

Época

Raíz

Época

MS=Materia seca. Diferentes literales representan diferencias entre zonas (P≤0.05).

En otras regiones de México, Vázquez-Alarcón et al(33) reportaron un contenido de Cd de 0.7 a 2.7 mg kg-1 en alfalfa, superior a lo encontrado en esta investigación, y en el caso del Pb (1.2 a 1.7 mg kg-1), los valores son inferiores a los determinados en este trabajo. El contenido en la raíz de alfalfa indica que existieron diferencias (P<0.01), siendo As, Cu en la zona 4 y Cr en la zona 2 los que obtuvieron los mayores valores. Al comparar entre componentes (parte comestible y raíz) únicamente se obtuvo diferencia significativa (P<0.01) para el contenido de Zn (12.09 ± 5.5 mg kg-1) en la parte comestible, siendo mayor que el detectado en la raíz (7.15 ± 5.2 mg kg-1). El resto de metales no mostraron diferencias; esto podría deberse a que el año 2015 fue clasificado como un año de alta precipitación pluvial. Según CONAGUA(34), marzo contribuyó con el 7.9 % a la hoja nacional de agua, equivalente a cuatro veces su contribución normal, de modo que en este mes, se produjo una precipitación

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de 125 mm, a diferencia de 2014 que tuvo una precipitación de 25 mm en el mismo mes. Para julio de 2014, la precipitación fue 150 mm. En el caso particular del Pb al no haber diferencia entre raíz y la parte comestible, puede deberse a que la vía principal de contaminación con el Pb no es la raíz, aunque tiende a ser acumulado en ésta, debido a que el Pb es poco soluble(35,36), lo cual contribuye a que posea menor movilidad, denotando que este elemento también puede estar ingresando a nivel de las hojas. Aunque las plantas de alfalfa tienen gran capacidad acumuladora de metales pesados (37,38); existen diferentes mecanismos de absorción y factores que pueden influir a que los metales no sean movilizados o no estén biodisponibles. Los metales se transportan a la raíz por ﬂujo de agua en forma de iones, los cuales se absorben por estar en contacto con las raíces cuando se encuentran solubles en agua. La baja movilización del Pb puede deberse a la capacidad que tiene la planta de excluir el metal del paso de la raíz al suelo, o bloqueando el movimiento del metal dentro de la planta por medios péptidos (fitoquelatinas), aminoácidos (histidina y cisteína), compuestos fenólicos y ácidos orgánicos (cítrico, oxálico y málico) , que secuestran o forman compuestos mediante la unión de ligandos específicos; además del valor del pH y las condiciones de textura y materia orgánica presentes en los suelos(39), lo que puede contribuir a que exista menor solubilidad impidiendo la movilización. Por tanto, la presencia del Pb y As en hojas puede deberse a que han sido absorbidos a nivel de las hojas debido a contaminación aérea. Otro mecanismo de absorción de metales por las plantas es la difusión que ocurre por gradiente de concentración de mayor a menor. También la intersección de la raíz con el suelo, la cual depende del tamaño, profundidad y el agua libre del suelo, que puede ser absorbida del espacio entre las partículas del suelo, siendo aprovechada esta vía tanto para los nutrientes como por los metales pesados(40). Además, se ha mencionado que las sinergias y antagonismos que pueden existir entre los metales conducen a una mayor absorción, que puede ser benéfica o perjudicial al crecimiento de las plantas, y con ello la acumulación en la misma(41). Tal es el caso del Pb y Cd, que de manera individual ocasionan daños negativos en las plantas, pero cuando aparecen juntos dentro de ésta, la fitotoxicidad se ve aumentada.

Factor de bioconcentración (BCF) y factor de translocación (TF)

Los valores de BCF (Figura 2) indican que las plantas de alfalfa en las cuatro zonas tuvieron un valor inferior a uno para todos los metales estudiados. En el análisis del BCF por épocas

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se encontró que existió diferencia significativa (P<0.01), donde los valores de Pb, Ni y As fueron superiores en el verano (Figura 3) y el Zn mostró su nivel más alto en primavera. Así se tiene que los metales menos disponibles en orden ascendente fueron el Cd, Cr, Pb. Sin embargo, para ningún metal y en ninguna de las dos estaciones climáticas muestreadas existieron valores BCF >1.

Figura 2: Factor de bioconcentración (BCF) de metales pesados en alfalfa cultivada en áreas irrigadas con aguas residuales 1

(BCF)

0.5 0.2 0.1 0.05

0.01 Cd

Metales pesados

Los datos son medias y la línea vertical representa la desviación estándar.

Figura 3: Factor de bioconcentración (BCF) por época del año en alfalfa cultivada en áreas irrigadas con aguas residuales 1 Verano Primavera

(BCF)

0.5

0.2

0.1 0.05 Cd

Metales pesados

Los datos son medias y la línea vertical representa la desviación estándar.

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Algunos autores(42,43) mencionan que cuando TF >1, se considera que las plantas son acumuladoras de metales pesados, y en el presente estudio los valores encontrados (Figura 4) demuestran que en orden decreciente los metales que mostraron mayor movilidad de la raíz a la parte aérea de la planta fueron; Zn, Cu, Ni, Pb y Cr. En el caso del Cd, estuvo en el límite y el As es el metal con la menor movilidad presentada en esta investigación.

Figura 4: Factor de translocación (TF) de metales pesados en alfalfa irrigada con aguas residuales 3.5 3.0

(TF)

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Cd

Metales pesados Los datos son medias y la línea vertical representa la desviación estándar.

En consecuencia, se considera que las alfalfas muestreadas en este trabajo tienen características de ser acumuladoras de metales pesados. Los valores obtenidos al evaluar el TF (Figura 5) durante las épocas demuestran diferencia significativa (P<0.01), siendo en verano donde se detectó mayor movilidad de Pb, Ni, Cu y Zn. En el caso de Cr la movilidad fue mayor en primavera. El Cd presentó valores que están en los límites, y se le considera con buena movilidad por la importancia tóxica que representa, y por ser altamente soluble en agua(44).

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Figura 5: Factor de translocación (TF) de metales pesados por época del año en alfalfa irrigada con aguas residuales 5 Verano Primavera

(TF)

3 2 1 0 Cd

Metales pesados Los datos son medias y la línea vertical representa la desviación estándar.

Siendo la alfalfa una planta considerada como acumuladora de metales pesados, hace suponer un riesgo de contaminación por la ingestión que de ella realizan los animales(45). Algunos metales como el Co, Mn, Fe, Se, Zn, Cu y Ni, son esenciales para las funciones biológicas y fisiológicas de plantas, incluyendo la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos, sustancias de crecimiento, síntesis de clorofila entre otras funciones; pero más allá de los límites permisibles, estos elementos metálicos se vuelven tóxicos dependiendo de la naturaleza, especies de metal y plantas(46). Aunque las plantas tienen un mecanismo de desintoxicación efectuado por las fitoquelatinas, éstas no logran evitar la captación por parte de los rumiantes, ya que cuando los metales están unidos a las fitoquelatinas, al ser ingeridas por el animal forman un compuesto de glutamilcisteína en el rumen y el intestino delgado, pero es probable que este compuesto sea degradado rápidamente por los microorganismos del rumen, liberando así al metal que tiende a ser acumulado en los tejidos animales(47). Principalmente en el caso de aquellos metales que no son necesarios para el metabolismo de los animales y que son considerados como de mayor toxicidad (Cd, Pb); y en el caso del As, se le ha considerado con alguna función en el metabolismo de plantas y animales; sin embargo, es un metaloide sumamente tóxico, y se les considera a los tres como cancerígenos. No obstante los valores encontrados en la parte comestible de la alfalfa, son bajos comparados con las normas establecidas para límites permisibles de metales en alimentos para ganado; pero hay que considerar que dichos límites han sido instaurados sin ser objetivos(47), por lo consiguiente la acumulación de los diferentes metales en rumiantes está relacionada más con el intervalo de tiempo de ingestión de los metales contenidos en los

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alimentos y la baja tasa de excreción de estos(47,48). Los metales tóxicos pueden tener bajos índices de absorción, pero logran utilizar mecanismos de absorción supuestos para otros metales tales como el Cd-Zn y Pb-Ca, lo que hace posible la contaminación de los productos y subproductos animales para consumo humano. Así se tiene que el Cd se acumula principalmente en riñones e hígado y el Pb se deposita primordialmente en huesos largos y puede ser movilizado a la leche de las vacas principalmente después del parto(49,50). La contaminación de los suelos y la edad de los animales son predictores de contaminación animal(51), y los valores de los metales en suelo utilizados para la realización de esta investigación son indicativas de contaminación, aunado a la edad de las vacas, las cuales están por arriba de los tres años de edad, tiempo necesario para que exista acumulación de metales pesados en el cuerpo de los bovinos. La concentración de metal en la leche (Cuadro 3) fue significativamente diferente entre las zonas (P≤0.001), excepto para As y Ni. El Pb estuvo por encima de los valores permisibles (0.020 mg kg-1) por la Comisión Europea(52) y la WHO/FAO(53). Sin embargo, los elementos tóxicos Pb y As, fueron inferiores a los valores establecidos por la Norma Oficial Mexicana NOM-184-SSA1-2002(54), que considera permisible para Pb 0.1 mg kg-1 y 0.2 mg kg-1 para As. En el caso del Cd no está reglamentado en las normas internacionales ni en la nacional.

Cuadro 3: Contenido de metales pesados en leche cruda (mg kg-1 MS) por zona irrigada con aguas residuales en Puebla y Tlaxcala, México Cd

Zona 1

0.001±0.0007b

0.059±0.05a

0.011±0.003a

0.037±0.01a

0.010±0.001b

0.440±0.1a

0.038±0.01a

0.001±0.0005b

0.041±0.02ab

0.012±0.005a

0.024±0.01b

0.016±0.007a

0.320±0.1b

0.029±0.01a

0.002±0.001ab

0.039±0.02b

0.012±0.005a

0.025±0.009b

0.015±0.009a

0.330±0.1b

0.033±0.02a

0.003±0.001a

0.045±0.02ab

0.012±0.004a

0.029±0.01ab

0.017±0.003a

0.350±0.1b

0.039±0.02a

MS=Materia seca. Diferentes literales representan diferencias entre zonas (P≤0.01).

En México, Solís et al(51), informaron valores de 0.065 mg kg-1 para Pb y 0.27 mg kg-1 para Cu y 24 mg kg-1 para Zn en leche producida en áreas de riego con aguas residuales domésticas e industriales, siendo los niveles superiores a los encontrados en este estudio. Rosas et al(53) indican valores de As en un rango de 0.9 a 27.4 mg kg-1 en leche de la Comarca Lagunera en México, considerada como una región rica en arsénico, siendo estos niveles inferiores a los determinados en este trabajo.

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La determinación de los valores de biotransferencia de los metales de las plantas a la leche fue de: 1.21E-04; 3.06E-07; 2.10E-05; 8.27E-05; 1.38E-05; 2.12E-04; 1.30E-02, para AS, Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, y Zn respectivamente, donde el As, Pb y Zn muestran una biotransferencia mayor y en el caso del As concuerda con los valores reportados por Rosas et al(55).

Conclusiones e implicaciones

Se concluye que las plantas de alfalfa producida en los suelos agrícolas de la cuenca del Alto Balsas en el estado de Tlaxcala y Puebla en México, contienen metales en las partes comestibles, y el consumo de éstas por los animales representa riesgo a la salud, debido a la acumulación que se puede generar por el consumo crónico, principalmente de Cd, Pb y As. De igual manera se ha determinado que la leche producida en estas regiones y bajo el sistema de producción de pequeños productores, contiene elementos tóxicos como el Pb y As que están en niveles por arriba de las normas internacionales y por debajo de las normas nacionales. Por ello es importante realizar investigaciones que ayuden a determinar el grado de riesgo, así como monitorear constantemente los suelos con el objetivo de implementar programas, para evitar la presencia de elementos tóxicos en la cadena alimenticia en las regiones analizadas, y con ello prevenir trastornos a la salud de los pobladores.

Agradecimientos

A la Asociación Universitaria Iberoamericana de Posgrado (AUIP), al Colegio de Postgraduados - Campus Puebla, al Centro Universitario de Vinculación y Transferencia de Tecnología (CUVyTT) de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, por el apoyo para la realización de este trabajo.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4440 Artículo

Milton Javier Luna Guerreroa Cándido López Castañedab* Alfonso Hernández Garaya,† Pedro Arturo Martínez Hernándezc María Esther Ortega Cerrillaa

Postgrado en Recursos Genéticos y Productividad-Genética, Colegio de Postgraduados. Carretera México-Texcoco km 36.5, Montecillo, Texcoco, Estado de México, México. b

Postgrado en Producción Animal, Universidad Autónoma Chapingo. Chapingo, México.

C Postgrado en Producción Animal, Universidad Autónoma Chapingo. Chapingo, México. * Autor de correspondencia: clc@colpos.mx.

Resumen: Se evaluó el comportamiento productivo en 100 familias de medios hermanos (FMH) derivadas de las variedades San Miguel y Oaxaca, y las poblaciones San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel, en macetas a la intemperie en Montecillo, Texcoco, Estado de México. Se realizaron cortes cada cinco semanas en otoño-invierno 2013-2014 y cada cuatro semanas en primavera 2014. Las FMH derivadas de San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel tuvieron en promedio 10 % mayor rendimiento de materia seca (RMS), tasa absoluta de crecimiento (TAC) y relación hoja:tallo (H:T) por planta, que las FMH derivadas de San Miguel y Oaxaca, en cada corte y estación del año. Las FMH derivadas de San Miguel presentaron mayor número de tallos (NT) en invierno y primavera, y menor altura de planta (AP) en primavera que las de Oaxaca y las FMH derivadas de San Miguel x Oaxaca y Oaxaca

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x San Miguel. El RMS y TAC en primavera fueron 57 y 33 % más altos que en otoño e invierno. La relación H:T en otoño fue 5 % mayor que en invierno y 30 % mayor que en primavera; el mayor NT y AP se presentaron en primavera. La eficiencia en el uso de la radiación (EUR) fue mayor en primavera que en otoño e invierno con los valores más altos en abril. La variabilidad entre las FMH derivadas de San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel, indica la posibilidad de seleccionar familias superiores en rendimiento de materia seca. Palabras clave: Rendimiento estacional, Rendimiento por corte, Relación hoja:tallo, Eficiencia radiación.

Abstract: The present research work was carried on to study the productive performance of a group of 100 half-sib families (HSF) derived from each of Oaxaca and San Miguel commercial varieties, and San Miguel x Oaxaca and Oaxaca x San Miguel populations, in pots placed outdoors at Colegio de Postgraduados, Montecillo, Texcoco, State of Mexico. Harvests of aerial biomass were made every 5 wk during the fall-winter growing season 2013-2014 and 4 wk during the spring growing season 2014. The HSF derived from San Miguel x Oaxaca and Oaxaca x San Miguel had 10 % higher dry matter yield (DMY), absolute crop growth rate (ACGR) and leaf:stem ratio (L:S) per plant than the HSF derived from San Miguel and Oaxaca in every growing season and harvest. On the other hand, the HSF derived from San Miguel had greater number of tillers (NS) per plant in the winter and spring seasons, and lower plant height (PH) in the spring season than the HSF derived from Oaxaca, San Miguel x Oaxaca and Oaxaca x San Miguel. The DMY and ACGR were 57 % and 33 % higher in spring than in fall and winter. The L:S was 5 % higher in fall than in winter and 30 % higher than in spring; the greatest values for NS and PH were measured in spring. The radiation use efficiency (RUE) had higher values in spring than in fall and winter with the highest values in April. The observed variability among the HSF derived from San Miguel x Oaxaca and Oaxaca x San Miguel, suggests the possibility of selecting families with higher dry matter yield. Key words: Dry matter, Herbage yield, Leaf:Stem ratio, Radiation efficiency.

Recibido 19/03/2017. Aceptado 23/10/2017.

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Introducción

La alfalfa (Medicago sativa L.) es un cultivo perenne de importancia mundial, debido a su alta calidad nutritiva, alto rendimiento, amplia adaptación, persistencia y capacidad de asociarse en simbiosis con bacterias del género Rhizobium, que fijan nitrógeno destinado inicialmente al tejido de la planta y posteriormente al suelo(1); además, entre los cultivos forrajeros, la alfalfa, registra los valores más altos en producción de proteína por unidad de superficie en clima templado(2). Los principales países productores de alfalfa en el mundo en los últimos cinco años, han sido Estados Unidos de América, Argentina, México, Irán e Italia. Sin embargo, a pesar de que México ocupa el tercer lugar en producción total, registra el mayor rendimiento anual por hectárea en zonas templadas del mundo, con una tasa de crecimiento anual de 0.74 %(3). En el año 2013, en el país, se registraron 31 millones t de forraje verde en 390 mil ha cultivadas, con rendimiento promedio de 80.71 t ha-1 año-1; siendo los estados de Chihuahua, Hidalgo y Guanajuato quienes aportaron el 46 % de la producción total del país(4). La alfalfa es una planta diploide y autotetraploide; de polinización cruzada. Su mejoramiento genético se basa en la selección fenotípica recurrente con pruebas de progenie, para acumular altas frecuencias de alelos deseables en una población(5). En Valles Altos del Centro de México, se han obtenido variedades de alfalfa adaptadas a partir de germoplasma de origen peruano y africano, al considerar como criterios de selección de estas variedades, la persistencia de las plantas, resistencia a plagas y enfermedades, grado de latencia invernal y producción anual(6). Por lo tanto, evaluar la persistencia de los cultivares, la producción de biomasa estacional y los componentes del rendimiento en poblaciones de alfalfa bajo diversas condiciones ambientales, es una herramienta importante para los fitomejoradores en la selección de cultivares superiores para usos y ambientes específicos(7). Los factores ambientales, el manejo agrícola y los organismos en el ecosistema circundante, interactúan con los cultivos de alfalfa. El dosel vegetal y la estructura de la corona permiten una amplia adaptación. Además, el sistema de raíces profundas y extensas crea un entorno de gran riqueza biológica en el suelo(1). Así, el incremento en rendimiento y sus componentes dependerá de la influencia de los factores ambientales como temperatura, radiación fotosintéticamente activa y fotoperiodo; así como de factores de manejo agrícola como la frecuencia e intensidad de corte o defoliación(8,9). En Valles Altos del Centro de México, existe una amplia gama de variedades de alfalfa de uso comercial y amplio conocimiento del comportamiento del rendimiento de materia seca en diferentes sistemas de producción y manejo. No obstante, a la fecha no existen trabajos de investigación en los que se hayan generado métodos de selección efectivos para la obtención 488

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de nuevas variedades más productivas. Al evaluar el comportamiento productivo de cinco variedades comerciales de alfalfa, en Montecillo, Texcoco, Estado de México; se determinó que las variedades comerciales San Miguel y Oaxaca con mayor persistencia, mejor adaptación y mayor rendimiento de materia seca, poseen características deseables para aumentar la producción de forraje(10). El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar en alfalfa, el rendimiento de materia seca y sus componentes, en familias de medios hermanos derivadas de las variedades San Miguel y Oaxaca, y las poblaciones San Miguel x Oaxaca (cruza directa) y Oaxaca x San Miguel (cruza recíproca), en macetas a la intemperie en cortes sucesivos en las diferentes estaciones del año.

Material y métodos

El experimento se realizó durante los ciclos otoño-invierno-primavera 2013-2014 en el área de invernaderos del Colegio de Postgraduados en Montecillo, Texcoco, Estado de México (19° 21´ N, 98° 55´ O y altitud de 2,250 msnm), clima templado subhúmedo (Cb(wo)(w)(i´)g), con lluvias en verano, precipitación y temperatura media anual de 636.5 mm y 15 °C, respectivamente(11). Se utilizaron cuatro poblaciones, conformadas por 100 familias de medios hermanos de las variedades San Miguel y Oaxaca, y las poblaciones San Miguel (♀) x Oaxaca (♂) (cruza directa) y Oaxaca (♀) x San Miguel (♂) (cruza recíproca). Éstas, obtenidas mediante cruzamiento controlado en campo, entre las variedades San Miguel y Oaxaca, en el ciclo de invierno-primavera 2005 en el Campo Experimental del Colegio de Postgraduados, Montecillo, Texcoco, Estado de México. Las familias de medios hermanos de San Miguel y Oaxaca, y las cruzas directa y recíproca entre éstas, se asignaron bajo un diseño completamente al azar en cada población. La unidad experimental consistió de una familia de medios hermanos o planta individual por maceta dentro de cada población. La siembra se realizó en cajas para almácigo el 8 de mayo de 2013, al colocar cinco semillas del mismo peso en cada celda. Cuando las plántulas tuvieron una edad de 27 días después de la siembra (dds) se trasplantaron individualmente en macetas de plástico con capacidad de 3 kg. Se utilizó un suelo esterilizado de textura franco-arenosa con densidad aparente de 1.12 g cm-3, capacidad de campo (CC) de 41.6 % y porcentaje de marchitamiento permanente (PMP) de 28.2 % (Laboratorio Central Universitario, Universidad Autónoma Chapingo, Chapingo, México). Las plántulas en las macetas se colocaron en tarimas de madera a una altura de 1 m sobre el nivel del piso en un área protegida con malla contra áfidos a la

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intemperie. Se aplicó una dosis de fertilización de 60-140-00 a los 57 dds y una segunda aplicación de la misma dosis, a los 247 dds, con urea como fuente de nitrógeno y superfosfato de calcio triple como fuente de fósforo; la alta dosis de fósforo incrementa la actividad de la fosfatasa y el crecimiento del sistema radical(12). Las macetas se regaron cada tercer día, manteniendo la humedad edáfica cercana a capacidad de campo (CC). Se hizo un corte de uniformización en todas las plantas a los 85 dds y se procedió a realizar cortes sucesivos programados cada cinco semanas en el periodo otoño-invierno 2013-2014, y cada cuatro semanas en el periodo primavera-verano 2014, a una altura de corte de 5 cm sobre el nivel del suelo. Para cada corte de midieron las siguientes variables: Altura de planta (AP) en cm, que se determinó con una regla graduada de 1 m de longitud y 5 mm de precisión, para lo cual a un lado de cada planta se colocó la regla de forma vertical sobre la superficie del suelo, y un dispositivo de la parte superior de la regla se hizo deslizar hacia abajo hasta tocar las hojas superiores de cada planta, registrándose la altura correspondiente. Número de tallos (NT) por planta, que se determinó al contar el número total de tallos presentes en cada planta al momento del corte. Relación hoja:tallo (H:T) por planta; de cada planta se tomaron cuatro tallos al azar, de los cuales se separaron las láminas foliares y los tallos, los que fueron llevados a una estufa por 48 h a 65 °C, tiempo en que alcanzaron peso constante, el cual se registró con una balanza eléctrica de alta precisión marca Excell modelo BH. Se calculó la relación hoja:tallo al dividir el peso seco del componente hoja (PSH)/peso seco del componente tallo (PST), con la ecuación siguiente H:T=PSH/PST; peso seco (PS) por planta (g); después de separar los cuatro tallos para la relación H:T, el resto de cada planta se colocó en bolsas de papel, las cuales se llevaron a una estufa por 48 h a 65 °C, tiempo en que alcanzaron peso constante. Rendimiento de materia seca (RMS) por planta (g); se calculó al sumar el peso seco por planta más el peso seco de los tallos y láminas foliares utilizados para calcular la relación hoja:tallo. Tasa absoluta de crecimiento (TAC) por planta (g MS d-1); se calculó al dividir el rendimiento de materia seca por planta/el número de días (t) transcurrido entre un corte y el siguiente (TAC=RMS/t). Eficiencia en el uso de la radiación (EUR) por planta (g MS MJ-1); se determinó al dividir el RMS entre la radiación solar acumulada diariamente (datos obtenidos de la estación meteorológica de la Universidad Autónoma Chapingo) en el periodo entre un corte y el siguiente, durante el experimento. La temperatura máxima y mínima del aire se obtuvo con un termómetro de máxima y mínima, marca Taylor modelo 5458P, colocado junto las plantas a una altura de 2 m sobre el 490

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nivel del piso. La cantidad de precipitación se determinó con un pluviómetro de acumulación semanal, colocado junto a las plantas durante el experimento. La temperatura máxima varió de 20.4 a 29.9 °C, la mínima de 1.0 a 11.4 °C y se registró una precipitación total de 583 mm, durante la estación de crecimiento y cortes subsecuentes (Figura 1). Las temperaturas registradas indicaron que las plantas estuvieron sujetas a condiciones térmicas favorables para su crecimiento, al considerar que la temperatura base (Tb) en clima templado es de 1 °C cuando la temperatura del aire (Ta) es ≤ 15°C y Tb de 5 °C cuando Ta ≥ 15 °C(8). Figura 1: Temperatura máxima, media y mínima promedio, y precipitación acumulada durante el experimento en Montecillo ciclo 2013-2014

El análisis estadístico utilizado para determinar el efecto conjunto de estaciones del año, cortes, poblaciones y familias se hizo con el programa SAS para Windows, versión 9.1, de acuerdo al siguiente modelo: Yijk = µ + Pobi + Fam(Pob)ik + Estj + Corte(Est)jl + (Pob*Est)ij + Corte(Pob*Est)ijl + Fam(Pob*Est)ijk + Eijk; Donde: Yijk: representa el valor de la variable de respuesta en la Población i del nivel j de Estación, nivel k de Familia y nivel l de Corte; µ: es la media general; Pobi: es el efecto de la Población al nivel i = 1, 2, 3 y 4; Fam(Pob)ik: es el efecto de Familias anidadas a las Poblaciones al nivel i y k;

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Estj : es el efecto de la estación del año al nivel j = 1, 2 y 3; Corte(Est)jl: es el efecto de los cortes anidados a las estaciones del año al nivel j y l; (Pob*Est)ij: es el efecto de la interacción Población x Estación del año al nivel i y j; Corte(Pob*Est)ijl: es el efecto de la interacción Población x Estación anidadas a los Cortes al nivel i, j y l; Fam(Pob*Est)ijk: es el efecto de la interacción Población x Estación anidadas a las Familias al nivel i, j, k; Eijk: es el error experimental. La comparación de medias se hizo con la diferencia mínima significativa (DMS, P≤ 0.05), con el programa estadístico SAS para Windows.

Resultados y discusión

La variabilidad en rendimiento de materia seca (RMS), tasa absoluta de crecimiento (TAC), eficiencia en el uso de radiación (EUR), relación hoja:tallo (H:T), altura (AP) y número de tallos (NT) por planta fue altamente significativa (P≤0.01) entre poblaciones, familias de medios hermanos dentro de cada población, estaciones del año, cortes dentro de estaciones del año, poblaciones x estaciones del año, familias de medios hermanos dentro de poblaciones x estaciones del año y cortes dentro de poblaciones x estaciones del año, excepto, en altura de planta para poblaciones (P≤0.05). El análisis de varianza de acuerdo al modelo utilizado para determinar los efectos de población, estación del año, cortes y familias de medios hermanos mostró que el ambiente y el genotipo influyeron en el rendimiento de forraje y sus componentes. La variación entre estaciones del año y cortes fue de mayor magnitud que la variación observada entre poblaciones, familias dentro de poblaciones y poblaciones x cortes, poblaciones x estaciones, familias dentro poblaciones x estaciones del año y cortes dentro de poblaciones x estaciones (Cuadro 1). El rendimiento de variedades de alfalfa es dependiente del efecto del genotipo, el ambiente y la interacción genotipo x ambiente. Se ha demostrado que las variedades antiguas de alfalfa, liberadas en Estados Unidos en los últimos 60 años, no difirieron en rendimiento de forraje con respecto a las variedades de reciente liberación, cuando se compararon con densidades de población similares. Sin embargo, cuando los factores 492

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bióticos y abióticos afectaron la densidad de población, se pudieron observar ganancias en rendimiento en las variedades modernas hasta del 10 % por década(13). Cuadro 1: Análisis de varianza en el rendimiento de materia seca (RMS), tasa absoluta de crecimiento (TAC), relación hoja:tallo (H:T), número de tallos (NT) y altura de planta (AP), en siete cortes y cuatro poblaciones de alfalfa Fuente de variación Poblaciones Familias (Pobl.) Estaciones Cortes (Estac.) Poblaciones*Estaciones Familias (Pobl.*Estac.) Cortes (Pobl.*Estac.) Error Media CV, %

Grados de libertad RMS 3 94.1** 375 18.9** 2 5581.8** 4 900.5** 6 13.7** 12 11.1** 741 5.0** 2586 2.4 6.6 23.6

Cuadrados medios TC H:T Altura 0.092** 3.21** 136.93* 0.019** 0.17** 142.33** 8.816** 21.94** 37427.93** 0.735** 20.32** 24132.03** 0.013** 0.40** 231.08** 0.009** 0.64** 188.72** 0.005** 0.07** 52.75** 0.002 0.59 26.74 0.198 1.22 49.98 22.293 19.86 10.34

Tallos (n) 726.58** 112.42** 16679.87** 2166.01** 322.21** 48.02** 18.68** 7.38 13.54 20.06

CV= coeficiente de variación; * (P≤0.05); ** (P≤0.001).

En RMS se detectaron diferencias altamente significativas (P≤0.01) entre estaciones del año; en primavera fue 57 % mayor que en otoño y 33 % mayor que en invierno en promedio de las cuatro poblaciones (Cuadro 2). Este incremento en el RMS se puede atribuir a las altas temperaturas registradas en primavera (máxima= 30 °C y mínima= 8 °C) en comparación con invierno (máxima= 27 °C y mínima= 4 °C) y otoño (máxima= 25 °C y mínima= 7 °C), que promovieron una mayor tasa de rebrote de yemas de las coronas formadas en otoño del año anterior(14). El conocimiento del efecto de la temperatura estacional en la dinámica de crecimiento de la alfalfa, permite determinar la frecuencia e intensidad de corte, para optimizar la producción y persistencia de los cultivares(9,15). También, se detectaron diferencias significativas (P≤0.05) entre poblaciones; las poblaciones derivadas de las cruzas San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel, produjeron 11 y 10 % mayor rendimiento de materia seca que el promedio de las variedades originales en todas las estaciones del año. En un estudio realizado en Serbia, se observó que el incremento en la producción de forraje de alfalfa con relación a los progenitores, fue de 9.1 % en la progenie F1 (cruzamientos dialélicos) y 8.1 % en la progenie OP1 (polinización abierta); así el cruzamiento de hermanos completos o medios hermanos, conlleva un incremento significativo en el rendimiento de materia seca y sus componentes(16).

