Rev.MVZ Córdoba 20(1):4393-4395, 2015. ISSN: 0122-0268
EDITORIAL
Chikungunya: few months after the attack Chikungunya: unos meses después del ataque
En mayo del 2014 se anunció en el editorial de la Rev.MVZ Córdoba la advertencia de la inevitable llegada del virus de chikungunya a Colombia y especialmente en el Caribe por sus condiciones climáticas del trópico húmedo, así como con la presencia del conocido vector competente del dengue: Aedes aegypti (1). La abundante población de este mosquito en el Caribe permitió una adaptación rápida del virus chikungunya y facilitó su diseminación en toda la costa Atlántica. La OPS y el Ministerio de Salud de Colombia conocían de su inminente llegada y destinaron recursos para controlar el vector y mitigar el impacto epidemiológico de este nuevo arbovirus. Sin embargo, se ha observado que las campañas de fumigación no fueron sistemáticas e incluso en algunas poblaciones rurales de la costa Atlántica no se realizaron. Desde el punto de vista filogenético, el virus de chikungunya que entró a Colombia, es la misma cepa de las islas vírgenes y Saint Martin (datos no publicados) en diciembre del 2013 y confirma los hallazgos de Lancioti y Valadere (2). Con relación a la presentación clínica de la enfermedad, esta ha sido la esperada, con algunas diferencias a las observadas en África y Asia. Aquí en el Caribe colombiano se han presentado pocas mialgias, diarreas, conjuntivitis y manifestaciones hemorrágicas; la artritis y la fiebre siguen siendo patognomónicas. No obstante, se han observado manifestaciones neurológicas como encefalitis y síndrome de Guillan Barré en algunos pacientes (datos no publicados). Al parecer existen casos de hepatitis que podrían estar asociados a la infección viral por CHikungunya con elevación de las enzimas hepáticas, casuística que está reportada en la literatura (3,4). Estas observaciones requieren por parte de las autoridades sanitarias una vigilancia más estricta de los casos post-chikungunya. No se sabe tampoco cómo es la coinfección con el dengue y si su asociación con el chikungunya lo hace mas letal o puede formar inmuncomplejos que aceleren o modifiquen su presentación clínica. Se han presentado casos letales asociados a chikungunya pero no se tiene certeza que sea la causa del deceso o si existe una coinfección con otro virus como el dengue (5). De otra parte, tampoco se han cuantificado los días laborales y escolares perdidos por la enfermedad; el impacto económico de esta patología sin duda es mayor que la gripa estacional y el mismo dengue. Se han registrado incapacidades en el área de la costa Atlántica de hasta 7 días, las artralgias con o sin edema en algunos pacientes persisten por meses al parecer en adultos mayores (datos no publicados). El Ministerio de Salud frecuentemente señala en los medios de comunicación que la carga de la enfermedad ha sido menor a la esperada, con solo 57.000 casos (6). Sin embargo, se ha observado que gran parte de la población de los departamentos del Caribe no está acudiendo a los hospitales ni a los centros de salud, porque al ellos observar la triada clínica: extantema-fiebre-artralgia, se automedican con acetaminofén. Quizás esa es la aparente razón de la baja casuística y probablemente por eso también hay escases del fármaco.
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Finalmente, la percepción de la población sobre la enfermedad es curiosa y a su vez interesante. Algunos creen que es el mosquito y no el virus el agente etiológico de la patología, otros consideran que se transmite de persona a persona por que han observado familiares que enferman en su misma casa. Otros han asociado mortalidad al ingerir alcohol post-infección chikungunya, ya que han coincidido con casos de personas que han fallecido posterior a una fiebre por chikungunya. Algunos mencionan conocer casos en donde la enfermedad ha repetido, situación que ha sido descrita en la literatura (7). Poco sabemos en Colombia de este nuevo arbovirus y se requiere analizar su genoma para observar si existen mutaciones y asociarlas con más profundidad con la presentación clínica que se está dando en los pacientes. Se necesita que se establezca si la coinfección con otros arbovirus exacerba o no los síntomas. Sería importante considerar una vacuna con cepas autóctonas.
REFERENCIAS 1. Gonzalez M, Mattar S. Virus Chikungunya in Colombia, a simple matter of time? Rev MVZ Córdoba 2014; 19:4045-4046. 2. Lanciotti R, Valadere AM. Transcontinental movement of asian genotype Chikungunya Virus. Emerg Infect Dis 2014; 20:1400-1403. 3. Economopoulou A1, Dominguez M, Helynck B, Sissoko D, Wichmann O, Quenel P, et al. Atypical Chikungunya virus infections: clinical manifestations, mortality and risk factors for severe disease during the 2005-2006 outbreak on Réunion. Epidemiol Infect 2009; 137(4):53441. doi: 10.1017/S0950268808001167. 4. Mohan A1, Kiran DH, Manohar IC, Kumar DP. Epidemiology, clinical manifestations, and diagnosis of Chikungunya fever: lessons learned from the re-emerging epidemic. Indian J Dermatol 2010; 55(1):54-63. DOI: 10.4103/0019-5154.60355.
Marco González T. M.Sc.
5. Omarjee R, Prat CM, Flusin O, Boucau S, Tenebray B, Merle O, et al. Importance of case definition to monitor ongoing outbreak of chikungunya virus on a background of actively circulating dengue virus, St Martin, December 2013 to January 2014. Euro Surveill. 2014; 19(13):pii=20753. URL Available in: http:// www.eurosurveillance.org/images/dynamic/EE/ V19N13/art20753.pdf 6. Instituto Nacional de Salud. Chikunguña a semana 49. INS; 2014. URL Disponible en: http://www.ins.gov.co/Noticias/Chikungunya/ Resumen%20Chikungu%C3%B1a%20 SEMANA%2049.pdf 7. Powers A, Logue C. Changing patterns of chikungunya virus: re-emergence of a zoonotic arbovirus. J Gen Virol 2007; 88:2363–2377.
Salim Mattar V. Ph.D.
Rev.MVZ Córdoba 20(1):4396-4405, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL
Applying multicriteria analysis for choosing the best marination for pork Aplicación de análisis multicriterio para elegir el mejor marinado para la carne de cerdo Nieto VMOS,1* M.Sc, Caldara FR,1 Ph.D, Nääs IA,1 Ph.D, Moi M,1 M.Sc, Almeida Paz ICL,1 Ph.D, Garcia RG,1 Ph.D, Seno LO,1 Ph.D, Santos LS,1 M.Sc. Federal University of Grande Dourados - UFGD, Agrarian Science College, Rodovia Dourados - Itahum, km 12, Caixa Postal 533 - CEP: 79.804-970, Dourados, MS, Brazil. *Correspondence: viviane.vmos@ gmail.com 1
Received: February 2014; Accepted: September 2014.
ABSTRACT Objective. This research aimed to choose a best marination solution using the Analytic Hierarchy Process (AHP). Materials and methods. Pork meat samples were collected in a commercial slaughterhouse, and they were randomly distributed in four treatments with three different salt contents blend. Color, pH, retention of the solution, exudate and cooking loss, shear force and sensory attributes were assessed and evaluated. Multicriteria analysis using AHP was applied to the results in order to choose the best overall marination solution. Criteria used for selection were the physical and sensory characteristics of meat, and based on these criteria were classified solutions marination. Results. Results showed that the combination of the salts was the best alternative (Na2CO3+NaCl+Na5P3O10), followed by the solutions of (Na2CO3 + NaCl), and (Na5P3O10 + NaCl). Conclusions. All tested solutions with the salts used alone or in combination led to better physical and sensory attributes than the meat not marinated. Key words: Firmness, sodium chloride, sodium tripolyphosphate, texture (Source:CAB).
RESUMEN
Objetivo. Esta investigación tuvo como objetivo elegir la mejor solución para los productos marinados, utilizando el Proceso Analítico Jerárquico (AHP). Materiales y métodos. Las muestras de carne de cerdo fueron recogidas en un beneficiadero comercial, y fueron asignadas aleatoriamente a cuatro tratamientos con tres contenidos diferentes de soluciones salinas. Color, pH, solución de retención, pérdida de exudado, pérdida de peso por cocción, fuerza cortante y atributos sensoriales fueron analizados y evaluados. Fue utilizado el análisis multicriterio AHP jerárquico con el fin de elegir la mejor solución de marinado. Los criterios adoptados para la selección fueron las características físicas y sensoriales de la carne y con base a estos criterios se clasificaron las soluciones del marinación. Resultados. Los resultados mostraron que la mejor combinación de sales fue la alternativa (Na2CO3 + NaCl + Na5P3O10), seguida por (Na2CO3 + NaCl + NaCl y Na5P3O10). Conclusiones. Todas las soluciones ensayadas con sales usados sólos o en combinación dieron lugar a los mejores atributos físicos y sensoriales de que la carne sin marinar. Palabras clave: Cloruro de sodio, firmeza, textura, tripolifosfato de sodio (Fuente:CAB). 4396
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INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Meat appearance is an essential aspect of consumers’ acceptance and many factors affect this characteristic. Among them, it is the waterholding capacity, which is the ability that the muscle tissue has to retain water (1), when processes such as cutting, cooking and pressing are applied. Marination techniques contribute to improve the quality of the meat and add value to them. Marination involves the use of salts with or without the addition of condiments for promoting the increase of meat water retention, and leading the meat to better physical and sensory characteristics (2,3).
La apariencia de la carne es un aspecto esencial para los consumidores a la hora de elegir y existen muchos factores que afectan esta característica. Entre ellos se incluye la capacidad de retención de agua, que es la capacidad que tiene el tejido muscular para retener agua (1) cuando se aplican procesos como corte, cocción y prensado. Las técnicas de marinado contribuyen a mejorar la calidad de la carne y agregar valor a la misma. El marinado involucra el uso de sales con o sin la adición de condimentos para promover el aumento de la retención de agua en la carne y así alcanzar las mejores características físicas y sensoriales de la misma (2,3).
Alkaline salts such as polyphosphate and sodium bicarbonate are often used in marination solutions. They have the ability of increasing the meat Ph and water holding capacity to improve color stability, and to provide meat more flavor and juiciness (4,5). Sodium chloride acts in the extraction and solubilization of muscle proteins, contributing to the increased the water holding capacity, reduction of the cooking loss and improves the quality and texture of the product (6,7). Current literature shows the synergistic effect of the sodium polyphosphate, sodium bicarbonate and sodium chloride (4,8). Besides the benefits obtained on the physical properties of the meat, it can also be an effective strategy to reduce or eliminate peculiar aromas and flavors of pork. Since the meat quality is determined by a combination of factors the choice of marination solutions is clearly a multicriterial task which involves different aspects related to benefits for the processing industry and consumers, such as functional and sensory characteristics of the meat.
A menudo se utilizan sales alcalinas como polifosfato y bicarbonato de sodio en las soluciones de marinado. Estas tienen la capacidad de aumentar el pH y la capacidad de retención de agua de la carne para mejorar la estabilidad del color y darle más sabor y jugosidad a la carne (4,5). El cloruro de sodio actúa en la extracción y solubilización de las proteínas musculares, contribuyendo al aumento de la capacidad de retención de agua y a la reducción de la pérdida de peso por cocción y mejora la calidad y la textura del producto (6,7). La literatura actual muestra el efecto sinérgico de polifosfato de sodio, el bicarbonato de sodio y el cloruro de sodio (4,8). Además de los beneficios obtenidos en las propiedades físicas de la carne, también puede ser una estrategia efectiva para reducir o eliminar aromas y sabores peculiares de la carne de cerdo. Puesto que la calidad de la carne es determinada por una combinación de factores, la elección de las soluciones de marinado es claramente una tarea multicriterial que implica diversos aspectos relacionados con beneficios para la industria y los consumidores, como las características funcionales y sensoriales de la carne.
Multicriteria methods for decision making support aim to determine the relationship of preferences among alternatives which are being evaluated for a certain purpose (9,10). Amongst the possible mathematical solutions, the use of the Analytic Hierarchy Process (AHP) allows the option to manage the selected criteria within a level structure, considering of viable alternatives. It is also possible to classify them according to known parameters. The AHP has been applied in various scenarios where there are alternatives and the range of possible solutions can be arranged in a matrix (11-13). This approach allows combining quantitative and qualitative factors for decision making and allows the input of information from other research database (14).
Los métodos multicriterio para la toma de decisiones tienen como objetivo determinar la relación de preferencias entre las alternativas que están siendo evaluadas para un propósito determinado (9, 10). Entre las posibles soluciones matemáticas, el uso del Proceso Analítico Jerárquico (AHP) permite manejar los criterios seleccionados dentro de una estructura de nivel, considerando las alternativas viables. También es posible clasificarlos de acuerdo con parámetros conocidos. El AHP ha sido aplicado en varios escenarios donde existen alternativas y la gama de posibles soluciones puede organizarse en una matriz (11-13). Este enfoque permite combinar factores cualitativos y cuantitativos para la toma de decisiones y permite incluir información de otra base de datos de investigación (14).
The objective of this study was to choose the best marination blend for pork using the Analytic Hierarchy Process (AHP).
El objetivo de este estudio fue a elegir la mejor solución de marinado para la carne de cerdo mediante el Proceso Analítico Jerárquico (AHP).
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MATERIAL AND METHODS
MATERIALES Y MÉTODOS
Sample collection. Meat samples (Longissimus’ dorsi muscle) were obtained from 115 kg male swine from the same genetic strain, which were subjected to the same pre-slaughter and slaughter handling, at a large commercial slaughterhouse (2300 heads/day) after 24 h of carcass chilling. Samples were adequately transported to the Federal University of Grande Dourados (UFGD) at Dourados, MS, Brazil where the remainder of the study was carried out.
Toma de muestras. Se obtuvieron muestras de carne (músculo Longissimus dorsi) a partir de un cerdo macho de 115 kg de la misma cepa genética, el cual fue sometido al mismo tratamiento de sacrificio, en un beneficiadero comercial grande (2.300 cabezas/día) después de haber estado en refrigeración por 24 h. Las muestras fueron transportadas adecuadamente a la Universidad Federal de Grande Dourados (UFGD) en Dourados, MS, Brasil, donde se llevó a cabo el resto del estudio.
Treatments and experimental design. The samples (n=40) were distributed in a randomized design, in four treatments: C, control without marination; M1, sodium bicarbonate (Na2CO3) and sodium chloride (NaCl) solution; M2, sodium tripolyphosphate (Na5P3O10) and sodium chloride (NaCl) solution, and M3, sodium bicarbonate (Na2CO3), sodium tripolyphosphate (Na5P3O10) and sodium chloride (NaCl) solution. Ten replicates per treatment were used. The solutions were prepared in order to achieve 9.09% of the salt solution on the final product considering the injection of the approximately 10% of the sample weight (Table 1). Table 1. Salt solution percentage composition and pH used in the marination of Normal and PSE pork meat. Ingredient Meat Water NaCl Na2CO3 Na5P3O10 Total pH of the solution
TM1 90.91 8.31 0.60 0.18 * 100.00 8.02
Addition of salt (%) TM2 TM3 90.91 90.91 8.19 8.19 0.60 0.42 * 0.18 0.30 0.30 100.00 100.00 10.34 8.97
Process of marination. The marination process took place at a controlled environment with ambient temperature at 13°C. Samples were weighed and then the solution was injected uniformly throughout of the sample using manual injector with a needle. After the injection of the salt solutions, the samples were weighed, individually packed in plastic bags, and stored under refrigeration at 4°C for 24 h to equilibrate the solutions. Samples were removed from storage and reweighed to determine purge loss. Physical and sensorial analysis. Fo r determining the weight loss by cooking, the samples were baked in an electric oven at 300°C for 16 minutes, eight minutes on each side, reaching an internal temperature of 80°C, and checked using a calibrated hand‑held digital thermometer. After baking were cooled to room temperature for one hour and the
Tratamientos y diseño experimental. Las muestras (n=40) se distribuyeron en un diseño aleatorizado en cuatro tratamientos: C, control sin marinado; M1, solución de bicarbonato de sodio (Na2CO3) y de cloruro de sodio (NaCl); M2, solución de tripolifosfato de sodio (Na5P3O10) y de cloruro de sodio (NaCl); y M3, solución de bicarbonato de sodio (Na2CO3), tripolifosfato de sodio (Na5P3O10) y de cloruro de sodio (NaCl). Se utilizaron diez repeticiones por tratamiento. Las soluciones fueron preparadas para lograr una solución salina al 9,09% en el producto final, teniendo en cuenta la inyección de aproximadamente el 10% del peso de la muestra (Tabla 1). Proceso de marinado. El proceso de marinado fue llevado a cabo en un ambiente controlado a temperatura ambiente y a 13°C. Las muestras se pesaron y la solución fue inyectada uniformemente en toda la muestra utilizando un inyector manual con una aguja. Las muestras fueron pesadas después de haber inyectado las soluciones salinas y fueron envasadas individualmente en bolsas de plástico y refrigeradas a 4°C por 24 h para equilibrar las soluciones. Las muestras fueron retiradas de la nevera y pesadas nuevamente para determinar la pérdida de peso. Análisis físico y sensorial. Para la determinación de la pérdida de peso por cocción, las muestras fueron dispuestas en un horno a 300°C durante 16 minutos, ocho minutos por cada lado, alcanzando una temperatura interna de 80°C que fue verificada utilizando una termómetro digital calibrado. Después de ser horneadas se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante una hora y se retiró la humedad superficial con un papel absorbente para ser pesadas otra vez. La pérdida de peso porcentual por cocción fue determinada a partir de la diferencia entre el peso inicial y el peso final. Se evaluó la tinción de las muestras antes y después del marinado, al estar expuestas al ambiente durante 30 minutos y a una oxigenación del mismo orden. Para determinar la fuerza de corte, era utilizar las muestras fueron preparadas según lo descrito en la pérdida de peso por cocción,
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surface moisture removal with absorbent paper, and reweighed. The percentage weight loss by cooking was determined by the difference between the initial weight and final weight. The samples were evaluated for staining before and after marination, for being so exposed to air for 30 minutes, oxygenation of the same order. To determine the shear force, was used the samples prepared as described under weight loss by cooking, of which six were removed cylinders 13 mm in diameter in the direction parallel to the muscular fibers with the aid of a punch. The shear force of the meat was measured using a texturometer (TA.XT2i, Stable Micro Systems), with a Warner-Bratzler blade. The shear force was determined directly from the force curves as a function of deformation, with the use of the “Texture Expert” V.1.15 (SMS) and calculated as the average of the measurements, is expressed in kgf. The objective evaluation of color was carried out with the Minolta spectrocolorimeter surface (model Minolta ® CR 410, SCI setting, D65 illuminant and 10° viewing angle) using the scale L* (brightness), a* (redness) and b* (level of yellowness) CIELab system. The measurements were performed at three different points on the sample surface, taking the average as the value determined. The sensory evaluations were performed using a panel of seven trained panelists who evaluated the samples for tenderness, flavor and juiciness based on a scale of nine points (1=extremely dry, tough or intensely off-flavored; and (9=extremely moist, tender or no off-flavor), and using the methodology adopted by Santos (8). Data were analyzed using Tukey test and Kruskal Wallis test at 95% significance and processed using the software SAS 9.2 (2000) applying the GLM (General Linear Model) procedure. Analytic Hierarchy Process. The analytic hierarchy process (AHP) involved four stages: (A) Structuring the selection of the appropriate marination solution: identifying and structuring the objective of selecting the proper marination solution required careful literature review which provided the basis for quantitative modeling. The challenge consisted in identifying the attributes considered relevant by the pork processing industry and consumers. The objective hierarchies were built attending this classification (15). In order to establish the hierarchy the attributes were selected by three experts in this field of knowledge, and they were based on the quality criteria which were considered valuable by the meat industry and consumers. (B) Identification of alternative options: The marination alternatives
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de las cuales se retiraron seis cilindros de 13 mm de diámetro en una dirección paralela a las fibras musculares con ayuda de un perforador. La fuerza de corte de la carne se midió mediante un texturómetro (TA.XT2i, Stable Micro Systems), con una cuchilla Warner-Bratzler. La fuerza de corte fue determinada directamente a partir de las curvas de fuerza en función de la deformación, con el uso de la herramienta “Texture Expert” V.1.15 (SMS) y fue calculada como el promedio de las mediciones y expresada en kgf. La evaluación objetiva del color se realizó con un espectrocolorimétro Minolta (modelo Minolta® CR 410, ajuste de SCI, iluminación D65 y ángulo de visión de 10°) usando la escala del sistema CIELab L* (brillo), a* (nivel de rojo) y b* (nivel de amarillo). Se hicieron mediciones en tres puntos diferentes sobre la superficie de la muestra, tomando el promedio como el valor determinado. Las evaluaciones sensoriales se realizaron usando un panel de siete panelistas entrenados quienes evaluaron la terneza, sabor y jugosidad de las muestras en base a una escala de nueve puntos (1=extremadamente seca, dura o con mal sabor; y 9=extremadamente húmeda, tierna o sin mal sabor) y utilizando la metodología adoptada por Santos (8). Los datos fueron analizados utilizando la prueba de Tukey y la prueba de Kruskal Wallis con un nivel de significancia del 95% y fueron procesados mediante el software SAS 9.2 (2000) aplicando el procedimiento GLM (Modelo Lineal General). Proceso Analítico Jerárquico. El proceso analítico jerárquico (AHP) consta de cuatro etapas: (A) La estructuración de la selección de la solución apropiada de marinado: identificar y estructurar el objetivo de seleccionar la solución de marinado más adecuada necesaria a partir de una revisión cuidadosa de la literatura que proporcione la base para el modelo cuantitativo. El desafío consistía en identificar los atributos considerados como relevantes por la industria y los consumidores de cerdo. Se construyeron jerarquías objetivas de acuerdo con esta clasificación (15). Con el fin de establecer la jerarquía, los atributos fueron seleccionados por tres expertos en este campo del conocimiento, y ellos se basaron en los criterios de calidad considerados como valiosos por la industria y los consumidores de carne. (B) Identificación de opciones alternativas: Las alternativas de marinado fueron seleccionadas inicialmente en base a la literatura actual (3-5). (C) Identificación de los criterios de selección aplicados: La selección de los criterios se basó en los resultados de este experimento y en información adicional en base también la literatura actual (4,3, 6). El esquema del sistema AHP fue diseñado utilizando tres niveles
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were initially selected based on current literature (3-5). (C) Identifying the applied selection criteria: The selection of the criteria was based on the results of the present experiment and additional information was chosen based also on current literature (4,3,16). The scheme of the AHP system was designed using three distinct levels (Figure 1). (D) Developing the weighting scheme and ranking the options: The purpose of the AHP is to provide a vector of weights expressing the relative importance of those layout alternatives for each chosen criterion. The scale of importance was defined according to the methodology adopted by Caldara et al (13) using the 1-9 scale for pairwise comparison (Table 2). A pairwise comparison matrix is formed in the application of the AHP system, in which rows and columns are assigned to the components belonging to the same related component in the decision hierarchy. The weight of component i compared to component j with regard to the corresponding component is determined using scale (Table 2) and assigned to the (i, j) th position of the pairwise comparison matrix (9), chosen to support comparisons within a limited range, but with sufficient sensitivity. The reciprocal of the assigned number is assigned to the (j, i) th position. Once the pairwise comparison matrix is formed, weights of components are calculated by solving for the eigenvector of the pairwise comparison matrix. The consistency is obtained by setting (nji= 1/nij). Therefore, the comparison needs to be repeated for each column of the matrix, i.e. independent judgments must be made over each pair. The matrix is consistent if and only if (λmax = n). Considering that the inequality (λmax > n) always exists, the average of the remaining eigenvalues can be used as a “consistency index” (CI= (λmax – n)/(n – 1)), which is the difference
distintos (Figura 1). (D) Desarrollo del esquema de ponderación y clasificación de las opciones: El propósito del AHP es proporcionar un vector de pesos que exprese la importancia relativa de las alternativas de diseño para cada criterio elegido. La escala de importancia fue definida de acuerdo con la metodología adoptada por Caldara et al (13) usando una escala de 1 a 9 para la comparación de pares (Tabla 2). Se construyó una matriz de comparación de pares en la aplicación del sistema AHP, en la cual se asignan filas y columnas a los componentes pertenecientes al mismo componente relacionado en la jerarquía de la decisión. El peso del componente i en comparación con el componente j en relación con el componente correspondiente se determina mediante la escala (Tabla 2) y es asignado a la posición (i, j) de la matriz de comparación de pares (9) que ha sido elegida para justificar las comparaciones dentro de un rango limitado, pero con una sensibilidad suficiente. El valor recíproco del número asignado se asigna a la posición (j, i). Una vez se ha construido la matriz de comparación de pares, los pesos de los componentes son calculados buscando una solución para el vector propio de la matriz de comparación de pares. La consistencia se obtiene estableciendo la relación (nji=1/nij). Por lo tanto, la comparación debe repetirse para cada columna de la matriz, es decir, deben hacerse juicios independientes para cada par. La matriz es consistente si y sólo si ((λmax = n). Teniendo en cuenta que la desigualdad (λmax > n) existe siempre, el promedio de los valores propios restantes puede ser utilizado como un “índice de consistencia” (CI= (λmax – n)/(n – 1)), el cual es la diferencia entre (λmax) y n dividido por el factor de normalización (n - 1). El índice de consistencia de la selección del mejor proceso de marinado se comparó con el índice de consistencia aleatorio promedio (RI) que fue obtenido a partir de las Table 2. Adopted scale of importance. Intensity of importance
Equal importance
3
Moderate importance
5
Strong importance
7
Very strong or demonstrated importance
9
Extreme importance
2, 4, 6, 8
Intermediate values
Reciprocals of above
Figure 1. Scheme of the chosen criteria for selecting the most appropriate marination solution for pork and the four alternatives tested experimentally.
Definition
1
If factor i has one of the above numbers assigned to it when compared to factor j, then j has the reciprocal value when compared with i
Adapted from Caldara et al (13).
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between (λmax) and n divided by the normalizing factor (n – 1). The consistency index of the selection of the best marination process was compared with the average random consistency index (RI) which was obtained from associated random matrices of order n to compute the error due to inconsistency (9). A consistency ratio (CR= CI/RI) correlating the consistency index and a random consistency index (RI) value lower than 10% was adopted, in order to maintain the matrix consistent. The important component of this decision theory is the preference that is associated with a utility function. In this decision making process, both preferences and uncertainty were merged into a unified and analytical framework, which were related to the data from the experimental procedure.
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matrices aleatorias asociadas de orden n para calcular el error debido a la inconsistencia (9). Se adoptó una relación de consistencia (CR= CI/RI) que correlacionará el índice de consistencia y un valor del índice de consistencia aleatorio (RI) inferior al 10%, con el fin de mantener la consistencia de la matriz. El componente más importante de esta teoría de la decisión es la preferencia que se asocia con una función de utilidad. En este proceso de toma de decisiones, tanto las preferencias y la incertidumbre se fusionaron en un marco unificado y analítico, que se relacionada con los datos del procedimiento experimental. Las resultados estadísticos de los niveles de significancia fueron utilizados como referencia para ser aplicados en las comparaciones de pares para los criterios que se muestra en la figura 1 y en la elección de alternativas. Se realizaron cálculos y análisis computacionales utilizando software web (15).
The results statistical levels of significance were used as reference for applying in the pairwise comparisons for the criteria shown in figure 1 and the choice of alternatives. Computational calculations and analysis was done using the web based software (15).
RESULTADOS El peso se refiere a la importancia de que un factor explícito haya sido considerado por los expertos y en los resultados del experimento. Los pesos globales confirman que las características físicas fueron más significativas (75.0%) en la selección del mejor marinado que las características sensoriales (25%) como se observa en la figura 2A.
RESULTS The weight is referred to the importance an explicit factor was considered by the experts and results from the experiment. Global weights confirm that physical characteristics were more significant (75.0%) in selecting the best marination then sensorial characteristics (25%) as seen in figure 2A.
Los subcriterios que fueron determinantes en los resultados finales para cada característica fueron la pérdida de exudado (27.3%) seguido por la pérdida de peso por cocción (18.1%) y la retención de la solución salina (13.9%).
Within the sub-criteria for each characteristic those, which were determinant in the final results, were the exudates loss (27.3%) followed by the cooking loss (18.1%) and the salt solution retention (13.9%).
Se encontró que el mejor marinado correspondía a una solución que mezcla las tres sales Na2CO3+NaCl+Na5P3O10 (43.3%), seguida de Na2CO3 + NaCl (25%) y Na5P3O10 + NaCl (21.8%). El grupo de control representó el peor resultado (9.9%) como se muestra en la figura 2B. Las
The best marination was found as the solution that mix up the three salts Na2CO3+NaCl+Na5P3O10 A
B
Figure 2. A. Local weight is the result when the sub-criteria are compared between themselves in a pairwise manner. Global weight is the local weight multiplied by the corresponding weight of the higher level criterion. B. Overall AHP score results of the marination solutions aiming at improvement the pork quality.
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(43.3%), followed by Na2CO3+NaCl (25%), and Na5P3O10+NaCl (21.8). The control was the worst result (9.9%) as shown in figure 2B. The physical characteristics (pH, retention of the solution, weight loss, cooking weight loss and shear force) were the most significant criteria in the second level (74.9%). Although the sensory attributes presented lower weight in deciding the best solution of the marination, it was observed that these attributes were somewhat higher in the marinated meat (>23%) compared to control, whose participation was only 16%. This was expected since the samples of the control treatment received no injection solution, while the others were injected with solutions containing ingredients considered flavors. Comparing the samples without the marinated meat marinated meat samples, it was observed that the characteristics were improved by the application of treatments figure 3, A-D. Compared with the control, the marination solutions M1, M2, M3 shown to be effective in improving the physical characteristics and the color characteristics of pork.
DISCUSSION The marination of the meat with alkaline solutions, obtained by means of phosphate and sodium bicarbonate, reduces the loss of the water content by increasing the water binding and retention of the natural juice (8,17). The reduction in the cooking loss may be partly explained by water-protein chemical interaction that occurring in the marination process. This interaction is due to the attraction of the charges, which are affected by the pH of the brine. During the meat cooking process it occurred the fixing of water through of the solidification of the gel protein where the water content and absorbed are retained. The salts and phosphates used in marination act on the muscle fiber de-polymerized the myosin filaments and facilitating the segregation of the complex act-myosin, increasing the dissolved protein (17,18). Moreover, sequester the metal ions negatively charged, leaving the positive charges available for binding the water molecule, thereby promoting the increased of the capacity of the meat to retain water (7,17,18). The marination with a solution of the sodium chloride and tripolyphosphate improves the texture of the fibers of the meat, making it the softest (5). In general, the most obvious mechanisms in reducing of the shear force after application of
características físicas (pH, retención de la solución, pérdida de peso, fuerza de corte y pérdida de peso por cocción) fueron los criterios más significativos en el segundo nivel (74.9%). Aunque los atributos sensoriales presentan un menor peso para tomar una decisión en cuanto a la mejor solución de marinado, se observó que estos atributos eran un poco más altos en la carne marinada (>23%) en comparación con el grupo de control, cuya participación fue únicamente del 16%. Esto no era inesperado puesto que las muestras del tratamiento de control no recibieron ninguna solución inyectable, mientras que las demás fueron inyectadas con soluciones con ingredientes saborizantes. Al comparar las muestras de carne marinadas y sin marinar, se observó que las características mejoraron debido a la aplicación de los tratamientos, figura 3, A-D. En comparación con el grupo de control, las soluciones de marinado M1, M2, M3 demostraron ser efectivas en mejorar las características físicas y las características de color de la carne de cerdo.
DISCUSIÓN El marinado de la carne con soluciones alcalinas obtenidas por medio de fosfato y bicarbonato de sodio, reduce la pérdida del contenido en agua mediante el aumento de la capacidad higroscópica y de retención de agua del zumo natural (8,17). La reducción de la pérdida de peso por cocción puede explicase en parte por la interacción química del agua y las proteínas que puede producirse en el proceso de marinado. Esta interacción es causada por la atracción de las cargas que son afectadas por el pH de la salmuera. El agua fue fijada durante el proceso de cocción de la carne a través de la solidificación de la proteína en gel donde se retiene el contenido de agua absorbida. Las sales y los fosfatos utilizados en el marinado actúan sobre las fibras musculares polimerizando los filamentos de miosina y facilitando la segregación del complejo actomiosina, incrementando las proteínas disueltas (17,18). Por otra parte, se secuestraron los iones metálicos con carga negativa dejando las cargas positivas disponibles para atar la molécula de agua, promoviendo así el aumento de la capacidad de la carne para retener agua (7,17,18). El marinado con una solución de cloruro de sodio y tripolifosfato mejora la textura de las fibras de la carne, haciéndola más suave (5). En general, los mecanismos más obvios para reducir la fuerza de corte después de la aplicación de soluciones salinas son el hinchamiento y relajación de las fibras musculares. Este edema es potenciado por el uso
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Figure 3. Comparison of marination solutions evaluated, taking into consideration the improvement of physical and sensory attributes of pork. (Na5P3O10 – sodium tripoliphosphate, NaCl – sodium chloride and Na2CO3 – sodium bicarbonate).
the salt solutions are both swollen and relaxation of the muscle fibers. This edema is potentiated by the use of alkaline brine, obtained from the use of phosphoric salts, bicarbonates, sodium chloride (19) and particularly the association between them (4,6,20). The sodium chloride present in the solution also plays an decisive role in the meat tenderness by acting on the extraction and solubilization of the muscle proteins and emulsification of the fats, contributing to the increased of the water-
de la salmuera alcalina, obtenida a partir del uso de sales fosfóricas, bicarbonatos, cloruro de sodio (19) y particularmente la asociación entre las mismas (4,6,20). El cloruro de sodio presente en la solución también desempeña un papel decisivo en la terneza de la carne por medio de la extracción y la solubilización de las proteínas musculares y la emulsificación de las grasas, contribuyendo al aumento de la capacidad de retención de agua, mejorando la terneza y la textura de la carne (7, 21). Este efecto mejora las
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holding capacity, improving the tenderness and texture of the meat (7, 21). This effect enhances the meat characteristics promoted by the action of sodium chloride was also observed by the authors (22) when working with acid solution. The weakening of the myofibril by the action of sodium bicarbonate is not well understood although, it is clear that the reduction in shear force has been similar to that achieved with sodium chloride and phosphate. Since the waterholding capacity directly influences the sensory characteristics of the meat, the flavor, juiciness and tenderness were significantly improved with the marination process (8). The softness can be attributed to a combination of the higher water content and the muscle structure weakened by the action of the salts. The juiciness of the marinated pork loins can be explained partly due to the reduction of and cooking loss, promoted by alkaline salt solution. When the alkaline salts were used alone M1 and M2 it showed a similar effect on the improvement of most characteristics evaluated, except that of the solution M1, which promoted the less shear force of the meat, while the solution M2 provided better tenderness, as evaluated by the panel sensory figure 3B. As it was assigned higher weights to the physical than to the sensorial characteristics, the solution M1 can be considered better figure 2. With the exception of pH, retention of the solution and color (L*, a*, b*), all parameters were improved by the association of the salts M3 when compared to their use individually figures 3C and 3D. It was proven in this way, positive synergy effect between the salts, greatly improving the quality characteristics of pork, supported by studies of (4). The multicriterial analysis using AHP provided a comprehensive view of the results that were found statistically in a compartmentalized manner. When the criterion were separately analyzed, it becomes more difficult to decide on the best alternative, whether the results are somewhat different among the different criterion. Thus, with assigned weights according to their relative importance, in view of the processing industries and consumers, it was possible to determine in a global context which was the best amongst the tested alternatives. In conclusions the multicriteria analysis was able to reveal the most suitable choice for the marination of the pork, given all the criteria involved in the selection process. The analysis indicates that use of the alkaline salts in combination is the best way to improve the physical and sensory characteristics of the meat.
características de la carne acentuado por la acción del cloruro de sodio, lo que también fue observado por los autores (22) cuando trabajaron con la solución ácida. El debilitamiento de las miofibrillas por la acción del bicarbonato de sodio no es entendido completamente, aunque es evidente que la reducción en la fuerza de corte ha sido similar a la alcanzada con el fosfato y cloruro de sodio. Puesto que la capacidad de retención de agua influye directamente en las características organolépticas de la carne, el sabor, la jugosidad y la terneza mejoraron significativamente con el proceso de marinado (8). La suavidad puede atribuirse a una combinación de un mayor contenido de agua y a la estructura muscular debilitada por la acción de las sales. La jugosidad de la carne de cerdo marinada puede explicarse en parte debido a la reducción y pérdida de peso por cocción, promovida por la solución de sales alcalinas. Cuando las sales alcalinas M1 y M2 fueron utilizadas se demostró un efecto similar en la mejora de la mayoría de las características evaluadas, excepto la de la solución M1, que tuvo como resultado una menor fuerza de corte de la carne, mientras que la solución M2 produjo la mejor terneza, según lo evaluado por el panel sensorial en la figura 3B. Ya que se asignaron pesos mayores a las características físicas en comparación con las características sensoriales, la solución M1 puede considerarse como mejor, figura 2. Con la excepción del pH, la retención de la solución y del color (L*, a*, b*), hubo una mejoría en todos los parámetros por la asociación de las sales M3 en comparación con su uso individual, figuras 3C y 3D. De esta manera se ha demostrado el efecto de sinergia positiva entre las sales, mejorando notablemente las características de calidad de la carne de cerdo, en base a los estudios realizados (4). El análisis multicriterial realizado utilizando AHP brindó una visión global de los resultados que se encontraron estadísticamente de forma compartimentada. Cuando los criterios fueron analizados por separado, se hizo más difícil decidir cuál es la mejor alternativa, ya que los resultados son un poco diferentes entre los diferentes criterios. Por lo tanto, con los pesos asignados según su importancia relativa de acuerdo con la industria y los consumidores, fue posible determinar cuál fue la mejor de las alternativas probadas en un contexto global. En las conclusiones del análisis multicriterio se reveló la opción más adecuada para el marinado de la carne de cerdo, en vista de todos los criterios involucrados en el proceso de selección. El análisis indica que el uso de una combinación de sales alcalinas es la mejor manera de mejorar las características físicas y sensoriales de la carne.
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4406-4414, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL
Use of ground and extruded canola seeds in feed for 15-30 kg piglets Uso de la semilla de canola molida y extrusada en la alimentación de lechones de 15-30 kg Carina Scherer,1 Ph.D, Antonio Furlan,2 Ph.D, Ivan Moreira,2 Ph.D, Angela Poveda P,3* Ph.D, Paulo Carvalho,1 Ph.D, Juliana Toledo,2 Ph.D. Universidade Estadual do Oeste do Paraná. Departamento de Zootecnia. Marechal Cândido Rondon, Paraná, Brasil CEP: 85960-000 2Universidade Estadual de Maringá. Departamento de Zootecnia. Av. Colombo,5790, Maringá–Paraná, Brasil, CEP: 87020-900. 3Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Zootecnia,Rodovia Celso Garcia Cid PR 445 Km 380, Londrina-Paraná, Brasil. CEP 86057-970. Correspondencia: angelpov@gmail.com. 1
Received: April 2014; Accepted: November 2014.
ABSTRACT Objective. Determine the nutritional values of ground (SCI) or extruded (SCE) canola seed and evaluate its use in the performance of piglets from 15 to 30 kg. Materials and methods. Two experimental diets with canola seed were evaluated in a digestibility trial. We used 15 barrows with an initial weight of 19.79±1.43kg, distributed in a completely randomized design. In the performance, four experimental diets were evaluated consisting of a diet with soybean oil added (RAS), one with the of addition of canola oil (RAC) and two oil-free; one with 11% SCI included and one with 6% SCE (RSCE) included. 40 commercial hybrid piglets were used that had 15.25±1.5kg initial body weight, randomly distributed, in four treatments and five replicates; two animals per experimental unit. Results. The digestible energy values for SCI and SCE were 4.197 kcal/kg and 5.234 kcal/kg, respectively. The extrusion process improved the digestibility coefficients. Piglets fed with RSCI showed less daily weight gain (DWG) and F:G ratio. Conclusion. Results suggest that SCE can be included in diets of piglets from 15 to 30 kg until 6% without negatively affecting performance. Key words: Animal performance, anti-nutritional factors, digestibility, economic viability (Source: AGROVOC).
RESUMEN Objetivo. Determinar los valores nutricionales de las semillas de canola integral molida (SCI) y extrusada (SCE) y evaluar su influencia sobre el desempeño de lechones de 15 a 30 kg. Material y métodos. Se evaluaron dos dietas experimentales con semilla de canola en un ensayo de digestibilidad. Fueron utilizados 15 lechones machos, castrados, con peso inicial de 19.79±1.43kg, distribuidos en un diseño completamente al azar. En el desempeño se evaluaron cuatro dietas experimentales que consistieron de una dieta con adición de aceite de soya (RAS), una con adición de aceite de canola (RAC) y otras dos exentas de aceite; siendo una con la inclusión de 11% de SCI (RSCI) y otra con la inclusión de 6% de SCE (RSCE). Fueron utilizados 40 lechones híbridos comerciales, con peso vivo medio inicial de 15.25±1.5kg, distribuidos en un diseño experimental completamente al azar, con cuatro tratamientos, cinco repeticiones; siendo dos animales por unidad experimental. Resultados. Los valores de energía digestible para SCI y SCE en base seca fueron de 4.197 kcal/kg y 5.234 kcal/ 4406
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kg, respectivamente. El proceso de extrusión mejoró los coeficientes de digestibilidad. Los lechones alimentados con RSCI presentaron menor ganancia de peso (GPD) y peor conversión alimentaria (CA). Conclusiones. Los resultados indicaron que la SCE puede ser incluida en la dieta de lechones de 15 a 30 kg, hasta un nivel de 6% sin afectar el desempeño. Palabras clave: Desempeño animal, digestibilidad, factores antinutricionales, viabilidad económica (Fuente: AGROVOC).
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Soy flour is the protein source most commonly used in pork production due to its high quality; however, the high cost of this feed has generated the search for alternative sources that reduce diet costs.
La harina de soya es la fuente de proteína más utilizada en la producción porcina por ser un producto de alta calidad; sin embargo, el alto costo de este alimento ha generado la búsqueda de fuentes alternativas que reduzcan los costos de las dietas.
Canola is a variety of colza and is considered an option to substitute soy flour. It was genetically developed from colza (Brassica napus), which has a low glucosinolate content (≤3 µg/g) and the oil has less than 2% erucic acid (1). In spite of the fact that canola seed is not commonly used in animal diets, investigations have shown that this product has high amounts of protein, which allows its use as a soy flour substitute (2). The chemical composition of canola can vary according to the genetic variety and environmental factors; however, the seed is considered to possess 23% raw protein and approximately 5.475 kcal/kg of raw energy, and the amino acid profile is compares favorably to that of soy flour (3). Whole canola seed contains from 36 to 40% excellent quality oil with less than 60 monounsaturated fatty acids and less than 7% saturated acids (4), which constitutes a source of energy that reduces the need to add oil to the diet. The diet given to piglets should be digestible and have a high concentration of nutrients; feed should therefore undergo different processes that improve the quality of the diet (5). Among the production processes that determine the diet’s physical form are flour, pelletizing and extrusion (6). Few studies have been done on the nutritional evaluation of extruded canola seed in pigs. However, results up to now have demonstrated that using canola flour and other feed in extruded or pelletized form can be used to the partially substitute soy flour. Ahmed et al (7) determined the actual and apparent digestibility of extruded canola flour and concluded that extrusion improves apparent digestibility of raw protein, amino acids, raw energy and energy that can be metabolized. Therefore, Mariscal et al (8)
La canola es una variedad de la colza y es considerada una opción para la sustitución de la harina de soya. Fue desarrollada genéticamente a partir de la colza (Brassica napus), que posee bajo contenido de glucosinolatos (≤3 µg/g) y menos de 2% de ácido erúcico en el aceite (1). A pesar de la semilla de canola no ser usada comúnmente en la dieta de animales, investigaciones han demostrado que este producto posee un alto valor proteico, lo cual permite su uso en sustitución de la harina de soya (2). La composición química de la canola puede variar de acuerdo con la variedad genética y a factores ambientales; sin embargo, se considera que la semilla posee 23% de proteína cruda y aproximadamente 5.475 kcal/kg de energía cruda, el perfil de aminoácidos es comparado favorablemente con el de la harina de soya (3). La semilla de canola integral posee entre 36 a 40% de aceite de excelente calidad, con más de 60 ácidos grasos monoinsaturados y menos de 7% de saturados (4), lo que la constituye en una fuente de energía que disminuye la necesidad de adicionar aceite a las dietas. La dieta ofrecida a los lechones debe ser digestible y con una alta concentración de nutrientes, para esto, los alimentos pueden ser sometidos a diferentes procesos los cuales mejoran la calidad de la dieta (5). Entre los procesos de fabricación que determinan la forma física de la dieta se encuentran la harina, la peletización y la extrusión (6) Pocos trabajos han sido realizados sobre la evaluación nutritiva de la semilla de canola extrusada en cerdos. Sin embargo, los resultados hasta ahora han demostrado que la utilización de la harina de canola y de otros alimentos
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determined the real, apparent and standardized digestibility coefficients in protein and amino acids of pelletized canola cake in recently weaned piglets. They concluded that the pelletizing process improves real digestibility of protein and amino acids. The objective of this study was to determine the nutritional value of ground or extruded canola seeds and evaluate their use in diets for piglets in the initial phase (15 to 30 kg).
MATERIALS AND METHODS Study site. The experiments were done in the Pork Breeding Sector of the Iguatemi Experimental Farm of the Universidad Estadual de Maringá (Paraná-Brazil), located at coordinates 23°21’S, 52°04’W, and at 564 meters above sea level. Characterization of the feed. The variety of canola (Brassica napus) used was Hyola 401, donated by the Cooperativa de Caficultores y Agropecuaristas de Maringá (COCAMAR- ParanáBrazil). The canola seed was ground in a 2 mm sieve, one part was added to the diet in ground form and the other underwent an extrusion process using an Imbra 120 extruder from Imbramac, with 120 kg/hour capacity and an interior barrel temperature of 118°C and pressure at 1 to 2 atm. Type of study. Experiment 1: Digestibility assay where ground canola seed (GCS) and extruded canola seed (ECS) were evaluated. Experiment 2: Determining productive parameters by evaluating four diets with 11% RSCI, 6% RSCE and two diets that include canola and soy oils. Animals. Experiment 1: 15 barrows were used, commercial hybrids with an initial weight of 19.79±1.43, individually kept in metabolism cages. The experimental period lasted 10 days (five days of adaption to the cages and diets and five days of feces collection). Experiment 2: 40 hybrid commercial piglets were used (20 males and 20 females) with an initial weight of 15.25±1.50. The animals were held in cages suspended with plastic flooring and a front-feeding trough and nipple-type drinking dispenser. Experiment design. Experiment 1: Completely random design with three treatments, five repetitions, with each experimental unit consisting of one piglet. Experiment 2: Completely random experimental design with four treatments, five repetitions and two animals per cage.
en forma extrusada o peletizada pueden ser utilizados en la sustitución parcial de la harina de soya. Ahmed et al (7) determinaron la digestibilidad real y aparente de la harina de canola extrusada y concluyeron que la extrusión mejora la digestibilidad aparente de la proteína cruda, aminoácidos, energía bruta y energía metabolizable, entre tanto, Mariscal et al (8) determinaron los coeficientes de digestibilidad real aparente y estandarizada de la proteína y aminoácidos de la torta de canola peletizada en lechones recién destetados. Ellos concluyeron que el proceso de peletización mejora la digestibilidad real de la proteína y de los aminoácidos. El objetivo del presente trabajo fue determinar el valor nutritivo de la semilla de canola molida o extrusada y evaluar su utilización en dietas para lechones en fase inicial (15 a 30 kg).
MATERIAL Y MÉTODOS Sitio del estudio. Los experimentos se realizaron en el Sector de Porcicultura de la Hacienda Experimental de Iguatemi de la Universidad Estadual de Maringá (Paraná-Brasil), localizado en las coordenadas 23°21’S, 52°04’W, y con una altitud de 564 msnm. Caracterización del alimento. La variedad de la canola (Brassica napus) utilizada fue la Hyola 401, donada por la Cooperativa de Caficultores y Agropecuaristas de Maringá (COCAMAR- ParanáBrasil). La semilla de canola fue molida en criba de 2 mm, una parte fue adicionada a la dieta en la forma molida y la otra fue sometida al proceso de extrusión utilizando una extrusora Imbra 120 de la empresa Imbramac, con capacidad para 120 kg/hora, con temperatura en el interior del cañón de 118°C y presión de 1 a 2 atm. Tipo de estudio. Experimento 1: Ensayo de digestibilidad donde se evaluó la semilla de canola integral molida (SCI) y extrusada (SCE). Experimento 2: Determinación de parámetros productivos evaluando cuatro dietas con 11% de RSCI, 6% de RSCE y dos dietas con inclusión de aceite de canola y soya. Animales. Experimento 1: Fueron utilizados 15 lechones machos castrados, híbridos comerciales con peso inicial de 19.79±1.43, alojados individualmente en jaulas de metabolismo. El periodo experimental tuvo duración de 10 días (cinco días de adaptación a las jaulas y a las dietas y cinco días de colecta de heces). Experimento 2: Fueron utilizados 40 lechones híbridos comerciales (20 machos y 20 hembras)
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Treatments. Experiment 1: A control diet (CD) of corn and soy flour calculated to meet the requirements of the initial phase and according to the chemical composition and energy values of ingredients found in Brazilian tables for birds and pigs (9), GCS and ECS substituted in dry base, 20% of the CD, resulting in two experimental diets. Experiment 2: The experimental treatments consisted of four diets, one with a corn base and soy cake with soy oil added (DAS), another one of corn base and soy cake with the addition of canola oil (DAC) and anther two without oil and 11% inclusion of ground canola seeds (GCS) and other with 6% inclusion of ground extruded canola seed (GECS). Diets were formulated according to the recommendations given by Rostagno et al (9), these being isoenergetic, isoprotein, isocalcitic and isophosphoric (Table 1). Diets and water were available during the whole experiment. Chemical and energy composition values were used as set out by Rostagno et al (9) with the exception of energy values of the canola seeds whose values were determined in the digestibility experiment previously described.
