Manual de parasitologia general2

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANÁLISIS

“Manual de Prácticas de Laboratorio de Parasitología

General”

Manual de Parasitología General

1

INTRODUCCIÒN La implantación del Nuevo Modelo Educativo en la Facultad de Bioanálisis genero la reestructuración del plan de estudios en un sistema de créditos, con Experiencias Educativas ubicadas en 4 áreas de formación, un gran porcentaje de estas Experiencias Educativas incluyen horas paralelas donde los alumnos llevan a cabo prácticas que fortalecen sus conocimientos, habilidades y actitudes, para lo cual es necesario contar con manuales que guíen las actividades de los alumnos dentro de los laboratorios.

Actualmente la Facultad de Bioanálisis con base al nuevo modelo educativo integral y flexible (MEIF) cuenta con el registro de un manual de prácticas de laboratorio de Parasitología Clínica; por ello la necesidad de realizar un Manual de Parasitología General que le va a permitir al alumno contar con material bibliográfico actualizado, en el cuál obtendrá noción sobre la microunidad de competencia y generalidades de la práctica a realizar, así como la importancia de cada una de ellas; ayudará a identificar la morfología de los parásitos , siendo ético, responsable y cuidadoso en la selección de métodos para coadyuvar en el diagnostico clínico oportuno de estas enfermedades.

Su contenido presenta contribuciones fundamentales a su formación “QUÍMICO CLÍNICO”, se conforma de 10 prácticas de laboratorio con listado de referencia bibliográficas. Cada unidad abarcara temas generales como miscelánea de reactivos de cada método.

La experiencia educativa Parasitología general se encuentra en el área disciplinar de la carrera de “QUIMICA CLINICA” cuenta con 3 horas teóricas y 2 de práctica, con un total de 8 créditos basado en el programa de dicha experiencia educativa del Nuevo Modelo Educativo Integral y Flexible.

Es importante señalar que un manual de prácticas es un documento que contiene la descripción de los procedimientos que deben seguirse en la realización de las actividades del alumno dentro del laboratorio.

Manual de Parasitología General

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Se conforma de generalidades, técnica o procedimiento, material y método, así como el equipo a utilizar y cualquier otro dato que pueda auxiliar al correcto desarrollo de cada práctica.

En él se encuentra la información básica referente a cada procedimiento, el cual aumenta la eficiencia de los alumnos.

Cada práctica de laboratorio esta estructurada de la siguiente manera: •

Número y nombre de la práctica

•

Microunidad de Competencia

•

Generalidades

•

Material

•

Técnica

•

Observaciones (Datos del Parásito)

•

Cuestionario

•

Bibliografías

Este manual introduce al alumno en el campo de la parasitología general, abordando desde los puntos pedagógicos, científicos

y de distintos ángulos, los conceptos

actuales para obtener un mejor entendimiento en lo relacionado a las enfermedades parasitarias que son tan frecuentes en nuestra región.

Debido a la situación geográfica

en áreas como en las que nos encontramos

(tropical y subtropical) y el desarrollo socioeconómico deficiente favorece a tener una prevalencia parasitaria elevada.

Manual de Parasitología General

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REGLAMENTO DEL DEPARTAMENTO DE LABORATORIOS U.C.S. XALAPA. DISPOSICIONES GENERALES 1.- El responsable de cada práctica es el maestro.

2.- No se permite a los alumnos trabajar en los laboratorios sin la presencia del maestro.

3.- El equipo de protección personal dentro de los laboratorios y en los anexos de los laboratorios será: Alumnos: 

Bata de algodón 100 %, de manga larga



Lentes de seguridad durante todo el tiempo que dure la práctica. En caso de lentes graduados, que sean de cristal duro inastillable y uso de protectores laterales.



El pelo recogido en las prácticas que se utilice mechero



Guantes en caso de que la práctica lo exija, a criterio del maestro.



Toalla o lienzo de algodón.

Profesor: 

Bata de algodón 100 %, de manga larga



Lentes de seguridad durante todo el tiempo que dure la práctica. En caso de lentes graduados, que sean de cristal duro inastillable y uso de protectores laterales.



El pelo recogido en las prácticas que se utilice mechero.

LOS SERVICIOS 4.- El departamento de laboratorios de la unidad de ciencias de la salud prestara los servicios a usuarios de conformidad a las siguientes normas: Los C.C. catedráticos deberán: 

Respetar sus horarios de entrada y salida.



Permanecer dentro del laboratorio mientras haya alumnos trabajando.

Manual de Parasitología General

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

Solicitar con anticipación su material de trabajo, por escrito en las hojas especiales que para ello existen, con un mínimo tiempo de 48 hrs. hábiles. Las hojas de pedido se les proporcionaran en los laboratorios.



Enseñar oportunamente a los alumnos el manejo y cuidado del material, reactivos y equipo que utilicen en la practica.



Informar a los alumnos sobre el manejo de residuos peligrosos biológico infecciosos.