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Cuadro 2: Rendimiento de materia seca (RMS), tasa absoluta de crecimiento (TAC), eficiencia en el uso de la radiación (EUR); relación hoja:tallo (H:T), altura de planta (AP) y número de tallos (NT), promedio por estación y población de alfalfa Estación Otoño

Invierno

Primavera

Promedio

DMS

Sign.

Variables RMS TAC EUR H:T AP NT RMS TAC EUR H:T AP NT RMS TAC EUR H:T AP NT RMS TAC EUR H:T AP NT RMS TAC EUR H:T AP NT RMS TAC EUR H:T AP NT

San Miguel

Oaxaca

San Miguel Oaxaca x x Oaxaca San Miguel

4.02 Cc 0.11 Cc 0.45 1.30 Aab 48.8 B 10 C 7.03 Bab 0.20 Bab 0.75 1.11 Bc 47.0 C 17 Ba 10.10 Ac 0.36 Ac 0.90 0.87 Cb 60.3 Ab 23 Aa 7.0 b 0.23 b 0.64 1.09 b 52.0 17 a 0.42 0.01

4.35 Cbc 0.12 Cbc 0.49 1.21 Ab 47.4 B 9C 6.52 Bb 0.19 Bb 0.70 1.22 Ab 46.7 B 14 Bb 10.14 Abc 0.36 Abc 0.91 0.85 Bb 64.4 Aa 17 Ac 7.0 b 0.22 b 0.64 1.09 b 52.9 13 b 0.45 0.01

4.60 Cab 0.13 Cab 0.48 1.38 Aa 47.1 B 10 C 7.5 Ba 0.21 Ba 0.80 1.32 Ba 46.8 B 14 Bb 11.25 Aa 0.40 Aa 1.00 0.98 Ca 63.1 Aa 20 A b 7.8 a 0.25 a 0.70 1.23 a 52.4 15 ab 0.49 0.02

4.93 Ca 0.14 Ca 0.53 1.36 Aa 48.4 B 10 C 7.3 Ba 0.21 Ba 0.78 1.31 Ba 48.0 B 15 Bb 10.93 Aab 0.39 Aab 0.98 0.96 Ca 63.7 Aa 17 Ac 7.7 a 0.25 a 0.70 1.21 a 53.4 14 b 0.43 0.01

0.05 1.58 1.16 ** **

0.06 1.53 0.88 ** **

0.06 1.49 0.96 ** **

0.04 1.53 0.85 ** **

** ** **

Promedio

DMS

Sign.

4.48 C 0.128 C 0.50 C 1.31 A 48.0 B 10 C 7.1 B 0.20 B 0.75 B 1.24 B 47.1 B 15 B 10.60 A 0.38 A 0.95 A 0.91 C 62.9 A 19 A

0.42 0.01

* *

0.09 1.97 1.07 0.68 0.02

* NS NS * *

0.05 1.62 1.41 0.82 0.03

* NS * * *

0.06 2.24 2.02

* * **

Diferente literal en mayúsculas en cada columna indica diferencias significativas entre estaciones (P≤0.01); diferente literal en minúsculas en cada hilera indica diferencias significativas entre poblaciones (P≤0.05); DMS=Diferencia mínima significativa; * (P≤0.05) ** (P≤0.01), NS= no significativas.

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En RMS por cortes dentro de estaciones del año se detectaron diferencias altamente significativas (P≤0.01) (Cuadro 3); el RMS promedio por corte fue mayor en los cortes de marzo y abril, que el promedio de todos los cortes (6.52 g MS planta-1). Esta mayor acumulación de forraje en marzo y abril, se debió a la presencia de temperaturas más altas (máxima= 30 °C y mínima= 8 °C), fotoperiodo más largo (12.4 h) y radiación fotosintéticamente activa más alta (10 MJ m-2 d-1) que en septiembre, octubre y noviembre (máxima= 25 °C, mínima= 7 °C, fotoperiodo= 11.6 h y radiación fotosintéticamente activa= 8 MJ m-2 d-1), y diciembre, enero y febrero (máxima= 27 °C, mínima= 4 °C, fotoperiodo= 11.2 h y radiación fotosintéticamente activa= 8 MJ m-2 d-1). En un estudio donde se evaluó el efecto de la temperatura sobre el rendimiento, al utilizar un análisis de regresión múltiple con datos climatológicos y de rendimiento colectados a través de 21 años, en Minnesota, Estados Unidos, en donde se determinó que el rendimiento de alfalfa en primavera para el segundo año de establecimiento, fue afectado positivamente por las temperaturas máximas de otoño y primavera, y temperaturas mínimas en invierno; la temperatura determinó el 50 % de la variabilidad en el rendimiento(17). De la misma manera, otros autores(18) determinaron que el mejor crecimiento de alfalfa ocurrió a temperaturas diurnas de 15 a 25 °C y nocturnas de 10 a 20 °C, rango óptimo para una alta tasa fotosintética y mayor absorción de CO2 por la planta.

Cuadro 3: Rendimiento de materia seca (RMS) promedio por corte en las diferentes poblaciones de alfalfa Cortes 30/Sep/13 29/Oct/13 28/Nov/13 06/Ene/14 13/Feb/14 20/Mar/14 17/Abr/14 Promedio Sign. DMS

San Miguel 4.70 Eb 3.60 Gb 4.16 Fb 5.33 Db 6.48 Ca 9.37 Bb 10.10 Ac 6.30 b ** 0.51

Poblaciones San Miguel x Oaxaca x Oaxaca Oaxaca San Miguel 4.49 Eb 4.37 Ea 4.48 Eb 5.10 Db 5.66 Cb 8.95 Bb 10.14 Abc 6.21 b ** 0.52

5.33 Da 3.46 Eb 5.16 Da 6.03 Ca 6.27 Cab 10.33 Ba 11.25 Aa 6.86 a ** 0.55

5.30 EDa 4.27 Fa 5.21 Ea 5.74 Dab 6.56 Ca 9.56 Bab 10.93 Aab 6.81 a ** 0.51

Promedio

Sign.

DMS

4.97 E 3.92 F 4.76 E 5.56 D 6.25 C 9.56 B 10.61 A

* * * * * * *

0.59 0.55 0.60 0.66 0.66 0.89 0.82

Diferente literal en mayúsculas en cada columna indica diferencias significativas entre cortes (P≤0.01); diferente literal en minúsculas en cada hilera indica diferencias significativas entre poblaciones (P≤0.05); DMS=Diferencia mínima significativa; * (P≤0.05); ** (P≤0.01).

Se detectaron también diferencias significativas (P≤0.05) en RMS entre poblaciones en cada corte realizado (Cuadro 3); la población San Miguel x Oaxaca produjo mayor RMS que el promedio de las poblaciones originales en 14, 16, 14, 11 y 10 %, para los cortes de

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septiembre, noviembre, enero, marzo y abril, respectivamente. La población Oaxaca x San Miguel produjo 13 % más RMS en septiembre y 17 % más RMS en octubre y noviembre. En todos los cortes realizados las poblaciones originales de Oaxaca y San Miguel presentaron menor RMS que las poblaciones de familias de medios hermanos, excepto, la población Oaxaca en el corte de octubre y la población San Miguel en el corte de febrero, meses en que presentaron rendimientos estadísticamente iguales a la población Oaxaca x San Miguel. La variabilidad observada entre las poblaciones originales y las poblaciones de las cruzas en cada corte realizado, muestra posibilidades de seleccionar familias superiores en rendimiento de materia seca, con ganancias genéticas del orden de 10 % por ciclo de selección(19). Así, la evaluación de progenitores con pruebas de progenie, mediante polinización abierta es eficaz para evaluar el rendimiento de materia seca y componentes de calidad; la prueba es eficaz si se realizan cruzas entre poblaciones genéticamente diversas, con el fin de producir la combinación de híbridos que pueden ser usados como donadores de genes en el desarrollo de nuevos cultivares sintéticos(20). La tasa de crecimiento del cultivo es el producto de la incidencia de luz sobre el dosel vegetal, la cantidad de luz interceptada por el área foliar y la eficiencia en el uso de la energía para la producción de materia seca(21). En la TAC se detectaron diferencias altamente significativas (P≤0.01) entre estaciones del año, la TAC promedio por estación más alta fue 0.38 g d-1 en primavera y la más baja fue 0.13 g d-1 en otoño (Cuadro 2). Estos resultados concuerdan con lo observado en Valles Centrales de Oaxaca, donde las mayores TAC se registraron durante la primavera, seguido de invierno, verano y otoño(22); en cambio, en Montecillo, Texcoco, Estado de México, se observó que la TAC promedio en 11 variedades de alfalfa fue mayor en verano, primavera e invierno que en otoño(23). Las altas TAC observadas en primavera e invierno, además de ser influenciadas por las condiciones ambientales, también tienen influencia de la acumulación de carbono (C) y nitrógeno (N) en la raíz y la corona. Las reservas de carbohidratos acumulados en dichos órganos, determinan la TAC del rebrote, esto principalmente después del corte y durante el rebrote temprano en primavera(24). Al comparar los valores de la TAC entre poblaciones en las estaciones del año, se observaron diferencias significativas P≤0.05), siendo San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel, las que registraron valores de mayor magnitud con relación a las poblaciones originales (Cuadro 2). Se ha demostrado que en poblaciones obtenidas mediante cruzamiento, se incrementa la acumulación de alelos deseables, es decir, la acción génica aditiva, que conlleva a un aumento significativo en la producción(5). En la TAC por corte se detectaron diferencias significativas (P≤0.05) entre poblaciones (Cuadro 4); San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel registraron una TAC mayor en 0.010 g de MS planta-1 y 0.008 g, que el promedio de las cuatro poblaciones originales (0.198 g). Tambien, la TAC, presentó diferencias altamente significativas (P≤0.01) para los siete cortes; el corte de abril fue mayor en 0.182 g, respectivamente, comparada con la media de todos los cortes (0.197 g). Esta variación es efecto de las condiciones ambientales favorables, 496

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temperaturas medias elevadas, fotoperiodo largo y mayor radiación fotosinteticamente activa en primavera que en las otras estaciones del año.

Cuadro 4: Tasa absoluta de crecimiento promedio por corte en las diferentes poblaciones de alfalfa Poblaciones Cortes 03/Sep/13 29/Oct/13 28/Nov/13 06/Ene/14 13/Feb/14 20/Mar/14 17/Abr/14 Promedio Sign. DMS

San Miguel

Oaxaca

San Miguel x Oaxaca

Oaxaca x San Miguel

Promedio

Sign.

DMS

0.134 Eb 0.102 Fb 0.119 Eb 0.152 Db 0.185 Ca 0.268 Bb 0.361 Ac 0.191 b ** 0.015

0.128 Eb 0.123 Ea 0.128 Eb 0.146 Db 0.162 Cb 0.256 Bb 0.362 Abc 0.188 b ** 0.016

0.152 Da 0.099 Eb 0.147 Da 0.172 Ca 0.179 Cab 0.295 Ba 0.402 Aa 0.208 a ** 0.017

0.151 Da 0.122 Ea 0.149 Da 0.164 Dab 0.187 Ca 0.273 Bab 0.390 Aab 0.206 a ** 0.016

0.142 E 0.111 F 0.136 E 0.159 D 0.179 C 0.273 B 0.379 A

* * * * * * *

0.017 0.021 0.017 0.025 0.019 0.025 0.029

La eficiencia con que las plantas capturan la radiación solar y la convierten en biomasa, está determinada por la eficiencia en el uso de la radiación (EUR), la cual fue mayor en primavera (0.95 g MS MJ-1) que en invierno (0.75 g) y otoño (0.50 g) (Cuadro 2). La EUR también mostró diferencias altamente significativas (P≤0.01) entre cortes, siendo mayor para el corte de marzo (0.96) y abril (0.95), y menor en el mes de octubre (0.44). Las familias de medios hermanos derivadas de las poblaciones San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel mostraron 10 % mayor EUR que las poblaciones San Miguel y Oaxaca; las poblaciones San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel mostraron mayor EUR en todos los cortes, excepto la población San Miguel en el corte de febrero y la población Oaxaca en Octubre (Cuadro 5). Otros estudios han determinado que la EUR en el cultivo de la alfalfa, puede incrementar el rendimiento en 0.6 g de MS MJ-1 a una temperatura de 6 °C y 1.6 g a una temperatura de 18 °C(25).

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Cuadro 5: Eficiencia en el uso de la radiación (EUR) promedio por corte de las diferentes poblaciones de alfalfa Cortes 03/Sep/13 29/Oct/13 28/Nov/13 06/Ene/14 13/Feb/14 20/Mar/14 17/Abr/14 Promedio Sign. DMS

San Miguel 0.47 Eb 0.40 Gb 0.48 Fb 0.60 Db 0.72 Ca 0.94 Bb 0.90 Ac 0.64 b ** 0.12

Poblaciones San Miguel Oaxaca x Oaxaca 0.45 Eb 0.49 Ea 0.51 Eb 0.57 Db 0.63 Cb 0.90 Bb 0.91 Abc 0.64 b ** 0.11

0.53 Da 0.38 Eb 0.59 Da 0.68 Ba 0.70 Bab 1.03 Aa 1.00 Aa 0.70 a ** 0.13

Oaxaca x San Miguel

Promedio

Sign.

DMS

0.53 EDa 0.47 Fa 0.60 Ea 0.64 Dab 0.73 Ca 0.96 Bab 0.98 Aab 0.70 a ** 0.12

0.50 D 0.44 F 0.55 E 0.62 C 0.69 B 0.96 A 0.95 A

* * * * * * *

0.14 0.08 0.11 0.07 0.05 0.05 0.06

La relación hoja:tallo presentó diferencias altamente significativas (P≤0.01) entre estaciones del año (Cuadro 2); la relación H:T promedio por estación fue 1.31 en otoño, 1.24 en invierno y 0.91 en primavera. Álvarez(23) al evaluar diez variedades de alfalfa demostró que independientemente de la variedad, la relación fue 1.6 en otoño, 1.4 invierno, 1.1 primavera y 1.0 verano. En cambio, otros autores(10), observaron mayor relación H:T en invierno con un valor de 1.04 y menor en primavera con 0.84. Entonces la menor relación en primavera en éste y otros trabajos, se asocia con mayores tasas de crecimiento, provocando un acelerado recambio de tejido y mayor contribución del tallo al cociente hoja/tallo(26). Durante esta estación, las hojas son más abundantes en la fase vegetativa y menos abundantes conforme la planta madura y florece debido a la senescencia del tejido, además los tallos se alargan y las ramas laterales se desarrollan(27). Se observaron diferencias significativas (P≤0.05) en la relación hoja:tallo entre poblaciones en invierno, primavera, y otoño (Cuadro 2); San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel, produjeron 11 y 9 % mayor relación hoja:tallo, que el promedio de las variedades progenitoras. Aunque el mejoramiento genético en alfalfa es complicado debido a su nivel de autotetraploidía y el alto nivel de polinización natural presente en la especie(6); Brummer(28), sugirió desarrollar poblaciones semi-híbridas, que se originan en un cruzamiento de dos poblaciones altamente heterocigóticas, con el propósito de capturar el vigor híbrido natural, el cual se verá reflejado en ganancias en rendimiento y sus componentes. En la relación hoja:tallo por cortes dentro de estaciones del año se detectaron diferencias altamente significativas (P≤0.01) (Cuadro 6), observando una disminución progresiva en los valores obtenidos conforme aumentó el número de cortes. Los mayores valores promedio

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fueron 1.50 en noviembre, 1.43 enero, 1.41 septiembre y 1.23 en febrero. Otros estudios determinaron que la relación hoja:tallo presentó cambios durante el periodo de estudio y fue más alta que la media de todos los cortes (0.79) en septiembre, octubre, enero, febrero y abril; los valores altos en la H:T observados en los meses invernales, se asocian al efecto de las bajas temperaturas en el crecimiento de las plantas, al disminuir la longitud de entrenudos, la longitud total del tallo y reducir su peso seco(10). La interacción entre la densidad de población y la etapa de madurez al corte, tienen impacto en el rendimiento de hojas y tallos, en la etapa de floración temprana, la producción de tallos y hojas es igual, mientras que en la etapa de floración tardía los tallos componen el 60 % y las hojas el 40 % del rendimiento total(29). Cuadro 6: Relación hoja:tallo (H:T) promedio por corte en las diferentes poblaciones de alfalfa Cortes 03/Sep/13 29/Oct/13 28/Nov/13 06/Ene/14 13/Feb/14 20/Mar/14 17/Abr/14 Promedio Sign. DMS

San Miguel 1.43 Aab 0.94 CDc 1.48 Ab 1.21 Bc 1.15 Bc 0.97 Cb 0.87 Db 1.15 b ** 0.07

Poblaciones San Miguel Oaxaca x Oaxaca 1.32 Bb 0.88 Ec 1.39 Bb 1.47 Ab 1.24 Cb 0.97 Db 0.85 Eb 1.16 b ** 0.08

1.51 ABa 1.17 Da 1.45 Bb 1.59 Aa 1.29 Cb 1.08 Ea 0.98 Fa 1.29 a ** 0.08

Oaxaca x San Miguel

Promedio

Sign.

DMS

1.38 Bab 1.04 Cb 1.67 Aa 1.43 Bb 1.43 Ba 1.08 Ca 0.96 Da 1.28 a ** 0.06

1.41 A 1.01 C 1.50 A 1.43 A 1.28 B 1.02 C 0.92 C

* * * * * * *

0.14 0.08 0.11 0.07 0.05 0.05 0.06

En la relación hoja:tallo entre poblaciones también se detectaron diferencias significativas (P≤0.05) para los siete cortes en las estaciones del año (Cuadro 6); la población San Miguel x Oaxaca presentó los mayores valores en los cortes realizados durante septiembre, octubre, enero, marzo y abril; mientras la población Oaxaca x San Miguel presentó mayor relación hoja:tallo para los cortes de noviembre, febrero, marzo y abril. Se observó que las poblaciones obtenidas mediante cruzamiento, presentaron 10 % mayor relación hoja:tallo que el promedio de las poblaciones Oaxaca y San Miguel. Se ha determinado que la selección en alto rendimiento de tallo es un método eficaz, para aumentar el rendimiento de forraje en alfalfa, pero al disminuir la cantidad de hojas, decrece la digestibilidad y el contenido de proteína de la planta(30). Se detectaron diferencias altamente significativas (P≤0.01) en AP entre estaciones del año; la AP promedio de las poblaciones en primavera fue 25 % mayor que en otoño e invierno (Cuadro 2). La altura de planta se relaciona con el rendimiento de materia seca; a medida que 499

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la pradera produce plantas más altas, también produce mayor rendimiento de materia seca y sus componentes tasa de crecimiento e índice de área foliar(31). Las diferencias en AP entre poblaciones también fueron significativas (P≤0.05); en primavera la variedad Oaxaca y las poblaciones San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel tuvieron 5 % mayor altura de planta que la variedad San Miguel; no se observaron diferencias significativas entre poblaciones en otoño e invierno (Cuadro 2). La variabilidad en rendimiento de materia seca, tasa de crecimiento, índice de área foliar y altura de planta, también se ha observado entre variedades comerciales de alfalfa en condiciones de campo en el Valle de México; la variedad Júpiter produjo mayor rendimiento de materia seca, tasa de crecimiento, índice de área foliar y altura de planta que la variedad Cuf 101(31). Se detectaron diferencias significativas (P≤0.05) entre poblaciones para la AP en los siete cortes realizados durante el ciclo, excepto, en los cortes de septiembre y enero (Cuadro 7). La población San Miguel registró en promedio la mayor AP promedio en los cortes de octubre y febrero, la población Oaxaca en febrero y abril, la población San Miguel x Oaxaca en marzo y abril y Oaxaca x San Miguel en noviembre, febrero y abril. También, se observaron diferencias altamente significativas (P≤0.01) en AP entre cortes; los mayores valores de AP se presentaron en los cortes de septiembre, octubre, marzo y abril, y fueron mayores que el promedio de todos los cortes (50 cm); las diferencias en altura de planta entre poblaciones y estaciones del año se deben a diferencias en el genotipo y el régimen de temperatura; por ej., se observó que la altura de planta al corte en verano fue 65 cm y en invierno fue 32 cm en Chapingo, México(32). Por otro lado, la temperatura mínima nocturna en verano es más alta que en invierno (Figura 1); estas diferencias en el régimen térmico, sin duda tienen efecto en el crecimiento y acumulación de materia seca de la planta de alfalfa.

Cuadro 7: Altura promedio por corte de las diferentes poblaciones de alfalfa Cortes 03/Sep/13 29/Oct/13 28/Nov/13 06/Ene/14 13/Feb/14 20/Mar/14 17/Abr/14 Promedio Sign, DMS

San Miguel 53.8 C 52.7 Ca 41.8 Dab 43.1 D 42.4 Da 55.7 Bc 60.3 Ab 49.9 ab ** 1.7

Poblaciones San Miguel x Oaxaca x Oaxaca Oaxaca San Miguel 53.9 C 49.3 Db 41.6 Eab 51.7 D 41.2 Ea 57.2 Bbc 64.4 Aa 49.9 ab ** 1.8

53.7 C 49.7 Db 38.6 Fb 41.7 E 39.3 Fb 60.0 Ba 63.1 Aa 49.4 ab ** 1.7

52.7 C 51.0 Cab 45.9 Da 43.6 DEd 41.4 Ea 59.2 Bab 63.7 Aa 51.1 a ** 1.9

Promedio

Sign.

DMS

53.5 C 50.7 D 42.0 E 42.5 E 41.1 E 58.0 B 62.9 A

NS * * NS * * *

2.6 2.4 5.8 2.1 1.7 2.1 2.2

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En el Cuadro 2 se presenta el número de tallos por planta en estaciones del año; a excepción de otoño se detectaron diferencias significativas (P≤0.05) entre poblaciones en invierno y primavera. La población San Miguel presentó mayor número de tallos en invierno y primavera que Oaxaca y las poblaciones Oaxaca x San Miguel y San Miguel x Oaxaca. También, se detectaron diferencias altamente significativas (P≤0.01) en el NT entre estaciones; el número de tallos promedio en primavera fue 9 y 4 tallos mayor que otoño e invierno, respectivamente. Se ha reportado que el diámetro del tallo de cada individuo de la población es altamente hereditario y controlado por los efectos genéticos aditivos, sugiriendo que la selección para mayor número y diámetro de tallos en alfalfa es factible, para aumentar el rendimiento(33). En NT en los siete cortes se detectaron diferencias significativas (P≤0.05) entre poblaciones en los cortes de febrero, marzo y abril, y no se presentaron diferencias significativas en septiembre, octubre, noviembre y diciembre (Cuadro 8). La población San Miguel registró el mayor NT promedio en los cortes de febrero, marzo y abril, la población Oaxaca y las poblaciones derivadas por cruzamiento, presentaron menor NT en los cortes de febrero, marzo y abril, siendo iguales estadísticamente. También, se observaron diferencias altamente significativas (P≤0.01) en NT entre cortes; los mayores valores de NT se presentaron en los cortes de noviembre, marzo y abril, y fueron mayores que el promedio de todos los cortes (13 tallos). La altura de corte en etapas avanzadas de maduración incrementa el rendimiento y el número de tallos por planta, al aumentar el número de tallos cerca de la superficie del suelo(33).

Cuadro 8: Número de tallos (NT) promedio por corte de las diferentes poblaciones de alfalfa Poblaciones Cortes 03/Sep/13 29/Oct/13 28/Nov/13 06/Ene/14 13/Feb/14 20/Mar/14 17/Abr/14 Promedio Sign. DMS

San Miguel

Oaxaca

San Miguel x Oaxaca

Oaxaca x San Miguel

Promedio

Sign.

DMS

8E 10 D 12 C 13 C 19 Ba 19 Ba 23 Aa 15 a ** 1.1

7E 9D 12 C 12 C 15 Bb 15 Bb 17 Ac 12 c ** 1.0

7E 9D 13 C 12 C 15 Bb 15 Bb 20 Ab 13 b ** 0.9

8E 10 D 13 C 12 C 16 Bb 16 Bb 17 Ac 13 b ** 0.9

8E 10 D 13 C 12 C 16 B 16 B 19 A

NS NS NS NS * * *

0.8 1.4 1.6 1.4 1.7 1.6 2.0

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Conclusiones e implicaciones

El comportamiento productivo de las cuatro poblaciones de alfalfa estuvo influenciado por las condiciones ambientales; el rendimiento de materia seca, tasa absoluta de crecimiento, eficiencia en el uso de la radiación y número de tallos fue mayor en primavera (cortes en marzo y abril) que en invierno (cortes en diciembre, enero y febrero) y otoño (cortes en septiembre, octubre y noviembre); la relación hoja:tallo fue mayor en otoño que en invierno y primavera. Se determinó también que las familias de medios hermanos derivadas de las poblaciones San Miguel x Oaxaca y Oaxaca x San Miguel, mostraron en promedio 10 % mayor rendimiento de materia seca, tasa absoluta de crecimiento y relación hoja:tallo que las familias derivadas de las poblaciones parentales San Miguel y Oaxaca; estas familias podrían utilizarse en un compuesto balanceado y recombinado genéticamente, para obtener una variedad sintética que podría recomendarse para condiciones similares a las que se tuvieron durante el presente estudio.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4300 Artículo

Rafael Rodríguez-Martíneza Irene Concepción Chavarría Nerib César A. Meza-Herrerac Alan Sebastián Alvarado-Espinob Juan Luis Morales Cruza Vicente Homero González-Álvarezb Ma. Guadalupe Calderón-Leyvab Francisco G. Véliz Derasa Oscar Ángel-Garcíaa*

Departamento de Ciencias Médico Veterinarias, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Torreón, Coahuila, México. b

Posgrado en Ciencias en Producción Agropecuaria, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Torreón, Coahuila, México. c

Unidad Regional Universitaria de Zonas Áridas, Universidad Autónoma Chapingo, Bermejillo, Durango, México.

*Autor de correspondencia: mvz.oscar_2207@hotmail.com

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Resumen: Se evaluó el uso de Ovsynch más dispositivo intravaginal de liberación controlada de progesterona (CIDR) en vacas altas productoras. El estudio se llevó en la Comarca Lagunera (25° 44´ N, 103° 10´ O a 1,111 msnm) durante diciembre y enero. Las vacas (n=100) se presincronizaron con dos inyecciones de PGF2α a los 35 y 47 días posparto y asignadas a dos tratamientos (n= 50): 1) El grupo OV recibió el protocolo Ovsynch: 100 µg de GnRH (i.m.; día 1), 25 mg de PGF2α (i.m.; día 7) y 100 µg GnRH (i.m.; día 9); 2) El grupo (OV+C) recibió el protocolo Ovsynch más un CIDR (1.38 g), retirado siete días después. Todas las vacas se expusieron a un protocolo de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF; 16 a 20 h posteriores a la última inyección). Se registró tanto el porcentaje de preñez, el número de vacas repitiendo celo considerando dos periodos (≤24 y ≥25 días post-inseminación), así como los días de retorno al celo. Mientras que no existió diferencia entre grupos para tasa de preñez (OV= 28 %, OV+C= 32 %; P>0.05), el porcentaje de vacas que manifestaron celo después de la IATF difirió (P<0.05) entre tratamientos durante los dos periodos estudiados, 28 vs 62 % ≤24 días; 69 vs 35 % ≥25 días; OV y OV+C, respectivamente. El promedio de días en que repitieron celo fue menor (P<0.05) en el OV+C (25 ± 1.6 vs 30 ± 1.3). El tratamiento Ovsynch+CIDR no mejoró la tasa de preñez; sin embargo, redujo la latencia en el retorno al celo, destacando como una alternativa para disminuir los días a la siguiente IA, y potencialmente para mejorar la eficiencia reproductiva y el retorno económico del hato lechero. Palabras clave: Preñez, Progesterona, Retorno a celo, Sincronización.

Abstract: The use of Ovsynch plus controlled internal drug release of progesterone (CIDR) in high producing dairy cows was evaluated. The study was carried-out at the Comarca Lagunera (25° 44´ N, 103° 10´ W, at 1,111 m asl.) during December and January. Cows (n= 100) were pre-synchronized with two injections of PGF2α at 35 and 47 d postpartum and assigned to two treatments (n= 50 each). 1) The group OV received the Ovsynch protocol: 100 µg GnRH (i.m.; d 1), 25 mg of PGF2α (i.m.; d 7), and 100 µg GnRH (i.m.; d 9); 2) The group OV+C was subjected to the Ovsynch protocol plus a CIDR (1.38 g P4) which was removed at d 7. Cows of both groups were exposed to a fixed time artificial insemination protocol (IATF; 16 to 20 h after the last injection). Response variables included pregnancy rate, cows with repeated estrus considering two periods, ≤24 and ≥25 d after insemination, and the period to return to estrus. While no differences occurred between groups regarding pregnancy rates (OV= 28 %, OV+C= 32 %; P>0.05), the percentage of cows showing estrus after IATF differed (P<0.05) between treatments for the two studied periods (28 % vs 62 % ≤24 d; 69 % vs 35 % ≥25 d; OV and OV+C, respectively). Moreover, mean of days when cows repeated estrus was lower (P<0.05) in the OV+C group (25 ± 1.6 vs 30 ± 1.3 d). Although

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the Ovsynch+CIDR treatment did not improve pregnancy rate, it reduced the latency for return to estrus, emerging as an alternative to diminish the days to the next AI, and potentially improve the reproductive efficiency and the economic return of the dairy herd. Key Words: Pregnancy, TAI, Progesterone, Return to estrus, Synchronization.

Recibido 17/10/2016. Aceptado 03/01/2018.