Table 1. Centesimal and nutritional composition of experimental diets. Ingredients DAS DAC DSCI Corn 64.58 64.58 60.41 Ground entire canola seed 11.00 Extruded Canola Seed Soy oil 1.43 Canola oil 1.43 Soy flour 24.50 24.50 20.30 Wheat flour 6.00 6.00 5.00 Bicalcium phosphate 1.54 1.54 1.52 Calcarious 0.60 0.60 0.56 Vitamin-Mineral Supl. 0.50 0.50 0.50 Common salt 0.40 0.40 0.40 L-Lysine HCl 0.32 0.32 0.28 DL-Methionine 0.04 0.04 L-Threonine 0.08 0.08 0.02 BHT 0.01 0.01 0.01 Calculated Nutritional Composition Digestible Energy, kcal/kg 3.366 3.368 3.389 Raw protein, % 17.76 17.76 17.88 Calcium, % 0.699 0.699 0.705 Total phosphorus, % 0.629 0.629 0.643 Available phosphorus, % 0.400 0.400 0.402 Total Lysine, % 1.122 1.122 1.124 Total Met + Cis, % 0.618 0.618 0.632 Raw Fiber, % 3.022 3.022 3.287 Ether Extract, % 4.361 4.369 6.968
DSCE 62.09 6.00 21.50 7.00 1.52 0.60 0.50 0.40 0.31 0.02 0.05 0.01 3.394 17.87 0.709 0.646 0.404 1.122 0.627 3.274 5.032
Vitamin-mineral supplement. Content per kg of premix: Vit. A: 2,000,000 UI; Vit. D3: 400,000 UI; Vit. E: 5,000 UI; Vit. K3: 400 mg; Vit. B1: 400 mg; Vit. B2: 1200 mg; Vit. B6: 600 mg; Vit. B12: 6,000 mcg; Nicotinic Acid: 6,000 mg; Pantothenic Acid: 2,400 mg; Biotin: 20 mg; Folic Acid: 200 mg; Selenium: 60 mg; Colin: 30 g; Lysine: 234 g; Salinomycin: 10,000 mg; Antioxidant: 20 g; Iodine: 300 mg; Cobalt: 200 mg; Copper: 35,000 mg; Zinc: 20.000,0 mg; Iron: 20,000 mg; Magnesium: 8,000 mg; Vehicle q.s.p.: 1,000 g. DAS=Diet with soy oil; DAC= Diet with canola oil; DSCI= Diet with canola seed; DSCE= Diet with extruded canola seed.
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con peso inicial de 15.25±1.50. Los animales fueron alojados en jaulas suspensas con piso plástico y equipado con comedero frontal y bebedero tipo nipple. Diseño experimental. Experimento 1: El diseño fue completamente al azar con tres tratamientos, cinco repeticiones, siendo la unidad experimental constituida por un lechón. Experimento 2: El diseño experimental fue completamente al azar, con cuatro tratamientos, cinco repeticiones y dos animales por jaula. Tratamientos. Experimento 1: Una dieta control (DC) formulada a base de maíz y harina de soya, calculada para atender los requerimientos de la fase inicial y de acuerdo con la composición química y los valores energéticos de los ingredientes encontrados en las tablas brasileñas de aves y cerdos (9), la SCI y la SCE sustituyeron en base seca, 20% de la DC, resultando en dos dietas experimentales. Experimento 2: Los tratamientos experimentales consistían de cuatro dietas, una a base de maíz y torta de soya con adición de aceite de soya (DAS), otra a base de maíz y torta de soya con adición de aceite de canola (DAC), y otras dos exentas de aceite, con 11% de inclusión de semilla de canola integral molida (DSCI) y otra con 6% de inclusión de semilla de canola molida y extrusada (DSCE). Las dietas fueron formuladas de acuerdo con las recomendaciones de Rostagno et al (9), siendo isoenergéticas, isoprotéicas, isocalciticas e isofosfóricas (Tabla 1). Las dietas y el agua estuvieron disponibles durante todo el periodo experimental. Fueron utilizados los valores de composición química y energéticos de los alimentos propuestos por Rostagno et al (9), con excepción de los valores energéticos de las semillas de canola cuyos valores fueron determinados en el experimento de digestibilidad descrito anteriormente. Manejo nutricional. Experimento 1: Las dietas fueron ofrecidas en dos horarios, siendo 60% a las 08:00 horas y 40% a las 16:00 horas. La cantidad total de la dieta ofrecida diariamente fue establecida de acuerdo con el consumo diario de la dieta (CDD) de los animales durante la fase de adaptación, basado en el peso metabólico (kg0.75) de cada unidad experimental. El agua era ofrecida en el comedero, posterior al consumo de la dieta en una proporción de 3.0 mL/g de comida, calculada para cada unidad experimental, evitando un exceso de consumo de agua. Experimento 2: Los animales recibieron agua y alimento ad libitum durante todo el periodo experimental.
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Nutritional management. Experiment 1: Diets were offered on two schedules, 60% at 08:00 hours and 40% at 16:00 hours. The total quantity offered each day was established according to the animal’s daily consumption of the diet (DCD) during the adaption phase, based on metabolic weight (kg0.75) of each experimental unit. Water was offered in the trough after consuming the diet in a proportion of 3.0 mL/g of food, calculated for each experimental unit, avoiding an excess of water consumption. Experiment 2: The animals received water and feed ad libitum during the whole experiment. Methodology. Experiment 1: The total collection method was used and 2% iron oxide (Fe2O3) was used as a fecal marker to indicate the beginning and end of collection. The feces produced were collected once daily, stored in plastic bags and frozen at 18°C. At the end of the collection period the material was homogenized, dried in a forced ventilation stove (55ºC), and ground in a hammer type grinder with a 1 mm sieve for laboratory analysis. Experiment 2: At the end of the experiment, the animals were weighed and total consumption was calculated to determine the daily consumption of the diet (DCD), daily weight gain (DWG), and feed conversion (FC). At the beginning and end of the assay blood samples were collected via the anterior cava vein in tubes with heparin to determine nitrogen of the plasmatic urea (PUN). The samples were centrifuged (3,000 rpm for 15 minutes) to obtain plasma that was transferred to 1.5 mL micro tubes which were duly identified and stored in a freezer (-18°C) for later analysis. The PUN values were determined with the Uréia-PP® (Gold Analisa Diagnóstico) kit. The initial PUN results were used as a co-variable for the statistical analysis of the final PUN. Laboratory analysis. Experiment 1: Feed and feces analysis was done at the Animal Nutrition Laboratory of the Universidad Estadual de Maringá. EB values were determined by means of a calorimetric pump (Parr Instrument Co.). Data analysis. Experiment 1: The digestibility coefficients of dry material (CDMS), raw protein (CDPC), ether extract (CDEE), organic material (CDMO) and brute energy (CDEB) of the feed were calculated taking into account the total collection method according to Sakomura and Rostagno (10). The values of digestible dry material (MSD), digestible protein (DP), digestible ether extract (DEE) digestible organic material (DOM) and
Metodología. Experimento 1: Fue adoptado el método de colecta total, fue utilizado 2% de óxido de hierro (Fe2O3) como marcador fecal para indicar el inicio y el final de las colectas. Las heces producidas fueron colectadas una vez al día, almacenadas en bolsas plásticas y congeladas a 18°C. Finalizado el periodo de colecta, el material fue homogenizado, seco en estufa de ventilación forzada (55ºC) y molido en molino tipo martillo con criba de 1mm para la realización de análisis de laboratorio. Experimento 2: Al final del experimento, los animales fueron pesados y el consumo total de la dieta fue computado para determinar el consumo diario de la dieta (CDD), ganancia de peso diaria (GDP) y conversión alimenticia (CA). Al inicio y final del ensayo fueron colectadas muestras de sangre, vía vena cava anterior en tubos con heparina para la determinación del nitrógeno de la urea plasmático (PUN). Las muestras fueron centrifugadas (3.000 rpm por 15 minutos) para la obtención del plasma, que fue transferido para microtubos de 1.5 mL los cuales fueron debidamente identificados y almacenados en freezer (-18°C) para posteriores análisis. Los valores de PUN fueron determinados con el kit Uréia-PP® (Gold Analisa Diagnóstico). Los resultados del PUN inicial fueron utilizados como covariable para el análisis estadístico del PUN final. Análisis de laboratorio. Experimento 1: Los análisis de los alimentos y de las heces fueron realizadas en el Laboratorio de Nutrición Animal de la Universidad Estadual de Maringá. Los valores de EB fueron determinados por medio de bomba calorimétrica (Parr Instrument Co.). Análisis de datos. Experimento 1: Los coeficientes de digestibilidad de la materia seca (CDMS), de la proteína cruda (CDPC), extracto etéreo (CDEE), materia orgánica (CDMO) y de la energía bruta (CDEB) de los alimentos, fueron calculados considerando el método de colecta total según Sakomura y Rostagno (10). Los valores de materia seca digestible (MSD), proteína digestible (PD), extracto etéreo digestible (EED), materia orgánica digestible (MOD) y energía digestible (ED) de los alimentos fueron calculados utilizando la fórmula descrita por Sakomura y Rostagno (10). Los coeficientes de digestibilidad de los nutrientes de las semillas de canola fueron sometidos a análisis de variancia, utilizándose el programa estadístico SAEG.
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Scherer - Ground or Extruded Canola Seed for Piglets
digestible energy (DE) of the feed were calculated using the formula described by Sakomura and Rostagno (10). The digestibility coefficients of the nutrients in canola seeds were submitted to variance analysis, using the statistical program SAEG. Experiment 2: To verify the economic viability of including entire ground canola seed and extruded canola seed in diets, the cost of the diet (CD) was calculated and the cost of the diet per kilogram of live weight (CMD) according to the following formula: Yi(R$/kg)= Qi x Pi / Gi, where Yi= cost of the diet per kg of live weight gained in the i-th treatment; Qi= quantity of diet consumed in the i-th treatment; Pi= price per kg of diet used in the i-th treatment; Gi=weight gain in the i-th treatment. Later the economic efficiency indexes were calculated (EEI) and the cost (CI) according to the following formulas: EEI (%) = MCe/ CTei x 100 y IC (%) = CTei/ MCe x 100, where MCe= least cost of diet per kg gained observed among the treatments; CTei= cost of the treatment i considered. Daily consumption diet (DCD), daily weight gain (DWG), feed conversion (AC), PUN and economic variables were analyzed using the SAEG statistical program.
RESULTS Ground entire canola seeds presented higher values for ether extract, organic material, brute energy and less raw protein when compared to extruded canola seed. Values for calcium, total phosphorus and brute energy were similar among the seeds (Table 2). The extruded canola seed presented higher values indicating that the extrusion process improved digestibility coefficients (Table 3) of the majority of the nutrients (p<0.05), except for the raw protein coefficient (CDPC), which was similar in both seeds. Table 2. Nutritional Composition of ground entire canola seed (ICS) and extruded canola seed (ECS) dry base.
El consumo diario de la dieta (CDD), la ganancia de peso diaria (GDP), la conversión alimenticia (CA), el PUN y las variables económicas fueron analizadas utilizando el programa estadístico SAEG.
RESULTADOS La semilla de canola integral molida presentó valores mayores para el extracto etéreo, materia orgánica, energía bruta, y un menor valor para la proteína cruda cuando comparada con la semilla de canola extrusada. Los valores para cálcio, fósforo total y energía bruta fueron semejantes entre las semillas (Tabla 2). La semilla de canola extrusada presentó valores mayores indicando que el proceso de extrusión mejoró los coeficientes de digestibilidad (Tabla 3) de la mayoría de los nutrientes (p<0.05), excepto para el coeficiente de proteína cruda (CDPC) que fue semejante entre las semillas. Los valores de energía digestible (ED), de extracto etéreo digestible (EED), de la materia orgánica digestible (MOD) y de la materia seca digestible Table 3. Apparent digestibility coefficients of ground canola seeds (ICS) and extruded canola seeds (ECS).
Parameters
SCI1
SCE1
Coefficients
SCI
SCE
CV, %1
Dry Material, % Raw protein, % Ether Extract, % Organic Material, % Calcium, % Total phosphorus, % Brute energy, kcal/kg
95.35 24.66 40.56 96.59 0.370 0.570 6.681
96.15 27.16 37.55 97.06 0.360 0.560 6.677
Dry Material, %
64.81±2.81b
80.15±3.98a
5.02
Raw Protein, %
69.65±4.08a
69.57±2.74a
4.99
Ether Extract, %
74.71±7.76b
92.85±3.46a
7.18
65.98±2.86b
80.47±8.24a
4.48
Brute energy, %
62.82±3.40b
81.67±3.95a
5.10
Analysis determined in the Laboratorio de Nutrición Animal del Departamento de Zootecnia of the Universidad Estadual de Maringá. 1
Experimento 2: Para verificar la viabilidad económica de la inclusión de la semilla de canola integral molida y de la semilla de canola extrusada en las dietas, fue calculado el costo de la dieta (CD) y el costo de la dieta por kilogramo de peso vivo (CMD) según la siguiente fórmula: Yi(R$/kg)= Qi x Pi / Gi, donde Yi= costo de la dieta por kg de peso vivo ganado en el i-ésimo tratamiento; Qi= cantidad de dieta consumida en el i-ésimo tratamiento; Pi= precio por kg de la dieta utilizada en el i-ésimo tratamiento; Gi=ganancia de peso en el i-ésimo tratamiento. Posteriormente fueron calculados los índices de eficiencia económica (IEE) e de costo (IC) según las siguientes fórmulas: IEE (%) = MCe/ CTei x 100 y IC (%) = CTei/ MCe x 100, donde MCe= menos costo de la dieta por kg ganado observado entre los tratamientos; CTei= costo del tratamiento i considerado.
Organic Material, %
Promedios seguidos de letra diferente, en la misma línea, difieren entre sí (p<0.05) por el test de F. 1Coeficiente de variación.
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The digestible energy values (DE), digestible ether extract (DEE), digestible organic material (DOM) and dry digestible material (DDM) of extruded canola seed were superior to the values of ground entire canola seeds (Table 4), demonstrating that the extrusion process improves the digestibility of those nutrients. In the performance experiment, piglets fed with diets that contained ground canola seeds presented the least weight gain and worst feed conversion (p<0.10) when compared with the control diet (Table 5), the other treatments did not show differences between the evaluated variables. The PUN concentration did not show differences between the treatments (p>0.05), indicating that the nitrogen present in the diets was used with the same efficiency and that the quality of the protein consumed was similar in all the treatments.
Table 4. Digestible values of ground canola seed (SCI) and extruded canola seed (SCE) for piglets in the initial phase (15 to 30 kg), in dry base. Parameters
SCI
SCE
Dry digestible material, %
62.32
76.34
Digestible raw protein, %
14.98
21.34
Digestible ether extract, %
30.50
35.27
Digestible organic material, %
63.83
78.20
Digestible energy, kcal/kg
4.197
5.234
(MSD) de la semilla de canola extrusada fueron superiores a los valores de la semilla de canola integral molida (Tabla 4), demostrando que el proceso de extrusión mejora la digestibilidad de estos nutrientes. En el experimento de desempeño, los lechones alimentados con dietas que contenían la semilla de canola integral molida presentaron una menor ganancia de peso y peor conversión alimenticia (p<0.10) cuando comparado con la dieta control (Tabla 5), los demás tratamientos no presentaron diferencias entre las variables evaluadas. La concentración del PUN no presentó diferencias entre los tratamientos (p>0.05), indicando que el nitrógeno presente en las dietas fue utilizado con la misma eficiencia y que la calidad de la proteína consumida fue semejante en todos los tratamientos. Table 5. Productive averages of piglets in initial phase (15 to 30 kg). Variables
DAS
DAC
DSCI
DSCE
C.V.
CDD, kg/day
1.370
1.368
1.347
1.327
3.06
GPD, kg/day
0.719a
0.698ab
0.656b
0.681ab
5.13
CA
1.91a
1.96ab
2.06b
1.95ab
4.18
PUN, mg/dl
10.12
8.91
9.80
9.90
15.90
DAS=Diet with soy oil; DAC= Diet with canola oil; DSCI = Diet with canola seed; DSCE= Diet with extruded canola seed; CV= Variation coefficient. Averages followed by different letters on the same line differ from the F Test (p<0.10).
The economic analysis (Table 6) presented a lesser cost per kilogram of live weight (p>0.05) for the DAC diet when compared with the other diets.
El análisis económico (Tabla 6) presentó un mayor costo por kilogramo de peso vivo (p>0.05) para la dieta DAC cuando comparada con las otras dietas.
The economic efficiency index and the cost index did not reveal differences among the treatments; however, the DAC diet and the DSCE diet reached a cost and economic index of 100%, these being the most efficient.
El índice de eficiencia económica y el índice de costos no presentaron diferencias entre los tratamientos; sin embargo, la dieta DAC y la DSCE alcanzaron un índice de costo y económico de 100%, siendo entonces más eficientes.
Table 6. Costs of kilogram of ration, cost of ration per kilogram of live weight gained (RC) of piglets, economic efficiency (IEE) and cost index (IC).
DISCUSIÓN
Variables
DAS
DAC
DSCI
DSCE
Cost of ration, R$/kg
0.42
0.45
0.40
0.41
CR, R$/kg PV gained*
0.80 a
0.90 b
0.82 ab
0.80 a
IEE (%)
100
88.89
97.56
100
IC (%)
100
112.5
102.5
100
DSO=Diet with soy oil; DCO= Diet with canola oil; DSCI = Diet with canola seeds; DSCE= Diet with extruded canola seeds. *Averages followed by different letters differ due to the Tukey test (p<0.05).
Las variaciones encontradas en la composición nutricional (Tabla 2) de las semillas de canola integral molida y extrusada, pueden ser atribuidas principalmente a la pérdida de humedad y de aceite que ocurrió durante el proceso de extrusión, lo que puede ser observado en los valores de materia seca y extracto etéreo, además, el proceso de extrusión concentró la porción proteica en el alimento. Las condiciones
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DISCUSSION Variations found in the nutritional composition (Table 2) of the ground and extruded canola seed can be attributed principally to a loss of moisture and oil that occurred during the extrusion process, which can be observed in the dry material values and the ether extract; additionally, the extrusion process concentrated the protein portion of the feed. The conditions of the process can affect the chemical characteristics and the nutritional quality of the product (11). It is evident that the extrusion process improves the digestibility coefficients of the nutrients principally due to the physical transformation of the starch grains, provoking a structural disorganization and favoring enzymatic action (9). The results obtained for ether extract can be due to the exercise of mechanical pressure during the extrusion process, breaking down the cellular membranes, and releasing the oil (10). Similar results were found by Ahmed et al (7) and Seneviratne et al (11), where better digestibility coefficients were found in the extruded canola flour. Results obtained in the performance experiment (Table 5) can be attributed to factors such as extrusion, where the process probably minimizes the effects of the anti-nutritional factors (erucic acid and glucosinolates) that diminished how the protein in the diet was used, interfering with the metabolism of iodine and other metabolic processes (12). In spite of including oil and canola oils, the nutritional quality was maintained. Similar results were described by PeñuelaSierra (2), who asserted that the quantity of the glucosinolates can explain the different responses obtained in the productive parameters. Montoya y Leterme (13), feeding pigs with different levels of canola flour and canola seed oil, did not observe differences in the feed conversion. The low PUN values are related to taking greater advantage of nitrogen for tissue deposition, indicating that the quantity and quality of the amino acids added to the diet was adequate. In conclusion, ground canola seeds and extruded canola seeds presented 4.197 and 5.234 kcal/kg of digestible energy in dry base, respectively, the extrusion process being an efficient method to improve the digestibility of the nutrients. The inclusion of up to 6% extruded canola seed in the diets of piglets in the initial phase (15 to 30 kg) did not harm the productive parameters;
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del proceso pueden afectar las características químicas y calidad nutricional del producto (11). Es evidente que el proceso de extrusión mejora los coeficientes de digestibilidad de los nutrientes debido principalmente a las transformaciones físicas en los gránulos de almidón provocando una desorganización estructural, favoreciendo la acción enzimática (9). Los resultados obtenidos para el extracto etéreo pueden ser debido a que en el proceso de extrusión se ejerció una presión mecánica, rompiendo las membranas celulares, disponiendo la grasa (10). Resultados semejantes fueron encontrados por Ahmed et al (7) y Seneviratne et al (11) donde encontraron mejores coeficientes de digestibilidad en la harina de canola extrusada. Los resultados obtenidos en el experimento d e d e s e m p e ñ o ( Ta b l a 5 ) p u e d e n s e r atribuidos a factores como la extrusión, donde probablemente el proceso minimiza los efectos de los factores anti nutricionales (ácido erúcico y los glucosinolatos) los cuales disminuyen el aprovechamiento de la proteína en la dieta, interfiriendo en el metabolismo del yodo y otros procesos metabólicos (12). A pesar de la inclusión de los aceites y de las semillas de canola la calidad nutricional se mantuvo. Resultados semejantes fueron descritos por Peñuela-Sierra (2), quienes afirman que la cantidad de glucosinolatos pueden explicar las diferentes respuestas obtenidas en los parámetros productivos. Montoya y Leterme (13), alimentando cerdos en ceba con diferentes niveles de harina de canola y aceite de semilla de canola, no observaron diferencias en la conversión alimenticia. Los valores bajos de PUN están relacionados con una mejor utilización del nitrógeno para la deposición de tejido, indicando que fue adecuada la cantidad y la calidad de los aminoácidos adicionados a la dieta. En conclusión la semilla de canola integral molida y la semilla de canola extrusada presentaron contenido de energía digestible de 4.197 y 5.234 kcal/kg en base seca, respectivamente, siendo el processo de extrusión un eficiente método para mejorar la digestibilidad de los nutrientes. La inclusión de hasta un 6% de la semilla de canola integral extrusada en las dietas de lechones en fase inicial (15 a 30 kg), no perjudican los parámetros productivos; sin embargo, su uso está condicionado a la disponibilidad del
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however its use is conditioned to its availability and price so that the diets can be economically viable. Acknowledgements To COCAMAR for donating the canola seed used in this study.
Estevez RL, Duarte JB, Chambo APS, Cruz MIF. A cultura da canola. SAP 2014; 13(1):1-9.
2.
Peñuela Sierra LM. Utilização do farelo de canola na alimentação de suínos [Tesis de Doctorado]. Maringá: Universidade Estadual de Maringá, Programa de Póstgrado en Zootecnia; Departamento de Zootecnia;2011.
4.
5.
Agradecimientos A COCAMAR por la donación de la semilla de canola utilizada en este trabajo.
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3.
alimento y de su precio, para que las dietas sean económicamente viables.
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4415-4426, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL
Random regression models for milk, fat and protein in Colombian Buffaloes Modelos de regresión aleatoria para leche, grasa y proteína en búfalos de Colombia Naudin Hurtado-Lugo,1,2 Ph.D, Humberto Tonhati,1 Ph.D, Raul Aspilcuelta-Borquis,1 Ph.D, Cruz Enríquez-Valencia,1 M.Sc, Mario Cerón-Muñoz,2* Ph.D. University of São Paulo, Faculty of Agrarian and Veterinary Sciences (FCAV), State Jaboticabal (UNESP), 14884900, SP, Brazil. 2Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, Grupo de investigación GaMMA, Carrera 75 No 65-87. Medellín, Colombia. Corresponding: cerongamma@ gmail.com 1
Received: June 2013; Accepted: August 2014.
ABSTRACT Objective. Covariance functions for additive genetic and permanent environmental effects and, subsequently, genetic parameters for test-day milk (MY), fat (FY) protein (PY) yields and mozzarella cheese (MP) in buffaloes from Colombia were estimate by using Random regression models (RRM) with Legendre polynomials (LP). Materials and Methods. Test-day records of MY, FY, PY and MP from 1884 first lactations of buffalo cows from 228 sires were analyzed. The animals belonged to 14 herds in Colombia between 1995 and 2011. Ten monthly classes of days in milk were considered for test-day yields. The contemporary groups were defined as herd-year-month of milk test-day. Random additive genetic, permanent environmental and residual effects were included in the model. Fixed effects included the contemporary group, linear and quadratic effects of age at calving, and the average lactation curve of the population, which was modeled by third-order LP. Random additive genetic and permanent environmental effects were estimated by RRM using third- to- sixth-order LP. Residual variances were modeled using homogeneous and heterogeneous structures. Results. The heritabilities for MY, FY, PY and MP ranged from 0.38 to 0.05, 0.67 to 0.11, 0.50 to 0.07 and 0.50 to 0.11, respectively. Conclusions. In general, the RRM are adequate to describe the genetic variation in test-day of MY, FY, PY and MP in Colombian buffaloes. Key words: Cattle, genetics, zootechnics (Source: EuroVoc). RESUMEN Objetivo. Fueron estimadas funciones de covariancia para los efectos genéticos aditivos y de ambiente permanente, y posteriormente fueron estimados los parámetros genéticos para la producción de leche en el día del control (PDC) para leche (MY), grasa (FY), proteína (PY) y producción de queso mozzarella (MP), usando modelos de regresión aleatoria (RRM) mediante Polinomios Ortogonales de Legendre (LP) en búfalos de Colombia. Materiales y Métodos. Fueron analizados 1884 registros de PDC de primeras lactancias para MY, FY, PY y MP, hijas de 228 reproductores. Los registros procedían de 14 rebaños entre 1995 y 2011. Para las PDC fueron consideradas 10 clases mensuales de días
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en lactancia. Los grupos contemporáneos fueron definidos como rebaño-año-mes de control. Fueron incluidos en el modelo efectos aleatorios genético aditivo, de ambiente permanente y residual. Los efectos fijos incluidos fueron grupo contemporáneo, efecto lineal y cuadrático de edad al parto, y curva promedia de la lactancia de la población, la cual fue modelada por un LP de tercera orden. Los efectos aleatorios genético aditivo y de ambiente permanente fueron estimados por RRM mediante LP de tercero a sexto orden. Las variancias residuales fueron modeladas usando estructuras homogéneas y heterogéneas. Resultados. Las heredabilidades para MY, FY, PY y MP variaron de 0.38 a 0.05, 0.67 a 0.11, 0.50 a 0.07 y 0.50 a 0.11, respectivamente. Conclusiones. En general, los RRM son adecuados para describir la variación genética para la PDC de MY, FY, PF y MP en búfalos de Colombia. Palabras clave: bovino, genética, zootecnia (Fuente: EuroVoc).
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Buffalo milk is mainly used for the production of milk derivatives due to the composition and physicochemical quality of its components (1). The nutritional quality and economic value of mozzarella cheese does not only depend on the quantity of milk produced, but also on its relationship with fat and protein (1,2).
La leche de búfalo se utiliza principalmente para la producción de derivados lácteos, debido a la composición y calidad fisicoquímica de sus componentes (1). La calidad nutricional y el valor económico del queso mozzarella no depende únicamente de la cantidad de leche producida, sino también de su relación con la grasa y la proteína (1,2).
Random regression models (RRM) can be applied to test-day milk yield as an alternative to standard procedures used for the genetic evaluation of longitudinal traits in dairy cattle. According to El Faro et al (3), in dairy cattle of different breeds, heritabilities of 0.15 to 0.48, 0.13 to 0.28 and 0.16 to 0.28 were estimated for milk (MY), fat (FY) and protein (PY) yield, respectively, using RRM (4-7). Studies estimating heritabilities for mozzarella cheese production (MP) with RRM are scarce. The objetive of this study was to estimate covariance functions for additive genetic and permanent environmental effects and, subsequently, genetic parameters for MY, FY, PY and MP in buffaloes from Colombia using RRM with Legendre polynomials (LP).
MATERIALS AND METHODS Description of the data. In the study, test-day MY, FY, PY and MP from 1884 first lactations of buffalo cows aged 26 to 49 months, from 228 sires, were analyzed. The animals belonged to 14 herds that comprise the database of Faculty of Agricultural Sciences, University of Antioquia, Colombia and Colombian Buffaloes Breeders Association. Calvings occurred between 1995 and 2011. Lactations were considered when the first control was between 5 and 45 d. Test-day yields were divided into monthly classes of lactation (1 to 10 classes) and animals with at least three test-day records were included in the analysis. The contemporary groups (CG) were defined as herd-year-month of milk test, with the restriction that each group should contain at least three animals. A pedigree file containing 7.090 animals was used in all analyses.
Es posible aplicar modelos de regresión aleatoria (MRA) a la producción de leche del día de control como una alternativa a los procedimientos estándar utilizados para la evaluación genética de características longitudinales en bovinos lecheros. De acuerdo con El Faro et al (3), en los bovinos lecheros de diferentes razas, se estimaron las heredabilidades de 0.15 a 0.48, de 0.13 a 0.28 y de 0.16 a 0.28 para la producción de leche (MY), grasa (FY) y proteína (PY), respectivamente, utilizando los MRA (4-7). Las estimaciones obtenidas en estudios de las heredabilidades para la producción de queso mozzarella (MP) via MRA son escasas. El objetivo del presente estudio fue estimar las funciones de covarianza para los efectos genéticos aditivos y de ambiente permanente y, posteriormente, los parámetros genéticos para MY, FY, PY y MP en búfalos de Colombia utilizando MRA con polinomios de Legendre (LP).
MATERIALES Y MÉTODOS Descripción de los datos. En el estudio fueron analizados los registros productivos de MY, FY, PY y MP en el día de control de primeras lactancias de 1.884 búfalas de 26 a 49 meses de edad, hijas de 228 reproductores. Los animales pertenecían a 14 rebaños que conforman la base de datos de la Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Colombia y la Asociación Colombiana de Criadores de Búfalos. Los partos ocurrieron entre el año 1995 y el 2011. Fueron consideradas lactancias cuando su primer control estuvo entre el día 5 y 45. La producción en el día de control se dividió en clases mensuales de lactancia (clases de 1 a 10) y se incluyeron en el análisis los animales con al menos tres registros de día de control. Los grupos contemporáneos (CG) se
Hurtado-Lugo - Random regression models in colombian buffaloes
MP was estimated using the mozzarella index proposed by Borghese and Mazzi (8), which is based on MY, %FY and %PY. This index is adopted in genetic and animal breeding programs in Italy and is calculated as follows: MP(kg)=MY*{[(3.5*%P)+(1.23*%F)–0.88]/100}. Statistical method. Single-trait RRM were used for the analysis of MY, FY, PY, and MP. Random additive genetic effects, permanent environmental effects of the animal, and residual effects were included in all models. The fixed effects were CG, linear and quadratic effects of the covariate age of dam at calving, and the average lactation curve of the population modeled by a third-order orthogonal polynomial. The matrix representation of the model is given as:
Where y = vector of observations; b = vector of fixed effects (CG and age of dam at calving and average curve of the population covariates); a = vector of solutions for additive genetic random regression coefficients; ap = vector of solutions for permanent environmental random regression coefficients; e = vector of residual effects, and X,Z,W = incidence matrices for fixed,random additive genetic and permanent environmental effects, respectively. The dimension of vector ‘‘a’’ consists of ka x Na coefficients, where ka corresponds to the order of the polynomial and Na is the number of animals in the relationship matrix. The dimension of vector ap consists of kap x Nd coefficients, where kap corresponds to the order of the polynomial and Nd is the number of animals with records. For analysis, it was assumed that the records were distributed with mean Xβ and the random effects were assumed to be normally distributed with:
Where Ka and Kap are covariance matrices between additive genetic and permanent environmental random regression coefficients, respectively; A is the relationship matrix between individuals; INd is the identity matrix of dimension Nd; ⊗ is the Kronecker product between matrices, and R is a block diagonal matrix containing
4417
definieron como rebaño-año-mes de control, con la restricción que cada grupo debe contener al menos tres animales. Se utilizó un archivo del pedigrí de 7.090 animales en todos los análisis. La MP fue estimada utilizando el índice de mozzarella propuesto por Borghese y Mazzi (8), el cual se basa en MY, %FY y %PY. Este índice ha sido adoptado en programas de genética y reproducción animal en Italia y se calcula de la siguiente forma: MP(kg)=MY*{[(3.5*%P)+(1.23*%F) – 0.88] / 100}. Método estadístico. Se utilizaron MRA univariados para el análisis de MY, FY, PY y MP. Se incluyeron los efectos aleatorios fueron genéticos aditivos, de ambiente permanente y los efectos residuales de los animales en todos los modelos. Los efectos fijos fueron CG, los efectos lineales y cuadráticos de la edad como covariable al momento del parto y la curva promedia de lactancia de la población, modelada por medio de un polinomio ortogonal de tercer orden. La representación matricial del modelo es la siguiente:
Donde y = vector de observaciones; b = vector de efectos fijos (CG y las covariables edad al momento del parto y curva promedio de la población); a = vector de soluciones para los coeficientes de regresión aleatoria genético aditivo; ap = vector de soluciones para los coeficientes de regresión aleatoria de ambiente permanente; e = vector de efectos residuales, y X,Z,W = matrices de incidencia para los efectos fijos, aleatorios genético aditivo y de ambiente permanente, respectivamente. La dimensión del vector “a” se compone de ka x Na coeficientes, donde ka corresponde al orden del polinomio y Na al número de animales en la matriz de relaciones. La dimensión del vector “ap” consiste de kap x Nd coeficientes, donde kap corresponde al orden del polinomio y Nd al número de animales con registros. Para el análisis se asumió que los registros tenían una distribución con media Xβ y se asumió que los efectos aleatorios tenían una distribución normal:
Donde Ka y Kap corresponden a las matrices de covarianza entre los coeficientes de regresión aletorios del efecto genético aditivo y de ambiente permanente, respectivamente; A es la matriz de relaciones entre los individuos; INd es la matriz identidad de dimensión Nd;
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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015
residual variances. It was assumed that the residuals are independent. The random additive genetic and permanent environmental effects were modeled using third- to sixth-order LP. A homogeneous (R) and a heterogeneous (r) structure with 10 classes (each month was considered to be a different class) were adopted for residual variances. In addition, heterogeneous variances with smaller classes were also considered, which were divided according to similarity between variances based on the 10 residual classes. Thus, test-day records for MY were divided into four classes (1st, 2nd to 4th, 5th to 8th and 9th to 10th month). The residual variance structure for FY was defined by four classes (1st, 2nd, 3rd to 8th and 9th to 10th month). For PY, residual variance was modeled using four classes (1st, 2nd to 7th, 8th and 9th to 10th month). Residual variance for MP was modeled using four classes (1st to 2nd, 3rd to 7th, 8th and 9th to 10th month). The general RRM is given as LEGka.kap_R or LEGka. kap_r, where ka and kap correspond to the order of the covariance function for additive genetic and permanent environmental effects, respectively, and R or r is the structure of residual variances. The covariance functions were estimated by the restricted maximum likelihood method using the WOMBAT program (9). The different models were compared using the logarithm of the likelihood function (log L), the likelihood ratio test (LRT) at 1% probability, restricted maximum likelihood Akaike’s (AIC) and Schwarz Bayesian (BIC) Information Criteria, and examination of variances and correlations estimated for the traits. The information criteria can be described as: and , where p is the number of parameters estimated, N is the number of data, r(X) is the rank of the incidence matrix of fixed effects in the model, and log L is the logarithm of the restricted maximum likelihood function.
⊗ es el producto de Kronecker entre las matrices, y R es una matriz diagonal que contiene las varianzas residuales. Se asume que los residuos son independientes. Los efectos genético aditivo y de ambiente permanente fueron modelados usando LP de tercer a sexto orden. Se adoptó una estructura homogénea (R) y heterogénea (r) con 10 clases (se consideró que cada mes correspondía a una clase diferente) para varianzas residuales. Además, también se consideraron las varianzas heterogéneas con clases más pequeñas, las cuales fueron divididas según su similitud entre las varianzas en base a las 10 clases residuales. Por lo tanto, los registros del día de control para MY se dividieron en cuatro clases (1º, 2º a 4º, 5º a 8º y 9º a 10º mes). La estructura de la varianza residual para FY se definió de acuerdo a cuatro clases (1º, 2º, 3º a 8º y 9º a 10º mes). Para PY, la varianza residual fue modelada usando cuatro clases (1º, 2º a 7º, 8º y 9º a 10º mes). La varianza residual para MP fue modelada usando cuatro clases (1º a 2º, 3º a 7º, 8º y 9º a 10º mes). El MRA general se define como LEGka.kap_R o LEGka. kap_r, donde ka y kap corresponden al orden de la función de covarianza para los efectos genético aditivo y de ambiente permanente, respectivamente, y R o r es la estructura de las varianzas residuales. Las funciones de covarianza fueron estimadas por el método de máxima verosimilitud restringida utilizando el programa WOMBAT (9). Los diferentes modelos fueron comparados mediante el logaritmo de la función de verosimilitud (log L), la prueba de razón de verosimilitud (LRT) con una probabilidad del 1%, los criterios de información de Akaike (AIC) y Bayesiano de Schwarz (BIC), y por medio del examen de las correlaciones y varianzas estimadas para las características. Los criterios de información pueden describirse como: y , donde p es el número de parámetros estimados, N es el número de datos, r(X) es el rango de la matriz de incidencia de los efectos fijos en el modelo, y log L es el logaritmo de la función de máxima verosimilitud restringida.
RESULTS
RESULTADOS
The mean test-day MY data followed a typical lactation curve for buffaloes, starting with 3.69 kg and increasing until peak yield in the third month (4.14 kg), followed by a decrease until the end of lactation (2.34 kg). The mean testday FY, PY and MP were 0.24, 0.14 and 0.75 kg, respectively, with a standard deviation of 0.11, 0.07 and 0.33 kg and coefficient of variation of 46.58, 45.89 and 44.41% (Table 1).
Los datos promedios del día de control para MY siguieron una curva de lactancia típica para los búfalos, iniciando con 3.69 kg y aumentando hasta el pico de la producción en el tercer mes (4.14 kg), seguido por una disminución hasta el fin de la lactancia (2.34 kg). Los valores promedio del día de control para FY, PY y MP fueron, 0.24, 0.14 y 0.75 kg, respectivamente, con una desviación estándar de 0.11, 0.07 y 0.33 kg y con un coeficiente de variación de 46.58, 45.89 y 44.41 (Tabla 1).
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Hurtado-Lugo - Random regression models in colombian buffaloes
Table 1. Description of milk yield (MY), fat yield (FY), protein yield (PY) and mozzarella production (MP) across first lactation of buffaloes. Test day
N
1
MY Mean
SD
CV
711
3.69
1.33
36.1
2
764
4.08
1.39
3
808
4.14
1.34
4
758
4.01
5
749
6
N
FY
PY
MP
Mean
SD
CV
Mean
SD
CV
Mean
SD
CV
100
0.27
0.12
44.93
0.17
0.07
39.72
0.89
0.35
39.56
34.2
118
0.27
0.13
49.21
0.17
0.08
46.68
0.90
0.41
45.77
32.2
133
0.27
0.11
40.64
0.17
0.06
39.06
0.87
0.33
38.18
1.25
31.1
141
0.24
0.10
42.06
0.15
0.05
35.06
0.78
0.29
36.59
3.82
1.14
29.7
138
0.24
0.09
38.94
0.14
0.05
37.32
0.75
0.27
36.13
707
3.66
1.21
32.9
123
0.23
0.11
48.28
0.14
0.06
43.26
0.73
0.32
43.16
7
705
3.37
1.14
33.8
134
0.21
0.10
47.37
0.11
0.05
48.05
0.63
0.29
46.37
8
626
3.08
1.08
35.2
88
0.18
0.08
45.23
0.10
0.04
40.98
0.54
0.22
40.70
9
536
2.78
0.97
34.99
47
0.17
0.07
42.31
0.09
0.03
34.21
0.50
0.18
35.40
10
426
2.34
0.98
41.96
14
0.15
0.07
43.03
0.08
0.03
32.35
0.46
0.17
36.31
N: number of observations; SD: standard deviation; CV (%): coefficient of variation. ]
Milk component yields remained constant during early lactation until the third month (0.27 kg for FY and 0.17 kg for PY). Production declined after the fourth month with increasing number of days in milk until the end of lactation (0.15 kg for FY and 0.08 kg for PY). In contrast, MP increased from early lactation (0.89 kg) to the second month (0.90 kg), followed by a decline after the third month to the end of the lactation (0.46 kg). In general, a greater variation in FY, PY and MP was observed at the end of lactation. The LEG3,3_4 model should be used for MY, PY and MP, and the LEG3,3_6 or LEG3,3_4 models should be used for FY, with the biological interpretation of this trait being easier with the LEG3,3_4 model because of the smaller number of parameters (Table 2).
La producción para componentes lacteos permanecieron constantes al inicio de la lactancia hasta el tercer mes (0.27 kg para FY y 0.17 kg para PY). La producción disminuyó después del cuarto mes con un mayor número de días de lactancia hasta el final de la misma (0.15 kg para FY y 0.08 kg para PY). En contraste, el MP aumentó desde al inicio de la lactancia (0.89 kg) hasta el segundo mes (0.90 kg), seguido por un descenso después del tercer mes hasta el final de la lactancia (0.46 kg). En general, se observó una mayor variación en FY, PY y MP al final del periodo de lactancia. El modelo LEG3,3_4 fue utilizado para MY, PY y MP y el modelo LEG3,3_6 o LEG3,3_4 fueron utilizados para FY, dado que la interpretación biológica de este rasgo es más fácil con el modelo LEG3,3_4 debido al menor número de parámetros (Tabla 2).
RRM with LP require the definition of the most appropriate order for each random effect included in the model. For MY, FY, PY and MP (Table 3), improvement of the log L (p>0.01 by the LRT) and AIC criteria was generally observed when the order of fit was increased from three to four for additive genetic variance combined with an order of six for permanent environmental variance.
El MRA con LP requiere de la definición del orden más apropiado para cada efecto aleatorio incluido en el modelo. Para MY, FY, PY y MP (Tabla 3), se observó de manera general una mejora en los criterios log L (p>0.01 por el LRT) y AIC cuando el orden de ajuste se aumentó de tres a cuatro para la varianza genética aditiva, en combinación con un orden de seis para la varianza de ambiente permanente.
Table 4 shows the eigenvalues associated with the matrix of random regression coefficients for additive genetic and permanent environmental effects obtained for the best models for MY, FY, PY and MP according to the BIC. As can be seen, lower-order RRM permit to model most part of the additive genetic variation in MY, FY, PY and MP, with a fourth coefficient being associated with an eigenvalue of zero, in contrast to the permanent environmental effect. The first eigenvalue analyzed was responsible for at least 62% of the data variation in MRA adjusted to the traits studied.
En la tabla 4, son presentados los valores propios asociados con la matriz de los coeficientes de regresión aleatoria para los efectos genético aditivo y de ambiente permanente obtenidos para los mejores modelos de MY, FY, PY y MP de acuerdo con el BIC. Como puede observarse, un MRA con un orden menor permite modelar la mayor parte de la variación genética aditiva en MY, FY, PY y MP, con un cuarto coeficiente asociado con un valor propio de cero, en contraste con el efecto de ambiente permanente. El primer valor propio analizado fue responsable de por lo menos el 62% de la variación en los datos en el MRA ajustado a los rasgos objeto de estudio.
4420
REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015
Table 2. Number of parameters estimated (P), logarithm of the maximum likelihood function (log L), Akaike information criterion (AIC), Schwarz Bayesian Information Criterion (BIC) and Likelihood Ratio Test (LRT) for the models used to compare the number of residual variance classes for milk yield (MY), fat yield (FY), protein yield (PY), and mozzarella production (MP) in buffaloes. Modela
P
log L
AIC
BIC
MY
P
log L
AIC
BIC
1) LEG3,4_4
20
-3051.38
6142.77
6278.83
2) LEG3,5_4
25
-3022.66
6095.32
6265.40
6319.86
(4-3) 6.95
3) LEG3,6_4
31
-2998.31
6058.62
4) LEG4,4_4
24
-3049.33
6396.54
6484.98
2) LEG3,3_3
15 -3097.33
6224.66
3) LEG3,3_4
16 -3089.50
6211.01
6358.78
-
LRTb
MY
6326.71
13 -3185.27
6209.11
Modela
LRTb (2-1) 95.76** (3-2) 7.83 **
1) LEG3,3_1
4) LEG3,3_10 22 -3082.55
Table 3. Number of estimated parameters (P), logarithm of the maximum likelihood function (log L), Akaike Information Criterion (AIC), Schwarz Bayesian information criterion (BIC) and Likelihood Ratio Test (LRT) for models used comparing the number of classes for the residual variance of Milk (MY), fat (FY), protein (PY) yields and mozzarella production (MP) in buffaloes.
ns
(2-1) 28.73** £
(3-2) 24.35**
6269.52
-
6146.66
6309.94
(5-4) 28.25** (6-5) 24.92**
£
5) LEG4,5_4
29
-3021.08
6100.16
6297.45
1) LEG3,3_1
13
1831.22
-3636.44
-3572.67
(2-1) 6.74**
6) LEG4,6_4
35
-2996.16
6062.32
6300.26
-
2) LEG3,3_4
16
1837.95
-3643.89
-3565.40
(3-2) 1.55ns
7) LEG5,5_4
34
-3013.89
6095.78
6327.09
(8-7) 24.24**
3) LEG3,3_6
18
1839.50
-3642.99
-3554.69
(4-3) 2.14ns
8) LEG5,6_4
40
-2989.65
6059.30
6331.43
-
4) LEG3,3_10 22
1841.64
-3639.27
-3531.34
-
FY
FY 1) LEG3,4_4
20
1819.91
-3639.82
2) LEG3,5_4
25
1811.85
-3623.69
-3501.05
-4703.44
(2-1) 16.97** (3-2) 7.14ns
3) LEG3,6_4
31
1813.85
-3627.69
-3475.61
-
-4676.35
-
4) LEG4,4_4
24
1803.98
-3607.95
-3490.21
(5-4) 14.54**
5) LEG4,5_4
29
1813.51
-3627.03
-3484.76
(6-5) 2.9 ns
6) LEG4,6_4
35
1810.45
-3620.89
-3449.19
-
7) LEG5,5_4
34
1807.38
-3614.76
-3447.96
(8-7) 3.14ns
8) LEG5,6_4
40
1804.52
-3609.04
-3412.81
-
PY 1) LEG3,3_1
13
2389.90
-4753.80
-4690.18
2) LEG3,3_4
16
2406.87
-4781.73
3) LEG3,3_10 22
2414.00
-4784.01 MP
1) LEG3,3_1
13
762.05
-1498.10
-1434.44
2) LEG3,3_4
16
777.11
-1522.22
-1443.87
(2-1) 15.06** (3-2) 2.72ns
3) LEG3,3_10 22
779.83
-1515.65
-1407.93
-
LEGka,kap_R or LEGka,kap_r: functions of Legendre polynomials (LEG) where ka and kap correspond to the order of the covariance function for additive genetic and permanent environmental effects, respectively, and R and r indicate the structure of residual variance (homogeneous or heterogeneous, respectively). b Likelihood ratio test between hierarchical models. **p<0.01; ns: not significant.
The estimates of additive genetic, permanent environmental, residual and phenotypic variances for test-day MY (LEG3,5_4), FY (LEG3,4_4), PY (LEG3,4_4), and MP (LEG3,4_4) are shown in figure 1. In general, the additive variances for the traits were higher in the first month, decreased until the eighth month, and then increased in the ninth and tenth month. The estimates of permanent environmental variance for MY were practically constant across lactation and were higher than the additive variances. Residual variance was declined from the fifth to the tenth month (Figure 1). For PY, the additive genetic variances showed the same trend
-3541.7
£
(2-1) 3.06
ns
(3-2) 7.99 ns
PY
a
The first three eigenvalues explained most of the additive genetic and permanent environmental variability (over 90%). On the basis of the results of the eigenvalues, the dimension of the three random effects can be reduced without the loss of information, disagreeing with the log L and AIC criteria for additive genetic and permanent environmental effects and agreeing with the BIC criterion for the additive genetic effect.
£
-4733.58 -4635.71
1) LEG3,4_4
20
2386.79
2) LEG3,5_4
25
2396.34
-4742.68
3) LEG3,6_4
31
2408.93
-4755.87
4) LEG4,4_4
24
2392.47
5) LEG4,5_4
29
6) LEG4,6_4
35
7) LEG5,5_4 8) LEG5,6_4
£
-4620.34
(2-1) 9.55
ns
(3-2) 12.59ns
-4604.13
-
-4736.94
-4619.50
(5-4) 2.21ns
2394.68
-4731.37
-4589.45
(6-5) 1.64ns
2396.32
-4742.65
-4591.37
-
34
2386.2
-4704.39
-4538.01
(8-7) 10.43ns
40
2396.63
-4713.25
-4517.50
-
£
MP 1) LEG3,4_4
20
777.36
-1514.72
2) LEG3,5_4
25
778.32
-1506.64
-1384.23
3) LEG3,6_4
31
783.29
-1504.57
-1352.77
-
4) LEG4,4_4
24
776.85
-1505.70
-1388.18
(5-4) 2.86ns
5) LEG4,5_4
29
779.71
-1501.41
-1359.41
(6-5) 5.58ns
6) LEG4,6_4
35
785.29
-1500.57
-1329.19
-
7) LEG5,5_4
34
779.95
-1491.90
-1325.41
(8-7) 4.07ns
8) LEG5,6_4
40
784.02
-1488.04
-1292.17
-
£
-1416.78
£
(2-1) 0.97ns (3-2) 5.00ns
£ Indicates the best model according to the AIC and BIC. a LEGka,kap_R or LEGka,kap_r: functions of Legendre polynomials (LEG) where ka and kap correspond to the order of the covariance function for additive genetic and permanent environmental effects, respectively, and R and r indicate the structure of residual variance (homogeneous or heterogeneous, respectively). b Likelihood ratio test between hierarchical models. **p<0.01; ns: not significant.