Los alumnos: 

Deberán solicitar el material y equipo mediante un vale debidamente requisitado, con especificaciones de cada pieza. El alumno que reciba el material, entregará su credencial vigente, revisando con cuidado el material en presencia del laboratorista. En caso de ruptura o pérdida del material, se conservara en el laboratorio su credencial hasta que el material sea repuesto.



Se debe de entregar el material limpio al término de la práctica.



Dejar limpias las mesas de trabajo de los laboratorios.



Depositar los desechos químicos generados en el recipiente que corresponda, según instrucciones del maestro.



Deben de conservar las tarjas de los laboratorios libres de toda basura (algodón, papeles o desechos de cualquier clase).



Separaran adecuadamente los residuos biológicos infecciosos para ser depositados ya sea en bolsas o en contenedores rígidos, según sea el caso.

NORMAS DE COMPORTAMIENTO 5.- Los usuarios deberán abstenerse de dejar, en el lugar de trabajo, cosas de valor a la vista y cerrar las puertas de los cubículos y laboratorios.

6.- Para trabajar en el laboratorio es necesario

que los estudiantes y personal

académico utilicen bata y lentes de seguridad.

7.- Durante el desarrollo de las prácticas queda estrictamente prohibido la entrada de personas ajenas al grupo.

8.- En los laboratorios queda prohibido.

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

Fumar



Consumir alimentos



Jugar



Provocar desordenes



El uso de zapatos abiertos (huaraches)

9.- Las tomas de agua y de gas deben mantenerse siempre cerradas cuando no se estén utilizando.

10.- Queda prohibido pipetear con la boca.

11.- No probar, oler ni tocar con las manos ningún producto químico.

12.- El trabajo con sustancias toxicas y volátiles deberá efectuarse dentro de la campana de extracción de gases.

13.- Antes de desecharse cultivos de microorganismos o muestras biológicas se deberán inactivar.

14.- Cualquier derrame de muestras biológicas deberá ser comunicado al profesor, quien supervisara el proceso de descontaminación del área.

15.- La recolección de muestras de sangre se realizara con seguridad, por lo cual quienes la toman deberán: 

Revisar sus manos en busca de cortes, raspaduras u otras lesiones cutáneas



Colocarse los guantes



Procurar no contaminar las manos mientras se extrae la sangre



Lavar las manos con agua y jabón inmediatamente después de cualquier accidente de contaminación con sangre.



Colocar las jeringas y agujas en los recipientes adecuados



En caso de pinchazo o cortada lavar la herida con agua y jabón.

16.- Cuando se maneje material contaminado, infecciosos o toxico por contacto, se deberán usar guantes y seguir las siguientes normas: 

Se deben evitar usar joyas en el laboratorio.



Cuando se termine el trabajo se deberán lavar las manos con agua y jabón.



Desechar los guantes



No tocar con las manos enguantadas los ojos, la nariz, otras mucosas ni la piel descubierta.

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

No abandonar el lugar de trabajo ni pasear por el laboratorio o pasillo con los guantes puestos.



Mantener el laboratorio limpio y ordenado, evitando la presencia de material y equipo que no tenga relación con el trabajo.



Nunca pipetear líquidos con la boca

SANCIONES: 17.-En caso de ruptura o perdida de material, se conservará en los laboratorios la credencial del alumno hasta que sea repuesto.

18.- Las personas a quienes se les sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones, serán sancionados conforme a la Legislación Universitaria, según la gravedad de la falta cometida.

19.- En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables serán las que decida el H Consejo Técnico, conforme a las disposiciones de la Legislación Universitaria.

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Materia fecal Heces  El examen de las heces comprende dos grandes capítulos de la investigación analítica clínica: la coprología Químico Funcional y la Coproparasitología La investigación comprende los siguientes puntos: 

Recolección



Caracteres organolépticos Macroscópicos como:

Cantidad Varía según la alimentación: con régimen cárnico, de 50 a 100 g/24 h; con régimen vegetariano, de 250 a 400 g; finalmente, en régimen mixto, de 100 a 200 g. Todo ello por día y en una sola deposición. Se puede definir la diarrea, dejando a un lado otras muchas definiciones, como la eliminación fecal que excede los 200 g por día, cuando el contenido de la dieta en fibras es bajo. El agua es el principal componente, siendo su contenido de aproximadamente un 65 %.

Consistencia Normalmente es pastosa-dura. Puede modificarse en distintas circunstancias.

En las diarreas la consistencia es líquida, en cantidad abundante cuando se deben a patología intestino delgado y mucosas si proceden del intestino grueso. Las deposiciones semiblandas indican un tránsito rápido por el intestino delgado o son propias de las afecciones pancreáticas o biliares. En el estreñimiento son duras, en forma de grandes bolos. Las deposiciones caprinas son propias de los estados espásticos acentuados.

