Guia de metodos de deteccion y analisis de cadmio en cacaox by Red de Investigación e Innovación en Cacao y Chocolate

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“GUÍA DE MÉTODOS DE DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE CADMIO EN CACAO (Theobroma Cacao L)”

Consultora: Sayet V. Barrueta Rivera Ing. Agroindustrial

Lima, Noviembre del 2013

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao

INDICE INTRODUCCION............................................................................................................... 3 I.

MARCO DE REFERENCIA ........................................................................................ 4 1.1.

GENERALIDADES DEL CULTIVO DE CACAO.................................................. 4

1.1.1.

Exportaciones del Cacao Peruano................................................................ 5

1.1.2.

Contaminación de Cacao con Cadmio.......................................................... 6

1.2.

METALES PESADOS EN ALIMENTOS .............................................................. 7

1.2.1.

Cadmio ......................................................................................................... 7

1.3. REGULACIONES INTERNACIONALES QUE ESTABLECEN LOS LIMITES MAXIMOS PARA EL CADMIO EN CACAO.................................................................... 8 1.4. REGULACIONES PARA LA EXPORTACIÓN DE CACAO A LOS MERCADOS INTERNACIONALES ..................................................................................................... 9 1.4.1.

Unión Europea.............................................................................................. 9

1.4.2.

Estados Unidos: ......................................................................................... 11

II. TECNICAS ANALITICAS DISPONIBLES PARA LA DETERMINACION DE CADMIO EN ALIMENTOS.............................................................................................................. 12 2.1.

ESPECTROMETRIA ATOMICA ........................................................................ 13

2.1.1.

Espectrometría de Absorción Atómica........................................................ 14

2.1.2.

Espectrometría de Emisión Atómica ........................................................... 18

2.2. ESPECTROMETRÍA DE MASAS CON PLASMA DE ACOPLAMIENTO INDUCTIVO (ICP-MS).................................................................................................. 20 2.3.

INTERFERENCIAS ........................................................................................... 21

2.4.

PREPARACION DE LAS MUESTRAS .............................................................. 22

2.5.

DESARROLLO DE LA TECNICA ANALITICA ................................................... 23

III. PROTOCOLO PARA LA DETERMINACION DE CADMIO EN GRANOS DE CACAO Y DERIVADOS .................................................................................................. 24 3.1.

OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN ........................................................... 24

3.2.

FUNDAMENTO ................................................................................................. 24

3.3.

REFERENCIAS NORMATIVAS......................................................................... 25

3.4.

DEFINICIONES ................................................................................................. 25 1

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao 3.5.

MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS ........................................................... 28

3.5.1.

Equipos y materiales .................................................................................. 28

3.5.2.

Reactivos.................................................................................................... 29

3.5.3.

Procedimiento de lavado de materiales de vidrio y plástico ........................ 30

3.6.

PROTOCOLO DE MUESTREO DE GRANOS DE CACAO Y DERIVADOS ...... 31

3.6.1. Procedimiento para la obtención de muestras de granos de cacao y derivados .................................................................................................................. 31 3.7. PROTOCOLO DE TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIÓN DE CADMIO EN CACAO Y DERIVADOS...................................... 32 3.7.1.

Método de digestión húmeda de la muestra ............................................... 32

3.7.2.

Digestión acida con microondas (Según AOAC 999.10)............................. 33

3.7.3.

Digestión por vía seca (Según NTP 208.030 y AOAC 999.11) ................... 34

3.8. CALIBRACION DEL EQUIPO DE ESPECTROMETRIA DE ABSORCION ATOMICA POR HORNO DE GRAFITO ....................................................................... 35 3.8.1.

Calibración ................................................................................................. 35

3.8.2.

Operación del Instrumento.......................................................................... 36

3.9. DETERMINACIÓN DE CADMIO POR ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON HORNO DE GRAFITO ................................................. 37 3.9.1.

Desarrollo de la Técnica Analítica............................................................... 38

3.9.2.

Curvas de calibración para Cadmio ............................................................ 38

3.9.3.

Cálculos y evaluación de los resultados ..................................................... 38

3.9.4.

Informe de ensayo...................................................................................... 39

IV.

SUGERENCIAS.................................................................................................... 40

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS......................................................................... 41

VI.

ANEXOS............................................................................................................... 44

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao

INTRODUCCION El cacao es un cultivo de mucha importancia económica en el Perú, ya que en la actualidad existen 144,232 hectáreas cultivadas de cacao, gran parte de las cuales se han instalado gracias a los programas de Desarrollo Alternativo, que promueven la siembra del cacao en la selva peruana. Así mismo las exportaciones de cacao orgánico y convencional han ido evolucionando, siendo reconocidos por su gran calidad en eventos internacionales. Sin embargo en estos últimos años la presencia de cadmio en el cacao y sus derivados, ha generado gran preocupación tanto en los países productores como en los países importadores, así como también en los organismos de Regulación Internacional como la OMS y la FAO. El 16 de septiembre de 2013, la Unión Europea notificó al Comité de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias de la Organización Mundial del Comercio (OMC) la Enmienda al Reglamento Europeo No. 1881/2006, en la cual se establecen niveles máximos (NM) de cadmio para el chocolate y productos derivados del cacao, que entrarán en vigor a partir del 1 de enero del 2019. Considerando como contenidos máximos de cadmio en diversos productos de cacao en un rango de 0.10 a 0.80 mg/kg. El Cadmio es una sustancia natural presente en la corteza terrestre, que ha adquirido una gran importancia toxicológica; cuya presencia en algunos cultivos está asociado a la actividad antrópica. Los usos más habituales de este metal son en la industria de la galvanoplastia, la fabricación de baterías y la estabilización de algunos plásticos, aunque el cadmio se ha utilizado también en la elaboración de algunos plaguicidas y fertilizantes. El vertido al suelo de los ácidos utilizados para la producción de pasta básica de cocaína es otro de los vehículos para su asimilación por los cultivos y especies silvestres. Existen muchas técnicas analíticas para la determinación de metales pesados en alimentos, entre los más utilizados tenemos la Espectrometría de Absorción Atómica y la Espectrometría de Masas. La absorción atómica es una técnica capaz de detectar y determinar cuantitativamente la mayoría de los elementos del sistema periódico. Su campo de aplicación es muy diverso, entre ellos la industria alimentaria. El método consiste en la medición de las especies atómicas por su absorción a una longitud de onda particular. En la presente guía se establece un protocolo de análisis para la determinación de Cadmio en granos de cacao y derivados mediante Espectrometría de Absorción Atómica con Horno de Grafito (GFAAS), con tres pre tratamientos de la muestra; digestión acida por vía húmeda y seca, y digestión acida asistida por microondas. 3

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao

I. 1.1.

MARCO DE REFERENCIA

GENERALIDADES DEL CULTIVO DE CACAO El nombre científico del cacao es Theobroma cacao, pertenece a la familia de las esterculiáceas y es una especie cuyo centro de origen es América del Sur y México. La altura del árbol es entre 6 y 10 metros, con un adecuado cultivo mide de 2 a 3 metros. A las semillas y granos del fruto se les denomina cacao, que luego de un proceso de fermentación y secado son utilizadas para la elaboración del chocolate. El cacao es un producto de mucha importancia económica y estratégica en nuestro país, ya que permite mejorar la calidad de vida de las familias de la Amazonia peruana, además de ser un producto que viene siendo promovido por los programas de Desarrollo Alternativo para la erradicación de cultivos ilícitos.

Fig. 01. El cacao

El Perú es uno de los principales lugares originarios del cacao, posee el 60% de las variedades de cacao del mundo y es el segundo productor mundial de cacao orgánico. En los últimos años se incrementó la producción de cacao orgánico en Perú, posicionándose en los primeros lugares en los nichos especiales del mercado mundial. [36]. En el año 2012 la producción nacional de cacao fue de 60 mil toneladas, involucrando a 40 mil familias dedicadas a su cultivo. [27]. El Perú ha sido calificado por la Organización Internacional del Cacao (ICCO) como un país en donde se produce y se exporta un cacao fino y de aroma, logrando el 36% de la producción mundial de este tipo. [36]. 4

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao En el año 2012, el cacao fue declarado Patrimonio Natural de la Nación, reconociéndose al cacao como uno de los cultivos más importantes del Perú, y en Octubre del 2013, fue declarado producto bandera. Las variedades más cultivadas de cacao son: • • •

Criollo: es el más antiguo y proviene de la selva norte. Forastero : es el más abundante y representa el 90 % de la producción mundial Trinitario : original de la isla de Trinidad, es un híbrido biológico natural, cruce del criollo y el forastero

Los principales usos del cacao son: -

Cacao en polvo: para elaborar el chocolate y aromatizar diferentes tipos de bebidas, galletas, pasteles, etc. Pulpa de cacao: elaboración de bebidas como licores con café y gaseosas. Manteca de cacao: se utiliza en la fabricación de medicamentos, cosméticos, jabones, etc. Jugo de cacao : para la elaboración de mermeladas y jaleas

Algunas de las propiedades medicinales del cacao, es que posee gran cantidad de minerales y vitaminas, y es uno de los alimentos que contiene antioxidantes, también posee anandamida que ayuda en el tratamiento de la depresión y el ánimo, también se utiliza en el tratamiento de la diabetes, es diurético y es bueno para la hipertensión. [36].

1.1.1. Exportaciones del Cacao Peruano En el 2012, las exportaciones de cacao y sus derivados sumaron los US$ 101,552.8 millones. Los principales países de destino fueron los mercados de Estados Unidos, Holanda, Bélgica, Alemania e Italia.

Cuadro 01. Exportaciones de cacao y derivados en valor FOB U$

Fuente: Informe Anual Promperu. 2012

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao La exportación de cacao Grano en el 2012 alcanzó los U$ 62.9 millones a un precio promedio de U$ 2.57 el kilo. Holanda y Bélgica son nuestros principales destinos con U$ 11.9 millones cada uno (19%), le siguen Alemania U$ 8.1 millones (13%) e Italia U$ 7.9 millones (13%), entre 32 Países compradores. En el 2012 las principales empresas exportadoras de cacao en grano fueron: Amazonas Trading que lidero las ventas con U$ 9.9 millones (16% del total), seguida de la cooperativa ACOPAGRO con U$ 8.2 millones (13%) y la Cooperativa Agraria Naranjillo U$ 7.9 millones (13%), entre otras 47 Empresas exportadoras, la mayoría ubicadas en zonas conflictivas del VRAE. [2]

1.1.2. Contaminación de Cacao con Cadmio Los metales pesados en los alimentos tienen múltiples orígenes. En el caso del cacao es posible que la contaminación del producto se de en las etapas de cultivo, producción y transformación. Conocer el origen de la contaminación en alimentos es fundamental para determinar las acciones a seguir y para establecer la calidad del producto. A nivel experimental, el análisis de metales pesados en alimentos y suelos involucra recolección, preparación de muestras, extracción de los metales, eliminación de interferencias y finalmente detección y cuantificación mediante técnicas analíticas instrumentales. [29] La planta de cacao absorbe ligeramente los metales pesados que existen por naturaleza en los suelos y los concentra en las semillas grasosas. Según las regiones, el grado de concentración de metales pesados es diferente. [8] La principal fuente de contaminación de cadmio son los fertilizantes provenientes de roca fosfórica. Por estas razones se hace necesario determinar cuál es la condición actual de los suelos y de algunos productos agrícolas que por su alto consumo podrían representar un peligro para la salud humana. Esta información también permitirá establecer una línea base que servirá de referencia para el monitoreo de estos metales en el futuro. Estudios realizados en Estados Unidos muestran que el factor que más contribuye a la concentración de cadmio en cultivos es el pH del suelo. En suelos ácidos la absorción de cadmio es mayor, pues los suelos donde se cultiva cacao son de tendencia ácida, típico de la región húmeda tropical. Experimentos realizados en Estados Unidos muestran que la aplicación de cal para la corrección del pH reduciendo la acidez, disminuye significativamente la absorción de cadmio. [20]

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao 1.2.

