Mg. T.M. Robert Caballero B. Docente
DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO:
COLORACIONES
FINALIDAD • Proporcionar resultados preliminares con objetivo clínico • Medida de control de calidad • Diagnóstico (Ziehl Neelsen)
MUESTRA • Muestra representativa • Evitar la contaminación con la microflora propia de la piel y membranas mucosas • Transporte inmediato al Laboratorio para su proceso • Medios de transporte adecuados • Importante para la efectividad del Laboratorio
FROTIS • Preparar evitando deformaciones de los microorganismos • Frotis en lámina limpia (nueva) • Frotis delgado • Tiempo de secado adecuado • Fijarse a calor suave
GENERALIDADES • Se necesita 105 microorganismos/ml para encontrar 1/C con microscopio de inmersión • La concentración de microorganismos pueden incrementar 10 a 100 veces • Muestras mucoides, pueden requerir digestión por un agente mucolítico • Cantidad relativa de leucocitos y células de descamación confirman la calidad del especimen
COLORACION GRAM • Diseñado por el microbiólogo Danés Hans Christian Gram en 1884. • Procedimiento más usado en microbiología • Técnica basada en las propiedades fisiológicas de la pared celular
Diferencia entre Gram + y gramBACTERIAS GRAM POSITIVAS • La pared celular gruesa: peptidoglicano, ac. Teicoico • P.C. en contacto directo con la membrana citoplasmatica • No posee membrana externa.
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS • Pared celular delgada: peptidoglicano • P.C. no esta en contacto directo con la membrana celular • La membrana externa compuesta de una capa doble de fosfolipidos (LPS).
ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS
REACTIVOS • CRISTAL VIOLETA – 2 gr de violeta de metilo +100 ml de alcohol etílico + 100 ml alcohol metílico – 4 gr de oxalato de amonio +200 ml de agua destilada – Se juntan las dos soluciones + 200 ml de agua destilada – Reposar 24 hs, luego se filtra y se guarda en frasco oscuro
• LUGOL – 4.5 gr de iodato de potasio + 450 ml de agua destilada – 3gr de yodo metálico – Para uso: 2ml de lugol + 38 ml de agua destilada
REACTIVOS • ALCOHOL ABSOLUTO 95% • SAFRANINA – 2.5 GR DE SAFRANINA + 500 ML DE AGUA DESTILADA – Guardar en frasco oscuro
TECNICA •
Paso I: Preparar el FROTIS, dejar secar
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Paso II: Aplicar coloración primaria (cristal violeta) por 1min, luego lavar para eliminar el exceso de colorante
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Paso III: Aplicar el agente fijante (solución yodada) por un minuto
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Paso IV: Lavado
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Paso V: Decoloración con alcohol acetona durante 10 segundos, repetir procedimiento si fuera necesario
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Paso VI: Lavar con agua para remover el exceso de alcohol
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Paso VII: Cubrir el portaobjeto con la sustancia de contraste (safranina) por 30 seg.
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Paso VIII: Lavar, secar y observar.
FUNDAMENTO Colorante primario + fijador = complejo violeta-yodo insoluble en el citoplasma de las bacterias
GRAM POSITIVOS: Solvente produce contracción de los poros del peptidoglicano, impermeable al complejo. GRAM NEGATIVOS: El solvente disuelve la porción lipídica y el complejo cristal violeta-yodo es removido, decolorando las células.
RESULTADOS
RESULTADOS • “Gram-negativos falsos”: si la bacteria gram-positiva es vieja, dañada o si la pared celular no esta intacta, decoloración prolongada • “Gram-positivo falso”: no existe, pero puede ocurrir si el paso de decoloración es omitido accidentalmente. • Uso de colorantes con precipitados que pueden dar falsos positivos
SENSIBILIDAD La sensibilidad de la coloración GRAM varía con el tipo de muestra: • LCR: 60 – 90% de sensibilidad • En Líquido pleural y pericardico de 50 a 70% • Líquido peritoneal: 25 – 50 % ( peritonitis expontanea) • Líquido sinovial: La sensibilidad varía según la etiología • 75% para stafilococo • <25% gonococo • 50% para los gram negativos
COLORACION ZIEHL NEELSEN • Se emplea para detectar la presencia de BAAR (Bacilos Acido-Alcohol Resistentes) • La pared celular de los BAAR: - Su estructura básica es característica de las bacterias gram positivas - Compleja y rica en lípidos
MICOBACTERIUM Los BAAR poseen una pared celular rica en lípidos y ácidos carboxílicos (ácido micólico)
RECOMENDACIONES EN EL MANEJO DE MUESTRAS • ESPUTO: – La calidad de muestra es determinada por el número de células epiteliales y el número de leucocitos – Se necesita 10 BAAR/ml de esputo para poder observar al microscopio – Es necesario 3 muestras de 5-10 ml – Esputos hemoptoicos interfieren el diagnóstico
• ASPIRADOS BRONQUIALES: – Procesar inmediatamente
• ORINA: Primera de la mañana en tres días sucesivos por la discontinuidad en la eliminación del BARR. No recomendable el sondaje, ni la orina obtenida durante 24 horas.
RECOMENDACIONES EN EL MANEJO DE LAS MUESTRAS • JUGO GÁSTRICO: – Procesarse antes de 4 horas después de su obtención, si esto no es posible debe neutralizarse con carbonato sódico. – Especialmente para niños
• HECES Principalmente útiles en casos de SIDA para el diagnóstico de presencia de M. avium • LÍQUIDOS ORGÁNICOS En los líquidos orgánicos como LCR, L. pleural, L. peritoneal o L. pericárdico, es importante la mayor cantidad posible de muestra (concentración)
REACTIVOS • CARBOL FUCSINA: – – – –
3 gr de fucsina básica +10 ml de alcohol etílico 95% 5 ml de fenol fundido 95 ml de agua destilada Juntar ambas soluciones y dejar reposar
• AZUL DE METILENO • ALCOHOL ACIDO
TECNICA: Coloraciรณn en caliente Paso I: Se aplica el colorante primario sobre la muestra y se deja reposar.