Introducción

En el norte de México se localiza una de las cuencas lecheras más importante del país y de Latinoamérica, en la cual existen alrededor de 250,000 vacas en ordeña, produciendo cerca de 16,000,000 L anuales(1), las cuales son manejadas en un sistema intensivo y bajo condiciones semidesérticas. En este tipo de sistema, uno de los principales problemas es la baja fertilidad durante los primeros 100 días de lactancia(2). Específicamente en la Comarca Lagunera, se reporta(3) una tasa de eliminación de vientres mayor al 35 % anual por fallas reproductivas. En efecto, en vacas altas productoras, con promedios iguales o mayores a 9,000 kg por lactancia, por lo general después del parto se presenta un desbalance energético que puede prolongar el anestro posparto(4,5); además de provocar desequilibrios hormonales(6), defectos en la ovulación(4) y deficiencias en el funcionamiento del cuerpo lúteo(7). Por otra parte, la baja manifestación de celo es otro factor que disminuye la fertilidad, ya que durante las últimas décadas se ha observado que el porcentaje de vacas que muestran signos de celo puede declinar del 80 al 50 % y la duración del celo se ha reducido de 15 a 5 h(8,9). Para tratar de incrementar la eficiencia reproductiva se han utilizado protocolos hormonales como el Ovsynch, que se basan en el uso de GnRH más prostaglandinas, que permiten la inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) sin la necesidad de la detección de celo (10,11). Dicho protocolo se ha diseñado para realizar la inseminación en el momento más apropiado en relación a la ovulación, generando mejoras en la fertilidad(12). Sin embargo, los resultados en cuanto a este protocolo han sido variables, por ejemplo, en Nueva Zelanda han reportado

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tasas de concepción a primer servicio del 39 al 52 %(13) mientras que en Estados Unidos e Inglaterra se reportan tasas del 30 al 40 %(14). Por lo anterior, se han desarrollado adecuaciones al protocolo Ovsynch, como la adición de progestágenos (11,15) a través de dispositivos intravaginales que pueden mejorar la fertilidad(15-17). Sin embargo, existen pocos reportes, y comúnmente muestran resultados contradictorios respecto al uso de esta técnica. Diversos investigadores(11,18) reportan un incremento del 5 % en la tasa de concepción entre los 32 y 60 días posteriores a la inseminación, al incluir progesterona mediante dispositivos intravaginales en conjunto con Ovsynch. Por el contrario, Bartolome et al(19) reportan que la inclusión de CIDR no mejora la tasa de gestación. En la Comarca Lagunera, a pesar de la gran importancia que reviste la industria del bovino lechero, cuyo comportamiento reproductivo genera bajas en la fertilidad de las vacas, existen pocos reportes con el objetivo de aumentar su fertilidad, motivo por el cual se evaluó el uso de Ovsynch más la inserción de un CIDR en vacas de alta producción.

Material y métodos

Localización, animales y manejo

El estudio se llevó a cabo de diciembre de 2013 a enero de 2014, en la Comarca Lagunera (25° 44’ 36’’ N y 103° 10’ 15’’ O; 1,111 msnm). Esta región se caracteriza por presentar un clima cálido extremo; con temperaturas en verano que oscilan de 23 a 43 °C, y en invierno de 2 a 9 °C, con una precipitación anual de 240 mm y humedad relativa de 29 a 83 %(20). El estudio se desarrolló en un establo bajo condiciones comerciales, con un inventario de 1,500 vacas Holstein en ordeña, las cuales se manejan en forma intensiva en corrales abiertos, alimentadas tres veces al día con una ración totalmente mezclada de acuerdo a sus requerimientos nutricionales, y sujetas a un manejo reproductivo de vacas frescas de cero a 10 días y que, con el fin de ayudar a la correcta involución uterina, reciben a los 25 días posparto una dosis de 25 mg de PGF2α. Se seleccionaron 100 vacas con un promedio diario de producción de leche de 63.5 ± 8.0 L y refractarias al tratamiento de Presynch (PgF2α, 25 mg; 35 y 47 d) y sin problemas

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reproductivos (piometras, quistes ováricos, etc.). Las vacas se dividieron en dos grupos homogéneos (n= 50 c/u) respecto al número de lactancias previas (2.92 ± 1.17) y condición corporal (3.25 ± 0.5; escala de 1-5). El primer grupo experimental (Ovsynch; OV) recibió 100 µg de GnRH (i.m.; día 1), 25 mg de PGF2α (i.m.; día 7), y 100 µg GnRH (i.m.; día 9), mientras que el segundo grupo (Ovsynch+CIDR;OV+C) se sometió al protocolo Ovsynch más un dispositivo de liberación controlada de progesterona CIDR®; 1.38 g, que se aplicó el día uno y se retiró siete días posteriores a su inserción. Las vacas de ambos grupos se inseminaron 16 a 20 h posteriores a la última inyección.

Variables evaluadas

Se determinó el porcentaje de vacas que repitieron celo después de la IATF(11), diariamente a las 0700, 1200 y 1700 h; el promedio de días (media ± eem) que las vacas manifestaron celo, el porcentaje de vacas con ciclos cortos (<16 días), ciclos normales (de 17 a 24 días), ciclos largos (de 25 a 39 días), vacas vacías y las vacas no detectadas (>39 días) después de la IATF, y la tasa preñez por diagnóstico de gestación a los 39 días posteriores a la IATF mediante ultrasonografía transrectal en tiempo real con un transductor a 7.5 MHz (Emperor CO., LTD, Modelo, EMP-820 Vet).

Análisis estadísticos

Se calcularon los porcentajes de vacas que repitieron celo después de la IATF, vacas con ciclos cortos, normales y largos, vacas vacías, vacas no detectadas en celo y la tasa de preñez, y se compararon por medio de Ji cuadrada. El promedio de días que las vacas manifestaron celo se comparó por medio de t-Student. Todas las pruebas se realizaron con el paquete estadístico MYSTAT 12 (Evenston, ILL, USA, 2000), con un nivel de significancia de P<0.05.

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Resultados

En el Cuadro 1 se muestra la respuesta reproductiva de ambos tratamientos. La tasa de preñez fue similar entre tratamientos, encontrándose 28 % para el OV y 32 % para OV+C (P>0.05). El porcentaje de vacas que retornaron al celo antes de los 25 días después de la IATF fue mayor (P<0.05) en las vacas del grupo OV+C (64 %) que en las del grupo OV (30 %). El porcentaje de vacas que manifestaron celo después de los 25 días post-inseminación fue mayor (P<0.05) en el grupo OV (69 %) respecto al grupo OV+C (35 %). Con respecto a la latencia de retorno a celo después de la IATF, los valores promedio menores fueron observados en el grupo-OV+C con respecto al grupo OV (P<0.05).

Cuadro1: Variables reproductivas en vacas sometidas al protocolo Ovsynch (OV; n=50) y Ovsynch más CIDR (OV+C; n=50), durante diciembre-enero Variables

% Acumulado

OV+C

% Acumulado

Preñez, % Vacas vacías, %

28a (14/50) 72a (36/50)

32a (16/50) 68a (34/50)

Días que repitieron celo: ≤16 17-24 25-39 >39*

6c (2/36) 25a (9/36) 33c (12/36) 36a (13/36)

6c (2/36) 31a (11/36) 64c (23/36) 36a (13/36)

21d (7/34) 44a (15/34) 15d (5/34) 21b (7/34)

21d (7/34) 64a (22/34) 80d (27/34) 20b (7/34)

Promedio de días abiertos

34.2±1.3a

24.8±1.6b

Valores con diferentes superíndices difieren (P<0.05). Valores con diferentes superíndices difieren (P<0.06). * Porcentaje de vacas no detectadas después de los 39 días.

a,b c,d

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Discusión

El porcentaje de preñez general fue del 30 %, cercano al 33 % reportado por Mellado et al(21) para esta región. La adición de progesterona (P4) al protocolo Ovsynch no mejoró la tasa de gestación a la primera IA, lo que concuerda con lo reportado en diversos trabajos(22,23). Contrario a lo anterior, se han reportado mejoras de ~ 5-7 % en la preñez mediante el uso de CIDR durante el programa Ovsynch antes de la IA(11,24,25). Además EI-Tarabany(26) reportó una mayor tasa de concepción a los 28 días después de la IA, utilizando Ovsynch más CIDR (35.9 %), respecto al Ovsynch (22.5 %). Es probable que la tasa de concepción fue similar entre los grupos de este trabajo, porque algunas de las vacas se encontraban ciclando al momento de someterlas al tratamiento, y la adición de progesterona exógena no tuvo efecto debido a la presencia de progesterona natural, ya que se sabe que las vacas que están cíclicas responden mejor al tratamiento con Ovsynch que las anovulatorias(11). Esto concuerda con lo reportado por Singh et al(27), quienes indican que el uso de este protocolo más el CIDR aumenta la tasa de fertilidad en las vacas anovulatorias. El porcentaje de vacas que retornaron al celo después de la IATF antes de los 25 días fue mayor en las vacas OV+C (62 %) que en las OV (31 %), probablemente porque el 41 % de las vacas del OV+C que presentaron celo del día 17 al 24 respondieron al tratamiento, y al no quedar gestantes, presentaron un ciclo ovárico de duración normal, lo que concuerda con lo reportado por Azevedo et al(28), quienes mencionan un efecto positivo del uso del CIDR sobre la actividad ovárica y estral, ya que las vacas tratadas con CIDR tuvieron dos veces más probabilidad de presentar ciclos de duración normal al no quedar preñadas, que las tratadas con Ovsynch pero sin CIDR (59 vs 39 %, respectivamente). En este sentido, se menciona(29) que las vacas sometidas al CIDR presentan un folículo dominante de mayor tamaño al momento de retirar el dispositivo, y una mayor tasa de concepción que las que no lo recibieron. De la misma manera, Wiltbank et al(25) reportan que las vacas con altos niveles de P4 mostraron un mayor porcentaje de gestación en el diagnóstico al día 29 postinseminación, y fueron menos susceptibles a la pérdida de preñez después de este tiempo. Por lo tanto, existe un efecto positivo de los elevados niveles de P4 previos a la IA, sobre el subsecuente mantenimiento de la preñez. Es probable que en este estudio, las vacas OV+C presentaran un mayor tamaño folicular y una mejor calidad del ovocito, propiciando un mejor desarrollo embrionario, reduciendo de esta forma las pérdidas embrionarias(15). La adición de P4 en el protocolo OV+C posiblemente provocó que los folículos fueran de mayor tamaño y tuvieran un mayor número de células foliculares que pudieron convertirse en células lúteas y sintetizar una mayor cantidad de progesterona(30); y que esta disponibilidad de P4 en la fase temprana del diestro ayudó a obtener una mayor tasa de preñez y supervivencia del embrión en estas vacas(31). En contraste, las vacas del protocolo OV que no recibieron la adición de 512

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P4 tuvieron probablemente folículos pequeños que pudieron ser insuficientemente maduros y no producir cantidades suficientes de estradiol; y por consiguiente tuvieron un CL de baja calidad, procediendo una luteólisis que pudo provocar la muerte embrionaria y por consiguiente una baja tasa de preñez, además de que estas vacas presentaran una mayor incidencia de retorno a celo y ciclos más prolongados(31). El porcentaje de vacas del grupo OV que retornaron al celo durante el periodo de los 17 a 24 días es cercano al 21 % reportado por Werven et al(32). Sin embargo, después de los 25 días, en este grupo se observó una mayor incidencia de vacas que presentaron celo respecto al OV+C, lo que sugiere que parte de estas vacas tuvieron un ciclo ovárico largo, ya que probablemente quedaron gestantes y sufrieron pérdidas embrionarias, tal como se ha señalado(31). En efecto, cuando no se adiciona P4 con el protocolo Ovsynch, el desarrollo folicular, embrionario y fetal son de baja calidad(33,34), ya que la P4 exógena durante esta etapa, evita la maduración prematura del ovocito al provocar una menor exposición a la LH, lo que se traduce en un mejor desarrollo folicular y sincronización de la ovulación(33), además de impactar positivamente en la calidad del ovocito y del desarrollo embrionario subsecuente(34). Finalmente, mientras que al día 24, el 60 % de las hembras del grupo OV+C había retornado al estro, en el grupo OV sólo el 25 % mostró estro al día 24, observando una reducción promedio de 10 días abiertos a favor el grupo OV+C. Aunque en el presente estudio no se realizó un análisis de sensibilidad económica, se han reportado costos de $ 6.10 USD por día abierto, observando una reducción promedio de 10 días abiertos a favor del grupo OV+C. Dicho costo incluye pérdidas económicas relacionadas a producción de leche y terneros, costos asociados a fallas reproductivas, inseminación artificial y tratamientos, así como costos de manejo(35).

Conclusiones e implicaciones

Tanto el protocolo Ovsynch como el uso del Ovsynch+ CIDR-P4 presentaron tasas de fertilidad comparables. Sin embargo, aunque el protocolo Ovsynch + CIDR no incrementó la tasa de preñez en vacas Holstein con altos niveles de producción láctea sometidas a primer servicio, sí promovió una reducción en la latencia en el retorno al celo. Por lo tanto, puede ser una alternativa para que las vacas repetidoras lo hagan en un ciclo de alrededor de 21 días, disminuyendo los días a la siguiente IA, lo que potencialmente puede contribuir a mejorar la eficiencia reproductiva y por ende, el retorno económico del hato lechero al

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disminuir el número de servicios por concepción, reducir el intervalo entre partos y los desechos tempranos por fallas reproductivas.

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Luis Gerardo Barriada-Bernala* Lilia Méndez-Lagunasb Juan Rodríguez-Ramírezb Sadoth Sandoval-Torresb Laura Aquino-Gonzálezb

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Oaxaca. Hornos 1003, Colonia Noche Buena; 71230, Santa Cruz Xoxocotlán, Oaxaca, México. Teléfono 01(55)9515170610 ext. 82753. b

Instituto Politécnico Nacional. Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Oaxaca. México.

*Autor de correspondencia: lgbarriada@conacyt.mx

Resumen: Dentro de la industria pecuaria, el diseño de dietas adecuadas para la productividad y salud de los animales es esencial. Para lo anterior, comúnmente se emplean raciones que combinan alimentos de volumen (aporte de fibra) y alimentos concentrados como los cereales (aporte energético), leguminosas (aporte proteico) y concentrados minerales. Mucuna spp., es una leguminosa tropical cuyas características nutricionales, para el área pecuaria, han sido subaprovechadas. La semilla de mucuna posee características nutricias de importancia para el sector pecuario tales como: 1) concentración (base seca) de proteína cruda y energía de 20

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al 30 % y de 15.7 a 24.7 MJ kg-1, respectivamente, 2) presencia de ácidos grasos insaturados, y 3) concentración de anti-nutrientes similares a otras leguminosas dentro de los cuales la concentración de la L-3,4 dihidroxifenilalanina (L-DOPA,) puede ser fácilmente reducida hasta no provocar efectos adversos en el crecimiento y desarrollo animal. Adicionalmente, la semilla de mucuna es un alimento económicamente ventajoso, ya que se considera como residuo de otras prácticas agrícolas. El propósito de este trabajo es presentar una revisión de la información disponible respecto a la concentración de componentes nutricionales presentes en la semilla de Mucuna spp. de interés para sistemas de producción y crianza animal. Palabras clave: Proteínas, Aminoácidos, Carbohidratos, Ácidos grasos, Fibra cruda, Antinutrientes, Mucuna.

Abstract: Adequate design of diets to animal health and productivity is essential in livestock industry. For the above, commonly are use bulky ingredients (fibrous sources) combined with a concentrates ingredients as cereals (energy sources), legumes (protein sources) and mineral concentrates. Mucuna spp. is a tropical legume in which its nutrients characteristics have been underutilized by livestock industry. Mucuna seed have an important nutritional characteristics as feedstuff: 1) Crude protein and energy concentration (dry matter basis) of 20 to 30 % and 15.7 to 24.7 MJ kg-1, respectively; 2) Presence of unsaturated fatty acids; 3) Similar concentration of anti-nutrient factors than other legumes, within which L-3,4 dihidroxiphenilalanine (L-DOPA,) can be easy reduced until no adverse effects on animal growth are noted. In addition, mucuna seed is a feedstuff economically advantageous, since is commonly considered as agriculture waste. The aim of this paper is to present a review of available information about the presence and concentration of nutritional compounds in the seed of Mucuna spp. with high potential for livestock industry. Key words: Protein, Aminoacids, Carbohydrates, Unsaturated acids, Crude fiber, Antinutrients, Mucuna.

Recibido 16/07/2016 Aceptado 01/11/2017

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Introducción

Actualmente, la industria pecuaria experimenta una fuerte presión, derivada de múltiples factores que la limitan para poder satisfacer la demanda creciente por parte de los mercados nacionales, de proteína de origen animal con características nutricionales específicas(1). La industria pecuaria emplea una limitada variedad de fuentes de alimento, tanto de origen vegetal como animal, especialmente aquéllas que también son empleadas como ingrediente principal en productos procesados destinados a la nutrición humana; por lo que este factor limita significativamente su desarrollo. El empleo de alimentos derivados de fuentes que son sub aprovechadas, y que poseen características nutricias tales que puedan ser empleadas en las dietas de los animales de cría/engorda, se constituyen en una opción que puede mejorar la competitividad de la industria(2,3,4). La formulación de dietas para la cría/engorda de rumiantes y no rumiantes, busca cubrir requerimientos específicos, tales, que permitan mejorar la capacidad de ingestión, mejorar la deposición proteica sobre los tejidos del animal en función del peso, así como el equilibrio entre los costos de los alimentos y las ganancias derivadas del aprovechamiento del animal(5). En las zonas tropicales y subtropicales existe una amplia variedad de recursos que son factibles de ser utilizados en la alimentación animal. Entre estas opciones se incluyen los granos de especies consideradas como no aprovechadas o como cosechas menores. Mucuna spp. es una herbácea anual de características taxonómicas y nutricias similares a otras leguminosas (Phaseolus vulgaris, Glycine max, entre otras), pero con un alto grado de variabilidad en sus propiedades nutricionales intra e interespecíficas, propias de especies con un grado bajo de domesticación, y cultivada bajo una amplia variedad de condiciones edafoclimáticas(6,7). La clase de semillas a la que pertenece mucuna, se le denomina como “de interés”, y comprenden a aquellas fuentes alimenticias no tradicionales, que tienen la presencia y concentración de compuestos de alto valor económico/nutricional (referidos principalmente a aminoácidos y carbohidratos), con potencial de convertirse en un producto agropecuario de alto valor(8). La semilla de mucuna presenta compuestos reconocidos como antinutricionales y cuya sola presencia en las raciones dietarias podría reducir la disponibilidad biológica y la digestibilidad de uno o más nutrientes, ocasionando la disminución de la función digestiva, la eficiencia reproductiva y la respuesta inmune(9,10). Existen experiencias exitosas que indican que las concentraciones de dichos compuestos antinutricionales, no son un

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impedimento en su empleo en las dietas para animales rumiantes(11,12) y no rumiantes(13,14,15) destinados al consumo humano. En la presente revisión, se analizan los diferentes compuestos en Mucuna spp. discutiendo su posible valor nutricio como alimento alternativo o como complemento dietario en animales de crianza para consumo humano.

Aporte energético

Cubrir las necesidades energéticas mediante el empleo adecuado de ingredientes en las dietas para animales, es un apartado de gran importancia dentro del área pecuaria(16), debido a que los costos de energía para el mantenimiento de los animales representa del 60 al 80 % del total de la energía consumida en el sistema de crianza(16,17). El empleo de granos y pastos, con o sin adición de complementos, así como aportes dietarios derivados de la ingesta no controlada de otras especies vegetales, constituyen la fuente principal de energía para animales de crianza(18). La mayoría de los carbohidratos de la semilla de mucuna son azúcares no reductores; siendo los almidones los de mayor concentración (Cuadro 1). De acuerdo al contenido de almidones presentes en diferentes especies de mucuna se infieren variaciones intra e interespecificas importantes; entre las especies reportadas, Mucuna preta es la de mayor concentración, 41.17 %(19), mientras que M. veracruz var. cáscara moteada es la de menor concentración, 22.9 %(20). En cuanto a los azúcares reductores, estos representan apenas entre el 3 al 5 % de la semilla, siendo M. deeringeana la de mayor concentración, 5.5 %(20), y M. ghana la de menor concentración 1.5 %(19).

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Azúcares no reductoresα

Almidónα

Energía en brutoγ

44.9±0.25 62.43 44.8±0.35

334±3.61 237 430±4.04

2.56±0.34 / 3.78±0.45

37.5±0.31 40.5 36.8±0.23

22.7±0.23 17.17 21.8±0.45

49.7±0.23

554±4.85

4.01±0.48

40.1±0.34

22.9±0.35

46.4±0.34

480±4.56

2.66±0.06

39±0.29

23.1±0.39

M. veracruz (cáscara moteada)(20)

45.6±0.18

301±3.60

4.14±0.1

22.9±0.22

22.9±0.29

M. deeringeana(20)

45.2±0.2

550±3.20

3.3±0.27

24.7±0.26

24.7±0.12

M. utilis (cáscara

M. utilis (cáscara negra) (35) M. utilis(35) M. monoesperma(36) M. gigantea(35) M. pruriens (begur)(56)

/ 59.27 / / /

/ 154 / / /

/ / / / /

/ 39.43 / / /

16.4 16.9 18 15.7 16.5±0.57

M. pruriens var IRZ(56) M. georgia(36) M. ghana(36) M. preta(36) M. jaspeada(36) Phaseolus vulgaris (23,24) Helianthus annuus(22) Gossypium spp. (22) Zea mays(21)

/ 61.3 62.78 66.47 63.74 / / / /

/ 283 150 300 319 / / / /

/ / / / / 2.5-5 2.2 0.9 1.7

/ 40.89 40.13 41.17 39.22 34-48 0.5 0 72

17.2 ±0.33 16.83 16.67 16.7 16.66 13.9 25.3 21.3 14.8

M. pruriens(20) M. pruriens(36) M. cochinchinesis(20) M. rajada(20) M. veracruz (cáscara

blanca)(20)

blanca)(36)

Azúcares reductoresβ

Carbohidratos

Cuadro 1: Carbohidratos presentes en semillas de mucuna

α Valores porcentuales promedio en la semilla en base seca. β mg 100 g-1 de semilla en base seca. γ MJ kg-1 en la semilla en base seca.

El contenido de almidón de la semilla de mucuna representa entre el 16 y 41 % del contenido de almidón del grano de Zea mays, maíz(21); que está por encima de otras semillas forrajeras de interés como Helianthus annuus, girasol; con concentraciones porcentuales promedio de 0.5 %(22). En comparación con otras leguminosas como Phaseolus vulgaris (frijol común), las semillas de mucuna tienen concentraciones comparables de almidón(23,24). El aporte energético de los carbohidratos dentro de las dietas para animales, está condicionado, por completo, por el tipo de aparato digestivo del animal, rumiante o no rumiante. La eficiencia parcial del aporte energético obtenido a través de los procesos

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fermentativos, digestivos y metabólicos, está estrechamente relacionada con el aporte de energía neta para el mantenimiento y producción(25). La capacidad de empleo de la energía proveniente de los carbohidratos presentes en la dieta de los animales difiere entre especies rumiantes y no rumiantes(26). En rumiantes, del 60 al 80 % de los carbohidratos ingeridos son fermentados en el rumen produciendo ácidos grasos volátiles (AGV) y energía para la síntesis microbiana. Los AGV son absorbidos a través de la pared rumial y empleados como energía por el animal. De los carbohidratos que escapan a la fermentación ruminal, una parte es digerida y absorbida en el tracto posterior(27,28). El aporte energético y su empleo en sistemas pecuarios de semillas de mucuna son poco conocidos. En dietas para rumiantes se han reportado 9.7 MJ kg-1, mientras que reportan valores de EM de 15.48 MJ Kg-1 en dietas suplementadas para no rumiantes(13,14). Estos valores se encuentran debajo de los reportados por la Fundación Española para el Desarrollo de la Nutrición Animal(22) en una amplia variedad de semillas (Cuadro 2). Los valores reportados sugieren que la digestibilidad de mucuna es baja, indicando la presencia e interacción de compuestos antinutricionales (polifenoles, inhibidores de la tripsina, altas cantidades de fibra, entre otros); de dietas constituidas de manera inadecuada, así como de combinaciones, en cantidad y variedad, de ingredientes incorrectos(29).

Cuadro 2: Digestibilidad y energía metabolizable de leguminosas

Mucuna prurensis(13,14) Glycine max(22) Helianthus annuus(22) Gossypium spp(22) Zea mays(22)

Energía metabolizableα (Bovinos) 9.7 14.95 18.6 0. 12.6 11.71

Digestibilidad

Energía metabolizableα (Porcinos)

Digestibilidad

0.63-0.69 0.9 0.86 0.8 0.65

15.48 16.90 18.8 13.3 14.22

0.55 0.84 0.80 0.55 0.73

α MJ Kg-1 en la semilla en base seca.

El aumento en la digestibilidad de mucuna puede abordarse a partir de varios factores: i) la reducción de los compuestos antinutricionales, ya que múltiples referencias indican que el empleo de una extracción acuosa a temperaturas moderadas (40 a 50 °C) reduce significativamente la concentración de compuestos fenólicos (fenoles, taninos y saponinas) y farmacológicos (L-3,4 dihidroxifenilalanina, L-DOPA), así como la inhibición de la actividad biológica de los compuestos enzimáticos (inhibidores de la tripsina), sin afectar significativamente la mayoría de las características nutricias de interés(30-33); ii) la reducción del contenido de fibra cruda en las dietas(34). La fibra cruda oscila entre 11.55 % del peso

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seco de la semilla de Mucuna utilis var. cáscara blanca(35), y el 1.54 % del peso seco de la semilla de M. utilis(36) colocándola entre el rango para Zea mays y Glycine max, 5 y 16 %(37), pero superior a Phaseolus vulgaris, 1.77 a 2.77 %(37).

Ácidos grasos

El empleo de ácidos grasos en la formulación de las dietas para rumiantes y no rumiantes, se lleva a cabo cuando se desea aumentar o complementar la ingesta calórica; sobre todo en aquellas situaciones en que el apetito se ve restringido, como escasez, mala formulación de la dieta, o cuestiones sanitarias(38,39). Así mismo, se ha correlacionado el efecto del aumento en la ingesta de ácidos insaturados con una reducción de la concentración de grasas saturadas sobre los tejidos musculares del animal. Diferentes cereales se suministran al ganado en su forma entera, adicionados directamente a la ración, o bien molidos o granulados, debido a la presencia mayoritaria de ácidos insaturados de cadena corta(40). Comúnmente, las semillas empleadas para suplementar con ácidos grasos las dietas animales, son semillas oleaginosas como Gossypium spp, Helianthus annuus y Carthamus tinctorius; y en menor grado Glicine max, Vicia faba y Linum usitatissimum(5). En semillas de la especie Mucuna spp., existen pocas referencias del perfil y concentración de ácidos grasos(35,36). Se han reportado 11 ácidos grasos identificados, siendo los ácidos poliinsaturados los de concentración relativa más baja (ácido oléico 14 a 39 %, ácido linoleico 21 a 44 %, y ácido linolénico 21 a 44 %). Los perfiles de ácidos grasos muestran diferencias intra e interespecíficas(35,36), particularmente en la presencia/ausencia de ácidos del complejo omega 9 (C16:n-9, C20:n-9, C22:n-9), de ácido behénico (C20:0), y de ácido lingocérico (C24:0). La concentración porcentual de ácidos grasos saturados e insaturados en la semilla de mucuna la hace ideal para incluirla en complementos dietarios. No existe información relacionada con la evaluación sensorial, metabólica o de aspectos relacionados con la engorda de animales, evaluados desde el punto de vista de raciones dietéticas enriquecidas con ácidos grasos provenientes de semillas de mucuna, ya sea en forma de la adición de semillas enteras, harina, o como un complemento adicionado a los alimentos balanceados para animales.

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Contenido proteico

Una evaluación del aporte proteínico de semillas de Mucuna spp. en dietas animales índica un contenido entre el 20 al 30 % (Cuadro 3); siendo la fracción globular la de mayor concentración. Al igual que otras semillas, la fracción y la concentración de proteína parecen ser afectadas por el genotipo y condiciones edafoclimáticas(41,42). Mohan y Janardhanan(35) realizaron un análisis intra e inter específico (Mucuna utilis variedades cáscara blanca y negra; y M. monosperma) determinando valores de 27 a 29 % de proteína cruda total; reportando a las globulinas como las de mayor concentración (11 a 14 % del contenido proteínico total), y las prolamidas las de menor presencia (0.68 % a 0.89).

/ / / / 11.7 12.5 / 14.0 / / / / / / /

/ / / / 0.76 0.89 / 3.34 / / / / / / /

/ / / / 1.92 1.75 / 8.45 / / / / / / /

α Valores promedio porcentuales en la semilla en base seca. β Valores expresados en gramos de la fracción proteica 100 g-1 de semilla en base seca. /= no presente, no cuantificado, o por debajo del límite de cuantificación.

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Total

/ / / / 8.39 8.32 / 4.22 / / / / / / /

Glutelinasβ

Prolamidasβ

32.3 / 31.8 / 23.4 22.73 / 20.4 31.6 17.91 / / / / /

Globulinasβ

38.4 33.2 37.8 38.2 25.7 29.6 29.62 23.5 37.5 28.9 27.17 29.31 29.16 27.95 27.56

Albuminasβ

M. cochinchinesis(20) M. rajada(20) M. veracruz (cáscara blanca)(20) M. deeringeana(20) M. utilis (cáscara blanca)(35) M. utilis (cáscara negra)(35) M. utilis(36) M. monoesperma(35) M. pruriens(20) M. pruriens(13) M. pruriens var IRZ(36) M. georgia(36) M. ghana(36) M. preta(35) M. jaspeada(35)

Proteína verdaderaα

Proteínaα

Cuadro 3: Proteínas en semillas de Mucuna spp.

70.7 33.2 69.6 38.2 71.87 75.79 29.62 73.91 69.1 46.81 27.17 29.31 29.16 27.95 27.56

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Adebowale et al(20) realizaron así mismo un análisis intra e interespecífico (Mucuna pruriens, M. cochinchinensis, M. rajada, M. deeringeana, M. veracruz blanca y M. veracruz moteada); reportando contenidos promedio de 27 % de proteína cruda total. Resultados similares se han obtenido al caracterizar las proteínas crudas totales en otras poblaciones de M. prurensis, en donde el contenido reportado, en base seca, se sitúa entre 27.9 y 30.1 %(31,43). Al comparar los valores reportados para otras especies forrajeras, la semilla de mucuna exhibe contenidos de proteína cruda mayores a los considerados para las leguminosas, 20 a 26 %(21), encontrándose dentro de los rangos de las semillas consideradas como altas en contenidos de proteína, a Gossypium spp., con 31 %(37). En cuanto a la digestibilidad, se han realizado ensayos in vivo(13) con coeficientes ≈50 % en no rumiantes; mientras que en ensayos in vitro(35), los coeficientes se encuentran en un rango de 64 a 71 %. Estos valores son ligeramente inferiores para los reportados en pruebas in vivo(22) para semillas de Helianthus annuus y Zea mays en alimentación de rumiantes, cerdos y aves (86, 80 y 89 % para semillas de H. annuus, y de 65, 73 y 83 % para semillas de Z. mays). Se ha reportado la digestibilidad de proteínas de mucuna por encima del rango de otras semillas de uso intensivo en el área pecuaria, como Glicine max y Oriza sativa y de otras leguminosas como Phaseolus vulgaris(44). Experiencias con animales, principalmente no rumiantes, mostraron que no existen diferencias significativas (en los pesos finales de los animales, así como en la retención y disponibilidad de nitrógeno) cuando se suplementó como parte de las dietas con semilla pre tratada de mucuna(45,46,47).