METALES PESADOS EN ALIMENTOS Los metales pesados que están en los alimentos provienen de diversas fuentes, las más importantes son: la composición mineralógica del suelo en el que se producen los alimentos para el hombre y los animales; los lodos residuales, los fertilizantes químicos y plaguicidas empleados en agricultura. La presencia de metales pesados en alimentos y particularmente en productos lácteos, constituye un tema de actualidad por los daños que ocasionan a la salud pública. Es necesario enfatizar que los riesgos a la salud de la población infantil necesitan ser evaluados de una manera integral, considerando la exposición crónica de metales pesados en alimentos que por lo regular se presenta de forma asintomática durante un tiempo prolongado de vida. [3]. Los metales pesados son un grupo de elementos químicos que presentan una densidad relativamente alta y toxicidad para el ser humano, aunque algunos son elementos esenciales en el ser humano, independientemente de que a determinadas concentraciones puedan ser tóxicos en alguna de sus formas. Sin embargo, hay una serie de elementos que en alguna de sus formas pueden representar un serio problema medioambiental y es común referirse a ellos con el término genérico de "metales pesados". La peligrosidad de los metales pesados es mayor al no ser química ni biológicamente degradables. Una vez emitidos, principalmente debido a la actividad industrial y minera, pueden permanecer en el ambiente durante cientos de años, contaminando el suelo y acumulándose en las plantas y los tejidos orgánicos. Además, su concentración en los seres vivos aumenta a lo largo de la cadena alimentaria. Los metales pesados tóxicos más conocidos son el mercurio, el plomo y el cadmio. [1].

1.2.1. Cadmio El Cadmio es un componente de la corteza terrestre que se encuentra en pequeñas cantidades asociado a minerales de cinc, cobre o plomo. Su contenido medio en el suelo es minoritario y está estimado en torno a 0,10-0,15 mg/Kg. Su presencia en el medio ambiente es, por tanto, de origen natural, a través de la erosión, pero su nivel puede verse incrementado por la acción del hombre, debido principalmente a actividades como la minería o también derivado de su uso en distintas aplicaciones (pinturas, baterías, etc.).

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao El reglamento de la Unión Europea N°1881/2006 fija los contenidos máximos para este metal en ciertos productos alimenticios, en particular en carne, vísceras, productos de la pesca, cereales, frutas y hortalizas. La absorción del cadmio en el aparato digestivo es baja (5-10%), sin embargo, el cadmio se acumula en el organismo, principalmente en el hígado y riñón, estando su vida media estimada en unos 20-30 años en humanos. [1]. donde podrá ejercer sus efectos toxicológicos. [21] El JECFA calcula la exposición dietética con base a los datos reportados por los países al Sistema Mundial de Vigilancia del Medio Ambiente SIMUVIMA, la estimación resultante de la exposición alimentaria puede compararse entonces con el valor de la Ingesta Diaria Admisible IDA o valor de referencia toxicológico asignado al contaminante que, en el caso del Cadmio, fue establecida una ingesta de forma semanal en 5,8 µg/kg de peso corporal/semana. [18]

1.3.

REGULACIONES INTERNACIONALES QUE ESTABLECEN LOS LIMITES MAXIMOS PARA EL CADMIO EN CACAO A continuación se detalla la evolución de las regulaciones con respecto al Cadmio en Cacao en la OMC y el CODEX Comunidades Europeas y su LM para Cadmio -

El 19 de diciembre de 2006, la Unión Europea (UE) expidió el Reglamento (CE) N°1881/2006, que señala los niveles de cadmio tolerables para los distintos productos. En esta Reglamentación no se encuentran definidos los límites tolerables para el cacao y sus derivados, pues no se consideraba al cacao y chocolates como una fuente significativa de consumo de cadmio.

En el 2007, por una publicación en la revista “Der Spiegel” de Alemania sobre la presencia de cadmio en el chocolate y la posibilidad de que este metal sea un agente cancerígeno, el tema se convirtió en una preocupación sanitaria que llevó a la discusión internacional sobre esta Reglamentación.

En mayo del 2011, se presenta la propuesta de modificación del reglamento N°1881/2006 EC, por la Dirección General de Salud y Protección al Consumidor DG-SANCO. En la cual se sugiere el nivel cadmio en cacao y chocolates sea de 0.30 -0.50 mg/kg. La UE analiza la posibilidad de enmendar el Reglamento (CE) No. 1881/2006, para incluir en la lista los límites máximos (LM) de cadmio para el cacao y productos de 8

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao chocolate, a través de la Regulación (CE) No 420/2011 y de acuerdo a la definición de la Directiva 2000/36/EC. Chocolate y cacao en polvo, en un rango de 0.30 a 0.50 mg/Kg, los cuales se establecerían de manera definitiva entre diciembre 2011 y enero 2012 Los argumentos científicos del proyecto de enmienda se basan en las opiniones científicas de la EFSA (“European Food Safety Authority”) sobre la ingesta de cadmio en la dieta humana. [24]. -

El 16 de septiembre de 2013, la Unión Europea notificó al Comité de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias de la Organización Mundial del Comercio (OMC) la Enmienda al Reglamento Europeo No. 1881/2006, en la cual se establecen niveles máximos (NM) de cadmio para el chocolate y productos derivados del cacao, que entrarán en vigor a partir del 1 de enero del 2019. [31].

Otras Regulaciones internacionales

1.4.

Según Legislación Australiana y Neozelandesa de Metales Pesados (Australian New Zealand Food Code), el contenido máximo de Cadmio para chocolates y productos de cacao es de 0.50 mg/Kg. [4].

Reglamento (CE) N° 333/2007, Control oficial de l os niveles de plomo, cadmio, mercurio, estaño inorgánico, 3-MCPD y benzo(a)pireno en los productos alimenticios.

REGULACIONES PARA LA EXPORTACIÓN DE CACAO A LOS MERCADOS INTERNACIONALES Aun no existen regulaciones específicas en cuanto al contenido de metales pesados en granos de cacao y derivados, sin embargo se han considerado otros requisitos para la exportación de granos de cacao y derivados, en cuanto a la regulación para el contenido de metales pesados en cacao y derivados, ya existe una enmienda al Reglamento N°1881/2006, lo cual ent rara en vigor a partir del 01 de enero del 2019, en la actualidad la mayor parte del cacao, está siendo exportado a los países de la Unión Europea y Estados Unidos cuyos requisitos se mencionan a continuación.

1.4.1. Unión Europea Principales requisitos en la Unión Europea

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao •

Legislación Alimentaria General Reglamento (CE) 178/2002: en este Reglamentos se establece los principios básicos de la Ley General de Alimentos y que es aplicado a todas las etapas de la producción, transformación y distribución de productos alimenticios.

•

Higiene de productos alimenticios Reglamento (CE) 852/2004: Este reglamento presenta una serie de requisitos de higiene o limpieza para los alimentos importados a la UE. Está basado en el sistema de Análisis de riesgos y puntos críticos de control (conocido como HACCP), el cual se aplica a las empresas de procesamiento, tratamiento, envasado, transporte, distribución y comercialización de productos alimenticios, es decir, a través de toda la cadena de valor del producto.

•

Específica para los productos de cacao Directiva (CE) 2000/36: Establece los requisitos para los productos de cacao y chocolate destinados al consumo humano. Esta directiva se refiere a la manteca de cacao, cacao en polvo, chocolate, chocolate con leche, chocolate familiar con leche, chocolate blanco, chocolate relleno, chocolate de taza, chocolate familiar de taza y el chocolate o praliné.

•

Directiva 2000/13/EC donde se establece los requisitos de etiquetado y publicidad. Principales restricciones para el cacao en grano

•

Contenidos Máximos de Contaminantes Reglamento (CE) 1881/2006: Este reglamento fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios que vayan a ser comercializados en la UE. Los contaminantes incluidos en el reglamento son los nitratos, la patulina, ciertos metales pesados, micotoxinas, dioxinas y un contaminante llamado 3-MCPD.

•

Reglamento (CE) 149/2008: Plaguicidas –LMR: El reglamento establece una lista de plaguicidas autorizados y prohibidos para el cacao, así como los Límites Máximos de Residuos (LMR), permitidos en el cacao. En cuanto a las sustancias activas para las que no se ha establecido un LMR, por defecto debe ser de 0,01 mg / kg, a menos que los usuarios proporcionen una justificación para utilizar niveles más altos. Desde septiembre del año 2008, todas las importaciones de cacao en grano en la UE están sujetas a las disposiciones de ésta legislación.

Además para el caso de la UE, es necesario tomar en cuenta que las actuales tendencias de los consumidores europeos prestan mayor atención a la forma como se producen, es por esta razón que los compradores solicitan certificaciones para comprobar que el cacao es producido de manera justa, amigable con el 10

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao medio ambiente y socialmente responsable. Las certificaciones más solicitadas en la UE son Comercio Justo (Fairtrade), Rainforest Aliance y Certificaciones UTZ. 1.4.2. Estados Unidos: Cumplir con las disposiciones de la Ley contra el Bioterrorismo que empezó a regir en los EE.UU. a partir del 2003 el cual se encuentra destinado a proteger la producción, distribución y venta de alimentos de origen norteamericano e importado, en contra de posibles atentados terroristas. El procedimiento para la aplicación de la presente Ley considera las siguientes etapas: -

Registro de instalaciones alimenticias. Notificación previa de alimentos importados. Detención administrativa. Norma final de establecimiento y mantenimiento de registros.

Sin embargo las dos primeras etapas son de cumplimiento obligatorio para las empresas extranjeras. Además la FDA impone un límite legal de granos dañados más bajo, más estrictos que los establecidos por las Normas Internacionales y no se aceptan productos que hayan sido tratados con plaguicidas prohibidos, así no existan residuos en el momento del análisis y se impone una detención obligatoria previa al muestreo como detención automática. También es preciso señalar que se debe de cumplir con los Límites máximos de Residuos (LMR) permitidos para este producto. Por otro lado, y dependiendo de la presentación del producto, la FDA prohíbe la importación de artículos adulterados o mal etiquetados y productos defectuosos, inseguros, sucios o en condiciones insalubres. Los productos no pueden estar mal etiquetados, tener diseños o imágenes falsas o engañosas o etiquetas que no proporcionen la información requerida. Por lo tanto se debe cumplir con las disposiciones de la FDA que se rige por el Código de Regulaciones Federales o Code of Federal Regulations CFR, Título 21, Capítulo 101; que se basa en la Ley Federal de Alimentos, Drogas y Cosméticos FD & C Act; en la Ley de Empaque y Etiquetado Justo FPLA; y, en la Ley de Etiquetado y Educación sobre Nutrición NLEA. Cuando corresponda, los embalajes de madera deben de cumplir con la NIMF 15. [30].