Los tres primeros valores propios explican la mayor parte de la variabilidad aditiva genética y de ambiente permanente (más del 90%). En base a los resultados de los valores propios, es posible reducir la dimensión de los tres efectos aleatorios sin sufrir ninguna pérdida de información, en desacuerdo con los criterios de log L y AIC para los efectos aditivos genéticos y de
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Table 4. Percentage of variance explained by the eigenvalues of the matrix of additive genetic and permanent environmental random regression coefficients for the models selected. Traits
Random regression coefficient 1
2
3
4
5
MY LEG3,5_4 Additive
84.92
15.06
0.02
-
-
Permanent environmental
69.94
19.93
7.12
2.35
0.67
Additive
79.36
15.48
5.16
-
-
Permanent environmental
82.10
12.66
2.92
2.32
-
FY LEG3,4_4
PY LEG3,4_4 Additive
62.65
22.60
14.75
-
-
Permanent environmental
62.87
16.25
11.14
9.74
-
MP LEG3,4_4 Additive
88.90
10.43
0.67
-
-
Permanent environmental
97.52
1.79
0.45
0.24
-
ambiente permanente y de acuerdo con el criterio BIC para el efecto genético aditivo. En la figura 1 se muestran las estimaciones de las varianzas aditivas genéticas, de ambiente permanente, residuales y fenotípicas para el día de control para MY (LEG3,5_4), FY (LEG3,4_4), PY (LEG3,4_4) y MP (LEG3,4_4). En general, las varianzas aditivas de los rasgos fueron mayores en el primer mes y disminuyeron hasta el octavo mes para luego aumentar en el noveno y décimo mes. Las estimaciones de la varianza de ambiente permanente para MY fueron prácticamente constantes a lo largo del periodo de lactancia y fueron más altas que las varianzas aditivas. La varianza residual disminuyó desde el quinto al décimo mes (Figura 1). Para PY, las varianzas genéticas aditivas mostraron la misma tendencia que las varianzas fenotípicas, observándose valores más altos al final de la lactancia. Para FY y MP, las varianzas genéticas aditivas mostraron la misma tendencia que las varianzas fenotípicas y residuales y fueron mayores al final del periodo de lactancia. Estas estimaciones más altas para FY, PY y MP pueden ser causadas por número de registros encontrados o debido al alto contenido de grasa y proteína al final de la lactancia (Figura 1). Las heredabilidades para MY, FY, PY y MP variaron de 0.38 a 0.05, de 0.67 a 0.11, de 0.50 a 0.07 y de 0.50 a 0.08, respectivamente (Figura 2).
Figure 1. Estimates of additive (♦), permanent environmental (■), residual (▲) and phenotypic (x) variance for milk yield LEG3,5_4 (A), fat yield LEG3,4_4 (B), protein yield LEG3,4_4 (C), and mozzarella production LEG3,4_4 (D).
En la figura 3 se muestran las estimaciones de las correlaciones genéticas y fenotípicas en el día de control para MY, FY, PY y MP. Las correlaciones genéticas para estos rasgos variaron de -0,56 a 0,96. Las correlaciones fenotípicas de los rasgos estudiados fueron menores a medida que se incrementó el
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Figure 2. Estimates of heritability (h2, A) and proportion of phenotypic variance due to the permanent environment (c2, B) for milk yield LEG3,5_4 (♦), fat yield LEG3,4_4 (■), protein yield LEG3,4_4 (▲), and mozzarella production LEG3,4_4 (x).
as the phenotypic variances, with the observation of higher values at the end of lactation. For FY and MP, the additive genetic variances showed the same trend as the phenotypic and residual variances and were higher at the end of lactation. These higher estimates for FY, PY and MP might be due to the number of records found or to the high fat and protein content at the end of lactation (Figure 1). The heritabilities for MY, FY, PY and MP ranged from 0.38 to 0.05, 0.67 to 0.11, 0.50 to 0.07 and 0.50 to 0.08, respectively (Figure 2). The estimates of genetic and phenotypic correlations for test-day MY, FY, PY and MP are shown in figure 3. The genetic correlations for these traits ranged from -0.56 to 0.96. The phenotypic correlations of the traits studied were lower as the interval between test days increased (Figure 3). In general, the phenotypic
intervalo entre los días de control (Figura 3). En general, las correlaciones fenotípicas tuvieron una magnitud menor que las correlaciones genéticas.
DISCUSIÓN La evaluación del mejor ajuste para la varianza residual (Tabla 2) mostró aumentos en log L (p<0.01), que fueron significativos por el LRT, con un aumento en el número de clases heterogéneas. De acuerdo con los criterios utilizados para la evaluación de la bondad de ajuste (AIC y BIC), se consideró que el modelo que incorpora la homogeneidad de las varianzas residuales era inapropiado. Este hecho indica un comportamiento distinto de las varianzas residuales a lo largo del periodo de lactancia y la necesidad de considerar estructuras de varianza heterogénea para los efectos residuales. La heterogeneidad de las varianzas residuales puede atribuirse a factores como la etapa de preñez, la
Figure 3. Estimates of genetic (top row) and phenotypic (bottom row) correlations for test-day milk yield (first column), protein yield (second column), fat yield (third column), and mozzarella production (fourth column) obtained by single-trait random regression.
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correlations were of lower magnitude than the genetic correlations.
DISCUSSION Evaluation of the best fit for residual variance (Table 2) showed increases of log L (p<0.01), which were significant by the LRT, with increasing number of heterogeneous classes. According to the criteria used for the assessment of goodnessof-fit (AIC and BIC), the model considering homogeneity of residual variances was found to be inappropiate. This fact indicates a distinct behavior of residual variances across lactation and the need to consider heterogeneous variance structures for residuals effects. The heterogeneity of residual variances can be attributed to factors such as stage of pregnancy, body condition, duration of the lactation interval and management conditions, since these factors are not easily incorporated into models analyses because of the lack of information (6-7). The changes in log L were of small magnitude and nonsignificant by the LRT (p>0.01), indicating that four residual classes would be sufficient to obtain a good fit of residual variance for MY, PY, FY, and MP. This would avoid the use of superparameterized models which generally present parameter estimation problems (7). The BIC, which is more rigorous because of parameterization, indicated that LEG3,5_4, LEG3,4_4, LEG3,4_4 and LEG3,4_4 were the best fitted models for MY, FY, PY and MP, respectively. Therefore, these models would be more adequate to describe the biological variation in yield traits across lactation. Specifically for PY and FY, the increases seen in late lactation may be related mainly to the small number of records available for this period (Table 1) or may have been due to computing artifacts rather than biology (8). In addition, fitting RRM at the beginning and end of lactation is difficult, resulting in parameter estimation problems (3-4). The results might be explained by the fact that buffalo breeding programs are only starting in Colombia and the population therefore presents small selection rates for the traits studied. In addition, the low yields in early and late lactation are related to the lack of feeding and management strategies during these periods. The trends of additive and permanent environmental variances across lactation obtained for the traits studied (MY, PY and FY) are comparable to those reported by Jamrozik and Schaeffer (4) and Silvestre et al (5), who
4423
condición corporal, la duración del intervalo de lactancia y las condiciones de manejo, ya que estos factores no pueden incorporarse fácilmente en el análisis de los modelos debido a la falta de informacion (6-7). Los cambios en log L fueron de una magnitud pequeña y no significativa por medio de LRT (p>0.01), lo que indica que sería suficiente utilizar cuatro clases residuales para obtener un buen ajuste de la varianza residual para MY, PY, FY y MP. Esto evitaría el uso de modelos superparametrizados que generalmente presentan problemas en la estimación de los parámetros (7). El BIC, el cual es más riguroso debido a la parametrización, indicó que LEG3 LEG3,5_4, LEG3,4_4, LEG3,4_4 y LEG3,4_4 fueron los modelos con el mejor ajuste para MY, FY, PY y MP, respectivamente. Por lo tanto, estos modelos serían más adecuados para describir la variación biológica de las caracteristicas productivas a lo largo de la lactancia. Específicamente para PY y FY, los aumentos al final de la lactancia pueden estar relacionados principalmente con un menor número de registros disponibles para este período (Tabla 1) o pueden ser causado por problemas computacionales en lugar de la biología (8). Además, resulta difícil realizar el ajuste del MRA al inicio y al final de la lactancia, lo que ocasiona problemas en la estimación de los parámetros (3-4). Los resultados pueden explicarse por el hecho de que los programas de cría de búfalos hasta ahora están empezando en Colombia y por lo tanto, la población posee tasas pequeñas de selección de caracteristicas estudiadas. Adicionalmente, la baja producción al inicio y al final de la lactancia se relacionan con la falta de estrategias de alimentación y manejo durante estos períodos. Las tendencias de las varianzas aditivas y de ambiente permanente a lo largo de la lactancia obtenidas para MY, PY y FY son comparables con aquellas reportadas por Jamrozik y Schaeffer (4) y Silvestre et al (5), quienes estimaron varianzas aditivas y de ambiente permanente más altas al principio y al final de la lactancia para MY, PY y FY en bovinos lecheros. Las heredabilidades para MY oscilaron entre 0,38 (primer mes) y 0.05 (séptimo mes). Sesana et al (7) encontró estimaciones más altas, particularmente en los extremos de la curva de lactancia, un hallazgo que puede atribuirse al hecho de que los autores utilizaron registros semanales. Las heredabilidades para FY variaron entre 0.67 (primer mes) y 0.11 (séptimo
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estimated higher additive and permanent environmental variances at the beginning and end of lactation for MY, PY and FY in dairy cows. The heritabilities for MY ranged from 0.38 (first month) to 0.05 (seventh month). Sesana et al (7) found higher estimates, particularly at the extremes of the lactation curve, a finding that might be attributed to the fact that the authors used weekly records. The heritabilities for FY ranged from 0.67 (first month) to 0.11 (seventh month), whereas the heritabilities for PY ranged from 0.50 (first month) to 0.07 (ninth month). Similar results have been reported for dairy cattle using RRM, with high estimates for FY and PY at the beginning and end of lactation (4-6, 9-11). Aspilcueta et al (6) reported heritabilities of lower magnitude using finite dimension models for monthly records of FY and PY in dairy buffaloes. The heritabilities for MP ranged from 0.50 (first month) to 0.08 (ninth month). Rosati and Van Vleck (12) reported a heritability for MP of 0.13 for 270-day lactation in the Italian buffalo population. In general, the heritability estimates for MY, PY, FY and MP showed a similar trend across lactation, with the observation of a marked increase at the end of this period (Figure 2). Similar trends have been reported for dairy cattle (4-5). For MY, the fractions of phenotypic variance due to permanent environmental effects were higher than the heritability estimates across lactation. The fractions of phenotypic variance for FY and PY were higher in the first month and between the fourth and seventh month of lactation, respectively. For MP, the fraction of phenotypic variance due to permanent environmental effects remained constant across lactation. The estimates were higher between adjacent test days (early lactation) and decreased with increasing distance between test days, especially between tests performed at the beginning and end of lactation. Negative and near to zero genetic correlations between milk tests performed at the beginning and end of lactation have been reported for dairy cattle (13-14). Sesana et al (7) and Breda et al (15) reported similar trends in genetic correlations for buffaloes. The correlations, variances and heritabilities obtained for the traits studied are probably due to the difficulty in modeling yields in early lactation, a phase during which the buffalo cow suffers from postpartum stress, as well as negative energy balance and nutritional deficiencies. In addition, genetic breeding programs of dairy buffaloes are only starting in Colombia and the herds and environment where the animals are
mes), mientras que las heredabilidades para PY oscilaron entre 0.50 (primer mes) y 0.07 (noveno mes). Se han reportado resultados similares para bovinos lecheros usando MRA con estimaciones altas para FY y PY al principio y al final de la lactancia (4-6, 9-11). Aspilcueta et al (6) reportó las heredabilidades de una menor magnitud utilizando modelos de dimensión finita para registros mensuales de FY y PY en búfalos lecheros. Las heredabilidades para MP variaron de 0.50 (primer mes) a 0.08 (noveno mes). Rosati y Van Vleck (12) reportaron una heredabilidad para MP de 0.13 para un periodo de lactancia de 270 días en la población de búfalos de Italia. En general, las estimaciones de la heredabilidad para MY, PY, FY y MP mostraron una tendencia similar durante la lactancia, observando un aumento marcado al final de este periodo (Figura 2). Se han reportado tendencias similares para bovinos lecheros (4-5). Para MY, las fracciones de la varianza fenotípica debido a efectos de ambiente permanente fueron más altas que las estimaciones de heredabilidad a lo largo de la lactancia. Las fracciones de la varianza fenotípica para FY y PY fueron más altas en el primer mes y entre el cuarto y séptimo mes de lactancia, respectivamente. Para MP, la fracción de la varianza fenotípica debido a efectos de ambiente permanente se mantuvo constante durante la lactancia. Las estimaciones fueron mayores entre días de control consecutivos (inicio lactancia) y disminuyeron al aumentar la distancia entre los días de control, especialmente entre los controles realizados al principio y al final de la lactancia. Se han reportado correlaciones genéticas negativas y cercanas a cero entre el control de leche realizado al principio y al final de la lactancia para bovinos lecheros (13-14). Sesana et al (7) y Breda et al (15) informaron tendencias similares en correlaciones genéticas de búfalos. Las correlaciones, varianzas y heredabilidades obtenidas para las caracteristicas estudiadas son causadas posiblemente a la dificultad de modelar la producción al inicio de la lactancia, una fase durante la cual la búfala sufre de estrés postparto, así como un balance energético negativo y deficiencias nutricionales. Además, los programas de mejoramiento genético en búfalos lecheros, hasta ahora están iniciando en Colombia y el ambiente donde se crían los animales y los rebaños, así como las bajas tasas de selección y un número pequeño de observaciones, puede influir en las etapas tempranas y tardías de la lactancia. Esto sugiere el uso de períodos más cortos de lactancia para las poblaciones de búfalos cuando los programas
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raised, as well as the low selection rates and small number of observations may influence the early and late stages of lactation. This suggests the use of shorter lactation periods for buffalo populations in which selection programs are only started. De Roos et al (10) suggested the need to model fixed curves since the estimates of genetic variances at the beginning and end of lactation are increased if fixed herd curves are not modeled independently. In conclusion, the RRM using LP are appropiate to describe the genetic variation in test-day MY, FY, PY and MP of buffaloes. Problems with the estimation of genetic parameters were observed at the beginning and at the end of the lactation curve, indicating that the traits studied may be affected by the number of available records at the extremes of the curve or by the high content of fat and protein, or may have been due to computing artifacts rather than biology (8). Residual variances varied across lactation and can be modeled by forming heterogeneous classes using low-order LP, explaining the changes in genetic variation according to days in milk. Acknowledgments This research had financial support from the Colombian Ministry of Agriculture and Rural Development, Colombian Cattle Breeders Federation (FEDEGAN), Colombian Buffaloes Breeders Association, Codi sostenibilidad E01808 and Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP– Part of doctoral thesis of first author: Process Nº2009/53773-1).
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de selección estén empezando. De Roos et al (10) sugirieron la necesidad de modelar curvas fijas ya que las estimaciones de las varianzas genéticas al principio y al final del periodo de lactancia se incrementan, si las curvas fijas del rebaño no han sido modeladas de forma independiente. En conclusión, la utilización de MRA via LP es apropiada para describir la variación genética en el día de control para MY, FY, PY y MP de búfalos. Se observaron problemas relacionados con la estimación de los parámetros genéticos al principio y al final de la curva de lactancia, lo que indica que las características estudiadas pueden ser afectadas por el número de registros disponibles en los extremos de la curva o por el alto contenido de grasa y proteína, o puede deberse a los problemas computacionales en lugar de la biología (8). Las varianzas residuales oscilaron durante la lactancia y pueden ser modeladas mediante clases heterogéneas usando LP de orden inferior, explicando los cambios en la variación genética de acuerdo con los días de lactancia. Agradecimientos Esta investigación contó con el apoyo financiero del Ministerio Colombiano de Agricultura y Desarrollo Rural, la Federación Colombiana de Ganaderos (FEDEGAN), la Asociación Colombiana de Criadores de Búfalos, Codi sostenibilidad E01808 y Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP – Parte de la tesis doctoral del primer autor: Proceso No. 2009/53773-1).
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4427-4435, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL
Non-genetic effects on growth characteristics of Brahman cattle Efectos no genéticos sobre caracteres de crecimiento del ganado Brahman Nicacia Hernández-Hernández,1 M.Sc, Juan Martínez-González,1* Ph.D, Gaspar Parra-Bracamonte,2 Ph.D, Martín Ibarra-Hinojosa,1 Ph.D, Florencio Briones-Encinia,1 Ph.D, Pánfilo Saldaña-Campos,3 Ph.D, Eligio Ortega-Rivas,4 Ph.D. Universidad Autónoma de Tamaulipas-Facultad de Ingeniería y Ciencias. Centro Universitario Adolfo López Mateos. Apartado Postal 149. Ciudad Victoria, Tamaulipas, México. C.P. 87149. Tel. Fax: +52 834 318 1721. 2Instituto Politécnico Nacional-Centro de Biotecnología Genómica. Boulevard del Maestro SN. Esq. Elías Piña, Col. Narciso Mendoza. Reynosa, Tamaulipas, México. C.P. 88710. 3 Instituto Tecnológico de Huejutla. Carretera Huejutla-Challahuiyapa km 5.5, Huejutla de los Reyes, Hidalgo, México. C.P. 43000. 4Asociación Mexicana de Criadores de Cebú. Naranjo No. 1006 Col. Águila. Tampico, Tamaulipas, México. C.P. 89230. *Correspondencia: jmartinez@uat.edu.mx 1
Received: June 2014; Accepted: Novenber 2014.
ABSTRACT Objective. To determine how some non-genetic factors influence weights at birth (BW), weaning (WW) and yearling (YW) of Brahman calves. Materials and methods. Data corresponding to 58257, 57045 and 40364 for BW, WW and YW, respectively, were analyzed. The models included the effects of year and season of birth and sex, and were considered simple interactions. Results. All effects were significant (p<0.05) for BW, WW and YW. Only the season of birth didn’t have a significant effect (p>0.05) on WW. The average general BW, WW and YW were 32±3.2, 188±37.7 and 291±56.8 kg, respectively. Variables evaluated that take into account the year of birth show a trend to increase weight each year. In relation to the birth season on BW and YW, it was observed that calves born during the rainy season were heavier than those born during the dry season. Similarly, male calves were heavier than females at birth, weaning and one year of age. The effects of the analyzed interactions were significant (p<0.05) for the three variables, except for the season of birth per sex interaction, which did not have a significant effect (p>0.05) for BW and WW. Conclusions. The studied non-genetic factors were important and should be taken into account in management strategies when striving to increase the efficiency of the productive system. Key words: Zebu, birth weight, weaning weight, year weight. (Source: AIMS)
RESUMEN Objetivo. Determinar cómo influyen algunos factores no genéticos sobre los pesos al nacer (PN), al destete (PD) y al año (PA) de terneros Brahman. Materiales y métodos. Se analizaron 58257; 57045 y 40364 datos para PN, PD y PA, respectivamente. Los registros fueron de animales nacidos durante los años 1994 a 2012. El modelo incluyó los efectos de año y época de nacimiento y sexo, también se consideraron las interacciones simples. Resultados. Todos los efectos resultaron significativos (p<0.05) 4427
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para PN, PD y PA. Sólo el efecto de época de nacimiento no tuvo efecto significativo (p>0.05) para el PD. Las medias generales de PN, PD y PA fueron de 32±3.2, 188±37.7 y 291±56.8 kg, respectivamente. Para las variables evaluadas sobre el año de nacimiento se observó una tendencia de aumento del peso conforme transcurrieron los años de estudio. Con relación a la época de nacimiento sobre el PN y PA se observó que los terneros nacidos durante la época de lluviosa fueron más pesados, que los nacidos durante la época seca. De igual modo, los terneros machos fueron más pesados que las hembras al nacimiento, destete y al año de edad. Los efectos de las interacciones analizadas fueron significativas (p<0.05) para las tres variables, a excepción, de la interacción época de nacimiento por sexo que no tuvo efecto significativo (p>0.05) para el PN y PD. Conclusiones. Los factores no genéticos estudiados fueron importantes y deben ser tenidos en cuenta en las estrategias de manejo cuando se quiere incrementar la eficiencia del sistema productivo. Palabras clave: Cebú, peso al nacer, peso al destete, peso al año. (Fuente: AIMS)
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Bovine growth is represented by increasing of the animal’s weight during different the stages of his life. Therefore, the importance of evaluating growth is based on selecting both males and females and has a great economic importance for production systems (1,2).
El crecimiento bovino está representado por el incremento del peso del animal en diferentes etapas de su vida. Por lo tanto, la importancia de evaluar el crecimiento radica en que es una característica de selección tanto de hembras como de machos y de alta importancia económica para los sistemas de producción (1,2).
An important component to evaluate in order to estimate the profitability of bovine meat production is the growth of calves as well as the reproductive efficiency of the cow (3). From a productive point of view, intermediate weight at birth (WB) is the most beneficial, since high weights are associated with distocic births and very low weights are associated with an increase in the pre-weaning mortality of the calves. Thus, the WB has a positive association with the weaning weight (WW) and later growth measurements (2). On the other hand, WW influences the determination of the economic efficiency of any bovine production system and can be recommended as selection criteria (3). A way to measure productive behavior is by evaluating growth, reproduction and survival characteristics (3). These characters are influenced by a series of environmental and genetic factors. Among environmental factors, the most common are: year of birth, season or month of birth, sex of the calf, age of the mother (measured in years or number of births), among others. It is known that these factors are different within the relative magnitude, according to agroecological area, production unit and genetic constitution of the population under study; however, it is necessary to assess the degree to which these factors affect certain characteristics in a defined population (4-6). On the other hand, the zebu livestock has a superior capacity to regulate body temperature during heat caloric stress in comparison with
Un componente importante a evaluar para estimar la rentabilidad en la producción de carne bovina, es el crecimiento de las crías, además de la eficiencia reproductiva de la vaca (3). Desde el punto de vista productivo, un peso al nacer (PN) intermedio es más adecuado, ya que los pesos altos se asocian con partos distócicos y pesos muy bajos se asocian con incrementos en la mortalidad pre-destete de los becerros. Asimismo, el PN tiene una asociación positiva con el peso al destete (PD) y posteriores medidas de crecimiento (2). Por otra parte, el PD influye en la determinación de la eficiencia económica de cualquier sistema de producción de bovinos y puede ser recomendado como criterio de selección (3). Una forma de medir el comportamiento productivo es mediante la evaluación de características de crecimiento, reproducción y de sobrevivencia (3). Estos caracteres están influenciados por una serie de factores de tipo ambientales y de tipo genéticos. Entre los ambientales los más comunes son: año de nacimiento, época o mes de nacimiento, sexo del becerro, edad de la madre (medida en años o número de parto), entre otros. Se sabe que estos factores son diferentes en la magnitud relativa, según la zona agroecológica, unidad de producción y constitución genética de la población en estudio; sin embargo, es necesario valorar el grado con el cual estos factores afectan cierta característica en una determinada población (4-6).
Hernández-Hernández - Brahman cattle growth European livestock (7). This superior capacity to regulate body temperature is the result of lower metabolic rates and a greater capacity to lose heat. In the same way, it has been demonstrated that in zebu breeds there exists an important variation that resists tick infestations (8). The objective of the present study was to evaluate the influence of some environmental factors on the growth of Brahman calves.
MATERIALS AND METHODS Data base. The study was done with data of weights of calves in the Ponderal Development Control Program authorized by the Mexican Association of Zebu Breeders (AMCC for its initials in Spanish) with headquarters in Tampico, Tamaulipas, Mexico (9). The animals were weighed at least every 90 days from birth until approximately 550 days old (10). The information analyzed corresponded to 58257 Brahmans born between 1994 and 2012 and registered with AMCC. The ranches where the animals were were spread out through the whole country, mainly in the tropical areas of Mexico. Modifying the feeding and handling systems; but in general registered breeders handle the animals uniformly (10); the handling of these animals has been previously described by several authors (2,11). Growth variables considered in this study were weight at birth (WB=58257), weight at weaning (WW=57045) and yearling weight (YW=40364). To analyze the data base, incomplete records were eliminated and the WW and YW were adjusted according to the recommendations of the Beef Improvement Federation of the United States (12). Statistic model and analysis. Data was submitted to a variance analysis using the MIXED procedure from the SAS statistical packet (13) that included the random effect of the bull, and the fixed effect of the birth year (BY) and sex (SX). The birth seasons were defined as: 1=dry (January to June) and 2=rainy (July to December). By preliminary analysis the ranch effect and the age of the mother were discarded from the final analysis. The model described was: Yijklm=μ+Ti+ANj+ENk+SEl+(AN*EN)jk+(AN*SE) +(EN*SE)kl+Eijklm jl Where: Yijklm=Is weight (at birth; at weaning; at one year) μ=General average of weight (at birth or
4429
Por otro lado, el ganado cebú posee una capacidad superior de regular la temperatura corporal durante el estrés calórico en comparación con el ganado europeo (7). Esta capacidad superior para la regulación de la temperatura corporal es el resultado de menores tasas metabólicas y de una mayor capacidad de perder calor. Igualmente, se ha demostrado que en las razas cebuinas existe una variación importante en la resistencia a las infestaciones de garrapata (8). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la influencia de algunos factores ambientales sobre el crecimiento terneros de la raza Brahman.
MATERIALES Y MÉTODOS Base de datos. El estudio fue realizado con datos de pesajes de los terneros en el Programa de Control de Desarrollo Ponderal, avalados por la Asociación Mexicana de Criadores de Cebú (AMCC) con sede en Tampico, Tamaulipas, México (9). Los animales fueron pesados al menos cada 90 días, desde el nacimiento hasta aproximadamente los 550 días de edad (10). La información analizada correspondió a 58257 animales Brahman nacidos entre los años 1994 y 2012; y registrados ante la AMCC. Los hatos donde se encontraban los animales estaban distribuidos en todo el país, principalmente en las regiones tropicales de México. Modificando los sistemas de alimentación y manejo; pero en general los ganaderos de registro manejan de manera uniforme sus animales (10), el manejo de estos animales ha sido descrito previamente por diversos autores (2,11). Las variables de crecimiento consideradas en este estudio fueron el peso al nacimiento (PN=58257), peso al destete (PD=57045) y peso al año (PA=40364). Para analizar la base de datos se eliminaron los registros incompletos de los animales y las variables PD y PA se ajustaron de acuerdo con las recomendaciones de la Federación de Mejoramiento de Ganado de Carne de Estados Unidos (12). Modelo y análisis estadístico. Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza utilizando el procedimiento MIXED del paquete estadístico SAS (13), que incluyó el efecto aleatorio del toro, y el efecto fijo de año de nacimiento (AN), época de nacimiento (EN) y sexo (SX). Las épocas de nacimiento fueron definidas como: 1=seca (enero-junio) y 2=lluviosa (julio-diciembre). Por análisis preliminares fueron descartadas del análisis final el efecto de hato y la edad de la madre.
4430
REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015
weaning) Ti=Random effect of the i-th bull. ANj=Fixed effect of the j-th year of birth ENk=Fixed effect of the k-th birth season SEl=Fixed effect of the l-th sex of the animal (AN*EN)jk=Effect of the interaction year of birth x birth season (AN*SE)jl= Effect of the interaction year of birth x sex (EN*SE)kl= Effect of the interaction birth season x sex Eijklm= Experimental error.
RESULTS
El modelo descrito fue: Yijklm=μ+Ti+ANj+ENk+SEl+(AN*EN)jk+(AN*SE) +(EN*SE)kl+Eijklm jl Donde: Yijklm=Es el peso (al nacer; al destete; al año) μ=Media general del peso (al nacer o al destete) Ti=Efecto aleatorio del i-ésimo toro ANj=Efecto fijo del j-ésimo año de nacimiento ENk=Efecto fijo de la k-ésima época de nacimiento SEl=Efecto fijo del l-ésimo sexo del animal (AN*EN) jk=Efecto de la interacción año de nacimiento x época de nacimiento (AN*SE) jl =Efecto de la interacción año de nacimiento x sexo (EN*SE)kl=Efecto de la interacción época de nacimiento x sexo Eijklm=Error experimental.
The average general weight for BW was 32.0±3.2 kg, with a variation coefficient of 8.2%. For this parameter all the variation sources had a significant effect (p<0.05).
Para determinar las diferencias estadísticas significativas, se aplicó la prueba de comparación de medias de Tukey con un nivel de significancia del 5%.
To determine different statistical differences, the Tukey measurement comparison test with a significance level of 5% was used.
The measurement found for weaning weight was 188.0±37.7 kg, with a variation coefficient of 16.4%. On the other hand, all the effects were significant (p<0.05) with the exception of birth season. Lastly, the general measurement ± DE for the weight at one year was 290.9±56.8 kg. For this parameter, all the variation sources also had a significant effect (p<0.05).
DISCUSSION Weight at birth. The average birth weight was 32.0±3.2 kg. This result is similar to what was reported in other investigations (4,5,11,14) where it is mentioned that the BW was around 32.0 kg. On the other hand, Cienfuegos-Rivas et al (15) reported an average of 37.7±6.1 kg. Table 1 shows the measurements of BW for BY. It can be seen that the calves born in 1996 had a lower weight at 31.3±3.1 kg, while calves born in 2005 were the heaviest, reaching an average of 33.1±3.5 kg. Several authors (4,5,11,14) mention that the BY affects the BW significantly. These differences in weight can be attributed to changes in the availability of forage and management of different herds, as well as climatic variations from year to year given the increasingly more erratic precipitation. In the same way, calves born during the rainy season weighed an average of 200g more than those born during the dry season (Table 2). These
RESULTADOS El peso promedio general para el PN fue de 32.0±3.2 kg, con un coeficiente de variación de 8.2%. Para este parámetro todas las fuentes de variación tuvieron efecto significativo (p<0.05). La media hallada para el peso al destete fue de 188.0±37.7 kg, con un coeficiente de variación de 16.4%. Por otra parte, todos los efectos resultaron significativos (p<0.05), excepto la época de nacimiento. Por último, la media general ± DE para peso al año fue de 290.9±56.8 kg. Para este parámetro todas las fuentes de variación tambien tuvieron efecto significativo (p<0.05).
DISCUSIÓN Peso al nacer. El peso promedio para PN fue de 32.0±3.2 kg. Este resultado es similar a lo reportado en otras investigaciones (4,5,11,14) donde se menciona que el PN estaba alrededor de los 32.0 kg. Por otra parte, Cienfuegos-Rivas et al (15) reportaron un promedio de 37.7±6.1 kg. En la tabla 1 se muestran las medias de PN por AN. Se puede apreciar que los terneros nacidos en el año de 1996 presentaron los pesos menores con 31.3±3.1 kg, mientras que los terneros que nacieron en el año 2005 resultaron los más pesados alcanzando una media de 33.1±3.5 kg. Diversos autores (4,5,11,14), mencionaron
Hernández-Hernández - Brahman cattle growth
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Table 1. Averages ± DE of weight at birth, weaning and yearlings for Brahman calves by birth year. Date of Birth
Weight at birth (kg) N
Weight at weaning (kg)
Average±DE
N
Weight at a year old (kg)
Average ±DE
N
Average ±DE
1994
359
31.5
2.5
g
362
163.5
28.0
L
359
213.9
42.7
k
1995
605
31.4
3.2
g
619
175.3
33.1
J
605
229.3
52.3
j
1996
761
31.3
3.1
g
828
170.1
32.2
K
761
240.1
51.0
i
1997
1708
31.5
3.1
g
1596
177.0
34.4
ij
1708
244.7
57.8
i
1998
3117
32.1
3.7
f
2478
179.9
34.8
hi
3117
257.7
61.0
h
1999
3522
32.1
3.0
ef
3086
181.4
36.4
hi
3522
262.4
62.8
h
2000
3426
32.4
1.7
cdef
3098
182.5
39.9
gh
3425
276.5
63.6
g
2001
4349
32.6
1.5
abcdef
4182
188.6
37.6
de
4349
283.5
62.4
f
2002
4691
32.9
2.2
abc
4483
194.7
37.6
ab
4690
289.0
61.9
cdef
2003
4802
32.8
2.7
abcd
4885
187.9
41.6
def
4801
285.5
63.2
ef
2004
5030
32.9
3.4
ab
4844
190.6
36.7
cd
5030
289.0
57.6
cdef
2005
4857
33.1
3.5
a
4871
190.7
36.8
cd
4856
291.9
55.9
bcde
2006
4623
32.8
3.6
abc
4724
189.1
40.3
de
4621
288.8
59.1
cdef
2007
4190
32.6
3.5
abcdef
4297
187.9
37.1
def
4190
288.5
53.9
def
2008
4069
32.5
3.5
bcdef
4043
187.2
36.3
ef
4065
292.7
52.2
bcde
2009
3673
32.7
3.6
abcde
3762
193.9
34.1
ab
3673
298.5
48.9
b
2010
3267
33.0
4.5
ab
3384
192.7
34.8
bc
3267
296.5
51.9
bc
2011
1145
32.8
3.1
abcd
1350
196.7
38.4
A
1145
293.4
57.3
bcd
2012
21
32.3
2.5
def
85
185.2
40.2
fg
21
307.7
32.6
a
abcdef averages with different literals are different (Tukey, P=0.05).
results are similar to those obtained by PeredaSolís et al (16), who showed 31.0 kg in the dry season and 32.0 kg for the rainy season. As to be expected, environmental conditions during the rainy season presented a more favorable panorama for cows, providing greater availability of enviorement the quantity and quality of forage that also translates into a greater weight in calves at birth. Similar results were observed for the sex of the calf; in this study the males were larger than the females by 1.8 kg (Table 2). These results are similar to those obtained by Stüve et al (4) and Pereda-Solís et al (16). This difference in weight is attributed to androgenic hormones, particularly testosterone. On the other hand, the effects of BY x BS and BY x SX were significant (p<0.05). With relation to the interaction of BY and BS it was observed that calves born in 2010 in the rainy season were heaviest with 33.6 kg, while those born in 1997 in the rainy season were only 31.8 kg. These results do not agree with those reported by Stüve et al (4).
que el AN afectó de manera significativa el PN. Estas diferencias de peso se pueden atribuir a los cambios en la disponibilidad de forraje y de manejo en los distintos rebaños, así como a las variaciones climáticas entre los años dado que cada vez son más erráticas las precipitaciones. De igual modo, los terneros nacidos durante la época lluviosa pesaron en promedio 200 g más que los nacidos durante la época seca (Tabla 2). Estos resultados son similares a los obtenidos por Pereda-Solís et al (16) quienes observaron para la época seca 31.0 kg y para la época lluviosa 32.0 kg. Como es de suponerse las condiciones ambientales durante la época de lluvias presentan un panorama más favorable para las vacas, al haber una mayor disponibilidad de forraje en cuanto a cantidad y calidad que también se traduce en un mejor peso en los terneros al nacimiento. Resultados similares se observaron para el sexo del ternero, en este estudio los machos superaron a las hembras en 1.8 kg (Tabla 2). Estos resultados son similares a los obtenidos por Stüve et al (4) y Pereda-Solís et al (16). Esta diferencia de peso se le
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Tabla 2. Averages ± DE of weight at birth, weaning and yearlings in Brahman calves by season of birth and sex. Season of Birth
Birth weight (kg)
Weaning Weight (kg)
Weight at one year (kg)
N
Average± DE
N
Average± DE
N
Average± DE
Rainy
25424
32.7± 3.1a
25639
187.8± 37.1
25418
288.3± 58.8a
Dry
32791
32.5± 3.3 b
31338
188.2± 38.1
32787
278.6± 60.7b
Sex Male
42927
Female
15288
33.1± 3.2a 31.3± 2.9b
41389 15588
193.3± 37.2a 173.9± 35.1
42927 15278
296.8± 56.3a 243.5± 52.3b
ab averages with different literals are different (Tukey, p=0.05).
Similarly, with the interaction of BY and SX it is observed that males born in 2005 were the heaviest with 33.1 kg and the females born in 1995 only reached 30.0 kg. This effect is probably due to the weight differences between sexes over the years (16). Weight at weaning. The general average ±DE for weight at weaning (WW) corrected at 205 days was 188.0±37.7 kg. These results agree with those reported in literature (6,11,14). However, Plasse et al (17) found a WW of 147.1±1.0. On the other hand, Montes et al (18) reported a WW of 237.08 kg in Brahman cattle. Table 1 shows averages of WW and BY and it can be appreciated that calves born in 1994 only had an average of 163.5±28.0 kg, while those born during 2011 reached 196.7±38.4 kg, the tendency was to increase the WW as the years of the study passed (2). These results could be due to the fact that the genetic improvement of the Brahman herds is added to the agroecological conditions of production units, which translates into greater weight of the animals (2,16). For the effect of season of birth no significant differences (p>0.05) were found between the dry and rainy season (Table 2). These results differ from those obtained by Stüve et al (4), who observed differences in weaning weight according to the birth month. Regarding sex, it was observed that the male calves were larger with an average of 193.3±34.0 kg in comparison to the females whose average was 173.9±92.0 kg with a difference of 19.4 kg (Table 2). These results are similar to those indicated by Rodríguez et al (6) with 203.8 kg for males, with females at 189.6 kg. On the other hand, Plasse et al (17) highlighted lower weight for a Brahman farm (147.0 kg).
atribuye a las hormonas androgénicas, en particular a la testosterona. Por otro lado, los efectos de las interacciones AN x EN y AN x SX fueron significativas (p<0.05). Con relación a la interacción de AN por EN se observó que los becerros nacidos en el año 2010 y época lluviosa fueron los más pesados con 33.6 kg, mientras que los nacidos en el año 1997 en la época lluviosa solo alcanzaron los 31.8 kg. Estos resultados no concuerdan a los reportados por Stüve et al (4). De igual modo, para la interacción de AN por SX se observó que los machos nacidos en el año 2005 fueron los más pesados con 33.1 kg y las hembras nacidas en el 1995 sólo alcanzaron los 30.0 kg. Este efecto se debe probablemente a las diferencias de peso entre sexos a través de los años (16). Peso al destete. La media general ±DE para peso al destete (PD) corregido a los 205 días fue de 188.0±37.7 kg. Estos resultados concuerdan con los reportados en la literatura (6,11,14). Sin embargo, Plasse et al (17) encontraron un PD de 147.1±1.0. Por otra parte, Montes et al (18) reportaron un PD 237.08 kg en bovinos de raza Brahman. En la tabla 1 se observan las medias de PD por AN y se puede apreciar que los terneros nacidos en el año 1994 sólo promediaron 163.5±28.0 kg, mientras que los nacidos durante el año 2011 alcanzaron 196.7±38.4 kg, la tendencia fue a aumentar el PD conforme transcurrieron los años de estudio (2). Estos resultados pudieron deberse a que aunado al mejoramiento genético de las poblaciones de Brahman, también se han modificado las condiciones agroecológicas en las unidades de producción que se traducen en mejores pesos de los animales (2,16). Para el efecto de época de nacimiento no se encontraron diferencias significativas (p>0.05) entre la época seca y lluviosa (Tabla 2). Estos resultados difieren a los obtenidos por Stüve et al (4) quienes observaron diferencias en el peso al destete, debidos al mes de nacimiento. Con relación al sexo, se observó que los terneros machos fueron superiores con una media 193.3±34.0 kg respecto a las hembras cuya media fue de 173.9±92.0 kg con una diferencia de 19.4 kg (Tabla 2). Estos resultados son similares a los señalados por Rodríguez et al (6) con 203.8 kg para los machos y las hembras de 189.6 kg. Por otra parte, Plasse et al (17) se señalan pesos inferiores para un hato de ganado Brahman (147.0 kg).
Hernández-Hernández - Brahman cattle growth
4433
In the year of birth and seasons of birth interaction, it was observed that calves born in 2011 and the rainy season were the heaviest at 197.1±39.9 kg, while those born in 1994 in rainy season only reached 160.3±27.8 kg. The results agree with those of Rodríguez et al (6) and Plasse et al (17), who explained that the variation in weights is due to the changes in environmental conditions.
En la interacción año de nacimiento por época de nacimiento, se observó que los becerros nacidos en el año 2011 y época lluviosa fueron los más pesados con 197.1±39.9 kg, mientras que los nacidos en el año 1994 en época lluviosa sólo alcanzaron los 160.3±27.8 kg. Los resultados concuerdan con los de Rodríguez et al (6) y Plasse et al (17) quienes explicaron que la variación en los pesos se debía a los cambios en las condiciones ambientales.
The interaction of year of birth and sex of the animal showed that males born in 2002 in the dry season were heavier at 200.0±35.6 kg, and females born in 2002 in the rainy season only reached 156.6±28.4 kg. Other investigators (6) did find differences in the interaction.
La interacción año de nacimiento por el sexo del animal, se observó que los machos nacidos en el año 2002 en la época seca fueron los más pesados con 200.0±35.6 kg y las hembras nacidas en el 2002 en la época lluviosa sólo alcanzaron los 156.6±28.4 kg. Otros investigadores (6) si encontraron diferencias con la interacción.
Weight by year. Lastly, the general average ±DE for weight at one year was 290.9±56.8 kg. These results agree with those cited in literature (2, 11), for example in bovines of the Sardo Negro the YW was 281.4±50.1 kg (19). In the same way, Parra-Bracamonte et al (2) obtained a general average of 261.6±57.4 kg. On the other hand, Velásquez and Álvarez (20) obtained lower results at 237.5 kg. With relation to the YB it can be observed that calves born during 1994 were lighter (213.9±42.7 kg), while calves born in 2012 were heaviest (307.7±32.6 kg). At any rate, in all the evaluated variables a tendency to increase in YW in each successive study year was observed (Table 1). As for the seasons, calves born during the rainy season were the heaviest (288.3±58.8 kg), compared to those born during the dry season (278.6±60.7 kg)(Table 2). These results agree with those obtained by Pereda-Solís et al (16), who found in the rainy season an average of (232.0±3.9 kg) and in the dry season an average of (225.0±12.8) kg. This could be due to adverse climatic conditions and the lack of availability to the quality and quantity of forage during the latter period. As in BW and WW, male calves were heavier with an average of 296.8±56.3 kg when compared to females with an average of 243.5±52.3 kg with a difference of 53.3 kg (Table 2). These results are different from those obtained by Pereda-Solís et al (16) for males (232.0±3.9 kg) and females (208.0±3.1 kg). Similar to BW and WW, in this study the effects of simple interactions were evaluated, observing that these were significant (p<0.05). In the interaction between year of birth and season of birth, it was observed that calves born in 2012
Peso al año. Por último, la media general ±DE para peso al año fue de 290.9±56.8 kg. Estos resultados concuerdan con los citados en la literatura (2, 11), por ejemplo en bovinos de la raza Sardo Negro el PA fue 281.4±50.1 kg (19). De la misma manera, Parra-Bracamonte et al (2) obtuvieron un promedio general de 261.6±57.4 kg. Por otra parte Velásquez y Álvarez, (20) obtuvieron resultados inferiores de 237.5 kg. Con relación al AN se pudo observar que los terneros nacidos durante el año 1994 fueron los más livianos (213.9±42.7 kg), mientras que los terneros que nacieron en el año de 2012 resultaron ser los más pesados (307.7±32.6 kg), de igual modo en las otras variables evaluadas se observa una tendencia a aumentar el PA conforme transcurrieron los años de estudio (Tabla 1). Con relación a las épocas, los terneros nacidos durante la época lluviosa fueron los más pesados (288.3±58.8 kg), respecto a los nacidos en época seca (278.6±60,7 kg)(Tabla 2). Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Pereda-Solís et al (16) quienes encontraron en la época lluviosa un promedio de (232.0±3.9 kg) y para la época seca un promedio de (225.0±12.8) kg. Esto puede deberse a las condiciones climáticas adversas y a la baja disponibilidad tanto en calidad como en cantidad forrajera durante el último período. Al igual que el PN y PD, los terneros machos fueron superiores con una media 296.8±56.3 kg con respecto al promedio de las hembras que fue de 243.5±52.3 kg con una diferencia de 53.3 kg (Tabla 2). Estos resultados difieren a los obtenidos por Pereda-Solís et al (16) para machos (232.0±3.9 kg) y para las hembras (208.0±3.1 kg). Similar al PN y PD, en este trabajo se evaluaron los efectos de las interacciones simples, observándose que todas fueron significativas (p<0.05). En la interacción año de nacimiento por época de
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in the dry season were the heaviest with 307.7 kg, while those born in 2004 in the dry season only reached 279.7 kg. Accordingly, the interaction year of birth and animal sex, it was observed that males born in 2012 were the heaviest at 325.7 kg and females born in 2002 only reached 233.3 kg. Similarly, the interaction between season of birth and sex of the animal significantly affect (p<0.05) calves born in the rainy season were the heaviest at 305.5 kg, while females born in dry season were only 249.5 kg. These results agree with Pereda-Solís et al (16), who observed that males born in the rainy season reached a greater weight (232.0 kg) compared to females born in the dry season (206.0 kg). On the other hand, in a study to determine the effects of young Brahman yearling bulls (grey or red) on age, it was observed that the Red Brahman bulls were heavier with significant differences (20). In conclusion, the factors of year of birth and sex significantly affect BW, WW, and YW and therefore are important to be kept in mind for handling strategies when increasing the efficiency of the productive system. Acknowledgements The authors wish to express their appreciation to the Mexican Association of Zebu Breeders for the facilities used during the study and the National Council for Science and Technology for the scholarship given to the first author to carry out master’s studies in sciences.
nacimiento, se observó que los becerros nacidos en el año 2012 y época seca fueron los más pesados con 307.7 kg, mientras que los nacidos en el 2004 en la época seca sólo alcanzaron los 279.7 kg. De igual modo, en la interacción año de nacimiento por el sexo del animal, se observó que los machos nacidos en el año 2012 fueron los más pesados con 325.7 kg y las hembras nacidas en el 2002 sólo alcanzaron los 233.3 kg. De forma Similar, la interacción época de nacimiento por el sexo del animal, afectó significativamente (p<0.05) los becerros nacidos en la época de lluvia fueron los más pesados con 305.5 kg, mientras que las hembras nacidas en época seca sólo alcanzaron 249.5 kg. Estos resultados concuerdan con PeredaSolís et al (16), quienes observaron que los machos nacidos en época lluviosa alcanzaron un peso mayor (232.0 kg) con respecto a las hembras nacidas en época seca (206.0 kg). Por otro lado, es un estudio para determinar el efecto del grupo racial de los toretes Brahman (gris o rojo) sobre el año de edad, se observó que los toretes Brahman Rojo tuvieron mayor peso con diferencias altamente significativas (20). En conclusión los factores de año de nacimiento y sexo afectan significativamente el PN, PD y PA por lo tanto, son importantes para ser tenidos en cuenta en las estrategias de manejo cuando se quiere incrementar la eficiencia del sistema productivo. Agradecimientos Los autores desean expresar su agradecimiento a la Asociación Mexicana de Criadores de Cebú por las facilidades prestadas para la realización del presente trabajo y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada al primer autor para realizar estudios de maestría en ciencias.
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Maternal-calf relationships and their influence on calves up to 120 days Relaciones materno-filiales y su influencia en terneros hasta los 120 días de edad Emanoela Souza-Conde AL,1 M.Sc, María V. Andrea,1* Ph.D, Marcy Conde L,1 Ing Pesca, Jesus Delgado-Mendez,1 Ph.D, Fagner C. Souza,1 Ing Agr, Mateus Paranhos da Costa JR, 2 Ph.D, Thereza CB de Bittencourt dos SC,3 Ph.D, Kaliane de Oliveira N,1 M.Sc. Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. Centro de Ciencias Agrarias, Ambientales y Biológicas. Rua Rui Barbosa, 710, Centro. Cruz das Almas- BA, Brasil. 2Departamento de Zootecnia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP –Via de Acesso Prof.Paulo Donato Castellane s/n. Jaboticabal, SP, Brasil. 3Universidade Federal da Bahia – UFBA. Escola de Medicina Veterinária. Av. Adhemar de Barros, 500 - Ondina – Salvador-BA, Brasil. *Correspondência: mvander@ufrb.edu.br. 1
Received: October 2013; Accepted: June 2014.
ABSTRACT Objectives. To research parental behavior and measure the weight of Nelore and Guzerat calves up to 120 days of age, collecting data from birth up to the first lactation. Materials and methods. Seven different corporal positions were considered to obtain specific data for each of the following categories: time to stand (TP), time to intend to feed after standing (TPTM), weight at birth (PN), weight at 120 days (P120), and time in contact with the calf (TCC). Additionally, independent variables were also evaluated, organized by class: weight at birth (CPN), number of calvings (CNP), order of calving in relation with the herd (CLPR), time of calving (CHP), and finally, hindering to feed (CTAT). Results. There was a significant result in favor of the Nelore race over the Guzerat race. The statistical averages for Nelore and Guzerat were: Time to stand averaged 71 and 153 minutes; time to intend to feed after standing, 39 minutes for Nelore and of 114 minutes for Guzerat. For variable weight at 120 days, Nelore reached an average of 122 kg, and Guzerat 109 kg. For the time in contact with the calf variable there was no significant variance between races. Conclusions. Results showed the superiority of the Nelore race, considering it better adapted to local environmental conditions. Key words: Behavior, calves, suckling, well being (Source: CAB).
RESUMEN Objetivo. Investigar el comportamiento materno y observar su influencia en el peso de los terneros de las razas Nelore y Guzerat hasta los 120 días de edad, evaluándolos desde su nacimiento hasta el primer amamantamient. Materiales y métodos. Se consideraron siete posturas corporales diferentes, las cuales fueron usadas para obtener las observaciones específicas en cada una de las siguientes categorías: Tiempo para ponerse de pie (TP), Tiempo para intentar lactar después de ponerse de pie (TPTM), peso al nacer (PN), peso a los 120 días (P120) y tiempo de contacto con la cría (TCC). Se evaluaron las variables independientes, organizadas en clases: peso al nacer (CPN); número de partos (CNP); orden del parto en relación al rebaño (CLPR); hora del parto (CHP) y obstaculización de mamada (CTAT). Resultados. Se obtuvo un mejor resultado en los terneros de la raza Nelore en relación a los 4436
Souza-conde - Comparative study of maternal
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de la raza Guzerat. Los promedios estadísticos para Nelore y Guzerat fueron los siguientes: TP con media de 71 y 153 minutos; TPTM de 39 y 114 minutos; P120 con 122 kg para terneros Nelore y 109 kg para los de la raza Guzerat. La variable TCC no obtuvo una diferencia significativa entre las razas. Conclusiones. Los resultados demuestran una superioridad para animales de la raza Nelore, lo que permite inferir que poseen una mejor adaptación a las condiciones ambientales locales. Palabras clave: Amamantamiento, bienestar, comportamiento, terneros (Fuente: CAB).
