U P L B P V - L a b o ra t o i re d e B i o lo g i e e t Pa t h o lo g i e V é g é t a l e UNIVERSITÉ DE NANTES
Identification HRM d’espèces d’orobanche à partir d’une graine © P. Simier, LBPV
Objectif
Parcelle de colza infestée par l’adventice parasite Phelipanche ramosa L. (Pomel) ; les fleurs violettes, sont de l'orobanche rameuse
L’objectif était de développer et d'évaluer une méthode HRM (High Resolution Melting) afin d’identifier, à partir d'une unique graine, les huit espèces d’orobanche les plus nocives et les plus communes sur le territoire français. Le développement d’une méthode de diagnose moléculaire, simple et fiable, à partir d’une seule graine revêt un enjeu important pour le commerce des semences des cultures sensibles à l’orobanche (chanvre, colza, tournesol, féverole…).
en revanche le test ne permet pas de les distinguer entre elles. Testé sur 50 lots de graines d’orobanche d’espèces différentes et de provenances différentes, les résultats d’identification par HRM correspondent parfaitement à ceux obtenus par séquençage direct des séquences plastidiales. Grâce à une analyse de lots identiques de graines réalisée par plusieurs expérimentateurs, la reproductibilité du test a été évaluée à 90%. Malgré le procédé original d’extraction d’ADN des échantillons, il n'a pas été possible d'extraire suffisamment d'ADN de certaines graines (10% des échantillons).
Contexte
Perspectives
Alors que la plupart des espèces d’orobanche vivent en équilibre avec leurs plantes hôtes dans divers écosystèmes naturels, quelques espèces se développent en tant qu’adventices de grandes cultures. Leur expansion est difficilement contrôlable, en raison d’un taux de multiplication très élevé (plusieurs dizaines de milliers de graines minuscules (~200 µm) par plante). Des mesures drastiques doivent être prises, telles que la certification de la non contamination des lots commerciaux de semences par des graines d’orobanches nuisibles. A ce jour, une telle certification existe pour les lots de semences de chanvre : la contamination d'un lot par une seule graine d’orobanche entraîne son rejet. Puisque l'identification des espèces d’orobanche à partir d'une seule graine est extrêmement difficile, et que parmi toutes les espèces décrites, seules quelques-unes sont réellement nuisibles pour les cultures, de nombreux lots de semences sont rejetés sans être certain de l’espèce d’orobanche incriminée.
Le test développé satisfait donc à ses objectifs et permet une identification précise des espèces d’orobanche ciblées. Il peut être utilisé pour identifier des contaminants dans des lots commerciaux de semences mais aussi à d'autres fins comme l’identification de graines présentes dans un sol. Le test peut être aussi étendu à du matériel végétatif. L’exploitation de ce test comme outil de diagnose moléculaire dans le cadre de la certification des lots commerciaux de semences pourra être proposée par le Geves si la réglementation internationale évolue vers une exigence de pureté des lots vis-à-vis des graines d’orobanche.
Résultats Dans un premier temps, un protocole a été développé permettant l’extraction d’ADN à partir d’une graine d’orobanche. Basé sur l'amplification par PCR de régions des gènes plastidiaux, trnL et rbcL, le test HRM mis en place permet avec succès l’identification des espèces O. cumana, O. cernua, O. crenata, O. minor, O. foetida et O. hederae. Cette dernière espèce (orobanche du Lierre) n’est pas nuisible pour les cultures mais se révèle très fréquente sur le territoire, et notamment en bordure des parcelles incriminées. Si les espèces P. ramosa et P. aegyptiaca peuvent être différenciées des autres espèces, 34
Partenaires Ces recherches sont le fruit d’une collaboration entre le Geves (Beaucouzé), Terres Inovia (Thiverval-Grignon) et le LBPV (Université de Nantes) dans le cadre d’un projet CASDAR “Orobanche” (N° C-2012-07) financé par le Ministère de l’Agriculture, de l’Agroalimentaire et de la Forêt.
Bibliographie Rolland M, Dupuy A, Pelleray A, Delavault P. 2016. Molecular identification of broomrape species from a single seed by High Resolution Melting Analysis, Frontiers in Plant Science, 7: 1838.
Contact Philippe Delavault, LBPV, UFR Sciences & Techniques, 2 rue de la Houssinière, 44322 Nantes Mél : philippe.delavault@univ-nantes.fr
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