Algunos otros alcances en cuanto a Regulaciones para la exportación se encuentra en el Anexo 2.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao

II. TECNICAS ANALITICAS DISPONIBLES PARA LA DETERMINACION DE CADMIO EN ALIMENTOS Desde hace más de treinta años, los métodos de análisis instrumental han tenido un desarrollo importante y son ampliamente utilizados de forma rutinaria en laboratorios de control y de investigación. En el numeral 3.2 del capítulo “Cadmium” del documento Safety Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants - WHO FOOD ADDITIVES SERIES 64, se resume las diferentes técnicas analíticas para cuantificar cadmio en alimentos, tales técnicas de detección incluyen la espectrometría de absorción atómica de llama (FAAS), electrotérmico (horno de grafito y el horno de Zeeman), espectrometría de absorción atómica (ETAAS), espectrometría de fluorescencia atómica con generación de hidruros (HG -AFS), espectrometría de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente (ICP- OES ) y Espectrofotometría de emisión de plasma con acoplamiento inductivo (ICP- MS). [19] La Espectrometría es una técnica instrumental que permite determinar el mayor número de elementos en una gran variedad de matrices, basada en la identificación de analitos mediante el espectro emitido o absorbido por los mismos, pudiéndose diferenciar entre atómica o de masas. [28] Dentro de las técnicas espectrométricas tenemos a la Espectrometría Atómica y la Espectrometría de masas. En el Cuadro 02, se muestras algunas ventajas y limitaciones de algunos métodos analíticos utilizados para la detección de metales pesados.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Cuadro 02. Resumen de algunos métodos analíticos para determinar Metales Pesados MÉTODO Espectrometría de absorción atómica por llama

VENTAJAS • • • • • •

Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito

• • • • •

• Espectrometría de masa con fuente de plasma de acoplamiento inductivo

• • • • • • •

Requiere solo conocimientos básicos de laboratorio Prueba rápida Tamaño reducido de la muestra con la copa de Delves (50–100 µl) Bajo precio y bajos costos de funcionamiento Relativamente pocas interferencias Interfaz robusta

Buen límite de detección (<1–2 µg/dl) Tamaño reducido de la muestra Precio y costos de funcionamiento moderados Moderada capacidad para analizar múltiples elementos Relativamente pocas interferencias(aunque más que con la espectrometría de absorción atómica por llama) Ampliamente utilizada, existen múltiples proveedores Límite de detección excelente (~0,1µg/dl) Rapidez Tamaño reducido de la muestra (50–100 µl) Relativamente pocas interferencias espectrales, bien conocidas. Permite mediciones isotópicas. Método económico si se procesan grandes cantidades de muestras. Capacidad para investigar más de un elemento.

LIMITACIONES • •

• • • •

•

• •

Límite de detección relativamente alto (~10 µg/dl) Tiempo necesario para la pre concentración o digestión de la muestra si no se utiliza la cubeta de Delves. Se necesitan muestras de gran tamaño para los métodos de nebulización. No se puede dejar el equipo funcionando sin atención. La prueba lleva más tiempo Requiere algo de experiencia de laboratorio (más que con la espectrometría de absorción atómica por llama) Mayor potencial de interferencia espectral que con la espectrometría de absorción atómica por llama.

Precio y costos de funcionamiento elevados Requiere operadores altamente especializados

Fuente: OMS, 2013

2.1.

ESPECTROMETRIA ATOMICA La espectrometría atómica, en términos generales, está basada en la absorción, emisión o fluorescencia por átomos o iones elementales. Hay dos regiones del espectro que dan información atómica: la ultravioleta/visible y la de rayos X. Los espectros atómicos ultravioleta y visible se obtienen mediante un adecuado tratamiento térmico que convierte los componentes de una muestra en átomos o iones elementales gaseosos. La emisión, absorción o fluorescencia de la mezcla 13

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao gaseosa resultante sirve a continuación para la determinación cualitativa y cuantitativa de uno o varios de los elementos presentes en la muestra. [38]

Fig. 02. Espectrofotómetro de Absorción Atómica.

En la espectrometría atómica podemos medir un átomo al pasar del estado fundamental al estado excitado o viceversa. Así tenemos Espectrometría de Absorción Atómica y espectrometría de emisión atómica. 2.1.1. Espectrometría de Absorción Atómica En química analítica, la espectrometría de absorción atómica es una técnica para determinar la concentración de un elemento metálico determinado en una muestra. Puede utilizarse para analizar la concentración de más de 62 metales diferentes en una solución. Principios en los que se basa La técnica hace uso de la espectrometría de absorción para evaluar la concentración de un analito en una muestra. Se basa en gran medida en la ley de Beer-Lambert. En resumen, los electrones de los átomos en el atomizador pueden ser promovidos a orbitales más altos por un instante mediante la absorción de una cantidad de energía (es decir, luz de una determinada longitud de onda). Esta cantidad de energía (o longitud de onda) se refiere específicamente a una 14

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao transición de electrones en un elemento particular, y en general, cada longitud de onda corresponde a un solo elemento. Como la cantidad de energía que se pone en la llama es conocida, y la cantidad restante en el otro lado (el detector) se puede medir, es posible, a partir de la ley de Beer-Lambert, calcular cuántas de estas transiciones tienen lugar, y así obtener una señal que es proporcional a la concentración del elemento que se mide. Instrumentos Para analizar los constituyentes atómicos de una muestra es necesario atomizarla. La muestra debe ser iluminada por la luz. Finalmente, la luz es transmitida y medida por un detector. Con el fin de reducir el efecto de emisión del atomizador (por ejemplo, la radiación de cuerpo negro) o del ambiente, normalmente se usa un espectrómetro entre el atomizador y el detector. Tipos de atomizadores Para atomizar la muestra normalmente se usa una llama, pero también pueden usarse otros atomizadores como el horno de grafito o los plasmas, principalmente los plasmas de acoplamiento inductivo. Cuando se usa una llama, se dispone de tal modo que pase a lo largo lateralmente (10 cm) y no en profundidad. La altura de la llama sobre la cabeza del quemador se puede controlar mediante un ajuste del flujo de mezcla de combustible. Un haz de luz pasa a través de esta llama en el lado más largo del eje (el eje lateral) e impacta en un detector. Fuentes de luz La fuente de luz elegida tiene una anchura espectral más estrecha que la de las transiciones atómicas. Lámparas de cátodo hueco. En su modo de funcionamiento convencional, la luz es producida por una lámpara de cátodo hueco. En el interior de la lámpara hay un cátodo cilíndrico de metal que contiene el metal de excitación, y un ánodo. Cuando un alto voltaje se aplica a través del ánodo y el cátodo, los átomos de metal en el cátodo se excitan y producen luz con una determinada longitud de onda. El tipo de tubo catódico hueco depende del metal que se analiza. Para analizar la concentración de cobre en un mineral, se utiliza un tubo catódico de cobre, y así para cualquier otro metal que se analice. Láser de diodo. La espectrometría de absorción atómica también puede ser llevada a cabo mediante láser, principalmente un láser de diodo, ya que sus propiedades son apropiadas para la espectrometría de absorción láser. La técnica 15

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao se denomina espectrometría de absorción atómica por láser de diodo (DLAAS o DLAS), o bien, espectrometría de absorción por modulación de longitud de onda. Métodos de corrección de fondo El estrecho ancho de banda de las lámparas catódicas huecas hace que sea raro el solapamiento espectral. Es decir, es poco probable que una línea de absorción de un elemento se solape con otra. La emisión molecular es mucho más amplia, por lo que es más probable que algunas bandas de absorción molecular se superpongan con una línea atómica. Esto puede resultar en una absorción artificialmente alta y un cálculo exagerado de la concentración en la solución. Se utilizan tres métodos para corregir esto: Corrección de Zeeman. Se usa un campo magnético para dividir la línea atómica en dos bandas laterales. Estas bandas laterales están lo suficientemente cerca de la longitud de onda original como para solaparse con las bandas moleculares, pero están lo suficientemente lejos como para no coincidir con las bandas atómicas. Se puede comparar la absorción en presencia y ausencia de un campo magnético, siendo la diferencia la absorción atómica de interés. Corrección de Smith-Hieftje (inventada por Stanley B. Smith y Gary M. Hieftje), La lámpara catódica hueca genera pulsos de alta corriente, provocando una mayor población de átomos y auto-absorción durante los pulsos. Esta auto-absorción provoca una ampliación de la línea y una reducción de la intensidad de la línea a la longitud de onda original. Lámpara de corrección de deuterio. En este caso, se usa una fuente de amplia emisión (una lámpara de deuterio), para medir la emisión de fondo. El uso de una lámpara separada hace de este método el menos exacto, pero su relativa simplicidad (y el hecho de que es el más antiguo de los tres) lo convierte en el más utilizado. [17]. En general la espectrometría de Absorción Atómica, mide la luz absorbida por un átomo en estado fundamental al pasar al estado excitado, así tenemos: Espectrometría de Absorción Atómica de Llama (F-AAS), de Atomización Electrotérmico (ETAAS), de Generación de Hidruros (HG- AAS), de Vapor frío (CVAAS), de Análisis elemental/directo (AMA / DMA). [28]

2.1.1.1.

Espectrometría de Absorción Atómica con Llama (F-AAS) El espectrómetro de absorción atómica de llama (FAAS) permite la detección y determinación de metales en cualquier tipo de muestra industrial siempre y cuando pueda ser solubilizada. Los límites de detección en este caso son del orden de la ppm (partes por millón). 16

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Esta técnica analítica está especialmente indicada para determinar elementos alcalinos, alcalinotérreos y metales pesados presentes en cualquier tipo de muestra susceptible de ser disuelta. Los niveles de concentración que se pueden analizar van desde % hasta ppb (partes por billón ó 1 mg/Tm). [38] La FAAS, es una técnica monoelemental y está sujeta a muchas interferencias químicas o de matriz que se producen como consecuencia de diversos procesos químicos que ocurren durante la atomización y que alteran las características de absorción del analito. El tipo más común de interferencia es el producido por aniones que forman compuestos de baja volatilidad con el analito y reducen así su velocidad de atomización lo que origina resultados menores de lo esperado. Las interferencias espectrales son poco frecuentes debido a que las líneas de la fuente son extremadamente estrechas y específicas. [28] 2.1.1.2.

Espectrometría de Absorción Atómica con Cámara de Grafito (GFAAS) El espectrómetro de absorción atómica con cámara de grafito (GFAAS), también llamada con atomización electrotérmica, permite trabajar con muestras de volumen muy reducido (inferior a 100 µL) o directamente sobre muestras orgánicas líquidas. Habitualmente se analizan muestras de material biológico de origen clínico (sangre, suero, orina, biopsias hepáticas, etc.). Por su elevada sensibilidad (niveles de ppb), la técnica se aplica en la detección de metales en productos de alta pureza, como por ejemplo fármacos, alimentos (peces y carne) y productos industriales, y también en aguas de bebida y de acuíferos (determinación de la presencia de Cu, Cd, Pb, As, Hg, etc.). [38]. La espectrometría de absorción atómica por horno de grafito utiliza un tubo de grafito calentado mediante electricidad para vaporizar y atomizar el analito a temperaturas de hasta 3000 °C, antes de su detecció n. Se pueden analizar muestras de volúmenes de 10–50 µl. Como la totalidad de la muestra se atomiza en un volumen pequeño, se obtiene una alta densidad de átomos. Esto hace que este tipo de espectrometría sea sumamente sensible. Se han desarrollado métodos que permiten medir concentraciones por debajo de 0,1 µg/dl, sin embargo, en la práctica habitual el límite de detección es de alrededor de 1–2 µg/dl. [35]. Actualmente, la espectrometría de absorción atómica por horno de grafito es uno de los métodos más utilizados para determinar las concentraciones de metales pesados en alimentos.

2.1.1.3.