TECNICA: Coloración en caliente Paso II: Se emplea la llama de un mechero para calentar la muestra hasta la aparición de vapores blancos
Se forma el complejo colorante – pared (fucsina soluble en los lípidos) Calor ; mordiente
TECNICA: Coloraciรณn en caliente Paso III: Se lava con agua corriente
TECNICA: Coloraciรณn en caliente Paso V: Se aplica el colorante secundario, se deja reposar y se lava con agua
Colorante de contraste: Azul de metileno
FUNDAMENTO Se forma el complejo colorante â&#x20AC;&#x201C; pared (fucsina soluble en los lĂpidos) Calor ; mordiente
Colorante de contraste: Azul de metileno
INFORME DEL RESULTADO METODO DE CDC BAAR 0
INFORME CDC Negativo
1-2/300 C Número observado (+_) 1-9/100 C Número medio/100C (+) 1-9/10 C Número medio/10C (2+) 1-9/ C
Número medio/C (3+)
>9/ C
> 9/C (4+)
RESULTADOS • Resultados erróneos: Por errores en la técnica durante cualquiera de los pasos: frotis → coloración → paso de la llama (mordiente) → secado y observación. Extendido muy grueso. Orden incorrecto de aplicación de los colorantes. Cantidad insuficiente de colorante sobre la muestra. Tiempo de contacto insuficiente, entre el colorante y la muestra. – Exposición a la llama durante poco tiempo (no se forma el complejo) o mucho tiempo (carbonización celular). – Cantidad insuficiente de decolorante, no se retira el exceso de colorante primario de la muestra. – – – –
SENSIBILIDAD • La sensibilidad varía de acuerdo al tipo de muestra • La baciloscopia tiene una sensibilidad de 20 a 30% – LCR: 40% – Líquido pericardico: 50% – Líquido peritoneal: 20 a 30 % – Líquido sinovial: 20% – Líquido pleural: 10 a 25%.
COLORACION GIEMSA • Coloración compuesta o diferencial (ya que emplea más de un colorante • Su empleo en Microbiología para identificar parásitos (protozoarios de la sangre y los tejidos), espiroquetas, levaduras y hongos (Chlamydia). • En hematología para observar elementos sanguíneos normales
FINALIDAD 1. En frotis sanguíneos para observar a los agentes patógenos junto a las células sanguíneas y mostrar las diferencias entre ambos. 2. Citopatológico: ponen en evidencia la morfología y estructura de los microbios que pueden ayudar al diagnóstico certero de varias enfermedades infecciosas de la sangre.
TECNICA • Reactivos: 1. Metanol o etanol → fijador. 2. Colorante de Giemsa + Agua tamponada (pH 7.2).
• Fundamento: se basa en la distinta afinidad que demuestran las células y sus componentes a los distintos colorantes incluidos en el colorante de Giemsa.
TECNICA • Técnica: - Se realiza el extendido de la gota de sangre (gota gruesa del pulpejo del dedo gordo). - Se deja secar, se cubre con la solución de Giemsa, se lava con agua y se observa. - El fijador (metanol o etanol) se usa cuando se cuentan con muestras de tejidos, no debe usarse con extendidos de sangre.
RESULTADOS OBSERVACION ESPERADA: • •
Núcleo celular = Rojo púrpura Citoplasma: - Granulocitos Neutrófilos= Rojo púrpura profundo - Eosinófilos= Naranja amarronado - Basófilos= Rojo negruzco - Monocitos= Azul grisáceo - Gránulos= Rojo púrpura - Linfocitos= Azul - Gránulos azurófilos= Rojo púrpura - Eritrocitos= Marrón anaranjado - Formas policromáticas= Azul violeta - Punteado basófilo= Azul oscuro - Cuerpos Howell Jolly= Rojo púrpura Trombocitos: - Hialómeros= Azul brillante - Granulómeros= Rojo púrpura PARASITOS • Núcleo celular= Rojo profundo • Citoplasma = azul.
RESULTADOS • Resultados erróneos: - Se deben principalmente a errores durante el extendido sanguíneo o durante la aplicación del fijador
COLORACION TINTA CHINA • No es un coloración de rutina • Usado para mejorar la detección microscópica del cryptococcus • Coloración para células con cápsula • La cápsula excluye al colorante: el material capsular desplaza las partículas de carbón de la tinta, tanto que la cápsula aparece con un halo claro alrededor
MUESTRAS
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Esputo Pus Exudado Tejidos Sedimento de Orina y LCR
COLORACION TINTA CHINA Sensibilidad de 25 a 50% Especificidad > 100%: leucocitos
AZUL DE TOLUIDINA • Para diagnóstico de P. carinii • Muestras: esputo y lavado broncoalveolar • Sensibilidad de 80% • REACTIVOS: – Reactivo de Sulfatación: – 45 ml de Ácido acético glacial – 15 ml de ácido sulfúrico
– Azul de toluidina O – – – –
0.3 gr de Azul de Toluidina 60 ml de agua destilada 2 ml de ácido clorhidrico 140 ml de etanol absoluto.
AZUL DE TOLUIDINA TECNICA: • Cubrir las láminas con reactivo de sulfatación por 5 minutos • Agitar la placa en movimientos rotatorios por 30 veces • Dejar reposar 5 minutos • Retirar y lavar por 5 minutos en agua destilada • Colorear en Azul de Toluidina por 40 a 50 minutos • Pasar por xilol y montar