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
The birth process is a dynamic event and is fundamentally important to mammals since it guarantees the continuity of the species (1). Maternal behavior of different species decisively affects the well-being and development of newborn animals. According to Paranhos et al (2) and Hötzel and Machado Filho (1), changes in maternal behavior are synchronized with the development of calves and with feedback between mother and calf that provokes regularity of a determined behavior. Much of this behavior is activated during the last stages of pregnancy or at the moment of calving.
El proceso de nacimiento es un evento dinámico y de importancia fundamental en la vida de los mamíferos, garantizando la continuidad de la especie (1). El comportamiento materno de diferentes especies influye decisivamente sobre el bienestar y el desarrollo de los animales recién nacidos. De acuerdo con Paranhos et al (2) y Hötzel y Machado Filho (1), los cambios en el comportamiento materno están sincronizados con el desarrollo de las crías, existiendo un feedback en la relación madre-cría que provoca la regularidad de un determinado comportamiento. Muchos de estos comportamientos son activados en las últimas etapas de la gestación o en el exacto momento del nacimiento de la prole.
According to Toledo (3) and Schmidek et al (4), an adequate analysis is necessary in order to evaluate the behavioral characteristics related to maternal abilities and a satisfactory lactation. Two aspects are outstanding: the survival of the calf (including the capacity of the cow to wean a calf every year) and the production of milk (considering production and sanitary characteristics). However, there are controversies over what should really be considered. Regarding maternal ability, two points stand out: the ethological evaluation and the potential growth of the calf. Thus, the phases when the calf is still under maternal care and the later interruption of this relationship at weaning are considered highly important for the future development of the calf. According to Paranhos da Costa et al (5), behavioral patterns of cows and calves during the prenatal period can be associated with survival and the future development of calves and maternal performance of cows in later calvings. The above author mentions the fact that some calves do not feed during the first six hours of life, and that this becomes significant when the percentage of incidence of this event is linked to survival rate, incurring also additional handling difficulties such as artificial lactation, calf adoption, and cow retention to be able to apply forced lactation. With the objective of comparing maternal behavior of bovine breeds in the semiarid region of Bahía as well as observing its influence on
De acuerdo con Toledo (3) y Schmidek et al (4) es necesario un análisis adecuado, con el fin de evaluar las características comportamentales relacionadas a las habilidades maternas y a una lactancia satisfactoria. Dos aspectos llaman la atención: la supervivencia del ternero (incluyendo la capacidad de la vaca de destetar un ternero por año) y la producción de leche (considerando características productivas y sanitarias). Sin embargo, hay controversias sobre lo que realmente debería ser considerado. Dentro de los aspectos de habilidad materna, se destacan dos puntos: la evaluación etológica y el potencial de crecimiento del ternero. De esta manera, las fases en las cuales el ternero todavía se encuentra sobre los cuidados maternos y la posterior interrupción de esta relación en el destete, son consideradas de gran importancia para el futuro desarrollo del ternero. Según Paranhos da Costa et al (5) los padrones comportamentales de vacas y terneros durante el período prenatal pueden estar asociados a la supervivencia, al futuro desarrollo de los terneros y al desempeño materno de las vacas en partos posteriores. Dicho autor menciona sobre el hecho de que los terneros no sean amamantados en las primeras seis horas de vida y de cómo esto asume significativa importancia, una vez que el porcentaje de incidencia de este evento está asociado a la tasa de supervivencia, ocasionando también dificultades extras en el manejo, tales como lactación artificial, adopción de terneros y contención de la vaca para realización de amamantamiento forzado.
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weight at 120 days, calvings of Nelore and Guzerat cows were evaluated on a specific property in the abovementioned state of Brazil under local climactic conditions.
MATERIALS AND METHODS Study location. This study took place at the Hacienda Soraya, in Serra Preta municipality in the Brazilian meso-region of Centro Norte Bahiano, the Feira de Santana micro-region, with semiarid climactic characteristics, 161 km from the capital city, Salvador. The municipality has an extension of 540.9 km2, and the coordinates are: latitude 12º11’15’’S, longitude 39º18’45’’W and altitude 311 m. Samples. Two groups of Zebu animals were defined: 9 Nelore cows and 9 Guzerat cows. The animals were handled in a maternity paddock (2 ha) with “urucroa” (Urochloa moçambisensis) forage pasture under a continuous feed system close to the corral. The animals were taken to the paddock 15 to 20 days before giving birth. Births occurred in the period from March to July. The Nelore and Guzerat breeds are part of the Nelore Brazil and Guzerat Brazil Programs. General description. In order to measure animal behavior, direct observations of the activities of the cows and calves took place during the first hours after calving. Calvings that took place from 4 hours until 23 hours were observed, and observation started when cows presented characteristics that indicated imminent birth. Data began to be recorded after the complete expulsion of the calf, observing body posture and activities of both the cow and the calf. Focal samples and continuous recording was done in order to be able to record observations on events occurring in a short space of time. Following the model adapted from the etiological chart “Etograma de Trabalho” (6), the following behavioral categories for cows and calves were defined in relation to body postures: Lying down. The animal was not supported by any body part, whether on the side or ventral; Standing. The animal was supported on four legs; In circular movement. Moving around its own body, staying in the same place; Move. When the animal moved its legs and left the place it occupied before. The following categories were defined specifically with relation to cows in post-partum activities:
Con el objetivo de comparar razas bovinas en lo que respecta al comportamiento maternal en la región semiárida de Bahía, así como observar su influencia en el peso a los 120 días de edad, fueron evaluados partos de vacas Nelore y Guzerat, en una determinada propiedad del mencionado estado brasileño, con condiciones climáticas locales.
MATERIALES Y MÉTODOS Lugar de estudio. Este trabajo fue realizado en la Hacienda Soraya, situada en el municipio de Serra Preta, insertada en la meso-región brasileña del Centro Norte Bahiano, micro-región de Feira de Santana, con características climáticas de semiárido, a 161 km de la ciudad capital Salvador. El municipio tiene una superficie de 540.9 km2, con latitud de 12º11’15’’S, longitud de 39º18’45’’W y altitud de 311 m. Muestras. Fueron definidos dos grupos de animales de razas cebúes: 9 vacas Nelore y 9 vacas Guzerat. Los animales fueron manejados en el potrero de maternidad (2 ha) compuesto de pastura de forraje “urucroa” (Urochloa moçambisensis) bajo el sistema de pasto continuo, próximo al corral. Dichos animales fueron conducidos al potrero alrededor de 15 a 20 días antes del parto. Las pariciones ocurrieron en el período de marzo a julio. El plantel de las razas Nelore y Guzerat forma parte de los Programas Nelore Brasil y Guzerat Brasil. Descripción general. Con el objetivo de medir el comportamiento de los animales, fueron realizadas observaciones directas a las actividades de vacas y terneros durante las primeras horas subsiguientes al parto. Fueron acompañados los partos que ocurrieron desde las 4 h hasta las 23 h. La observación fue iniciada cuando la vaca presentó características que indicaban inminencia de parto. El registro de los datos se inició después de la expulsión completa del ternero, observándose la postura corporal y las actividades desarrolladas, tanto por la vaca como por el ternero. Se utilizó el proceso de muestra focal y registro continuo, con la finalidad de facilitar las observaciones que ocurrían en un corto espacio de tiempo. Siguiendo el modelo adaptado del gráfico etológico o “Etograma de Trabalho” (6), fueron definidas las siguientes categorías comportamentales para vacas y terneros, con relación a sus posturas corporales: Acostada. El animal no se apoyaba en ninguno de sus miembros, pudiendo estar en decúbito lateral o ventral; Parada. El animal se encontraba apoyado sobre los cuatro miembros;
Souza-conde - Comparative study of maternal Contact with calves. Activities consisting of smelling, licking and pushing calves, in direct contact; Without apparent activity. When the cow is motionless, without any apparent movement; Feeding difficulties. Activities that constitute impeding access of the calf to the udder; backing up, walking in circles, kicking and butting the calf. Regarding calf activities, the following categories were also considered: Lying on side. When in lateral lying position; Lying down. When in sternal position; First movement. When it moved its head, turning to get into the sternal position; Standing. Time taken to stand up; Time the calf takes to begin to feed. Trying to feed. When the calf found the udder and tried to attach itself; Lactation. When the calf had the udder in its mouth, sucking. Recording was terminated immediately after the calf was able to start sucking or, if this did not occur, after five hours of observation. Cases that needed help (two Guzerat cows) were not included in the data recorded. After field activities, data was recorded and variables calculated. When the calf was not able to feed, when it could not get up within six hours, 315 minutes for latencies (standing and trying to feed) was attributed, which was defined by the total observation time plus 15 more minutes. When these behavioral categories took more than 5 hours of observation, the maximum observation time value was assumed as representative of latency to stand up (TP), as well as latency to attempt feeding after standing up (TPTM). Statistical analysis. Two sets of variables were defined: one for calf behavior and weight gain after 120 days, and the other for behavior of cows when with calves. Four variables were considered for calves: Time to stand up (TP). Time that the calf took from birth until standing on its four legs, firmly or unbalanced; Time to try to feed after standing up (TPTM). Defined as the time the calf takes after standing up to attempt attaching itself to the udder; Weight at birth (PN). Weight of the calf the day following birth; Weight at 120 days (P120). Weight of the calf at 120 days.
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En movimiento circular. Haciendo movimientos alrededor de su propio cuerpo, permaneciendo en el mismo local; Desplazamiento. Cuando el animal movía las patas de lugar y salía del lugar que ocupaba anteriormente. Específicamente en las vacas fueron definidas las siguientes categorías, relacionadas con las actividades post parto: Contacto con la cría. Actividades que consistieron en oler, lamer y empujar a la cría, estando en contacto directo; Sin actividad aparente. Cuando la vaca se encontraba quieta, sin ningún movimiento aparente; Perturbación del amamantamiento. Actividades que consistieron en impedir el acceso del ternero a la ubre, con movimientos de retroceder, andar en círculos, dar patadas y cabezazos a la cría. Con respecto a las actividades de los terneros, fueron consideradas también las siguientes categorías: Acostado. Cuando se encontraba en posición de decúbito lateral; Echado. Cuando estaba en decúbito esternal; Primer movimiento. Cuando movía la cabeza, girando para quedarse en posición de decúbito esternal; De pie. Tiempo que ha demorado para ponerse de pie; Tiempo que el ternero ha llevado para comenzar a mamar. Intento de mamar. Cuando el ternero encontraba la ubre e intentaba prenderse de una de ellas; Lactación. Cuando el ternero estaba con la ubre en la boca, realizando movimientos de succión. Los registros terminaron inmediatamente después de que el ternero consiguió realizar su primera mamada o cuando ésta no ocurría, después de cinco horas de observación. Los casos que necesitaron de ayuda (dos vacas de la raza Guzerat) no integraron el registro de datos. Al final de las actividades de campo, los datos fueron registrados y las variables calculadas. Cuando el ternero no consiguió mamar, o sea, no consiguió levantarse en el lapso de seis horas, se le atribuyó el valor de 315 minutos para las latencias (ponerse de pie e intentar mamar) lo cual fue definido por el tiempo total de observación, sumándole 15 minutos más. Cuando estas categorías de comportamiento tuvieron un tiempo superior a las 5 horas de observación, fue asumido el valor máximo de tiempo de observación como
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For cows, the variable was: Contact time with the calf (TCC). Defined as the percentage of time that the cow was in contact with the calf in relation to total observation time in activities such as licking, smelling and touching the calf, caring for and encouraging calf movement. Values obtained in the field were grouped into classes (from 1 to 6, differentially) from which the following independent variables were created: CPN (calving weight class): 1 – calves from 25 to 30 kg, 2 from 31 to 35 kg and 3 from 36 to 40 kg; CNP (calving number class): 1 – first calving, 2 – second calving y 3 – third calving or more; CLPR (calving location in relation to herd class): 1 – for calvings 0 to 10 meters from the flock, 2 – for calvings 11 to 30 m and 3 – for calvings greater than 30 m; CHP (hour of calving class): 1 – for calves born between 4 hours and 7 hours; 2 – between 8 hours and 10 hours; 3 – between 11 hours and 13 h; 4 – between 14 hours and 15 hours; 5 – between 16 hours and 18 hours and, finally, 6 – between 18 hours and 23 hours; CTAT (feeding obstacle class): 1 – obstacles and 2 – no obstacles. For PN variables (in kg), TP (in minutes), TPTM (in minutes) and P120 (in kg), variance analysis was done (ANOVA), using the version 9.1 statistical program (7), as well as measurement estimates, minimum and maximum values with their respective standard deviations, and finally, error calculation of these variables. After this analysis the F Test was applied at a level of 5% probability for comparing averages, in order to detect differences present in the F Test in both breeds (Nelore y Guzerat) for TP, TPTM, P120.
representativo de la latencia para ponerse de pie (TP), así como también, de la latencia para intentar mamar después de ponerse de pie (TPTM). Análisis estadístico. Fueron definidos dos conjuntos de variables: uno para el comportamiento de los terneros y la ganancia de peso de los mismos a los 120 días de edad, y otro para el comportamiento de las vacas junto con los terneros. Para los terneros variables:
fueron consideradas cuatro
Tiempo para ponerse de pie (TP). Tiempo que el ternero llevó desde el nacimiento hasta permanecer apoyado en los cuatro miembros, de manera firme o no equilibrado; Tiempo para intentar mamar después de ponerse de pie (TPTM). Definido como el tiempo que el ternero ha llevado después de quedarse de pie para iniciar el intento de sostenerse en la ubre; Peso al nacer (PN). Peso del ternero al día siguiente del nacimiento; Peso a los 120 días (P120). Peso del ternero a los 120 días de vida. Para las vacas, la variable fue: Tiempo de contacto con la cría (TCC). Definida como el porcentaje del tiempo en que la vaca estuvo en contacto con la cría en relación al tiempo total de observación, en actividades como lamer, oler, tocar el ternero, cuidando e incentivando los movimientos de los terneros. Los valores obtenidos en campo fueron agrupados en clases (de 1 a 6, diferentemente), de las cuales fueron originadas las siguientes variables independientes:
RESULTS
CPN (clase peso al nacimiento): 1 – para terneros de 25 a 30 kg, 2 de 31 a 35 kg y 3 de 36 a 40 kg; CNP (clase números de partos): 1 – primer parto, 2 – segundo parto y 3 – tercer parto en adelante; CLPR (clase local de parto en relación al rebaño): 1 – para partos distantes de 0 a 10 metros del rebaño , 2 – para partos de 11 a 30 m y 3 – para partos arriba de 30 m; CHP (clase hora del parto): 1 – para terneros nacidos entre las 4 h y las 7 h; 2 – entre las 8 h y las 10 h; 3 – entre las 11 h y las 13 h; 4 – entre las 14 h y las 15 h; 5 – entre las 16 h y las 18 hy, finalmente, 6 – entre las 18 h y las 23 h; CTAT (clase obstaculización de mamada): 1 – obstaculiza y 2 – no obstaculiza.
Regarding the weight and mortality of calves (Figure 1), there was a greater frequency of
Para las variables PN (en kg), TP (en minutos), TPTM (en minutos) y P120 (en kg) fueron
The TCC variable was classified as follows: 1 – for calved cows that maintained contact from 0 to 20%; 2 – from 20 to 40%; 3 - from 40 to 60%; 4 – from 60 to 80% and 5 – above 80%. These percentages were determined from the total observed time versus the time that the cow was in contact with the calf.
Souza-conde - Comparative study of maternal calves with intermediate weights (31 to 35 kg), indicating the absence of mortality in the entire analyzed herd (0% for the two breeds). It was observed that approximately 80% of the cows had multiple births. This fact made comparing the results of both analyzed breeds easier. In relation to CTAT, approximately 90% of Nelore cows did not impede their calves when these tried to feed while 20% of Guzerat cows created some obstacles when their calves tried to feed (Figure 2). In this study, it can be observed that more than 55% of Nelore cows calved at night (between 18 hours and 23 hours) while with the Guzerat cows (60%) calving was distributed in the first two classes (class 1 – between 4 hours and 7 hours and class 2 – between 8 hours and 10 hours) coinciding with the results found by Toledo (8) for positive TP correlation, where probably better temperatures and air humidity helped improve imprinting. In this investigation it was possible to observe that the TPR value was superior in Guzerat cows, where 80% of them gave birth at a minimum distance of 30 m from the flock (Figure 3). Results presented in table 1 show significant values for the studied TP, TPTM and P120 variables, where the Nelore cows were outstanding in comparison to the Guzerat breed. Table 1. Average values of the variables (PN: Birth weight; TP: Time to stand; TPTM: Time to feed after standing; P120: Weight at 120 days; TCC: Time in contact with calf), found in the two breeds observed. Breeds
PN ( Kg)
Nelore
33
a
Guzerat
33
a
TP (min.) 71 153
a b
TPTM (min.) 39 114
a b
P120 (Kg)
TCC
122
a
4
a
109
b
3
a
The average followed by the same letter does not differ statistically, using the F Test, p<0.05.
Average TP values of 71.22 and 153 minutes were found for the Nelore and Guzerat breeds, respectively. Considering this variable, some Nelore cows presented minimum values of 28 minutes, while the values were 67 minutes for the Guzerat cows (Table 2). This information was also obtained by Toledo (8) and Schmidek et al (4). In table 2 the Guzerat cows presented minimum and maximum TPTM values of 34 and 315
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realizados análisis de variancia (ANOVA), utilizando el programa estadístico SAS, versión 9.1 (7), así como estimadas las medias, los valores de máximo y mínimo, con sus respectivos desvíos estándar y, finalmente, fue calculado el error de estas variables. Después de este análisis fue aplicado el Test F al nivel de un 5% de probabilidad para la comparación de promedios, con el fin de detectar las diferencias presentadas en el Test de F en ambas razas (Nelore y Guzerat), para TP, TPTM, P120. La variable TCC fue clasificada en clases: 1 - para vacas paridas que mantuvieron contacto de 0 a 20%; 2 – de 20 a 40%; 3 - de 40 a 60%; 4 – de 60 a 80% y 5 – arriba de 80%. Estos porcentajes fueron determinados a partir de la relación del tiempo total observado versus el tiempo en que la vaca estuvo en contacto con la cría.
RESULTADOS
Con relación al peso y mortalidad de terneros (Figura 1), se obtuvo una mayor frecuencia de nacimientos con pesos intermedios (31 a 35 kg), indicando ausencia de mortalidad en todo el rebaño analizado (0% para las dos razas). Fue posible observar que aproximadamente el 80% de las vacas fueron multíparas. Este hecho facilitó la comparación de los resultados para ambas razas analizadas. Con relación a CTAT, aproximadamente el 90% de las vacas Nelore no impidieron a sus terneros cuando estos intentaban mamar y el 20% de las vacas Guzerat crearon algunos obstáculos para que sus crías intentaran mamar (Figura 2). En el presente trabajo, se puede observar que más del 55% de las vacas Nelore parieron en el período nocturno (entre las 18 h y las 23 h), mientras que en las vacas Guzerat (60%) los nacimientos se distribuyeron en las dos primeras clases (clase 1– entre las 4 h y las 7 h y clase 2– entre las 8 h y las 10 h), coincidiendo con los resultados encontrados por Toledo (8), con los mismos resultados de correlación positiva para TP, donde probablemente las temperaturas más amenas y la humedad del aire pudieron mejorar el “imprinting”, o impronta. En esta investigación fue posible observar que el valor de la TPR fue superior en las vacas Guzerat, donde el 80% de ellas parieron a una distancia mínima de 30 m con relación al rebaño (Figura 3).
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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015 Herd 1 Nelore
% Calf
% Of Cows
Herd 2
Class birthweight
Guzerat
Classes difficulty sucking
Figure 1. CPN values (1 – 25 to 30 kg, 2 – 31 to 35 kg and 3 – 36 to 40 kg), in percentages for the two breeds analyzed.
Figure 2. CTAT values (1 – difficulty to feed, 2 – no difficulty to feed), in percentages for the two analyzed breeds.
Nelore Nelore
Guzerat % Of Cows
% Of births
Guzerat
Local childbirth class relative to herd Contact time with the calf (TCC)
Figure 3. TPR values (1 – for births at a distance from 0 to 10 m; 2 – from 11 to 30 m; 3 – above 30 m), in percentages for the two analyzed breeds.
Table 2. Average, standard deviation (de), average, maximum and minimum values for the characteristics (PN: Weight at birth; TP: Time to stand up; TPTM: Time to feed after standing up; P120: Weight at 120 days; TCC: Time in contact with calf), presented significant results regarding the analyzed breeds. Characteristic
Average
DE
Average Minimum Maximum
TP (min.) Nelore
71
Guzerat
153
a
b
33.38
73.5
28
119
98.62
102.42
67
315
TPTM (min.) Nelore
39
11.39
39.00
21
53
114
b
Guzerat
114.76
74.14
34
315
Nelore
122
a
7.35
124.12
109
131
Guzerat
109
b
11.23
110.75
86
122
a
P120 (kg)
The average followed by the same letter does not differ statistically, using the F Test F, p<0.05
Figure 4. TCC values (1 – for cows that had contact from 0 to 20%; 2 - 20 to 40%; 3 - 40 to 60 %; 4 - 60 to 80%; 5 – more than 80%), for the two analyzed breeds.
Los resultados presentados en la tabla 1 muestran valores significativos para las variables estudiadas TP, TPTM y P120, donde las vacas Nelore se sobresalieron con relación a las de la raza Guzerat. En el estudio fueron encontrados valores promedios de TP de 71.22 y de 153 minutos para las razas Nelore y Guzerat, respectivamente. Considerando esta variable, algunas vacas Nelore presentaron valores mínimos de 28 minutos, mientras que en las Guzerat dichos valores fueron de 67 minutos (Tabla 2). Estas mismas informaciones también fueron obtenidas por Toledo (8) y Schmidek et al (4). En la tabla 2 se observa que las vacas Guzerat presentaron para la variable, valores mínimos y máximos de TPTM de 34 y de 315 minutos, respectivamente. Estos valores posiblemente están asociados a la agitación de las vacas, las mismas que dificultan el comportamiento del ternero. Como se puede observar en la misma tabla, los datos de las vacas Nelore también mostraron valores significativos para esta variable (mínimo de 21 y máximo de 53 minutos). Se deduce que pueda existir una asociación entre TP, con valores promedios de 71 minutos para los animales Nelore
Souza-conde - Comparative study of maternal minutes, respectively, for this variable. These values are possibly associated with the cow’s agitation, which affects the behavior of the calf. As can be observed in the same table, data on Nelore cows also showed significant values for this variable (minimum 21 and maximum 53 minutes). It is deduced that an association could exist between TP, with average values of 71 minutes for Nelore animals and 153 minutes for Guzerat and TPTM animals, with average values of 39 minutes for Nelore cows and 114 minutes for Guzerat. The TCC variable (Figure 4) is numerically superior in Nelore cows, with class 3 variations (those that maintained 40 to 60% contact with the calves) up to class 5 (with 80% contact). Regarding the weight of the animals, values found in the study show the significant effect of the abovementioned variables (TP, TPTM) in connection with P120, confirming the maternal ability of the Nelore cows to birth calves that are heavier at 120 days. The average values were 122 kg and the standard deviation 7.35, while the Guzerat breed presented an average weight of 109 kg and a standard deviation of 11.23. The TCC variable, in spite of having presented greater values for Nelore cows, was not significant.
DISCUSSION Keeping in mind the calvings, questions arise concerning aspects such as: weight, calf behavior, cow behavior, birth hour, among others. The affirmation is that lighter calves perform better, have easier births, and avoid distocic or difficult births. However, studies have revealed that lighter weight calves with below average indexes present slower behavior, higher mortality index, more lactation difficulties (60%), and also higher TP (4). Cows recognizing calves, an increase in the number of births and the age of the cow all acquire a positive correlation with parental commitment (8). The first moments a cow has with her calf are fundamentally important, generating an experience for both (9). This characteristic has a direct influence on the calf’s survival, since feeding time and colostrum quality could be compromised. Its ingestion is essential, since it contains proteins, casein, vitamins, minerals and immunoglobulins that will play a physiological and functional role in the neonatal development (8,10).
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y 153 minutos para los de la raza Guzerat y TPTM, con valores promedios de 39 minutos para las vacas Nelore y 114 minutos para las Guzerat. Con relación a la variable TCC (Figura 4), ésta se mostró numéricamente superior en las vacas Nelore, ocurriendo variaciones de la clase 3 (las que mantuvieron de un 40 a un 60% de contacto con la cría) hasta la clase 5 (con un 80% de contacto). Con relación al peso de los animales, los valores encontrados en el trabajo demuestran el efecto significativo de las variables antes citadas (TP, TPTM) con relación al P120, confirmando la habilidad materna de las vacas Nelore en criar terneros más pesados a los 120 días. Sus valores promedios fueron de 122 kg y el desvío estándar de 7.35, mientras que los de la raza Guzerat presentaron un peso promedio de 109 kg y desvío estándar de 11.23. La variable TCC, a pesar de haber presentado mayores valores para las vacas Nelore, no fue significativa.
DISCUSIÓN Tomando en consideración los nacimientos de los terneros, surgen dudas sobre algunos aspectos, tales como: peso, comportamiento de los terneros, de sus madres, hora de su nacimiento, entre otros. Es común la afirmación de que terneros livianos presentan mejores desempeños, provocando partos más fáciles, evitando partos distócicos o laboriosos. Sin embargo, los estudios han revelado que terneros poco pesados, con índices abajo de la media, presentan comportamientos más lentos, mayores índices de mortalidad, mayores índices de fallas en la lactación (60%), repitiéndose también en mayores TP (4). El reconocimiento de la cría por la madre, el aumento del número de partos y la edad de la vaca, adquieren una correlación positiva para el compromiso de parentesco (8). Los primeros instantes de la vaca con el ternero son de fundamental importancia, generando la experiencia de ambos (9). Esa característica posee influencia directa en la supervivencia del ternero, pues aumenta el tiempo para mamar y la calidad del calostro puede estar comprometida. Su ingestión es imprescindible, pues contiene proteínas, caseína, vitaminas, minerales, y principalmente las inmunoglobulinas que actuarán en el desarrollo fisiológico y funcional de los neonatos (8,10). Las vacas poseen una característica peculiar con relación al horario de parto. Los estudios de Schmidek (4) y Toledo (8) informan que es posible observar un gran número de los mismos, ocurriendo en las horas más frescas del día, como en los horarios nocturnos, ocasionando sensación de confort térmico y muchas
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Cows develop peculiar characteristics when calving. Studies done by Schmidek (4) and Toledo (8) report that many can be observed during the cool hours of the day and at night, giving a sensation of thermic comfort and often of tranquility and safety, and result in more births at these times. Regarding calving location related to distance from the herd, two extremely important periods must be kept in mind: the acknowledgment period, or response capacity (when pregnant animals are attracted to cows giving birth) and the selectivity period (when interference in the behavior of cow and calf can occur). Also, the farther the calving occurs with relation to the herd, greater is the performance of mother and calf (5). According to literature (8), calving that occurs at a minimum distance of 30 m from the herd is satisfactory when considering the relation between the distance from the herd and the time the cows dedicate to the calves. However, this relationship was not observed in Guzerat cows, who presented lower TCC values. The time to stand is a determining behavior for good bovine performance, and the success of this variable will have optimum results, including locating the udder and the first feeding. It is interesting to highlight that the care and experience of the cow will be decisive, since these activities help regulate body temperature, avoiding hypothermia and activating blood circulation, breathing and the motor and sensorial system (11-14). Contact between the cow and the calf begin in the moments before birth begins with mechanical stimulus such as the dilatation of the cervix to facilitate the birth of the calf (1). These stimuli can possibly result in the cow’s search to have greater contact with the calf, affecting the agility of the newborn, since greater contact means that the calf will stand quicker and it is hoped that it will try to feed quicker, thus lowering TPTM values. This variable, along with TP, could also show the newborn’s strength. To select animals for improvement, some evaluation criteria must be followed, since genetic evaluation is one of the most important tools presently used (15). Within those criteria the most outstanding is: weight at 120 days (P120), which has a direct correlation with maternal ability, determining a connection between the cow’s performance and the growth of the calf (6,10).
veces tranquilidad y seguridad, favoreciendo la concentración de pariciones en esas horas. Tratándose de la localización del parto con relación a la distancia del rebaño, hay que tomar en consideración dos períodos extremamente importantes: el período del reconocimiento, o capacidad de respuesta (cuando ocurre atracción de animales gestantes por vacas parturientas) y el período de selectividad (cuando puede ocurrir interferencia en el comportamiento de la madre y de su cría). Así, cuanto más distante ocurra el parto con relación al rebaño, mejor será el desempeño de la madre y su ternero (5). Según la literatura (8), la ocurrencia del parto a una distancia mínima de 30 m del rebaño es satisfactorio cuando se observa una relación entre la distancia del rebaño y el tiempo que estas madres dedican a las crías. No obstante, esta relación no fue observada en las vacas Guzerat que presentaron los menores valores de TCC. Considerando que el tiempo para ponerse de pie es un comportamiento determinante para el buen desempeño del bovino, el éxito de esta variable desencadenará resultados óptimos en otras actividades, tales como localizar las ubres y realizar la primera mamada. Es interesante resaltar que el cuidado y experiencia de la madre serán decisivos, pues estas actitudes ayudan a la manutención de la temperatura corporal, no permitiendo que la cría sufra una hipotermia, sino que ocurra en la activación de la circulación sanguínea y respiratoria y activación del sistema motor y sensorial (11-14). El contacto de la madre con su cría se desencadena en los instantes que anteceden al parto, a través de estímulos mecánicos, como la dilatación del cérvix para facilitar el paso del ternero (1). Estos estímulos posiblemente lograrán que la madre busque tener un mayor contacto con la cría, influyendo en la agilidad del neonato, pues cuanto mayor el contacto, más rápido el ternero se levantará y se espera también que intente mamar más rápidamente, para de esta manera conseguir que se obtengan valores menores de TPTM. Esta variable, conjuntamente con la TP, podrá también caracterizar el vigor del recién nacido. Para seleccionar animales con miras al mejoramiento, se necesita seguir algunos criterios de evaluación, siendo la evaluación genética una de las herramientas más importantes usadas actualmente (15). Entre tales criterios, el que más se destaca es: el peso a los 120 días (P120), donde el mismo tiene correlación directa con la habilidad materna, determinando la preferencia por el desempeño de la vaca con el crecimiento del ternero (6,10).
Souza-conde - Comparative study of maternal
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Lira et al (16) suggest giving greater attention and selection to animals with greater preweaning weight, since it is the period of life when the animal grows and develops quicker, contributing to the reduction of production costs at that age.
Lira et al (16) sugieren mayor atención y selección en los animales con mayor potencial para pesos predestete, pues es el período de la vida en el cual el animal presenta mayor velocidad de crecimiento y desarrollo, contribuyendo con reducción en los costos de producción en la edad de aprovechamiento.
This variable (P120) is one of the most important to be analyzed, since it influences TP, TPTM and TCC variables (17). The variable (P120) will reflect characteristics such as weight at 18 months, precocity and canal performance.
Esta variable (P120) es una de las más importantes a ser analizadas, pues sufre influencia de las variables TP, TPTM y TCC (17). La variable (P120) reflejará en características como peso a los 18 meses, precocidad y rendimiento de la canal.
Maternal behavior observed showed superiority in the Nelore breed, especially in TP, TPTM and P120 variables.
Los comportamientos maternales observados demostraron una superioridad para la raza Nelore, especialmente en las variables TP, TPTM y P120.
Studies can contribute to minimize production costs, as well as using rational handling techniques oriented to increasing the weight of the calves and promoting herd improvement.
Los estudios pueden contribuir para minimizar los costos de producción, conjuntamente con la utilización de técnicas de manejo racionales, orientadas a aumentar el peso de los terneros y promover el mejoramiento del rebaño.
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4447-4454, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL
Blood gas analysis in Mangalarga Marchador horses with colic Análisis de gases sanguíneos en caballos Mangalarga Marchador con cólico Tiane F. Castro,1 M.Sc, Félix González,1* Ph.D. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Veterinária, Av. Bento Gonçalves, 9090, Porto Alegre, 94540-000, Brasil. *Correspondencia: felixgonzalez.ufrgs@gmail.com 1
Received: April 2014; Accepted: November 2014.
ABSTRACT Objective. This study aims to distinguish blood gas changes in horses with colic syndrome in which small or large intestine is affected. Materials and methods. Thirty Mangalarga Marchador horses were assessed, divided into groups according to the affected intestinal segment in episodes of colic syndrome (ECS): a group (N=10) of horses suffering from ECS with lesions only in the small intestine, a group (N=10) of horses suffering from ECS with lesions only in the large intestine and a group (N=10) of healthy horses (control). All the animals with ECS were submitted to exploratory laparotomy in order to establish the intestinal segment affected. Blood samples were collected by venipuncture, before surgical procedure to determine sodium, potassium, chloride, urea, glucose, hematocrit, hemoglobin, pH, carbon dioxide partial pressure, total carbon dioxide concentration, bicarbonate, base excess and anion gap. Results. No significant changes were found in plasma levels of Na+, K+, Cl-, pCO2 and anion gap in any type of ECS. Horses with small intestine injuries presented higher levels of tCO2, urea and bicarbonate compared to those with large intestine injuries and to the control group, as well as higher levels of glucose and base excess than the control group. Conclusions. Horses with colic syndrome bearing small intestine injuries show wider variations in the blood gas parameters than horses with large bowel lesions. Key word: Acid-base imbalance, electrolytes, large intestine, small intestine (Source:CAB).
RESUMEN Objetivo. El presente estudio tuvo como objetivo diferenciar las alteraciones de gases sanguíneos que ocurren en casos de cólico equino con comprometimiento en intestino delgado o grueso. Material y métodos. Fueron evaluados 30 caballos Mangalarga Marchador con sindrome de colico equino (SCE) divididos en grupos según el segmento intestinal afectado con episodios de cólico: un grupo de animales (N=10) con SCE solo en el intestino delgado, un grupo (N=10) con SCE solo en el intestino grueso y un grupo (N=10) de animales sanos (control). Todos los animales fueron sometidos a laparotomía exploratoria para identificar el segmento intestinal afectado. Muestras de sangre fueron recogidas antes del procedimiento quirúrgico para determinar la concentración: sodio, potasio, cloro, urea, glucosa, hematocrito, hemoglobina, pH, presión parcial de dióxido de carbono, concentración total de dióxido de carbono bicarbonato, exceso de base y anión gap. Resultados. 4447
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No fueron observadas alteraciones significativas en los niveles plasmáticos de Na+, K+, Cl-, pCO2 ni anión gap, independiente de la localización intestinal del SCE. Los equinos con lesiones en el intestino delgado presentaron niveles superiores de tCO2, urea y HCO3- con relación a los que tuvieron lesiones de intestino grueso y al control, así como niveles superiores de glucosa y de exceso de base con relación al control. Conclusiones. Equinos con síndrome de cólico con lesión de intestino delgado presentaron variaciones más amplias en los parámetros de gases sanguíneos que equinos con cólico afectados en el intestino grueso. Palabras clave: Ácido-básico, desequilibrio, electrolitos, intestino delgado, intestino grueso (Fuente: CAB).
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Equine colic syndrome (ECS) or acute abdomen is a multifactorial syndrome that results in deep abdominal pain in horses, with a diversified etiology varying from excessive gas yielded from feed fermentation to obstruction and bowel torsion, commonly requiring surgical intervention (1). The diagnosis of ECS is relatively easy considering the features of the abdominal pain, which cause changes in animal behavior, but its etiology is yet a challenge for veterinarians, especially in the definition of the affected intestinal segment.
El síndrome de cólico equino (SCE) o abdomen agudo es un síndrome multifactorial que ocasiona dolor abdominal intenso en los caballos con una etiología variada entre el exceso de gas producto de la fermentación alimenticia hasta obstrucción y torsión intestinal, lo que comúnmente requiere de una intervención quirúrgica (1). El diagnóstico de SCE es relativamente fácil teniendo en cuenta las características del dolor abdominal que causa cambios en el comportamiento del animal, pero su etiología es todavía un reto para los veterinarios, especialmente la definición del segmento intestinal afectado.
The use of supporting diagnosis tools, like hemogram, blood gas analysis and biochemical profile can give information concerning inflammatory focuses, dehydration or hipovolemia, toxemia, and electrolytic, acidbase or metabolic imbalances, providing a more precise diagnosis, an adequate treatment and a more accurate prognosis (2). Practically all disorders affecting the gastrointestinal tract lead to imbalances in blood pH, bicarbonate, sodium, potassium and chloride that may be immediately corrected to avoid the risk of death. The acid-base and hydro-electrolytic evaluation, as well as the blood gas condition allow choosing the more appropriated treatment for the animal with colic syndrome. Blood gas analyzes the partial O2 and CO2 pressure as well as bicarbonate and pH (3), becoming the most appropriate method for evaluating the acid-base balance of organic fluids and their probable disturbances (4). Blood gas evaluation is a very useful parameter for determining the severity of the colic syndrome and also may helps in the identification of bowel lesions (1). The present work had the aim of evaluating changes in blood gas parameters in Mangalarga Marchador horses suffering from colic syndrome, discriminating the intestinal bowel affected, in order to obtain additional tools for clinical and surgical assessment.
El uso de herramientas de diagnóstico, como hemogramas, gasometría arterial y perfil bioquímico, pueden ofrecer información sobre focos inflamatorios, deshidratación o hipovolemia, toxemia y desequilibrios electrolíticos, acido-base o metabólicos, proporcionando un diagnóstico más preciso, un tratamiento adecuado y un pronóstico más exacto (2). Prácticamente todos los trastornos que afectan el tracto gastrointestinal conducen a desequilibrios en el pH sanguíneo, bicarbonato, sodio, potasio y cloruro que pueden corregirse inmediatamente para evitar el riesgo de muerte. La evaluación del equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base, así como la condición de gases sanguíneos, permiten elegir el tratamiento más apropiado para el animal con síndrome de cólico. Por medio de los gases arteriales se analiza la presión parcial de O2 y CO2 así como el bicarbonato y pH (3), convirtiéndose en el método más apropiado para evaluar el equilibrio acido-base de los fluidos orgánicos y sus probables perturbaciones (4). La gasometría arterial es un parámetro muy útil para determinar la severidad del síndrome de cólico y puede también ayudar en la identificación de lesiones intestinales (1). El presente estudio tuvo como objetivo evaluar los cambios en los parámetros de gases sanguíneos en caballos Mangalarga Marchador con síndrome de cólico, haciendo una diferenciación del intestino afectado, con el fin de obtener herramientas
Castro - Blood gas analysis in Mangalarga Marchador horses
MATERIAL AND METHODS Animals. All the horses in this work were selected following criteria of clinical signs of colic syndrome at a referred veterinary hospital. The animals were Mangalarga Marchador horses from 3 to 15 years old, from both sexes (18 males and 12 females). The location of the intestinal section affected was established through laparotomy procedure. The animals were organized in three groups as follows: animals with lesions only in the small intestine (N=10); animals with lesions only in the large intestine (N=10); and healthy animals (control group) (N=10). Sampling and analysis. Blood samples (2 mL), from the jugular vein, were collected anaerobically through heparinized tubes (Becton Dickinson, São Paulo, Brazil) for blood gas analysis before the surgical procedure. The analysis was done using a portable analyzer (I-Stat 1, Abbott, Princeton, USA), with specific cartridges following the manufacturer´s instructions. The equipment was automatically calibrated before the samples analysis. The cartridge used was EC8+, which is able to determine sodium (Na+), potassium (K+), chloride (Cl-), urea, glucose, hematocrit, hemoglobin, pH, partial carbon dioxide pressure (pCO2), total carbon dioxide concentration (tCO2), bicarbonate (HCO3), base excess (EB) and anion gap (AG). Statistical analysis. Statistical analysis was performed through Anova test, relating the intestinal bowel affected with the studied parameters. Quantitative variables (mean and standard deviation) were analyzed using the Tukey test, considering a significance level of 5%, using the Instat program.
RESULTS The values obtained for hemogasometric analysis according to the affected intestinal section are showed in table 1. Plasma levels of Na+, K+, Cl-, pCO2 and anion gap did not show any significant alteration (p> 0.05) no matter which was the affected bowel segment. Glucose concentration was higher in 65% of the animals suffering from ECS, compared to the reference values (maximum reference value: 115 mg/dL). Glucose and urea concentrations were higher (p<0.05) in the group of horses with small intestine lesions compared to animals with large intestine lesions and to control animals. The values of hematocrit and hemoglobin did
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adicionales para realizar una evaluación clínica y quirúrgica.
MATERIALES Y MÉTODOS Animales. Todos los caballos en este estudio fueron seleccionados siguiendo los criterios de los signos clínicos del síndrome de cólico en un hospital veterinario. Los animales eran caballos Mangalarga Marchador de 3 a 15 años de edad, de ambos sexos (18 machos y 12 hembras). La ubicación de la sección intestinal afectada fue establecida por medio un procedimiento laparoscópico. Los animales fueron organizados en tres grupos de la siguiente manera: los animales con lesiones únicamente en el intestino delgado (N=10); los animales con lesiones únicamente en el intestino grueso (N=10); y los animales sanos (grupo de control) (N=10). Muestreo y análisis. Se tomaron muestras de sangre (2 mL) de la vena yugular anaeróbicamente a través de tubos heparinizados (Becton Dickinson, Sao Paulo, Brasil) para el análisis de gases arteriales antes del procedimiento quirúrgico. El análisis se realizó utilizando un analizador portátil (I-Stat 1, Abbott, Princeton, Estados Unidos) con cartuchos específicos y siguiendo las instrucciones del fabricante. El equipo fue calibrado automáticamente antes del análisis de las muestras. El cartucho utilizado fue un EC8+, por medio del cual es posible determinar la concentración de sodio (Na+), potasio (K+), cloruro (Cl-), urea, glucosa, hematocrito, hemoglobina, pH, presión parcial de dióxido de carbono (pCO2), concentración total de dióxido de carbono (tCO2), bicarbonato (HCO3), exceso de base (EB) y brecha aniónica (BA). Análisis estadístico. El análisis estadístico fue desarrollado mediante la prueba Anova, en relación con el intestino afectado con los parámetros estudiados. Las variables cuantitativas (media y desviación estándar) fueron analizadas mediante la prueba de Tukey, utilizando un nivel de significancia del 5% y el programa Instat.
RESULTADOS En la tabla 1 se muestran los valores obtenidos a partir del análisis de hemogasométrico según la sección intestinal afectada. Los niveles plasmáticos de Na+, K+, Cl-, pCO2 y brecha aniónica no mostraron ninguna alteración significativa (p>0.05) independientemente del segmento intestinal afectado. La concentración de glucosa fue mayor en un 65% de los animales con
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Table 1. Blood gas analysis, hematocrit, hemoglobin, urea and glucose values of horses with colic syndrome classified according to the affected intestinal segment. The values are presented as mean ± standard deviation. Parameter (reference values*) N Na (132-146 mmol/L) +
K+ (2.4–4.7 mmol/L) Cl (96-102 mmol/L) -
pH (7.35–7.45) pCO2 (38-46 mmHg) tCO2 (25-32 mmol/L) HCO3- (22-26 mmol/L) Base excess (-4)-(+4) Anion Gap (6-14 mmol/L) Hematocrit (32-48%) Hemoglobin (11-19 g/dL) Urea (23-55 mg/dL) Glucose (75-115 mg/dL)
Small intestine lesions 10 136.5 ±2.17 3.24 ±0.46 98 ±3.09 7.45 ±0.05 45.64 ±3.65 32.3a ±5.23 31.47a ±4.94 7.3a ±5.52 9.9 ±2.64 43.2 ±10.84 14.78 ±3.75 47.1a ±18.4 157.6a ±81.3
Large intestine lesions
Control (healthy horses)
10 135. 4 ±2.41 3.38 ±0.68 98.6 ±1.65 7.44 ±0.04 44.26 ±2.21 28.5b ±1.90 26.79b ±3.43 5.9a ±4.91 10.4 ±2.59 42.4 ±8.04 14. 88 ±2.98 33.1b ±8.1 114.5b ±31.5
10 134.7 ±2.21 3.35 ±0.61 98.9 ±1.85 7.41 ±0.02 42.72 ±1.44 28.5b ±1.96 23.95b ±1.01 2.1b ±1.45 9.4 ±2.01 38.9 ±3.96 12.89 ±1.35 36.6b ±7.7 94.6b ±6.6
Different letter in the same row indicates significant difference (p< 0.05) among groups. * Kaneko et al (5).
not show differences among all groups of horses (p>0.05). Venous blood pH was higher in 40% of the ECS cases than in the control animals. However, no differences in blood pH were found between the two groups of horses with colic syndrome (p>0.05). The tCO2 was higher in horses with small intestine ECS compared to the other two groups of animals (p<0.05). The bicarbonate levels were increased in 70% of the horses with colic syndrome (maximum reference value: 26 mmol/L). It was observed that the highest the bicarbonate value, the more severe the clinical condition of the horses. The group of horses with small bowel lesions had the highest values of bicarbonate compared to the other groups of horses (p<0.05). In 60% of the animals with ECS the value of base excess was above +4 (reference value: -4 to +4), with higher values in the group with small bowel lesions (p<0.05).
DISCUSSION This work shows evidences of blood gas alterations in horses with colic syndrome. The blood concentration of sodium was at the reference values in all the animals of this study, ECS and control, without any difference between the two groups of horses with colic syndrome. This was also the observation of Navarro et
SCE, en comparación con los valores de referencia (valor de referencia máximo: 115 mg/dL). Las concentraciones de glucosa y urea fueron más altas (p<0.05) en el grupo de los equinos con lesiones en el intestino delgado en contraste con los animales con lesiones del intestino grueso y a los animales de control. Los valores de hemoglobina y hematocrito no evidenciaron diferencias entre todos los grupos de caballos (p>0.05). El pH sanguíneo fue mayor en el 40% de los casos con SCE que en los animales de control. Sin embargo, no se encontraron diferencias en el pH sanguíneo entre los dos grupos de caballos con síndrome de cólico (p>0.05). El valor de tCO2 fue mayor en los caballos con SCE en el intestino delgado en comparación con los otros dos grupos de animales (p<0.05). Los niveles de bicarbonato se incrementaron en un 70% en los caballos con el síndrome de cólico (valor de referencia máximo: 26 mmol/L). Se observó que entre mayor fuera el valor de bicarbonato más grave era la condición clínica de los caballos. El grupo de caballos con lesiones en el intestino delgado presentó los valores más altos de bicarbonato en relación con los otros grupos de equinos (p<0.05). En el 60% de los animales con SCE el valor de exceso de base fue superior a +4 (valor de referencia: -4 a +4), con valores más altos en el grupo con lesiones en el intestino delgado (p<0.05).
DISCUSIÓN Este estudio muestra evidencias de alteraciones en los gases arteriales en caballos con cólico. La concentración sanguínea de sodio se encontraba en los valores de referencia en todos los animales de este estudio, en los grupos de SCE y de control, sin ninguna diferencia entre los dos grupos de equinos con síndrome de cólico. Esta fue también la observación que hizo Navarro et al (6), quien estudió las alteraciones electrolíticas en caballos con trastornos gastrointestinales y donde no se encontraron cambios en las concentraciones de sodio en varios tipos de lesiones intestinales. Ihler et al (7) tampoco encontraron diferencias en el sodio en la sangre al hacer una comparación entro los caballos que sobrevivieron o fallecieron debido a casos de SCE. Durante una situación clínica de SCE, la anorexia y adipsia causada por el dolor severo pueden causar una disminución del líquido extracelular acompañado de pérdida de agua en el cuerpo, aunque con una pérdida pequeña de electrolitos (8). Esto podría conducir a hipernatremia por hemoconcentración, pero no se produjo dicha situación. Como en el presente estudio, Ferreira (8) no encontró variaciones significativas en los niveles
Castro - Blood gas analysis in Mangalarga Marchador horses
al (6) who studied electrolytic alterations in horses with gastrointestinal disorders and did not find changes in sodium concentrations in several types of intestinal lesions. Ihler et al (7) also did not found differences in blood sodium comparing horses that survived or deceased in cases of ECS. During a clinical situation of ECS, anorexia and adipsia due to the severe pain might cause a depletion of extracellular fluid with loss of body water, although with small loss of electrolytes (8). This might lead to hypernatremia by hemoconcentration, but such a situation did not occur. As in the present study, Ferreira (8) did not find significant variations in potassium levels in horses submitted to temporary fistulization at the cecum. Di Filippo et al (9) found lesser serum potassium values in horses that survived to colic syndrome compared to those that died and to the control group. That work was done with animals observed at the moment of the clinical examination, same as our study. The reduction of potassium values in colic cases may be attributed to less feed intake or to gastrointestinal losses (10). Chloride blood levels also were not affected by the clinical condition of ECS, as in the work of Navarro et al (6). Costa et al (11) observed significant decrease in serum chloride in horses with jejunum isquemia. Glycemia was higher in horses with lesions in the small bowel. This result was also observed by Di Filippo et al (9) who found hyperglycemia in horses that survived to a colic syndrome. In another study (12) hyperglycemia was evident in animals with induced intestinal obstruction. Hyperglycemia is a frequent finding observed in cases of ECS and is generally associated with an unfavorable prognostic (13). This is related to the high secretion of catecholamines as a consequence of excitation, pain and stress, typical episodes of ECS (14). Urea blood concentration is regulated by two events: synthesis rate in the liver and clearance rate by kidney. Synthesis rate depends on protein intake and catabolism. Clearance rate depends on glomerular filtration rate and reabsorption activity at the renal tubules (15). In dehydration conditions, as occur in colic syndrome, glomerular filtration rate is diminished resulting in pre-renal azotemia. In the present study, urea values were higher in horses with small bowel lesions, which suggest a greater compromise in that kind of lesions. Di Filippo et al (16) did not find variations in hepatic and renal blood markers in horses submitted to experimental intestinal obstruction. In agreement with those results,
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de potasio en caballos sometidos a fistulización temporal en el intestino ciego. Di Filippo et al (9) encontraron valores menores de potasio en suero en los caballos que sobrevivieron al síndrome cólico en comparación con aquellos que murieron y con el grupo de control. Dicho estudio se realizó observando a los animales en el momento del examen clínico, al igual que en nuestro estudio. La reducción en los valores de potasio en casos de cólico puede atribuirse a un menor consumo de alimentos o pérdidas gastrointestinales (10). Los niveles de cloruro en la sangre tampoco se vieron afectados por la condición clínica de SCE, como en el estudio de Navarro et al (6). Costa et al (11) observaron una disminución significativa del cloruro en suero en caballos con isquemia del yeyuno. La glucemia fue mayor en los equinos con lesiones en el intestino delgado. Este resultado también fue observado por Di Filippo et al (9), quienes reportaron hiperglucemia en los caballos que sobrevivieron a un síndrome cólico. En otro estudio (12) se evidenció hiperglucemia en animales con una obstrucción intestinal inducida. La hiperglucemia es un hallazgo frecuente observado en casos de SCE y se asocia generalmente con un pronóstico desfavorable (13). Esto está relacionado con una alta secreción de catecolaminas como consecuencia de la excitación, el dolor y el estrés, los cuales son episodios típicos de SCE (14). La concentración de urea en la sangre está regulada por dos eventos: la tasa de síntesis en el hígado y la tasa de eliminación por el riñón. La tasa de síntesis depende del catabolismo y de la ingesta de proteínas. Tasa de eliminación depende de la tasa de filtración glomerular y de la actividad reabsorción en los túbulos renales (15). En condiciones de deshidratación, como ocurre en el síndrome cólico, la tasa de filtración glomerular se ve reducida lo que tiene como resultado azotemia prerrenal. En este estudio, los valores de urea fueron mayores en los caballos con lesiones en el intestino delgado, lo que sugiere un mayor compromiso en ese tipo de lesiones. Di Filippo et al (16) no encontraron variaciones en los marcadores hepáticos y renales en equinos sometidos a una obstrucción intestinal experimental. De acuerdo con estos resultados, Granot et al (17) encontraron que los caballos con cólico no mostraron valores diferentes de urea en comparación con los animales que murieron o sobrevivieron. A partir de nuestros resultados sería posible considerar que los caballos con síndrome cólico causado por lesiones situadas en el intestino delgado pueden sufrir una condición más severa del desequilibrio hídrico que los caballos con afectaciones en el intestino grueso.