Espectrometría de Absorción Atómica con Generación de Hidruros (HGAAS)

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Es una Técnica monoelemental restrictiva a elementos refractarios, que presenta una alta sensibilidad, pero sujeta a interferencias químicas debidas a altas concentraciones de los metales de transición, aunque controlando la acidez del medio y la concentración del NaBH4, son dos factores que permiten reducir al mínimo dichas interferencias. [38] 2.1.1.4.

Espectrometría de Absorción Atómica con Vapor Frío (CV- AAS) Al igual que en la Espectrometría Atómica por Generación de Hidruros, se utiliza un agente reductor (borhidruro sódico o el más sensible cloruro estannoso) que consigue reducir las especies de mercurio a su estado elemental, el cual es volátil y es arrastrado por argón hasta la celda de medida. [38]

2.1.2. Espectrometría de Emisión Atómica La espectrometría de emisión es una técnica espectroscópica que analiza las longitudes de onda de los fotones emitidos por los átomos o moléculas durante su transición desde un estado excitado a un estado de inferior energía. Cada elemento emite un conjunto característico de longitudes de onda discretas en función de su estructura electrónica. Mediante la observación de estas longitudes de onda puede determinarse la composición elemental de la muestra. Hay muchas maneras en que los átomos pueden ser llevados a un estado excitado. El método más simple es calentar la muestra a una temperatura alta, produciéndose las excitaciones debido a las colisiones entre átomos de la muestra. Este método se utiliza en la espectrometría de emisión de llama. A pesar de que las líneas de emisión están causadas por una transición entre estados energéticos cuantizados, y pueden ser muy agudas a primera vista, tienen una anchura finita; es decir, se componen de más de una longitud de onda de luz. Esta ampliación de la línea espectral tiene muchas causas diferentes. La espectrometría de emisión suele llamarse a menudo espectrometría de emisión óptica, debido a la naturaleza de la luz que se emite. [17] La espectrometría de emisión atómica mide la luz emitida por un átomo excitado al pasar al estado fundamental, tenemos: Emisión Atómica con Llama (F-AES), Espectrometría atómica de emisión con Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICPAES). [28] 2.1.2.1.

Espectrometría de Emisión Atómica con Llama (F-AES)

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Presenta la ventaja que la llama actúa como fuente, no necesitando como los métodos de absorción una lámpara diferente para cada elemento. La calidad del monocromador no tiene que ser tan alta para alcanzar el mismo grado de selectividad, pero también sufre interferencias químicas semejantes. Resumiendo para estas técnicas estudiadas de Absorción y Emisión Atómica las principales interferencias son las químicas o de matriz. [28] 2.1.2.2.

Espectrometría Atómica de Emisión con Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-AES) Técnica con gran aceptación hoy en día, que está justificada por las características analíticas de la misma: Un gran número de elementos determinables (> 70) Una reproducibilidad de hasta 0,3% en los mejores casos Buena exactitud Técnica multielemental Pocos efectos de matriz o químicos Una dinámica lineal de concentración cubriendo varios órdenes de magnitud. El ICP tiene una excelente reputación con respecto a los efectos de matriz, particularmente cuando se compara con métodos alternativos como la Espectroscopía de Absorción Atómica (AAS). Sin embargo, los efectos de matriz pueden ser observados en ICP-AES, aunque usualmente la magnitud del efecto es baja. En el caso de soluciones, el concepto de matriz incluye no solo el (los) elemento (s) mayoritario (s), sino los reactivos tales como solventes ácidos u orgánicos, debido a que su naturaleza y concentración pueden influir en la intensidad de la señal del analito. También hay que tener en cuenta que según el nebulizador utilizado los efectos matriz pueden ser muy importantes, por ejemplo si se utiliza el nebulizador ultrasónico (para intentar llegar a los límites exigidos en Pb, Cd, en algunos alimentos) es muy sensible a los efectos matriz, y por eso a veces sólo se recomienda sobre todo para matrices no muy ácidas y limpias tipo aguas, aunque es cierto que si se trabaja con el patrón interno adecuado estos efectos sí se verían reducidos incluso con antorcha en vista axial y nebulizador ultrasónico. La Espectrometría Atómica de Emisión con Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-AES) presenta espectros de emisión complejos sujetos interferencias espectrales por lo que es importante tener equipos con una alta resolución. [28]. 19

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2.2.

ESPECTROMETRÍA DE INDUCTIVO (ICP-MS)

MASAS

CON

PLASMA

ACOPLAMIENTO

La espectrometría de masas con plasma inductivamente acoplado (del inglés Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) es conocida como ICP-MS. Esta técnica de análisis elemental e isotópico se ha venido imponiendo para las más diversas aplicaciones en las últimas dos décadas. Esto se debe principalmente a su capacidad de discriminar isótopos y a sus bajos límites de detección, que pueden llegar a ser inferiores a los 10-6 mg L-1. Dichos límites son mucho más bajos que los de otras técnicas analíticas más convencionales como fluorescencia de rayos x, espectrometría de emisión o absorción atómica, etc. Ver Fig. 03. [16]

Fuente: CYTED. 2009

Fig. 03. Rangos aproximados de los límites de detección en µg L-1

El ICP-MS permite por medio de la atomización de las muestras en un plasma, la determinación de metales mediante emisión atómica. El ICP-MS es de gran importancia en química analítica, por su gran sensibilidad, su capacidad para distinguir un elemento de otro en muestras complejas y la posibilidad de realizar análisis multielemental simultáneo, determinado estos análisis de hasta un nivel de partes por trillón (pg/g). Algunas aplicaciones incluyen la determinación de multivitamínicos, determinación de trazas de metales, detección y cuantificación de elementos traza en plantas y alimentos, análisis de multielementos en combustibles y lubricantes, entre otros. Además, ICP-MS ofrece alta especificidad a través de la interpretación de espectros y la información isotópica. Sin embargo, las interferencias poliatómicos que resultan de la combinación de los iones de la matriz con argón pueden afectar a esta técnica. Algunas de las interferencias pueden ser controladas o eliminadas mediante el uso de diferentes 20

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao técnicas de preparación de muestras, como la incineración o digestión de microondas antes de la determinación, mientras que otros tienen que ser controladas utilizando un enfoque matemático. [19] Con la Espectrometría de Masas medimos la relación masa/carga de los iones producidos en un Plasma Óptico de Acoplamiento Inductivo ICP-MS, tiene escasas interferencias de matriz, las cuales se pueden corregir con el uso de patrón interno. Además en este caso, la introducción de muestra suele ser menor que en los ICP-AES ya que habitualmente se trabaja con micronebulizadores, de forma que el efecto matriz es aún menor. Asimismo, los métodos de análisis que utilizan ICP-MS presentan también pocas interferencias espectrales por lo que es la técnica más libre de interferencias. [28] La ICP- MS ofrece una alta especificidad a través de la interpretación de espectros y la información isotópica. Según estudios donde participaron trece laboratorios, y probaron el método ICP-MS en siete productos alimenticios: puré de zanahoria, músculo de pescado, setas, harina de trigo, la dieta simulada, langostinos y polvo de mejillón. La concentración de cadmio elemental (materia seca) osciló entre 0,28 a 1,70 mg / kg. El estudio indicó que el método ICP-MS es satisfactoria para la determinación de cadmio en los alimentos. [19] El precio del dispositivo de espectrometría de masa con fuente de plasma de acoplamiento inductivo es elevado, pero su productividad es alta y, comparativamente, resulta económico cuando se necesita analizar numerosas muestras o elementos. [35].

2.3.

INTERFERENCIAS Los tipos de interferencias pueden ser: a) Interferencias físicas: Causadas por diferencias en las propiedades físicas de las soluciones como la viscosidad, tensión superficial o presión de vapor. b) Interferencias químicas: cualquier alteración en el número total de átomos

libres formados por unidad de volumen debido a la formación de compuestos químicos termoestables. Las causas más comunes de éstas son: Disociación incompleta de la molécula formada o formación de una sal difícil de fundir y reacción espontánea de los átomos libres con otros átomos o radicales presentes en el medio ambiente. c) Interferencias ionización: Debido a una excesiva ionización de los átomos, disminuye la población de átomos neutros y disminuye la sensibilidad.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao d) Interferencias espectrales: Las interferencias espectrales de línea ocurren cuando hay superposición de dos líneas atómicas o cuando estas no son resueltas por el monocromador. Las interferencias espectrales de banda se producen debido a la absorción de la radiación por moléculas o radicales, y por dispersión de la radiación por sólidos. En conclusión, las técnicas de Absorción y Emisión Atómica están sujetas preferentemente a interferencias de matriz, la Emisión Atómica con Plasma de Acoplamiento Inductivo presenta preferentemente interferencias espectrales y la Espectrometría de Masas con Plasma de Acoplamiento Inductivo es la técnica con menor número de interferencias. [28]

2.4.

PREPARACION DE LAS MUESTRAS La preparación de la muestra para el análisis de cadmio depende del tipo de matriz de los alimentos, así como el método de cuantificación. Las dos técnicas más utilizadas son la digestión húmeda con ácidos y la técnica de calcinación seguida de lixiviación, la técnica de digestión húmeda utiliza una combinación de ácidos altamente puros (nítrico, clorhídrico, sulfúrico) junto con oxidantes tales como peróxido de hidrógeno, para ayudar a la digestión, esta técnica es comúnmente usada en la preparación de la muestra. La digestión acida asistida por microondas se utiliza ampliamente, esta técnica permite el uso de la muestra grandes (1-2 g) bajo condiciones de temperatura y presión controladas, permite reducir la contaminación y evitar las pérdidas del elemento durante la mineralización. La incineración en seco y la técnica de lixiviación se utilizan en una medida limitada, debido a que la calcinación a temperaturas por encima de 400°C puede inducir pérdidas de cadmio. Otra técnica, que se utiliza con menor frecuencia, es la técnica de muestreo suspensión. Esto tiene algunas ventajas sobre la técnica de digestión ácida asistida por microondas, tal como el menor tiempo de preparación de la muestra, la seguridad y el costo. Sin embargo, esta técnica requiere la optimización de tamaño de partícula, concentración de la suspensión y la homogeneidad, esta técnica se puede utilizar en combinación con ETAAS. [19] Existen varias opciones para la preparación de la muestra que en muchos casos depende de la matriz y la técnica de medición empleada. Sin embargo para análisis de metales en alimentos son comunes los procesos de digestión húmeda y seca, en algunos casos acelerados por radiación de microondas. [29]

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao

2.5.

DESARROLLO DE LA TECNICA ANALITICA Durante el desarrollo de una técnica analítica es fundamental la determinación de las figuras de mérito relacionadas con la medición estos parámetros de confiabilidad describen los rangos y condiciones de trabajo de la técnica además de sus atributos y sus limitaciones. Por una parte los límites de detección y cuantificación están relacionados con la cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser detectada por el método, y con la concentración más baja que se puede determinar de otra forma reproducible, con criterios de exactitud y precisión establecidos. El límite de cuantificación se realiza mediante la preparación de un número estipulado de blancos a los cuales se realiza la cuantificación del analito de interés. La linealidad y la sensibilidad se establecen a partir de la curva de calibración y hacen referencia a la proporcionalidad que existe entre la concentración del analito y la señal del instrumento, y el factor de respuesta del instrumento como una función de la concentración, respectivamente. Normalmente, la sensibilidad se mide como la pendiente de la curva de calibración. [29]

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III. PROTOCOLO PARA LA DETERMINACION DE CADMIO EN GRANOS DE CACAO Y DERIVADOS 3.1.

OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN Esta guía establece el protocolo de análisis químico para la detección del nivel de cadmio en granos de cacao y derivados, mediante la técnica de Espectrometría de absorción atómica, de acuerdo a las normas y métodos oficiales de análisis de metales pesados en alimentos.

3.2.

FUNDAMENTO El presente protocolo para análisis químico del grano de cacao y derivados, se fundamenta en las sugerencias de expertos en aditivos alimentarios y normas oficiales, para la determinación de metales pesados en alimentos. Tal como se menciona a continuación. En la Guia Metodológica del grupo de trabajo regional para el establecimiento de limites máximos de cadmio en la almendra del cacao y productos del cacao1, sugieren como técnicas de elección para el análisis de Cadmio en Cacao y derivados: la espectrofotometría de absorción atómica electrotérmica (horno de grafito u horno Zeeman) - ETAAS y la espectrofotometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo ICP - MS. El INVIMA2 de la Republica de Colombia, considero como métodos de análisis la Espectrofotometría de Absorción Atómica con Horno de grafito, para la determinación de las concentraciones de cadmio en productos de cacao como Chocolate de mesa, chocolate de leche y licor de cacao, utilizando los Métodos oficiales de la AOAC Official Method 999.10, 999.11.

Comité Conjunto de Expertos FAO/OMS en Aditivos para los Alimentos (JECFA). Guía para la generación de datos requeridos para la realización de la “evaluación de la exposición al cadmio en el cacao y los productos del cacao” Ecuador-Colombia, Agosto 2013. 2 INVIMA. Instituto Nacional de Vigilancia de Alimentos y Medicamentos. Caracterización de las concentraciones de cadmio en derivados de cacao y otros alimentos y evaluación de la exposición dieta. Carrera 68 D N°17-11 Bogotá D.C. Colombia. www.invi ma.gov.co

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Así mismo según el Anexo 01. Tabla de Valoración de estudios sobre determinación de Cadmio en Cacao, encontramos que la mayoría de determinaciones de cadmio, fueron realizadas mediante la Técnica de Espectrometría de Absorción Atómica de llama, sin embargo cabe precisar que esta técnica posee límites de detección muy altos en comparación con la Espectrometría de Absorción Atómica con Horno de Grafito. Por lo tanto, para el presente protocolo de análisis se consideró la técnica analítica de Espectrofotometría de Absorción Atómica con Horno de grafito, así mismo se detallan las 3 formas más comunes de preparación de las muestras.

3.3.

3.4.

REFERENCIAS NORMATIVAS -

Reglamento CE N°333/2007. Por el que se establecen los métodos de muestreo y análisis para el control oficial de los niveles de plomo, cadmio, mercurio, estaño inorgánico, 3-MCPD y benzo(a)pireno en los productos alimenticios

NTP 208.030-2010. Productos de cacao. Determinación de plomo, cadmio, cobre, hierro y cinc.

CODEX STAN 228-2001. Métodos de Análisis Generales para los Contaminantes.

AOAC Official Method 999.10. Lead, Cadmium, Zinc, Copper and Iron in Foods. Atomic Absorption Spectrophotometry after Microwave digestion.

AOAC Official Method 999.11. Determination of Lead, Cadmium, Copper, Iron, and Zinc in Foods. Atomic Absorption Spectrophotometry after Dry Ashing.

Norma Oficial Mexicana NOM 117-SSA1-1994. Método de prueba para la determinación de Cadmio, Arsénico, Plomo, estaño, cobre, fierro, zinc y mercurio en alimentos, agua potable y agua purificada por espectrometría de absorción atómica.

DEFINICIONES Se aplicarán las siguientes definiciones en la toma de muestras de cacao y derivados:

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Lote: Cantidad identificable de alimento entregada de una sola vez y que presenta, a juicio del agente responsable, características comunes, (tales como el origen, la variedad, el tipo de envase, el envasador, el expedidor o el etiquetado). Sublote: Parte de un lote grande designada para aplicar en ella el método de muestreo; cada sublote deberá estar separado físicamente y ser identificable. Muestra elemental: Cantidad de material tomada en un único punto del lote o sublote. Muestra global: Agregación de todas las muestras elementales tomadas del lote o sublote, las muestras globales se considerarán representativas de los lotes o sublotes de los que se obtengan. Muestra de laboratorio: Muestra destinada al laboratorio. Muestreador: persona capacitada en materia de procedimientos de muestreo y autorizada para tomar muestras cuando sea necesario. Tamaño de la muestra: número de unidades, o cantidad de material, que constituye la muestra. Unidad: la parte discreta más pequeña de un lote que deberá extraerse para formar la totalidad o parte de una muestra primaria. Se aplicarán las siguientes definiciones en el tratamiento de las muestras y determinación de cadmio en cacao y derivados. Blanco de calibración del instrumento: es la solución del ácido usado como diluyente. Blanco de reactivos: es la solución que contiene todos los reactivos usados en los mismos volúmenes y concentraciones en el procesamiento de la muestra. Este blanco debe seguir los pasos de digestión y preparación de la muestra. Blanco de reactivos fortificado: es la solución que se prepara a partir de una alícuota del blanco de reactivos, añadiendo una alícuota de la solución estándar concentrada "solución madre", para dar una concentración final que produzca una absorbancia aceptable (aproximadamente 0,1) para el analito. El blanco de reactivos fortificado debe seguir el mismo esquema de digestión y preparación de la muestra. Espectrometría: es una rama de la espectroscopia relacionada con la medición de espectros.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Espectrometría de absorción atómica: es una rama del análisis instrumental en el cual un elemento es atomizado en forma tal que permite la observación, selección y medida de su espectro de absorción. Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito: es el método mediante el cual el elemento se determina por un espectrómetro de absorción atómica, usado en conjunto con un horno de grafito. El principio es esencialmente el mismo que en absorción atómica de aspiración directa en flama, excepto que se usa un horno en lugar de la flama para atomizar la muestra. Método de adiciones estándar: es el que implica la preparación de estándares en la matriz de la muestra, añadiendo cantidades conocidas de un estándar a una o más alícuotas de la muestra y que compensa los efectos de exaltación o depresión de la señal del analito, pero no corrige interferencias aditivas que causan una desviación de la línea de base y en la cual los resultados obtenidos son válidos si: -

La curva analítica es lineal. La forma química del analito es la misma que en la muestra. El efecto de interferencia es constante en el intervalo de trabajo. La señal se corrige por interferencia aditiva.

Muestra de control de calidad: es una muestra externa al laboratorio, que contiene una alícuota de concentración conocida del analito, cuyos valores de absorbancia deben estar comprendidos en el rango lineal del método. Muestra fortificada: es la muestra a la cual se le adiciona una alícuota de concentración conocida del analito, diluida en el ácido apropiado de tal forma que la solución resultante tenga una absorbancia de 0,1 aproximadamente. Símbolos y Abreviaturas Cd °C % cm g mg L ml µg nm N M v

Cadmio grados centígrados Por ciento centimetro gramo miligramo Litro mililitro microgramo nanómetro normal molar volumen 27

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao LDI LDM Ω MΩ

3.5.

límite de detección del instrumento límite de detección del método ohmio megaohmio

MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS

3.5.1. Equipos y materiales Para digestión por vía seca -

Balanza Analítica Pipetas y micropipetas Espectrofotómetro de absorción atómica: Provisto con un horno grafito para determinaciones electrotérmicas, con apropiada corrección de fondo (no atómica). Lámparas: Lámparas de descarga sin electrodo o con cátodo hueco para cadmio. Horno: Programable u horno mufla con termostato que mantenga 450°C ± 25°C: Si se utiliza el horno de mufla, se r equiere un dispositivo de precalcinación. Placa calentadora: Con control térmico, para calentar hasta alrededor de 300°C. Lámpara: IR 250W, fijada a un soporte de manera que permite ajustar la distancia a la placa calentadora. Placa cerámica: Por ejemplo, una placa desecadora sobre un soporte con un diámetro que se adecua a la placa calentadora. Cubierta de vidrio: Cristalizador de 185 mm de diámetro y 100 mm de altura, para colocar en la placa cerámica o equivalente. Botella de lavado: Depurador, conteniendo H2SO4 para la purificación de aire. Crisoles de cuarzo o platino: 50 ml – 75 ml. Botellas de poliestireno: Con cierres herméticos, 100 ml.

Para digestión acida asistida con microondas -

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao -

Vasos de digestión con teflón: De 100 mL, capaz de resistir una presión de al menos 1,4 MPa. horno de microondas. Diseñado para uso en laboratorio, por ejemplo, MDS-2000, CEM Corp., PO Box 200, Mattews, NC28106-2000, etc. Matraces aforados: de 25 y 1000 ml. Embudos: De vidrio o de plástico. Botellas de plástico: botellas de poliestireno con tapas que cierren herméticamente, de 50-100 ml. Horno de secado. O equipo de liofilización.

Para digestión por vía húmeda -

Balanza Analítica Pipetas y micropipetas Horno o Estufa de secado Mortero cerámico Placa de calentamiento Balón: 50 ml Fiola: 100 ml Matraces aforados: de 25 y 1000 ml. Embudos: De vidrio o de plástico.

3.5.2. Reactivos Todos los reactivos deben ser de al menos pureza analítica (p.a), preferiblemente ultrapura (Suprapuro) o equivalente. Para digestión por vía seca -

Agua: Redestilada o desionizada, resistividad ≥ 18 MΩ·cm Ácido clorhídrico: 6 M. Diluir 500 ml de HCl al 37% (w/w) con agua hasta 1 L. Ácido Nítrico: al 65 % (w/w) Ácido Nítrico: 0.1 M. Diluir 7 ml de HNO3 al 65% con agua desionizada a 1 L. Solución estándar de cadmio: 1 mg/ml. Disolver 1,000 mg de Cd en 14 ml de agua + 7 ml de HNO3, en una fiola de 1L. Diluir a volumen con agua. Solución estándar de trabajo: Diluir la solución estándar de cadmio con HNO3 al 0.1 M, a un rango de estándares que cubran el rango lineal del elemento a determinar.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Para digestión acida asistida con microondas -

Agua: Redestilada o desionizada, resistividad ≥ 18 MΩ·cm Ácido Nítrico: al 65 % (w/w) Ácido Nítrico: 0.1 M. Diluir 7 ml de HNO3 al 65% con agua desionizada a 1 L. Ácido Nítrico: 3 M. Diluir 200 ml de HNO3 al 65% con agua desionizada a 1 L Peróxido de hidrógeno: al 30% (w/w). Solución estándar de cadmio: 1 mg/ml. Disolver 1,000 mg Cd en 14 ml de agua + 7 ml de HNO3 al 65%, en un matraz aforado de 1 L y diluir a volumen con agua. Solución estándar de trabajo: Diluir la solución estándar de cadmio con HNO3 al 0.1 M, a un rango de estándares que cubran el rango lineal del elemento a determinar.

Para digestión por vía húmeda -

Agua: Redestilada o desionizada, resistividad ≥ 18 MΩ·cm Ácido Nítrico: al 65 % (w/w) Acido Perclórico: HClO4 concentrado. Solución estándar de cadmio: 1 mg/ml. Disolver 1,000 mg de Cd en 14 ml de agua + 7 ml de HNO3 al 65%, en un matraz aforado de 1 L y diluir a volumen con agua. Solución estándar de trabajo: Diluir la solución estándar de cadmio con HNO3 al 0.1 M, a un rango de estándares que cubran el rango lineal del elemento a determinar.