Aminoácidos

Existe escasa información con respecto al perfil de aminoácidos obtenidos a partir de los extractos proteínicos de las semillas de Mucuna spp. Adebowale et al(20) reportaron 18 aminoácidos, siendo la prolina, el ácido aspártico, la glutamina y el ácido glutámico, los de mayor concentración. Los aminoácidos esenciales para la nutrición pecuaria se muestran en el Cuadro 4.

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M. prurensisβ, (56)

M. deeringeanaα, (20)

M. Veracruz var moteadaα, (20)

M. Veracruz var blancaα,

(20)

M. rajadaα. (20)

M. conchinchinensisα, (20)

M. prurensisα, (20)

M. monoespermaα. (35)

M. utilis var. blancaα(35)

M.utilis var. negraα,(35)

Cuadro 4: Aminoácidos identificados en semillas de Mucuna spp.

Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina cisteína

29.3 72.0 66.8 56.1 27.0

30.1 80.2 66.1 59.8 /

26.8 63.1 51.9 52.4 /

36.7 96.7 77.8 78.5 /

23.6 90.8 72.7 67.8 23.6

35.7 88.7 67.8 56.7 12.6

37.9 89.5 70.7 80.4 /

45.9 88.6 75.8 74.5 /

44.9 98.5 80.4 79.5 22.0

3.47 4.16 7.88 6.18 1.07

Fenilalanina tirosina Treonina Triptófano Valina Proteína total

89.3 49.1 / 33.9 75.7

184 12.7 / 45.9 71.8

93.7 33.6 / 44.9 73.9

91.8 46.7 20.9 57.8 69.1

100 50.4 23.4 69.8 70.7

109.9 54.4 34.3 69.4 33.2

100.2 66.3 23.4 66.8 69.6

78 97.4 21.3 62.2 37.9

71.7 60.8 21.2 76.4 38.2

9.35 3.58 1.22 4.23 69.1

/ No presente, no cuantificado, o por debajo del límite de cuantificación. α gramos de aminoácido kg-1 de semilla en base seca. β valores calculados en gramos de aminoácido g-1 de nitrógeno total cuantificado.

Diferencias intra e interespecíficas se acentúan en algunos de los aminoácidos; por ejemplo, la combinación metionina/cisteína y el triptófano; cuyas concentraciones determinadas en más de la mitad de las especies y variedades de mucuna descritas, se encuentran en concentraciones tales que se les considera como los aminoácidos limitantes; mientras que en otras especies se encuentran por arriba de los valores de otras leguminosas (p. ej. Glicine max). Este comportamiento se observa en semillas de otras especies, sobre todo en aquéllas que no han sido sujetas a procesos de manejo/mejoramiento agrícola (“domesticación”). Independientemente de la especie o variedad evaluada, las semillas de mucuna son una fuente importante de leucina y lisina.

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Minerales

En las semillas de mucuna, se ha documentado la presencia de siete de los nueve macrominerales esenciales, minerales de requerimientos de más de 70 mg kg-1 de peso del animal (Cuadro 5); siendo deficientes en compuestos azufrados y clorados. Las deficiencias se acentúan dentro del grupo de los microminerales (requerimientos menores de 70 mg kg-1 de peso), donde sólo están presentes 4 de los 14 considerados como esenciales(21).

Cuadro 5: Minerales presentes en semillas de mucuna M. cochinchinesis(20) M. rajada(20) M. veracruz (cáscara blanca)(20) M. veracruz (cáscara moteada)(20) M. deeringeana(20) M. utilis (cáscara blanca)(35) M. utilis (cáscara negra)(35) M. gigantean(56) M. utilis(35) M. monoesperma(35) M. pruriens(20) M. pruriens(56) M. pruriens, var IRZ(36) M. georgia(36) M. ghana(36) M. preta(36) M. jaspeada(36)

Naα

Kα

Caα

Mgα

Pα

Feα

Cuα

Znα

Mnα

0.002 0.002 0.004 0.003 0.004 0.071 0.004 / / 0.062 0.003 / / / / / /

0.004 0.41 0.433 0.356 0.433 1.66 0.361 0.23 0.003 1.761 0.389 1.11 0.005 0.003 0.005 0.005 0.008

0.293 0.258 0.359 0.008 0.359 0.759 0.408 0.518 0.0002 0.172 0.262 0.25 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001

0.05 0.06 0.07 0.059 0.07 0.271 0.073 / 0.0002 0.072 0.053 / 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002

0.568 0.601 0.459 0.566 0.459 0.327 0.607 0.194 0.0005 0.129 0.457 0.22 0.0005 0.0005 0.0004 0.0005 0.0005

0.015 0.009 0.014 0.02 0.014 0.006 0.018 / 0.01 0.005 0.015 / 0.010 0.009 0.010 0.009 0.006

0.001 0.001 0 0 0 0 0.001 / 0.004 0 0.001 / 0.001 0.002 0.003 0.002 0.001

0.002 0.002 0.004 0.004 0.004 0.002 0.006 / 0.005 0.001 0.004 / 0.003 0.003 0.003 0.004 0.004

0 0 0 0 0 0.009 0 / 0.006 0.008 0 / 0.006 0.007 0.006 0.006 0.005

α Los valores se expresan en gramos 100 g-1 de semilla en base seca. / No presente, no cuantificado, o por debajo del límite de cuantificación.

Además de los nutrientes mencionados, existen diferencias intraespecíficas e interespecíficas aparentemente condicionadas por variables edafoclimáticas y estado fenológico del grano. Mucuna utilis var. cáscara blanca(35), es la de mayor concentración de macrominerales, particularmente de aquéllos de mayor interés por su alto costo, los cuales son suplementados en las dietas (sodio, 0.071 g; calcio, 0.408g; fósforo, 0.327 g por 100 g-1 de semilla). Por otra parte mientras que M. utilis tiene la menor concentración de calcio (0.0002 g 100 g-1) y fósforo (0.0005 g por 100 g-1)(35). En comparación con otras semillas, las concentraciones de macrominerales y microminerales son claramente inferiores a la mayoría de los cereales de uso intensivo, lo que constituye un 528

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claro indicativo de la necesidad de suplementar las dietas animales con sales minerales cuando el principal ingrediente sean las semillas de mucuna. Al incorporar la semilla de mucuna en dietas animales, se debe elegir preferentemente las proporciones que mejoren la relación disponibilidad / costos de los complementos minerales.

Antinutrientes

Los factores antinutrientes son compuestos, que al ser ingeridos, son adversos desde el punto de vista nutricional, ya que reducen el consumo de alimentos, modifican el proceso digestivo normal, así como la absorción y la utilización de nutrientes(48). Cuando se habla de material vegetal, a los metabolitos secundarios se les considera como los antinutrientes(49,50). Son mecanismos de defensa inducidos y contra constitutivos contra la herbívora de animales e insectos, la infección de microorganismos, y como respuesta sistémica a condiciones medioambientales estresantes(49,50). Los componentes antinutricionales más importantes en semillas de Mucuna spp. son: i) la LDOPA, siendo el anti nutriente que puede catalogarse como “limitante” en el aprovechamiento de mucuna, ii) poli fenoles, iii) taninos, iv) inhibidores de proteasas (siendo los de mayor concentración), v) lecitinas. El contenido de fenoles totales varía de 30 a 90 g kg-1 de semilla(20,35). La L-DOPA se mantiene entre el 3 al 7 %(35), siendo M. deeringeana la de menor concentración, 3.87 %(35). A los compuestos considerados como antinutrientes se les atribuyen efectos adversos como la diminución de la capacidad de digestión de los carbohidratos, proteínas, disminuyendo la capacidad enzimática (p. ej. inhibiendo a la amilasa, la tripsina, la cromotripisina, la lipasa, entre otras); la absorción de vitaminas y minerales; causado por el daño sobre la mucosa del tracto digestivo(48). La presencia y concentración de L-DOPA ha sido objeto de debate, ya que algunas investigaciones sugieren que tiene un efecto negativo en el desarrollo normal del animal(51,52), mientras que otras concluyen que ésta no afecta significativamente(53,54). Aunque se reconocen los efectos fitohematoglutinantes de las fracciones proteicas de mucuna en humanos(35), no existen estudios de sus efectos en animales rumiantes y no rumiantes; pero podría suponerse efectos adversos en la nutrición de los animales(55).

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En comparación con las semillas de Mucuna spp., las semillas forrajeras presentan una gama más amplia de compuestos antinutricionales(37), siendo la presencia de inhibidores enzimáticos los de mayor espectro y diversidad. La presencia de saponinas, polifenoles, fitohemaglutininas e inhibidores enzimáticos, parece ser común a las especies forrajeras y a mucuna.

Conclusiones

El alto contenido de proteínas, almidones, ácidos grasos presentes en las semillas de mucuna puede ser empleado como complemento en la formulación de las dietas para animales rumiantes y no rumiantes. Debido al alto contenido de proteínas, una de las aplicaciones más interesantes de la semilla radica en su empleo como suplemento dietario mediante su dosificación directa (semilla entera, o molida) y como productos proteínicos procesados (concentrados o aislados proteínicos). Si bien existe evidencia del efecto de los compuestos antinutricionales, principalmente de la acción biológica de la L-DOPA, sobre el estado nutricional de los animales de cría/engorda; existen alternativas tecnológicas simples, eficaces y de bajo costo que reducen la concentración de antinutrientes en las semillas de mucuna, hasta niveles mínimos, en donde no se registra diferencia significativa con respecto a las dietas tradicionales. La siguiente fase de evaluación del empleo de mucuna como alimento alternativo para la industria pecuaria, consiste en: i) el desarrollo de productos alimenticios con mejores índices de digestibilidad proteica, energía metabolizable y contenido de fibra; ii) la evaluación del efecto que tiene sobre las características nutricionales, al someter a los constituyentes de interés de la semilla a un proceso industrial (p.ej. efectos térmicos sobre la calidad proteica); iii) la evaluación de los índices de digestibilidad y de energía metabolizable en diferentes etapas productivas de los animales; iv) la evaluación de las interacciones, así como concentraciones máximas permitidas, de compuestos anti nutricionales, evaluando sus efectos en los procesos digestivos y la fisiología animal; v) el análisis de su aporte nutricional al emplear la semilla o algún derivado nutricional obtenida de ella, como suplemento en dietas establecidas; vi) la evaluación de las propiedades nutricias de la semilla en un abanico más amplio de especies y razas de animales rumiantes y no rumiantes de interés pecuario (haciendo énfasis en un enfoque regional).

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Agradecimientos Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) del gobierno de los Estados Unidos Mexicanos, por las facilidades técnicas y materiales derivadas del proyecto cátedras para jóvenes doctores (cátedra 2515).

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4337 Revisión bibliográfica

Lorenzo Danilo Granados-Riveraa Omar Hernández-Mendob*

Campo Experimental General Terán. INIFAP. General Terán, Nuevo León. México.

Programa de Ganadería, Colegio de Postgraduados, Texcoco, México.

*Autor de correspondencia: ohmendo@colpos.mx

Resumen: El objetivo fue discutir el efecto del isómero trans-10, cis-12 del ácido linoleico conjugado (ALC) en el síndrome de depresión de grasa láctea (SDGL) en vacas, caracterizado por reducir hasta en 50 % la concentración de grasa en leche. Este síndrome causa menor rendimiento de derivados lácteos, por lo que el productor recibe menor pago por la leche. Diversas teorías explican la presencia del SDGL, siendo la biohidrogenación la mejor sustentada, donde establece que baja proporción de fibra detergente neutro o alta inclusión de ácidos grasos (AG) insaturados en la dieta de vacas lactantes, propician alteraciones en la biohidrogenación ruminal. Ello da origen a mayor producción de AG trans, que inhiben enzimas necesarias para la síntesis de AG en la glándula mamaria. El isómero trans-10, cis-12 ALC es uno de los principales responsables de la presencia del SDGL, cuyo mecanismo de acción no es claro aún, pero se sabe que dicho isómero suprime factores de transcripción que regulan la síntesis de grasa en leche. Palabras clave: Ácidos grasos, Síntesis de grasa, Biohidrogenación, Industria lechera.

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Abstract: The objective of this review is to discuss the effect of trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid (CLA) on the milk fat depression syndrome (MFD) in dairy cows. The MFD is characterized by a reduction of up to 50 % of fat concentration in milk, leading to lower yield of dairy products, and consequently, the farmer gets less payment for that milk. There are many theories that discuss MFD; however, the biohydrogenation is the one best supported, which states that a low proportion of neutral detergent fiber or high inclusion of unsaturated fatty acids (FA) into the diet of lactating cows, leads to alterations in ruminal biohydrogenation. This causes an increase of trans FA production, inhibiting those enzymes that are needed to synthesize FA in the mammary gland. The trans-10, cis-12 isomer of CLA is one of the main factors to develop MFD. However, the mechanism is still unclear, but it is known that such isomer suppresses transcription factors that regulate the synthesis of fat in milk. Key words: Fatty acids, Fat synthesis, Biohydrogenation, Dairy industry.

Recibido 05/12/2016 Aceptado 23/09/2017

Introducción

La leche bovina tiene un elevado valor nutricional, cuya composición general es de 4.6 % lactosa, 3.6 % proteína y 4.2 % grasa; esta última está compuesta por 98 % de triglicéridos en promedio, los cuales están integrados por ácidos grasos (AG) de cadena corta (C4 a C8; 19.0 %), cadena media (C10 a C14; 19.0 %) y cadena larga (> C16; 62.0 %). Los AG de C4:0 a C14:0 y la mitad del C16:0 se sintetizan de novo, mientras que el resto de AG, incluyendo la segunda mitad del C16:0 provienen de la transferencia de AG preformados presentes en la sangre(1). La síntesis de AG de novo en glándula mamaria se generan a partir de acético y butírico(2), y cuerpos cetónicos como acetoacetato y β-hidroxibutirato(3). En tanto que la síntesis por transferencia, los AG son transportados en quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad, como AG preformados no esterificados, transferidos desde el intestino delgado provenientes de la dieta o por movilización del tejido adiposo(3). Por tanto, modificaciones en la producción de ácido acético y butírico en el rumen, así como el tipo de AG presente en la dieta,

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determinan la composición de AG en leche, y esta situación hace que la grasa láctea sea el componente de la leche más fácilmente modificable(4). Al respecto, la síntesis de grasa es muy sensible al cambio de dieta. Por ejemplo, dietas con menos de 25 % de fibra detergente neutro (FDN), y más de 3.5 % en carga ruminal de AG insaturados, esto es, carga que considera el total de la ingesta de AG insaturados, o la inclusión de ionóforos en la dieta (≥ a 2.7 mg L-1 hr-1)(5,6), pueden inducir un síndrome caracterizado por un bajo contenido de grasa en leche, reducción que puede ser hasta en 50 %, fenómeno conocido como síndrome de depresión de grasa láctea (SDGL)(7,8,9). Dicho síndrome es también inducido por la adición de ácido linoleico conjugado (ALC) en la dieta, siendo el isómero trans-10, cis-12 del ALC el principal responsable(9). El ALC hace referencia a un conjunto de al menos 26 isómeros geométricos y posicionales del ácido linoleico con enlaces dobles en posición conjugada(9), y es producido en el rumen como intermediario en el proceso de biohidrogenación del ácido linoleico, por acción de bacterias(10) como Butirivibrio fibrisolvens(11) y Megasphaera elsdenii(12). El ALC, también puede ser sintetizado de forma endógena en los tejidos de rumiantes a partir de ácido vaccénico (C18: 1 trans-11), por acción de la esteril-CoA desaturasa(13). La importancia del ALC radica en su potencial efecto anticancerígeno y su reducción de grasa en tejido adiposo y muscular, atribuido a sus isómeros cis-9, trans-11 y trans-10, cis-12(14,15). En particular, el isómero trans-10, cis-12 ALC se asocia con una disminución en la concentración de grasa en leche (SDGL) (8). Durante el SDGL hay una reducción de la síntesis de todos los AG presentes en la leche de rumiantes, siendo mayor en la síntesis de novo de AG respecto a la absorción de AG preformados(9), por tal motivo son mayormente afectados los AG de cadena corta y cadena media respecto a los de cadena larga(7), debido a que los primeros son sintetizados de novo mientras los segundos en su mayoría son absorbidos desde la sangre como AG preformados(16). Para la industria lechera el SDGL no es conveniente debido a un menor rendimiento de subproductos como queso y mantequilla, y para el productor representa menor pago por la leche. Las condiciones de alimentación que causan SDGL están bien establecidas(7,9), por lo que se puede predecir el nivel de caída de la grasa en leche con relativa facilidad(8). Sin embargo, los mecanismos que causan SDGL no están del todo claros(17), por lo que es necesario generar información para proponer estrategias de alimentación que ayuden a contrarrestar este problema. Al respecto, se han propuesto algunas teorías para explicar el SDGL, por lo que el objetivo de esta revisión bibliográfica es discutir dichas teorías y recopilar los avances más relevantes de los mecanismos que causan el síndrome de depresión de grasa láctea para ayudar a generar propuestas de solución a este problema.

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Síntesis de grasa en leche

Origen de la grasa láctea

La grasa láctea en rumiantes tiene mayor proporción de AG saturados respecto a la de animales monogástricos(1), que depende de modificación de lípidos dietarios durante la fermentación ruminal(17), que sigue dos rutas, la lipólisis y biohidrogenación ruminal. La primera consiste en la acción de lipasas presentes en el rumen sobre los enlaces éster que unen los AG y los alcoholes, que al ser hidrolizados liberan los AG al medio(17). La segunda consiste en una serie de reacciones enzimáticas secuenciales, que incluyen isomerización e hidrogenación, saturando así los AG insaturados, donde las bacterias Butirivibrio fibrisolvens y Megasphaera elsdenii son las principales responsables del proceso(18). Durante la biohidrogenación se forma el ácido esteárico(17), por lo que los AG absorbidos en intestino delgado de origen dietario son mayormente AG saturados (70 %), y únicamente del 10 a 15 % de AG insaturados escapa a la biohidrogenación ruminal(17). Ello explica la alta proporción de AG saturados en grasa láctea de rumiantes, aunque en leche de vaca, los AG no depende exclusivamente de los AG dietarios, también son sintetizados de novo(1). Al respecto, Palmquist y Mattos(19) reportan que aproximadamente el 40 % de AG en leche bovina se origina de la síntesis de novo, en tanto el 60 % restante proviene de la absorción y transferencia de AG preformados procedentes en su mayoría de la dieta.

Síntesis de novo de ácidos grasos

En los rumiantes, la síntesis de AG de novo se realiza en las células epiteliales de la glándula mamaria, y utiliza como fuentes de carbono al acetato y butirato derivados de la fermentación ruminal de los carbohidratos(2). Estos ácidos grasos volátiles son absorbidos en la circulación portal a través de la pared del rumen, donde el butirato es metabolizado ampliamente a β-hidroxibutirato, mientras que sólo una pequeña cantidad de acetato es metabolizada antes de entrar en la circulación sanguínea(20). Es importante mencionar que cantidades considerables de acetato endógeno se producen a partir de

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acetil-CoA en hígado(21) y glándula mamaria(22). El β-hidroxibutirato aporta alrededor del 8 % del carbono utilizado para sintetizar la grasa láctea, y aproximadamente dos de los cuatro átomos de carbono en el extremo metilo terminal de los AG sintetizados de novo se derivan del β-hidroxibutirato, y la otra mitad, se derivan del acetato(23). El βhidroxibutirato es oxidado en la mitocondria por la enzima β-hidroxibutirato deshidrogenasa, produciendo acetil-CoA, la cual no puede utilizarse para la lipogénesis que ocurre en el citosol. Por lo tanto, la contribución de butirato a la síntesis de AG está limitada principalmente a la síntesis de los cuatro carbonos iniciales de la cadena carbonada de los AG(24). Es preciso señalar que, en rumiantes, la glucosa no es un precursor de la síntesis de AG, debido a que la actividad de las enzimas ATP citrato liasa y NADP malato deshidrogenasa son extremadamente bajas en el tejido mamario(25). La síntesis de AG de novo inicia cuando el acetato es activado a acetil-CoA y, por medio de la enzima acetil-CoA carboxilasa alfa, se forma malonil-CoA(26). Una vez sintetizado malonil-CoA, la síntesis de AG se realiza por elongación o alargamiento de la cadena carbonada, mediante el complejo enzimático ácido graso sintasa, a través de reacciones sucesivas de condensación decarboxilativa de moléculas de acetil CoA (o butiril CoA) con malonil CoA, extendiendo así la cadena hidrocarbonada con dos átomos de carbono por cada ciclo, hasta un máximo de 16 (27). Cada ciclo requiere dos moléculas de equivalentes reductores (NADPH+H+)(26), generadas a partir del ciclo de la pentosa fosfato y la oxidación de isocitrato mediante la isocitrato deshidrogenasa(24).

Absorción y transferencia de ácidos grasos a grasa en leche

En la glándula mamaria de la vaca, no es posible la condensación sucesiva de acetil CoA con malonil CoA para alargar la cadena de AG a más de 16 carbonos debido a que no existen las enzimas necesarias para la elongación(26). Por tanto, los AG C16:0 y C18:0, utilizados para la síntesis de la grasa láctea en glándula mamaria tienen dos orígenes: 1) triglicéridos transportados en quilomicrones y en lipoproteínas de muy baja densidad de origen mayoritariamente intestinal, y 2) ácidos grasos no esterificados, principalmente palmítico C16:0, esteárico C18:0, y oleico C18:1 cis-9, movilizados desde el tejido adiposo(28). Los triglicéridos provenientes de la dieta se adhieren a quilomicrones y son hidrolizados por la enzima lipoproteína lipasa, separando a los AG y al glicerol(29). Los AG libres y el glicerol son absorbidos en las células alveolares del tejido mamario donde son utilizados para la síntesis de grasa en leche(27). Del total de AG absorbidos en el

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intestino delgado que provienen de triglicéridos de la dieta, entre 50 y 60 % son transferidos a la leche(24). En tanto, menos del 10 % de AG movilizados de reservas corporales son transferidos a la leche(2,3). Sin embargo, cuando las vacas están en balance energético negativo, la transferencia a partir de AG movilizados del tejido graso aumenta en proporción directa a la magnitud del déficit de energía(3).

Ácido linoleico conjugado (ALC)

El término ácido linoleico conjugado (ALC) hace referencia a un conjunto de al menos 26 isómeros geométricos y posicionales del ácido linoleico (Cuadro 1), los cuales poseen enlaces dobles en posición conjugada(7,9,30). El isómero cis-9, trans-11 denominado ácido ruménico se degrada a ácido vaccénico (C18:1 trans-11), por efecto del proceso de hidrogenación del enlace cis-9, y dada la lentitud de esta fase, se acumula ácido vaccénico, ocasionando que una gran parte de éste escape del rumen y esté disponible para absorción intestinal(31) (Figura 1).

Cuadro 1: Isómeros del ácido linoleico conjugado reportados en grasa láctea, queso y carne de bovinos Cis/Trans-18:2 trans-6,cis-8 cis-7,trans-9 trans-7,cis9 cis-8,trans-10 trans-8,cis-10 cis-9,trans-11 trans-9,cis-11 cis-10,trans-12 trans-10,cis-12 cis-11,trans-13 cis-12,trans-14 trans-11,cis-13

Cis/Cis-18:2 cis-7,cis-9 cis-8,cis-10 cis-9,cis-11 cis-10,cis-12 cis-11,cis-13 cis-12,cis-14

Adaptado de Collomb et al(31) y Harvatine et al(7).

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Trans/Trans-18:2 trans-6,trans-8 trans-7,trans-9 trans-8,trans-10 trans-9,trans-11 trans-10,trans-12 trans-11,trans-13 trans-12,trans-14 trans-13,trans-15

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Figura 1: Síntesis del ácido linoleico conjugado en rumiantes

Adaptado de Collomb et al(31).

El ALC también se sintetiza de forma endógena, a través de la desaturación del ácido vaccénico por acción de la delta (Δ) 9-desaturasa, enzima que se encuentra ampliamente distribuida en bacterias del rumen como Butirivibrio fibrisolvens, glándula mamaria y tejido adiposo(13). La síntesis endógena del ALC es la principal vía de producción del isómero cis-9, trans-11(13), mientras que la síntesis del isómero trans-10, cis-12 es a través de la biohidrogenación ruminal exclusivamente(12).

Síndrome de depresión de grasa láctea (SDGL)

El SDGL se observa en vacas lactantes y se caracteriza por una reducción de hasta 50 % en la concentración de grasa en leche(7,9), de igual forma se modifica la composición de

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AG en leche(7), donde se reducen principalmente AG de cadena corta y cadena media(32), con poco o nulo cambio en producción de leche ni en concentración de proteína y lactosa en leche(7,9). Las condiciones de alimentación que provocan el SDGL son aquellas dietas con niveles bajos de FDN (< 25 %), carga ruminal de AG insaturados ≥ 3.5, inclusión de ionóforos en la dieta a dosis ≥ a 2.7 mg L-1 hr-1(7,9), o la combinación de estos factores de riesgo(6). Al respecto, dietas bajas en FDN provocan pH bajos en el rumen, y con ello acumulación excesiva de ácido láctico, que promueve mayor síntesis de ácido propiónico y menor de acético y butírico(33), mientras que los AG poliinsaturados y los ionóforos promueven la generación de AG trans a través de cambios en el metabolismo ruminal(34), condicionando así el síndrome de depresión de grasa láctea(7,9). Se han desarrollado varias teorías para explicar los cambios metabólicos en las vacas lactantes que condicionan la presentación del SDGL. Al respecto, se ha propuesto que el aumento en la proporción de ácido propiónico y disminución del ácido acético y butírico en rumen resulta en síntesis menor de β-hidroxibutirato, precursor necesario en la síntesis de AG, y ello induce menor concentración de grasa en leche(33). También se ha sugerido que el aumento del ácido propiónico estimula mayor secreción pancreática de insulina, y con ello mayor suministro de energía hacia tejido muscular, adiposo y sanguíneo, lo cual representaría una competencia por nutrientes entre glándula mamaria y otros tejidos(35). Sin embargo, a la fecha, no existe suficiente evidencia científica que sustente estas teorías(7,8,9), excepto la de biohidrogenación propuesta por Bauman y Griinarii(30).

Teoría de biohidrogenación

La teoría de biohidrogenación establece que las condiciones alimenticias como baja proporción de fibra detergente neutro (FDN) o alta inclusión de AG insaturados en la dieta de vacas lactantes propician alteraciones en la biohidrogenación ruminal que dan origen a producción mayor de AG trans, los cuales son capaces de inhibir enzimas necesarias para la síntesis de AG en glándula mamaria(30). Al respecto, Griinari et al(36) establecieron las bases de la teoría de biohidrogenación, al indicar que son necesarias dos condiciones a nivel ruminal para observar el SDGL en vacas lactantes, 1) alta disponibilidad de ácido linoleico o α-linolénico y 2) un cambio en los procesos microbianos en el rumen. Ambas condiciones favorecerán la producción a través de la biohidrogenación ruminal del isómero trans-10, cis-12 ALC, principal responsable del SDGL(7,8,9). Los AG linoleico y α-linolénico dan origen a los isómeros trans-10, cis-12 ALC a través de isomerización enzimática, por lo que una disponibilidad alta en el rumen de dichos AG promoverá mayor concentración del isómero trans-10, cis-12 ALC en rumen, lo que a su vez permitirá una mayor tasa de escape de este isómero hacia

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glándula mamaria(12), ocasionado disminución de grasa en leche. En tanto, una dieta baja en FDN genera pH bajo en rumen y cambios en las proporciones de los ácidos grasos volátiles, incrementándose la producción de ácido propiónico, y dichas condiciones favorecen el crecimiento de la población de bacterias Megasphaera elsdenii, bacterias responsables de la producción del isómero trans-10, cis-12 ALC(12).

Isómero trans-10, cis-12 ALC en la teoría de biohidrogenación

Durante el SDGL aumentan los isómeros trans de los AG C18:1 y C18:2 en la leche, entre ellos el isómero trans-10, cis-12 ALC. Esta observación permitió obtener los primeros indicios del mecanismo de acción para la presencia del SDGL(7,8,9). Con base en ello, se infundieron duodenalmente (para evitar alteraciones por bacterias ruminales) isómeros puros del AG C18:2 con el objetivo de relacionarlos con la caída de grasa en leche(7). Al respecto, Baumgard et al(32) infundieron los isómeros del ALC trans-10 cis12 y cis-9 trans-11 y observaron que el primero reducía la concentración de grasa en leche, mientras que cis-9, trans-11 ALC no tuvo ningún efecto (Figura 2). Posteriormente, de Veth et al(37) reportaron que la caída de grasa en leche a causa del isómero trans-10, cis-12 ALC se ajusta a una curva de decaimiento exponencial, con reducción de 50 % de grasa en leche a 7.5 g d-1 y un máximo de respuesta medio a 3.5 g d-1 (Figura 3), resultados similares fueron reportados por Shingfield y Griinari(38).

Figura 2: Concentración de grasa en leche durante la infusión abomasal de isómeros del ácido linoleico conjugado (ALC)

La infusión duró cuatro días y los tratamientos fueron: testigo, cis-9, trans-11 ALC (10 g d-1) y trans-10, cis-12 ALC (10 g d-1). Fuente: Baumgard et al(32).

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Figura 3: Modelo de decaimiento exponencial que establece la relación entre el cambio en rendimiento de grasa en leche de vaca y la dosis del isómero trans-10, cis-12 ALC

Los valores del modelo para y= tasa de rendimiento de grasa en leche; para x= dosis del isómero isómero trans-10, cis-12 ALC; P<0.001. Fuente Veth et al(37).