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Granot et al (17) found that horses with colic impaction did not have different values of urea compare to animals that died or that survived. From our results it would be probable that horses with colic syndrome caused by lesions situated at the small intestine may be suffering from a more severe condition of water imbalance than horses with compromised large intestine. In the present study, the hematocrit values were not different between individuals with colic syndrome and control animals. An increase in the hematocrit may occur in cases of equine colic syndrome as a result of hemoconcentration, dehydration and shock (14). Datt and Usenik (18) found significant hematocrit increase in horses after 12 hours of duodenum obstruction. It seems that hematocrit elevation in gastrointestinal disorders in horses may be more frequent in most severe cases. Concomitant with the result of the hematocrit, hemoglobin values were not significantly different among the groups of animals. However, horses with colic syndrome together had hemoglobin values greater than control horses. This result is in agreement with Silva (12), who found higher hemoglobin values in horses with colic syndrome than in healthy animals. It is plausible that hemoglobin could be a more sensitive indicator than hematocrit of gastrointestinal disorders of horses (18,19). In our study, 40% of the horses with colic syndrome had increased blood pH in relation to the control group. Other authors also found elevated blood pH in horses with colon and jejunum obstructions (11,19), which was associated with increased bicarbonate concentration. In the present study, the rise in blood pH was linked not only with higher values of bicarbonate but also with more positive values of base excess in both groups of horses with colic syndrome, especially in animals with small intestine lesions. All together 60% of the colic affected horses had base excess values above +4, more severely when lesions occurred in the small intestine. Similar finding was observed in cases of horses with experimental intestinal obstruction (11). The tCO2 values had significant rise in horses with small bowel lesions. The tCO2 parameter expresses the alkaline reserve, with bicarbonate as its main component. A high tCO2 indicates the presence of metabolic alkalosis, and a low tCO2 indicates a metabolic acidosis (14). These increments in tCO2 and alkaline reserve in horses with small bowel lesions, were not expected in the situation of pain and stress in horses with colic, which should promote breath rate increment and decrease in pCO2 (respiratory alkalosis). In contrast with our findings, other authors found metabolic
En este estudio, los valores de hematocrito no fueron diferentes entre individuos con síndrome cólico y los animales del grupo de control. Se podría presentar un aumento en el hematocrito en casos de síndrome cólico equino como consecuencia de la hemoconcentración, deshidratación y shock (14). Datt y Usenik (18) encontraron un aumento significativo en hematocrito en los equinos 12 horas después de la obstrucción del duodeno. Parece ser que la elevación del hematocrito en trastornos gastrointestinales en caballos puede ser más frecuente en los casos más severos. De manera concomitante con el resultado del hematocrito, los valores de hemoglobina no fueron significativamente diferentes entre los grupos de animales. Sin embargo, los equinos con síndrome cólico presentaron valores de hemoglobina mayores que los caballos del grupo de control. Este resultado coincide con Silva (12), quien encontró valores más altos de hemoglobina en caballos con síndrome cólico que en animales sanos. Es plausible que la hemoglobina sea un indicador más sensible que el hematocrito para trastornos gastrointestinales en caballos (18,19). En nuestro estudio, el 40% de los caballos con síndrome cólico tenía un pH sanguíneo mayor en relación con el grupo de control. Otros autores también encontraron un pH sanguíneo elevado en caballos con obstrucciones en el colon y yeyuno (11,19), lo que se asoció con una mayor concentración de bicarbonato. En el presente estudio, el aumento de pH en la sangre estaba vinculado no sólo con valores más altos de bicarbonato, sino también con valores más positivos de exceso de base en ambos grupos de caballos con síndrome cólico, especialmente en los animales con lesiones en el intestino delgado. El 60% de los caballos afectados por cólicos mostraron valores de exceso de base superiores a +4, más severamente cuando las lesiones se produjeron en el intestino delgado. Se observó un hallazgo similar en casos de equinos con una obstrucción intestinal experimental (11). Los valores de tCO2 evidenciaron un aumento significativo en los caballos con lesiones en el intestino delgado. El parámetro tCO2 expresa la reserva alcalina, siendo el bicarbonato su componente principal. Un valor alto de tCO2 es indicativo de la presencia de alcalosis metabólica, y un valor bajo de tCO2 indica acidosis metabólica (14). Estos incrementos en los valores de tCO2 y la reserva alcalina en caballos con lesiones en el intestino delgado fueron inesperados en los casos de dolor y estrés en caballos con cólico, lo que debe estimular un incremento en la velocidad de respiración y una disminución de pCO2 (alcalosis respiratoria). De manera contrastante con nuestros resultados, otros autores encontraron acidosis metabólica en equinos que padecen de síndrome cólico (9), asociado con una disminución de HCO3-
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acidosis in horses suffering from colic syndrome (9), associated with a decline in HCO3- and base excess attributed to hipovolemia and generation of lactic acid. The anion gap was within the reference values in 90% of the horses with colic syndrome. According to the anion gap equation [AG=(Na++K+) – (HCO3- + Cl-)] the AG values should be diminished, because the term HCO3- is augmented and sodium, potassium and chloride did not have alterations, as it was showed in our work. More research should be done to evaluate if there are other anion alterations in cases of equine colic syndrome. In conclusion, horses with colic syndrome do not show significant alterations in plasma electrolytic parameters (Na+, K+, Cl-) or in the levels of pCO2 and anion gap, independently of the intestinal location of the lesion. Horses with small bowel lesions have higher values of tCO2, HCO3-, base excess, urea and glucose than horses with large bowel lesions, suggesting a condition of metabolic alkalosis and more severe stress.
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y exceso de base atribuido a hipovolemia y a la generación de ácido láctico. La brecha aniónica se encontraba dentro de los valores de referencia en el 90% de los caballos con síndrome cólico. De acuerdo con la ecuación de la brecha aniónica [BA=(Na+ + K+)–(HCO3+Cl-)]. Los valores de BA deben ser disminuidos porque el término HCO3- se ha incrementado y no se presentaron alteraciones en los valores de sodio, potasio y cloruro, como se demostró en nuestro estudio. Se debe efectuar una mayor investigación para evaluar si existen otras alteraciones aniónicas en casos de síndrome cólico equino. En conclusión, los equinos con síndrome cólico no mostraron alteraciones significativas en los parámetros de electrolítico plasmático (Na+,K+,Cl-) o en los niveles de pCO2 y la brecha aniónica, independientemente de la ubicación de la lesión intestinal. Los caballos con lesiones en el intestino delgado mostraron valores más elevados de tCO2, HCO3-, exceso de base, urea y glucosa que los equinos con lesiones en el intestino grueso, lo que sugiere una condición de alcalosis metabólica y estrés más severo.
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4455-4460, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL
Biochemical detection of E-ADA on Neospora caninum tachyzoites and the effects of a specific enzymatic inhibitor Detección bioquímica de E-ADA en taquizoitos de Neospora caninum y los efectos de un inhibidor enzimático específico Alexandre A. Tonin,1* Ph.D, Aleksandro S. Da Silva,2 Ph.D, Victor C. Pimentel,3 Ph.D, Daniele Zanini,3 Ph.D, Maria Rosa C. Schetinger,3 Ph.D, Vera M. Morsch,3 Ph.D, Giovana Camillo,4 M.Sc, Fernanda S.F. Vogel,4 Ph.D, Sonia T.A. Lopes,1 Ph.D. Universidade Federal de Santa Maria, Departamento de Clínica de Pequenos Animais, Santa Maria, Brasil. 2Universidade do Estado de Santa Catarina, Departamento de Zootecnia, Chapecó, Brasil. 3 Universidade Federal de Santa Maria, Departamento de Química, Santa Mria, Brasil. 4Universidade Federal de Santa Maria, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Santa Maria, Brasil. *Correspondence: tonin.aat@gmail.com 1
Received: April 2014; Accepted: October 2014.
ABSTRACT Objective. This study aimed to investigate the presence and activity of the ecto adenosine deaminase (E-ADA) enzyme in tachyzoites of Neospora caninum (Nc-1 strain), as well as to assess the activity of a well-known E-ADA inhibitor, the deoxycoformycin. Materials and methods. The parasites were grown in cell culture, being subsequently separated in a pellet of tachyzoites, on which the E-ADA activity was tested using the concentrations 0 (control), 0.2, 0.4 and 0.8 mg mL-1. Results. The E-ADA showed high activity, progressively increasing its activity according to the enhancement of the protein concentration. The test was carried out with different concentrations of deoxycoformycin, showing that it was able to inhibit the E-ADA present on the free form of the parasite. Conclusions. Based on these results we conclude that the E-ADA is present on tachyzoites of N. caninum, and deoxycoformycin is able to inhibit this enzyme. In this sense, knowing the negative impact of N. caninum on reproductive issue in cattle (mainly abortion), might it is an alternative in order to deal with this parasitic infection. Key words: adenosine deaminase, deoxycoformycin, neosporosis (Source: CAB, MeSH).
RESUMEN Objetivo. Este estudio tuvo como objetivo investigar la presencia y la actividad de la adenosina deaminasa (E-ADA) en taquizoitos de Neospora caninum (Nc-1 cepa), así como ensayar un conocido inhibidor de estas enzimas. Material y métodos. Los parásitos se multiplicaron en cultivo celular y posteriormente fueron separados en un sedimento de taquizoitos. La actividad de E-ADA fue probada en el parásito, usando concentraciones de 0 (control), 0.2, 0.4 y 0.8 mg mL-1. Resultados. El E-ADA tenía una alta actividad aumentó progresivamente de acuerdo con la concentración de proteínas. La prueba se llevó a cabo con diferentes concentraciones del inhibidor E-ADA (desoxicoformicina) y fue 4455
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capaz de inhibir la presente E-ADA en el parásito. Conclusiones. Por la observación de los resultados se concluye que la enzima E-ADA está presente en taquizoítos de N. caninum, y desoxicoformicina es capaz de inhibir la acción de la enzima. En este sentido, conocer el impacto negativo del parásito en los problemas productivos y reproductivos en el ganado (principalmente abortos), estos resultados pueden ser una alternativa para envitar esta enfermedad parasitaria. Palabras clave: adenosina deaminase, desoxicoformicina, neosporosis (Fuente: CAB, MeSH).
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Neospora caninum (N. caninum) is an obligate, intracellular, coccidian, protozoan parasite of the phylum Apicomplexa (1). Infection by N. caninum can cause the clinical disease known as neosporosis, which most notably presents itself as abortion in cattle (2). The main form of N. caninum that causes the acute infection in the intermediate host is the tachyzoite (3). At the early stage of infection, tachyzoites probably modulate host cell functions, while late stages probably are targeted for destruction by the host, diminishing their pathogenicity (4-6). The biological cycle of N. caninum is very similar to the one generated by Toxoplasma gondii (1,7). Literature has described different proteins (mainly belonging to kinase’s family) as a regulator of the biological cycle of T. gondii (8), as well as it can occur in N. caninum. The effective treatment of neosporosis is unknown, thus proteins and enzymes present in the parasite may became a parallel line of studies, in order to test inhibitors as an alternative way for treatment. The purinergic system, between various components, presents the enzyme ecto adenosine deaminase (E-ADA). E-ADA is considered to be a key enzyme in the purine metabolism, catalyzing the irreversible deamination of adenosine and deoxyadenosine to inosine and deoxyinosine, respectively, and closely regulating extracellular adenosine and inosine concentrations (9,10). In this sense, 2’-Deoxycoformycin, a potent inhibitor of E-ADA, is increasingly used as a tool to investigate adenosine metabolism (10). However, on N. caninum, E-ADA has not been studied yet, becoming the main purpose of this study. Thus, the aim of this study was to investigate the presence and the activity of E-ADA on N. caninum tachyzoites, as well as to assess the effects of deoxycoformycin on the activity of this enzyme.
El Neospora caninum (N. caninum) es un parásito obligado, intracelular, coccidio, protozoo del phylum Apicomplexa (1). Las infecciones de N. caninum puede conllevar a la enfermedad clínica conocida como neosporosis, que se presenta principalmente durante el aborto en bovinos (2). La forma principal de N. caninum que causa la infección aguda en el huésped intermediario es el taquizoíto (3). En las etapas tempranas de la infección, los taquizoítos modulan probablemente la funciones de la célula huésped, mientras que en las etapas finales son probablemente destruidos por el anfitrión, disminuyendo su patogenicidad (4-6). El ciclo biológico de N. caninum es muy similar a aquel generado por Toxoplasma gondii (1.7). En la literatura se han descrito diferentes proteínas (principalmente pertenecientes a la familia de quinasas) como un regulador del ciclo biológico de T. gondii (8), así como puede presentarse en N. caninum. No existe un tratamiento efectivo conocido para la neosporosis, de forma que las proteínas y enzimas presentes en el parásito pueden convertirse en una línea paralela de estudios para poner a prueba los inhibidores como un tratamiento alternativo. La adenosina desaminasa (E-ADA) se presenta en el sistema purinérgico, entre varios componentes. Se considera que la E-ADA es una enzima clave en el metabolismo de la purina, catalizando la desaminación irreversible de la adenosina y desoxiadenosina a inosina y deoxinosina, respectivamente y regulando estrechamente las concentraciones extracelulares de adenosina e inosina (9,10). En este sentido, la 2’-Deoxicoformicina, un inhibidor potente de E-ADA, es utilizada cada vez más como una herramienta para investigar el metabolismo de la adenosina (10). Sin embargo, la E-ADA no ha sido estudiado aún en N. caninum, convirtiéndose en el objetivo principal de este estudio. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar la presencia y la actividad de E-ADA en los taquizoítos de N. caninum, así como evaluar los efectos de la deoxicoformicina en la actividad de esta enzima.
MATERIAL AND METHODS Local. The experiment was conducted at the Laboratory of Animal Parasitology, at Universidade Federal de Santa Maria, city of Santa Maria, Brazil.
Tonin - Biochemical detection of E-ADA on Neospora caninum
Neospora caninum isolate. Neospora caninum tachyzoites (NC-1 isolate) were maintained by continuous passage in Vero cell culture, using standard procedures. Parasites were harvested from tissue culture, and viability was determined by trypan blue exclusion (11), followed by counting three aliquots in a Neubauer chamber. For inoculation, organisms were adjusted to the appropriate concentration (1x106 tachyzoites/ mL). Tachyzoites were washed three times in PBS, adjusted at pH 7.4 and NC-1 tachyzoites were separated into pellets for E-ADA analysis. Preparation of tachyzoites. The pellet of tachyzoites was resuspended in 50 mmol/L per mM of phosphate buffer; pH 6.5 in order to measure the E-ADA activity. The protein concentration of the tachyzoites was measured by the method of Bradford (12) with bovine serum albumin used as the standard. The concentration of proteins in the parasite was expressed as mg mL-1. E-ADA activity in tachyzoites. To measure the E-ADA activity in tachyzoites of N. caninum, it was used the technique described to evaluate the E-ADA activity on trypomastigotes forms of Trypanosoma evansi (13). In this sense, E-ADA activity was measured spectrophotometrically on tachyzoites of N. caninum through the modified method of Guisti and Galanti (14). The enzymatic reaction was started by addition of 500 µL of 21 mmol/L adenosine as substrate, and it was incubated for 1h at 37°C. The reaction was stopped by adding 1.5 ml of 106/0.16 mM phenol–nitroprusside to the reaction mixture, which was immediately mixed with 1.5 ml of 125/11 mM alkaline-hypochlorite (sodium hypochlorite) and vortexed. The ammonia released would react with alkaline-hypochlorite and phenol in the presence of a catalystsodium nitroprusside to produce indophenol (a blue color) and the concentration of ammonia is directly proportional to the absorbance of indophenol read at 620 nm. Ammonium sulfate of 75 µM was used as ammonium standard. The specific activity is reported as U/mg of protein. The estimation was performed in triplicate. Tests with E-ADA inhibitor: deoxycoformycin. For this test it was evaluated the action of deoxycoformycin (Pentostatin ® - Tocris) on tachyzoites of N. caninum. The amount of 0.8 mg mL-1 of protein from the parasite was used in order to measure the E-ADA activity. For these tests it was used four concentrations: 10 nM, 1nM, 25 pM and 15 pM deoxycoformycin. The dose of inhibitor was set in a pilot study and all the tests were carried out in triplicate.
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MATERIALES Y MÉTODOS Local. El experimento se realizó en el Laboratorio de Parasitología Animal, en la Universidad Federal de Santa María, en la ciudad de Santa María, Brasil. Neospora caninum aislada. Los taquizoítos de Neospora caninum (NC-1 aislada) fueron dispuestos en un cultivo de células Vero por paso continuo utilizando procedimientos estándar. Los parásitos fueron cosechados a partir de un cultivo de tejidos y se determinó su viabilidad por exclusión de azul de tripano (11), seguido por tres alícuotas en una cámara de Neubauer. Para su inoculación, los organismos se ajustaron a la concentración adecuada (1x106 taquizoítos/mL). Los taquizoítos fueron lavados tres veces en PBS, ajustados a un pH de 7.4 y los taquizoítos de NC-1 fueron separados en pellets para el análisis de E-ADA. Preparación de los taquizoítos. El pellet de taquizoítos fue puesto en una suspensión de 50 mmol/L por mM de tampón fosfato a un pH de 6.5 para medir la actividad de E-ADA. La concentración proteica de los taquizoítos se midió por el método de Bradford (12) utilizando albúmina de suero bovino como estándar. La concentración proteica en el parásito se expresó como mg mL-1. Actividad de E-ADA en los taquizoítos. Para medir la actividad de E-ADA en los taquizoítos de N. caninum se utilizó la técnica descrita para evaluar la actividad de E-ADA en formas de tripomastigotos de Trypanosoma evansi (13). En este sentido, la actividad de E-ADA fue medida espectrofotométricamente en los taquizoítos de N. caninum mediante el método modificado de Guisti y Galanti (14). Se inició la reacción enzimática agregando 500 µL de 21 mmol/L de adenosina como sustrato y se incubó durante 1h a 37°C. Se detuvo la reacción añadiendo 1.5 ml de 106/0,16 mM de fenol-nitroprusiato a la mezcla de reacción, la cual se mezcló inmediatamente con 1.5 ml de 125/11 mM de hipoclorito alcalino (hipoclorito sódico) y fue posteriormente sometida a agitación vorticial. El amoniaco liberado reaccionó con el hipoclorito alcalino y el fenol en presencia de un catalizador de nitroprusiato sódico para producir indofenol (color azul), de esta forma la concentración de amoníaco será directamente proporcional a la absorbancia del indofenol a 620 nm. Se utilizó 75 µM de sulfato de amonio como el estándar de amonio. Se reportó la actividad específica como U/mg de proteína. Se realizaron tres estimaciones. Pruebas con inhibidor de E-ADA: deoxicoformicina. En esta prueba se evaluó la acción de la deoxicoformicina (Pentostatina® Tocris) en los taquizoítos de N. caninum. Se utilizó 0.8 mg mL-1 de proteína del parásito para medir la actividad
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Statistical analysis. The results of the E-ADA activity on tachyzoites were submitted to analysis of variance followed by Duncan test (p<0.05). The analyses were performed using SAS statistical package (SAS Institute, Cary, NC, USA).
RESULTS The pellet tachyzoites of N. caninum eluted on phosphate buffer showed a protein concentration of 0.88 mg mL-1, while the E-ADA activity was assessed at concentrations of 0, 0.2, 0.4, and 0.8 mg mL-1. In this study the presence of E-ADA on tachyzoites of N. caninum was detected biochemically, showing that in the lowest and highest concentrations of proteins tested, the ADA activity remained between 0.92 and 1.93 U/mg of protein, respectively (Figure 1A). Tests with deoxycoformycin on E-ADA activity showed that this inhibitor acts on the E-ADA own of the N. caninum. Inhibition o f p a ra s i t e E -A D A a c t i v i ty wa s d i r e c t l y proportional to the largest concentration of deoxycoformycin used (Figure 1B).
de E-ADA. Se utilizaron cuatro concentraciones para estas pruebas: 10 nM, 1nM, 25 pM y 15 pM de deoxicoformicina. En un estudio piloto se utilizó la dosis del inhibidor y todas las pruebas fueron realizadas en tres ocasiones. Análisis estadístico. Los resultados de la actividad de E-ADA en los taquizoítos se sometieron a un análisis de varianza, seguido de la prueba de Duncan (p<0.05). Los análisis se realizaron utilizando el paquete estadístico SAS (SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.).
RESULTADOS En el pellet de taquizoítos de N. caninum eluido en tampón fosfato se observó una concentración proteica de 0.88 mg mL-1, mientras que la actividad de E-ADA fue analizada en concentraciones de 0, 0.2, 0.4 y 0.8 mg mL-1. En este estudio se detectó bioquímicamente la presencia de E-ADA en taquizoítos de N. caninum, demostrando que en las concentraciones más altas y más bajas de las proteínas probadas la actividad de ADA se mantuvo entre 0.92 y 1.93 U/mg de proteína, respectivamente (Figura 1A). Las pruebas con deoxicoformicina en la actividad de E-ADA demostraron que este inhibidor actúa sobre el mismo E-ADA del N. caninum. La
U/mg of protein
A - E-ADA activity in N. caninum tachyzoites 3 2 1 0
0.2
0.4
0.8
Concentration of parasite (mg dL-1)
U/mg of protein
B - Tests with E-ADA inhibitor: 0.8 mg dL-1 of protein in parasite 3 2 1 0
0 nM
15 pM
25 pM
1 nM
10 nM
Concentrations of deoxycoformycin
Figure 1. Biochemical detection of adenosine deaminase activity in tachyzoites of N. caninum. Relation among E-ADA activity and parasite protein concentration (A) and tests with E-ADA inhibitor (deoxycoformycin) in tachyzoites of N. caninum (B).
Tonin - Biochemical detection of E-ADA on Neospora caninum
DISCUSSION Probably, on the parasite, ADA is in charge of the regulation of adenosine concentration and, consequently, inosine, as occurs in other mammals (9). Our results are corroborated by other studies, for example, using the same method, the E-ADA was detected in trypomastigotes of T. evansi (13). Also, according literature, the N. caninum tachyzoites express a potent type-I nucleoside triphosphate hydrolase (15), similar T. gonddi. In this sense, it was already demonstrated that T. gondii is capable of synthesizing pyrimidine nucleosides (16). Then, purine is needed for the parasite growth, and, for this reason, it must be recovered from the host cell (17), as well as from the protozoa. Inhibition of E-ADA activity in N. caninum was directly proportional to the largest concentration of deoxycoformycin used. This finding suggests the need for further studies, in order to test whether the E-ADA inhibitor may have harmful effect on N. caninum, which could bring improvements on how the chemotherapy against this parasite is conducted. In a study with other protozoa, it was observed that when E-ADA inhibitor was only used in the treatment of T. brucei in mice, the curative action was not observed and the animals died as a consequence of the disease (18). However, studies showed that the treatment with an adenosine analogue called cordycepin (3`-deoxyadenosine), when protected by an inhibitor of E-ADA, it was effective, showing curative treatment indexes on mice infected with T. brucei (18,19). This approach will be investigated in further studies in vivo with neosporosis by our group. This study allowed us to conclude that the enzyme E-ADA was present in N. caninum ta c hyzo i t e s . We a l s o c o n c l u d e t ha t t he deoxycoformycin tested is able to inhibit the E-ADA detected in this study in parasite, which might be an option for chemotherapy. In this sense, knowing the negative impact of N. caninum on reproductive issue (2) in cattle (mainly abortion), might it is an alternative in order to deal with this parasitic infection.
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inhibición de la actividad de E-ADA del parásito fue directamente proporcional a la mayor concentración de deoxicoformicina utilizada (Figura 1B).
DISCUSIÓN En el parásito, la ADA está probablemente a cargo de la regulación de la concentración de adenosina y, en consecuencia, de la inosina, como ocurre en otros mamíferos (9). Nuestros resultados han sido corroborados por otros estudios, por ejemplo, utilizando el mismo método, se detectó E-ADA en tripomastigotos de T. evansi (13). También, de acuerdo con la literatura, los taquizoítos de N. caninum muestran un trifosfato nucleótido hidrolasa tipo-I potente (15), similar a T. gonddi. En este sentido, ya ha sido demostrado que el T. gondii es capaz de sintetizar nucleósidos de pirimidina (16). Por lo tanto, la purina es necesaria para el crecimiento del parásito y, por esta razón, debe recuperarse de la célula huésped (17) así como de los protozoos. La inhibición de la actividad de E-ADA en N. caninum fue directamente proporcional a la mayor concentración de deoxicoformicina utilizada. Este hallazgo sugiere la necesidad de realizar estudios adicionales con el fin de comprobar si el inhibidor de E-ADA puede tener efectos nocivos sobre N. caninum, lo que podría mejorar la manera cómo se lleva a cabo la quimioterapia para este parásito. En un estudio realizado con otros protozoos se observó que cuando el inhibidor de E-ADA fue utilizado en el tratamiento de T. brucei en ratones, no observó ninguna acción curativa y los animales murieron como consecuencia de la enfermedad (18). Sin embargo, otros estudios demostraron la efectividad de un tratamiento con un análogo de la adenosina llamado cordicepina (3’-desoxiadenosina) cuando es protegido por un inhibidor de E-ADA, evidenciando indicios de un tratamiento curativo en los ratones infectados con T. brucei (18,19). Este enfoque será investigado por nuestro grupo en estudios posteriores in vivo con neosporosis. Este estudio nos permitió llegar a la conclusión que la enzima E-ADA estaba presente en los taquizoítos de N. caninum. También concluimos que la deoxicoformicina ensayada es capaz de inhibir la E-ADA detectada en el parásito en este estudio, la cual puede ser una opción para la quimioterapia. En este sentido, al conocer el impacto negativo de N. caninum en la producción y reproducción bovina (2) (principalmente aborto), puede constituir una alternativa para tratar esta infección parásita.
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4461-4471, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL
Quality Index Method developed for gutted and ungutted red tilapia (Oreochromis ssp) Esquema del metodo índice de calidad desarrollado para tilapia roja (Oreochromis ssp) eviscerada y sin eviscerar Nelson Gutiérrez G,1* Ph.D, Claudia Amorocho C,1 Ph.D, Angélica Sandoval A,2 Ph.D, Yaneth Ruíz O,1 M.Sc. Universidad Surcolombiana, Facultad de Ingeniería, Departamento Ingeniería Agrícola, Av. Pastrana Cra. 1 Neiva, Colombia. 2Universidad del Tolima, Facultad de Ingeniería Agronómica, Departamento producción y sanidad vegetal, Barrio Santa Helena, Ibagué Colombia. *Correspondencia: ngutierrezg@ usco.edu.co 1
Received: April 2014; Accepted: November 2014.
ABSTRACT Objective. To develop a Quality Index Method (QIM) for gutted and ungutted red tilapia from aquaculture ponds. Materials and methods. 40 specimens of gutted red tilapia and 40 ungutted ones were located in foam polyethylene boxes within layers of ice and storage at 4°C. Three fish were randomly sampled on days 0, 3, 5, 8, 11, 14 and 17 for gutted tilapia, and on days 0, 3, 6, 9, 11, 14 and 16 for ungutted tilapia. A sensorial panel of 8 experts was formed to evaluate the product. With three samples each day with average points of the sensorial attributes proposed in the method, the quality index for gutted and ungutted red tilapia was obtained based on the storage time on ice. Results. The Quality Index Method obtained for gutted and ungutted red tilapia showed maximum values of 21 and 29, respectively. It was adjusted in an increasing lineal model with high correlation between the Quality Index and the storage time on ice. Conclusions. The developed model is useful to determine deterioration levels and to define storage and consumption time. For gutted red tilapia the panel rejected the fish after 8 - 11 days of storage whereas the ungutted red tilapia was rejected after 6 - 9 days. Key words: Cold storage, fish, freshness, sensory evaluation (Source: USDA).
RESUMEN Objetivo. Desarrollar los esquemas del Método de Índice de Calidad (MIC) para la tilapia roja de piscifactoría eviscerada y sin eviscerar. Materiales y métodos. 40 especímenes de tilapia roja eviscerados y 40 sin eviscerar, fueron ubicados en cajas de polietileno expandido entre capas de hielo y almacenadas a 4°C; se realizaron muestreos los días 0, 3, 5, 8, 11, 14 y 17 para tilapia eviscerada, mientras en la tilapia sin eviscerar los días 0, 3, 6, 9, 11, 14 y 16; se conformó un panel de 8 expertos para la evaluación sensorial de tres ejemplares en cada día de muestreo; con los puntajes promedio de los atributos sensoriales propuestos en el esquema, se obtuvo el índice de calidad para la tilapia roja eviscerada y sin eviscerar en función del tiempo de almacenamiento en hielo. Resultados. Los esquemas del Método índice de Calidad desarrollados para tilapia roja entera eviscerada y sin eviscerar, obtuvieron valores máximos de Índice de Calidad de 21 y 29 puntos respectivamente, ajustados a un 4461
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modelo lineal creciente con alta correlación entre el Índice de Calidad y el tiempo de almacenamiento en hielo. Conclusiones. Los esquemas del MIC desarrollados son útiles para determinar el nivel de deterioro y definir los tiempos de almacenamiento y consumo. En la tilapia roja eviscerada los panelistas rechazaron el pescado para consumo entre los días 8 y 11 de almacenamiento, mientras que para la tilapia sin eviscerar el producto fue rechazado entre los días 6 y 9 de almacenamiento. Palabras clave: Evaluación sensorial, frescura, pescado, refrigeración (Fuente: USDA).
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
In Latin America the production on an industrial scale of species such as salmon, trout and tilapia has seen a notorious increase over the last decade, led by countries such as Brazil, Mexico, Ecuador and Chile. However, the development of aquiculture on a small scale begins to show notable possibilities in the market (1). Over the last two decades in Colombia an important progress has been made in the small to medium scale production of a hybrid tilapia known as red tilapia (Oreochromis ssp) in aquaculture ponds established in reservoirs to generate energy.
En América Latina la producción a escala industrial de especies como el salmón, trucha y tilapia ha registrado un notorio crecimiento durante la última década, liderada por países como Brasil, México, Ecuador y Chile; no obstante, el desarrollo de la acuicultura en pequeña escala empieza a mostrar posibilidades notables en los mercados (1). En Colombia desde hace dos décadas se viene presentando un avance importante en la producción a pequeña y mediana escala de un hibrido de tilapias conocido como tilapia roja (Oreochromis ssp) en piscifactoría establecida en represas para generación de energía.
However, fish is a highly perishable product and a few hours after death a series of postmortem reactions occur, among them the autodegenerative reactions that are enzymatic and microbiological changes (2) that contribute to the detriment of the product (3) by the appearance of undesirable smells, colors and flavors which the final consumer rejects (2,4). These changes are also manifested by the accumulation of organic compounds and microorganisms that can present a hygienic or toxicological risk for the consumer. Nevertheless, the final quality of the fish depends not just on the nature of the species, but also is implicitly related to handling and storage conditions (5,7).
Sin embargo, el pescado es un producto altamente perecedero y unas pocas horas después de la muerte se presentan una serie de reacciones postmortem entre las que se destacan las reacciones autodegradativas de tipo enzimático y cambios microbiológicos (2), que contribuyen con el detrimento del producto (3); evidenciado en la aparición de olores, colores y sabores no deseados, los cuales causan rechazo por parte del consumidor final (2,4), cambios que además son manifestados por la acumulación de compuestos orgánicos y microorganismos que pueden representar un riesgo higiénico o toxicológico para el consumidor. No obstante, la calidad final del pescado no sólo depende de la naturaleza de las especies, sino que además está implícitamente relacionado con el manejo y las condiciones de almacenamiento (5,7).
Different investigators and institutes in the fishing industry have developed methods to evaluate the freshness of fish, based on postmortem changes associated with sensorial, physicochemical and microbiological changes (4,8). Included in these is appearance, smell, taste and texture, which have been establishes as the principle attributes of freshness (9, 10), and that is why the sensorial method is considered the most reliable to determine freshness of fish in relation to the physicochemical and microbiological methods (10,11). Sensorial evaluation is considered an important method to evaluate freshness (6) and quality (12), commonly used by control organisms in different countries to determine that fish complies with quality standards established by the fishing industry as part of quality control and by buyers to assure that the products meets their expectations (13).
Diferentes investigadores e institutos comprometidos con la industria pesquera, han desarrollado métodos para evaluar la frescura del pescado, basándose en medidas de cambios postmortem asociados con cambios sensoriales, fisicoquímicos y microbiológicos (4,8). Dentro de estos, la apariencia, el olor, sabor y la textura, han sido establecidos como los principales atributos de frescura (9,10); razón por la cual, el método sensorial es considerado como el más fiable para determinar la frescura del pescado en correlación con los métodos fisicoquímicos y microbiológicos (10,11). La evaluación sensorial considerada como un método importante para la evaluación de la frescura (6) y calidad (12); comúnmente utilizado por los organismos de control en diferentes países para determinar que el pescado cumple con los estándares de calidad establecidos por la industria pesquera, como parte del
Gutiérrez - Quality index method scheme for red tilapia
This characteristic has made, for instance, in the European legislation has established the use of such analysis, followed by a chemical or microbiological one, always when the sensorial evaluation determines it, in order to eliminate doubts about the product (2,14). In Colombia, the activities of inspection, surveillance and control of fishing products, in particular fish, mollusks and fresh crustaceans, are regulated by means of Resolution 122 of 2012 (15) and are exclusively based on chemical and microbiological tests. Within those sensorial methods, different classification systems have been developed that are applicable to specific situations or to a limited number of fish species or products without having one particular defined method (11). Over several years the Quality Index Method (QIM) has been used as a reference method in the European Union to determine the quality of sliced fish. The QIM is based on an objective evaluation of certain attributes of raw fish during storage on ice (12,13,16). This evaluation should be done by trained personnel with clear and defined guidelines keeping in mind different attributes, such as the eyes, gills and scales, allowing accurate judgment about the product. The QIM has been catalogued as a precise and objective method, not destructive, quick, easy to apply and specific (17,18,19). In the QIM each one of the analyzed attributes is qualified with a point system from 0 to 3, where zero represents the greatest indications of freshness and three determines the greatest indication of deterioration (13,17,18). Points for each one of the analyzed attributes are added to give a total sensorial score for the day it is evaluated on; this way the Quality Index is achieved. Due to the fact that higher scoring is given the longer the product is stored (18), the quality index is lineally increased (13,18,20) and therefore is frequently used to predict the remaining storage time on ice (12,18,21), which is useful for fish merchants to determine how much time it is acceptable to keep the product on the market (2). This method has been implemented to establish the degree of freshness in species such as: gilt-headed bream (Sparus aurata) (17,22, 23), red sea bream (Pagellus bogaraveo) (18), sardine (Sardinops sagax), (16), cod (Gadus morhua) (20), herring (Clupea harengus L.) (21), common octopus (Octopus vulgaris) (19), common cuttlefish (Sepia officinalis) (24), and red mullet (Mullus barbatus) (25), among others. The objective of this investigation was to develop IQM model for gutted and ungutted red tilapia relating to the storage time on ice, and implicitly to study sensorial changes with results applicable
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control de calidad y por los compradores para asegurar que el producto cumple con sus expectativas (13). Esta característica ha hecho que por ejemplo en la legislación europea, se haya establecido el uso de dicho análisis, seguido por uno químico y/o microbiológico, siempre y cuando la evaluación sensorial lo determine, con el fin de descartar sospechas sobre el producto (2,14).En el contexto Colombiano, las actividades de inspección, vigilancia y control para los productos de la pesca, en particular pescados, moluscos y crustáceos frescos, reglamentadas mediante Resolución 122 de 2012 (15), están soportadas exclusivamente en pruebas químicas y microbiológicas. Dentro de los métodos sensoriales, se han desarrollado diferentes sistemas de clasificación, aplicables en situaciones específicas o en un número limitado de especies de pescado o productos, sin que se tenga definido uno en particular (11). Desde hace unos años, se ha venido empleando el Método Índice de Calidad (MIC), como método de referencia en el marco de la Unión Europea para determinar la calidad del pescado en lonjas; el MIC se basa en la evaluación objetiva de ciertos atributos del pescado crudo durante su almacenamiento en hielo (12,13,16). Esta evaluación debe ser realizada por personal entrenado con guías claras y definidas teniendo en cuenta diferentes atributos de manera simultánea, como el caso de ojos, branquias y piel, permitiendo realizar un dictamen acertado sobre el producto. El MIC ha sido catalogado como un método preciso y objetivo, no destructivo, rápido, fácil de aplicar y específico (17,18,19). En el MIC cada uno de los atributos analizados, es calificado con una puntuación de 0 a 3, donde cero es el puntaje que representa mayor índice de frescura y tres el puntaje que determina el mayor índice de deterioro (13,17,18). Las puntuaciones para cada uno de los atributos analizados son sumadas para dar una puntuación sensorial total del día que se está evaluando; de esta manera se obtiene el denominado Índice de Calidad. Debido a que las puntuaciones más altas se van dando en la medida en que avanza el almacenamiento (18), el índice de calidad se incrementa linealmente (13,18,20), por lo que con frecuencia es utilizado para predecir el tiempo restante de almacenamiento en hielo (12,18,21), lo que es de gran utilidad para los comerciantes de pescado para determinar por cuánto tiempo permanecerá aceptable su producto para la venta (2). Este método se ha implementado para establecer el grado de frescura de especies como: la dorada (Sparus aurata) (17,22,23), besugo (Pagellus bogaraveo) (18), sardina (Sardinops sagax), (16), bacalao (Gadus morhua) (20), arenque entero (Clupea harengus L.) (21), pulpo común (Octopus vulgaris) (19), sepia común (Sepia officinalis) (24), y el salmonete (Mullus barbatus) (25), entre otros.
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both to the industrial sector as well as for regulatory entities of this food and agriculture product.
MATERIALS AND METHODS Sampling and storage conditions. A total of 80 samples of commercial sized fish (380-420 g) were acquired from aquaculture ponds in the Betania reservoir, located in the south west of the department of Huila, 35 km from Neiva, where the greater amount of tilapia for the national and international market is produced. 40 fish with scales were gutted at the collection site, packed in expanded polystyrene boxes with ice, alternating layers of fish with layers of ice in a 1:1 proportion. Once packed, they were taken to the laboratory within an hour after acquiring them, and the polystyrene boxes were stored in refrigeration at a temperature that oscillated between 0 and 4°C. Another 40 specimens were transported without gutting in the same conditions as the gutted fish. To analyze the gutted tilapia, sampling was done at 0, 3, 5, 8, 11, 14 and 17 days according to the methodology suggested by Simat et al (17), while the ungutted tilapia was sampled on days 0, 3, 6, 9, 11, 14 y 16. Sensorial model. A group of 8 expert panelists made up of academics, investigators and businessmen in the fishing sector were trained to do a sensorial evaluation by means of the Quality Index Method (QIM). An initial model for whole red tilapia was planned according to the one proposed by Martinsdóttir et al (13) for redfish due to its morphologic similarity to tilapia. In gutted red tilapia, the aspects to evaluate through a developed model were: appearance (skin, blood in the gills, firmness), eyes (cornea, form, pupil), gills (color, smell, mucous) and meat (color and structure). Among others, the aspects for ungutted tilapia to evaluate were appearance (scales, blood in gills, firmness, belly), eyes (cornea, form, pupil), gills (color, smell, mucous) and meat (color and structure) and entrails (appearance, firmness and consistency). The panelists evaluated each one of the established sensorial attributes on a scale of demerits from zero to three points, and judgments emitted for each evaluator were centralized in an numeral measurement. With the sum of the average scores of the sensorial attributes that were part of the QIM, a quality index was obtained for gutted and ungutted
El objetivo de esta investigación fue desarrollar los esquemas del MIC para tilapia roja eviscerada y sin eviscerar, en función de los días de almacenamiento en hielo, e implícitamente estudiar sus cambios sensoriales; con resultados aplicables tanto para el sector industrial como para las entidades reguladoras de este producto agroalimentario.
MATERIALES Y METODOS Muestreo y condiciones de almacenamiento. Un total de 80 muestras de peces con un tamaño comercial (380-420 g) fueron adquiridas de una piscifactoría ubicada en el embalse de Betania, localizado al sur-occidente del departamento del Huila, a 35 Km de la ciudad de Neiva, donde se concentra la mayor producción de tilapia para suplir el mercado nacional e internacional. 40 ejemplares con escamas fueron eviscerados en el sitio de recolección, embalados en cajas de poliestireno expandido con hielo, alternando capas de pescado con capas de hielo en una proporción 1:1. Una vez embalados, fueron llevados al laboratorio antes de transcurrir una hora después de su adquisición, las cajas de poliestireno fueron almacenadas en refrigeración a una temperatura que osciló entre 0 y 4°C. Los otros 40 especímenes fueron transportados sin eviscerar en las mismas condiciones que el pescado eviscerado. Para los respectivos análisis en la tilapia eviscerada se hicieron muestreos los 0, 3, 5, 8, 11, 14 y 17 días, conforme a la metodología propuesta por Simat et al (17), mientras en la tilapia sin eviscerar los muestreos se hicieron a los días 0, 3, 6, 9, 11, 14 y 16. Esquema sensorial. Se conformó un grupo de 8 panelistas expertos integrado por académicos, investigadores y empresarios del sector piscícola, con experiencia en manipulación de tilapia roja, que fueron entrenadas para la evaluación sensorial mediante el Método de índice de Calidad (MIC). Se proyectó un esquema inicial para tilapia roja entera, similar al esquema propuesto por Martinsdóttir et al (13) para la gallineta nórdica por su similitud morfológica con la tilapia. En la tilapia roja eviscerada, los aspectos a evaluar a través del esquema desarrollado fueron: apariencia (piel, sangre en los opérculos, firmeza), ojos (córnea, forma, pupila), branquias (color, olor, moco) y carne del filete (color y estructura). Entre tanto, en la tilapia sin eviscerar los aspectos a evaluar fueron: apariencia (piel, sangre en los opérculos, firmeza, vientre), ojos (córnea, forma, pupila), branquias (color, olor, moco) y carne del filete (color y estructura) y vísceras (apariencia, firmeza y consistencia). Los panelistas valoraron cada uno de los atributos sensoriales establecidos, en una escala de deméritos de cero a tres puntos, los juicios emitidos por cada evaluador fueron centralizados con la media
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Gutiérrez - Quality index method scheme for red tilapia
RESULTS QIM model for gutted red tilapia. Results of the sensorial evaluation done by the panel of experts for each one of the evaluated parameters provided the model of the quality index method for gutted red tilapia, and sensorial attributes were included that presented a notorious evolution during storage time. This way the developed model in the end had 4 quality parameters and 11 sensorial attributes, and the maximum total score was 21 points (Table 1). In analysis done through the QIM model for gutted tilapia, the evolution of sensorial attributes such as “firmness” in the quality parameter, “appearance”, the “form” in the “eye” parameter, “color” in the “gill” parameter and “structure” in the “meat” parameter were those that best reflected deterioration of the product’s quality by showing a gradual evolution that increased during the 17 days of storage on ice (Figure 1). With the total sum of the average score from the 11 sensorial attributes composed in the QIM model (Table 1), the quality index for gutted red tilapia (Oreochromis ssp) was obtained based on the storage time on ice (Figure 2).
Análisis estadístico. Los datos obtenidos de la tabla de valores tal y como lo sugieren Sykes et al (26), fueron sometidos a un análisis de regresión lineal, realizando una correlación entre el índice de calidad y el tiempo de almacenamiento en hielo con un nivel de confianza del 95%.
RESULTADOS Esquema del MIC para tilapia roja eviscerada. Los resultados de la evaluación sensorial realizada por el panel de expertos para cada uno de los parámetros evaluados, permitieron obtener el esquema del método índice de calidad para tilapia roja eviscerada, se incluyeron los atributos sensoriales que presentaron una evolución notoria durante el tiempo de almacenamiento. De esta manera el esquema desarrollado finalmente contó con 4 parámetros de Firmness Demerit points
Statistical analysis. Data obtained from the value table as suggested by Sykes et al (26) were subjected to a lineal regressive analysis with a correlation between the quality index and the storage time on ice with a confidence level of 95%.
aritmética; con la sumatoria de los puntajes promedio de los atributos sensoriales que hicieron parte del MIC, se obtuvo el índice de calidad para la tilapia roja (Oreochromis ssp) eviscerada y sin eviscerar en función del tiempo de almacenamiento en hielo.
Form Demerit points
red tilapia (Oreochromis ssp) based on storage time on ice.
Structure Demerit points
QIM framework for ungutted red tilapia. The sensorial evaluation done by the panel of experts for each one of the parameters evaluated determined the quality index method model for ungutted red tilapia (Table 2). The
Demerit points
Color
The parameters that were included in the quality index model (Table 1) were useful to establish the detriment to the quality of gutted red tilapia during storage on ice and showed a high positive correlation (R2=0.98; p≤0.01) that shows its utility in determining the evolution of the loss of freshness in the fish. As can be seen in figure 2, the quality index increases as storage on ice advances, and reaches a maximum detriment value of 21 points on day 17.
Time (days)
Figure 1. Evolution of sensorial attributes for gutted Red Tilapia stored on ice, based on storage time (n=8).
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Table 1. QIM model for gutted red tilapia Quality Parameter Appearance Scales
Scoring Description
Eyes
Cornea
Form
Pupil
Gills
Color
Smell
Mucous
Meat, filet
Color
Structure
Points
Shiny, iridescent pigmentation, swollen (healthy)
0
Somewhat matte, become discolored
1
Blood in gills Absent
Firmness
Table 2. E Quality Index model for ungutted red tilapia. Quality Parameter Appearance Scales
0
Scoring Description
Blood in gills
Points
Shiny, iridescent pigmentation
0
Somewhat matte, become discolored
1
Matte
2
Absent
0
Very little (10-30%)
1
A lot (30-50%)
2
Very little (10-30%)
1
In rigor
0
A lot (30-50%)
2
Firm, elastic (a fingerprint disappears quickly)
1
In rigor
0
Soft (finger leaves a mark for 3 seconds)
2
Very soft (leaves a mark for more time)
3
Firm, elastic (a fingerprint disappears quickly)
1
Clear
0
Opalescent
1
Soft (finger leaves a mark for 3 seconds)
2
Milky
2
Convex
0
Very soft (leaves a mark for more time)
3
Flat
1
Firm
0
Slightly sunken
2
Not very firm
1
Sunken, concave
3
Black
0
Soft
2
Opaque
1
Cleary
0
Grey
2
Opalescent
1
Blood red
0
Milky
2
Similar to beef (less red)
1
Convex
0
Faded, brown spots
2
Flat
1
Brown, Faded
3
Slightly sunken
2
Slightly metallic
0
Moderately metallic
1
Sunken, concave
3
Metallic
2
Black
0
Clear
0
Opaque
1
Milky
1
Grey
2
Blood red
0
Similar to beef (less red)
1
Coffee, clotted
2
Faded, abundant clotting
3
Translucid, creamy color similar to flesh with a slight pink color.
0
Waxy, milky
1
Opaque, yellow, brown spots
2
Firm, defined myomers Slightly friable, myomers moderately defined myomers Friable, slightly defined myomers Quality index
Firmness
Belly
Eyes
Cornea
Form
Pupil
Gills
Color
Faded, brown spots
2
Brown, faded
3
Slightly metallic
0
0
Moderately metallic
1
1
Metallic
2
2
Strongly metallic, with a yeast sensation
3
Clear
0
Milky
1
Brown, clotted
2
Abundantly clotted
3
Translucid, cream color similar to skin with slight pink coloring.