3.5.3. Procedimiento de lavado de materiales de vidrio y plástico -

Preparar una solución de ácido con 500 ml de HNO3 concentrado + 450 ml de agua desionizada.

Primero lavar todos los materiales de vidrio y plástico con agua y detergente, enjuagar con agua potable, seguido de un enjuague con agua desionizada, luego enjuagar con la solución de ácido diluido. Finalmente enjuagar 4 – 5 veces con agua desionizada.

Remojar los crisoles los crisoles de cuarzo en HNO3 al 20% y enjuagar con agua desionizada antes de usar. Cuando sea necesario, se deben llevar los crisoles a ebullición con HNO3 al 20% antes de usar. Calentar los crisoles de platino hasta que estén al rojo vivo y llevar a ebullición con HCl al 50 % (v/v) antes de usar.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao

3.6.

Llevar todos los materiales de vidrio y plástico a un área de secado, los materiales se deben escurrir y el secado debe ser por goteo, para ello los balones se deben almacenar boca abajo, pipetas y buretas en forma vertical.

Guardar en cuanto este seco para evitar contaminación por partículas en el aire.

PROTOCOLO DE MUESTREO DE GRANOS DE CACAO Y DERIVADOS Un correcto muestreo es una operación difícil que exige gran cuidado, es así que es necesario insistir en la necesidad de obtener una muestra representativa, un muestreo inexacto y sin cuidado puede conducir a errores en los resultados finales, es así que hemos usado como referencia el Reglamento CE N°333/2007 3 DE LA COMISIÓN, para confeccionar este protocolo de muestreo.

3.6.1. Procedimiento para la obtención de muestras de granos de cacao y derivados Teniendo en cuenta el plan de muestreo del Reglamento CE N°333/2007, para la obtención de las muestras de granos de cacao de los centros de acopio y los derivados de cacao de los almacenes de los centros de transformación agroindustrial, los lotes de gran tamaño se dividirán en sublotes, a condición de que estos puedan separarse físicamente. En el caso de productos que se comercialicen a granel como los granos de cacao, será de aplicación el Cuadro 1, del punto B.2. del Reglamento CE N°333/2007. La muestra global será de al menos 1 kg o 1 L, salvo cuando no sea posible, como ocurre, por ejemplo, cuando la muestra se compone de un envase o una unidad. El número mínimo de muestras elementales que deberán tomarse del lote o sublote será el indicado en el cuadro 3, del punto B.2. del Reglamento CE N°333/2007 . Las muestras elementales tendrán un peso análogo. El peso de una muestra elemental deberá ser de 100 g o 100 ml como mínimo, lo que dará como resultado una muestra global de al menos 1 kg o 1 L aproximadamente. En el caso de lotes o sublotes que estén conformados por envases individuales o unidades como en el caso de Pasta o Licor de cacao, Polvo de cacao y Chocolates, en el Cuadro 4, del punto B.2. del Reglamento CE N°333/2007, se

DO L 88/29 de 28.03.2007. Reglamento (CE) N° 333/20 07 de la Comisión, por el que se establecen los métodos de muestreo y análisis para el control oficial de los niveles de plomo, cadmio, mercurio, estaño inorgánico, 3-MCPD y benzo(a)pireno en los productos alimenticios.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao indica el número de envases o unidades que deberán tomarse para formar la muestra global. El requisito básico es obtener una muestra de laboratorio representativa y homogénea sin que se produzca una contaminación secundaria. El material de muestra recibido por el laboratorio deberá usarse en su totalidad para preparar la muestra de laboratorio. Toda muestra deberá colocarse en un recipiente limpio e inerte que ofrezca una protección adecuada contra la contaminación, contra la pérdida de analitos por adsorción en su pared interna y contra daños durante el transporte. Se tomarán todas las precauciones necesarias para evitar que se modifique la composición de la muestra durante el transporte o el almacenamiento. El analista velará por que las muestras no se contaminen al prepararlas. Siempre que sea posible, el instrumental y el equipo que entren en contacto con la muestra no deberán contener los metales objeto de la determinación y deberán estar hechos de materiales inertes, por ejemplo plásticos como el polipropileno, el politetrafluoroetileno (PTFE), etc. Además, deberán limpiarse con ácido para minimizar el riesgo de contaminación. Podrá utilizarse acero inoxidable de alta calidad para los instrumentos cortantes.

3.7.

PROTOCOLO DE TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DETERMINACIÓN DE CADMIO EN CACAO Y DERIVADOS

PARA

La muestra global (granos de cacao seco y fermentado, pasta o licor de cacao, polvo de cacao y chocolates), deberá triturarse finamente (cuando proceda) y mezclarse bien siguiendo un proceso con el que esté demostrado que se obtiene una completa homogeneización. Previamente los granos de cacao deben estar libres de la cascarilla, debiendo retirar las cascarillas con ayuda de un instrumento de acero inoxidable previamente tratado con ácido para evitar contaminación con metales. En el presente protocolo se está considerando 3 tipos de tratamientos que han sido utilizadas en algunas investigaciones y están recomendadas por la AOAC. 3.7.1. Método de digestión húmeda de la muestra Tomado de [33]4. 4

Mite, F. 2010. Avances del monitoreo de presencia de cadmio en almendras de cacao, suelos y aguas en Ecuador. INIAP (Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias) Estación Experimental Tropical Pichilingue.

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Triturar las muestras con la ayuda de un mortero cerámico para evitar contaminación con metales.

Pesar 0.5 g de muestra en un Becker de 100 ml, en seguida agregar una mezcla de HNO3 (8 ml) + HCLO4 (2 ml), tapar con una luna de reloj y someterla a mineralización nítrico-perclórica por una hora.

Colocar la mezcla en una placa calentadora a 180°C por 90 min hasta la digestión total. La digestión estará completa cuando aparezca el humo blanco y la formación de un líquido incoloro.

Filtrar el extracto en un balón de 50 ml y llevarlo a volumen con agua desionizada.

Realizar las lecturas respectivas en el espectrofotómetro de absorción atómica con horno de grafito.

3.7.2. Digestión acida con microondas (Según AOAC 999.10) Para productos con bajo contenido de grasa (≤40 %) -

Pesar 0,2 - 0,5 g de muestra seca en el envase de digestión, si se utilizan productos que contienen agua, el peso máximo se limita a 2 g, pero el contenido de materia seca no debe superar los 0,5 g. Por ejemplo, si el producto tiene un contenido de agua de 50%, tomar un máximo de 1 g (= 0,5 g materia seca). Si un producto tiene un contenido de agua de 95 %, tomar 2 g (< 0,5 g de materia seca).

Añadir 5 ml de HNO3 concentrado al 65%, y 2 ml de H2O2 al 30 %, cerrar los vasos herméticamente y someter a digestión en microondas, el perfil de la temperatura permitirá llegar a 180°C± 5 º C en men os de 5.5 min, y permanecerá a 180 ± 5 º C durante 9,5 minutos para la finalización de las reacciones específicas.

Dejar enfriar completamente los vasos de digestión antes de abrirlos, después el contenido del recipiente se puede filtrar, centrifugar, o se les permite que se asiente y luego se procede a decantar.

Transferir a un matraz aforado de 25 ml y enrasar con agua desionizada, luego transferir esta solución en un envase de polipropileno de 50 ml. Tratar los blancos de la misma forma.

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Si la solución requiere dilución por la alta concentración de metal, se diluirá con HNO3 3M, con el fin de mantener la concentración de ácido antes de la determinación de metales.

3.7.3. Digestión por vía seca (Según NTP 208.030 y AOAC 999.11) Llevar a ceniza los productos con un alto contenido de grasa (≥40 %), y hacerlo con mucho cuidado para evitar auto-ignición. -

E n un crisol, pesar 10 g – 20 g de la porción de ensayo, con una aproximación de 0.01 g.

Secar en un horno de secado, sobre un baño de agua, o sobre una placa de calentamiento a 100°C, si existe el riesgo de un ex ceso de ebullición en la calcinación. Proceder de acuerdo con el tipo de horno.

Calcinación en un horno programable: Colocar la capsula en un horno programable a la temperatura inicial no mayor a 100°C. Aumentar la temperatura hasta 450 °C a una velocidad máxima de 50°C/h. Dejar reposar la capsula durante por lo menos 8 horas o durante toda la noche.

Calcinación en un horno de mufla con termostato: Luego del secado y precalcinación (aparato de pre-calcinación de muestras), colocar el crisol con la porción de ensayo cubierto con tapa de vidrio sobre el producto. Previamente llevar a ceniza el producto incrementando la temperatura lentamente con lámpara infrarrojo (IR) por incremento gradual de temperatura sobre la placa cerámica hasta llegar al máximo. La temperatura final sobre la placa cerámica debe ser de 300 °C aproximadamente. El tiempo reque rido para precalcinación varia con el producto. Poner el crisol en el horno de mufla a 200°C – 250°C e incrementar lentamente la temperatura has ta 450°C a una velocidad no mayor de 50°C/h. Dejar reposar durante 8 horas o toda la noche. Sacar el crisol del horno y dejar enfriar.

Solución: Humedecer la ceniza con 1 ml – 3 ml de agua y evaporar en baño de agua o placa de calentamiento. Poner nuevamente el crisol en el horno a 200°C como máximo y levantar la temperatura (50°C/h – 100 °C/h) hasta 450°C. Proceder llevando a ceniza a 450°C por 1 hor a – 2 horas o más. Repetir el procedimiento hasta que el producto este completamente calcinado, la ceniza debe ser blanca/gris o ligeramente coloreada. El número de repeticiones necesarias varía dependiendo del tipo de producto.

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Adicionar 5 ml de HCl 6 M, al crisol asegurando que toda la ceniza entre en contacto con el ácido. Evaporar el ácido en un baño de agua o placa de calentamiento.

Disolver el residuo en 10 ml – 30 ml al 0.1 ml más cercano de HNO3 0.1 M. Agitar el crisol con cuidado para que toda la ceniza entre en contacto con el ácido. Tapar con una luna de reloj y dejar reposar por 1 -2 horas. Agitar bien la solución del crisol con una varilla de agitación y filtrar en un balón aforado de 100 ml, aforar a ese volumen con solución de ácido nítrico 1% y trasvasar el contenido en botellas de plásticas. [29]

3.8.

Incluir 2 blancos por cada lote analítico y leer en el equipo de espectrometría.

CALIBRACION DEL EQUIPO DE ESPECTROMETRIA DE ABSORCION ATOMICA POR HORNO DE GRAFITO

3.8.1. Calibración Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable. Se inicia la configuración operacional del instrumento y en el sistema de adquisición de datos. Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las lámparas de descarga sin electrodos. Se debe verificar la estabilidad del instrumento mediante el análisis de una solución estándar 20 veces más concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de cinco veces y calculando la desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%. El instrumento debe calibrarse para el analito a determinar usando el blanco de calibración y los estándares de calibración preparados a 3 o 4 niveles de concentración dentro del intervalo dinámico de concentración del analito. Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibración. Introducir los estándares de calibración del analito de menor a mayor concentración y registrar al menos tres réplicas de la absorbancia de cada uno. Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima contra concentración del analito. La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste sobre los datos de concentración respuesta es aceptada.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica. [34].