Si bien, los estudios donde se infundió duodenalmente a vacas lactantes el isómero trans-10, cis-12 ALC han sido de corta duración (<7 días)(37), los resultados son similares a los obtenidos con dietas que inducen SDGL (bajas en FDN o enriquecidas con ácido linoleico y α-linolénico), donde la concentración de grasa en leche ha disminuido hasta 50 %, y se observaron aumentos del isómero trans-10, cis-12 ALC en leche(8). Existen suplementos alimenticios que contienen el isómero trans-10 cis-12 ruminal protegido, y han sido usados para estudiar su efecto en vacas lactantes en periodos prolongados, desde 6 a 20 semanas(7). En dichos estudios se ha encontrado que la reducción de grasa en leche persiste durante todo el período experimental(39,40) y la concentración de grasa en leche vuelve a la normalidad cuando cesa el suministro del tal isómero(41). No obstante, las dietas de vacas lactantes donde se han incluido aceites de pescado o en general aceites de origen marino, los cuales son ricos en AG insaturados, causan en la grasa láctea de las vacas poco o ningún aumento del isómero trans-10, cis-12 ALC(8), aunque se observa reducción de la concentración de grasa en leche(42); lo cual sugiere que otros isómeros producidos por biohidrogenación ruminal intervienen en la inhibición de la síntesis de grasa en leche(30). Por ejemplo, incluir los isómeros cis-10, trans-12 ALC(43) y trans-9, cis-11 ALC(44) de forma abomasal en vacas lactantes, reducen la concentración de grasa en leche. Es importante mencionar que en estos estudios solamente se consideró un solo nivel de tales isómeros, por lo que habrá que tener mucha precaución al extrapolar los resultados. Además, la caída de grasa en leche provocada por dichos isómeros no fue tan pronunciada respecto a la provocada 545

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por el trans-10, cis-12 ALC(7). Es por ello que los estudios para determinar los mecanismos de acción de los isómeros que llevan a la presencia del SDGL se han enfocado en el isómero trans-10, cis-12 ALC.

Mecanismos de acción del trans-10, cis-12 ALC en el SDGL

Las dos fuentes de AG en la síntesis de grasa en leche (síntesis de novo y absorción y transferencia de AG preformados) requieren la labor coordinada de un complejo enzimático implicado en el transporte de precursores de AG a la glándula mamaria, la síntesis de novo, la desaturación, esterificación y formación de triglicéridos, y finalmente la deposición de AG en leche(16), y es precisamente a través de la inhibición de este complejo enzimático que el isómero trans-10, cis-12 ALC causa la presencia de SDGL en vacas lactantes(8). Al respecto, se ha demostrado que el trans-10, cis-12 ALC reduce la expresión génica (mRNA) de enzimas lipogénicas, y de factores lipogénicos(44). A pesar de que los mecanismos de acción del isómero trans-10, cis-12 ALC que reducen la grasa en leche no están claros aun(17), la evidencia científica apunta a que este proceso está regulado por supresión de fragmentos nucleares en la proteína 1 unida al elemento de respuesta de los esteroles (FREP1)(8). El FREP1 es un regulador global de la síntesis de grasa en leche(17), implicado en la regulación de genes lipogénicos en el tejido epitelial mamario(8), en particular a los asociados con la síntesis de novo(45). Al respecto, el grado de supresión de FREP1 es directamente proporcional a la magnitud de la caída en grasa láctea provocada por el isómero trans-10, cis-12 ALC(8). Sin embargo, los cambios en la expresión del FREP1 no han podido explicar totalmente el mecanismo de acción para la presencia del síndrome de depresión de grasa láctea(17,32), sugiriendo que el isómero trans-10, cis-12 ALC afecta otros factores de transcripción que regulan la síntesis de grasa en leche(44). Al respecto, dietas que provocan SDGL e infusiones abomasales con trans-10, cis-12 ALC modifican la expresión de la hormona tiroidea conocido como S14(45), así como los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPARs)(46). El isómero trans-10, cis-12 ALC reduce en glándula mamaria la expresión del PPARs, evidenciando el papel central de este factor de transcripción en la regulación de la síntesis de grasa de la leche de vaca (45). Sin embargo, la función de los PPARs durante el SDGL es debatible(47,48), debido a que el isómero trans-10, cis-12 ALC redujo la grasa corporal en ratones sin actividad del PPARs(49). No obstante, los adipocitos responden de manera diferencial a las señales moleculares dependiendo del tejido donde se encuentren(50), situación que explicaría la variación en la respuesta del PPARs durante el SDGL(51). Hasta el momento la evidencia científica indica que los

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factores de transcripción afectados por el isómero trans-10, cis-12 ALC, y que explican la reducción de la síntesis de grasa en leche son FREP1, S14 y PPARs. No obstante, es posible existan otras rutas no identificadas(52), y gran parte de la investigación respecto al estudio del SDGL está orientada hacia la identificación de dichas rutas(53), por lo que sería interesante explorarlas, para un mayor entendimiento de la ocurrencia de dicho síndrome.

Efecto del SDGL en la industria lechera

La industria lechera se ha visto afectada por el efecto que causa el síndrome de grasa láctea, como consecuencia de la implementación de un sistema de fijación de precios a productos lácteos por el departamento de agricultura de Estados Unidos en 2000(54). Este acontecimiento desencadenó el pago a productores no solo por concepto de volumen de producción, pero por aquella leche con mayor concentración de grasa y proteína. En consecuencia, los productores del sistema lechero estadunidense han encaminado su producción usando estrategias nutricionales para lograr tal objetivo(55). En el caso de México, no existe regulación por parte del gobierno en los precios de los productos lácteos(56). Sin embargo, algunas empresas lecheras del país pagan incentivos económicos a productores por mayor concentración de grasa y proteína en leche, incrementando de 3 a 8 % el pago por la leche(57). La importancia de ofrecer altas concentraciones de grasa y proteína en leche radica en la relación positiva de dichos componentes y el rendimiento de subproductos como el queso(58). Al respecto, los factores más importantes que afectan el rendimiento en queso son la concentración de grasa y caseína en leche, que en conjunto representan alrededor del 94 % de la materia seca del queso(59), cuyo rendimiento aumenta linealmente con las concentraciones de grasa y caseína en leche. En particular, la concentración de grasa láctea se correlaciona positivamente (r= 0.79) con el rendimiento en queso(59). Este comportamiento sugiere, por tanto, que la reducción de la grasa láctea causada por el isómero trans-10, cis-12 ALC, reduce de manera significativa el rendimiento en queso. Al respecto, Schiavon et al(60) complementaron la dieta de vacas con 5.5 g d-1 de trans-10, cis-12, reduciendo 13 % la concentración de grasa en leche, y en consecuencia observaron reducción de 11 % del rendimiento en queso. Por su parte, Chen et al(61), al complementar la dieta de cabras con 6 g d-1 de trans-10, cis-12, observaron reducción de 23.2 % en la concentración de grasa en leche, y reducción de 10.2 % en rendimiento en queso. Además, la reducción de grasa en leche de vacas por el isómero trans-10, cis-12 aumenta el tiempo de coagulación de la leche, lo cual reduce la firmeza del queso(60), aspecto que desfavorece la aceptabilidad del queso por los consumidores(59). Con base en estos antecedentes, se asume que el síndrome de depresión de grasa láctea afecta la industria 547

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lechera al reducir el rendimiento en queso, por lo que el productor al ofertar leche con bajo contenido de grasa recibe menor pago por la misma. Ante esto, es necesario generar estrategias de alimentación que mitiguen la caída de grasa en leche a causa del SDGL.

Estrategias nutricionales en la mitigación del SDGL

En dietas para vacas lactantes con contenido alto de aceites poliinsaturados (> 5 %), la vitamina E a dosis mayores de 9,000 UI d-1 incrementa la concentración de grasa en leche(62) a consecuencia de una mejora en la digestión de la fibra en el rumen(62). Además, estabiliza el pH ruminal(62), lo cual pudiera ayudar a regular el crecimiento de la población de bacterias Megasphaera elsdenii, responsables de la síntesis del isómero trans-10, cis-12 ALC(12). Con base en ello, Ramírez-Mella et al(40) propusieron utilizar vitamina E para incrementar la concentración de grasa en leche disminuida a consecuencia del isómero trans-10, cis-12 ALC. Sin embargo, no lograron recuperar la concentración de grasa en leche al incluir vitamina E; aunque, observaron un pequeño incremento del isómero cis-9, trans-11 ALC, aspecto que es interesante seguir estudiando para determinar el papel que juega la vitamina E en la síntesis de este isómero del ALC. Por otro lado, durante el SDGL se reduce la síntesis de todos los AG en la leche de vaca, aunque esta disminución es mayor en la síntesis de AG de cadena corta y cadena media(7,9), lo cual implica que la síntesis de novo es mayormente afectada respecto a la absorción y transferencia de AG preformados(7,8,9). Apoyados con este antecedente, Kadegowda et al(63) y Vyas et al(64) formularon la hipótesis que en vacas lactantes se podría recuperar la concentración de grasa disminuida durante el SDGL a consecuencia del isómero trans-10, cis-12 ALC, al suministrarles en la dieta una mezcla de AG de cadena corta y cadena media, bajo el supuesto que el SDGL es producto de una reducción drástica de la síntesis de AG de novo. Sin embargo, en ambos estudios no se logró la recuperación de la grasa en leche, concluyendo que la dosis usada de la mezcla de AG fue insuficiente. En los citados estudios, la recuperación de la grasa en leche no se logró debido a que la mayoría de los AG suplementados no se transfirió a la leche, excepto el ácido palmítico (C16:0), y en promedio su eficiencia de transferencia a la leche fue de 50 %(63,64). Esto implica que inclusiones mayores del C16:0 a vacas lactantes en el SDGL, podrían ayudar a recuperar la concentración de grasa en leche. El C16:0, es un AG importante en la síntesis de triglicéridos en la glándula mamaria, con mayor potencial para incrementar la biosíntesis de lípidos en glándula mamaria(65). Al respecto, la síntesis de triglicéridos consiste en la acilación sucesiva del esqueleto de glicerol-3-fosfato en sus tres átomos de carbono (sn 1, sn 2, sn 3), donde en la primera

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acilación en el sn 1, el sustrato principal de la enzima glicerol-fosfato-acil-transferasa es el C16:0; esta acilación resulta en la formación de ácido lisofosfatídico, el cual es el punto de partida de la síntesis de triglicéridos(66). Por lo tanto, el aumento en la disponibilidad de C16:0 en la glándula mamaria, estimula la síntesis de triglicéridos en leche, lo que en consecuencia incrementa la concentración de grasa en leche(66). Dada la importancia del C16:0 en la síntesis de triglicéridos en glándula mamaria, se han desarrollado complementos con más del 85.0 % de C16:0, los cuales suministrados a vacas lactantes han incrementado la concentración de grasa en leche(65). Por tanto, el C16:0 pudiera ser una opción viable para recuperar la concentración de grasa en leche disminuida por efecto del isómero trans-10, cis-12 ALC.

Conclusiones

El síndrome de depresión de grasa láctea se produce por cambios en la biohidrogenación ruminal, que favorece mayor producción de metabolitos que inhiben enzimas involucradas en la síntesis de ácidos grasos. Uno de estos metabolitos es el isómero trans-10, cis-12 ALC, el cual ha tenido atención mayor, y a partir de su estudio se ha consolidado la teoría de biohidrogenación, teoría que explica con mayor solidez el SDGL. Este síndrome, es un problema vigente que afecta la industria lechera al reducir los rendimientos de subproductos lácteos, por lo que el productor recibe menor pago por la leche, y es por ello que son necesarios estudios encaminados a develar los mecanismos que lo provocan, para así diseñar estrategias alimenticias que mitiguen sus efectos negativos.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4599 Nota de investigación

Prevalencia de anticuerpos contra diarrea viral bovina en vacas no vacunadas en los estados de Puebla, Tabasco y Veracruz, México Prevalence of antibodies against bovine viral diarrhea in non-vaccinated cows from the States of Puebla, Tabasco and Veracruz, Mexico

Jorge Víctor Rosete Fernándeza Ángel Ríos Utrerab* Juan Prisciliano Zárate Martínezb Sara Olazarán Jenkinsa Lorenzo Granados Zuritac Abraham Fragoso Islasa Víctor Manuel Banda Ruizd Guadalupe Asunción Socci Escatelld

Sitio Experimental Las Margaritas, CIRGOC, INIFAP, México.

Campo Experimental La Posta, CIRGOC, INIFAP. Kilómetro 22.5 carretera federal Veracruz-Córdoba, Teléfono: 229 262 2200. Paso del Toro, Medellín, Veracruz, México. c

Campo Experimental Huimanguillo, CIRGOC, INIFAP, México.

Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal, INIFAP, México.

* Autor de correspondencia: rios.angel@inifap.gob.mx.

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Resumen: La prevalencia (PRE) de anticuerpos contra diarrea viral bovina (DVB) se determinó en 421 vacas de 24 ranchos ubicados en 11 municipios de los estados de Puebla, Veracruz y Tabasco, México. Adicionalmente, se evaluó la influencia de anticuerpos contra DVB sobre la tasa de gestación (TG). Antes del estudio, los hatos nunca fueron vacunados contra DVB. Se obtuvieron muestras de sangre de cada vaca dos veces, con un intervalo de 3.5 a 4.0 meses. La presencia de anticuerpos se determinó mediante la técnica de ELISA. Al primer muestreo, Puebla (51.4 %) y Tabasco (49.7 %) presentaron menor PRE (P<0.01) que Veracruz (76.2 %); sin embargo, al segundo muestreo, los tres estados presentaron diferentes (P<0.05) PRE: 31.1, 54.6 y 76.0 %, respectivamente. Al primer muestreo, la PRE varió de 25.0 a 85.0 % entre municipios, mientras que al segundo varió de 15.0 a 85.9 %. Al primer muestreo, la PRE varió de 9.1 a 95.0 % entre ranchos, mientras que al segundo varió de 5.0 a 95.0 %. La TG de las vacas sin anticuerpos contra DVB fue similar (P>0.05) a la de las vacas con anticuerpos (57.3 vs 53.5 %). En conclusión, 1) Veracruz presentó mayor PRE que Puebla y Tabasco; 2) el 100 % de los hatos presentaron anticuerpos contra DVB, lo que sugiere que el virus de la DVB está ampliamente distribuido en los tres estados; 3) existió una gran variación en la PRE entre ranchos y entre municipios, siendo ésta cercana a 100 % en varios casos; y 4) la presencia de anticuerpos contra DVB no influyó la tasa de gestación. Palabras clave: Diarrea viral bovina, Prevalencia, Anticuerpos, Fertilidad, Vacas, Trópico.

Abstract: The prevalence (PRE) of antibodies against bovine viral diarrhea (BVD) was determined in 421 cows from 24 herds located in 11 Municipalities of the States of Puebla, Tabasco and Veracruz, Mexico. In addition, the influence of the presence of antibodies against bovine viral diarrhea on pregnancy rate (PR) was evaluated. Before the study, the herds were never vaccinated against BVD. Blood samples were taken from each cow twice, with an interval of 3.5 to 4.0 mo. The presence of antibodies was determined with the ELISA test. At the first sampling, Puebla (51.4 %) and Tabasco (49.7 %) showed lower PRE (P<0.01) than Veracruz (76.2 %); however, at the second sampling, the three States showed different (P<0.05) PRE: 31.1, 54.6 and 76.0 %, respectively. At the first sampling, PRE varied from 25.0 to 85.0 % between municipalities, while at the second sampling it varied from 15.0 to 85.9 %. At the first sampling, PRE varied from 9.1 to 95.0 % between herds, while at the second sampling it varied from 5.0 to 95.0 %. The PR of cows without antibodies against BVD was similar (P>0.05) to that of cows with antibodies (57.3 vs 53.5 %). In conclusion, 1) Veracruz showed higher PRE than Puebla and Tabasco; 2) All the herds had antibodies against BVD, suggesting that the BVD virus is amply distributed in the three States; 3) A great variation existed between herds and between municipalities, with PRE being close to 100 % in several cases; 4) The presence of antibodies against BVD did not influence pregnancy rate.

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Key words: Bovine viral diarrhea, Prevalence, Antibodies, Fertility, Cows, Tropics.

Recibido 19/08/2017 Aceptado 17/10/2017

La eficiencia reproductiva de las vacas es uno de los aspectos más importantes que se deben considerar con el fin de aumentar la producción pecuaria. Ésta está determinada por factores genéticos, biológicos y ambientales. El genético es el más difícil de mejorar, debido a que las características relacionadas con la eficiencia reproductiva presentan baja heredabilidad(1,2), provocando que el progreso de la eficiencia reproductiva sea lento a través de la selección. Sin embargo, los factores como la alimentación y la sanidad, son más rápidos de mejorar. Desde el punto de vista sanitario, existe un gran número de enfermedades que afectan de manera significativa la fertilidad de la hembra bovina, entre las que se encuentra la diarrea viral bovina (DVB). Los estudios disponibles en la literatura sugieren que la DVB tiene una distribución mundial(3,4). La patogenia y epidemiología de esta enfermedad fue ampliamente descrita por Lanyon y Reichel(5). En México, el estudio con una mayor amplitud geográfica es el realizado por Suzan et al(6), abarcando 12 entidades federativas; sin embargo, es probable que el estudio con un mayor número de animales (n= 4,487) sea el realizado por Milián-Suazo et al(7), aunque este último también incluyó un número importante de entidades federativas. La prevalencia promedio de estos dos estudios fue 69.5 y 69.0 %, respectivamente, observándose que ambos estudios reportaron prácticamente la misma prevalencia de DVB. Estos dos estudios, aunados a otros estudios realizados en México(8-13), suman un total de 24 entidades federativas, indicando que el virus también se encuentra ampliamente distribuido en nuestro país. Sin embargo, la literatura científica indica que, al parecer, aún existen ocho entidades federativas (Baja California Sur, Colima, Nayarit, Puebla, Quintana Roo, Tabasco, Tlaxcala, Zacatecas) en las cuales se desconoce formalmente a través de artículos científicos, la prevalencia de anticuerpos contra el virus de la DVB. Por lo tanto, debido a las pérdidas económicas que causa dicha enfermedad(14), el conocimiento de este tipo de información es fundamental para, al menos, promover la implementación de programas de buenas prácticas en producción y sanidad animal. El objetivo del presente trabajo fue determinar la prevalencia de anticuerpos contra el virus de la DVB en vacas de los estados de Puebla, Tabasco y Veracruz, así como determinar si la presencia de anticuerpos influye la tasa de gestación. Un objetivo secundario fue realizar una revisión de las prevalencias obtenidas en México, con el fin de estimar el nivel global de prevalencia y usarlo como referencia.

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El trabajo se realizó en 24 ranchos ganaderos: 11 ubicados en cinco municipios del estado de Puebla; 7 ubicados en tres municipios del estado de Veracruz; y 6 ubicados en tres municipios del estado de Tabasco. El estudio se realizó con vacas híbridas (Bos taurus x Bos indicus) principalmente (n= 401); sin embargo, también hubo algunas vacas Brahman puras (n= 20). Debido a restricciones económicas, y a que se ha demostrado que la mayor prevalencia de anticuerpos contra DVB se presenta en vacas en comparación con becerros y vaquillas(3), este estudio solo incluyó vacas adultas. Las vacas no presentaban signos clínicos de enfermedad. Las vacas se mantuvieron en pastoreo rotacional, estaban oficialmente libres de brucelosis y tuberculosis y nunca habían sido vacunadas contra DVB. Se evaluaron reproductivamente por medio de ultrasonografía del útero y ovarios, con el fin de identificar vacas gestantes y no gestantes, excepto en los ranchos del estado de Tabasco, en los que no fue posible realizar dicha evaluación. Considerando un hato con 100 vientres en promedio, se seleccionó al azar una muestra representativa del 20 % de las vacas, antes del primer muestreo, muestreando las mismas en el segundo muestreo. El tamaño de muestra se calculó mediante la fórmula: TM= (TP/2.25) x (Nc-Fe), donde: TM= tamaño de muestra, TP= tamaño de la población estudiada, 2.25= constante, Nc= nivel de confianza para inferir sobre la población, y Fe= frecuencia esperada(15). Esta fórmula se adaptó considerando que la población en este caso fue de tamaño conocido (100 vientres por hato), con una frecuencia esperada de 0.50 y un nivel de confianza del 0.95 (P<0.05). Aplicando la fórmula, se tuvo un tamaño de muestra de 20 animales: TM= (100/2.25) x (0.95-0.50) = 19.998. Se tomaron muestras de sangre en dos ocasiones, con un intervalo de 3.5 a 4.0 meses, al mismo grupo de vacas en cada rancho. El diagnóstico serológico para la detección de anticuerpos se realizó mediante un kit para la prueba de ELISA (CIVTEST BOVIS BVD/BD P80; Laboratorios Hipra, S.A.), cuya sensibilidad y especificidad es 96.3 y 99.5 %, respectivamente; se leyó a una densidad óptica de 450 nm en un espectrofotómetro marca BioTek ELx800. Las variables de respuesta estudiadas fueron: 1) prevalencia de anticuerpos contra DVB al primer muestreo, 2) prevalencia al segundo muestreo, y 3) tasa de gestación al primer muestreo. Para ambos muestreos, la prevalencia se codificó como 1 cuando la vaca presentó anticuerpos contra DVB; en caso contrario, se codificó como 0. La tasa de gestación también se consideró como una variable binaria. Ambas prevalencias (primer y segundo muestreo) se analizaron con un modelo de regresión logística que incluyó estado de la República Mexicana, municipio anidado en estado, y rancho anidado en estado x municipio. Los análisis se realizaron con el procedimiento GENMOD de SAS(16), asumiendo una distribución binomial y aplicando una función liga logit. Para la tasa de gestación, el modelo incluyó

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estatus zoosanitario, estado y municipio anidado en estado. El estatus zoosanitario se definió como la presencia/ausencia de anticuerpos contra DVB. Estado de la República Mexicana, municipio y rancho afectaron significativamente la prevalencia de anticuerpos al primer y segundo muestreo. Las prevalencias en ambos muestreos, por Estado, se muestran en el Cuadro 1. En el Cuadro 2 se resumen las prevalencias encontradas en México en el periodo 1975-2016, las cuales serán usadas en la discusión de los resultados. Al primer muestreo, los estados de Puebla y Tabasco presentaron menor prevalencia (P<0.05) que el estado de Veracruz, siendo similares (P>0.05) en los estados de Puebla y Tabasco. Al segundo muestreo, Puebla presentó menor (P<0.05) prevalencia que Tabasco y Veracruz, mientras que la prevalencia en Tabasco fue menor (P<0.05) que en Veracruz. En el caso del estado de Puebla la prevalencia disminuyó 20.3 unidades porcentuales del primero al segundo muestreo. Las prevalencias obtenidas en el presente estudio para el estado de Veracruz son similares a las reportadas por Suzan et al(6) y Milián-Suazo et al(7), quienes reportaron prevalencias de 75.4 y 69.0 % para este mismo estado, pero son mayores que la prevalencia promedio (60.3 %) reportada para las zonas Norte, Centro y Sur del estado de Veracruz(17). Al parecer, este es el primer estudio que reporta prevalencias de anticuerpos contra DVB para los estados de Puebla y Tabasco, ya que no se encontraron en la literatura científica reportes de este tipo. Las prevalencias encontradas en Puebla y Tabasco al segundo muestreo, son considerablemente menores que las encontradas en otros estados de la República Mexicana(6,7,18,19). Las prevalencias promedio reportadas por diversos autores(6,7,17) para el estado de Veracruz, también son mayores que las obtenidas para Puebla y Tabasco. La prevalencia encontrada en Tabasco en el segundo muestreo es similar a la prevalencia promedio (59.3 %) obtenida a partir de 20 estudios realizados en México (Cuadro 2); sin embargo, la prevalencia encontrada en Puebla en el segundo muestreo es menor que la prevalencia promedio nacional.

Cuadro 1: Prevalencias (%) de anticuerpos contra diarrea viral bovina al primer y segundo muestreo y sus respectivos errores estándar e intervalos de confianza al 95% (IC95%), por estado de la República Mexicana Primer muestreo

Segundo muestreo

Estado

Prevalencia

IC95%

Prevalencia

IC95%

Puebla

51.4 ± 6.2a

39.4-63.1

31.4 ± 5.8a

21.4-43.6

Tabasco

49.7 ± 8.0a

34.6-64.8

54.6 ± 7.8b

39.3-69.1

Veracruz

76.2 ± 5.1b

64.8-84.7

76.0 ± 5.0c

65.0-84.3

a,b,c Prevalencias

con diferente literal son diferentes (P<0.05).

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Cuadro 2: Prevalencias (P) de anticuerpos contra diarrea viral bovina obtenidas en México en el periodo 1975-2016 Autor al(6)

Suzan et Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Suzan et al(6) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Milián-Suazo et al(7) Correa et al(8) Cantú y Alvarado(9) Cantú y Alvarado(9) Cantú y Alvarado(9) Cantú y Alvarado(9) Solorio(10) Córdova-Izquierdo et al(11) Segura-Correa et al(12) Ramos et al(13) Romero et al(17) Romero et al(17) Romero et al(17) Romero et al(17) Cedillo et al(18) Escamilla et al(19) Mellado(23) Barajas-Rojas et al(25) Meléndez et al(26) Ojeda-Carrasco et al(27) Ojeda-Carrasco et al(27) Ojeda-Carrasco et al(27) Ojeda-Carrasco et al(27) Córdova-Izquierdo et al(28) Moles et al(29) Sánchez-Castilleja et al(30) Solís-Calderón et al(31) Varguez et al(32) Varguez et al(32) Varguez et al(32) Varguez et al(32) Promedio a

Estado

Municipio

Genotipoa

P (%)

Hidalgo Morelos Veracruz Sonora Sur Sonora Norte Durango Baja California Yucatán Guerrero San Luis Potosí Jalisco Coahuila Chihuahua Promedio Aguascalientes Chiapas Chihuahua Guanajuato Hidalgo Jalisco Coahuila y Durango (La Laguna) Querétaro Sinaloa Veracruz Promedio D.F., Estado de México, Yucatán Tamaulipas Tamaulipas Tamaulipas Tamaulipas Michoacán Campeche Nuevo León Oaxaca Veracruz Norte Veracruz Centro Veracruz Sur Promedio Coahuila Querétaro Coahuila Veracruz Aguascalientes Estado de México Estado de México Estado de México Promedio Sureste mexicano Altiplano Central Hidalgo Yucatán Campeche Sur Campeche Centro Campeche Norte Promedio

No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica

H (principalmente) H (principalmente) C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas C, SP, HF, Cruzas H Bt x Bi H H H H H

109 23 65 115 74 107 112 51 30 40 32 46 99 903 No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica

73.4 56.5 75.4 60.9 71.6 64.5 52.7 60.8 63.3 57.5 62.5 60.9 61.6 69.5 98.0 56.0 95.0 90.0 96.0 81.0 96.0

No se indica No se indica No se indica No se indica No se indica

H Bt x Bi Bt x Bi H, Bt x Bi H, C, CH

No se indica No se indica No se indica 4,487 47

64.0 55.0 69.0 69.0 75.0

No se indica No se indica No se indica No se indica H Bt, Bi, Bt x Bi No se indica No se indica Múltiples razas y cruzas Múltiples razas y cruzas Múltiples razas y cruzas Múltiples razas y cruzas H Holstein CH, HF HxC H No se indica No se indica No se indica No se indica L, CH, BB, BM, SP x C No se indica H C, H x C, SP x C No se indica No se indica No se indica No se indica

No se indica No se indica No se indica 500 961 267 813 1031 804 756 574 3,538 116 99 19 865 110 40 91 47 178 69 603 500 560 No se indica No se indica No se indica 742

34.1 63.8 52.1 49.0 63.2 12.3 30.0 41.0 64.2 57.4 59.3 60.3 83.6 70.0 100.0 <5.0 32.8 40.0 58.2 29.8 42.7 87.0 72.3 48.6 14.0 46.4 30.8 21.1 40.4 59.3

Aldama González Altamira Promedio Tarímbaro Candelaria No se indica San Juan Cotzocón No se indica No se indica No se indica No se indica Torreón Colón Saltillo Tlapacoyan No se indica Tlalmanalco Amecameca Ayapango No se indica No se indica No se indica No se indica b c d b,c,d

H= Holstein, C= Cebú, BM= Beef Master, BB= Belgian Blue, Bt= Bos taurus, Bi= Bos indicus, CH= Charolais, HF= Hereford, L= Limousin, SP= Suizo Pardo. b Candelaria, Carmen, Calakmul, Palizada. c Hopelchén, Champotón, Campeche, Escárcega. d Calkiní, Hecelchakán, Tenabo.

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En el municipio de Nauzontla la prevalencia disminuyó 23.1 unidades porcentuales del primero al segundo muestreo, mientras que en el de San José Acateno la prevalencia disminuyó 23.9 unidades porcentuales del primero al segundo muestreo. En el municipio de Cunduacán la prevalencia aumentó 33.4 unidades porcentuales del primero al segundo muestreo. En los municipios de Cotaxtla, Medellín de Bravo y San Rafael, no hubo cambios sustanciales en la prevalencia de anticuerpos contra DVB del primero al segundo muestreo (Cuadro 3).

Cuadro 3: Prevalencias (%) de anticuerpos contra diarrea viral bovina al primer y segundo muestreo y sus respectivos errores estándar e intervalos de confianza al 95% (IC95%) por municipio Primer muestreo Municipio Ayotoxco de Guerrero Hueytamalco Nauzontla San José Acateno Xochitlán Cunduacán Huimanguillo Ranchería el Puente Cotaxtla Medellín de Bravo San Rafael

Prevalencia 25.0 ± 9.7a 39.5 ± 5.8ab 38.5 ± 13.5ab 79.4 ± 6.7cde 71.4 ± 17.1bcde 33.3 ± 16.6ab 58.0 ± 10.7bc 58.3 ± 14.2bcd 49.3 ± 13.2ab 88.0 ± 6.0e 82.1 ± 5.0de a,b,c,d,e Prevalencias

IC95% 10.8-47.8 28.8-51.3 17.0-65.6 63.2-89.6 32.7-92.8 13.1-62.4 36.8-76.5 30.8-81.5 25.7-73.2 70.8-95.7 70.1-90.0

Segundo muestreo Prevalencia 15.0 ± 8.0a 27.6 ± 6.0a 15.4 ± 10.0a 55.5 ± 8.8bc 57.1 ± 18.7bcd 66.7 ± 13.6bcd 54.8 ± 10.6bc 41.7 ± 14.2b 64.1 ± 13.9bcd 74.4 ± 6.7cd 85.9 ± 5.1d

IC95% 4.9-37.6 17.5-40.6 3.9-45.1 38.2-71.5 23.0-85.6 37.6-86.9 34.4-73.7 18.5-69.2 35.4-85.3 59.3-85.2 72.6-93.4

con distinta literal son diferentes (P<0.05).