Color Pardo. Durante la lactancia, amarillo. Se tornan verdes por la acción del aire en la lactancia natural. Son oscuras si contienen gran cantidad de pigmentos biliares (descargas biliares e ictericia hemolítica); pero son aún más oscuras y de aspecto alquitranado cuando contienen sangre de procedencia alta (si la sangre es de procedencia baja, es de color rojo y no bien mezclada) y en pacientes en tratamiento con sales de hierro. De color amarillo pardo, pero con gran contenido en grasa, en las esteatorreas de origen pancreático (conteniendo pigmentos biliares). El color verde es propio de las diarreas de fermentación del niño.

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Moco Su presencia en las heces es propia de los estados inflamatorios (enteritis y Colitis), pero también se presenta en el síndrome de intestino irritable, en el que no hay inflamación.

Pus Se presenta en pequeñas cantidades en la enteritis y colitis de cualquier etiología.

Pero la presencia brusca de pus abundante es indicio de la evacuación a la luz intestinal de un absceso próximo (perirrectales, prostáticos, piosálpinx, etc.).

Sangre Muy frecuente en la enteritis y la colitis, parece en cantidades pequeñas y mezclada con moco-pus. Si procede de las porciones altas del intestino se presenta bien mezclada con las heces y suele ser negruzca, aun cuando puede persistir roja si el tránsito intestinal ha sido muy rápido. Si la sangre va mal mezclada con las heces sugiere una procedencia baja. En ausencia de enteritis o colitis o, en general, de cualquier infección intestinal, la presencia de sangre hará sospechar una lesión de la mucosa (úlcera, tumor, angiodisplasia, etc.) o también en una enfermedad hemorrágica. Debe practicarse siempre un análisis de sangre (tiempos de hemorragia, coagulación, protrombina y tromboplastina y plaquetas). En los casos en que existe la sospecha de pérdida de sangre a nivel gastrointestinal distal (p.e. anemia ferropénica en el anciano), pero no se obtienen datos macroscópicos de la misma es conveniente su detección mediante el estudio de sangre oculta en heces (prueba del guayaco) o el empleo de hematíes marcados, con resultados positivos cuando su volumen es de 0,1 ml/min o superior. 

Examen Microscópico



Consistencia:

 Acuosa  Blanda  Pastosa  Dura

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Ejemplos Agua de arroz Puré de lentejas

Cólera Tifoidea

Papilla

Insuficiencia gástrica

Pegajosa

Esteatorrea origen biliar, pancreático

Pegajosa oscura

Melenas

Pastosa espumosa

Dispepsia

Restos gruesos de alimentos

Insuficiencia pancreática

Color La coloración parda habitual se debe a urobilina y estercobilina, el color es según el alimento.

Lactantes

– Amarillo canario

Carnívoros

– Castaño oscuro (Café)

Vegetariano

– Verdoso

Pan o Papas

– Amarillentas

Blanco grisáceo (ceniza):

- Ictericia Obstructiva - Hepatitis - Ingestión de Bario (peptobismol)

Amarillentas con matices: - Esteatorrea - Diarreas de fermentación - Insuficiencia pancreática

Parásitos: Macros y microscópicos 

Células: epiteliales – Irritación Manual de Parasitología General

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Leucocitos: se observan colocando una gota de ácido acético al 10% más una gota de materia fecal. Su presencia indica infección bacteriana.

Si hay más de 10 por campo, hacer un diferencial.

Mayor cantidad de Neutrófilos (Polimorfo nucleares) la infección es causada por bacterias. Si hay mayor cantidad de no segmentados la infección es viral Cristales: •

Oxalato de Calcio – Normal y aumentada, su presencia en insuficiencia gástrica

•

De colesterol – Cálculos vesiculares hematoidina – agujas amarillas, se presentan en grupos, aparecen después de hemorragias.

•

Charcot-Leyden – Amibiasis, I. belli

Grasa •

Tránsito acelerado.

•

Deficiencia enzimatica.

•

Deficiencia en absorción.

•

Metodología por el Laboratorio Clínico.

•

Grasas neutras – teñidas con Sudán III (gotas anaranjadas), más de 60 gotas indican esteatorrea

Síndrome de mala absorción Definición Es la dificultad en la digestión o absorción de los nutrientes de las substancias alimenticias.

Típicamente, la mal absorción puede ser la insuficiencia para absorber azúcares, grasas y proteínas específicas u otros nutrientes (tales como las vitaminas) o una mal absorción inespecífica general de los alimentos.

La mala absorción puede ir acompañada de: 

Diarrea



Hinchazón o cólicos



Retraso del crecimiento



Deposiciones difíciles y frecuentes Manual de Parasitología General

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

Debilitamiento muscular



Distensión abdominal

Causas 

Fibrosis quística



Intolerancia a la lactosa



Enfermedad celíaca (enteropatía inducida por gluten)



Enfermedad de whipple (distrofia por medicamentos)



Intolerancia a la lacto albúmina bovina (proteína de la leche de vaca)



Intolerancia a la proteína de la leche de soya



Acrodermatitis enteropática que causa la mala absorción del Zinc



Mal absorción de vitamina B-12



Parásitos

Características macroscópicas 

Olor : ácido



Color: Claro



Consistencia: de pastosa a liquida



Cantidad: abundantes



Flotabilidad de las heces



Presencia de grasa (gotas oleosas).