3.8.2. Operación del Instrumento Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC, el análisis debe interrumpirse y buscar la posible causa de error, el instrumento se debe recalibrar y verificar la nueva calibración. Para verificar que el instrumento no presenta deriva, por cada 10 análisis se debe analizar el blanco de calibración. Si el valor verdadero del analito difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse. Si la matriz de la muestra es responsable de la deriva o afecta la respuesta del analito puede ser necesario trabajar por adiciones estándar. La demostración de la operatividad inicial del instrumento se hace estableciendo los límites de detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de calibración lineal. Para determinar el LDM se usa un blanco de reactivos fortificado con una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de lectura de absorbancia del blanco de reactivos fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo a: LDM= t x s t= valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación estándar estimada para n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas. s= desviación estándar de las réplicas del análisis. El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de diferente concentración, uno de los cuales debe estar próximo al límite superior del intervalo lineal. [34]. Para la determinación de cadmio en el equipo, ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la determinación del analito, de acuerdo a las recomendaciones del manual del instrumento. El programa de temperaturas para el horno de grafito puede variar dependiendo de la matriz de la muestra. En el caso de existir interferencias no específicas (absorción molecular o dispersión de la luz), se recomienda consultar la

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao bibliografía existente en cuanto a los métodos disponibles para eliminarlas, así como en el caso de interferencias de matriz. [34].

3.9.

DETERMINACIÓN DE CADMIO POR ESPECTROFOTOMETRÍA ABSORCIÓN ATÓMICA CON HORNO DE GRAFITO

Para la determinación de cadmio, las muestras se depositan en un tubo de grafito pequeña, que puede ser calentado para vaporizar y atomizar el analito. La mayoría de GFAAS disponibles en la actualidad están totalmente controlados desde un equipo personal que tiene un software compatible con Windows. Las muestras acuosas deben ser acidificadas (normalmente con ácido nítrico, HNO3 a un pH de 2.0 o menos. La decoloración en una muestra puede indicar que los metales están presentes en la muestra, por ejemplo, un color verdoso puede indicar un alto contenido de níquel, o un color azulado puede indicar un alto contenido de cobre. Una buena regla a seguir es analizar clara (relativamente diluida) las primeras muestras, a continuación, analizar de color (relativamente concentrada) muestras. En el Cuadro 03, se encuentran los parámetros instrumentales para espectrofotometría de absorción atómica con horno de grafito para un equipo Perkin Elmer HGA-500. Para otros instrumentos es muy probable que se tengan que cambiar los parámetros de acuerdo al manual proporcionado con el instrumento.

Cuadro 03. Ejemplo de parámetros instrumentales para la espectrometría de absorción atómica con horno de grafito. Programa de temperaturas Metal

Longitud de Onda, nm

228.8

Paso 1

Paso 2

Paso 3

Paso 4

30 s, T°= 130°C

350 5 10

1200 0 2

2500 2 2

Volumen de solución de prueba, µl 10

Tubo grafito

Sin recubrimiento

Fuente: NTP 208.030-2010

La absorbancia de las muestras se lee directamente a una longitud de onda de 228.8 nm. A partir del patrón certificado de 1000mg/L de Cadmio. Realizar las curvas de calibración de 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0, 1.3, 1.5, 1.8 mg/L. de acuerdo al requerimiento del analista. 37

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3.9.1. Desarrollo de la Técnica Analítica En este punto se detalla el procedimiento usado para el cálculo de las principales figuras de mérito a utilizarse como criterio de confianza en la implementación de las metodologías de medición. Con la técnica de horno de grafito, debe usarse siempre el método de adición. Cuando se utiliza el método de adición, las mediciones se deben hacer dentro del rango lineal. Las mediciones se realizan de preferencia con el área de pico más que con la altura de pico. 3.9.2. Curvas de calibración para Cadmio Tomar 5 ml de un patrón de cadmio 1000 mg/L, colocar en un balón aforado de 500 ml, y aforar con HNO3 al 1%. Esta solución de 10 mg/L de cadmio será rotulado como “solución madre”. De la solución madre se tomaran alícuotas de 1, 2, 3, 5, 7, 10, 13 y 15 ml que serán aforados a 100 ml con agua destilada en HNO3 al 1% para preparar patrones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.3, y 1.5 mg/L de cadmio, respectivamente. Preparar un blanco que contenga agua destilada en HNO3 al 1%. La curva de calibración será leída cada vez que se analicen las muestras y patrones. [29]. 3.9.3. Cálculos y evaluación de los resultados Límite de detección: Calcular el límite de detección, LD para cadmio como sigue a continuación. LD = 3 x desviación estándar del promedio de las determinaciones del blanco (n ≥ 20). Calcular la concentración C, del metal en la muestra de ensayo de acuerdo con la siguiente formula:

C = (a-b) x V m

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao Donde: C= Concentración de la muestra de ensayo (mg/Kg) a= Concentración en las soluciones de ensayo (mg/L) b= Concentración promedio en las soluciones del blanco (mg/L) V= Volumen de la solución de ensayo (ml) m= Peso de la porción de ensayo (g)

Si (a – b) es menor que el LD, entonces se sustituye (a – b) por el LD para calcular el límite de detección en la porción de ensayo. Si la porción de prueba se ha diluido, entonces se tiene que tomar en cuenta el factor de la dilución. Cuando se corren los duplicados, el promedio de los resultados se debe dar con 2 cifras significativas. [25] 3.9.4.

Informe de ensayo: Los resultados se informaran en mg/kg o µg/kg de Cadmio. [25]

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IV. SUGERENCIAS Realizar pruebas de laboratorio, aplicando los distintos tratamientos a las muestras de cacao y derivados, con el fin de conocer cuál de ellas tiene menos interferencias y no tenga pérdidas de analitos durante el tratamiento. Para la validación de un método analítico de determinación de Cadmio en cacao, se debe realizar ensayos en laboratorios certificados utilizando las diferentes técnicas analíticas y evaluar las ventajas y desventajas de cada una de ellas, así como el costo de los análisis. Ampliar la presente guía, con la formulación de protocolos para la determinación de cadmio en insumos agrícolas, suelos, agua y tejidos de la planta del cacao. Realizar estudios minuciosos sobre la presencia de cadmio en cacao en las diferentes zonas productoras de cacao, con el fin de contrarrestar y evitar la contaminación del producto final.

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V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición. (AESAN). 2013. Cadmio. Consultado 05 nov. 2013 (en línea). Disponible en Página Web: http://www.aesan.msc.es/AESAN/web/cadena_alimentaria/subdetalle/qui_metales pesados.shtml 2. Agrodataperu. 2013. Exportaciones de cacao en grano 2012. Consultado 05 nov. 2013. Disponible en Página Web: http://www.agrodataperu.com/category/cacao-grano-exportacion 3. Alimentación sana. 2013. Metales Pesados en Alimentos. Consultado 27 oct. 2013 (En línea). Disponible en página Web: http://www.alimentacionsana.org/PortalNuevo/actualizaciones/metalesalimentos.ht m 4. Alonzo, D.2011.Metales pesados. Revisión Septiembre 2011. Secretaria de Estado de Turismo y Comercio. CATICE de Gandía. 5. Association of Official Analytical Chemists. (AOAC INTERNATIONAL). 2002. Method 999.10. Lead, Cadmium, Zinc, Copper and Iron in Foods. Atomic Absorption Spectrophotometry after Microwave digestion. 6. Association of Official Analytical Chemists. (AOAC INTERNATIONAL). 2002. Method 999.11. Determination of Lead, Cadmium, Copper, Iron, and Zinc in Foods. Atomic Absorption Spectrophotometry after Dry Ashing. 7. Adams, M. y Carrasquero, A. (2012). Determinación de los procesos asociados a la contaminacion con cadmio en cacao en Ocumare de la Costa, Estado de Aragua. Postgrado en ciencias del suelo. Fac. de Agronomia – UCV. Apartado 1017. Las acacias, Maracay, Venezuela. 8. Centro de Innovación Tecnológica del Cacao. (CITE CACAO - USAID PDA). 2011. Estudio “Contenido de Cadmio y Plomo en la Producción de Cacao en San Martín”. Consultores: Huamani, H y Huauya, M. Tarapoto, San Martin, Perú. 9. Codex Stan 228-2001. 2001. Métodos de Análisis Generales para los contaminantes. 10. Comisión Europea. 2007. Reglamento CE N°333/200 7. Por el que se establecen los métodos de muestreo y análisis para el control oficial de los niveles de plomo, cadmio, mercurio, estaño inorgánico, 3-MCPD y benzo(a)pireno en los productos alimenticios. Fecha pub. 29.3.2007. Diario Oficial de la Unión Europea L 88. P. 2938.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao 11. Comisión Europea. 2006. Reglamento CE N°1881/20 06, Por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios. Fecha pub. 20.12.2006. Diario Oficial de la Unión Europea L 364. P. 5. 12. Comisión Europea. (2013). Amending Regulation (EC) N° 1881/2006 as regards maximum levels of cadmium in foodstuffs. SANCO/10617/2009.rev.09.Brussels 13. Cooperativa Agraria Cafetalera la Divisoria. 2010. Resultados de análisis de cadmio en suelos y tejidos de cacao de la Divisoria. Laboratorio de suelos de la Universidad Nacional Agraria la Selva UNAS-Tingo María, Huánuco, Perú. 14. Cooperativa Agraria Industrial Naranjillo. (COOPAIN LTDA). 2011. Informe de evaluación preliminar de cadmio en suelos tropicales y almendras de cacao en la influencia de la COOPAIN. Tingo María, Huánuco, Perú. 15. Crozier, J. 2012. Heavy Metals in Cocoa. International workshop on possible EU regulations on cadmium in cocoa and chocolate products. Nature and Food Quality Quality in the Netherlands (LNV), the European Cocoa Association (ECA) & CAOBISCO. E-mail: j.crozier@cabi.org, Página Web: www.cabi.org. 16. Ciencia y Tecnología para el Desarrollo, (CYTED). 2009. Metodologías analíticas para la determinación y especiación de Arsénico en aguas y suelo. Argentina 17. Espectrometria.com. 2013. Espectrometría, consultado 11 de Nov. 2013 (en línea), Disponible en Pagina web: http://www.espectrometria.com/espectrometra_de_absorcin_atmica 18. FAO/OMS Comité Conjunto de Expertos en aditivos para los alimentos (JECFA). 2013. Guía para la generación de datos requeridos para la realización de la “evaluación de la exposición al cadmio en el cacao y los productos del cacao”. Quito, Ecuador, 12-15 de agosto de 2013. 19. FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, (JECFA). 2011. Safety evaluation of certain food additives and contaminants. Who Food Additives Series: 64. 20. Fundación Hondureña de Investigación Agrícola, FHIA. 2011. Cacao y Agroforestería Informe Técnico 2011. Honduras. 21. Gieco, L. y Maté, C. 2003. “Cadmio un toxico encubierto”. Licenciatura en Gestión Ambiental, materia Toxicología Ambiental, U. CAECE. 22. Huamani, H. et all. 2012. Presencia de Metales Pesados en el Cultivo de Cacao Orgánico. Universidad Nacional Agraria de la Selva, UNAS, Tingo María, Huánuco, Perú. 23. Instituto de Cultivos Tropicales & Programa de Desarrollo Rural Sostenible. (ICT/GTZ). 2008. Monitoreo de la presencia de cadmio en almendras de cacao, suelos y aguas en San Martin y Amazonas. Tarapoto, San Martin, Perú. 24. Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura (IICA). 2013. Evolución del tema de cadmio en cacao en la OMC y el CODEX. Bolaños Ledezma, Erick. Programa SAIA-IICA-Sede Central. 25. INDECOPI. (2010) NTP. 208.030.2010. Productos de Cacao. Determinación de plomo, cadmio, cobre, hierro y cinc. 2aEdicion. Lima Perú. 26. Instituto Nacional para la Vigilancia de Alimentos y Medicamentos (INVIMA). 2013. Caracterización de las concentraciones de cadmio en derivados de cacao y otros alimentos y evaluación de la exposición dieta. Colombia. 42