0
Waxy, Milky
1
Opaque, yellow, brown spots
2
Firm, myomers defined
0
Slightly friable
1
Friable
2
Organs defined and firm
0
Organs defined and slightly firm
1
Organs not defined lacking firmness
2
Very consistent
0
Average consistency
1
Little consistency
2
Smell
Mucous
0-21
Quality index in gutted red tilapia
Meat, Filet Color
Quality index
Structure
Entrails
Appearance
Consistency Time (days)
Figure 2. Changes in score of the quality index in gutted red tilapia based on storage time on ice (n=8).
No consistency Quality Index
3 0-29
Gutiérrez - Quality index method scheme for red tilapia
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Demerit points
Firmness
Demerit points
Form
Figure 4. Changes in QI quality index score in ungutted tilapia based on storage times on ice (n=8).
calidad y 11 atributos sensoriales, cuya puntuación máxima total asignada fue de 21 puntos (Tabla 1). Demerit points
Color
Demerit points
Structure
Demerit points
Consistency
Time (days)
Figure 3. Evolution of the sensorial attributes in gutted Red Tilapia stored on ice, based on storage time (n=8).
developed model had 5 quality parameters and 14 sensorial attributes, with a total maximum assigned score of 29 points of demerit. In the case of ungutted tilapia, the evolution of the sensorial attributes “firmness” in the quality parameter “appearance”, “form” in the “eye” parameter, “color” in the “gills” parameter, “structure” in the “meat” parameter and “consistency” in the quality parameter “entrails”, were those that best reflected the
En los análisis realizados dentro del esquema MIC para tilapia eviscerada, la evolución de los atributos sensoriales como “firmeza” en el parámetro de calidad “apariencia”, la “forma” en el parámetro “ojo”, el “color” en el parámetro “branquias“ y la “estructura” en el parámetro “carne, filete”, fueron los que mejor reflejaron el detrimento de calidad del producto al presentar una evolución gradual creciente durante los 17 días de almacenamiento en hielo (Figura 1). Con la sumatoria total de las puntuaciones promedio de los 11 atributos sensoriales que componen el esquema MIC (Tabla 1), se obtuvo el índice de calidad para la tilapia roja eviscerada (Oreochromis ssp) en función del tiempo de almacenamiento en hielo (Figura 2). Los parámetros que se incluyeron en el esquema de índice de calidad (Tabla 1), resultaron ser útiles para establecer el detrimento de la calidad en tilapia roja eviscerada durante su almacenamiento en hielo ya que mostraron una alta correlación positiva (R2=0.98; p≤0.01), razón por la cual se demuestra su utilidad para determinar la evolución de la pérdida de frescura del pescado. Como puede verse en la figura 2 el índice de calidad aumenta a medida que avanza el almacenamiento en hielo, alcanzando un valor máximo de demérito de 21 puntos en el día 17. Esquema del MIC para tilapia roja sin eviscerar. La evaluación sensorial efectuada por el panel de expertos para cada uno de los parámetros evaluados permitieron determinar el esquema del método índice de calidad para tilapia roja sin eviscerar (Tabla 2). El esquema desarrollado contó con 5 parámetros de calidad y 14 atributos sensoriales, cuya puntuación máxima total asignada fue de 29 puntos de demérito. En el caso de la tilapia sin eviscerar, la evolución de los atributos sensoriales “firmeza” en el parámetro de calidad “apariencia”, “forma” en el parámetro “ojo”, “color” en el parámetro “branquias“, “estructura” en
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changes in the product by presented a growing gradual evolution during 16 days of storage on ice (Figure 3). With the total sum of average scores of the 14 sensorial attributes that make up the QIM model, the Quality Index for ungutted Red Tilapia (Oreochromis ssp) based on storage time on ice (Figure 4). Just like with the gutted tilapia, the quality index obtained increased lineally regarding storage time on ice; finding a high positive correlation, adjusting the lineal model adequately (R2=0.9794; p≤0.01), for which the parameters that were included in the quality index model (Table 2) were useful to establish the evolution of the loss of freshness in the fish. As can be seen in Figure 4, the quality index increased with storage time on ice, reaching a maximum demerit value of 29 points at day 16.
DISCUSSION In gutted tilapia, results obtained are similar to those found by Nielsen and Hyldig (21), who determined the shelf life of herring as being 8-14 days when the fish is caught in winter and 3-8 days when caught in autumn; similarly, Méndez (27) found the shelf life of fresh and unfrozen gilt-head bream to be 7 days, which matches the microbiological count obtained. Additionally, following the recommendation of the group evaluator, the acceptation level of the product can be determined based on sensorial evaluation. Based on this, it is clear that QIM becomes a tool to aid any person with short training to decide on the deterioration level of red tilapia according to the analysis of attributes described in the model for storage conditions on ice as evaluated here. The quality model index developed by evaluating the deterioration of gutted and ungutted red tilapia showed a gradual growing evolution, similar to the model developed for other species of fish (18-20, 28); additionally, in the two cases evaluated, the relation between the quality index and storage time were adjusted to a lineal model with high correlation values. Other studies show reports in the case of sweet water species such as the hybrid tambacu or chacmoto (Colossoma macropomum x Piaractus mesopotamicus). In this case, QIM scores between 0 and 26 were reported with 5 quality parameters and 10 sensorial ones (29)
el parámetro “carne/filete” y “consistencia” en el parámetro de calidad “visceras”, fueron los que mejor reflejaron cambios en el producto al presentar una evolución gradual creciente, durante los 16 días de almacenamiento en hielo (Figura 3). Con la sumatoria total de las puntuaciones promedio de los 14 atributos sensoriales que componen el esquema MIC, se obtuvo el Índice de Calidad para la Tilapia Roja sin eviscerar (Oreochromis ssp) en función del tiempo de almacenamiento en hielo (Figura 4). Al igual que en la Tilapia eviscerada, el índice de calidad obtenido fue aumentando linealmente respecto al tiempo de almacenamiento en hielo; encontrando una alta correlación positiva, ajustándose de manera adecuada a un modelo lineal (R2=0.9794; p≤0.01), lo cual indica que los parámetros que se incluyeron en el esquema de índice de calidad (Tabla 2), resultaron ser útiles para establecer la evolución de la pérdida de frescura del pescado. Como puede verse en la figura 4 el índice de calidad aumenta a medida que avanza el almacenamiento en hielo, alcanzando un valor máximo de demérito de 29 puntos el día 16.
DISCUSIÓN En la tilapia eviscerada, los resultados obtenidos son similares a los encontrados por Nielsen y Hyldig (21), quienes determinaron una vida útil del arenque entre de 8-14 días en el pez capturado en invierno y de 3-8 días capturado en otoño; asimismo, Méndez (27), encontró una vida útil de la dorada fresca y descongelada de 7 días, tiempo concertado con el recuento microbiológico obtenido. Además, atendiendo la recomendación del grupo evaluador, se puede determinar el nivel de aceptación del producto en función de la valoración sensorial. Con lo anterior queda claro que el MIC se constituye en una herramienta para que cualquier persona con un entrenamiento corto, pueda decidir sobre el nivel de deterioro de la tila roja en función del análisis de los atributos descritos en el esquema para las condiciones de almacenamiento en hielo aquí evaluadas. Los esquemas de índice de calidad desarrollados para la evaluación del deterioro en la tilapia roja eviscerada y sin eviscerar, mostraron una evolución gradual creciente, similar a todos los esquemas desarrollados para otras especies de pescado (18-20,28); además, en los dos casos evaluados la relación entre el índice de calidad y el tiempo de almacenamiento se ajustaron a un modelo lineal con altos valores de correlación. Otros estudios reportan resultados para el caso de especies de agua dulce como el del híbrido de cachamoto (Colossoma macropomum x Piaractus mesopotamicus), en este caso, se reportaron puntajes
Gutiérrez - Quality index method scheme for red tilapia
and the pacu (Piaractus mesopotamicus) that is found in rivers to the south of the continent, although in this case QIM scores were reported between 0 and 32, with 9 quality parameters and 15 sensorial attributes (30). In the same way, the quality index values obtained based on storage time on ice resulted in the same order as those cited in other studies (18), reaching a maximum demerit value of 21 points on day 17 with gutted red tilapia and 29 points on day 16 with ungutted red tilapia. In addition to determining the loss of freshness based on storage time, the QIM allows the indirect establishment of criteria to reject the product when needed for consumption or later transportation and processing. With the results of this study a maximum limit is proposed for consumption between 8 and 11 days of storage in gutted red tilapia and ungutted red tilapia, the product was rejected by the panelists between 6 and 9 days of storage. For future investigations, it is proposed to compare the results of the evaluation of deterioration obtained by sensorial analysis, with results of the loss of freshness obtained with useful methods such as Torrymetro (18).
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de MIC entre 0 y 26 con 5 parámetros de calidad y 10 atributos sensoriales (29) y el pacú (Piaractus mesopotamicus) que se encuentra en ríos del sur del continente, aunque en este caso se reportaron puntajes del MIC entre 0 y 32, con 9 parámetros de calidad y 15 atributos sensoriales (30). De la misma forma, los valores de índice de calidad obtenidos en función del tiempo de almacenamiento en hielo resultaron del mismo orden que los citados en otros estudios (18) alcanzando un valor máximo de demérito de 21 puntos el día 17 en la tilapia roja eviscerada y 29 puntos el día 16 en la tilapia roja sin eviscerar. Además de poder determinar la pérdida de frescura en función del tiempo de almacenamiento, el MIC permite de manera indirecta establecer criterios para el rechazo del producto cuando se requieren para su consumo o posterior transporte y procesamiento. Con los resultados de este estudio se propone como límite máximo para consumo entre 8 y 11 días de almacenamiento en la tilapia roja eviscerada y en la tilapia sin eviscerar, el producto fue rechazado por los panelistas entre los días 6 y 9 de almacenamiento. Para futuras investigaciones, se propone comparar los resultados de la evaluación del deterioro obtenida con análisis sensorial, con los resultados de la pérdida de frescura obtenidos con métodos instrumentales como el Torrymetro (18).
Acknowledgements
Agradecimientos
To the Universidad del Tolima for partial financing of this project (project: 290213).
A la Universidad del Tolima por la financiación parcial de este proyecto (proyecto: 290213)
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4472-4481, 2015. ISSN: 0122-0268 ORIGINAL
Enterotoxigenic Genes in strains of Staphylococcus spp., isolated from cheese made in Pamplona-Colombia Genes enterotoxigénicos en cepas de Staphylococcus spp., aisladas a partir de queso elaborado en Pamplona-Colombia Fanny Herrera A,1* Ph.D, Jesús Santos B,2 Ph.D. 1
Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Microbiología, Grupo de Investigación en Microbiología y Biotecnología (GIMBIO). Ciudad Universitaria, Pamplona, Norte de Santander, Colombia. 2Universidad de León, Facultad de Veterinaria, Departamento de Higiene y Tecnología de los Alimentos. Campus de Vegazana, A.A. Nro. 24071, León, España. *Correspondencia: fannyh@unipamplona.edu.co Received: April 2014; Accepted: November 2014.
ABSTRACT Objective. To determine the incidence of coagulase-positive strains of enterotoxigenic Staphylococcus in doble crema (double cream) cheese samples produced in Pamplona. Materials and methods. Bacterial isolation was performed following the routine method for coagulase positive Staphylococcus provided by the Colombian Technical Standard 4779, by using Baird Parker medium with confirmation of typical colonies by performing the coagulase test. Detection of genes for principal enterotoxins was done by PCR. Results. The prevalence of coagulase positive Staphylococcus in cheese samples was 31%, with 27% of the samples failing to meet the requirements of the NTC 750. In 24.6% of the studied isolates, genes for enterotoxin production were detected. The presence, in the isolated strains, of genes for SEB, SEA and SED was 18.5%, 4.6% and 3.0%, respectively. Conclusions. The significant presence of enterotoxigenic genes found in the isolates obtained from samples of double cream cheese made in Pamplona, suggests an important hazard to the health of consumers. Key words: coagulase, cheese, enterotoxins, prevalence, Staphylococcus (Source: MeSH).
RESUMEN Objetivo. Determinar la incidencia de cepas de Staphylococcus coagulasa positivas, potencialmente enterotoxigénicas, en muestras de queso doble crema elaborado en Pamplona. Materiales y métodos. Se siguió el método tradicional de aislamiento de Staphylococcus coagulasa positivos estipulado por la Norma Técnica Colombiana 4779, empleando el medio de Baird Parker con confirmación de las colonias típicas mediante la realización de la prueba de la coagulasa. La detección de los genes para las principales enterotoxinas se realizó utilizando la técnica de PCR. Resultados. Se encontró una prevalencia de Staphylococcus coagulasa positivos en el 31% de las muestras; el 27% de las muestras incumplieron la NTC 750. En el 24.6% de las cepas estudiadas se detectaron genes para producción de enterotoxinas. La presencia, en las cepas aisladas, de genes para ESB, ESA y ESD 4472
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fue de 18.5%, 4.6%, y 3.0%, respectivamente. Conclusiones. La significativa presencia de genes enterotoxigénicos encontrada en las cepas obtenidas a partir de las muestras de queso doble crema elaborado en Pamplona, sugiere un importante peligro para la salud de los consumidores. Palabras clave: Coagulasa, enterotoxinas, prevalencia, queso, Staphylococcus (Fuente: MeSH).
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Foodborne Illnesses (FBI) are a growing problem to public health around the world, resulting in the ingestion of food contaminated with microorganisms, pluricellular organisms (helminthes), chemical and/or toxic substances. The most obvious clinical manifestations of FBIs are gastrointestinal: however, these illnesses can have chronic effects on health, including neurological, gynecological or immunological symptoms, as well as damage multiple organs, and cause cancer or death (1).
Las Enfermedades de Origen Alimentario (ETAs) son un problema creciente de salud pública en todo el mundo, resultando de la ingestión de alimentos contaminados con microorganismos, organismos pluricelulares (helmintos), sustancias químicas y/o toxinas. Las manifestaciones clínicas más evidentes de las ETAs son de tipo gastrointestinal: sin embargo, estas enfermedades pueden tener efectos crónicos sobre la salud, incluyendo síntomas neurológicos, ginecológicos o inmunológicos, como también daño a múltiples órganos, cáncer y la muerte (1).
One of the most important etiologic agents of FBIs in the world is Staphylococcus aureus. The term “staphylococci” defines a group of Gram positive coco bacteria that divide on more than one plane to form three-dimensional cell bunches. Staphylococcus belongs to order I Bacillales of the Staphylococcaceae family (2); 18 species of Staphylococcus that affect food have been described, and coagulase positive ones such as S. aureus is the one that is most transmitted by food (3).
Dentro de los agentes etiológicos más importantes de ETAs en el mundo se encuentra Staphylococcus aureus. El término “estafilococos” define un grupo de bacterias en forma de cocos Gram-positivos que se dividen en más de un plano para formar racimos tridimensionales de células. El género Staphylococcus, pertenece al orden I Bacillales, familia Staphylococcaceae (2); se han descrito 18 especies de Staphylococcus de importancia en alimentos, siendo, las especies coagulasa-positivas como S. aureus las que más se transmiten por alimentos (3).
Staphylococci are normal inhabitants of the body surface of the majority of warm blooded animals, present in mucous and skin, and for this reason the most important source of these bacteria in food are nasal passages and food handlers that have wounds and/or boils on hands and arms; additionally, domestic animals such as cows can be bearers of this bacteria, since S. aureus is an important mastitis producer in milk-producing females, which contaminates cheese made from it (3).
Los estafilococos son habitantes normales de las superficies corporales de la mayoría de los animales de sangre caliente, encontrándose en las mucosas y en la piel, por esta razón la fuente más importante de estas bacterias en los alimentos son los portadores nasales y las personas con heridas y/o forúnculos en manos y brazos que manipulan los alimentos; adicionalmente, animales domésticos como vacas pueden ser portadores de esta bacteria ya que S. aureus es importante productor de mastitis en hembras lecheras contaminando el queso elaborado con la misma (3).
Staphylococcus aureus produces a wide range of substances associated with virulence, among them enzymes, cytotoxins, exotoxins, exfoliative toxins and enterotoxins (4). The main factor for virulence of Staphylococcus involved in staphylococcal food poisoning (SFP) is the production of enterotoxins (SE). S. aureus produces five typical toxins: SEA, SEB, SEC, SED and SEE, which produce emesis in primates. The enterotoxins that are best characterized are ESA and ESB; the most frequent outbreaks of ETAs are ESA and ESP (4). S. aureus enterotoxins are thermostable, and thus resist thermal treatments to which food is subjected (3).
Staphylococcus aureus produce una gama amplia de sustancias asociadas con la virulencia, entre ellas enzimas, citotoxinas, exotoxinas, toxinas exfoliativas y enterotoxinas (4). El principal factor de virulencia de Staphylococcus involucrado en la intoxicación alimentaria estafilocócica (IAE) es la producción de enterotoxinas (SE). S. aureus produce cinco toxinas típicas: SEA, SEB, SEC, SED y SEE las cuales producen emesis en primates. Las enterotoxinas mejor caracterizadas son la ESA y ESB; las más frecuentes en brotes de ETAs son la ESA y la ESB (4). Las enterotoxinas de S. aureus
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FBI is acquired when consuming food where the microorganism has preformed one or several of its enterotoxins. Symptoms generally develop 6 hours after ingesting contaminated food, characterized by vomiting, nausea, abdominal spasms and diarrhea. It can cause death in persons whose autoimmune system is compromised. FBI is self-limiting and is not a notifiable illness, which means that many outbreaks and cases are not reported. In the United States of America (USA) it has been calculated that only from 1 to 5% of all food poisoning cases are reported; however, it is estimated that it causes 14% of the FBIs in the country (5). S. aureus is considered one of the principal agents causing FBIs in the world, and the pathogen is more frequently associated with cheese made with raw milk (6). In the United States, it is calculated that more than 241,000 domestic cases of staphylococcal food poisoning (SFP) occur annually; keeping in mind that the hospitalization rate is 6.4% for confirmed laboratory cases, an average of 1,064 of these cases were hospitalized, resulting in 6 deaths (7). In France in 2008, S. aureus was confirmed as the second causative agent of FBIs after Salmonella and is the first suspected agent in 42.5% of FBI outbreaks. In Latin America many types of fresh artisan cheese exist; within FBIs are SFPs. In provinces of countries in the region, such as Cuba and Argentina, S. aureus has been one of the principal bacteria implicated in FBI outbreaks in periods from 2004-2008 and 1993-2001, respectively, with artisan cheese being an important food involved in those outbreaks (8,9). In Colombia, S. aureus is found among the principal microorganisms that are on the FBI surveillance network (10). Among published outbreaks is one that happened in the Atlantic Department in a school cafeteria from the Santo Tomás municipality and one that happened in the Honda municipality (Tolima), which affected people who participated in a community event; the causative agent in these outbreaks was S. aureus (11,12). The objectives of this study were to detect the prevalence of positive Staphylococcus coagulasa in doble crema (double cream) cheese made in the city of Pamplona, establishing if the analyzed cheese samples did or did not comply with the allowable limits for this bacteria as established by the Colombian Technical Standard (NTC) 750, and also to determine the presence of genes that codify ESA, ESB, ESC, ESD and ESE enterotoxins in positive Staphylococcus coagulasa strains by means of the Polymerase Chain Reaction (PCR).
son termoestables, de tal manera que resisten los tratamientos térmicos a los cuales se someten los alimentos (3). La IAE, se adquiere al consumir un alimento en el cual el microorganismo ha preformado una o varias de sus enterotoxinas. Los síntomas se desarrollan, generalmente, 6 horas después de la ingestión del alimento contaminado, caracterizándose por vómitos, náuseas, espasmos abdominales y diarrea. En personas inmunocomprometidas puede ocasionar la muerte. La IAE es autolimitante y no es una enfermedad de declaración obligatoria, aspectos que hacen que muchos brotes y casos no se informen. En los Estados Unidos de Norteamérica (USA) se ha calculado que sólo son declarados entre el 1 y el 5% de todos los casos por esta intoxicación, a pesar de esto, se estima que es la causante del 14% de ETAs en ese país (5). Se considera que S. aureus es uno de los principales agentes causales de ETAs en el mundo, y es el patógeno más frecuentemente asociado a quesos elaborados con leche cruda (6). En USA, se calcula que ocurren más de 241,000 casos domésticos de IAE anualmente; teniendo en cuenta una tasa aproximada de hospitalización del 6.4%, para los casos confirmados en el laboratorio, en promedio 1,064 de estos casos fueron hospitalizados resultando en 6 muertes (7). En Francia, en el 2008, fue confirmado S. aureus como el segundo agente causal de ETAs después de Salmonella y se le considera el primer agente sospechoso del 42.5% de los brotes de ETAs (6). En Latinoamérica existen muchos tipos de quesos frescos artesanales; dentro de las ETAs se destaca la IAE. En provincias de países de la región como Cuba y Argentina, S. aureus ha sido de las principales bacterias implicadas en brotes de ETAs en los períodos 2004-2008 y 1993-2001, respectivamente, resultando el queso artesanal un importante alimento involucrado en los mismos (8,9). En Colombia, S. aureus se encuentra entre los principales microorganismos que se declaran en la red de vigilancia de ETAs (10). Dentro de los brotes publicados se destacan el sucedido en el departamento del Atlántico en el comedor de un colegio del municipio de Santo Tomás y el ocurrido en el municipio de Honda (Tolima) el cual afectó a personas que participaban de un evento comunitario; en estos brotes se implicó como agente causal principal a S. aureus (11,12). Los objetivos del presente trabajo fueron detectar la prevalencia de Staphylococcus coagulasa positivos en muestras de queso doble crema artesanal elaborado en la ciudad de Pamplona, estableciendo si las muestras de queso analizadas cumplían o no con los límites permisibles para esta bacteria establecidos por la Norma Técnica Colombiana (NTC) 750 y también
Herrera - Enterotoxigenic genes in Staphylococcus from cheese MATERIALS AND METHODS Sampling. Over the course of a year, 100 samples of 200 g of doble crema (double cream) cheese made in Pamplona and sold in formally established places were collected. The samples were refrigerated and transported in the same conditions for immediate microbiological analysis. Isolation of Staphylococcus. The NTC 4779 recommendation (13) was followed: 10 g of the sample was taken and homogenized in 90 mL of 0.1% peptonized water (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom), making decimal dilutions up to 10-3; later 0.1 mL of dilutions 10-3 y 10-2 were piped (depending on the sample, at times 10-1 and 10-2 ó 10-3 and 10-4 dilutions were inoculated) on the previously prepared surface of the Baird Parker medium (Oxoid); the inoculated dilution was spread with the help of a Drigalsky loop until the surface was very dry, incubating at 35±2ºC for 48 hours. After the incubation time, plates that contained from 20-200 black, shiny colonies were selected having white shrunken borders and surrounded by clear areas that contrasted with the opaque medium, areas with precipitated calcium and magnesium salts, which were then counted; a minimum of three colonies were used for the coagulase test. Testing the coagulase. The number of colonies to be confirmed were transferred in the same number of tubes that contained 5 mL of Brain Heart Infusion broth (BHI, Oxoid), concluding a positive control, incubating at 35±2ºC for 18-24 hours. After this time, 0.3 mL of each BHI broth was put into tubes that contained 0.3 mL of dehydrated plasma of rabbit-EDTA (bioMerieux SA, Marcy l’Etoile, France), and a tube of 0.3 mL of plasma as a negative control was also transferred, incubating at 35±2ºC. For the first six hours they were observed hourly, in negative cases the reading was extended to 24 hours. Once finalized the incubation time, the results were interpreted, based on tubes that presented plasma coagulation, comparing them with positive and negative controls. The calculation of positive Staphylococcus coagulasa was done keeping in mind the total number of colonies after 48 hours of incubation and the proportion of colonies confirmed for the coagulase test, using as a correction factor the relation: positive colonies/ examined colonies, reporting Colony Forming Units (CFU)/g. Detecting enterotoxigenic genes. From the positive coagulase strains cultivated in Soy Tripticase broth (Oxoid) and incubated at 37ºC for 24 hours, 1 mL was transferred, centrifuged in a Eppendorf 5415D micro centrifuge at 12,000 rpm/3 min. Later 200 µL of Chelex (Bio-Rad,
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determinar la presencia de genes que codifican las enterotoxinas ESA, ESB, ESC, ESD y ESE, en las cepas de Staphylococcus coagulasa positivas, mediante la realización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
MATERIALES Y METODOS Muestreo. Durante el lapso de un año, se recolectaron 100 muestras de 200 g de queso doble crema elaborado en Pamplona, expendido en lugares formalmente establecidos. Las muestras fueron refrigeradas y transportadas en las mismas condiciones y realizando los análisis microbiológicos inmediatamente. Aislamiento de Staphylococcus. Se siguió el protocolo recomendado por la NTC 4779 (13), así: se tomaron 10 g de la muestra y se homogeneizaron en 90 mL de agua peptonada 0.1% (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom), realizando diluciones decimales hasta 10-3; posteriormente se pipeteó 0.1 mL de las diluciones 10-3 y 10-2 (dependiendo de la muestra en algunos casos se inocularon las diluciones 10-1 y 10-2 ó 10-3 y 10-4) sobre la superficie del medio Baird Parker (Oxoid), previamente preparado; se extendió el inóculo con ayuda de un asa de Drigalsky hasta que la superficie quedó bien seca, incubando a 35±2ºC durante 48 horas. Transcurrido el período de incubación se seleccionaron las placas que contenían entre 20-200 colonias negras y brillantes con bordes reducidos blancos, rodeadas de zonas claras que contrastan con el medio opaco, zona de precipitado de sales de calcio y magnesio, las cuáles fueron contadas; se tomó un mínimo de tres colonias para realizar la prueba de la coagulasa. Prueba de la coagulasa. Se transfirió el número de colonias a confirmar en un mismo número de tubos que contenían 5 mL de caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI, Oxoid), incluyendo un control positivo, incubando a 35±2ºC durante 18-24 horas. Pasado este tiempo, se pasaron 0.3 mL de cada caldo BHI a tubos que contenían 0.3 mL de plasma deshidratado de conejo-EDTA (bioMerieux SA, Marcy l’Etoile, France), igualmente se transfirió a un tubo 0.3 mL del plasma como control negativo, incubando a 35±2ºC. Se observó cada hora durante las primeras seis horas, en caso negativo se realizó la lectura hasta las 24 horas. Una vez finalizado el tiempo de incubación, se interpretaron los resultados, con base en los tubos que presentaron coagulación del plasma, comparándolos con los controles positivos y negativos. Se realizó el cálculo de Staphylococcus coagulasa positivo teniendo en cuenta el número total de colonias después de las 48 horas de incubación y la proporción de colonias confirmadas por la prueba de la coagulasa, utilizando como factor de corrección la relación: colonias positivas/colonias examinadas, informando Unidades Formadoras de Colonia (UFC)/g.
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Hércules, California, USA) was added, the pellet was completely re-suspended and incubated at 56ºC for 30 min. Each tube was agitated in a vortex for 10 seconds; later each tube was placed on a heating block (JP Selecta S.A, Barcelona) at 100ºC for 8 minutes. Then each tube was again agitated and finally centrifuged at 12,000 rpm /3 min. The concentration of DNA used was quantified using a Spectrophotometer-UV Q3000 (Quawell, Beijing, China). Using 3 µL of the DNA (50 ng/µL approximately) the PCR was done, and for this, corresponding pairs of primers for each enterotoxin were used at a concentration of 25mM and a commercial cocktail, 5 PRIME MasterMix (Taq polimerase, buffer, dNTPs y Mg+2) (5 PRIME Hamburg, Germany). Different genes were amplified in a Mastercycler Personal (Eppendorf, Hamburg, Germany); the sequence of the primers used and the length of the amplified ones are shown in table 1 (14).
Table 1. Genes, primers, hybridization temperatures, and sizes expected in amplicons used to determine the presence of enterotoxin genes in positive S.aureus coagulase strains. Gen
Primer Sequence (5´ a 3´)
TH(ºC)
sea
ACGATCAATTTTTACAGC TGCATGTTTTCAGAGTTAATC
56
seb
GAATGATATTAATTCGCATC TCTTTGTCGTAAGATAAACTTC
55
416
sec
GACATAAAAGCTAGGAATTT AAATCGGATTAACATTATCCA
56
257
sed
TTACTAGTTTGGTAATATCTCCTT CCACCATAACAATTAATGC
58
334
see
ATAGATAAAGTTAAAACAAGCAA TAACTTACCGTGGACCC
52
170
LEA(pb) 544
TH: Temperature of hybridization; LEA: Expected amplicon length
The amplification products (5 μl) were subjected to electrophoresis in agarose gel (Bio-Rad) at 1% p/v at 100 V for 1 h. Visualization was done by means of staining with RedSafeTM (iNtRon Biotechnology, INC., Sungnam, Kyungki-Do, Korea), using a transiluminator ultraviolet light, Mini-Transiluminator (Bio-Rad) and documented with the Digimage System application connected to a Canon Power Shot G11 digital camera (Major Science, Taipei, Taiwan).
RESULTS The prevalence of positive Staphylocuccus coagulase (SCP) in the analyzed samples was 31%. Additionally, 27% of the samples did not comply with NTC 750 (15), which establishes the microbiological requirements (among them positive Staphylococcus coagulase), for fresh cheese (Table 2). In 23% of the samples a
Detección de genes enterotoxigénicos. A partir de las cepas coagulasa positivas crecidas en caldo Tripticasa de Soja (Oxoid), e incubadas a 37ºC durante 24 horas, se transfirió 1 mL, centrifugando en una microcentrífuga Eppendorf 5415D a 12,000 rpm/3 min. Posteriormente se adicionaron 200 µL de Chelex (Bio-Rad, Hércules, California, EEUU), resuspendiendo el “pellet” completamente e incubando a 56ºC por 30 min. Se agitó cada tubo empleando un vortex durante 10 segundos; luego se transfirió cada tubo a un bloque de calentamiento (JP Selecta S.A, Barcelona) a 100ºC durante 8 minutos. Nuevamente se agitó cada tubo y finalmente se centrifugó a 12,000 rpm /3 min. Se cuantificó la concentración de ADN empleando un Espectrofotómetro-UV Q3000 (Quawell, Beijing, China). Partiendo de 3 µL del ADN (50 ng/µL aproximadamente) se llevó a cabo la PCR, para esto, se emplearon los pares de cebadores correspondientes para cada enterotoxina a una concentración de 25 mM y un cóctel comercial 5 PRIME MasterMix (Taq polimerasa, buffer, dNTPs y Mg+2) (5 PRIME Hamburgo, Alemania). Fueron amplificados los diferentes genes en un equipo Mastercycler Personal (Eppendorf, Hamburgo, Alemania); la secuencia de los cebadores empleados y la longitud de los amplificados se muestran en la tabla 1 (14). Se sometieron los productos de la amplificación (5 μl) a electroforesis en gel de agarosa (BioRad) al 1% p/v a 100 V durante 1 h. Se realizó la visualización mediante tinción con RedSafeTM (iNtRon Biotechnology, INC., Sungnam, Kyungki-Do, Korea), empleando un transiluminador de luz ultravioleta, Mini-Transiluminador (Bio-Rad) y documentando con la aplicación del Digimage System acoplado a una cámara digital Canon Power Shot G11 (Major Science, Taipei, Taiwan).
RESULTADOS La prevalencia de Staphylocuccus coagulasa positivos (SCP) en las muestras analizadas fue del 31%. Adicionalmente, el 27% de las muestras incumplieron la NTC 750 (15), que establece los requisitos microbiológicos (entre ellos Staphylococcus coagulasa positivos), para queso fresco (Tabla 2). En el 23% de las muestras, se encontró una concentración de SCP mayor o igual a 104 UFC/g. De 65 cepas estudiadas se detectaron genes que codificaron para la producción de las enterotoxinas investigadas en el 24.6% de las cepas, las cuáles fueron aisladas a partir de 12 muestras. La prevalencia de genes para ESB, ESA y ESD en estas cepas fue de 18.5%, 4.6%, y 3.0%, respectivamente (Tabla 3, Figura 1). En una de las cepas estudiadas se detectaron los genes para las ESA y ESB simultáneamente. No se detectó la presencia de genes para producción de ESC ni ESE.
Herrera - Enterotoxigenic genes in Staphylococcus from cheese concentration of SCP greater or equal to 104 UFC/g was found. Of the 65 strains studied, genes that codified for the production of enterotoxins were found in 24.6% of the strains, which were isolated from 12 samples. The prevalence of genes for ESB, ESA and ESD in these strains was 18.5%, 4.6%, and 3.0%, respectively (Table 3, Figure 1). In one of the strains studied genes detected for ESA and ESB simultaneously. The presence of genes to produce ESC or ESE was not detected.
Figure 1: Example obtained for each one of the detected enterotoxins: M: pattern of molecular size 100 pb; 1: Strain ESA (+) ATCC (American Type Culture Collection) 13565; 2: Isolated cheese strain; 3: Strain ESB (+) CECT (Colección Española de Cultivos Tipo) 4459; 4-5: Isolated cheese strains; 6: Strain ESD (+) ATCC 23235; 7: Isolated cheese strain.
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Table 2. Quality of double cream samples studied according to the positive Staphylococcus coagulase count. UFC/g
% SAMPLES (N=100)
QUALITY CRITERIA
≤100
72
Good
>100-1000
1
Marginally acceptable
>1000
27
Inacceptable
: according to NTC 750
1
Table 3. Relationship of samples and strains in which the studied enterotoxinogenic genes were detected. SAMPLE
STRAIN
DETECTED ENTEROTOXENIC GEN
9
8
ESD
12
9
ESD
29
15
ESB
29
16
ESB
50
45
ESB
54
54
ESA
67
57
ESA
70
59
ESA/ESB
70
60
ESB
78
61
ESB
78
62
ESB
78
63
ESB
80
64
ESB
82
65
ESB
83
66
ESB
84
67
ESB
DISCUSSION
DISCUSIÓN
A high prevalence of SCP was found in the samples. These results concur with those found by Mendonça et al (16), who analyzed samples of fresh cheese sold in Brazil, determining a prevalence of 30.9%; similarly, data found by Maldonado and Llanca (17) in samples of cheese sold in Girardot, Aragua State, Venezuela, found SCP in 25% of the analyzed samples. However, these results are different from those found by other authors such as Rodríguez et al (18), who were not able to isolate SCP in samples of artisan cheese sold in Upata, Bolivar, Venezuela. Can and Celik (19) analyzed samples of cheese from Turkey, detecting SPC in 9.5% of the cheese samples. Jakobsen et al (20) detected SCP in 47.3% of samples of fresh artisan cheese made in Norway. In Colombia, Vanegas et al (10) isolated SCP in 100% of the samples sold in stores, on the street and in markets in Bogota.
Se encontró una alta prevalencia de SCP en las muestras. Estos resultados concuerdan con los hallados por Mendonça et al (16) quienes analizaron muestras de queso fresco expendido en Brasil, determinando una prevalencia del 30.9%; de igual forma se relaciona con los datos hallados por Maldonado y Llanca (17), en muestras de queso comercializado en Girardot estado Aragua, Venezuela quienes encontraron SCP en el 25% de las muestras analizadas. Sin embargo, estos resultados distan de los hallados por otros autores como Rodríguez et al (18) quienes no lograron aislar SCP en muestras de queso artesanal comercializado en Upata, Bolivar, Venezuela. Can y Celik (19) analizaron muestras de queso de origen turco, detectando SCP en el 9.5% de las muestras de queso. Jakobsen et al (20), detectaron SCP en el 47.3% de muestras de queso fresco elaborado artesanalmente en Noruega. En Colombia, Vanegas et al (10) aislaron SCP en el 100% de muestras de queso expendido en tiendas, ventas callejeras y mercados de la ciudad de Bogotá.
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On the other hand, an important percentage of samples did not comply with Colombian legislation that regulates these products (15). Different results were found by Giammanco et al, who determined that only 4% of the samples of traditional, fresh Sicilian cheese did not comply with European legislation (>103 CFU/g) (17). However, authors such as Maldonado and Llanca determined that 100% of samples of fresh cheese in the form of cakes sold in Girardot, Aragua State, Venezuela, did not comply with Covenin, the Venezuelan Commission of Industrial Regulations (>104 CFU/g). Luján et al (22) determined that 80% of the samples of fresh artisan cheese sold in three districts of Lima, Peru, did not comply with the Peruvian Technical Standards (>102 CFU/g). Komatsu et al (23) detected that 88% of the samples of cheese made in the city of Uberlândia, Brazil, did not comply with the standards established by the Ministry of Health for S. aureus (5.0 x 102 CFU/g).
Por otro lado, un importante porcentaje de muestras incumplieron la legislación colombiana que reglamenta estos alimentos (15). Resultados diferentes hallaron Giammanco et al, quienes determinaron que sólo el 4% de las muestras de queso fresco tradicional siciliano incumplían la legislación europea (>103 UFC/g) (17). Sin embargo, otros autores como Maldonado y Llanca determinaron que el 100% de las muestras de queso fresco en forma de torta expendido en Girardot, estado Aragua, Venezuela incumplían la norma de la Comisión Venezolana de Normas Industriales Covenin (>104 UFC/g). Luján et al (22) determinaron que el 80% de muestras de queso fresco artesanal comercializado en tres distritos de Lima, Perú, incumplían la Norma Técnica Peruana (>102 UFC/g). Komatsu et al (23) detectaron que el 88% de las muestras de queso elaborados en la ciudad de Uberlândia, Brasil, incumplían la norma establecida por el Ministerio de Salud para S. aureus (5.0 x 102 UFC/g).
The gene that codifies ESB was the main enterotoxic gene detected in this study, followed by ESA; results concur with the findings of Gücükoğlu et al (24), who analyzed samples of ice cream and found that the main enterotoxin produced was ESB. Valero-Leal (25) also found that ESB was the main enterotoxin detected in samples of milk and fresh cow cheese from Zulia State (Venezuela). On the other hand, Vanegas et al (10) detected ESA in 100% of the SCP strains isolated from artisan cheese from Bogota.
El gen que codifica la ESB fue el principal gen enterotóxico detectado en este estudio, seguido de la ESA; resultado que concuerda con los hallados por Gücükoğlu et al (24) quienes analizando muestras de helado de crema, y encontraron que la principal enterotoxina producida fue la ESB. Valero-Leal (25), también hallaron que la ESB fue la principal enterotoxina detectada en muestras de leche y queso freso de vaca originarios del estado Zulia (Venezuela). Por otro lado Vanegas et al (10), detectaron la ESA en el 100% de las cepas SCP aisladas a partir de queso artesanal procedente de Bogotá.
It has been determined that ESB is responsible for close to 10% of FBIs in the USA (4). Its lethal dose 50 (LD50) is 0.02mcg/kg (26), and concentrations of this toxin of just 0.4 μg/kg can induce symptoms in humans; additionally, it has been observed that individuals exposed to ESB manifest more severe symptoms than those exposed to ESA (5). On the other hand, it has been demonstrated that this enterotoxin maintains biological activity after heating to 60 ºC for 16 hours, and the optimum temperature for producing it in cultures is 39.4ºC (3), conditions that favor its presence in fresh cheese.
Se ha determinado que la ESB es responsable de cerca del 10% de los brotes de ETAs en USA (4). Su dosis letal 50 (LD50) es 0.02mcg/kg (26), concentraciones de esta toxina de tan solo 0.4 μg/kg pueden inducir los síntomas en humanos; adicionalmente, se ha observado, que individuos expuestos a la ESB manifiestan síntomas más severos que los expuestos a la ESA (5). De otra parte, se ha demostrado que esta enterotoxina retiene su actividad biológica luego del calentamiento a 60ºC durante 16 horas, y la temperatura óptima para su producción en medio de cultivo es de 39.4ºC (3), condiciones que favorecen su presencia en queso fresco.
An important percentage of samples analyzed found a concentration of SCP greater or equal to 104 CFU/g; the lowest number of S. aureus cells required to produce the minimum level of enterotoxins considered necessary to provoke illness depends on the type of enterotoxin. For example, ESA has been detected in concentrations of 104 CFU/g (3); it is recognized, in general, that this value is found between 105-108 CFU/g (5). However, there is data from reported SFP outbreaks in which SCP counts are from 7.6 x 102 (27), a concentration found in 33% of the samples analyzed in this study.
En un porcentaje importante de las muestras analizadas, se encontró una concentración de SCP mayor o igual a 104 UFC/g; el menor número de células de S. aureus requeridos para la producción del nivel mínimo de enterotoxinas considerado necesario para provocar enfermedad depende del tipo de enterotoxina, por ejemplo la ESA se ha detectado en concentraciones de 104 UFC/g (3); se reconoce, en general, que este valor se encuentra entre 105-108 UFC/g (5). Sin embargo, existen datos de brotes de IAE en los cuales se reportaron recuentos de SCP desde 7.6 x 102 (27), concentración encontrada en el 33% de las muestras analizadas en este trabajo.
Herrera - Enterotoxigenic genes in Staphylococcus from cheese Double cream cheese in Pamplona is made using raw milk and applying artisan processes where intrinsic and/or extrinsic factors do not exist that limit or control the presence of Staphylococcus aureus. Stretching, which is done between 40ºC and 42ºC, allows growth, since it can grow up to 47.8ºC; the pH of the finished product (5.35.6) does not control growth or the spread of this bacteria, since it can grow in pH of up to 4.0; the percentage of salt in the cheese (3.47% NaCl), is not considered a limitation for this bacteria, since it is halotolerant and can survive in salt concentrations of up to 20% p/p (5). Additionally, contamination can occur in any stage of production, since making the product implies intense contact with handlers, utensils, environments, among others. These stages are done at temperatures above 25°C that favor the spread of the bacteria, since S. aureus has a generation time of 0.8 h at this temperature (28) and therefore produces enterotoxins. On the other hand, the presence of this bacteria in this type of cheese could indicate contamination on the skin, mouth or nasal passages of handlers that came into direct contact with the food and did not follow minimal hygiene standards, such as the use of gloves, mouth coverings, caps or protective clothing, as well as poor cleaning of surfaces, equipment and utensils, which could be seen in some dairy microbusinesses in the province of Pamplona (29). Other sources of contamination could be milk with mastitis, work equipment and tools, air, dust and water. It is evident that inadequate cleaning and disinfecting practices increase the persistence of the bacteria in cheese processing equipment and environments, and the demonstrated resistance of S.aureus to disinfectants when a biofilm is formed is added to this (30).
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La elaboración del queso doble crema, en Pamplona, se realiza empleando leche cruda como materia prima, aplicando procesos artesanales en los que no existen factores intrínsecos y/o extrínsecos, que limiten o controlen la presencia de Staphylococcus aureus: en primer lugar la etapa de hilado, que se realiza entre 40ºC y 42ºC, permite su crecimiento ya que puede crecer hasta los 47.8ºC; el pH del producto terminado (5.3-5.6) no controla el crecimiento ni la multiplicación de esta bacteria porque puede crecer a pH incluso de 4.0; el porcentaje de sal del queso (3.47% NaCl), no se considera limitante para esta bacteria ya que es halotolerante soportando concentraciones de sal hasta del 20% p/p (5). Adicionalmente, se puede presentar contaminación en cualquier etapa del proceso de elaboración ya que la obtención del producto implica etapas con elevado contacto con manipuladores, utensilios, ambientes, entre otros, etapas que se realizan a temperaturas superiores a 25°C que favorecen la multiplicación de la bacteria, ya que S. aureus presenta un tiempo de generación en la leche de 0.8 h a esta temperatura (28), y por ende la producción de enterotoxinas. Por otra parte, la presencia de esta bacteria en este tipo de queso podría indicar contaminación a partir de la piel, boca o fosas nasales de los manipuladores que entraron en contacto directo con el alimento y no contaban con las mínimas normas de higiene, como el uso de guantes, tapa bocas, gorros y batas, además de la deficiente higiene de superficies, equipos y utensilios, lo cual pudo comprobarse en algunas microempresas lácteas de la provincia de Pamplona (29). Otras fuentes de contaminación pueden ser, leche con mastitis, equipos y utensilios de trabajo, aire, polvo y agua. Es evidente que inadecuadas prácticas de limpieza y desinfección aumentan la persistencia de la bacteria en los equipos y ambientes de procesamiento del queso; a esto hay que sumar la demostrada resistencia de S.aureus a desinfectantes cuando forma biopelículas (30).
In conclusion, a high prevalence of Staphylococcus was found in samples of double cream cheese made in Pamplona, reflecting inadequate hygiene practices and disinfection used all along the processing chain, so that it is necessary to train food handlers in Good Manufacturing Practices. Additionally, the storage temperature of milk and the finished product should be controlled so as to minimize the spread of the bacteria.
En conclusión, se encontró una alta prevalencia de Staphylococcus en las muestras de queso doble crema elaborado en Pamplona, reflejando inadecuadas practicas de higiene y desinfección empleadas a lo largo de toda la cadena de procesamiento del mismo, de tal manera que se debe capacitar a los manipuladores en Buenas Prácticas de Manufactura. Además, se deben controlar la temperatura de almacenamiento de la leche y del producto terminado para minimizar la multiplicación de la bacteria.
Finding enterotoxigenic genes in 24.6% of the analyzed strains that correspond to the toxins that are most frequently found in FBI outbreaks indicates that double cream cheese made in Pamplona can be a public health risk.
El hecho de encontrar en el 24.6% de las cepas analizadas, genes enterotoxigénicos correspondientes a las toxinas más frecuentemente implicadas en brotes de ETAs, indica que el queso doble crema elaborado en Pamplona puede representar un peligro para la salud pública.
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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015
Acknowledgements
Agradecimientos
Universidad de Pamplona. Faculty of Basic Sciences, Department of Microbiology, students of the Semillero of the Investigation Group in Microbiology and Biotechnology, Paola Andrea Naranjo, Yelitza Lizcano and Vanessa Ortega.
A la Universidad de Pamplona. Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Microbiología, estudiantes del Semillero del Grupo de Investigación en Microbiología y Biotecnología, Paola Andrea Naranjo, Yelitza Lizcano y Vanessa Ortega.
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4482-4487, 2015. ISSN: 0122-0268 COMUNICACIÓN BREVE
The search for the mdr1-1Δ mutation of the MDR1 gene in four canine breeds in Uruguay (preliminary study) Búsqueda de la mutación mdr1-1Δ del gen MDR1 en cuatro razas caninas en Uruguay (estudio preliminar) Rosa Gagliardi B,1* M.Sc, Diana Martínez A,2 MV, Beatriz Tellechea H,2 MV, Pedro Sitjar Q,2 MV, Silvia Llambí D,1 Ph.D, María Arruga L,3 Ph.D. Universidad de la República, Facultad de Veterinaria, Área Genética. Montevideo, C.P. 11600, Uruguay. Veterinarios con ejercicio liberal de la profesión. 3Universidad de Zaragoza, Facultad de Veterinaria, Laboratorio de Citogenética y Genética Molecular. Zaragoza, C. P. 50013, España. *Correspondencia: rgagliar@gmail.com 1 2
Received: May 2014; Accepted: October 2014.
ABSTRACT Objective. The objective of this study is to analyze the frequency of mdr1-1Δ mutation in German Shepherd, Doberman, Border Collie and Greyhound dog breeds in Uruguay. Materials and methods. A total of 95 animals from the four breeds mentioned above were studied. DNA was isolated from blood using potassium acetate with a subsequent degradation from RNA with RNAsaH. The concentration and quality of the DNA obtained was evaluated with a Nanodrop, ND-1000 spectrophotometer. To determine the presence or absence of the mdr1-1Δ mutation, DNA samples were sent to Gene Seek, Neogen Corporation of Chicago, United States, for genotyping. Results. In all 95 animals studied, the mdr1-1Δ mutation was not present. Conclusions. Based on the preliminary results obtained, other elements that may cause adverse drug reactions must be considered: unidentified mutations in other regions of the MDR1 gene; mutations in other genes involved in the transport of drugs from the same subfamily or another; mutations in enzymes involved in drug metabolism (e.g. Cytochrome P450). Moreover, especially with Border Collies and Greyhounds, it is advisable to increase the number of animals in the study. Key words: Dogs, ivermectine, P-glycoprotein (Source: CAB).
RESUMEN Objetivo. En este trabajo se realizó la búsqueda de la mutación mdr1-1Δ en caninos de las razas Ovejero Alemán, Doberman, Galgo y Border Collie de Uruguay. Materiales y métodos. Se estudió un total de 95 animales, de las cuatro razas caninas mencionadas. El ADN se aisló a partir de muestras sanguíneas empleando acetato de potasio 8M con posterior degradación de ARN con RNAsaH. Se evaluó la concentración y calidad del ADN en un espectrofotómetro Nanodrop, ND-1000. Para conocer la presencia o ausencia de la mutación mdr1-1Δ, los ADN de las muestras extraídas se enviaron a Gene Seek, (Neogen Corporation) de Chicago, Estados Unidos. Resultados. En ninguno de los 95 animales estudiados se encontró la mutación mdr1-1Δ. Conclusiones. Dados los resultados preliminares obtenidos, se deberían considerar otros elementos que puedan causar reacciones adversas a fármacos: mutaciones aun no identificadas en otras regiones del gen MDR1; mutaciones en otros genes que intervengan en el transporte de medicamentos de la misma subfamilia u otra; mutaciones en enzimas que participan en el metabolismo de los medicamentos (ej. Citocromo P450). Por otra parte, y en particular en las razas Border Collie y Galgo es aconsejable aumentar el número de animales en estudio. Palabras clave: Glucoproteína-P, ivermectina, perros (Fuente: CAB). 4482
Gagliardi - Mdr1-1Δ mutation in four canine breeds in Uruguay
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INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Antiparasitic treatments in canines, both external and internal, are one of the routine tasks in a Veterinary Clinic. Different types of drugs are used for this treatment. Macrocyclic lactone is part of a family of endectocide antiparasitics that has frequently been used, particularly ivermectine. It increases the release and union of gamma-amino butyric acid (GABA) in nerve synapses, provoking the blockage of transmission impulses and paralysis of the parasite. GABA is an inhibiting neurotransmitter in the nervous system of nematodes and arthropods, while in mammals it acts on the central nervous system (CNS). In these latter ones the blood-brain barrier plays a protective role in preventing xenobiotics from entering, and for this reason drugs such as ivermectine present a wide safety margin.