Recolección, manejo y conservación de productos biológicos (Control de calidad) Manual de Parasitología General

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Generalidades.

En el manejo de los productos biológicos es donde va a radicar el éxito o el fracaso de un diagnóstico en enfermedades parasitarias. Es necesario seguir ciertos lineamientos preestablecidos para cada producto. Un portaobjetos desengrasado insuficientemente, dará por resultado un frote sanguíneo defectuoso, con el que difícilmente se haría un diagnóstico adecuado. Una materia fecal recolectada con orina, destruye los embriones de Necator, lo que hace fracasar un examen posterior como el desarrollo de larvas F, en el cultivo de Harada-Mori (1955) para la obtención de larvas.

En suma, las muestras mal recolectadas, inadecuadamente conservadas y con mucho tiempo después de haber sido obtenidas, no servirán para observaciones y estudios posteriores, e inclusive pueden conducir a resultados erróneos o falsos.

Recolección. La obtención de la materia

fecal se puede hacer de diferentes

maneras; la más frecuente es por la expulsión natural. La segunda se puede obtener con purgantes y la otra es de qué se toma por medio de la cucharilla rectal. La que se utiliza con mayor frecuencia es la primera, la segunda se utiliza en casos muy especiales como en amebosis intestinal crónica y en estrongiloidosis; Finalmente, la toma con cucharilla rectal se utiliza en los lactantes. Las muestras serán seriadas en tres días consecutivos, salvo otras indicaciones Manejo. Se deben utilizar frascos limpios de boca ancha, se evitará la contaminación con tierra, agua u orina. Los frascos se guardarán en lugares frescos, pues el calor acelera los fenómenos de fermentación y con frío se pueden destruir los quistes y trofozoítos de protozoos (Goldman

y Johnson, 1950; Chang, 1955); deberán

etiquetarse con el nombre de la persona, edad, sexo, fecha, de preferencia, hora de expulsión de las heces.

Conservación. Los conservadores pueden ser físicos o químicos. Los medios físicos, son las temperaturas bajas, de 10º C que es la temperatura del refrigerador; Manual de Parasitología General

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se utilizan sobre todo para heces formadas, las cuales incluso pueden llegar a examinarse 24 y hasta 48 horas después de evacuadas, lo que no sucede con las heces diarreicas, que deben examinarse en un plazo no mayor de una hora y no deberán refrigerarse.

Los medios químicos permiten la conservación de las muestras durante un tiempo mayor, sin correr el riesgo de que las formas parasitarias se deformen o destruyan.

En seguida se anotan algunos de los más usados:

Conservadores y preservadores 

Solución de formalina* al 10 %.



Solución de formalina al 5%.



Solución de merthiolate-yodo-formaldehído (MIF).



Fijador de fenol alcohol y formol (PAF)

Práctica No. 1 Microscopía Manual de Parasitología General

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Microunidad de competencia: El alumno comprenderá los procedimientos experimentales de muestras biológicas de forma responsable, para su observación a nivel microscópico siendo cuidadoso.

Generalidades: Sirve para ampliar las imágenes de objetos muy pequeños, tiene un sistema de iluminación para poder visualizar el objeto y de un sistema de lentes para aumentar la imagen. El microscopio es un aparato frecuentemente utilizado en el laboratorio de diagnostico clínico para observar de células microorganismos, etc. Uno de los instrumentos más valiosos para el parasitólogo es el microscopio y continuación se indicaran algunas reglas simples para mantener los aparatos en buen estado y, por consiguiente que brinden el auxilio necesario con resultados óptimos.

La calibración del microscopio, le permitirá hacer mediciones de las estructuras que observe, lo que le facilitará el diferenciar e identificar células, parásitos y otras estructuras.

La calibración consiste en la determinar los coeficientes micrométricos para cada uno de los objetivos de manera que cuando se necesitan saber el tamaño de una célula, se establezca el número de subdivisiones con la escala micrométrica que al multiplicarse por el factor del objetivo se determine el tamaño de la misma en micras.

Material Manual de Parasitología General

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•

micrómetro ocular

•

cámara de Neubauer

Técnica: Instructivo para la calibración del microscopio con el micrómetro ocular: a) descripción de la escala de la cámara de Neubauer: En la cámara de Neubauer hay cuatro secciones marcadas con una L, donde se cuentan los leucocitos y una zona central donde recuentan los eritrocitos. En la figura 1 se señala el tamaño de los diferentes cuadros. El cuadro central de la cámara es la zona de cuenta de eritrocitos, en esta cuadricula mide 1mm (1000 micras como lo indica la figura 1)

Figura 1.