Las prevalencias por rancho variaron de 9.1 ± 8.7 a 95.0 ± 4.9 % al primer muestreo, y de 5.0 ± 4.9 a 95.0 ± 4.9 % al segundo muestreo. De acuerdo con Brownlie et al(20), los hatos con una prevalencia entre 5 y 25 % se clasifican como hatos con bajo nivel de exposición, reflejando que vacas viejas o compradas estuvieron expuestas al virus en el pasado, o reflejando evidencia temprana de infección del hato, por lo que dichos hatos se pueden encontrar en una fase de transición. Por su parte, los hatos con una prevalencia entre 65 y 100 % son clasificados(20) como hatos con alto nivel de exposición al virus, lo que sugiere infección severa activa o la existencia de al menos un animal permanentemente infectado. Se ha reportado que las hembras permanentemente infectadas que inician servicio y las hembras preñadas con un producto permanentemente infectado, son las vías más frecuentes de contagio del virus de la DVB(21). En tres ranchos la prevalencia de anticuerpos contra DVB fue la misma en ambos muestreos. Sin embargo, en un rancho la prevalencia disminuyó 35 unidades porcentuales del primero

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al segundo muestreo. Este comportamiento serológico se presenta en hatos con animales persistentemente infectados, donde los animales que al primer muestreo resultan seropositivos, en un muestreo posterior resultan seronegativos al ser alejados de los animales persistentemente infectados(22); por lo tanto, la presencia de animales persistentemente infectados en un lote o hato, ocasiona que en entre dos muestreos serológicos, se eleve o reduzca la prevalencia, por lo que como factor de alto riesgo, los animales persistentemente infectados deben ser eliminados para la erradicación de la enfermedad. Los hatos estudiados se dedican a la producción de becerros para la engorda; entonces son vendidos al destete, lo que ocasiona la eliminación de la mayoría de ellos y, en consecuencia, la eliminación de los principales animales persistentemente infectados. La tasa de gestación de las vacas seronegativas al virus de la DVB fue similar a la de las vacas seropositivas (Cuadro 4). En un estudio realizado en el estado de Coahuila se encontró que la tasa de gestación a los 60-90 días no se afectó por la seropositividad a DVB(23). Igualmente, en una investigación realizada en Canadá tampoco se encontró asociación entre diferentes concentraciones serológicas de anticuerpos contra DVB y el estatus de preñez(24).

Cuadro 4: Tasas de gestación y sus respectivos errores estándar e intervalos de confianza al 95% (IC95%) por estatus zoosanitario de la vaca, estado de la República Mexicana y municipio Efecto/nivel

Tasa de gestación

IC95%

57.3 ± 5.1 53.5 ± 4.3

47.3 – 66.9 45.0 – 61.7

52.6 ± 5.8 58.2 ± 4.5

41.4 – 63.6 49.2 – 66.6

49.0 ± 11.3 51.6 ± 4.9 38.0 ± 13.5 50.9 ± 6.6 72.1 ± 16.9 51.2 ± 8.0 70.9 ± 7.1 51.2 ± 6.7

28.4 – 70.0 42.0 – 61.1 16.7 – 65.3 38.2 – 63.5 33.3 – 93.1 35.9 – 66.3 55.4 – 82.7 38.3 – 64.1

Estatus zoosanitario Seronegativoa Seropositivob Estado de la República Mexicana Puebla Veracruz Municipio Ayotoxco de Guerrero Hueytamalco Nauzontla San José Acateno Xochitlán Cotaxtla Medellín de Bravo San Rafael a Seronegativo= b Seropositivo=

ausencia de anticuerpos contra diarrea viral bovina. presencia de anticuerpos contra diarrea viral bovina. (P>0.05).

En conclusión, el estado de Veracruz presentó mayor prevalencia de anticuerpos contra DVB que los estados de Puebla y Tabasco. El 100 % de los hatos presentaron anticuerpos, lo que 562

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sugiere que el virus de la DVB está ampliamente distribuido en los tres estados. Existió una gran variación en la prevalencia entre ranchos y entre municipios, siendo la prevalencia cercana al 100 % en varios casos, por lo que es probable que existan animales permanentemente infectados en algunos hatos. Considerando que Veracruz y Tabasco se encuentran entre los principales estados exportadores de becerros, es importante que las dependencias responsables de la salud animal implementen estrategias de prevención y control, ya que en el futuro el comercio internacional podría requerir que el ganado esté libre de esta enfermedad.

Agradecimientos

Se agradece al FORDECYT el financiamiento para realizar este estudio.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4194 Nota de investigación

Claudia García Figueroaa Miguel Enrique Arechavaleta-Velascoa*

Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal. Instituto Nacional de Investigaciones, Forestales, Agrícolas y Pecuarias. México.

Autor de correspondencia: arechavaleta.miguel@inifap.gob.mx

Resumen: Una de las principales enfermedades que afectan a las abejas melíferas es la acariosis traqueal causada por el ácaro Acarapis woodi. El objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de la acariosis traqueal y los niveles de infestación de Acarapis woodi en colonias de abejas del estado de Morelos, en donde la apicultura es un actividad pecuaria importante que se realiza bajo diversas condiciones climáticas y bajo diferentes sistemas de producción. El estudio se llevó a cabo utilizando muestras de abejas de 1,198 colonias que estaban ubicadas en 233 apiarios distribuidos a lo largo del territorio estatal, que son propiedad de 96 unidades de producción apícola. Los apiarios representan el 21.5 % del total de apiarios que existen en el estado y las unidades de producción representan el 13.7 % del total de unidades de producción registradas en Morelos. Los resultados indican que la prevalencia estimada para la acariosis traqueal en Morelos es de 0.02 y que el 10.30 % de los apiarios incluidos en el estudio tuvieron al menos una colonia positiva a esta enfermedad. El porcentaje de infestación promedio en las colonias positivas fue de 7.32 ± 0.75, con un nivel mínimo de infestación de 5 % y un nivel máximo de 20 %. Estos resultados indican que actualmente la acariosis traqueal tiene una prevalencia relativamente baja en Morelos y el porcentaje de infestación promedio estimado en las colonias positivas también es bajo, asimismo indican

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que la prevalencia estimada para esta enfermedad en este estudio es menor a la reportada hace 34 años. Palabras clave: Acariosis traqueal, Acarapis woodi, Abejas melíferas, Prevalencia.

Abstract: Tracheal mite disease caused by Acarapis woodi is one of the most important diseases that affect honeybees. The objective of this study was to estimate the prevalence of tracheal mite disease and the levels of infestation of A.woodi in honeybee colonies in the State of Morelos, where beekeeping is an important activity performed in different climate conditions and under different production systems. This study was conducted using 1,198 honeybee colonies, located in 233 apiaries distributed along the state. The colonies belong to 96 beekeeping productive units. The apiaries included in the study represent 21.5 % of the apiaries in the State and the beekeeping productive units represent the 13.7 % of the beekeeping units registered in Morelos. The results of the study indicate that the prevalence of the tracheal mite disease in Morelos is 0.02 and that 10.30 % of the apiaries included in the study had at least one colony infected with the disease. The average percent infestation in the positive colonies was 7.32 ± 0.75, with a minimum level of infestation of 5 % and a maximum level of 20 %. These results indicate that currently the prevalence of the tracheal mite disease in Morelos is relatively low and that the average level of infestation estimated is low; the results indicate also that the prevalence estimated in this study for this disease is lower than the reported 34 yr ago. Key words: Tracheal mites, Acarapis woodi, Honeybee, Prevalence.

Recibido 01/06/2016 Aceptado 25/09/2017

La apicultura es una actividad pecuaria importante y con mucho arraigo en Morelos, que se realiza en todo el estado bajo diversas condiciones climáticas(1) y bajo diferentes sistemas de producción(2). El inventario apícola en la entidad es de 30,120 colmenas que se encuentran distribuidas en 1,084 apiarios. En 2014 se registró una producción de miel de 1,568 t, lo que corresponde al 2.58 % de la producción nacional(3).

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En Morelos existen 700 unidades de producción apícola registradas que se clasifican de acuerdo a su objetivo y sistema de producción en: 1) productores de abejas reinas y núcleos, 2) productores de miel que movilizan colonias y 3) productores de miel que no movilizan colonias(2,4). Las abejas que manejan las unidades de producción son de origen europeo y africanizado(5). La actividad apícola en la entidad se realiza bajo tres tipos de clima: cálido subhúmedo (A(w)), semicálido (ACw) y templado subhúmedo (C(w))(1). Las abejas melíferas pueden sufrir el efecto de diversas enfermedades que afectan el desarrollo de las colonias y la producción de miel. En la mayoría de los casos, las pérdidas económicas pueden llegar a ser considerables, ya que los daños provocados van desde la reducción en la producción de miel hasta la pérdida total de la colonia. Una de las principales enfermedades que afectan a las abejas melíferas es la acariosis traqueal(6,7). Esta enfermedad es una parasitosis interna causada por el ácaro Acarapis woodi, un parásito microscópico que vive en las tráqueas ubicadas en el tórax de las abejas, y fue descrito por primera vez por Rennie en 1921(6). Las abejas parasitadas pueden comportarse de manera normal; sin embargo, la población de abejas de una colonia se reduce cuando se encuentra infestada por A. woodi, lo que provoca que la producción de miel y la recolección de polen disminuyan(8,9). Un estudio que se realizó en México, reporta que colonias con niveles de infestación considerados como moderados (35 %) produjeron en promedio 52 % menos miel que colonias libres del parásito, mientras que colonias con niveles de infestación altos (89 %) produjeron en promedio 87 % menos miel que colonias libres de este ácaro(10). La acariosis traqueal está presente en todos los países de importancia apícola del mundo con excepción de Australia, China y Japón. El primer reporte de esta enfermedad en México se registró en abril de 1980 en Jalisco, en apiarios cercanos a Guadalajara(11). Estudios realizados durante 1982 reportaron la presencia de A. woodi en 24 de los 32 estados del país y se estimó una prevalencia a nivel nacional para la enfermedad de 30.5 %(12). Existen pocos estudios, publicados sobre la distribución de esta enfermedad en México. Un estudio que se realizó en Yucatán en 1992 reporta una prevalencia del 10 % para la acariosis traqueal en la entidad(13). Mientras, que otro estudio realizado en el 2009 en el municipio de Mérida en el que se incluyeron colonias de abejas silvestres y bajo manejo, reportó que no se detectó la presencia de A. woodi en las colonias incluidas en ese estudio(14). El único estudio publicado sobre la distribución de la acariosis traqueal en colonias de abejas de Morelos, se realizó en 1982, y se llevó a cabo con una muestra de 200 apiarios; se estimó que el 44.5 % de los apiarios tuvieron colonias positivas a la enfermedad(12). Con base en lo anterior, el objetivo de este estudio fue estimar la prevalencia de la acariosis traqueal y los niveles de infestación de A. woodi actuales en colonias de abejas del estado de Morelos.

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El estudio se llevó a cabo en 233 apiarios que fueron seleccionados en forma aleatoria; los apiarios incluidos en el estudio se encuentran distribuidos a lo largo del territorio estatal(15), 115 apiarios estaban localizados en zonas con clima cálido subhúmedo (A(w)), 88 apiarios en zonas con clima semicálido (ACw) y 30 en zonas con clima templado subhúmedo (C(w)). Los 233 apiarios representan el 21.5 % del total de apiarios que existen en el estado y pertenecen a 96 unidades de producción apícola, que representan el 13.7 % del total de unidades de producción apícola registradas en Morelos. De los 233 apiarios incluidos en el estudio, 161 son propiedad de productores de miel que no movilizan colonias, 51 pertenecen a productores de miel que movilizan colonias y 21 a productores de abejas reinas y núcleos. En cada uno de los apiarios se seleccionó en forma aleatoria al 20 % de las colonias de abejas, seleccionándose en total 1,198 colonias. De cada colonia se obtuvo una muestra de aproximadamente 200 abejas obreras, que fueron recolectadas de uno de los bastidores centrales de la cámara de cría de las colmenas en frascos con alcohol al 70%. Las muestras se tomaron entre los meses de diciembre de 2011 y marzo de 2012. Para determinar el número de colonias infestadas y estimar el porcentaje de infestación de A. woodi de cada colonia, se utilizó el método descrito por Shimanuki y Knox(16), para lo cual se tomaron 10 abejas de cada muestra y utilizando un microscopio estereoscópico se hicieron disecciones para separar el primer anillo torácico de las abejas para exponer las tráqueas. A cada anillo torácico se le aplicó una gota de ácido láctico al 85 % para aclarar el tejido y separar los músculos torácicos de las tráqueas. Veinticuatro horas después se observaron las tráqueas con ayuda de un microscopio óptico, las abejas que tuvieron tráqueas que presentaron manchas de color café-rojizo se identificaron como positivas(16). Posteriormente, en las colonias que resultaron positivas se analizaron 10 abejas más, para determinar el número de abejas positivas en la muestra y estimar el porcentaje de infestación de la colonia, dividiendo el número de abejas positivas entre el número de abejas analizadas de la muestra (n= 20)(16). La prevalencia de la acariosis traqueal se calculó a partir de dividir el número de colonias positivas entre el total de colonias analizadas, mientras que el nivel de infestación promedio se estimó considerando el porcentaje de infestación de las colonias que fueron diagnosticadas como positivas a la enfermedad. Asimismo, se determinó el número de apiarios que presentaron al menos una colonia positiva a la enfermedad, para estimar la proporción de apiarios en los que la enfermedad está presente. Finalmente, para determinar si existe efecto del tipo de clima y del tipo de unidad de producción sobre la presencia de colonias positivas a la acariosis traqueal en los apiarios se realizaron pruebas de homogeneidad. De las 1,198 colonias analizadas, únicamente 28 colonias resultaron positivas a la enfermedad. El porcentaje de infestación promedio en las colonias positivas fue de 7.32 ± 0.75, con un nivel mínimo de infestación de 5 % y un nivel máximo de 20 %. Las 28 colonias

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positivas estuvieron ubicadas en 24 apiarios de los 233 incluidos en el estudio. Con base en estos resultados la prevalencia estimada para la acariosis traqueal en Morelos es de 0.02 y el 10.30 % de los apiarios incluidos en el estudio tuvieron al menos una colonia positiva a esta enfermedad. Asimismo, se encontró que la presencia de colonias positivas a la enfermedad en los apiarios se distribuye en forma homogénea entre los tres tipos de climas en los que se realiza apicultura en la entidad (Xi2=1.52; n=233; P>0.05), y también se distribuye en forma homogénea entre los tres tipos de unidad de producción apícola que existen en Morelos (Xi2=0.83; n=233; P>0.05). Estos resultados indican que actualmente la acariosis traqueal tiene una prevalencia relativamente baja en Morelos y el porcentaje de infestación promedio estimado en las colonias positivas también es bajo. Asimismo, muestran que no existe efecto del clima o del tipo de unidad de producción sobre la presencia de colonias positivas a la enfermedad en los apiarios. Los resultados de este estudio indican que la prevalencia de esta enfermedad se redujo en forma importante durante los últimos 34 años, ya que en 1982, Zozaya et al(12) reportaron que en Morelos la acariosis traqueal estaba presente en el 44.5 % de los apiarios incluidos en su estudio (n= 200), mientras que en este trabajo se encontró que el 10.3 % de los apiarios (n= 233) tuvieron al menos una colonia positiva. Diversos factores pudieron contribuir a la disminución que se observa; los factores más relevantes se discuten a continuación. Después de que se detectó la enfermedad en 1982, inicialmente, los apicultores aplicaron productos químicos para controlarla, principalmente mentol y en menor medida bromopropylato (Folbex Forte®) y una mezcla de nitrobenceno y salicilato de metilo (Acarol®); sin embargo, con el paso del tiempo los apicultores fueron dejando de aplicar productos químicos para controlar la enfermedad, a tal grado que se estima que no se han aplicado tratamientos contra este parásito en por lo menos los últimos 20 años. Actualmente los apicultores no realizan ninguna práctica de manejo o aplican algún producto químico para controlar esta enfermedad(2). Los productos químicos que se utilizaron en el pasado no eliminan completamente a los ácaros de una colonia(17) y además es muy probable que en su momento, no todos los apicultores trataran sus colonias, de tal forma que es poco factible que la reducción en la prevalencia se deba a los tratamientos que se aplicaron en el pasado. Algunos estudios que se realizaron en Yucatán y Veracruz, sugieren que las abejas africanizadas son más resistentes que las abejas europeas a la acariosis traqueal, pero no al grado de ser completamente resistentes al parásito(18,19,20). Acarapis woodi se detectó en Morelos por primera vez en 1982, mientras que las abejas africanizadas arribaron a la entidad en 1990(21); es posible que la disminución que se observa en la prevalencia esté relacionada con el proceso de africanización que ocurrió en la población de colonias de abejas, y a la

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interacción entre el parásito y las abejas africanizadas durante los últimos 26 años. Sin embargo, no todas las colonias de abejas en Morelos son africanizadas; en un estudio reciente se estimó que la frecuencia de colonias con morfotipo africanizado fue 0.28, mientras que la frecuencia de las colonias europeas fue de 0.35 y la de las colonias con morfotipo híbrido o intermedio fue 0.37(5), lo que indica que sólo una parte de las colonias de abejas que se manejan en la entidad son africanizadas, lo que indica que la africanización no puede explicar por sí sola la disminución en la prevalencia de A. woodi. Se sabe que existe variabilidad genética en las poblaciones de colonias de abejas para la resistencia a la acariosis traqueal(22,23), asimismo otro estudio demostró que es posible seleccionar colonias resistentes y susceptibles a este parásito(24). La resistencia a este ácaro ha sido atribuida a la expresión del comportamiento de acicalamiento de las abejas(25,26,27). La interacción que ha ocurrido entre las colonias de abejas y el parásito durante los últimos 34 años, pudo dar lugar a un proceso de selección natural en las poblaciones de abejas en respuesta a la presión de selección generada por la presencia de A. woodi. Es posible que la reducción que se observa en la prevalencia de la acariosis traqueal se deba en parte a este proceso. La varroosis causada por Varroa destructor, es el principal problema desde el punto de vista sanitario que enfrenta la apicultura. Este ácaro se detectó en Morelos en 1993 y actualmente esta enfermedad tiene una alta prevalencia en el estado(28,29). Los apicultores han utilizado productos químicos para el control de V. destructor, desde que el ácaro fue detectado en la entidad; los productos más utilizados son el fluvalinato, la flumetrina, el timol y el ácido oxálico(2). Existen reportes de que algunos de los productos utilizados para el control de V. destructor también actúan contra A. woodi. Se sabe que el fluvalinato(30), el amitraz(31,30,32) y el timol(33,34) también tienen efecto sobre A. woodi. Es probable que la disminución en la prevalencia de la acariosis se deba en parte a la constante aplicación de tratamientos contra V. destructor que se ha llevado a cabo durante los últimos 23 años, y que estos tratamientos hayan tenido un efecto indirecto sobre las poblaciones de A. woodi. Se puede concluir que en la actualidad la prevalencia de la acariosis traqueal de las abejas en Morelos es baja y que los niveles de infestación promedio de Acarapis woodi en las colonias positivas también son bajos. Asimismo, los resultados indican que durante los últimos 34 años hubo una disminución importante en la prevalencia de esta enfermedad, a pesar de que en la actualidad los apicultores no aplican ningún tipo de control en contra de este parásito.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4295 Nota de investigación

Luis Ángel Valdés Péreza Joel Hernández Ceróna* Rodolfo Luzbel de la Sotab Carlos Fernando Aréchiga Floresc Eligio Gabriel Salgado Hernándeza Antonio Romero Arredondod

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. México. b

Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de la Plata. La Plata, Argentina.

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma de Zacatecas. México. d

Práctica profesional privada. México.

Autor de correspondencia: jhc@unam.mx

Resumen: Se probó si la administración de dos inyecciones de PGF2α en las primeras 48 h posparto disminuye la incidencia de retención de las membranas fetales (RMF) y de patologías uterinas en vacas lecheras. Se utilizaron 800 vacas de diferente número de partos, las cuales se asignaron aleatoriamente a dos tratamientos; PGF2α (n= 400) recibieron una inyección de

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PGF2α (500 μg de cloprostenol sódico) en las primeras 12 h posparto y una segunda inyección 48 h después; testigo (n= 400) no recibió PGF2α. Se registró la incidencia de RMF (vacas que no eliminaron la placenta de las siguientes 24 h posparto) y de patologías uterinas (metritis y endometritis), tasa de gestación en el primer servicio y porcentaje de vacas gestantes en el día 150 posparto. Las vacas testigo tuvieron mayor probabilidad de RMF (Odds ratio 1.69; P= 0.01) que las vacas tratadas con PGF2α. La proporción de vacas con patologías uterinas en el día 28 posparto fue menor (P= 0.01) en las vacas tratadas con PGF2α (29.8 %) que en las testigo (36.7 %). La tasa de gestación en el día 150 posparto fue mayor en las vacas con involución normal que en las vacas con patologías uterinas (Odds ratio 1.4, P=0.03). Se concluye que dos inyecciones de PGF2α en las primeras 48 h posparto (primeras 12 y 48 h posparto) disminuyen la incidencia de RMF y de patologías uterinas en vacas lecheras. Palabras clave: Vacas lecheras, Retención de membranas fetales, PGF2α.

Abstract: In order to determine its effect on incidence of retained fetal membranes (RFM) and postpartum uterine pathologies in dairy cows, the administration of two injections of PGF2α in the first 48 h after parturition was tested. In this study, 800 cows with different parities were randomly assigned to two treatment groups: PGF2α (n= 400), receiving two postpartum PGF2α injections (500 μg of cloprostenol sodium), one during the first 12 h and one at 48 h; and control (n= 400), not receiving PGF2α. The incidence of RFM (cows that had not expelled the placenta at 24 h postpartum), and of postpartum uterine pathologies (metritis and endometritis), was registered, as well as pregnancy rate at first service and percentage of pregnant cows at d 150 postpartum. Control cows had a higher probability of presenting RFM (Odds ratio 1.69; P= 0.01) than cows treated with PGF2α. Likewise, the proportion of cows with uterine pathologies at d 28 postpartum was lower (P= 0.01) in cows treated with PGF2α (29.8 %) than in control cows (36.7 %). The accumulated pregnancy rate at d 150 postpartum was higher in cows with normal involution than in cows with uterine pathologies (Odds ratio 1.4, P= 0.03). It is concluded that two injections of PGF2α in the first 48 h postpartum (at 12 and 48 h) lowers the incidence of RFM and of uterine pathologies in dairy cows. Key words: Dairy cows, Retention of fetal membranes, PGF2α.

Recibido: 11/10/2016 Aceptado: 07/11/2017

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La recuperación de la competencia reproductiva posparto en las vacas lecheras depende principalmente del tiempo que tome la involución uterina y del inicio de la actividad ovárica(1). Las patologías uterinas posparto incrementan el periodo del parto al primer servicio, generan bajas tasas de gestación en el primer servicio, incrementan el número de días abiertos, aumentan el número de vacas eliminadas y provocan importantes pérdidas económicas por baja en la producción y por el costo de los tratamientos(1,2). Entre los principales factores de riesgo de las patologías uterinas posparto, está la retención de las membranas fetales (RMF)(1,3,4). Dentro de las estrategias para prevenir y tratar las patologías uterinas se ha considerado el uso de la prostaglandina F2α (PGF2α). La evaluación del uso de la PGF2α como herramienta de manejo en la prevención de patologías uterinas ha arrojado resultados contradictorios(5). Uno de los primeros hallazgos que demuestran la importancia de las PGF2α en la involución uterina, es la correlación negativa entre las concentraciones de PGF2α posparto con el tiempo de involución uterina(6,7). Gross et al(8) encontraron un efecto favorable de la administración de PGF2α inmediatamente después del parto en la disminución de la incidencia de RMF en animales a los cuales se les indujo el parto con dexametasona; sin embargo, estos resultados contrastan con lo obtenido en otro estudio similar(9). Ortega et al(10), observaron que la administración de dos inyecciones de prostaglandinas en las primeras 48 h posparto, disminuyó el porcentaje de vacas que presentaron RMF, redujo el tiempo del parto al primer estro, y aumentó el número de vacas gestantes en el día 90 posparto; sin embargo, no hay otro estudio que corrobore dichos resultados. Por tanto, en el presente trabajo se probó si la administración de dos inyecciones de PGF2α en las primeras 48 h posparto (primeras 12 y 48 h posparto), disminuye la incidencia de RMF y de patologías uterinas en vacas lecheras. El presente trabajo se realizó durante los meses de agosto a noviembre de 2014, en un establo lechero de manejo intensivo de 3,200 vacas en ordeño, con una producción promedio de 10,000 kg por lactación. Se utilizaron 800 vacas de diferente número de partos alimentadas con una ración integral, según las recomendaciones del NRC(11). Veintiún días antes del parto las vacas se trasladaron a un corral de acuerdo con su número de parto (primíparas o multíparas). Después del parto, las vacas se alojaron en el corral de vacas frescas de acuerdo, también, con su número de parto, en los cuales permanecieron hasta el día 21 posparto (pp). Todas las vacas recibieron sistemáticamente tres inyecciones de PGF2α con un intervalo de 14 días a partir del día 26 ± 3 pp. Las vacas que se detectaron en estro después del periodo voluntario de espera (45 días), se inseminaron. Los animales no detectados en estro se enrolaron en un protocolo de sincronización e inseminación artificial a tiempo fijo

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(CoSynch). El diagnóstico de gestación se realizó por medio de palpación transrectal entre los días 40 y 50 post inseminación. El manejo de los animales durante el experimento fue aprobado por el Subcomité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales (SICUAE) del Posgrado en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal de la Universidad Nacional Autónoma de México. Diez días antes del parto las vacas se asignaron aleatoriamente a dos diferentes tratamientos: PGF2α (n= 400), recibieron 500 μg de Cloprostenol sódico (Celosil®; MSD Animal Health, México) vía intramuscular dentro de las primeras 12 h posparto (1 a 12 h) y una segunda inyección 48 h después; testigo (n= 400), no recibieron PGF2α. La proporción de vacas primíparas (33 %) y multíparas (67 %), la condición corporal al parto (3.8 ± 0.3), la proporción de partos gemelares (2.9 %) y partos asistidos (44 %) fueron similares entre las vacas tratadas con PGF2α y las testigo (P>0.10). Todas las vacas se examinaron por vía transrectal en los días 14, 21 y 28 posparto, para determinar el grado de involución y hacer el diagnóstico de patologías uterinas. Se registró la incidencia de patologías uterinas de acuerdo con el criterio de Sheldon et al(12). Se consideró como RMF a aquellas vacas que no eliminaron la placenta en las siguientes 24 h posparto; metritis, vacas con retraso en la involución uterina con descargas purulentas (primeros 21 días pp), sin signos de enfermedad sistémica, y endometritis vacas con descargas mucopurulentas (~50 pus % y 50% moco) (después de 21 días pp). A los animales que resultaron positivos a cualquiera de las patologías descritas, se les aplicaron los tratamientos farmacológicos utilizados en el hato. Se evaluó el tiempo trascurrido del parto al primer servicio; tasa de gestación en el primer servicio (proporción de vacas gestantes del total inseminado) y tasa de gestación acumulada en el día 150 posparto. El efecto de cada factor en la presentación de RMF se determinó por medio de regresión logística múltiple. La RMF se consideró como variable dependiente, mientras que el tratamiento, tipo de parto (simple o gemelar), dificultad de parto (asistido o no asistido), número de partos (primíparas o multíparas), sexo de la cría (macho o hembra) se consideraron como variables independientes(13). La tasa de gestación en el primer servicio y la tasa de gestación acumulada en el día 150 posparto, también se analizaron mediante modelos de regresión logística múltiple considerando, además de la variables independientes mencionadas anteriormente, a la RMF (vacas con o sin RMF) y la salud uterina al día 28 posparto [involución normal o patologías uterinas (metritis o endometritis)]. El modelo se estableció de acuerdo al método propuesto por Hosmer y Lemeshow(14) de modo análogo al usado por López-Gatius et al(15). El modelo final se construyó mediante la técnica de eliminación manual paso a paso, que comprende: la selección preliminar de todas la variables para las asociaciones univariadas; la construcción de un modelo completo utilizando las variables significativas que resultaron del análisis univariado; la eliminación gradual de las

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variables no significativas del modelo completo; la comparación del modelo reducido con el modelo anterior para el ajuste del modelo y los factores de confusión; la evaluación de las interacciones entre las variables y la evaluación del ajuste del modelo mediante estadística de Hosmer-Lemeshow(14). En el análisis univariado el valor de P<0.25 se utilizó como criterio de inclusión en el modelo inicial y se continuó depurando el modelo dejando sólo los efectos principales (P<0.05). La proporción de vacas con metritis o endometritis en los días 14, 21 y 28 posparto de los grupos tratado con PGF2α y testigo, así como entre vacas con RMF y sin RMF, se comparó mediante un análisis de sobrevivencia (Kaplan-Meier). Las curvas se compararon mediante la prueba de Log-rank. Los días al primer servicio, se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA). El tratamiento con PGF2α en las primeras horas posparto redujo la incidencia de RMF (17.5 vs 11 %; testigo y PGF2α, respectivamente; razón de probabilidades 1.69; intervalo de confianza 95%= 1.12-2.55; P<0.01). La disminución de la incidencia de RMF observada en este trabajo concuerda con lo encontrado por Ortega et al(10), quienes aplicaron el mismo tratamiento en condiciones similares a las del presente estudio y obtuvieron una reducción en la RMF (3 vs 10 %; vacas tratadas y testigo, respectivamente). Cabe destacar que en el presente estudio la reducción de la RMF fue de 37 % con respecto a las vacas testigo, mientras que en el trabajo de Ortega et al(10) fue de 70 %. No obstante, los resultados son alentadores, ya que muestran que aún en un hato con incidencia elevada de RMF (17.5 %), en el cual habría más factores de riesgo de RMF(16), el tratamiento con PGF2α reduce esta patología. El mecanismo por el cual la administración de PGF2α en las primeras horas posparto reduce la RMF se desconoce. En algunos estudios se ha propuesto que la PGF2α facilita el proceso de separación y expulsión de la placenta; así, se ha encontrado a nivel caruncular una alteración en la síntesis de PGF2α en vacas con RMF(17). Además, la relación de PGF2α:PGE2 en las vacas que no presentan RMF es mayor a favor de la PGF2α, lo que indica la importancia de altos niveles de esta hormona a nivel caruncular para la expulsión de la placenta(18,19). Dentro de la patogenia de la RMF, se destaca el papel de los neutrófilos; se menciona que existe una alteración en la actividad de los neutrófilos a nivel uterino en aquellos animales que presentan RMF(20,21). Se ha observado que la inducción del parto con dexametasona es un factor de riesgo para la RMF, ya que este tratamiento inhibe la actividad de los neutrófilos en la unión de la carúncula y el cotiledón(16). Cabe señalar que en el presente estudio, la inyección que pudo influir en la eliminación de la placenta fue la que se aplicó en las primeras 12 h posparto, ya que al momento de la segunda inyección (48 h después) ya se había determinado qué vacas tuvieron RMF; es prudente mencionar que el tiempo de corte para diagnosticar un caso de RMF fue a las 24 h posparto. No obstante, el tratamiento con las dos inyecciones de PGF2α tuvo efectos en otras variables reproductivas que se discuten más adelante.