Los tratamientos antiparasitarios, tanto contra parásitos externos como internos en caninos, son uno de los manejos de rutina en la Clínica Veterinaria. Con este fin se emplean diferentes clases de fármacos. La familia de las lactonas macrocíclicas es una familia de antiparasitarios endectocidas que se ha empleado frecuentemente, en particular la ivermectina. El modo de acción de la misma es aumentar la liberación y unión del ácido gamma-amino butírico (GABA) en las sinapsis nerviosas; provocando que se bloquee la transmisión de impulsos y la parálisis del parásito. El GABA es un neurotransmisor inhibidor en el sistema nervioso de nematodos y artrópodos, mientras que en mamíferos actúa en el sistema nervioso central (SNC). En estos últimos la barrera hematoencefálica cumple una función protectora evitando el ingreso de xenobióticos, de esta manera fármacos como la ivermectina presentan un amplio margen de seguridad.
P-glycoprotein, part of said barrier, is responsible for transporting different compounds outside the CNS and plays, in this case, a protective role (1). Starting in the 1980s, when ivermectine began to be used as an antiparasitic, cases began to be reported of canines that had neurologic symptoms (lethargy, ataxia, coma, blindness, convulsions, etc.) which resulted in respiratory paralysis and death of the animal. Generally Collies, Shetland Sheepdogs, Australian Shepherds, White Shepherds, Longhaired Whippets or dogs interbred with these breeds were affected. It was later seen that these animals lacked functional P-glycoprotein, caused by the presence of a 4pb deletion (mdr1-1Δ mutation) in the gene that codifies it (MDR1: multiple drug resistant gene) (2-5). Merola et al (1) performed drug neurotoxicity communications on different breeds and mixed breeds of dogs, including some where the abovementioned mutation has not been detected. Among the breeds that have been studied are German Shepherds, Dobermans, Border Collies and Greyhounds. Of these breeds, the one that showed mdr1-1Δ mutation was Border Collies and some breeds related to Greyhounds. In spite of these findings, it is important to consider that in some of these studies very few animals were analyzed (Doberman: 2 cases) (1). In this study, the preliminary search for mdr11Δ mutation in canines of the German Shepherd, Doberman, Greyhound and Border Collie breeds in Uruguay is carried out.
La glucoproteína-P, parte de dicha barrera, responsable de transportar diferentes compuestos fuera del SNC, cumple, en este caso, una función de protección (1). A partir de la década de 1980; momento en que se comenzó a usar la ivermectina como antiparasitario, se empezaron a comunicar casos de muerte de perros que presentaban sintomatología neurológica (letargia, ataxia, coma, ceguera, convulsiones, etc.) terminando en una parálisis respiratoria, con muerte del animal. Estos animales generalmente eran de la raza Collie, Shetland Sheepdog, Australian Shepherd, White Shepherd, Longhaired Whippet, o perros cruzados con estas razas. Posteriormente se vió que estos animales carecían de una glucoproteína-P funcional: hecho causado por la presencia de una deleción de 4pb (mutación mdr1-1Δ) en el gen que la codifica (MDR1: gen de resistencia múltiple a fármacos)(2-5). Merola et al (1), realizaron comunicaciones de neurotoxicidad a fármacos en perros de diferentes razas y mestizos; incluyendo algunas donde no se ha descrito la mutación mencionada. Entre las razas que se han estudiado se encuentran el Ovejero Alemán (Pastor Alemán), Doberman, Border Collie, Galgo. De estas razas, en las que se describió la mutación mdr1-1Δ fue en Border Collie y en algunas razas relacionadas al Galgo. Pese a estos hallazgos, es importante considerar que en algunas de ellas se han analizado muy pocos animales (Doberman: 2 casos) (1). En este trabajo se realiza la búsqueda preliminar de la mutación mdr1-1Δ en caninos de las razas Ovejero Alemán, Doberman, Galgo y Border Collie de Uruguay.
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REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 20(1) Enero - Abril 2015
MATERIALS AND METHODS
MATERIALES Y MÉTODOS
Samples analyzed. A total of 95 animals from four breeds were studied: German Shepherd (34 animals), Doberman (31 animals), Greyhound (21 animals) and Border Collie (9 animals). The samples were random, from different regions of the country, particularly to the south, east and northeast (departments of Montevideo, Canelones, San José and Maldonado), due to animal density in these departments. Blood was drawn from the anterobrachial or saphenous vein, in conditions of asepsia, using K3 EDTA as an anticoagulant, preserved frozen until processed in the laboratory. Extractions were performed in the presence of the animal’s owners, at their home or during a routine veterinary visit, with minimal stress, following CHEA regulations (Honorary Commission on Animal Experimentation).
Muestra analizada. Se estudió un total de 95 animales, de cuatro razas caninas: Ovejero Alemán (34 muestras), Doberman (31 muestras), Galgos (21 muestras) y Border Collie (9 muestras). Dichas muestras se tomaron al azar, de diferentes regiones del país, particularmente sur, este y noreste (departamentos de Montevideo, Canelones, San José y Maldonado). Esto se debió a la densidad de animales en esos departamentos. La sangre se extrajo de la vena anterobraquial o de la safena, en condiciones de asepsia, empleando como anticoagulante K3 EDTA, conservándose congelada hasta su procesamiento en el laboratorio. Las extracciones se realizaron en presencia de los propietarios de los animales, en el domicilio o en una visita de rutina a la Veterinaria, con un estrés mínimo, siguiendo las normas de la CHEA (Comisión Honoraria de Experimentación Animal).
DNA Isolating. DNA was isolated using an extraction technique with potassium acetate 8M and later degradation of RNA with RNAsaH (6). A spectrophotometer (Nanodrop, ND-1000) was used to evaluate the concentration and quality of DNA obtained. Search for the mutation. To find the genotype of the MDR1 gene, DNA from extracted samples was sent to the Gene Seek laboratory, Neogen Corporation from Chicago, United States. In table 1 a sample from a region of the MDR1 gene that includes the studied mutation is shown. Table 1. MDR1 gene region where nucleotides underlined are lost in presence of the mdr1-1Δ mutation. TAGGTTGTATATGTTGGTGGGGACAATGGCTGCCATCATCCATGGAGCTG CACTCCCTCTCATGATGCTGGTTTTTGGAAACATGACAGATAGCTTTGCAA ATGCAGGAATTTCAAGAAACAAAACTTTTCCAGTTATAATTAATGAAAGTAA
RESULTS As can be seen in table 2, where as an example a sample is shown of the result of the genotypes of 10 of samples studied, none of the cases that were analyzed in this work presented the mdr1-1Δ mutation.
DISCUSSION The absence of the mdr1-1Δ mutation in the 95 genotyped samples belonging to the four canine breeds could be due in first place to the low number of genotyped samples for each breed, considering that the frequency of the mutation
Aislamiento de ADN. El ADN se aisló empleando la técnica de extracción con acetato de potasio 8M y posterior degradación de ARN con RNAsaH (6). Para evaluar la concentración y calidad del ADN obtenido se empleó un espectrofotómetro (Nanodrop, ND-1000). Búsqueda de la mutación. Para conocer el genotipo para el gen MDR1, el ADN de las muestras extraídas se envió al laboratorio Gene Seek, Neogen Corporation de Chicago, Estados Unidos. En la tabla 1 se muestra una región del gen MDR1 que incluye la mutación estudiada.
RESULTADOS Según puede verse en la tabla 2, donde se muestra como ejemplo el resultado de los genotipos de 10 de las muestras estudiadas, en ninguno de los casos que se analizaron en este trabajo, se presentó la mutación mdr1-1Δ. Table 2. Results of genotypes from 10 of the studied samples (original results).
BC3
AGAT
AGAT
BC4
AGAT
AGAT
BC5
AGAT
AGAT
G10
AGAT
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G11
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GS1
AGAT
AGAT
GS2
AGAT
AGAT
D1
AGAT
AGAT
D2
AGAT
AGAT
D3
AGAT
AGAT
BC: Border Collie, G: Greyhound, GS: German Shepherd, D: Doberman.
Gagliardi - Mdr1-1Δ mutation in four canine breeds in Uruguay is low. Merola (1) studied dogs of different races that presented sensibility to ivermectine. Among these dogs, 20% of cases with German Shepherds presented sensibility to the drug, and in Greyhounds, 7.6%. In these cases, a direct relation between the existence of sensibility and the administered dose of ivermectine is shown. Animals that have the studied mutation lack normal P glycoprotein, being susceptible to ivermectine even in the low doses (0.15 to 0.34 mg/kg) (1) used in routine treatments in veterinary clinics. In reference to this study, the mdr1-1Δ mutation was sought in four breeds that have shown adverse reactions to ivermectine or that are related to the Collie Border breed. In the case of German Shepherds, in the United States the mdr1-1Δ mutation was described specifically in white animals (7,8). In that country, white is a variety within the breed. On the other hand, in Europe the mutation has not been detected in German shepherds. However, white animals make up the White Swiss Shepherd breed, which does present the mdr1-1Δ mutation in an elevated frequency (2,3). In Uruguay, German Shepherds are found widely throughout the country. Additionally, White Swiss Shepherd is not clearly defined as a separate breed. The majority of the samples taken for this study correspond to the southeast area of the country, where there are no white animals. At any rate, it is unknown if the animals studied are related to animals of this color. These preliminary results lead to the prediction that the mutation problem would not be present in German Shepherds without the introgression of White Swiss Shepherds. Regarding Dobermans, there is little previous information regarding the presence or absence of the mdr1-1Δ mutation (1). In spite of the fact that cases reporting sensitivity to the drug exist, the presence of the aforementioned mutation have not been communicated. In this breed, around the world, two cases of drug poisoning with ivermectine were discovered. In the first case, the animal accidentally ingested an excessive amount of the drug (1). This case was described in the 1990s, and since the mutation had not been described, its presence could not be determined. The second case involved animals with demodicosis that were treated with ivermectine and presented neurotoxicity. These cases were genotyped for the MDR1 gene, normal homozygotes for this gene (9). In reference to Greyhounds, 23 samples were studied and all showed a negative result for
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DISCUSIÓN La ausencia de la mutación mdr1-1Δ en las 95 muestras genotipificadas pertenecientes a las cuatro razas caninas podría deberse en primer lugar, al bajo número de muestras genotipificadas para cada raza, considerando que la frecuencia de la mutación fuera relativamente baja. Merola (1) estudió perros de diferentes razas que presentaban sensibilidad a la ivermectina. Entre estos perros, de los Pastores Alemanes el 20% de los casos presentaba sensibilidad a dicho fármaco, y de los Greyhound el 7.6%. En estos casos, se encontró una relación directa entre la existencia de sensibilidad y la dosis de ivermectina administrada. Los animales que presentan la mutación estudiada, carecen de una glucoproteína P normal; siendo susceptibles a la ivermectina aún con dosis bajas (0.15 to 0.34 mg/kg) (1), usadas en tratamientos de rutina en la Clínica Veterinaria. En lo que se refiere a este trabajo, se buscó la mutación mdr1-1Δ, en cuatro razas donde se han descrito reacciones adversas a la ivermectina o que están relacionadas a la raza Collie (Border Collie). En el caso de los perros de raza Ovejero Alemán, en Estados Unidos, se describió la mutación mdr1-1Δ, específicamente en animales de color blanco (7,8). En este país, el blanco es una variedad dentro de la raza. Por otra parte, en Europa se ha comunicado que en pastores alemanes no se ha detectado la mutación. Sin embargo, los animales de la variedad de color blanco constituyen la raza Pastor Blanco Suizo, la que sí presenta la mutación mdr1-1Δ en una frecuencia elevada (2,3). En Uruguay, la raza Pastor Alemán se encuentra ampliamente difundida. A esto se suma el hecho de que el perro Pastor Blanco Suizo no presenta una separación clara de esta raza. La mayoría de las muestras extraídas en este trabajo corresponden al sureste del país, donde no se presentan animales de color blanco. De todas formas, se desconoce si los animales estudiados están relacionados con animales de este color. Estos resultados preliminares permiten predecir que la mutación problema no estaría presente en la raza Ovejero Alemán sin introgresión del Pastor Blanco Suizo. En cuanto a la raza Doberman, existe poca información previa respecto de la presencia o ausencia de la mutación mdr1-1Δ (1). Pese a que se han descrito casos de sensibilidad a fármacos, no se ha comunicado la presencia de la mutación mencionada. En esta raza, a nivel mundial, se describieron dos casos de intoxicación farmacológica con ivermectina. En el primero de ellos, el animal ingirió accidentalmente una cantidad excesiva del fármaco (1). Este caso fue descrito en la década de 1990, por lo que al no haber estado descrita la mutación, no se pudo determinar su presencia. En el segundo caso se trató de animales con demodicosis que recibieron tratamiento con
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the mdr1-1Δ mutation. According to previous studies (8), in certain breeds related to these animals (Longhair Whippet), the mutation is found in elevated frequencies at more than 40%. The fact that it was not found in the analyzed samples could be attributed to the fact that in our country there are no pure animals of this breed, since the majority are a cross between creole greyhound and English Greyhound, as well as others. At any rate, it would be important to increase the number of animals analyzed, considering the possibility that the mutation is rarely found in the population of greyhounds in our country. On the other hand, given the mix in the breed, it would be interesting to continue studying these animals in order to have a better idea of the situation respecting this mutation. In the case of Border Collies, where 9 animals were studied, the mdr1-1Δ mutation wasn’t found either. In this breed, Neff et al (8) described the absence of the mutation. Other authors (10) detected it in frequencies of only 0.6%. In Uruguay previous studies were done to analyze wild dogs and collies, finding the mdr1-1Δ mutation only in collies (11,12). Given the existing relationship between Border Collies and collies, where the studied mutation was first described, and the fact that there are authors that found it in very low frequency, it would be interesting to continue studying this breed and increase the number of sampled animals to know their situation in the country. As previously mentioned, former studies (1) associated toxicity to ivermectine with the dose that was administered, and keeping in mind that in the four breeds that were studied there were cases of sensitivity to ivermectine, it was considered that drug sensitivity could be due to yet unidentified mutations in other regions of the MDR1 gene, mutations in other genes that intervene in the transport of drugs from the same subfamily or another one, or mutations in enzymes that participate in the metabolism of these drugs (e.g. cytochrome P450) (9,13). Based on the results obtained in this study and the elements previously mentioned, the possibility that animals from the studied breeds could present adverse reactions to drugs such as ivermectine cannot be discarded, and it is advisable for more studies to be done in order to be able to analyze different causes responsible for the mentioned drug sensitivity, among others. This acquires greater interest if the amount of drugs that underlie P glycoprotein are considered as well as the relationship this has to other types of treatments such as those with antitumor drugs.
ivermectina y presentaron neurotoxicidad. Estos fueron genotipificados para el gen MDR1 siendo homocigotas normales para este gen (9). En lo que se refiere a los Galgos, se estudiaron 23 muestras dando, todas ellas, un resultado negativo para la mutación mdr1-1Δ. Según estudios previos (8), en determinadas razas relacionadas a estos animales (Longhair whippet) la mutación se encuentra en frecuencias elevadas, de más del 40%. El no haberla encontrado en las muestras analizadas podría atribuirse a que en nuestro país no se encuentran animales puros de esta raza; siendo la mayoría cruzas entre galgo criollo y greyhound (galgo inglés), además de otras. De todas formas sería importante aumentar el número de animales analizado, considerando la posibilidad de que en la población de galgos de nuestro país la mutación se encuentre en baja frecuencia. Por otra parte, dado el grado de mestizaje que presenta la raza, es de interés continuar estudiando estos animales con el fin de conocer con mayor exactitud su situación respecto de esta mutación. En el caso de los Border Collie, raza en la que se estudiaron 9 animales, tampoco se encontró la mutación mdr1-1Δ. En esta raza, Neff et al (8) describieron la ausencia de la mutación. Otros autores (10) la detectaron en frecuencias de tan solo 0.6%. En Uruguay se realizaron estudios previos donde se analizaron perros cimarrones y animales de la raza Collie; encontrándose la mutación mdr1-1Δ únicamente en los Collie (11,12). Dada la relación existente entre los Border Collie y los Collie, donde se describió en primera instancia la mutación estudiada, y el hecho de que hay autores que la encontraron en muy baja frecuencia, interesa continuar estudiando esta raza y aumentando el número de animales muestreados para conocer la situación de la misma en el país. Como se mencionó previamente, estudios anteriores (1) asocian la toxicidad de la ivermectina con la dosis a la que se administra, y teniendo en cuenta que en las cuatro razas estudiadas se describieron casos de sensibilidad a ivermectina, se consideró que la sensibilidad a fármacos podría deberse también a mutaciones aun no identificadas en otras regiones del gen MDR1; mutaciones en otros genes que intervengan en el transporte de fármacos de la misma subfamilia u otra; mutaciones en enzimas que participan en el metabolismo de los fármacos (ej. citocromo P450)(9,13). Basados en los resultados obtenidos en este trabajo, y los elementos mencionados previamente, no se descarta la posibilidad de que animales de las razas estudiadas puedan presentar reacciones adversas a drogas como la ivermectina, siendo aconsejable realizar más estudios con el fin de poder analizar diferentes causas responsables de la sensibilidad al
Gagliardi - Mdr1-1Δ mutation in four canine breeds in Uruguay Acknowledgments The authors thank the Kennel Club Uruguayo (FVet, UdelaR agreement), the breeders of the animals that were studied, and individual veterinarians, all of whom worked to obtain samples of the animals studied.
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fármaco mencionado entre otros. Esto adquiere mayor interés si se considera la cantidad de fármacos que son sustrato de la glucoproteína P y también la relación que esta tiene con otro tipo de tratamientos como son los tratamientos con fármacos antitumorales. Agradecimientos Los autores agradecen al Kennel Club Uruguayo (convenio FVet, UdelaR), a criadores de las razas estudiadas y a veterinarios particulares. Todos los anteriores colaboraron en la obtención de las muestras de los animales estudiados.
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4488-4494, 2015. ISSN: 0122-0268 COMUNICACIÓN BREVE
Possibility of culturing Pacific goliath grouper Epinephelus quinquefasciatus in water with different salinities Posibilidad de cultivo del mero guasa del Pacífico Epinephelus quinquefasciatus en aguas de diferentes salinidades Lury García N,1* M.Sc, Frank Chapman Ch,2 Ph.D. Universidad del Pacífico, Programa de Tecnología en Acuicultura, Av Simón Bolívar # 54A-10 Los Laureles, Buenaventura-Valle del Cauca, Colombia. 2University of Florida, Program Fisheries and Aquatic Sciences, 7922 NW 71st Street, Gainesville-Florida 32653, USA. *Correspondencia: lurynohemyg3@gmail.com; fchapman@ufl.edu 1
Received: March 2014; Accepted: November 2014.
ABSTRACT Objective. To assess the survival and growth of juvenile Pacific goliath grouper (Epinephelus quinquefasciatus) in captivity at low salinities. Materials and methods. We randomly selected twelve juvenile goliath groupers with an average standard length of 44.2 ± 6.1 cm and 1492 ± 476 g in body weight, and raised them for three months in the laboratory in waters of 32-26, 20, 10 and 5 parts per thousand of salinity. Results. All juvenile Pacific goliath groupers tolerated the initial gradual transfer from full strength seawater to salinities of 32-26, 20, 10, and 5 parts per thousand, which was done over a period of four days. All of them survived and grew in body weight and length during the course of the three-month experiment, in all the treatments of high and low salinity water. The body condition factor (K) for each fish was between 1.5 and 2.4. Conclusions. This is a first time trial that documents a randomized, controlled experiment demonstrating the ability of Pacific juvenile goliath grouper to gradually transfer from full strength seawater to water of lower salinity, and survive and grow well in these brackish waters. Key words: Aquaculture, euryhaline species, osmoregulation, water salinity (Source: BNA, NAL).
RESUMEN Objetivo. Evaluar la supervivencia y crecimiento de mero guasa del Pacifico (Epinephelus quinquefasciatus) a bajas salinidades en cautiverio. Materiales y métodos. Se seleccionaron al azar doce juveniles de mero guasa de una longitud estándar promedio de 44.2 ± 6.1 cm y 1492 ± 476 g de peso corporal, que fueron criados por tres meses en el laboratorio en aguas de 32-26, 20, 10, y 5 unidades prácticas de salinidad (UPS). Resultados. Todos los juveniles de mero guasa toleraron la transferencia gradual, que se realizó en cuatro días, desde agua de mar a aguas con salinidades de 32-26, 20, 10, y 5 UPS. Igualmente todos sobrevivieron los tres meses, y presentaron ganancia en peso y longitud corporal en todos los tratamientos con niveles altos y bajos de salinidad. Los factores de condición corporal (K), para cada pez estuvieron entre 1.5 y 2.4. Conclusiones. Por primera vez se documenta un experimento de prueba aleatoria controlada; que demuestra la habilidad de juveniles de mero guasa del Pacífico, a poder adaptarse de agua marina a salinidades más bajas que las de su medio ambiente natural, y de crecer en ellas con total supervivencia. Palabras clave: Acuicultura, especies eurihalinas, osmoregulación, salinidad del agua (Fuente: BNA, NAL). 4488
García - Culturing Epinephelus quinquefasciatus in water of different salinities
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INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
The resources that draw greater commercial interest in the marine fish industry in Colombia a r e s h r i m p s , l o b s t e r, t u n a s , s n a p p e r s , mackerels and groupers (1). Of the grouper the most desired is the goliath grouper, its flesh is considered excellent, and high prices in the local and international market are obtained. It is a large species that reaches up to 455 kg in weight and 2.5 m long (2). The biological and ecological characteristics of the species indicate great adaptability to captivity and the ability to endure environmental fluctuations, including salinity (3-5). In captivity, individual fish from 0.5-3.5 kg more than double their weight in 90 to 240 days (3). It could be a marine fish species adaptable to diversification of aquaculture in Colombia. However, there is little information about its adaptability to low salinity conditions and culturing the species under these circumstances (3-5).
Los recursos de mayor interés comercial de la pesca marítima industrial en Colombia son los camarones, langosta, atunes, pargos, sierras, chernas y meros (1). De los meros, el guasa es de los más apetecidos, su carne es considerada excelente, y obtiene altos precios tanto en el mercado local como internacional. Es una especie de gran tamaño, alcanza hasta 455 kg de peso y 2.5 m de longitud (2). Las características biológicas y ecológicas de la especie indican gran adaptabilidad de su medio ambiente al cautiverio y a soportar amplias fluctuaciones ambientales, incluyendo la salinidad (3-5). En cautiverio individuos de 0.5-3.5 kg alcanzaron más del doble de su peso en 90 a 240 días (3). Puede ser una especie de pez marino adecuada para la diversificación de la acuicultura en Colombia. Sin embargo, existe poca información sobre su adaptabilidad a condiciones de baja salinidad y del cultivo de la especie en estas circunstancias (3-5).
Marine aquaculture, including grouper, is principally done in cages suspended in protected areas of the sea or in channels and tanks in farms by the sea (6). Although culturing in cages in the sea is the simplest and most economic initial solution, a viable alternative that protects the environment, economic growth, social and cultural sustainability, principally in Colombia, is culturing marine fish inland (opinion of the authors of this study). Also in the opinion of the authors is that the principal advantages of culturing marine fish in the inland is the possibility of improved control over the environment where the animals are bred, predator control, the option to apply a feeding ration protocol that is efficient and results in weight gain and growth, feeding at required times, and reducing food waste that often occurs in cages, thus lowering feeding costs and increasing the productive efficiency of fish culture. From the point of view of environmental sustainability, culturing marine fish inland could make use of saline water and land that is not apt for agriculture or farming. Breeding marine fish with a high commercial value would enable a diversification of production risks and profitability, and would offer new opportunities for economic growth and employment in the rural sector. This is especially true for the costal populations that are characterized by having a culture and life style immersed in a mix of traditional agriculture and artisan fishing. In a recent study it was shown that grouper has the anatomic and physiologic mechanisms
La acuicultura marina, incluyendo la del mero, se práctica principalmente en jaulas suspendidas en áreas protegidas en el mar o en canales y estanques en granjas junto al mar (6). Aunque el cultivo en jaulas en el mar es la solución inicial más sencilla y económica, una alternativa viable para la protección del medio ambiente, crecimiento económico, y sostenibilidad social como cultural, principalmente en Colombia, es el cultivo de peces marinos en tierra adentro (opinión de los autores de este estudio). Es opinión también de los autores, de las principales ventajas del cultivo de peces marinos tierra adentro es la posibilidad de controlar mejor el ambiente en donde se crían los animales, el control de predadores, opción de aplicar un protocolo de ración alimentaria que muestre eficiencia y ganancia de peso y crecimiento de los animales, alimentar cuando sea requerido, y reducir el desperdicio de comida que ocurre con mayor frecuencia en jaulas, disminuyendo de esta forma los costos de alimentación y aumentando la eficiencia productiva del cultivo. Desde el punto de vista de sostenibilidad ambiental, el cultivo de peces marinos en tierra adentro podría hacer uso de aguas y tierras salinas no aptas para agricultura o ganadería. El cultivo de peces marinos de alto valor comercial haría diversificar riesgos de producción y rentabilidad, y ofrecería nuevas oportunidades de crecimiento económico y empleo en el sector rural. Lo anterior, especialmente en las poblaciones costeras que se caracterizan por tener una cultura y estilo de vida inmersas en una mezcla de agricultura tradicional y pesca artesanal. En un reciente estudio se demostró que el mero guasa tiene los mecanismos anatómicos y fisiológicos de osmoregulación que les permite mantener un adecuado balance de sales y agua en ambientes
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of osmoregulation that allows them to keep an adequate balance of salts and water in environments both fresh water and salt water (5). In static bioassays of acute toxicity of 96 hours (CL50-96h) in water with low salinity, the survival of the bass depends on weight (greater than 160g) or body size (5). Populations of goliath grouper are found on both coasts of Colombia and the species is recognized as Epinephelus itajara in the majority of texts. Recently the population of the Pacific was designed with the scientific name E. quinquefasciatus or Pacific goliath grouper (7). Although genetically different, up to now no apparent differences in the biological and ecological characteristics between the two populations have been observed. In the same way, individuals of both populations have demonstrated a great adaptability in captivity (5). Similarities in the results and interpretation between the two species can thus be assumed. The objective of this study was to evaluate the survival and growth of Pacific goliath grouper (Epinephelus quinquefasciatus) in brackish water.
MATERIALS AND METHODS Study site. Experiments were done at the Fish Culture Station facilities of the National Aquiculture and Fishing Authority (AUNAP) Bahía Málaga on the Pacific coast, Valle del Cauca, Colombia (04°06’00” N; 77°21’00” O). Animals in the experiment. The groupers were young Epinephelus quinquefasciatus (species previously known as E. itajara) collected from the natural marine environment (26-32 parts per thousand of salinity or pps; 35 pps=35 g of salt per liter of solution) close to the station, transported in plastic containers without sedatives, acclimated to captivity in floating cages (3 x 3 x 2 m with plastic mesh openings of 2.5 cm) in the ocean (26-32 pps and 28-32°C), and kept at a density of 20 kg/ m3 in inanition for a week before beginning the experiment to ease transition to feeding in captivity. Identification, handling of specimens and obtaining different salinities. From the group, 12 fish were selected with a standard average length (SL) of 44.2±6.1 cm and 1492±476 of weight; even when the number of fish was low, and there was high standard deviation, each individual represented an independent variable or standard since in this
tanto de agua dulce y agua salada (5). En bioensayos estáticos de toxicidad aguda de 96 horas (CL50-96h) en aguas de baja salinidades, la supervivencia de los meros depende de su peso (mayor de 160 g) o volumen corporal (5). Poblaciones de mero guasa se encuentran en ambas costas de Colombia y la especie es reconocida como Epinephelus itajara, en la mayoría de los textos. Recientemente a la población del Pacífico se le designó el nombre científico de E. quinquefasciatus o mero guasa del Pacífico (7). Aunque genéticamente diferentes, hasta el momento no se han observado diferencias aparentes en las características biológicas y ecológicas entre las dos poblaciones. Igualmente individuos de ambas poblaciones han demostradó gran adaptabilidad al cautiverio (5). Se puede asumir entonces similitudes en los resultados e interpretación entre las dos especies. El objetivo de este trabajo fue evaluar la supervivencia y crecimiento de mero guasa (Epinephelus quinquefasciatus) a bajas salinidades en cautiverio
MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. Los experimentos se realizaron en la instalaciones de la Estación Piscícola de la Autoridad Nacional de Acuicultura y Pesca (AUNAP) Bahía Málaga en la costa Pacífica, Valle del Cauca, Colombia (04°06’00” N; 77°21’00” O). Animales experimentales. Los meros fueron juveniles de Epinephelus quinquefasciatus (especie antes conocida como E. itajara) recolectados del medio natural marino (26-32 unidades prácticas de salinidad o ups; 35 ups=35 g de sal por litro de solución) en cercanías a la estación, transportados en vasijas de plástico sin sedante, aclimatados al cautiverio en jaulas flotantes (3 x 3 x 2 m con ojo de malla plástica de 2.5 cm) en el mar (26-32 ups y 28-32°C), y mantenidos a una densidad de 20 kg/m3 en inanición por una semana antes de comenzar el experimento para facilitar la transición al alimento en cautiverio. Identificación, manejo de especímenes y obtención de las diferentes salinidades. Del grupo, se seleccionaron al azar 12 ejemplares de una longitud estándar (LE) promedio de 44.2±6.1 cm y 1492±476 g de peso; aun cuando el número de ejemplares fue bajo, y desviación estándar alta, cada individuo representa una variable o muestra independiente ya que en este tipo de aclimatación (supervivencia y crecimiento) expresa la singularidad fisiológica de cada individuo y no necesariamente de grupo alguno; la comparacion de estas variables entre grupos es solo de referencia y descripción. Estos
García - Culturing Epinephelus quinquefasciatus in water of different salinities type of acclimation (survival or growth), the physiological singularity of each individual and not necessarily of any group is expressed; the comparison of these variables between groups is only a reference and description. These were taken to the laboratory and were randomly equally divided into 4 tanks with salinities of 5, 10, 20 and 26-32 ppt; the required salinities were obtained by diluting marine water in fresh water until reaching the required salinity which was verified with a refractometer; the salinity of salt water fluctuated between 26 and 32 ppt. Acclimation to the desired salinity was gradually done over 4 d. The salinity was reduced sea water at 20 ppt during one hour, and kept at this salinity for 24 h; then it was reduced by 15 ppt during one hour and kept at that salinity for 24 h; then it was reduced by 8 ppt and kept at that salinity for 48 h, and finally during one hour the complete transition to fresh water was made. Each fish was marked with a small cut on its fin. Captivity location and feeding of the specimens. The experiment was performed in tanks of 1500 l (2 x 1 x 1 m), with an interchange of 20% to 30% daily, and constant oxygenation; each system was randomly measured for oxygen, temperature, and salinity with a multiparameter instrument (YSI 85, YSI, Inc., U.S.A.). The fish were fed two times a day with pieces of fresh fish (Opistonema libertate) at 4% its total weight. This percentage was used so as not to introduce too much organic material in the system and thus be able to control the quality of the water. Survival, feeding, recording measurements and duration of the study. During the experiment it was observed that the survival of individuals and their individual feeding behavior as: consumption or rejection of feed. The assay was done over 12 weeks and every two weeks the fish were individually sampled, with the total weight recorded (g), total length and standard (cm). With this data the averages of weight and size were obtained, both initial and final, the percentage of weight gained, and the condition factor (K= weight * 100/Length3.056) of each individual; the condition factor was used to evaluate the state of health of the individuals during the experiment. At the end of the experiment the survival rate was calculated. Data analysis. Data was organized and analyzed using descriptive and parametric statistics with a level of reliability at 95% (alpha of 0.05), on Excel sheets (Excel ver. 12.0, Microsoft Corporation, U.S.A.), Barlett test to establish homogeneity of the variables, and the t-test from Student.
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se llevaron al laboratorio y dividieron igualmente al azar en 4 tanques con salinidades de 5, 10, 20 y 26-32 ups; las salinidades requeridas se obtuvieron diluyendo el agua marina con agua dulce, hasta alcanzar la salinidad requerida la cual fue verificada con un refractómetro; la salinidad del agua marina fluctuó entre 26 y 32 ups. La aclimatación a la salinidad deseada se hizo gradualmente durante 4 d. La salinidad fue reducida de agua de mar a 20 ups en una hora, y mantenidos a esa salinidad por 24 h; luego reducida a 15 ups en una hora y mantenidos a esa salinidad por 24 h; luego reducida a 8 ups y mantenidos a esa salinidad por 48 h, y finalmente se hizo en una hora la transición completa hasta agua dulce. Cada pez fue marcado con un pequeño corte en la aleta. Sitio de cautiverio y alimentación de especímenes. El experimento se realizó en tanques de 1500 l (2 x 1 x 1 m), con intercambio de 20% al 30% diario, y aireación constante; cada semana se midió aleatoriamente el oxígeno, temperatura, y salinidad con un instrumento multiparámetro (YSI 85, YSI, Inc., U.S.A.). Los peces se alimentaron dos veces al día con trozos de pescado fresco (Opistonema libertate) a razón de 4% de su peso total. Se utilizó este porcentaje con el fin de no introducir demasiada materia orgánica al sistema y así controlar la calidad de agua. Supervivencia, alimentación, registro de medidas y duración del estudio. Durante el experimento se observó la supervivencia de individuos y comportamiento alimentario individual como: consumo o rechazo del alimento. El ensayo se mantuvo por 12 semanas y cada 15 días los peces fueron muestreados individualmente, registrándose peso total (g), longitud total y estándar (cm). Con estos datos se obtuvieron los promedios de peso y talla, tanto inicial como final, el porcentaje de peso ganado, y el factor de condición (K=peso*100/Longitud3.056) de cada individuo; el factor de condición fue utilizado para evaluar el estado de salud de los individuos durante el experimento. Al final del experimento se calculó el porcentaje de supervivencia. Análisis de los datos. Los datos fueron organizados y analizados utilizando estadística descriptiva y paramétrica con un nivel de confiabilidad del 95% (alpha de 0.05), en hojas de cálculo Excel (Excel ver. 12.0, Microsoft Corporation, U.S.A.), test de Barlett para establecer homogeneidad de las varianzas, y el t-test de Student.
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RESULTS
RESULTADOS
All the young grouper survived the initial acclimation by gradual transfer that was done in four days, from sea water to water with salinities of 32 a 26, 20, 10 and 5 ppt. All the specimens survived the three months of treatment with high and low levels of salinity (Table 1). The fish also easily accepted the consistent feeding of pieces of fresh fish. In every treatment each fish increased in weight and size; but growth rates were very variable so no significant differences were detected (p>0.05) between different salinities (Table 1). Body condition factors for each fish were between 1.5 and 2.4 (Table 1).
Todos los juveniles de mero resistieron la aclimatación inicial de transferencia gradual que se realizó en cuatro días, del agua de mar a agua con salinidades de 32 a 26, 20, 10 y 5 ups. Todos los especímenes sobrevivieron los 3 meses de tratamiento a niveles altos y bajos de salinidad (Tabla 1). Los peces también aceptaron fácilmente el alimento consistente de trozos de pescado fresco. En cada uno de los tratamientos cada pez incrementó en peso y talla; pero las tasas de crecimiento fueron muy variables así que no se detectaron diferencias significativas (p>0.05) entre las diferentes salinidades (Tabla 1). Los factores de condición corporal para cada pez estuvieron entre 1.5 y 2.4 (Tabla 1).
Table 1. Values of total length, body weight, growth and condition factor for Pacific goliath grouper (Epinephelus quinquefasciatus) in different salinities (parts per thousand of salinity ppt) during a three month period at temperatures between 24.1°C and 28.0°C. The predicted values were estimated using the model of relation length-weight reported in FishBase, a digital fish encyclopedia, for E. itajara (2). Salinty and Fish 5 ppt average 1 2 3 10 ppt average 4 5 6 20 ppt average 7 8 9 26-32 ppt average 10 11 12 (28-32 ppt) Nature
Length (cm); Initial Weight (g)
Length (cm); Final weight (g)
Weight gained (%)
Condition factor (K)
41.5; 1310 36.0; 800 41.5; 1300 47.0; 1750 38.5; 1050 30.0; 500 40.0; 1000 45.5; 1650 47.8; 1800 47.5; 1750 48.0; 1750 48.0; 1900 49.0; 1833 47.5; 1750 50.5; 1850 49.0; 1900 Predicted 43; 1295
43.3; 1467 37.0; 1150 43.0; 1400 50.0; 1850 40.6; 1283 32.0; 800 42.0; 1300 48.0; 1750 50.6; 1967 50.0; 1950 50.0; 1850 52.0; 2100 50.8; 2083 49.5; 1850 51.5; 2050 51.5; 2350 Predicted 45; 1489
12.0 43.8 7.7 5.7 32.0 60.0 30.0 6.1 9.2 11.4 5.7 10.5 13.4 5.7 10.8 23.7 Predicted 15.0
1.5 – 2.3 2.3 1.8 1.5 1.6 – 2.4 2.4 1.8 1.6 1.5 – 1.6 1.6 1.5 1.5 1.5 – 1.7 1.5 1.5 1.7 Predicted 1.6
Survival (individuals) 100% (1) (1) (1) 100% (1) (1) (1) 100% (1) (1) (1) 100% (1) (1) (1) -
DISCUSSION
DISCUSIÓN
In this study, the possible similarity in the osmorregulatory adaption of the Pacific goliath grouper population with that of its congener described in the Atlantic (5) is discussed. For the first time an experiment is documented that shows the ability of young Pacific goliath grouper to be gradually transferred from sea water to lower salinities than those of its natural environment and grow in them with complete survival over a period of three months. The corporal condition factors for each fish were between 1.5 and 2.4 (Table 1); similar estimates to the range factors of theoretical condition of 1.6, determined for grouper bass of a similar size captured and predicted by the length-weight relation model reported in
En este estudio, se destaca posible similitud en adaptación osmorregulatoria de la población de mero guasa del Pacífico con la de su congénere descrita en el Atlántico (5). Por primera vez se documenta un experimento que demuestra la habilidad de juveniles de mero guasa del Pacífico de ser gradualmente transferidos de agua marina a salinidades más bajas que las de su ambiente natural y de crecer en ellas con total supervivencia durante un período de tres meses. Los factores de condición corporal para cada pez estuvieron entre 1.5 y 2.4 (Tabla 1), estimativos similares a los rangos del factor de condición teórico de 1.6, determinados para los meros guasa de similar talla capturados en la naturaleza y predichos por el modelo de la relación longitud-peso reportados en la enciclopedia computarizada de peces FishBase (2). El
García - Culturing Epinephelus quinquefasciatus in water of different salinities
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the digital fish encyclopedia FishBase (2). The fact that all the fish survived in good health and bodily conformation (k), similar or larger when compared to grouper found in nature, is a significant result of this study and shows the possibility of breeding the species in water with different salinities.
hecho de que todos los ejemplares hayan sobrevivido con buen estado de salud y conformación del cuerpo (K), similar o mayor en comparación con el de meros encontrados en el medio natural, es un resultado significativo de este estudio y refleja la posibilidad del cultivo de la especie en aguas de diferentes salinidades.
The survival and growth in good health in salinity of 5 ppt is also a good result, since Woo & Wu (8) and Wu & Woo (9) reported that the osmoregulatory capacity in other species of grouper was only between 7 and 30 ppt and these were the only results reported in recent literature. Although the optimal salinity for breeding was not determined, in the experimental salinity of 10 ppt (isosmotic) similar results were observed and even better growth to that observed in a natural environment with salinities around 28-32 ppt, with the explanation that the osmoregulatory processes require energy, so that salt water environments that diminish energy needs help to maximize the growth of the species.
El sobrevivir y crecer en buen estado de salud en salinidad de 5 ups, también son resultados alentadores ya que Woo & Wu (8) y Wu & Woo (9) reportaron que la capacidad osmorreguladora en otras especies de meros fue sólo entre 7 y 30 ups; siendo estos los únicos resultados reportados en la literatura reciente. Aunque no se determinó la salinidad óptima de cultivo, en la salinidad experimental de 10 ups (isosmótica) se observó similar y hasta mejor crecimiento al observado en el medio natural con salinidades alrededor de 2832 ups; teniendo como explicación que los procesos osmorreguladores requieren de energía, así que salinidades ambientales que disminuyan estas necesidades energéticas ayudarían a maximizar el crecimiento de la especie.
In the case of gilt-headed bream, Sparus aurata, marine species considered to be eurohaline, it has been clearly demonstrated that greater growth occurs when they are acclimated at 12 ppt and not at 6 or 38 ppt (10). Even so, the exact mechanism of the effect of salinity in growth is not completely understood (11). Additionally, during this experiment the grouper were docile and easily adapted to captivity, although some of them had leeches. In other grouper species a lower incidence of diseases especially in waters with lower salinity was noted (8,9). For several years, a variety of grouper have been commercially cultivated, principally in China, Japan, Taiwan, Southeast Asia and the Middle East, but these practices are mainly based on collecting young fish in the wild and fattening them in captivity until they are at commercial size (6). Sustainable aquaculture practices, however, should depend on seed obtained under domestic conditions. The purpose of this study was to initiate investigations about the growth possibility of grouper in low salinity or freshwater conditions. Eventually the purpose is to organize a group of producers to develop the production technology of eggs and young fish. This is for the aquaculture of marine species in coastal areas or inland in Colombia, an attractive proposition, especially for reducing risks inherent in breeding in cages at high sea, in relation to activities like maintaining, repairing production structures, caring for fish, disease
En el caso de la dorada Sparus aurata, especie marina considerada eurohalina, ha quedado claramente demostrado un mayor crecimiento cuando estan aclimatadas a 12 ups y no a 6 ni 38 ups (10). Aun asi, el mecanismo exacto del efecto de la salinidad en el crecimiento no está completamente esclarecido (11). Adicionalmente durante éste experimento los meros demostraron docilidad y facilidad de adaptación al cautiverio, aunque se detectaron en algunos de ellos infestaciones con sanguijuelas. En otras especies de meros se ha comprobado menor incidencia de enfermedades especialmete en aguas de baja salinidad (8,9). Por varios años, se han cultivado a nivel comercial, varias especies de mero principalmente en China, Japón, Taiwán, el sudeste de Asia y oriente medio, pero estas prácticas se basan principalmente en la recolección de juveniles en el medio silvestre y su engorde en cautiverio hasta tamaño comercial (6). Prácticas de acuicultura sostenible, sin embargo, deben depender de la semilla obtenida bajo condiciones domésticas. El propósito de este estudio fue iniciar investigaciones sobre la posibilidad de crecimiento de mero guasa en condiciones salobres o de agua dulce. Eventualmente con el propósito de conformar un plantel de reproductores para el desarrollo de la tecnología de producción de huevos y juveniles de la especie. Esto por cuanto la acuicultura de especies marinas en las zonas costeras o en tierra adentro de Colombia es una propuesta atractiva, especialmente en la reducción de los riesgos inherentes al cultivo en jaulas en alta mar, en relación con actividades como el mantenimiento y reparación de estructuras de producción, cuidado de los peces, la transmisión de enfermedades a las poblaciones naturales y la
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in natural populations and contaminating the benthic community. Additionally, property conflicts, public perfection, and technical matters in selecting the site make it more and more difficult to do ocean aquiculture. The great osmoregulatory capacity of the young of this species (5), as well as the proven capacity to adapt to captivity (3,4), are indicators of the potential of culturing this species in Colombia, not just in marine environments, but also in low salinity and even freshwater conditions.
contaminación de la comunidad bentónica. Además, los conflictos de propiedad, la percepción pública, y cuestiones técnicas en la selección del sitio, hace cada véz más difícil la acuicultura oceánica. La amplia capacidad osmorreguladora de los juveniles de la especie (5), así como su comprobada capacidad de adaptación al cautiverio (3,4) son indicadores del potencial del cultivo de la especie en Colombia, no sólo en ambientes marinos, sino en condiciones salobres y hasta en agua dulce.
Acknowledgement
Agradecimientos
To the fishermen, students at the Universidad del Pacífico, and the leaders at the AUNAP in Bahía Málaga for making the staff available and allowing the use of their installations.
A los pescadores, estudiantes de la Universidad del Pacífico, y directivos de la AUNAP en Bahía Málaga por la disposición del personal y permitir la utilización de las instalaciones.
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4495-4504, 2015. ISSN: 0122-0268 COMUNICACIÓN BREVE
Establishing an in vitro production program for buffalo embryos (Bubalus bubalis) in Colombia Establecimiento de un programa de producción in vitro de embriones bufalinos (Bubalus bubalis) en Colombia Felipe Gamarra P,1 MV, Viviana Rendón V,1 MV, Aldemar Chávez R,1 MVZ, Leonardo Perez S,1 MVZ, Walter Cardona-Maya,2 Ph.D, Jesús Berdugo G,3* M.Sc. Genescol S.A. Carrera 17 # 58-60 Autopista Palenque-Chimita, Girón, Santander, Colombia. Universidad de Antioquia. Facultad de Medicina, Grupo Reproducción, Carrera 53 # 61-30, Laboratorio 534, Medellín, Colombia. 3Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Grupo de Reproducción Animal y Salud de Hato, Carrera 45 No 26-85 Edif 561B. Bogotá, Colombia. *Correspondencia: jaberdugog@unal.edu.co 1 2
Received: March 2014; Accepted: November 2014.
ABSTRACT Objective. Evaluate the results of the standardization of the in vitro production program of buffalo embryos, using oocytes obtained by ultrasound guided oocyte puncture during the 2012 breeding season in Colombia. Materials and methods. Fifty seven buffalo females were selected for ultrasound guided transvaginal aspiration of follicles, oocytes were identified within follicular fluid, classified and transported to the laboratory and matured in vitro for 18 to 20 hours. Frozen semen of seven Mediterranean bulls were used, motile sperm was obtained using the Percoll technique and oocytes were inseminated with 2 million sperm/ml. Presumptive zygotes were cultured for 6 days, grade 1 embryos obtained were frozen using ethylene glycol. Embryos were transferred to females on day 5 during natural cycle. Results. 97 aspirations were performed on the 57 animals, in 8.2% of the aspirations no oocytes were found. 8 oocytes/aspiration were obtained. Of the 783 oocytes, 92% were classified as viable (721/783) and were fertilized. The cleavage and blastocyst rate were 23% and 19% respectively. 37 embryos were transferred and 11 pregnancies were obtained, confirmed by rectal palpation 60 days after transfer, with a pregnancy rate of 29.7%. Conclusions. The results presented here are comparable with others in literature and shows the feasibility of producing in vitro embryos and pregnancies after the standardization of current protocols, with normal and sexed semen and transfer during natural cycle in buffalo. Key words: Buffaloes, embryo, fertilization in vitro, reproduction (Source: MeSH).
RESUMEN Objetivo. Evaluar los resultados de la estandarización de la técnica de producción in vitro de embriones de búfalo, a partir de oocitos obtenidos por punción folicular durante la estación reproductiva del 2012 en una hacienda en Cordoba, Colombia. Materiales y métodos. Cincuenta y siete búfalas fueron seleccionadas para aspiración transvaginal de folículos guiada por ultrasonido, los oocitos fueron identificados y madurados in vitro. Se utilizó semen congelado de 7 búfalos de la raza Mediterráneo para la fertilización in vitro. La fracción móvil fue separada en un gradiente de Percoll, los oocitos fueron inseminados con 2 millones de espermatozides/mL, los presuntos cigotos fueron cultivados por 6 días y los embriones grado 1 obtenidos fueron congelados utilizando etilenglicol. Posteriormente, 4495
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los embriones fueron transferidos el día 5 post estro en búfalas en ciclo natural. Resultados. En las 57 búfalas, se realizaron 97 aspiraciones foliculares, no se obtuvieron oocitos en el 8.2% de los procedimientos. Se obtuvieron en promedio 8 oocitos por búfala en cada sesión de aspiración. Se recolectaron 783 oocitos de los cuales fueron clasificados como viables el 92% (721/783), se obtuvo una taza de clivaje del 23% y de blastocistos del 19%. De 37 embriones transferidos se obtuvieron 11 preñeces, confirmadas por palpación rectal a los 60 días postransferencia, obteniéndose una taza de preñez del 29.7% Conclusiones. Los resultados presentados en este trabajo son comparables con los de la literatura, en la cual se muestra cómo es posible obtener embriones de semen convencional y sexado, además de producir gestaciones con protocolos estándar de fertilización in vitro y transferencia en ciclos con celo natural adaptados para la especie. Palabras clave: Búfalos, embrión, fertilización in vitro, reproducción (Fuente: MeSH)
INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Buffaloes are an important species due to their great adaptability in extreme environmental conditions and for their production of milk and meat. Muñoz et al (1) reported for Colombia an average milk production at 270 days of 1096±275 kg and the production of fat and protein at 270 days was 7.4 y 5.0%, respectively for lactation. For meat production, animals with increases of up to 1200 g/day are possible, which shows precocity, obtaining a final product low in fat and with a high protein content. Additionally, it has been accepted that buffaloes are more efficient than tractors in pulling conditions up to one ton and its benefits in crops have been shown, especially in palm oil (1).
Los búfalos son una especie importante por su gran adaptabilidad a condiciones medioambientales extremas y por producción de leche y carne. Muñoz et al (1) reportó para Colombia una media de producción de leche a los 270 días de 1096±275 kg y la producción de grasa y proteína a los 270 días fue de 7.4 y 5.0%, respectivamente por lactancia. Para la producción de carne, se tienen animales con ganancias de hasta 1200 g/día, lo que demuestra su precocidad, obteniendo un producto final bajo en grasa y con alto contenido de proteína. Adicionalmente, se ha aceptado que los búfalos son más eficientes que el tractor en condiciones de tiro de hasta una tonelada y se ha demostrado sus bondades en los cultivos, especialmente en los de palma de aceite (1).