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao 27. La Republica. 2013. Economía, F. pub. 06 jul. 2013, Consultado 11 nov. 2013. (en línea), Disponible en Pagina Web: http://www.larepublica.pe/06-07-2013/losenvios-de-cacao-peruano-al-exterior-crecerian-hasta-20-durante-este-ano 28. Laboratorio Nacional de Referencia para la Determinación de Residuos Químicos. 2012. Análisis de Elementos para categorías de ensayo NT-18. Mediante técnicas de espectrometría atómica o espectrometría de masas. España. 29. Martínez, G., & Palacio, C. 2010. Tesis: Determinación de metales pesados cadmio y plomo en suelos y granos de cacao frescos y fermentados mediante espectroscopia de absorción atómica de llama. Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia. 30. Ministerio de Agricultura - Dirección General de Competitividad Agraria. 2012. Cacao Perú. Lima, Perú. 31. Ministerio de Comercio Exterior de Ecuador. 2013. F. Pub. 25 set. 2013. Consultado 12 Nov. 2013, (en línea). Disponible en página web: http://comercioexterior.gob.ec/la-union-europea-aprueba-niveles-maximosderesi duos-nm-para-el-cadmio-en-productos-elaborados-con-cacao/ 32. Ministerio de Comercio Exterior y Turismo. 2007. “Diagnóstico y propuesta de parámetros para la estandarización y homogenización del tratamiento pos cosecha de cacao” (Vol. 3). Perú. 33. Mite, F., Carrillo, M., & Durango, W. 2010. Avances del monitoreo de presencia de cadmio en las almendras de cacao, suelos y aguas en Ecuador. Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP). Estación Tropical Pichilingue. Departamento Nacional de Manejo de Suelos y Aguas. E-mail: fmitev@gye.satnet.net, Ecuador. 34. Norma Oficial Mexicana NOM 117-SSA 1-1994. 1994. Método de Prueba para la determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, etc. en alimentos, agua potable y agua purificada por espectrometría de absorción atómica. México. 35. Organización Mundial de la Salud. (OMS). 2013. Guía breve de métodos analíticos para determinar las concentraciones de plomo en la sangre. Ginebra 27, Suiza. 36. Sifuentes, Cesar. 2013. Comida Peruana, el cacao peruano, Consultado 27 oct. 2013 (en línea), Disponible en Pagina Web: http://comidaperuana.about.com/od/Ingredientes/a/El-Cacao-Peruano.htm 37. Takrama, J., & Ofori, K. 2012. Cadmium in Ghana Soils, Cocoa and Cocoa Products. Ghana. 38. UMA, Servicio de Espectrometría Atómica. 2013. Espectrometría de Absorción Atómica. Consultado 30 nov. 2013 (en línea), Disponible en Pagina Web: http://www.uma.es/investigadores/servinv/labea/tec_analiticas/tec_analiticas.html

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VI. ANEXOS ANEXO 1. Tabla de Valoración de Estudios sobre Cadmio en Cacao ANEXO 2. Requisitos de acceso para cacao orgánico al mercado de Holanda ANEXO 3. Reglamento CE N°1881/2006 ANEXO 4. Enmienda al Reglamento CE N°1881/2006 ANEXO 5. Reglamento CE N°333/2007 ANEXO 6. AOAC 999.10 Official Method. ANEXO 7. AOAC 999.11Official Method. ANEXO 8. NTP 208.030-2010. ANEXO 9. CODEX STAN 228-2001. ANEXO 10. Norma Oficial Mexicana NOM 117-SSA1-1994. ANEXO 11. Cotización de análisis de metales pesados en cacao por ICP MS. Lab. ANDES CONTROL OTROS ANEXOS.

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao ANEXO 1. Tabla de Valoración sobre estudios de cadmio en cacao

FECHA

NOMBRE DE ESTUDIO

AUTOR

LUGAR/AMBITO

TIPO DE MUESTRAS

2007

Diagnostico y propuesta de Ministerio de Comercio parametros para la Exterior y Turismo estandarizacion y (MINCETUR) homogenizacion del tratamiento poscosecha de cacao

2008

Monitoreo de la Presencia de Cadmio en Alamendras de Cacao, Suelos y Aguas en San Martin y Amazonas

INSTITUTO DE CULTIVOS San Martin-Bagua-La TROPICALES / ICT Peca y Copallin en la & Region Amazonas PROGRAMA DESARROLLO RURAL SOSTENIBLE /GTZ

1. Determinar las áreas con presencia de cadmio en los sistemas de cultivo de cacao en estas regiones. 2. Determinar las concentraciones de Cadmio en cacao comercial en las principales zonas cacaoteras de ambas regiones.

2010

Resultados de Analisis de suelos realizado en la Universidad Nacional Agraria La Selva UNASTingo Maria Informe de Evaluacion Preliminar de Cadmio en suelos tropicales y almendras de cacao en la influencia de la COOPAIN

COOPERATIVA AGRARIA CAFETALERA LA DIVISORIA LTDA.

Huanuco-Leoncio Prado-La Divisoria

Determinacion del 1. Suelo contenido de Cd. En los 4. Tejidos de la planta de suelos y tejidos de cacao cacao en la Divisoria.

COOPERATIVA AGRARIA INDUSTRIAL NARANJILLO LTDA.

Distritos de las Determinar la 3. Granos fermentados y regiones de Huanuco y Concentración de cadmio secos de acopio San Martin en almendras de Cacao, suelos y roca fosforica

2011

Contenido de Cadmio y CITE CACAO-USAID Plomo en la Producción de PDA/TECHNOSERVE Cacao en San Martín

2011

Tesis: Presencia de metales pesados en el cultivo de cacao organico

Huamani Yupanqui, Hugo Alfredo

1. Ayacucho-San Fco VRAE 2.Cuzco-Quillabamba 3. Junin-Satipo 4. Huanuco-Tingo 5. Tumbes-Zarumilla 6. Piura-San Juan de Bigote 7. Amazonas-Bagua Chica-La Peca 8. San Martin-TarapotoJuanjui

OBJETIVO

• Elaborar un diagnostico 3. Granos fermentados y respecto a los secos de acopio tratamientos poscosecha de cacao. • Determinacion de cadmio en almendras de cacao en el laboratorio SGS FRESENIUS GMBH en Alemania

San Martin (Provincias) Determinar la correlación entre el contenido de cadmio y plomo extraíble del suelo con el contenido de cadmio y plomo total en las almendras del cacao. Ucayali y Huanuco Evaluacion de los contenidos de cadmio y plomo en suelos y hojas de cacao

RESULTADOS Contenido de cadmio en mg/Kg en almendras de cacao 1. 0.64 2. 0.085 3. 0.37 4. 1.2 5. 0.75 6. 1.2 7. 0.24 8. 0.32 Promedio Total 0.60 mg/Kg

1. Suelo Cadmio en suelo; tenores de 2.Granos frescos de 0.02 a 0.46 ppm. cacao Cadmio en Grano Fresco; 3. Granos fermentados y Rango de 0.10-2.97 ppm. secos de acopio Cadmio en Grano de Acopio; de 8. Agua 0.10-2.29 ppm.

1. Suelo 3. Granos cacao

Cadmio en suelos: de 0.37 ppm 1.52 ppm Cadmio en Hojas y tallos: de 0.17 - 0.33 ppm Almendra de cacao: de 0.04 4.11 mg/Kg Cd. Suelo: de 0.089 -3.028 mg/Kg Cd. Roca Fosforica: 12.782 ppm

Cadmio en Almendras frescas frescos de de cacao: 1.33 ppm Cadmio en Suelo: 0.110 ppm

Cd suelo: 0.53 ppm 1. Suelo 4. Tejidos de la planta de Cd Hojas Cacao: 0.21 ppm cacao

TECNICA Y/O METODO DE ANALISIS 3

LABORATORIO (Laboratorio SGS FRESENIUS GMBH en Alemania)

(Laboratorio del ICTTarapoto)

(Laboratorio de suelos UNAS)

Almendra de cacao: 1 En suelo y Roca Fosforica: 5

(Laboratorio CERPER)

Guía de Métodos de Detección y Análisis de Cadmio en Cacao 2010

2010

2012

Tesis: Determinacion de Martinez, Genny metales pesados cadmio y plomo en suelos y granos de cacao frescos y fermentados, mediante espectroscopia de absorcion atomica de llama Avances del monitoreo de Mite, Francisco presencia de cadmio en almendras, suelos y aguas en el Ecuador

Colombia-Santander- Determinar el contenido San Vicente de Cuchuri de cadmio en muestras de cacao y suelos

1. Suelo 3.Granos cacao

Ecuador

Identificar las áreas y los niveles de contaminación por cadmio en los diferentes sistemas de cultivo de cacao en el Ecuador.

1. Suelo 2. Grano fresco de cacao 4. Tejidos de la planta de cacao 5. Cascara 6. Testa o cascarilla 8. Agua

Metales pesados en cacao

Crozier, J.

Peru y Venezuela

Establecer el nivel de 1. Suelo Cd en Almendras Peru: 0.03 metales pesados en los 3. Granos fermentados y 2.51 mg/Kg granos de cacao de Perú secos de acopio Cd en Almendras Venezuela: y Venezuela, 0.03 - 3.52 mg/Kg especialmente el cadmio, el plomo y el aluminio.

Determinacion de los procesos asociados a la contaminacion con cadmio en Cacao Cadmio en suelos, cacao y productos de cacao en Ghana

Adams M, Carrasquero A.

Venzuela- Ocumare de Cuantificar los niveles de la Costa cadmio en el sistema geoquimico de las plantaciones de cacao Ghana Determinacion de cadmio en suelos, cacao y productos de cacao en Ghana

Takrama Jemmy, K. Ofori Frimpong - Cocoa Research Institute

Tipos de muestras

Técnicas y/o método de Análisis

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Suelo Granos Frescos de Cacao Granos Fermentados y secos de acopio Tejidos de la planta Cascara Testa o cascarilla Derivados de cacao (Chocolate, polvo de cacao) Agua

2. 3. 4. 5.

frescos

Cd suelo: 0.33 - 6.0 mg/Kg de Cd Almendra: 4.0 - 7.0 mg/Kg

Cd en Cascara: 1.01 mg/Kg Cd en Hojas: 1.52 mg/Kg Cd en Maguey: 0.67 mg/Kg Cd en Almendras: 0.84 mg/Kg Cd en Testa: 1.51 mg/Kg Cd en Agua: 0.31 µl/L

(Laboratorio de la Universidad Industrial de Santander)

(INIAP-Estacion experimental Pichilingue)

Almendras: 4 Suelos: 3 y 4

1. Suelo Cd suelo: Menor a 0.1 ppm 2. Grano fresco de cacao Cd en Almendra: no supera los 0.05 ppm

1. Suelo 3. Grano fermentado y seco de cacao 6. Testa o cascarilla 7. Derivados de cacao

Cd en almendra: 0.269 ppm Cd en cascarilla: 0.309 ppm Cd en Polvo de cacao: 0.250 ppm Cd en chocolate sin azucar: 0.10 ppm Cd en chocolate: 0.150 ppm

(Laboratorio - Cocoa Research Institute of Ghana)

Espectrometria de absorcion atomica (sin especificar) Espectrometria de absorcion atomica de llama Espectrometria de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) Espectrometria de emision optica con plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) ICP sin especificar