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Un mecanismo del efecto favorable de la administración de PGF2α en la RMF propuesto por Salgado et al(22), está asociado con las concentraciones sanguíneas de calcio. Así, en su estudio las vacas que recibieron PGF2α en un tratamiento similar al del presente trabajo, tuvieron mayores concentraciones circulantes de calcio en los primeros siete días posparto que las vacas testigo. Estos investigadores proponen que la administración de PGF2α incrementa la calcemia, lo cual subsana parcialmente las hipocalcemia subclínica que padecen las vacas lecheras durante los primeros días posparto(23). Estos hallazgos tendrían relación con el proceso de expulsión de la placenta y con las patologías uterinas, ya que se ha encontrado mayor incidencia de patologías uterinas en vacas con hipocalcemia(24,25). El efecto negativo de los bajos niveles de calcio posparto, puede explicarse por la disminución de la actividad fagocitaria de los neutrófilos en vacas con hipocalcemia(25); asimismo, los neutrófilos liberan proteasas y colagenasa que favorecen la expulsión de la placenta, procesos calcio dependientes(26). No obstante el desconocimiento del mecanismos de acción de la inyección de PGF2α, la obtención de una respuesta positiva en la incidencia de RMF similar a la observada por Ortega et al(10) ofrece bases consistentes para realizar futuras investigaciones que expliquen en qué procesos influye la PGF2α para facilitar la expulsión de la placenta. Por otro lado, se observó en el presente estudio que el parto gemelar incrementa la probabilidad de presentar RMF (razón de probabilidades 5.19; intervalo de confianza 95%= 2.5-13.85; P<0.01), lo cual es congruente con la información publicada, ya que la manipulación uterina durante el parto gemelar incrementa el riesgo de RMF(27). Sin embargo, la asistencia en el parto no tuvo un efecto significativo en la RMF (P>0.05), lo cual es diferente a lo esperado, ya que la distocia también es un factor de riesgo de RMF(16). Cabe mencionar que el dato de distocias no aparece en los registros del hato, sólo se anota asistencia en el parto independientemente del grado de ayuda; así, la asistencia al parto registrada fue de 43.7 % en el grupo tratado con PGF2α y 45.2 % en el testigo. De acuerdo con el análisis de Kaplan-Meyer, las vacas tratadas con PGF2α tuvieron menor prevalencia de metritis o endometritis (Figura 1; P<0.05) que las vacas testigo (90.3 vs 91.5; 70.5 vs 73.5; 29.8 vs 36.7; en los días 14, 21 y 28, respectivamente), lo cual pudo ser un efecto de la menor incidencia de RMF observada en las vacas tratadas con PGF2α. Esta posibilidad es congruente con los resultados del análisis de sobrevivencia realizado en vacas con RMF y sin RMF, en el cual se observa que las vacas con RMF tuvieron mayor prevalencia de patologías uterinas que las vacas sin RMF (Figura 2; P<0.01); se menciona que la RMF es uno de los principales factores de riesgo de metritis y endometritis(3,4).

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Figura 1: Curva de sobrevivencia para la proporción de vacas con patologías uterinas en los primeros 28 días posparto tratadas con prostaglandinas (PGF2α)

Una inyección de PGF2α en las primeras 12 h posparto y una segunda inyección a las 48 h posparto (─▲─), y testigos (─■─); P<0.05.

Figura 2: Curva de sobrevivencia para la proporción de vacas con patologías uterinas en los primeros 28 días posparto en vacas con RMF (─■─) y sin RMF (─▲─); P<0.01

El tratamiento con PGF2α no afectó la probabilidad de gestación en el primer servicio. Las vacas de parto asistido tuvieron la misma probabilidad de quedar gestantes en su primer servicio en comparación con las vacas de parto no asistido (Cuadro1). Las variables sexo de la cría, tipo de puerperio, RMF, tipo de parto y su interacción con el tratamiento no afectaron la probabilidad de gestación en el primer servicio (P>0.10).

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Cuadro 1: Razón de probabilidades (RP) para la gestación en el primer servicio de acuerdo a las variables en el modelo de regresión logística Variables

Clases

Tratamiento

Testigo PGF2α No asistido Asistido Primíparas Multíparas

Dificultad al Parto Número de partos

Tasa de gestación

344 350 389 305 236 458

24.1 22.8 24.9 21.6 31.3 19.4

Referencia 0.91 1.38 Referencia 2.02 Referencia

IC 95%

0.64-1.30 0.95-2.00

0.62 0.08

1.40-2.92

0.01

El tratamiento con PGF2α no afectó la tasa acumulada de gestación en el día 150 posparto. Las vacas que padecieron patologías uterinas en el día 28 posparto tuvieron menor probabilidad de estar gestantes en el día 150 posparto (Cuadro 2). El mecanismo por el cual una infección uterina posparto afecta negativamente el establecimiento de la gestación no está determinado; algunas evidencias muestran efectos nocivos de las endotoxinas en el endometrio, en el desarrollo folicular y en el desarrollo embrionario(28). Además, las vacas con patologías uterinas tienen mayor riesgo de padecer endometritis subclínica, la cual afecta negativamente la tasa de gestación en el primer servicio e incrementa el riesgo de pérdidas embrionarias y fetales(29). Los factores como sexo de la cría, dificultad de parto y tipo de parto no afectaron la probabilidad de gestación acumulada en el día 150 posparto, ni hubo interacción con el tratamiento (P>0.10).

Cuadro 2: Razón de probabilidades (RP) para la gestación en el día 150 posparto de acuerdo a las variables en el modelo de regresión logística Variables Tratamiento Número de parto Salud uterina* Tipo de parto

Clases

Tasa de gestación

Testigo PGF2α Primíparas Multíparas Normal Patologías Simple Gemelar

336 341 236 441 377 300 657 20

59.8 62.4 67.3 57.8 64.9 56.3 61.9 35.0

Referencia 1.10 1.47 Referencia 1.40 Referencia 2.46 Referencia

IC 95%

0.80-1.50 1.06-2.06

0.53 0.02

1.02-1.92

0.03

0.96-6.34

0.06

* Día 28 posparto.

El intervalo del parto al primer servicio fue similar (P>0.05) entre las vacas tratadas con PGF2α y las testigo [68 ± 1.1 vs 65 ± 1.1 días (media ± error estándar); grupos PGF2α y testigo, respectivamente]. Se esperaba, sin embargo, que los efectos en la salud uterina 583

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provocados por las dos inyecciones de PGF2α se reflejaran en menor intervalo del parto al primer servicio. No obstante, cuando se compararon los grupos con involución normal o patológica en el día 28 posparto independientemente de si fueron tratados o no con PGF2α, las vacas con patologías uterinas tuvieron mayor intervalo al primer servicio (71 ± 1.1 días; P<0.01) en comparación con las vacas con involución normal (62 ± 1.0 días), lo cual es congruente con los efectos que tienen las infecciones uterinas en el inicio de la actividad ovárica posparto y en la salud uterina al momento del primer servicio(1,5). Las vacas de primer parto fueron más fértiles que las vacas multíparas (Cuadros 1 y 2); así, tanto la tasa de gestación en el primer servicio, como la tasa acumulada de gestación en el día 150 posparto fue mayor en las vacas primíparas que en las multíparas. Esta observación es congruente con otros estudios(30,31). Se concluye que dos inyecciones de PGF2α, en las primeras 48 h posparto (primeras 12 y 48 horas posparto) disminuyen la incidencia de retención de membranas fetales y de patologías uterinas en vacas lecheras.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado en parte por el proyecto IN219811-3 y por el PASPA-DGAPA de la Universidad Nacional Autónoma de México. Se agradece al propietario del Rancho Montoro (Aguascalientes, México), al personal Médico y a los trabajadores, su apoyo para realizar este estudio.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4490 Nota de investigación

In vitro ruminal degradation of neutral detergent fiber insoluble protein from tropical pastures fertilized with nitrogen Degradación ruminal in vitro de la proteína insoluble en fibra detergente neutro de pastos tropicales fertilizados con nitrógeno

Francisco Indalecio Juárez Lagunesa* Alice N. Pellb Robert W. Blakeb Maribel Montero Lagunesc Juan Manuel Pinos Rodrígueza

Universidad Veracruzana. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. CP. 91710. Veracruz, Ver. México. b

Cornell University. Animal Science Department. Ithaca, NY. USA.

INIFAP. Campo Experimental La Posta. Medellín, Ver. México.

* Corresponding author: juarezf@hotmail.com

Abstract: The objective was to determine in vitro the NDF insoluble protein (NDIP) extension and degradation rate of four tropical grasses by the potential effect of N fertilization. The grasses (Andropogon gayanus, Brachiaria brizantha, Cynodon plectostachyus and Megathyrsus maximus) that grow in Mexico were used. Each grass was grown in four plots (5×5 m), fertilized (relationship equivalent to 0 and 100 kg N/ha) and clipped 35 d after the N fertilization. A complete randomized block design with factorial arrangement 4×2, and two replicates per treatment was used, where the factors were grass species and N fertilization. Non-protein nitrogen (NPN), buffer insoluble protein (IP), NDIP and acid detergent insoluble

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protein (ADIP) were performed. Freeze-dried samples were incubated at 0, 1.5, 3, 6, 9, 12, 24, 48 and 96 h. After fermentation, the CP content of the NDF residues was determined. An exponential equation was used to determine the rate of the NDIP disappearance. There was no detectable interaction between type of grass and fertilization level. The NDIP (as %CP) averaged 35 % with a range of 10 to 60 %. The NDIP variation was primarily due to species. The extent and rates of degradation of the NDIP were 70.6 % and 7.1 %/h respectively, with no N-fertilization effect. The NDIP was degraded faster (P≤0.05) than NDF (7.7 vs 5.0 %/h). These data show that the NDIP is ruminally degraded and that this fraction significantly contributes to the rumen nitrogen supply. Key words: Tropical grasses, Degradation kinetics, Protein fractions, NDF, N fertilization.

Resumen: El objetivo fue determinar la tasa y extensión de degradación ruminal in vitro de la proteína insoluble en fibra detergente neutro (NDIP) de pastos tropicales por efecto de la fertilización nitrogenada. Se analizaron los pastos Andropogon gayanus, Brachiaria brizantha, Cynodon plectostachyus y Megathyrsus maximus. Cada pasto se estableció en cuatro parcelas (5×5 m), se fertilizó (a una relación equivalente a 0 y 100 kg N/ha) y se muestreó cada 35 días. El análisis estadístico fue un diseño en bloques completos al azar en un arreglo factorial 4×2 y dos réplicas por tratamiento. Los factores fueron la especie y la fertilización. Se determinó el nitrógeno no proteico, proteína insoluble en buffer, NDIP y proteína insoluble en fibra detergente ácido (ADIP). Las muestras liofilizadas de los pastos se incubaron por 0, 1.5, 3, 6, 9, 12, 24, 48 y 96 h. Después de la fermentación, se determinó PC en la FDN residual y se calculó la tasa de desaparición de NDIP con una ecuación exponencial. No se detectó efecto de interacción entre especie y fertilización. La NDIP (%PC) promedió 35 % con rango de 10 a 60 %. La variación de NDIP fue debido a la especie. La tasa y extensión de la degradación de NDIP fueron del 7.1 %/h y 70.6 % respectivamente, sin efecto de la fertilización. La tasa de degradación fue más rápida (P≤0.05) en la fracción NDIP que en la FDN (7.7 % vs 5.0 %/h). Los resultados muestran que parte del NDIP es degradado en rumen, pudiendo aportar N para la actividad microbiana. Palabras clave: Pastos tropicales, Cinética de degradación, Fracciones de proteína, FDN, Fertilización nitrogenada.

Recibido 15/05/2017 Aceptado 12/11/2017

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In tropical grasses the fiber-bound protein (neutral detergent insoluble protein, NDIP) accounts for one third of its crude protein content(1,2) which might represent a potential source of protein for ruminal degradation in bovines grazing under tropical conditions. The CNCPS version 6.5(3) assumes that the digestion rate of the PB2 fraction (fiber-bound protein) is similar to the CB3 fraction (digestible fiber) and Higgs(4) validates this assumption assigning, for grass hay, an average digestion rate of 4.5 %/h for both fractions. Although Ogden (5) showed that in C4-grasses the rate of digestion of the NDIP fraction is faster than its own NDF fraction (11.0 vs 7.8 %/h). In Australian tropical grasses measuring NDIP rates of digestion found a range between 4.7 and 7.9 %/h(6). However, Singh(2) for tropical grasses in India consider the Sniffen digestion rate of fiber-bound protein of less than 1.5 %/h(7). Also, in Brazilian grasses(8) reported digestion rates between 0.08 and 1.3 %/h for the PB3 fraction. At a given passage rate of 2.5 %/h Ogden(5) or a range between 2.0–4.4 %/h Bowen(6) it is critical to know if the NDIP digestion rate exceeds or not the passage rate. Because grasses frequently make up the only source of protein for many ruminants, information on the NDIP fraction of grasses is a prerequisite to modeling the N economy of ruminants. Concentration, distribution and digestibility of protein in forages is affected by species (9), N fertilization(10), and cutting age(8). Data on the effects of these management practices are incomplete. The goals were to examine in vitro the pool size, and extent and rate of digestion of the cell wall protein of four tropical grasses (Andropogon gayanus, Brachiaria brizantha, Cynodon plectostachyus, and Megathyrsus maximus), and to explore the effects of N fertilization on these variables. The study was conducted at the experimental station La Posta, of the Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Located in the State of Veracruz on the southeastern coast of Mexico at 19° 02' L and 96° 08' L, at 12 m asl, tropical subhumid Aw, average annual rainfall of 1,728 mm, 25 °C of average temperature and 81 % relative humidity. The soil is classified as Oxisol, a predominantly sandy loam with >15 % clay. The grasses Andropogon gayanus, Brachiaria brizantha, Cynodon plectostachyus, and Megathyrsus maximus Var. Guinea, were selected because they are commonly used in tropical areas. At onset of the rainy season, each grass was grown in four plots (5×5 m). Two plots were fertilized with N (relationship equivalent to 100 kg N/ha) and other plots not. All plots were previously cut to a height of 5 cm. After 35 d of regrowth, one sample of 2 m2 from the center of each plot was clipped at a height of 10 cm. A sub-sample of 500 g of green material was frozen immediately at -15 °C, and other sub-sample of 500 g was placed in a forced air oven at 100 °C during 24 h for dry matter (DM) determination. This sample was discarded after DM determination. At the end of sampling (July 25th), four frozen samples

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from each grass were freeze dried, placed in 30 × 25 cm heavy duty freezer bags, and sent to Cornell University for laboratory analysis. All samples were ground through a 1-mm screen in a Wiley mill (Model 4, Arthur H. Thomas Co. Philadelphia, PA). Dry matter was determined by direct oven-drying samples at 100 °C overnight. Crude protein (N × 6.25) was determined by Macrokjeldahl procedure(11), modified by using boric acid at 4% concentration during distillation. The protein fractions were determined as described by Licitra(12). The N and protein fractions of the grasses were partitioned according to Pichard and Van Soest(13) and Van Soest(14) as follow: all the nitrogen determinations were converted to protein values by multiplying the amount of N by 6.25. The non-precipitable fraction of the Tungstic acid precipitation method was used to measure non protein nitrogen (NPN) which is fraction A, and the borate-phosphate buffer method was employed to measure protein solubility (fraction B). The difference between the precipitable fraction in Tungstic acid and soluble in buffer is the true soluble protein (fraction B1 fast solubility). The difference between the insoluble fraction in buffer and soluble in NDF is the B2 fraction (medium solubility). The difference between the insoluble fraction in NDF and soluble in ADF is the B3 fraction (slow solubility). And the protein insoluble in ADF is the C fraction (indigestible protein). The bicarbonate-phosphate buffer of Goering and Van Soest(15) was employed in the in vitro medium. An equal amount of cysteine hydrochloride replaced the sodium sulfide. The medium was boiled to remove dissolved gases, cooled, cysteine added (0.625 mg/mL), and the pH was adjusted to 6.8 as necessary. Ruminal fluid was collected via ruminal cannula approximately 6 h after feeding from a 600 kg, mature, non-lactating Holstein cow that was fed ad libitum on average quality mixed hay in order to meet maintenance requirements in accordance with The Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2002) protocol. At the onset of a fermentation, each 120 mL serum bottle contained 16 mL medium, 4 mL ruminal fluid, and 200 mg sample. Incubation times for determining NDIP disappearance were 0, 1.5, 3, 6, 9, 12, 24, 48, and 96 h. At each time point, the gas was released with a needle, the bottle was opened and the fermentation was briefly interrupted by adding 40 mL of NDF solution. The NDF(16) and NDIP, measured by Kjeldahl analysis of the fiber residue, were determined at each time point. Because of the small size and low nitrogen concentration of the samples, Kjeldahl solutions were diluted by 50 % to increase sensitivity. Reducing agents such as cysteine HCl and sodium sulfide in the medium may affect the rate of protein degradation (17) especially during the first 2 h of fermentation (unpublished data). To minimize this effect, blanks containing 200 mg of sample and medium with cysteine HCl but without rumen fluid were used. The amount of protein in the blanks digested after

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2-h fermentation period was subtracted from the initial amount of protein in the experimental samples. An exponential equation with lag was used to determine the rate of NDF disappearance(18): Y=a*(exp(-b*(X–c))) where Y=residual NDF/DM at time t; a=digestible NDF, %; b=rate of NDF disappearance, %/h; and c=lag time, h. Because no lag was observed in the NDIP disappearance, an exponential equation without lag was used for NDIP rate computations: Y=a*(exp(-b*X)) where Y=residual NDIP/DM at time t; a=digestible NDIP, %; b=rate of NDIP disappearance, %/h. The goal of this study was to measure the digestion rate of the NDIP, not to determine whether ADIP is digested or not(19). As a result, no ADIP corrections were made. All curves were fitted using Table Curve (version 2.0, Jandel Scientific, San Rafael, CA). A complete randomized block design with factorial arrangement and two replicates per treatment was used, where the factors were grass species and N fertilization. A laboratory standard of guinea grass (M. maximus) was used to control for ruminal fluid variation among in vitro runs. A 4 x 2 factorial arrangement of forage species (A. gayanus, B. brizantha, C. plectostachyus, or M. maximus Var. guinea) and N fertilization (0 and 100 kg/ha) as factors was used. The grass*fertilizer interaction was used to test for the main effects. The grass*fertilization effects were tested with the rest of the experimental error. Planned comparisons among the forages were estimated using Tukey's W procedure. Results were deemed significant at P≤0.05 for the grass and for the fertilization effect. The ANOVA analyses were performed using the MINITAB, Version 10 (Minitab Inc., State College, PA). Because there were no interactions (grass*N fertilization) of the 4×2 factorial arrangement of treatments, means of mean factors (grass or N fertilization) are shown in separate tables. Chemical composition, protein fractions, kinetic and potential degradation of tropical grasses are shown in Table 1. The average contents of CP (8.4 ± 2.21 %DM) and NDF (70.0 ± 3.58 % DM) are within the range of tropical grasses at similar stages of growth(20). Most of the protein is in the buffer insoluble fraction (IP), and the major part of this is in the NDIP. Brachiaria brizantha is an exception because it has low NDIP and ADIP values with corresponding increases in NPN.

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Table 1: Chemical composition, protein fractions, kinetics and neutral detergent insoluble protein (NDIP) potential degradation of tropical grasses Andropogon Cynodon gayanus plectostachyus

Megathyrsus maximus

Brachiaria brizantha

SEM

71.5a 74.9a a 41.0 41.2a 9.1a 8.3ab 1.5b 1.0b 7.4a 5.6b 4.4a 3.1ab 0.6b 0.8a Protein fractions (% CP)

71.9a 42.3a 7.2b 1.1b 5.2b 2.9b 0.6b

65.3b 36.5b 9.0a 2.5a 5.3b 1.2c 0.3c

0.57 0.18 0.12 0.06 0.11 0.14 0.02

16.6b 12.3b c 2.4 19.7a c 31.7 29.2c a 42.5 28.1b b 6.7 10.6a NDIP kinetics and potential degradation

16.9b 10.7b 38.1b 24.9b 9.4a

29.2a 12.9b 44.6a 9.9c 3.5c

0.77 0.68 0.86 1.06 0.28

74.5b 9.7a 0.67b 2.2b 0.75b 34.1b 25.3b

52.2c 5.2b 0.58c 0.64c 0.32c 49.2a 25.6b

0.69 0.28 0.007 0.135 0.040 1.07 0.62

Chemical composition (% DM) NDF ADF CP (N × 6.25) NPN (N × 6.25) IP (N × 6.25) NDIP (N × 6.25) ADIP (N × 6.25) A B1 B2 B3 C Extent, % Rate, %/h Potentially indigestible, %DM* Potentially digestible, %DM Escape, %DM** Escape, %NDIP** Escape, %potentially digestible**

81.7a 8.4a 0.72b 3.7a 1.3a 37.9b 30.8ab

74.1b 5.2b 0.80a 2.3b 1.1a 48.9a 36.2a

NDF=neutral detergent fiber; ADF=acid detergent fiber; CP=crude protein; NPN=non protein nitrogen; IP=protein insoluble in buffer; NDIP=neutral detergent insoluble protein; ADIP=acid detergent insoluble protein. * NDIP residue after 96 h in vitro incubation. ** Insoluble potentially digestible NDIP escaping from rumen degradation. a,b,c Means with different superscripts in row are different (P≤0.05); SEM=standard error of means.

When the protein fractions are expressed on a CP basis, intracellular soluble protein (A, B1, and B2) makes up 66 % of the total CP, and the extracellular structural protein (B3 and C) composes 34 % of the total. The largest pool (36 %) of the non-cell wall protein is the B2 fraction, which consists of proteins that make up the structure of cellular organelles and some enzymatic complexes(21). The B3 fraction which is the NDIP - ADIP was 26 % of the total CP. Unlike the protoplasmic proteins, the structural proteins are glycoproteins (extensins) with high levels of hydroxyproline(22). Large variation was found within the protein fractions, primarily due to species. Brachiaria brizantha had a very different protein profile from the others, because it has more A and B2 and less B3 and C fractions, suggesting that this forage have a higher percentage of the forage N in an useable form for ruminants. Andropogon gayanus had about 50 % of its protein in the cell wall. However, C. plectostachyus and M. maximus Var. Guinea had similar protein 593

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profiles. Approximately 10 % of the protein in C. plectostachyus and M. maximus Var. Guinea was ADIP, a fraction often assumed to be unavailable or unused by the animal(19). These variations pose a difficulty when trying to predict protein fractions on grasses with the same CP content. A situation that arise when NIRS technology is used to predict N fractions in forages. Even though, total N is well predicted by NIRS, and NDIP also has an acceptable coefficient of determination (only when there is a strong correlation with total N), the protein B3 fraction it is not well predicted given by the accumulation of errors caused by the subtraction process(23). A recommendation is to generate NIRS calibration equations by grass specie. The extent of digestion at 96 h ranged from 52.2 to 81.7 % and the rates ranged from 5.2 to 9.7 %/h. These measured rates of NDIP digestion are faster than those in the Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS version 6.5)(4) feed library for the same grasses. The CNCPS is a nutritional model that evaluates the environmental and nutritional resources available in an animal production system and enables the formulation of diets that closely match the predicted animal requirements. Assuming a passage rate of 5 %/h, much of the NDIP will be degraded in the rumen if our rates are used. Data of the present work are in agreement with those found by Ogden(5). In contrast, when slower rates are used(2,9), the NDIP will make little contribution to the ruminal N supply. The B2 pool described by Messman(24) was determined mathematically, using a 2-pool model, not by chemical fractionation. Their B2 rates ranged from 0.6 to 1.2 %/h, which are slower than rates of this work, and close to those proposed by Sniffen(7) for the CNCPS version 5.0 B3 fraction. There is wide variation in NDIP content, and in NDIP extent and rate of digestion due to species. A. gayanus and B. brizantha have similar CP content but their NDIP fraction behave differently. Brachiaria brizantha has less NDIP (15 %CP) and it is only 52.2 % digestible and its digestion rate is slow (5.2 %/h). On the other hand, half of the CP in A. gayanus is NDIP, but this NDIP is 81.7 % digestible with a digestion rate of 8.4 %/h. C. plectostachyus and M. maximus Var. Guinea contain the same amount of NDIP, but their rate constants were different (5.2 vs 9.7 %/h). Therefore, at a given passage rate, more of the NDIP from M. maximus would be ruminally available despite the fact that it had the same NDIP content as C. plectostachyus. The species variation in the rate of digestion of the NDIP may be due to differences in the extent of glycosylation and amino acid profile of the structural proteins(22). The role of moderately glycosylated extensin proteins; hyperglycosylated arabinogalactan proteins(25); and hidroxiprolin/prolineâ&#x20AC;&#x201C;rich proteins that may be no glycosylated at all as important components of cell wall proteins, play pivotal roles in cell wall signal and affects the amount of intra and intermolecular cross-linking(26). Both glycosylation and cross-linking may affect ruminal degradation. The first step in predicting the amount of undegradable protein in the NDIP was to evaluate how much remained undegraded after 96 h of in vitro fermentation. Between 16 % (A.

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gayanus) and 50 % (B. brizantha) of the NDIP remained after 96 h. Following the calculations of Anderson(27) and using a fixed passage rate of 5 %/h, the NDIP escaping ruminal digestion ranged from 0.32 to 1.32 % of DM. Bowen(6) found a range from 0.50 to 1.0 % of DM of rumen undegradable protein fraction actually measuring passage rate in C4 grasses. The escape value was highest for A. gayanus and lowest for B. brizantha. Expressing this fraction as a percentage of the NDIP indicates that between 25.3 to 36.2 % escaped the rumen and was available for digestion in the intestine. The residual NDIP of B. brizantha after 96 h of fermentation was double the ADIP level. This implies that part of the NDIP would not be digested in the rumen even with long retention times. This observation may lead us to question the use of ADIP as an indicator of indigestible N in the rumen. Microbial contamination was not an interference due to its removal by either NDF or ADF solutions. Means by effect of N fertilization on chemical composition, protein fractions, kinetics and potential degradation of tropical grasses are shown in Table 2. Nitrogen fertilization increased (P≤0.05) N content as has been reported in different studies(28,29). Mass protein fractions (%DM): NPN, IP, NDIP and ADIP tended to follow the total protein mass fraction. Similar response in Lolium perenne found Hoekstra(30).

Table 2: Effect of N fertilization on average chemical composition, protein fractions, kinetics and NDIP potential degradation of tropical grasses

NDF ADF CP (N × 6.25) NPN (N × 6.25) IP (N × 6.25) NDIP (N × 6.25) ADIP (N × 6.25) A B1 B2 B3 C Extent, % Rate, %/h

N fertilization kg/ha 0 100 Chemical composition (% DM) 72.1 69.7 40.3 40.2 b 5.9 10.9a b 1.2 1.8a b 4.1 7.6a b 2.2 3.6a b 0.5 0.7a Protein fractions (% CP) 20.8 16.7 9.3 13.5 33.4b 38.4a 27.6 25.1 8.8 6.3 NDIP kinetics and potential degradation 65.7 75.5 6.7 7.6

SEM 0.29 0.09 0.06 0.03 0.06 0.07 0.01 0.38 0.34 0.43 0.53 0.34 0.14

NDF=neutral detergent fiber; ADF=acid detergent fiber; CP=crude protein; NPN=non protein nitrogen; IP=protein insoluble in buffer; NDIP=neutral detergent insoluble protein; ADIP=acid detergent insoluble protein. a,b,c Means with different superscripts in row are different (P≤0.05). SEM=standard error of means.

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The impact of N fertilization on the distribution of the protein fractions results in more true cellular protein (B2). Similar response found Johnson(10) fertilizing C. dactylon in Florida at different rates of N, concluding that the nitrogen pool available for rumen microbes to be utilized in microbial protein synthesis is increased in tropical forages as fertilization rates increase. In contrast, with temperate grasses Hoekstra(30) using L. perenne did not found any effect at all of the nitrogen fertilization on the nitrogen fractions suggesting that appears to be limited scope for the manipulation of grass-protein fractionation through grass fertilization. Because N-fertilized grasses had more N in the more digestible fractions, more N retention would be expected. The digestion rates for NDIP were not affected by N fertilization. In the literature review, it was not find evidence of N fertilization on digestion rate of the NDIP fraction in tropical forages. Results for extent and rate of degradation of the NDF are presented in Figure 1. The range in the rates of the NDF disappearance is in agreement with those found elsewhere(31) in some tropical forages (5 -6 %/h), and with those suggested by the CNCPS(4) for grass hay (4.5 Âą 1.0 %/h). The digestion coefficients for NDF were lower than those for the NDIP (Pâ&#x2030;¤0.05). Also, Ogden(5,32) shows that rates of digestion of NDIP fraction are faster than the NDF fraction and also found that the effective disappearance of NDIP is considerably higher than for NDF. Lignin (the major determinant of indigestibility)(14) does not seem to affect the structural proteins the same way as it inhibits digestion of structural carbohydrates. For instance, glycoproteins may be more readily digested than cellulose or hemicellulose because there are no linkages between lignin and extracellular proteins. Besides, proline the most extensive amino acid in structural proteins(26), is extremely soluble as 14 kg of it can be dissolved in 1 kg of water(33). Weiss(34) could not find evidence that lignin interferes directly with CP digestion.