La cuadricula para cuenta de eritrocitos esta dividida en 5 x 5 cuadros y cada una mide 0.2 mm ó 200 micras. A su vez cada cuadro está dividido en 4 x 4 cuadros y cada uno mide 0.05 mm ó 50 micras; a partir de ellos se obtienen los coeficientes micrométricos (C.M). b) DESCRIPCIÓN DE LA ESCALA DEL MICROMETRO OCULAR La escala del micrómetro ocular tiene 10 divisiones grandes del mismo tamaño, de las cuales de la segunda a la sexta presentan 5 subdivisiones iguales.

Manual de Parasitología General

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Para medir una estructura, esta se hará coincidir dentro de la escala, contabilizando las divisiones grandes como cinco y las pequeñas como uno.

Mide 100 micrómetros

DETERMINACIÓN DE LOS COEFICIENTES MICROMETRÍCOS Se deben establecer los coeficientes micrométricos de cada objetivo (10X, 40X, y 100X).

Colocar el micrómetro ocular en el orificio izquierdo del microscopio, la cámara de Neubauer en la platina, enfocar con el objetivo de 10X y centrar en el campo la cuadrícula de eritrocitos.

Hacer coincidir la escala del micrómetro ocular en la línea media de la cuadricula para hacer cuenta de eritrocitos.

Buscar donde una de las divisiones de la escala del micrómetro coincida con el borde de un cuadro de la cámara de Neubauer y establecer los coeficientes micrométricos (C.M)

Manual de Parasitología General

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MEDICIÓN DE ESTRUCTURAS MICROSCÓPICAS Para determinar el tamaño de una estructura microscópica se deberá hacer coincidir la estructura, en la escala del micrómetro ocular, moviendo la platina.

Una vez que coincida el borde izquierdo de la estructura con una línea, establecer el número de subdivisiones que abarca, contabilizando como 5 las que no tienen subdivisiones y como uno cada uno de las mismas.

Calcular la medida de la estructura, en micrómetros, multiplicando el número de subdivisiones por el coeficiente micrométrico del objetivo correspondiente.

Manual de Parasitología General

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Cuestionario 1. ¿Cuál es la finalidad de la utilización de la micrometría en parasitología? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 2. Menciona

ventajas

y

desventajas

del

uso

de

la

micrometría

______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 3. ¿Cómo

calculamos

la

micrometría

del

objetivo

de

inmersión?

______________________________________________________________ ______________________________________________________________ Bibliografía: 1. http://equipo1.files.wordpress.com/2007/10/dsc00078.jpg 2.

http://www.scielo.cl/scielo.php? pid=S071822442005000200002&script=sc_arttext.

3. http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/trematodos/ge neralidades.php Práctica No. 2 Manual de Parasitología General

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Examen Directo Microunidad de competencia El alumno aprenderá a reconocer la morfología de los protozoos mediante examen directo de una manera responsable.

Generalidades: Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas móviles de parásitos de tamaño microscópico (trofozoítos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Balantidium coli, etc.; así como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercoralis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Trichostrongylus sp., Paragonimus, Fasciola, etc.).

Material: Portaobjetos Cubreobjetos Pipetas Pasteur Microscopio compuesto Aplicadores de madera o palillos.

La muestra utilizada es tan pequeña, que es poco representativa.

Reactivos: Cloruro de sodio, agua destilada, yodo cristaloide, yoduro de potasio Soluciones: (ver miscelánea de reactivos)) Solución salina isotónica Lugol parasitológico: solución madre: Solución de trabajo.

Técnica: Manual de Parasitología General

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1. En un portaobjeto se colocan, separadamente, una gota de solución salina y otra de lugol.

2. Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcla con la solución salina.

3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.

4. Se coloca el cubreobjetos.

5. Se efectúa la misma operación en la gota del lugol y se observa.

Bibliografía: 1. http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf 2. http://www.facmed.unam.mx/dirije/index.php?dir_ver=11 3. Becerri Flores, Romero Cabello (2004). Parasitología médica de las moléculas a la enfermedad. México, DF: McGraw-hill Interamericana.

4. Francisco Trujillo Contreras, Ángeles Villanueva Yerenas, Miguel Raygoza Anaya (2001). Enfermedades Parasitarias. Guadalajara, jal.: Ediciones Cuéllar.

Práctica No. 3 Manual de Parasitología General

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Búsqueda De Parásitos Intestinales Microunidad de competencia: Que el alumno aprenda a identificar los diferentes tipos de morfología de parásitos intestinales. Por medio de examen directo y en fresco siendo ético y responsable.

Generalidades: Grupo de animales que viven a expensas de seres vivos, en cuyo aparato digestivo se alojan y con el que compite por el consumo de las sustancias alimenticias que ingiere el huésped. Su tamaño va desde ser diminuto (y sólo es posible verlos a través del microscopio), o medir desde centímetros hasta metros. Su presencia en el organismo humano está directamente relacionada con la falta de higiene, tanto personal como al preparar alimentos y las condiciones del lugar donde se consumen.