Buffaloes belong to the Bovidae family, bovines, the Bubalus genus, and the species includes bubalis and carabaensis (2,3). Raising buffalo in Colombia has experienced an exponential increase in the last 15 years, and based on vaccination records, Fedegán, the Colombian Cattle Federation, reported that 160.449 heads exist in the country, females making up 70% of the population (3). Present in Colombia is the Bulbalina race, from the species Bubalus bubalis, comprised of Murrah, Mediterranean and a crossbreed of the first animals that arrived in the country, called buffalypso. From the vaccination model some technologies have been attempted to apply, especially in the area of reproduction, without satisfactory results. In Colombia, improvement programs for the species are being developed, and although reproductive biotechnologies are known and have been applied for more than 10 years, they have not spread widely to breeders (3). The results of transferring embryos on buffalo ranches have had discouraging results, especially programs involving multiple ovulation and embryo transferring (MOET). Drost (4) reviewed the Hindu experience, including 10 years of superovulation and embryo transferring, finding
El búfalo pertenece a la familia Bovidae, bovino, del que existe el género Bubalus al que pertenecen las especies, bubalis y carabaensis (2,3). La cría del búfalo en Colombia ha experimentado un incremento exponencial en los últimos 15 años, la Federación Colombiana de Ganaderos -Fedegánbasada en los registros de vacunación informó que en el país existen 160.449 cabezas, siendo hembras el 70% de la población (3). En cuanto a la variedad de razas Bubalinas existentes en Colombia, de la especie Bubalus bubalis, se encuentran la Murrah, Mediterráneo y cruzas de los primeros animales que llegaron al país y que se denominan bufalypso. Del modelo vacuno se han tratado de aplicar algunas tecnologías, especialmente en el área de la reprodución, sin resultados satisfactorios. En Colombia, se están construyendo programas de mejoramiento para la especie y aunque las biotecnologías reproductivas se conocen y se aplican desde hace más de 10 años, no están ampliamente difundidas entre los criadores (3). Los resultados de la aplicación de la transferencia de embriones en los hatos bufalinos han tenido resultados desalentadores, especialmente aquellos programas de múltiple ovulación y transferencia de embriones (MOET). Drost (4), revisó la experiencia
Gamarra - In vitro production Buffalo embryos in Colombia 2.3 embryos per animal with a pregnancy rate of 15% and an embryo reabsorption rate of 35%. Given the low rate of obtaining embryos by MOET, the in vitro production of embryos (PIV) became an alternative to obtaining embryos in these programs. The first buffalo embryo born in vitro was reported in India in 1990. The PIV can considerably increase the amount of embryos obtained, whether it be by slaughterhouse ovaries or live buffaloes. The average oocytes per ovary in the case of slaughterhouse is from 0.43 to 0.70 in India vs 2.4 to 3.3 in Italy (5), but if they are obtained by means of follicular aspiration guided by ultrasound (OPU), this increased up to 2.25 oocytes/ovary (6). When compared with bovines, in spite of being philogenetically similar and having similar general reproductive conditions, buffaloes have some very important differences, among them the presence of less primordial follicles and the formation of gonads (7), in consequence less follicles at birth and less amount of follicles selected in the ovulatory cycle (8). For many years the selection system in buffalo production has had a strong maternal influence, since the offspring of the best female buffalos are the ones chosen as reproducers, and for that reason transferring embryos is chosen as the technique to be applied. Colombian breeders should increase productivity and efficiency in order to take care of market demands, especially taking advantage of the fact that animal reproduction is very efficient when it is evaluated in terms of gestation, birth rate and animal development (9,10). With this information and the uncertainty of the results, at the end of 2008 (11) the technique of transferring embryos produced in vitro in Colombia began, with variable results. From this first experience the first animals were born in 2011 (12) which prompted an investigation group to establish an embryo production program in Colombia. The objective of this investigative study is to show the results obtained in in vitro production of buffalo embryos, report pregnancies during the 20122013 reproductive season, and discuss information obtained in global literature in order to apply this technology and make it a reality for the Colombian buffalo industry.
MATERIALS AND METHODS Study site. This study took place from August 2012 and January 2013, on the Praga farm, in the Municipality Pueblo Nuevo, Córdoba, in the agroecological area of a Tropical Rain Forest (8o28’69’’ North 75o16’54’’ West), altitude 60 meters above sea level, annual rainfall 1600 mm.
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Hindú de 10 años de superovulación y transferencia de embriones, encontrando 2.3 embriones por animal, con una tasa de preñez del 15% y una tasa de reabsorción embrionaria del 35%. Dada la baja tasa de obtención de embriones por MOET, la producción in vitro de embriones (PIV) se convirtió en una alternativa para la obtención de embriones en estos programas. El primer embrión bufalino nacido in vitro fue reportado en la India en 1990. La PIV puede incrementar considerablemente la cantidad de embriones que se obtienen, bien sea de ovarios de matadero o de búfalas vivas. El promedio de oocitos por ovario en el caso de matadero es de 0.43 a 0.70 en la India vs 2.4 a 3.3 en Italia (5), pero si se obtienen mediante aspiración folicular guiada por ultrasonido (OPU), esta se incrementa hasta 2.25 oocitos/ovario (6). Cuando se compara con vacunos, a pesar de ser tan cercanos filogenéticamente y de tener condiciones generales reproductivas similares, el búfalo tiene algunas diferencias que se vuelven muy importantes, entre ellas la presencia de menos folículos primordiales en la formación de las gónadas (7), en consecuencia menos folículos al nacimiento y menor cantidad de folículos seleccionados en el ciclo ovulatorio (8). Por muchos años, en la producción con búfalos, el sistema de selección ha tenido una gran influencia materna, siendo escogidos como reproductores los hijos de las mejores búfalas, es por eso que la transferencia de embriones es la técnica de elección para ser aplicada. Los criadores colombianos deben incrementar su productividad y eficiencia con el fin de atender las demandas del mercado, especialmente aprovechar que la reproducción de los animales es muy eficiente cuando se evalúa en términos de gestación, natalidad y desarrollo de los animales (9,10). Con esta información y la incertidumbre de los resultados, a finales del 2008 (11), se inició la aplicación de la técnica de transferencia de embriones producidos in vitro en Colombia, obteniendo resultados variables, de esa primera experiencia nacieron los primeros animales en el 2011 (12), que llevaron al grupo de investigación al establecimiento de un programa de producción de embriones en Colombia. El objetivo del presente trabajo de investigación es mostrar los resultados obtenidos en la producción in vitro de embriones bufalinos e informar la obtención de preñeces durante la estación reproductiva 2012-2013 y discutir la información obtenida con la literatura mundial con el fin de hacer de la aplicación de esta tecnología una realidad para la industria bufalina Colombiana.
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Animals. 57 females, 8 buvillas and 49 multiple births with a minimum of 90 days postnatal were used, weight at 530 kg and corporal condition superior to 3.5 (scale of 1 to 5: 1 = emaciated y 5 = obese). Follicular suction. Before aspirating the oocytes, the perineal area was washed and disinfected, and epidural anesthesia was given by means of a 4 mL injection of xylocaine. The buffalos were aspirated by means of a 20 caliber needle guided by ultrasound, connected to a convex transvaginal sound by means of an echograph (Mindray model DP 2200). The aspiration system was washed constantly with a half TCM 199 with 25 mM of hepes, supplemented with 100 USP/ mL of heparin, 10% bovine fetal serum and 1% penicillin and streptomycin solution (20000 UI and 20000 µg/mL). The oocytes were aspirated by means of the union to a vacuum pump with 80 mmHg and were collected in 50 mL test tubes with 0.4 mL of heparin (Liquemine, Roche®) and identified and classified on the farm. Once identified, the oocytes were classified as A, B, C, and D (13), all the A, B and C oocytes were classified as viable and transported to the laboratory in the middle of maturation in an incubator at 37.5°C in a gassified environment, TCM 199 with 25 mM hepes, supplemented with 0.3mM cysteine, 50 µM cisteamine, 0.5 µg/ml FSH, 5 µg/mL LH and 1 ug/mL 17 β estradiol (14). All of the structures sent were subjected to maturation, no rounded structures were sent, which apparently do not have cytoplasm. Laboratory procedure. Unless explicitly mentioned, all the reagents for the culture preparation were from Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co, St Louis, Mo, USA). Once at the laboratory, the oocytes were transferred to Petri dishes to continue maturation in groups of a maximum of 20 until the moment of fertilization at 20 hours post aspiration. For fertilization frozen conventional and sexed semen from COFA (Centro Fecundacione Artificialle, Cremona, Italy). To prepare the spermatozoids, the percoll 90-45 technique was used (15). Semen straws were thawed at 37°C for 30 seconds. Semen was placed in the upper part of the gradient, after centrifuging, the pellet was re-suspended to obtain a concentration between 1.5 to 2 million spermatozoids/ml with fertilization and TALP modified, supplementing with 0.2 mM/mL penicilamin, 0.1 mM/mL hipotaurin and 0.01 mM/mL heparin. Fertilization was done in dishes with 50 µl drops, a maximum of 20 oocytes, using specific reproducers programmed for each donator. They were
MATERIALES Y MÉTODOS Sitio de estudio. El presente estudio se realizó entre agosto del 2012 y enero del 2013, en la hacienda Praga, localizada en el Municipio de Pueblo Nuevo, Córdoba, condición agroecológica de Bosque Húmedo Tropical (8o28’69’’ Norte 75o16’54’’ Oeste), altitud 60 m.s.n.m, régimen anual de lluvias 1600 mm. Animales. Fueron utilizadas 57 hembras, 8 buvillas y 49 multíparas con mínimo 90 días posparto, peso de 530 kg y condición corporal superior a 3.5 (escala de 1 a 5: 1 = emaciada y 5 = obesa). Aspiración folicular. Previa a la aspiración de los oocitos, la zona perineal fue lavada y desinfectada, y se indujo anestesia epidural mediante la inyección de 4 mL de xilocaina. Las búfalas fueron aspiradas mediante el uso de una aguja calibre 20 guiada por ultrasonido, acondicionada a una sonda transvaginal convexa mediante ecógrafo (Mindray modelo DP 2200). El sistema de aspiración fue lavado constantemente con medio TCM 199 con 25 mM de hepes, suplementado con 100 USP/mL de heparina, 10% de suero fetal bovino y 1% de una solución de penicilina y estreptomicina (20000 UI y 20000 µg/mL). Los oocitos aspirados mediante la unión a una bomba de vacío con 80 mmHg fueron colectados en tubos de ensayo de 50 mL con 0.4 mL de heparina (Liquemine, Roche®) e identificados y clasificados en la misma finca. Una vez identificados, los oocitos fueron clasificados en A, B, C, y D (13), todos los oocitos grado A, B y C fueron clasificados como viables y transportados al laboratorio en medio de maduración en una incubadora a 37.5°C en medio gasificado, TCM 199 con 25 mM de hepes, suplementado con 0.3mM cystine, 50 µM cisteamina, 0.5 µg/ml FSH, 5 µg/mL LH y 1 ug/mL 17 β estradiol (14). Todas las estructuras enviadas fueron sometidas a maduración, no se incluyeron algunas estructuras redondeadas, que aparentemente no tienen citoplasma. Procedimiento de laboratorio. A menos que se mencione explícitamente, todos los reactivos para la preparación de los medios de cultivo fueron de la firma Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co, St Louis, Mo, USA). Una vez en el laboratorio, los oocitos fueron transferidos a cajas de Petri, para continuar su maduración en grupos de máximo 20, hasta el momento de la fertilización a las 20 horas post aspiración. Pa r a l a f e r t i l i z a c i ó n s e u t i l i z ó s e m e n congelado convencional y sexado, proveniente de la central italiana COFA (Centro Fecundacione
Gamarra - In vitro production Buffalo embryos in Colombia cultured in the fertilization environment between 20 and 24 hours at 38.5°C, in a 5% atmosphere of CO2, 90% humidity. Later the oocytes were denuded and the zygotes were taken to half culture, synthetic oviductal fluid (SOF) to which essential and nonessential amino acids and bovine seric albumin were added. The first environmental change was 4 days after the aspiration; due to the characteristics of the buffalo oocytes it is not possible to identify the quantity of blastomers in each structure and due to this, only the non-inseminated structures are removed. The second environmental change is done at day 6, when the first blastocysts can be observed. The formation of blastocysts begins on day 6 obtaining those that are the best quality and go to day 8, when they were frozen by means of the ethylene glycol slow freezing method (12) for direct transfer. Some embryos were transferred to receptors in a natural cycle, day 6 post-estrum in the ipsilateral horn to the corpus luteum of this cycle’s ovulation. Statistical analysis. Data was shown with statistically descriptive values, in comparative cases the proportion comparison test was sued and a nonparametric correlation analysis was done between the variables, p>0.05 was considered statistically significant; GraphPad Prism 5 (GraphPad software, San Diego, CA) program was used.
RESULTS Between July 2012 and January 2013, 97 follicular aspirations were performed on 57 animals, 49 multi-birth buffalos and 8 young cows. The age of the buffalos was on average 96 months with a range from 14.5 to 206 months. The general results of the program are presented in table 1. Of the 57 buffalos, 36 were only aspirated once. 97 aspirations were done in 8 procedures, Table 1. Comparison between young cows and multiple birth cows within the parameters described for production of in vitro embryos in water buffalo. Young cows
Multiple birth cows
Total
Valor of p
Animals
8
49
57
Aspiration
15
82
97
Total
95
688
783
No difference (ND) ND
Oocytes / aspiration
6.3
11.1
8.07
<0.05
Viables
89
632
721
ND
Oocytes / aspiration
5.7
10.2
7.4
ND
Blastocyst at day 6-7
12
123
135
<0.05
18.30%
19%
ND
% of blastocysts at day 13.30% 6-7/ viable oocysts
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Artificialle, Cremona, Italia). Para preparar los espermatozoides fue utilizada la técnica de percoll 90-45 (15). Las pajillas de semen fueron descongeladas a 37°C por 30 segundos. El semen fue colocado en la parte superior del gradiente, después de la centrifugación el pellet fue resuspendido para obtener una concentración entre 1.5 a 2 millones espermatozoides/ml con el medio de fertilización y medio TALP modificado, suplementado con 0.2 mM/mL penicilamina, 0.1 mM/mL de hipotaurina y 0.01 mM/mL de heparina. La fertilización se llevó a cabo en cajas en gotas de 50 µl, con máximo 20 oocitos, utilizando reproductores específicos programados para cada donante. Se cultivaron en el medio de fertilización entre 20 y 24 horas, a 38.5°C, en una atmósfera de 5% de CO2, 90% de humedad. Posteriormente, los oocitos fueron desnudados y los presuntos zigotos fueron llevados a medio de cultivo, fluido oviductal sintético (SOF) al que se le adicionan aminoácidos esenciales y no esenciales y albúmina sérica bovina. El primer cambio de medio fue el día 4 post aspiración; debido a las características propias de los oocitos bufalinos no es posible identificar la cantidad de blastómeros de cada estructura debido a esto, sólo se retiran las estructuras no fecundadas. El segundo cambio de medio se realizó el día 6, momento en donde se comienzan a observar los primeros blastocistos. La formación de blastocisto inicia a partir del día 6 obteniendo los de mejor calidad y van hasta el día 8 de estadio, momento en el que fueron congelados, mediante la técnica de congelación lenta en etilenglicol (12), para transferencia directa. Algunos embriones fueron transferidos a receptoras en ciclo natural, el día 6 post estro en el cuerno ipsilateral al cuerpo lúteo de la ovulación de ese ciclo. Análisis estadístico. Los datos se mostraron con valores de estadística descriptiva, en los casos de comparación se usó la prueba de comparación de proporciones y se realizó análisis de correlación no paramétrica entre las variables, se consideró significancia estadística un p>0.05, se utilizó el programa GraphPad Prism 5 (GraphPad software, San Diego, CA).
RESULTADOS Entre julio del 2012 y enero del 2013, se realizaron 97 aspiraciones foliculares a 57 animales, 49 búfalas pluríparas y 8 buvillas. La edad de las búfalas fue en promedio 96 meses con un rango de 14.5 hasta 206 meses. Los resultados generales del programa se presentan en la tabla 1.
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no oocytes were obtained, the maximum of oocytes per aspiration was 35. 783 oocytes were recovered, of these 721 (92%) were classified as viable and were used to produce embryos. 8.07 total oocytes/buffalo and 7.4 oocytes/viable per aspiration. No significant differences were found in the production of oocytes/buffalo during the season, with a range from 8 to 11. 126 oocytes were fertilized with sexed semen and there were no significant differences in cleavage or in the production of embryos when compared with non-sexed semen, 20% and 17% respectively. Of the oocytes fertilized on day 4 171 (23%) cleaved and on days 7 and 8 of the culture, 135 (19%) reached the blastocyst stage; all the embryos were frozen with ethylene glycol for direct transfer. 1.35 embryos were obtained by aspiration with a variation from 0 to 7. Of the 135 embryos obtained, 88 (65%) became blastocysts on day 6, and 47 (35%) on day 7. The production of embryos in the first aspiration in September 2012 was 10% and the last reported one in January 2013 was 20%, a significant difference (p<0.05). In 11 female buffalos (11.3%) in which at least one oocyte was recovered no embryos were obtained, these represented 67 oocytes, 29% of these suspected zygotes did not cleave, 56% reached the state of 2 cells and 15% went from 4 to 8 cells on day 4 but stopped developing. Additionally, buffalos that had given birth produced more oocytes and embryos than the young cows, 11.1 vs. 6.3 oocytes/buffalo and 18.3 % vs 13.3% buffalo blastocysts respectively (p<0.05). Concerning embryo development, the young cow embryos reached t h e b l a s t o c y s t s t a t e o n d ay 7 , g r e a t e r proportion than the buffalos that had given birth (56% vs 14%). Finally 37 embryos were transferred from which 11 pregnancies were started (29%), confirmed by rectal palpation 60 days after transfer.
DISCUSSION This study presents for the first time in world literature the use of PIV of buffalo embryos and the transfer of frozen embryos during natural heat for production of high quality buffalos.
De las 57 bufalas, 36 fueron aspiradas solamente una vez. Se realizaron 97 aspiraciones, en 8 procedimientos no se obtuvieron oocitos, el máximo de oocitos por aspiración fue de 35. Fueron recuperados 783 oocitos, de estos 721 (92%) fueron clasificados como viables y se utilizaron para producción de embriones. Se obtuvieron 8.07 oocitos totales/búfala y 7.4 oocitos/viables por aspiración. No se encontraron diferencias significativas en la producción de oocitos/búfala durante toda la estación, con un rango de 8 a 11. Se fertilizaron 126 oocitos con semen sexado y no se obtuvieron diferencias significativas en el clivaje ni en la producción de embriones cuando se comparó con semen no sexado, 20% y 17% respectivamente. De los oocitos fertilizados al día 4 clivaron 171 (23%) y en los días 7 y 8 de cultivo alcanzaron el estado de blastocisto 135 (19%); todos los embriones fueron congelados en medio con etilenglicol para transferencia directa. Se obtuvieron 1.35 embriones por aspiración, con un variación de 0 a 7. De los 135 embriones obtenidos, 88 (65%) se convirtieron en blastocistos en el día 6 y 47 (35%) en el día 7. La producción de embriones en la primera aspiración en septiembre del 2012 fue del 10% y en la última informada en enero 2013 fue del 20%; siendo esta diferencia significativa (p<0.05). En 11 búfalas (11.3%) en las que al menos se recuperó un oocito no se obtuvieron embriones, estos representaron 67 oocitos, 29% de estos presuntos zigotos no clivaron, el 56% alcanzaron el estado de 2 células y el 15% llegó de 4 a 8 células al día 4 pero detuvieron su desarrollo. Adicionalmente, las búfalas paridas produjeron más oocitos y embriones que las buvillas, 11.1 vs 6.3 oocitos/búfala y 18.3 % vs 13,3% blastocistos búfala respectivamente (p<0.05). En cuanto al desarrollo embrionario los embriones de buvilla llegan al estado de blastocisto el dia 7, mayor proporción que las búfalas paridas (56% vs 14%). Finalmente fueron transferidos 37 embriones de los que se obtuvieron 11 preñeces (29%) confirmadas por palpación rectal el día 60 post transferencia.
DISCUSIÓN En este trabajo se presenta por primera vez en la literatura mundial el uso del PIV de embriones bufalinos y la transferencia de embriones congelados durante un celo natural para la producción de búfalos de calidad superior.
Gamarra - In vitro production Buffalo embryos in Colombia
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It is seen to be a safe and reproducible procedure, complications were only seen in 1.7% of the cases; an edema could be explained as the anaphylactic reaction to the epidural anesthesia used, which was resolved spontaneously. Post aspiration complications were not present, such as adherences.
Se demuestra que es un procedimiento seguro y reproducible, sólo se presentaron complicaciones en 1.7% de los casos, un edema que podría ser explicado como una reacción anafiláctica a la anestesia epidural utilizada, el cual se resolvió espontáneamente. Tampoco se presentaron complicaciones post aspiración como adherencias.
It should be kept in mind that to obtain oocytes of young animals the size of the vaginal canal was a limiting factor, since the transducer could not be used on 7 young cows (data not shown), and it is probable that in very young animals the transducer would damage the vagina canal and these animals cannot be aspirated. It was also seen that 8 buffalos could not be aspirated for anatomic reasons due to a narrow vagina or adherences of the internal organs.
Se debe tener en cuenta que para obtener oocitos de animales jóvenes el tamaño del canal vaginal fue un limitante, ya que en 7 buvillas no se pudo pasar el transductor (datos no mostrados), es probable que en animales muy jóvenes, el paso del transductor lacere el canal vaginal y esos animales no se puedan aspirar. Se constató que 8 búfalas no pudieron ser aspiradas por razones anatómicas, debido a la estrechez de la vagina o adherencias de los órganos internos.
The rate for obtaining oocytes in this study was 8.07 oocytes/buffalo by aspiration, which is superior to that informed in Italy 2.3 (13), Brazil 4.1-6.7 (16.17) and 1.2 in India (18). A possible explication could be the fact that the aspirations were done during the reproductive season, while some of these authors sampled their study during the whole year. The viability of this study was superior (92%) to that reported in literature (44%,45%), (16,18).
La tasa de obtención de oocitos en el presente trabajo fue de 8.07 oocitos/búfala por aspiración, la cual es superior a la informada en Italia 2.3 (13), Brasil 4.1-6.7 (16,17) y 1.2 en India (18), una posible explicación podría ser el hecho que las aspiraciones fueron realizadas durante la estación reproductiva, mientras que algunos de estos autores muestran sus trabajos durante todo el año. La viabilidad en el presente estudio fue superior (92%) a lo reportado en la literatura (44%,45%), (16,18).
Neglia et al (19), suggest that the length of the needle and the suction system have a great influence in the quality of the oocytes found, indicating that the cells of the cumulus, poorly adhered, are detached during the aspiration process. For this study a short needle was used, that goes directly connected to the conduction system, which could explain the high viability of the oocytes obtained, even more when one of the principal parameters of classification of the oocytes are the grainy layers surrounding it.
Neglia et al (19), sugirieron que la longitud de la aguja y del sistema de succión tiene una gran influencia en la calidad de los oocitos encontrados, indicando que las células del cúmulus, pobremente adheridas se desprendan durante el proceso de aspiración. En este trabajo para la aspiración fue utilizada una aguja corta, que va directamente conectada al sistema de conducción, esta razón podría explicar la alta viabilidad de los oocitos obtenidos, más aún cuando uno de los principales parámetros de clasificación de los oocitos son las capas de granulosa que lo rodean.
Also, it is important to highlight that when evaluating the oocytes there are very few that can be classified as type A, since a large quantity of the oocytes do not have the appearance of a complex with adequate granular and cytoplasm; in some cases they appear as rounded structures that apparently do not have cytoplasm that would be like an atretic oocyte, which in this study weren’t taken into account for the analysis. This limitation meant that almost all the oocytes obtained were used for fertilization. In conditions in the field, it is necessary to use grade A, B, C oocytes to produce embryos, and it is possible to seek ways to correctly classify oocytes of this species.
También, es importante resaltar que al evaluar los oocitos son muy pocos los que se pueden clasificar como tipo A, debido a que una gran cantidad de oocitos no tienen la apariencia de un complejo con la granulosa y citoplasma adecuados; en algunos casos aparecen unas estructuras redondeadas que aparentemente no tienen citoplasma que semejarían un oocito atrésico que en este trabajo no fueron tenidos en cuenta para el análisis. Esta limitación hace que prácticamente todos los oocitos obtenidos sean utilizados para la fertilización. En las actuales condiciones de trabajo de campo, se hace necesario el uso de los oocitos grado A, B, C para producir embriones, cabe la posibilidad de buscar formas para la clasificación correcta de los oocitos en esta especie.
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It has been reported that a greater quantity of embryos are produced when oocytes collected from live animals are used for embryo production, rather than using ovaries from a slaughterhouse (30.6±4.3% versus 18.5±1.8%). However, in literature consulted, no differences were observed in the maturation or cleavage of oocytes (18,20) when comparing these two sources of oocytes.
Se ha informado que se produce una mayor cantidad de embriones cuando se utiliza para la producción de embriones, oocitos colectados de animales vivos, que cuando se usan aquellos provenientes de ovarios de matadero (30.6±4.3% versus 18.5±1.8%). No obstante, en la literatura colsultada no se observan diferencias ni en la maduración ni en el clivaje de los oocitos (18,20), cuando se comparan las dos fuentes de oocitos.
Pregnancy rates obtained are superior to those reported by our group in 2011 (25% vs 29%) although this difference is not significant and is in line with other reports in literature (21, 22).
Las tasas de preñez obtenidas, son superiores a las informadas por nuestro grupo en el año 2011 (25% vs 29%) (12) sin que esta diferencia sea significativa y están de acuerdo con otros informes en la literatura (21,22).
Results obtained in this study using sexed semen differ from those reported by Lu et al (21), in which significant differences were observed in fertilization when sexed and conventional semen are used. It is fundamental to understand that the production of blastocysts in vitro within a production system for in vitro embryos is not only influenced by biological factors, such as the development of follicles and the quality of oocytes, but also by factors related to laboratory procedures, the mother’s nutrition and handling of the animals. The use of frozen embryos for direct transfer facilitates establishing and managing these programs since in the properties where artificial insemination program are established, the only requirement that is needed is to change from inseminating to transferring the embryo, with time and luteal evaluation adjustments that an experienced technician can do without significantly increasing costs. From this experience, it can be said that with buffalo, biotechnological procedures that are performed with natural reproduction are successful. The pregnancy rate in this study was 29% compared with 20% (12) obtained when the receptors for transferring embryos were synchronized. When the results of the program are analyzed from the point of view of the breeder based on the data reported here: 1.35 embryos are obtained by aspiration and a pregnancy rate of 29%, resulting in the probability of pregnancy for each aspirated buffalo of 0.39%, which means that three sessions of follicular aspiration should be done to guarantee at least one pregnancy for each animal that undergoes aspiration, calculating that to ensure at least one pregnancy 4 to 6 transferrable embryos should be produced per cycle (23). This means that for now, to see some improvement,
Los resultados obtenidos en el presente estudio usando semen sexado, difieren de lo informado por Lu et al (21) en el cual se observaron diferencias significativas en la fertilización cuando se usa semen sexado y convencional. Es fundamental entender que la producción de blastocistos in vitro, dentro de un sistema de producción de embriones in vitro, no está únicamente influenciada por factores biológicos, como el desarrollo de los folículos y la calidad de los oocitos, también por factores relacionados con los procedimientos de laboratorio, la nutrición de las madres y el manejo de los animales. El uso de embriones congelados para transferencia directa, facilita el establecimiento y manejo de estos programas, debido a que en las explotaciones en las que están establecidos programas de inseminación artificial, lo único que se necesita es hacer el cambio de inseminar a transferir embrión, con los ajustes de tiempo y de evaluación luteal que un técnico experimentado puede realizar, sin incrementar significativente los costos. De la experiencia obtenida, se puede afirmar que con el búfalo, los procedimientos biotecnológicos que se realicen, complementados con la reproducción natural son exitosos. En este trabajo la tasa de preñez fue del 29% comparada con un 20% (12) obtenida cuando se sincronizaron las receptoras para la transferencia de los embriones. Cuando se analizan los resultados del programa desde el punto de vista del criador basado en los datos aquí informados: se obtienen 1,35 embriones por aspiración y una tasa de preñez del 29%, resultando una probabilidad de preñez por cada búfala aspirada del 0.39%, lo que significa que se deberían hacer tres sesiones de aspiración folicular para poder garantizar por lo menos una preñez de cada animal que se somete a aspiración, calculando que para asegurar por lo menos una preñez deben ser producidos de 4 a 6 embriones transferibles por ciclo (23). Esto hace que por
Gamarra - In vitro production Buffalo embryos in Colombia aspiration should be done with a minimum of five donors. Investigators should strive to improve embryo production conditions and analyze donors in order to increase the possibilities of generating embryos for the improvement program. Acknowledgements I nve r s i o n e s C o l b ú f a l o s SAS, w h e r e t h e procedures with animals were done.
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ahora, para lograr algún mejoramiento, los trabajos de aspiración se deberían realizar con un mínimo de cinco donadoras. Los investigadores deben dedicarse a mejorar las condiciones de producción de embriones y a analizar las donadoras con el fin de incrementar las posibilidades de generar embriones para el programa de mejoramiento. Agradecimientos Inversiones Colbúfalos SAS, empresa donde se llevaron a cabo los procedimientos con los animales
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Rev.MVZ Córdoba 20(1):4505-4510, 2015. ISSN: 0122-0268
CASO CLÍNICO
Terminal leptospirosis in a woolly monkey (Lagothrix lagothricha) in Colombia Leptospirosis terminal en un mono lanudo (Lagothrix lagothricha) en Colombia Viviana González A,1* M.Sc, Juliana Peña S,2 MV, Javier Bustamante R,1 M.Sc, Miryam Astudillo H,1 M.Sc. Universidad del Valle, Facultad de Salud, Grupo de Biotecnologia y Enfermedades Bacterianas, Av 1N No. 3N-03, Cali, Colombia. 2Fundacion Zoologica de Cali, Carrera 2 Oeste Calle 14, Cali, Colombia. *Correspondencia: vivianarjbr@gmail.com 1
Recibido: March 2014; Aceptado: November 2014.
ABSTRACT A captive woolly monkey (Lagothrix lagothricha) displayed severe lethargy, vomiting and diarrhea. Laboratory tests revealed anemia, leukopenia, hypoproteinemia, severe azotemia and positive Leptospira IgM ELISA. The monkey was humanely euthanized and the necropsy revealed a multifocal tubulointerstitial glomerulonephritis; in addition to splenic lymphoid depletion, and interstitial pneumonia, all of which are compatible with leptospirosis. Rodent control and biosecurity measures should be done at all zoological collections in order to prevent transmission to facility personnel and to threatened mammals maintained in captivity. Key words: Epidemiology, leptospira, primate, zoo (Source: DeCS).
RESUMEN Se presenta el caso clínico de un mono lanudo (Lagothrix lagothricha) en cautiverio, con letargia, vómito y diarrea. Las pruebas de laboratorio revelaron anemia, leucopenia, hipoproteinemia, azotemia severa y ELISA IgM positiva a Leptospira. El mono fue humanamente sacrificado y la necropsia reveló una glomerunonefritis tubulointersticial multifocal; además de depleción linfoidea esplénica, y neumonía intersticial, los cuales son compatibles con leptospirosis. Todas las colecciones zoológicas deberían realizar protocolos de desratización y aplicar medidas de bioseguridad para prevenir la transmisión al personal y mamíferos amenazados mantenidos en cautiverio. Palabras clave: Epidemiologia, leptospira, primate, zoológico (Fuente: DeCS).
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INTRODUCTION
INTRODUCCIÓN
Leptospirosis is the most widespread rat-borne zoonosis in tropical regions, also affecting mammals other than the maintenance host in tropical regions (1,2), caused by pathogenic serovars of the spirochete Leptospira spp. Transmission occurs through direct or indirect routes with contaminated bodily fluids from domestic maintenance hosts such as Rattus spp. and Mus spp. (2). Fatalities typically arise due to renal-vascular dysfunction that leads to renal, cardiac, or respiratory failure (3). Naturally acquired infection with Leptospira is uncommon in non-human primates (4), with only scant reports of seroreactivity in wild primates (5) and asymptomatic seroconversion occurring in primates in zoos (6,7). However, captivity-associated confinement of non-native species may increase exposure to peridomestic reservoirs, promoting pathogen transmission potential to animals and personnel (6). This report details a clinical case of leptospirosis in a captive woolly monkey (Lagothrix lagothricha).
La leptospirosis es la zoonosis transmitida por ratas más común en regiones tropicales, afectando también a los mamíferos distintos del reservorio en regiones tropicales (1,2), y es causada por serotipos patógenos de la espiroqueta Leptospira spp. La transmisión se produce a través de rutas directas o indirectas con fluidos corporales contaminados de reservorios domésticos como Rattus spp. y Mus spp. (2). Las muertes ocurren típicamente debido a disfunciones renales vasculares que conlleva a insuficiencia renal, cardíaca o respiratoria (3). La infección adquirida naturalmente por Leptospira es infrecuente en primates no humanos (4), con tan sólo algunos escasos informes de seroreactividad en primates salvajes (5) y seroconversión asintomática en primates en zoológicos (6,7). Sin embargo, el confinamiento asociado al cautiverio de especies no nativas puede aumentar la exposición a los reservorios peridomésticos, facilitando la transmisión potencial de patógenos para los animales y el personal (6). En este informe se detalla un caso clínico de leptospirosis en un mono lanudo en cautiverio (Lagothrix lagothricha).
CASE REPORT A zoo-born, adult 8 kg male woolly monkey (Lagothrix lagotricha) had been part of the collection of the Zoological Foundation of Cali, Colombia, since 1997. The monkey was a dominant male that shared the enclosure with other members of the same species. In June 2010, the monkey was reported to be severely lethargic, vomiting and passing diarrhea. On day one, anesthesia was performed in order to conduct a physical examination, and to collect blood for a complete blood count, serum biochemistry, serology, and urine for a darkfield examination and urinalysis. Antibiotic and supportive treatment was also administered under anesthesia. The physical exam determined a good body condition (4/5), dehydration of 10%, and lymphadenopathy of the submandibular, axillary, inguinal and popliteal lymph nodes. The monkey had moderate anemia with unremarkable values of both mean corpuscular volume and mean corpuscular hemoglobin, indicating a normocytic normochromic anemia characterized by severe poikilocytosis and polychromasia, with many echinocytes, and moderate Howell-Jolly bodies, in addition to leukopenia with moderate neutropenia. Platelet count was within normal International Species Information System (ISIS) ranges and no bands were detected. Of interest, the biochemical panel revealed hypoalbuminemia and hypocalcemia. We also detected marked increment of alanine
REPORTE DEL CASO Un mono lanudo (Lagothrix lagotricha) macho adulto, nacido en cautiverio de 8 kg que formaba parte de la colección de la Fundación Zoológica de Cali, Colombia, desde 1997. El mono era un macho dominante que compartía el recinto con otros miembros de la misma especie. En junio de 2010, se reportó que el mono sufría de letargo, vómito y diarrea severa. En el primer día, se le aplicó anestesia para llevar a cabo un examen físico y para recoger muestras de sangre para un examen de hemograma, bioquímica sérica, serología y orina. También se administró un tratamiento antibiótico y de apoyo bajo la anestesia. En el examen físico se determinó una buena condición corporal (4/5), deshidratación del 10% y linfadenopatía de los ganglios linfáticos submandibulares, axilares, inguinales y poplíteos. El mono sufría de anemia moderada con valores comunes de volumen corpuscular medio y hemoglobina corpuscular media, indicando una anemia normocítica normocrómica caracterizada por poiquilocitosis y policromasia severa, con un gran número de equinocitos y cuerpos de HowellJolly moderados, además de leucopenia con neutropenia moderada. El conteo de plaquetas estuvo dentro de los rangos normales del Sistema Internacional de Información de Especies (ISIS) y no se detectó ninguna banda. El análisis bioquímico reveló hipoalbuminemia y hipocalcemia. También se detectó un incremento marcado de alanina
González - Terminal leptospirosis in a woolly monkey transaminases and severe increase of creatinine and BUN (Table 1). Table 1. Complete blood counts and biochemistry panel results of a woolly monkey with leptospirosis. Parameter
RBC
Complete Hematocrit Blood
Hemoglobin
Counts
WBC Neutrophils
Total Proteins
Blood
Albumin
Chemistry ALT/GPT Panel
BUN Creatinine Calcium
Result
ISIS value
ꜜ3.12 x 10^6/uL ꜜ 27% ꜜ 86 g/L
4.19 - 5.73 10^6/uL 35.4 - 44% 119 – 141 g/L
5.60 x 10^9 cells/L 7.15 - 18.25 x 10^3/uL 3.4 cells x 10^9/L
ꜜ 5.2 g/L ꜜ 3.4 g/L ꜛ 131 UI/L
ꜛ 192.7 mg/dL ꜛ 5.1 mg/dL ꜜ 7.7 mg/dL
3.7 - 13.2 x 10^3/uL 6.6 - 7.8 g/dL 3.9 - 5.5 g/dL 34-72 UI/L 11 - 29 mg/dL 0.6 - 1 mg/dL 9.4 - 10.8 mg/dL
On day two, blood was drawn once more to monitor kidney function and as a treatment follow-up. There was a marked increase of creatinine (813.28 µMol/L), and electrolyte imbalance (plasma sodium 150.1 mMol/L and phosphate 4.58 mMol/L). Urinalysis revealed proteinuria, hematuria, and leukosuria (100 mg/ dL and 17-20 RBC and 8-10 leucocytes per 40X field, respectively) with low bacteria counts. The presence of detectable antibodies against Leptospira was confirmed through ELISA IgM test (12 units). According to the manufacturer, results >11 units are considered positive for anti-Leptospira IgM. These antibodies are produced during the acute phase of the disease, but may remain detectable for longer periods (2). However, diagnosis was reached considering a positive ELISA result in combination with clinical presentation and epizootiology. Urine dark field microscopy was negative for the presence of spirochetes. Due to unresponsiveness to treatment and clinical deterioration, the monkey was euthanized. In Colombia, euthanasia is performed by qualified veterinarians by administering intravenously 1 mL of a solution of sodium penthobarbital and sodium difenilhidantoine per 5 kg total body weight. The first compound acts as a nonselective central nervous system depressant and the latter is an anti-convulsant. This procedure offers a calm, rapid and humane death. Necropsy revealed presence of abundant abdominal adipose tissue, in addition to free blood in thorax and abdomen. The kidneys (Figure 1) and lungs contained diffuse pinpoint hemorrhages; the latter also had atelectic foci and the trachea was edematous. No gross lesions were found in the spleen, liver, intestines
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aminotransferasas y un aumento severo de creatinina y BUN (Tabla 1). En el día dos se tomaron muestras adicionales de sangre para monitorear la función renal y como seguimiento al tratamiento. Se presentó un aumento marcado de creatinina (813.28 µMol/L) y electrólitos (sodio en plasma 150.1 mMol/L y fosfato en plasma 4.58 mMol/L). El análisis de orina reveló glucosuria, hematuria y proteinuria (100 mg/dL y 17-20 RBC y 8-10 leucocitos por campo de 40X, respectivamente) con conteos bajos de bacterias. Se confirmó la presencia de anticuerpos detectables contra la Leptospira a través de la prueba ELISA IgM (12 unidades). De acuerdo con el fabricante, los resultados > 11 unidades son considerados como positivas para IgM contra Leptospira. Estos anticuerpos son producidos durante la fase aguda de la enfermedad, pero pueden permanecer detectables por períodos más largos de tiempo (2). Sin embargo, se llegó a un diagnóstico considerando un resultado positivo de ELISA en combinación con la presentación clínica y la epizootiología. El análisis de orina en microscopio de campo oscuro mostró un resultado negativo para espiroquetas. El mono fue sacrificado debido a la falta de respuesta al tratamiento y a su deterioro clínico. En Colombia, la eutanasia es realizada por veterinarios calificados mediante la administración intravenosa de 1 mL de una solución de pentobarbital de sodio y difenilhidantoina de sodio por cada 5 kg de peso corporal total. El primer compuesto actúa como un depresor no selectivo del sistema nervioso central y el segundo es un anticonvulsivo. Este procedimiento ofrece una muerte tranquila, rápida y humana. La necropsia reveló presencia de abundante tejido
Figure 1. Diffuse petecchiae in the surface of kidneys of an acute case of leptospirosis in a Lagothrix lagothricha in captivity in Cali, Colombia. Photo credit: Zoological Foundation of Cali, 2010.
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and pancreas. The cut surfaces of the kidneys bulged and both kidneys were slightly enlarged. H&E histopathology revealed multifocal tubuleinterstitial glomerulonephritis, changes in spleen associated with lymphoid depletion, and moderate interstitial pneumonia. The bloody liquid found in thorax and abdomen contained mainly bilirubin, blood cells and proteins.
DISCUSSION This clinical case presents the first documented clinical case of leptospirosis in a captive woolly monkey. Very few confirmed cases of leptospirosis have been reported in nonhuman primates in the world (3). The only reported outbreak in Colombia happened in a rehabilitation facility in Cebus capucinus, C. apella and C. albifrons, where most of the primates presented diffuse jaundice and pulmonary hemorrhage (8). This anicteric infection was characterized by leukocytopenia. The septicemic phase of leptospirosis is associated with damage to vascular lining cells, which combined with the release of bacterial toxins and inflammatory responses to the bacteria (4), account for the pathological features found in this case, including nephritis and petecchiae (2,8). This phase may be followed by a systemic inflammatory response syndrome, which may reflect a leukopenia or leukocytosis, depending on the response of each individual (4), although leukocytosis is more common (2). RBC showed severe poikilocytosis predominantly marked by echinocytes, revealing a toxic disease process with alteration of the RBC membrane. HowellJolly bodies showing signs of hemolytic anemia or an affected spleen; also polycromasia and microcytes, which occur in disseminated intravascular coagulation (DIC). DIC and leukopenia are common findings amongst patients with sepsis, and leptospirosis is considered a frequent cause of sepsis in tropical regions (9). Barbiturate euthanasia solutions can cause vascular damage and necrosis in different organs. However, the incidence of these artifacts is minimal or absent when recommended doses are used (10). Serum biochemistry analysis revealed hypoproteinemia, hypocalcemia, azotemia and hypoalbuminemia, which are all indicators of a nephropathy, more specifically, acute renal failure. Although jaundice is a common clinical sign associated with leptospirosis, anicteric leptospirosis is also reported as part of the acute febrile syndrome (11). Alanine amino
adiposo abdominal, además de sangre libre en el tórax y abdomen. Los pulmones (Figura 1) y riñones presentaban hemorragias puntiformes difusas; este último también tenía focos atelectásicos y una tráquea edematosa. No se encontraron lesiones macroscópicas en el bazo, hígado, intestinos y páncreas. Al corte, la superficie de los riñones sobresalían y ambos riñones estaban aumentados de tamaño. La histopatología reveló glomerulonefritis túbulointersticial multifocal, cambios en el bazo asociado con el agotamiento linfoide y neumonía intersticial moderada. El líquido sangriento encontrado en el tórax y abdomen contenía principalmente bilirrubina, células sanguíneas y proteínas.
DISCUSIÓN Este reporte de caso representa el primer caso clínico documentado de leptospirosis en un mono lanudo cautivo. Se han reportado muy pocos casos confirmados de leptospirosis en primates no humanos en el mundo (3). El único brote reportado en Colombia ocurrió en un centro de rehabilitación en Cebus capucinus, C. apella y C. albifrons, donde la mayoría de los primates presentaron ictericia difusa y hemorragia pulmonar (8). Esta infección anictérica estuvo caracterizada por leucocitopenia. La fase septicémica de la leptospirosis se asocia con daños a las células de revestimiento vascular, que combinado con la liberación de toxinas bacterianas y las respuestas inflamatorias a las bacterias (4), dan cuenta de las características patológicas encontradas en este caso, incluyendo la nefritis y petequias (2, 8). Esta fase puede ser anterior a un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, que puede reflejar una leucopenia o leucocitosis dependiendo de la respuesta de cada individuo (4), aunque la leucocitosis es más común (2). Los eritrocitos mostraron poiquilocitosis severa marcada predominante por equinocitos, revelando un proceso de enfermedad tóxica con alteración de la membrana de los eritrocitos. Los cuerpos de HowellJolly mostraron signos de anemia hemolítica o de un bazo afectado, también de policromasia y microcitos, que se presentan durante la coagulación intravascular diseminada (CID). La DIC y leucopenia son resultados comunes entre los pacientes con sepsis y se considera que la leptospirosis es una causa frecuente de sepsis en regiones tropicales (9). Las soluciones barbitúricas pueden causar daño vascular y necrosis en diversos órganos. Sin embargo, la incidencia de estos artefactos es mínima o ausente cuando se utilizan las dosis recomendadas (10). El análisis bioquímico del suero reveló hipoproteinemia, hipocalcemia, azotemia e hipoalbuminemia, los cuales son indicadores de una nefropatía, más específicamente, de una insuficiencia renal aguda.
González - Terminal leptospirosis in a woolly monkey transferase is almost exclusively found in the primate liver; however, increased levels in the absence of jaundice can be the result of a hemolytic crisis, because it is also found in the RBC cytosol. In addition, anicteric disease can occur in peracute processes with severe liver damage and increased enzyme activity (3). The exudate collected from thorax and abdomen was most likely linked to the severe acute multi-organic inflammatory reaction. The absence of leptospires in the urine viewed by dark-field microscopy may be a reflection of intermittent shedding, known to occur in some species. It could also be due to the bactericidal treatment administered (12). Very few confirmed cases of leptospirosis have been reported in non-human primates in the world (3). The only reported outbreak in Colombia happened in a rehabilitation facility, where most of the primates presented diffuse jaundice and pulmonary hemorrhage (8). We confirmed leptospirosis with ELISA IgM; these antibodies may remain detectable for several months (3). However, a high IgM titer in a single serum specimen is consistent with a current or recent infection. The specific serovar involved could not be determined due to the known cross-reactivity with in test. The fact that a single animal was infected in the enclosure might be due to individual infection susceptibility possibly related to endocrine responses (stress) from multiple sources. Behavioral modifications due to captive conditions might also influence this pattern since these folivorous animals have been seen hunting rodents inside the enclosure (unpublished data). Although leptospirosis is not a reportable disease in Colombia, it is listed internationally as an important occupational disease in captive facilities (6), and it holds economic relevancy. Since leptospirosis diagnosis in non-human primates tends to be characterized by lessevident clinical signs and lesions, and by short-lived antibody responses (3), this clinical case provides evidence that it is important to consider it part of rule-outs or differential diagnosis in future clinical events within and outside of Colombia. Rodent control and biosecurity measures are recommended for all institutions keeping mammals in order to avoid pathogen transmission to personnel and between enclosures.
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Aunque la ictericia es un signo clínico común asociado con la leptospirosis, la leptospirosis anictérica también ha sido reportada como parte del síndrome febril agudo (11). La alanina aminotransferasa se encuentra casi exclusivamente en el hígado de los primates; sin embargo, unos niveles más altos en ausencia de ictericia pueden ser el resultado de una crisis hemolítica, porque también se encuentra en el citosol eritrocitario. Además, la enfermedad anictérica puede ocurrir en procesos sobreagudos con daños severos en el hígado y una mayor actividad enzimática (3). El exudado recogido del tórax y abdomen estaba asociado muy probablemente a una reacción inflamatoria multiorgánica aguda severa. La ausencia de leptospiras en la orina vista por microscopía de campo oscuro puede ser un reflejo de una diseminación intermitente, que se presenta en algunas especies. También podría ser debido al tratamiento bactericida administrado (12). Se han reportado muy pocos casos confirmados de leptospirosis en primates no humanos en el mundo (3). El único brote reportado en Colombia ocurrió en un centro de rehabilitación, donde la mayoría de los primates presentaba ictericia difusa y hemorragia pulmonar (8). Se ha confirmado la leptospirosis mediante la utilización de la prueba ELISA IgM; estos anticuerpos pueden permanecer detectables durante varios meses (3). Sin embargo, un alto título de IgM en una sola muestra de suero es consistente únicamente con una infección reciente o actual. No se pudo determinar el serovar específico involucrado debido a la reactividad cruzada conocida de la prueba. El hecho de que un único animal haya sido infectado en el recinto podría ser causado por la susceptibilidad individual a la infección posiblemente relacionada con las respuestas endocrinas (estrés) de múltiples fuentes. Las modificaciones del comportamiento debido a condiciones de cautiverio también podrían influir en este patrón ya que se ha observado que estos animales folívoros cazan roedores dentro del recinto (datos inéditos). Aunque la leptospirosis no es una enfermedad de declaración obligatoria en Colombia, se muestra internacionalmente como una enfermedad ocupacional importante en instalaciones de cautiverio (6) y tiene una relevancia económica. Puesto que el diagnóstico de la leptospirosis en primates no humanos tiende a estar caracterizado por lesiones y signos clínicos menos evidentes y por las respuestas de anticuerpos de corta duración (3), este caso clínico proporciona evidencia en cuanto a que es importante considerarla como parte de las exclusiones o diagnosis diferenciales en futuros casos clínicos dentro y fuera de Colombia. Se recomienda implementar medidas de bioseguridad y desratización en todas las instituciones que mantienen mamíferos en cautiverio con el fin de evitar
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Acknowledgements We thank Dr. Carlos Lopez DVM for his advice on clinical pathology, Dr. Sonia M. Hernandez DVM PhD for her comments, Leonor Oviedo for laboratory assistance and the staff at the Colombian Agricultural Institute (ICA) for sample provision, and to the personnel at the Zoological Foundation of Cali who were actively involved in this case. Conflict of interests: Authors declare having no conflict of interest.
la transmisión de patógenos al personal y entre los recintos. Agradecimientos Agradecemos al Dr. Carlos López DVM por su consejo en patología clínica, a la Dr. Sonia M. Hernández DVM PhD por sus comentarios, a Leonor Oviedo por su asistencia en el laboratorio y al personal del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) por la disposición de las muestras, y al personal de la Fundación Zoológica de Cali que participaron activamente en este caso. Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.
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