Figure 1: Comparison of extent and rate degradation of neutral detergent fiber (NDF) versus neutral detergent insoluble protein (NDIP) in tropical grasses 1

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The NDIP as a percentage of the CP averaged 35 with a range of 10 to 60. The NDIP variation was primarily due to species but fertilization also was a factor. The NDIP is potentially ruminally available with an extent of 70.6 % at a rate of 7.1 %/h. Nitrogen fertilization had no influence on the kinetics of the NDIP digestion. The NDIP was digested faster than the NDF.

Acknowledgements

This work was funded by Cornell University Animal Science Department. We thank professors Peter Schofield, Dany G. Fox, Jimmy B. Robertson and Peter J. Van Soest for their guidance during this research.

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https://doi.org/10.22319/rmcp.v9i3.4500 Nota de investigación

Oportunidades para caprinocultores de Guanajuato, México, en la comercialización de queso fino Opportunities for goat farmers in Guanajuato, Mexico, in the marketing of fine cheese

Rodolfo Santos-Lavallea Juan José Flores-Verduzcoa Fernando Cervantes-Escotoa José María Salas-Gonzálezb Leticia Myriam Sagarnaga-Villegasc*

Centro de Investigaciones Económicas Sociales y Tecnológicas de la Agroindustria y la Agricultura Mundial (Ciestaam). Universidad Autónoma Chapingo (UACh). Km 38.5 Carretera México -Texcoco, Chapingo, Estado de Mexico. México. b

Departamento de Sociología Rural, Chapingo, Estado de Mexico. México.

Departamento de Zootecnia, Chapingo, Estado de Mexico. México.

*Autor de correspondencia: sagarnaga.myriam@gmail.com

Resumen:

A partir de 2008 el precio real de la leche de cabra se ha mantenido a la baja. Ante la imposibilidad de negociar una mejora, algunos caprinocultores han optado por transformarla en queso artesanal. Esta investigación permite conocer los retos y oportunidades al tomar esta decisión. El objetivo fue analizar las causas que limitan la participación y el posicionamiento en el mercado de empresas de caprinocultores productoras de queso fino, ubicadas en Guanajuato, México, con el fin de identificar alternativas orientadas a incrementar ventas. El estudio se realizó bajo el enfoque de red de

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valor y se aplicaron encuestas semi-estructuradas a los diferentes actores que la integran; la información permitió identificar flujos comerciales, formación de precios, problemas percibidos y su complejo causal. Se encontró que las empresas tienen débil posicionamiento en los mercados y limitada participación en venta directa a detallistas en mercados potenciales. La escasa diferenciación de productos y el bajo poder de negociación con sus compradores son las principales causas. A partir de esos hallazgos, se propone gestionar innovaciones en productos, procesos y mercadotecnia. Palabras clave: Red de valor, Diferenciación de productos, Posicionamiento, Innovación.

Abstract: Since 2008 the real price of goat's milk has been decreasing. By the impossibility of negotiate an improvement, some producers have chosen to make artisan cheese. This research allows to know the challenges and opportunities to take this decision. The objective was to analyze the causes that limit the participation and the positioning in the market of companies producers of fine cheese owned by goat producer, located in Guanjuato, México, in order to identify alternatives aimed at increasing sales. The study was conducted under the value network approach and semi-structured surveys were carried out to different actors that make it up; the information allowed to identify trade flow, price formation and identify perceived problems and their causal complex. It was found that the analized enterprises have a weak position in the markets and a limited participation in direct sales to retailers in potential markets. The low differentiation of the products and the low bargaining power with its buyers are the main causes. Based on these findings, it is proposed to manage innovations in products, processes and marketing. Key words: Value network, Product differentiation, Positioning, Innovation.

Recibido 27/05/2017 Aceptado 23/11/2017

En México el estado de Guanajuato produce 27.3 % de la leche de cabra, ocupando el segundo lugar nacional(1). En esa entidad existen dos grupos de empresas productoras de queso fino: aquéllas propiedad de caprinocultores que transforman su propia leche, y las que al no tener producción primaria, se abastecen de centros de acopio.

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Los mercados de la leche están monopolizados(2), razón por la cual los productores tienen bajo poder de negociación, confirmado con una tendencia del precio real a la baja durante ocho años consecutivos: de $7.42 por litro en 2008, a $4.95 en 2016(1). Por ello encuentran en la fabricación de quesos una alternativa para mejorar sus ingresos. La investigación se focaliza en siete empresas que pertenecen al primer grupo, las cuales llevan más de 20 años en la actividad. Sin embargo, no han podido mantener un crecimiento en ventas, por lo que, en la actualidad, 71 % de ellas reportan infraestructura subutilizada. Mientras esto pasa, empresas competidoras, ubicadas en la misma entidad y en el estado de Querétaro, están ampliando instalaciones y conquistando nuevos clientes. Por tal motivo el objetivo de este estudio fue analizar las causas que limitan la participación y el posicionamiento en el mercado de estas empresas (propiedad de productores), con el fin de identificar alternativas orientadas a incrementar el volumen de ventas. Se tomó como guía metodológica el concepto de red de valor, propuesto por Nalebuf y Branderburguer(3) y adaptado para el sector agropecuario por Muñoz(4). Este enfoque permite a una, o a un grupo de empresas de un sector, tomar acciones específicas en el marco de su entorno competitivo, pues ayuda a comprender las acciones de los demás actores y las reglas del juego que emplean, tomando en cuenta las fuerzas competitivas que deben enfrentar(5), y así diseñar o reestructurar su modelo de negocios. La red de valor está concebida como “el conjunto de empresas especializadas en una actividad en común, caracterizada por la concentración territorial de sus actores, con desarrollo de vínculos de naturaleza económica o no, que contribuyen de esta manera a la generación de valor o riqueza, tanto para sus miembros como su territorio”(3). Esta se conforma por cinco grupos de actores que es necesario analizar por separado y en sus interacciones; en el centro se ubican empresas cuyo poder les permite configurar la dinámica de la red de valor, conocidas como empresas tractoras(4). La investigación se efectuó de mayo de 2016 a enero de 2017. El trabajo de campo se realizó con apoyo de un facilitador, quien referenció nombre y ubicación de las empresas. Se aplicaron entrevistas semi-estructuradas a los propietarios de las siete empresas bajo estudio, es decir se realizó un censo. La selección del resto de actores se hizo por muestreo no probabilístico, conocido como bola de nieve(6), para ello se solicitó a los primeros que mencionaran otros actores con los que se relacionan. Se entrevistaron doce proveedores de leche de cabra independientes; cuatro dueños o gerentes de empresas productoras de queso, consideradas como competidores. También un funcionario del sistema producto caprino estatal, otro de la Secretaria de Desarrollo Agropecuario de Guanajuato, cuatro investigadores y asesores en cabras; todos estos considerados como complementadores. Un actor cumple con esta función, si las acciones desarrolladas por él permiten que los clientes valoren más los bienes y servicios ofrecidos,

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o bien que los proveedores prefieran relaciones con la empresa tractora en vez de dirigirse con la competencia(4). Adicionalmente se entrevistó a dos distribuidores de queso de cabra y al personal de tres distintos puntos de venta al detalle en la Ciudad de México, considerados dentro del grupo de clientes. La información cuantitativa recabada se analizó utilizando estadística descriptiva y la cualitativa resultó útil en la construcción de flujos e identificación de actores, el análisis de la red de valor y la elaboración del árbol de problemas. Para construir el árbol de problemas y su complejo causal se aplicó la metodología del marco lógico(7). Finalmente, se generó un conjunto de propuestas para el problema principal, con acciones que eliminan las causas que lo originan. La leche producida en granja tiene el siguiente flujo: pasa por un proceso de acopio y comercialización cuando las empresas requieren comprarla, de lo contrario, al ser producida en granja propia pasa directamente a la quesería para su transformación. Las empresas incluidas en este estudio procesan 103,904 L mensuales de leche y obtienen 16,468 kg de queso. Este producto se distribuye por tres canales de comercialización: venta directa a detallistas en centros de consumo, venta a distribuidores y venta a consumidores locales (Figura 1).

Figura 1: Flujo comercial del queso de cabra en las empresas de caprinocultores

Fuente: elaboración propia con datos de campo, 2016.

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En el flujo comercial se identificaron los siguientes actores: productores de leche, agroindustrias queseras, distribuidores, cremerías, supermercados, hipermercados, restaurantes, mercados y tiendas gourmet, detallista de “cambaceo” y consumidor final. De acuerdo al volumen comercializado, las empresas dependen en gran medida de los distribuidores (51.81 %) para que el producto llegue a los detallistas; sin embargo, también se observa una estrategia para trabajar en circuitos cortos de comercialización, vendiendo directamente a detallistas e incluso al consumidor final (48.19 %), con ello se busca acceder a una mayor proporción del valor generado(8). Los precios pagados por el consumidor final no solo se ven influenciados por el grado de intermediación, también dependen de la máxima cantidad de dinero que están dispuestos a desembolsar. Por ejemplo, el mismo producto, puesto en un mercado gourmet recibe un precio mayor ($323.00) pues ahí concurren consumidores con alto poder adquisitivo (Cuadro 1). Un caso especial es la venta por “cambaceo”, realizada por detallistas que entregan el producto a domicilio a $ 375.00 kg-1.

Cuadro 1: Precios pagados en función del tipo de mercado en que participan las empresas Tipo de mercado detallista Cremerías CDMX Supermercados Venta local Hipermercados Tiendas gourmet Mercado gourmet Casa por casa

Precio por kilogramo de queso (pesos) Distribuidor 130.00 N/A N/A 115.00 140.00 N/A N/A

Detallista 167.00 148.50 N/A 175.00 182.00 140.00 165.00

Consumidor final 225.00 245.00 165.00 265.00 265.00 323.00 375.00

N/A= no aplica.

También se encontró que el consumidor final se beneficia del menor precio cuando las empresas realizan la venta local ($165.00 por kg), evidencia de los circuitos cortos de comercialización, que reduce costos y a la vez los precios finales de los alimentos(9). Por su parte el margen del precio final que es retenido por los distintos actores en el flujo comercial depende tanto de lo que paga el consumidor final, como de los niveles de intermediación (Cuadro 2). Con relación a los detallistas, se observa variación, pero los que venden casa por casa y en mercados gourmet retienen incluso más dinero que las propias empresas productoras de queso. En cambio, los distribuidores se quedan con la menor cantidad, compensada por el volumen desplazado, sobre todo en hipermercados. Las empresas logran un margen mayor cuando realizan venta local.

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Cuadro 2: Margen absoluto retenido por los actores en el flujo comercial (pesos/kilogramo) Tipo de mercado detallista Cremerías CDMX Supermercados Venta local hipermercado Tiendas gourmet Mercado gourmet Casa por casa

Precio al consumidor final 225.00 245.00 165.00 265.00 265.00 323.00 375.00

Consumidordetallista 58.00 80.00 N/A 90.00 83.00 183.00 210.00

Detallistadistribuidor 37.00 N/A N/A 60 42.00 N/A N/A

Detallista o distribuidor-empresa 130.00 148.50 * 165.00 115.00 140.00 140.00 165.00

* La diferencia son descuentos (10 %) realizados por la tienda de autoservicio.

La descripción y el análisis de la red de valor inician en las empresas tractoras (Figura 2). Estas tienen en promedio 22 años elaborando queso de cabra, con un rango de 16 a 40 años. La escala va de 2,000 a 72,000 L al mes, algunas ocupan mano de obra contratada adicional a la familiar, utilizan 100 % de leche de cabra evitando el uso de extensores. Comercializan los productos con diferentes marcas. Se puede afirmar que fabrican queso de manera artesanal, la producción es manual y se respeta el conocimiento sobre el “saber hacer” que se ha importado directamente de Francia.

Figura 2: Representación de la red de valor con sus interrelaciones

Fuente: elaboración propia con datos de campo, 2016.

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Tres empresas se encuentran en expansión, tres más se consideran estancadas y una en retroceso debido a que ha reducido su capacidad de operación. Dos de las que se encuentran en expansión operan con mano de obra contratada y orientan la oferta hacia mercados que demandan mayor volumen; otra dirige su oferta al mercado gourmet. Se ha documentado en quesos artesanales de leche de vaca que cuando las empresas evolucionan en escala y perciben un panorama favorable en la demanda, es cuando utilizan estrategias de comercialización distintas a la venta local(10). La venta directa a detallistas en centros de consumo tiene como compradores a supermercados y mercados gourmet. Con los supermercados se firma un contrato que establece precio, volumen, frecuencia de abasto y penalizaciones. No hay exclusividad, se pueden encontrar varias empresas compitiendo en una misma tienda. Demandan constancia, estandarización de productos, garantía en calidad y cumplimiento de lo pactado; por ello sólo una empresa vende en este canal, el resto prefiere recurrir a distribuidores y detallistas menos exigentes. El mercado gourmet es un punto de venta en la Ciudad de México que concentra varios negocios que ofrecen productos dentro de esta categoría. Este es un mercado exigente que selecciona los mejores quesos con base en catación y análisis de los procesos con que se fabrican. Ello explica el alto precio que está dispuesto a pagar el consumidor final. Se venden tres marcas de queso, una de las empresas incluidas en el análisis. En la venta a distribuidores participan cuatro empresas, no hay contrato establecido, el precio se negocia cuando acuden a la planta o antes del envío. A su vez estos entregan a detallistas: hipermercados, cremerías, tiendas gourmet y restaurantes. Todas las empresas venden localmente en planta y el pago es de contado; además, una de ellas vende en mercados públicos para llegar al consumidor final; otra vende a detallistas que ofrecen productos gourmet; dos venden en cremerías y dos más a restaurantes, todas dentro del estado de Guanajuato. La materia prima principalmente es producida en granjas propias, ahí se cuida la calidad higiénica mediante buenas prácticas de ordeño, lo cual le confiere garantía al producto. Los productores independientes son seleccionados como proveedores cuando reúnen condiciones de entrega, volumen y calidad demandados. Se ven beneficiados al recibir un mejor precio ($6.20), comparado con el que recibirían en centros de acopio que abastecen a industrias competidora ($5.50). En relación con la proveeduría de leche, las empresas tienen disponibilidad todo el año, gracias al control en la reproducción de las cabras. Aun así, existen picos de producción en mayo-junio, que algunas almacenan como pasta láctica o queso semi-maduro.

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Como complementadores, por el lado de la demanda, se ubicó la empresa Lactografhy, quien apoya a productores de queso promocionándolos en sus puntos de venta. También el Instituto Guanajuato para la Calidad A.C. facilita el que algunas empresas implementen Buenas Prácticas de Manufactura (BPM). Un actor puede ejercer dos o más funciones simultáneamente en una red de valor(4), por lo que los distribuidores también se desempeñan como complementadores, ayudando al desarrollo de la demanda. Finalmente, el Centro para el Desarrollo Integral del Campo (CEDIC) ejerce el papel de asesor en el desarrollo de capacidades empresariales con dos empresas. Los competidores se pueden diferenciar en dos grupos: los de mercado masivo, y los que están en el mercado gourmet. En el primer caso, existe un duopolio que tiene poder para competir por el abasto de leche, fijar reglas de precios y calidad a sus proveedores y dominar en tiendas de autoservicio. Basan su estrategia en la operación de economías de escala (compiten por precio), a diferencia de los quesos artesanales que suelen ser más costosos(11). También ofrecen otros productos lácteos como yoghurt, jocoque, queso de vaca y de oveja; dan cumplimiento al sistema de Análisis de Riesgos y Control de Puntos Críticos (HACCP) y a las normas de la Food and Drug Administration (FDA); cuentan con innovación de producto; atención y prospección de clientes a través de su fuerza de venta. Su éxito puede confirmarse por la capacidad alcanzada para crecer con nuevas instalaciones o para adquirir a otras empresas competidoras y para exportar pasta láctica de cabra. En el segundo caso, las empresas tractoras compiten tanto con empresas del duopolio, como con otras dos de menor escala, que se distinguen por producir su propia materia prima y elaborar productos artesanales con leche 100 % de cabra. Una de ellas cuenta con certificación en buenas prácticas de producción, la otra en HACCP y certificación de productos orgánicos. Dirigen su oferta a tiendas especializadas en productos orgánicos y artesanales; ofrecen además leche pasteurizada, yoghurt y cajeta. El débil posicionamiento de los productos en los mercados se percibe como uno de los problemas a superar por las empresas bajo estudio. Con algunos clientes detallistas lo están perdiendo y con otros no lo han logrado. En el primer caso, una se posicionó desde hace 10 años en cremerías de especialidad de la Ciudad de México; sin embargo, en fechas recientes está perdiendo esa ventaja ante un competidor que ofrece productos diferenciados por un mejor empaque, mayor vida de anaquel y menor tiempo de entrega. En el segundo caso, empresas competidoras en mercados y tiendas gourmet se han posicionado porque comunican e informan al consumidor de mejor manera, resaltando atributos del producto a través de la etiqueta; se diferencian por la certificación orgánica y ofrecen una mayor diversidad de productos. La falta de diferenciación de las características extrínsecas en los productos se considera la causa principal del débil posicionamiento en los mercados. Factores como el tipo de empaque y la información en la etiqueta (tecnología de proceso, nutricional y el precio)

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desempeñan un papel importante en la elección de compra(12-15). En las empresas analizadas, que participan en cremerías de especialidad, tiendas y mercado gourmet, la información que las etiquetas proporcionan es insuficiente, no mencionan que es un producto gourmet elaborado de manera artesanal, limitando su posicionamiento, razón por la cual están dejando de ganar dinero, pues la disposición a pagar en mercado gourmet puede representar un incremento en precio de 37 %, en cremerías de especialidad 25 % y en supermercados 7.5 %. En los supermercados e hipermercados se exige a los proveedores que incluyan código de barras para facilitar el manejo de inventarios dentro de la tienda. Se encontró que cinco de las empresas (71 %) no lo tienen. Lo anterior imposibilita vender a estos detallistas, que tienen la ventaja de distribuir mayor volumen del producto. Para estos clientes la calidad también se ha convertido en una condición de compra, y es una forma de discriminar a quienes no cuentan con las certificaciones que la acrediten. Sin embargo, sólo tres empresas (43 %) intentan implementar HACCP, sin contar aún con dicha certificación. Las empresas bajo estudio no han identificado plenamente el problema de su débil posicionamiento. Sólo perciben que la demanda no ha crecido en los últimos años y que los costos fijos son altos; adicionalmente se sienten presionadas para mantener precios bajos, con el fin de conservar sus clientes. Otro de los problemas a superar es la limitada participación con venta directa en supermercados e hipermercados; considerados como mercados potenciales, por el volumen que pueden desplazar. Por esta razón resulta estratégico, pues la intervención de distribuidores reduce sensiblemente su participación económica; sin embargo, sólo 4.61 % de la producción tiene este destino. Para lograr lo anterior las empresa requieren superar las siguientes barreras: el poder para fijar las condiciones de compra a sus proveedores, que les posibilita establecer un precio tope ($35.00 la pieza de 200 g); también los requisitos para la aceptación de los productos, tales como uso de código de barras, garantía de certificación de calidad, fechas de abasto con día y hora de entrega; asimismo, tienen autoridad para establecer descuentos a proveedoras por promoción y costo de distribución. Esta situación coincide con lo teorizado por Porter(5), al hablar de que las empresas necesitan contrarrestar las fuerzas competitivas de sus proveedores para mejorar sus utilidades. Por otro lado, se encontró que cinco de las siete empresas (71 %) no cuentan con fuerza de ventas en su estructura administrativa, lo que limita su habilidad para negociar y hacer prospecciones que permitan captar más clientes.

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Como productores primarios, las empresas forman parte de la organización “Caprinocultores Unidos de Guanajuato”, A. C.; como fabricantes de queso no están organizados, situación que no ayuda a contrarrestar el poder ejercido por los clientes. Los problemas percibidos y el complejo causal permiten construir el árbol de problemas (Figura 3), en correspondencia con la herramienta de marco lógico(7).

Figura 3: Diagrama de árbol de problemas en las empresas de caprinocultores

Fuente: elaboración propia con datos de campo, 2016.

Con base en el análisis de esa información, el problema principal es que las empresas no adoptan una estrategia de innovación en producto, procesos y mercadotecnia. Lo anterior fue evidenciado en apartados anteriores al exponer las causas de los problemas percibidos: deficiencias en certificación, código de barras, empaque, etiquetado, capacidad de negociación, fuerza de ventas y organización. Ese problema tiene como efecto principal que cinco de las siete empresas (71 %) tienen capacidad instalada subutilizada. En casos extremos sólo se aprovecha 20 % de la misma. Cuando la disponibilidad de materia prima no es en una limitante, la subutilización se atribuye al bajo volumen de ventas. Para recuperar el posicionamiento en los mercados se sugiere establecer una diferenciación de productos. De conformidad con lo anterior, se propone certificar los procesos de elaboración de queso en HACCP, generalizar el empaque al alto vacío, incluir el código de barras en las etiquetas, rediseñar las etiquetas con el propósito de comunicar a los

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consumidores que el queso es un producto gourmet, elaborado 100 % con leche de cabra de manera artesanal y, finalmente, que es fabricado por productores de leche de cabra, como un mensaje de autenticidad. Comunicar asertivamente información valorada por los consumidores a través de las etiquetas, permite generar confianza, asociación con el lugar y el método de fabricación(16). También se recomienda establecer un vínculo directo con los consumidores, que se sustente en relaciones de confianza y proximidad(17). Si la búsqueda de esa clientela es de forma individual, la alternativa es colocar a un vendedor profesional en su estructura organizacional. Como algunas empresas no tienen capacidad para contratar fuerza de ventas de manera individual, se propone que se agrupen para generar una alianza estratégica y explorar conjuntamente la contratación de una persona que lleve a cabo esta tarea. Se ha documentado que agruparse con otros productores permite contar con medios suficientes para negociar con las grandes cadenas de distribución y cumplir con sus exigencias(18). Se concluye que los retos que enfrentan las empresas productoras de quesos finos de cabra son distintos, en función del canal de comercialización en el que se insertan. Cuando orientan la oferta de producto a supermercados e hipermercados, estos presentan barreras de entrada, como el poder de negociación sobre sus proveedores; cuando participan en mercados gourmet, se encuentran con empresas competidoras mejor posicionadas. Una de las opciones de mercado que ofrece mayores beneficios, tanto para el consumidor de quesos finos de cabra, como para quien los produce, es la venta local, con un menor número de transacciones; sin embargo, no toda la producción puede colocarse por esta vía, por lo que deben buscarse otras alternativas fuera del estado de Guanajuato. Ante esta situación, las empresas productoras de quesos finos requieren definir con claridad a qué mercado dirigirán su oferta, porque lo anterior determina los retos a enfrentar y define las acciones que deberán implementarse. Si optan por los mercados gourmet, la alternativa es la diferenciación de productos, destacando, además de los atributos sensoriales, el origen y el método de elaboración. En cambio, si la alternativa son los hipermercados y supermercados, las empresas requieren integrarse de manera horizontal, para generar economías de escala y contrarrestar relaciones de poder con sus compradores.

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Agradecimientos

Se agradece a las empresas que elaboran quesos finos de cabra en Guanajuato, en especial al MVZ Salvador Arellano por el apoyo brindado.

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Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias Volumen 9 Número 3

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Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias

Edición Bilingüe Bilingual Edition

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 9 Núm. 3, pp. 408-613, JULIO-SEPTIEMBRE-2018

ISSN: 2448-6698

CONTENIDO CONTENTS Detection of Neospora caninum from slaughtered dairy cattle in Aguascalientes, Mexico Le�cia Esperanza Medina Esparza, Ricardo de Luna Oseguera, Irene Victoria Vitela Mendoza, Carlos Cruz Vázquez................................................................................... 408

Frecuencia de casos e identificación molecular de Cryptosporidium spp en corderos lactantes mantenidos en pastoreo en el estado de Veracruz, México

Cases frequency and molecular identification of Cryptosporidium spp in lactating lambs kept grazing in the State of Veracruz, Mexico Irene Vitela-Mendoza, Victor Guillen Lorenzo, Carlos Cruz-Vázquez, Le�cia Medina-Esparza, Miguel Ramos Parra..................................................................................... 420

Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally-inoculated vampire bats

Detección del virus de la rabia en órganos no relacionados con el sistema nervioso central de murciélagos vampiro experimentalmente infectados María Luisa Méndez-Ojeda, Edith Rojas-Anaya, José Francisco Morales Álvarez, Graciela Tapia-Pérez, Gererdo Suzán, Osiris Gaona Pineda, Rodrigo A. Medellín-Legorreta, Charles E. Rupprecht, Elizabeth Loza-Rubio.................................................................................................................................................. 435

Valorización de una Indicación Geográfica Protegida. El caso de la carne de la Sierra de Guadarrama, España

Valuation of a Protected Geographical Indication. The case of the meat of the Sierra de Guadarrama, Spain Mario del roble Pensado-Leglise, Javier Sanz-Cañada.................................................................................................................................................................................... 451

Metales pesados en leche de vacas alimentadas con alfalfa producida en suelos irrigados con aguas residuales en Puebla y Tlaxcala, México

Heavy metals in milk from cows fed alfalfa produced in soils irrigated with wastewater in Puebla and Tlaxcala, Mexico Numa Pompilio Castro-González, Rafael Moreno-Rojas, Francisco Calderón-Sánchez, Alicia Moreno-Ortega, José Víctor Tamariz-Flores ..................................................466

Evaluación del rendimiento de materia seca y sus componentes en germoplasma de alfalfa (Medicago sativa L.)

Performance of dry matter yield and its components in germoplasm of alfalfa (Medicago sativa L.) Milton Javier Luna Guerrero, Cándido López Castañeda, Alfonso Hernández Garay, Pedro Arturo Mar�nez Hernández, María Esther Ortega Cerrilla...............................486

Eficiencia reproductiva de Ovsynch + CIDR en vacas Holstein bajo un esquema de inseminación artificial a tiempo fijo en el norte de México

Reproductive efficiency of Ovsynch + CIDR in Holstein cows under a fixed time artificial insemination scheme in northern Mexico Rafael Rodríguez-Mar�nez, Irene Concepción Chavarría Nerí, César A. Meza-Herrera, Alan Sebas�an Alvarado-Espino, Juan Luis Morales Cruz, Vicente Homero González-Álvarez, Ma. Guadalupe Calderón-Leyva, Francisco G. Véliz Deras, Oscar Ángel-García..................................................................................... 506

Valor nutricional de la semilla de Mucuna spp. como complemento dietario en animales no rumiantes y rumiantes. Revisión

Nutritional value of Mucuna spp. seed, as a dietary complement to non ruminant and ruminant livestock. Review Luis Gerardo Barriada-Bernal, Lilia Méndez-Lagunas, Juan Rodríguez-Ramírez, Sadoth Sandoval-Torres, Laura Aquino-González..............................................................518

Síndrome de depresión de grasa láctea provocado por el isómero trans-10, cis-12 del ácido linoleico conjugado en vacas lactantes. Revisión

Milk fat depression syndrome caused by trans-10, cis-12 isomer of conjugated linoleic acid in lactating cows. Review Lorenzo Danilo Granados-Rivera, Omar Hernández-Mendo.......................................................................................................................................................................... 536

Prevalencia de anticuerpos contra diarrea viral bovina en vacas no vacunadas en los estados de Puebla, Tabasco y Veracruz, México

Prevalence of antibodies against bovine viral diarrhea in non-vaccinated cows from the States of Puebla, Tabasco and Veracruz, Mexico Jorge Víctor Rosete Fernández, Ángel Ríos Utrera, Juan Prisciliano Zárate Mar�nez, Sara Olazarán Jenkins, Lorenzo Granados Zurita, Abraham Fragoso Islas, Víctor Manuel Banda Ruiz, Guadalupe Asunción Socci Escatell..................................................................................................................................................................... 555

Prevalencia de la acariosis traqueal y niveles de infestación de Acarapis woodi en colonias de abejas de Morelos, México

Prevalence of honeybee tracheal mite disease and infestation levels of Acarapis woodi in honeybee colonies of Morelos, Mexico Claudia García Figueroa, Miguel Enrique Arechavaleta-Velasco..................................................................................................................................................................... 567

Retención de membranas fetales y patologías uterinas en vacas lecheras tratadas con PGF2α después del parto

Retention of fetal membranes and uterine pathologies in dairy cows treated with PGF2α after parturition Luis Ángel Valdés Pérez, Joel Hernández Cerón, Rodolfo Luzbel de la Sota, Carlos Fernando Aréchiga Flores, Eligio Gabriel Salgado, Antonio Romero Arredondo............576

In vitro ruminal degradation of neutral detergent fiber insoluble protein from tropical pastures fertilized with nitrogen

Degradación ruminal in vitro de la proteína insoluble en fibra detergente neutro de pastos tropicales fertilizados con nitrógeno Francisco Indalecio Juárez Lagunes, Alice N. Pell, Robert W. Blake, Maribel Montero Lagunes, Juan Manuel Pino Rodríguez.....................................................................588

Oportunidades para caprinocultores de Guanajuato, México, en la comercialización de queso fino

Opportunities for goat farmers in Guanajuato, Mexico, in the marketing of fine cheese Rodolfo Santos-Lavalle, Juan José Flores-Verduzco, Fernando Cervantes-Escoto, José María Salas-González, Leticia Myriam Sagarnaga-Villegas..................601

Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 9 Núm. 3, pp. 408- 613, JULIO-SEPTIEMBRE-2018

Pags. Detección de Neospora caninum en ganado lechero sacrificado en Aguascalientes, México

Rev. Mex. Cienc. Pecu. Vol. 9 Núm. 3, pp. 408-613, JULIO-SEPTIEMBRE-2018