Existen muchos parásitos causantes de afecciones en el ser humano Material: 

Materia Biológico ( Heces, Secreciones)



Formaldehído al 10 % (ver miscelánea de reactivos)



Abatelenguas



Lugol (ver miscelánea de reactivos)



NaCl 0.85 % (ver miscelánea de reactivos)



Aplicador de madera



Cubreobjetos



Portaobjetos



Microscopio



Laminillas permanentes de las diversas especies.

Técnica: Manual de Parasitología General

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Coproparasitoscópico microscópico en fresco: 1. Colocar una gota de solución NaCl al 0.85%, en un portaobjetos.

2. Con un aplicador obtener aproximadamente 2 mg de la materia fecal y mezclarla en la gota de solución salina.

3. Hacer una suspensión uniforme y retirar los detritos macroscópicos.

4. Colocar un cubreobjetos y hacer la observación microscópica inmediatamente con los objetivos 10X y 40X. Coproparasitoscópico microscópico directo: 1. En un portaobjeto se colocan, separadamente, una gota de solución salina y otra de lugol.

2. Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcla con la solución salina.

3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.

4. Se coloca el cubreobjetos.

5. Se efectúa la misma operación en la gota del lugol y se observa.

Resultados de la observación Microscópica. a) Nombre del parásito__________________________________________________ c) Estadío desarrollado _________________________________________________ d) A que órgano (s) sitio (s) invade o parásita ______________________________ e) Menciona que tipo de técnica se llevo a cabo, especificando si fue en fresco ó en tinción

__________________________________________________________

f) Describe las características y /o criterios morfológicos. ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

Cuestionario Manual de Parasitología General

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1. ¿Cuál es el examen de laboratorio de elección para la búsqueda de huevos, quistes o larvas en heces?: ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

2. ¿Cuál es el examen de laboratorio de elección para la búsqueda de trofozoítos en heces? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

3. ¿Qué entiende por examen coproparasitoscópico cualitativo? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

Bibliografía 1. http://74.125.47.132/search? q=cache:uTJ0VqepWRAJ:www.higiene.edu.uy/cefa/parasito/2007/PROTINTce fahtm.doc+morfologia+de+protozoos+intestinales+de+importancia+MEDICA&c d=12&hl=es&ct=clnk&gl=mx 2. http://www.facmed.unam.mx/dirije/index.php?dir_ver=11

3. Becerri Flores, Romero Cabello (2004). Parasitología médica de las moléculas a la enfermedad. México, DF: McGraw-hill Interamericana.

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Práctica No.4 Morfología de los protozoos intestinales Microunidad de competencia: El alumno identificará los protozoos intestinales de importancia medica mediante la observación de métodos directos, de una manera ética y responsable.

Generalidades: Los protozoarios son microorganismos unicelulares pertenecientes al Reino Protista, subreino Protozoa.

Se caracterizan por ser eucariota, pueden reproducirse asexuada o sexuadamente, tienen movilidad variable dependiendo de sus órganos de locomoción. Pueden vivir libremente o actuar como parásitos. Pueden parasitar a distintos animales y a la especie humana.

Los parásitos humanos se pueden clasificar taxonómicamente en 4 Phylum basándose en sus características nucleares, de reproducción y de locomoción.

Según la clasificación de la sociedad de protozoólogos parásitos

pertenecen

fundamentalmente

a

tres

de 1980, los protozoos

phyla:

Sarcomastigophora,

apicomplexa, y Cilophora. Los Sarcomastigóforos se subdividen, a su vez, en dos grandes subphyla: Mastigophora y Sarcodina, respectivamente los flagelados tisulares intestinales y la amibas.

Morfología: Entamoeba histolytica (amebosis) Trofozoítos: es la forma patógena, mide de 20 a 50 µm. las cepas patógenas contienen hematíes en su interior.

Prequiste: tiene un solo núcleo, barras de cromatina con sus extremos romos y una vacuola de glucógeno. Quiste: es la forma infectante, posee de uno a cuatro núcleos cuyos cariosomas centrales se observan a veces en las preparaciones en fresco, y siempre en las preparaciones coloreadas.

Manual de Parasitología General

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Entamoeba Coli: morfológicamente es semejante a la Entamoeba histolytica, se diferencia por las características de la cromatina perinuclear y la posición excéntrica del cariosoma, se presenta como trofozoítos, prequiste y quiste.

Entamoeba hartmanni: esta especie es semejante en cuanto a las fases que posee a E. histolytica, con excepción de sus tamaño; Entamoeba hartmanni desarrolla trofozoítos de 4-10µm de diámetro, tiene un citoplasma vacuolado parecido al que muestra Entamoeba coli; el núcleo único en esta fase muestra un endosoma central y la cromatina periférica se distribuye de manera homogénea. La media de los quistes oscila entre 5-10 µm de diámetro, pueden ser vacuolados y mostrar con una tinción permanente cuerpos cromatoides de aspecto baciloide o similares a un grano de arroz.

Endolimax nana: es más pequeña que la Entamoeba histolytica, morfológicamente se destaca porque tanto los Trofozoítos como los quistes poseen un núcleo con un cariosoma central

muy marcado, y no se observa membrana nuclear

en los

preparados microscópicos observados en fresco.

Material: 

Materia Biológico ( Heces, Secreciones, Viales positivo proporcionados por el catedrático )



Formaldehído al 10 % (ver miscelánea de reactivos)



Abatelenguas



Lugol (ver miscelánea de reactivos)



NaCl 0.85 % (ver miscelánea de reactivos)



Aplicador de madera



Cubreobjetos



Portaobjetos



Microscopio



Laminillas permanentes de las diversas especies

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26

Técnica: Coproparasitoscópico microscópico directo: 1. En un portaobjeto se colocan, separadamente, una gota de solución salina y otra de lugol.

2. Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcla con la solución salina.

3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.

4. Se coloca el cubreobjetos.

5. Se efectúa la misma operación en la gota del lugol y se observa.

Datos del parásito. a) Nombre del parásito _________________________________________________ b) A que grupo taxonómico pertenece _____________________________________ c) Estadío desarrollado _________________________________________________ d) A que órgano (s) sitio (s) invade o parásitan ______________________________ e) Menciona que tipo de técnica se llevo a cabo, especificando si fue en fresco ó en tinción

__________________________________________________________

f) Describe las características y /o criterios morfológicos. ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

Cuestionario 1. ¿Qué características son importantes para diferenciar Entamoeba histolytica de Entamoeba hartmanni? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 2. ¿Qué recursos de laboratorio son esenciales para identificar las amebas comensales?

Manual de Parasitología General

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______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 3. Aun cuando Entamoeba coli, Endolimax nana no son amebas patógenas, ¿en qué radica la relevancia de su hallazgo? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

Bibliografía: 1. http://www.facmed.unam.mx/dirije/index.php?dir_ver=11 2.

Becerri Flores, Romero Cabello (2004). Parasitología médica de las moléculas a la enfermedad. México, DF: McGraw-hill Interamericana.

3. Tay Zavala J., Gutiérrez Quiroz M., Gracia Yáñez Y. (2003) “Parasitología Clínica De Craig” Editorial Masson Doyma México S. A. Tercera edición.

4. De Haro Arteaga I., Salazar Schettino P., Cabrera Bravo M. (1995) “Diagnostico Morfológico de las Parasitosis” Editorial Méndez Editores. Segunda edición.

Manual de Parasitología General

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Práctica No. 5 Morfología de los protozoarios flagelados intestinales Microunidad de competencia: El alumno identifique las características morfológicas del los protozoarios flagelados mediante técnicas permanentes, efímeras obteniendo así una conciencia social.

Generalidades: Morfología de Giardia:

Presentar un tamaño inferior a 20 μm.

Carecen de ciertos orgánulos como son las mitocondrias y el aparato de Golgi. Únicamente tiene un hospedador (monoxeno), es cosmopolita y tiene dos formas de vida en su ciclo vital: Trofozoíto: presenta un tamaño en torno a 20 μm de longitud y 15 μm de ancho con una morfología piriforme y una simetría bilateral. Proyectada en un plano se asemeja a una pera. Posee 8 flagelos, 2 anteriores, 2 posteriores, 2 ventrales y 2 caudales, cuya función es la motilidad celular. En la cara ventral presenta una estructura con forma de disco bilobulado, cuya función es permitir la fijación del parásito a la superficie del epitelio intestinal. En la cara dorsal y coincidiendo en posición con el disco bilobulado se sitúan dos núcleos ovalados con grandes endosomas. A lo largo de la superficie ventral se disponen unos elementos denominados cuerpos mediales, cuya función aún permanece desconocida. El trofozoíto es la forma vegetativa que se alimenta y se reproduce.

Quiste: presenta un tamaño en torno a 15 μm de longitud y 10 μm de ancho con una morfología ovalada. Posee 4 núcleos que siempre aparecen dispuestos en alguno de los polos. No presenta flagelos aunque se pueden apreciar los axonemas flagelares (restos de los flagelos) y los cuerpos mediales duplicados con respecto al trofozoito.

La pared es transparente y muy resistente tanto a factores físicos como químicos. El quiste es la forma vegetativa infectante y de resistencia.

Alimentación por fagocitosis y pinocitosis del contenido intestinal a través de la superficie dorsal.

Manual de Parasitología General

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Reproducción por división binaria longitudinal. Se produce tan rápido que en poco tiempo pueden formarse millones de parásitos. No presentan reproducción sexual.

Material: 

Materia Biológico ( Heces)



Formaldehído al 10 % (ver miscelánea de reactivos)



Abatelenguas



Lugol (ver miscelánea de reactivos)



NaCl 0.85 % (ver miscelánea de reactivos)



Aplicador de madera



Cubreobjetos



Portaobjetos



Microscopio

Técnica: Coproparasitoscópico microscópico directo: 1. En un portaobjeto se colocan, separadamente, una gota de solución salina y otra de lugol.

2. Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcla con la solución salina.

3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.

4. Se coloca el cubreobjetos.

5. Se efectúa la misma operación en la gota del lugol y se observa.

Datos del parásito. a) Nombre del parásito _________________________________________________ b) A que grupo taxonómico pertenece _____________________________________ c) Estadío desarrollado ________________________________________________ d) A que órgano (s) sitio (s) invade o parásita ______________________________ Manual de Parasitología General

30

e) Menciona que tipo de técnica se llevo a cabo, especificando si fue en fresco ó en tinción ___________________________________________________________ f) Describe las características y /o criterios morfológicos. ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

Cuestionario 1. Mencione dos productos biológicos útiles para realizar el diagnóstico de la giardiosis ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

Bibliografía: 1.- http://ciencianet.com.ar/77/vacuna-contra-el-chagas-pero-para-animales-dom-sticos 2.- http://www.facmed.unam.mx/dirije/index.php?dir_ver=11 3.- Becerri Flores, Romero Cabello (2004). Parasitología médica de las moléculas a la enfermedad. México, DF: McGraw-hill Interamericana.

Manual de Parasitología General

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Práctica No. 6 Morfología de Protozoarios Ciliados Intestinales Microunidad de competencia: El alumno aprenderá a identificar las diferentes estructuras morfológicas de los ciliados por medio de técnicas de fijación de manera cuidadosa y ordenada.

Generalidades: Son formas unicelulares, relativamente grandes, con una estructura interna compleja.

Hay tres características que los definen: •

Su superficie aparece cubierta de cilios alineados regularmente, con los que se mueven de forma activa y veloz.

•

Tienen dos núcleos, macronúcleo y micronúcleo, este último reservado para la reproducción sexual, que realizan esporádicamente.

•

La mayoría realiza la fagocitosis mediante la que se alimentan a través de una zona especializada, hundida, llamada citostoma, es decir, boca celular.

Morfología: Balantidium Coli Es el protozoario parasítico más grande en el ser humano.

Trofozoítos. Tienen un tamaño usual de 40-50 µm, tiene forma ovoide con la parte anterior afiliada, movilidad rotatoria. Núcleos: 1 largo, macronúcleo en forma de riñón, 1 pequeño, micronúcleo esférico adyacente al macronúcleo, el cuerpo esta recubierto de cilios. Se observan vacuolas contráctiles.

Quiste: Tamaño usual de 50-55µm, es esférico u oval, posee un macronúcleo grande visible en preparaciones no teñidas. El macronúcleo y vacuolas contráctiles visibles en quistes jóvenes. En los maduros

las estructuras internas tienen

apariencia granular

Manual de Parasitología General

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Material: 

Materia Biológico ( Heces)



Formaldehído al 10 % (ver miscelánea de reactivos)



Abatelenguas



Lugol (ver miscelánea de reactivos)



NaCl 0.85 % (ver miscelánea de reactivos)



Aplicador de madera



Cubreobjetos



Portaobjetos



Microscopio



Preparaciones fijas de la especies.

Técnica: Coproparasitoscópico microscópico directo: 1. En un portaobjeto se colocan, separadamente, una gota de solución salina y otra de lugol.

2. Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcla con la solución salina.

3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.

4. Se coloca el cubreobjetos.

5. Se efectúa la misma operación en la gota del lugol y se observa.

Datos del parásito. a) Nombre del parásito _________________________________________________ b) A que grupo taxonómico pertenece

____________________________________

c) Estadío desarrollado _________________________________________________ d) A que órgano (s) sitio (s) invade o parásita _______________________________ e) Menciona que tipo de técnica se llevo a cabo, especificando si fue en fresco ó en tinción ___________________________________________________________ f) Describe las características y /o criterios morfológicos. ____________________________________________________________________ Manual de Parasitología General

33

____________________________________________________________________ Cuestionario: 1.- ¿Que región del cuerpo humano invade el Balantidium coli? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 2.- ¿Cuál es la vía de entrada para el ser humano y cuál es la fase infectante del ciliado? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 3.- ¿Cuáles son las manifestaciones clínicas más frecuentes de la Balantidiosis? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

Bibliografía: 1.- http://www.uprm.edu/biology/profs/bunkley/lab4.htm 2.- http://webpages.ull.es/users/jpinero/Tablas%20e%20imagenes/7.pdf 3.- wapedia.mobi/es/Ciliophora 4.- http://mundo-pecuario.com/tema132/trematodos.html

Manual de Parasitología General

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Práctica No. 7 Morfología de los protozoarios sanguíneos flagelados Microunidad de competencia: El alumno identifique las características morfológicas del los protozoarios flagelados mediante técnicas permanentes, efímeras obteniendo así una conciencia social.

Generalidades: Morfología de Leishmania Leishmania presenta 2 estados morfológicos, el promastigote, presente de forma extracelular y ubicado en el intestino de los flebótomos, se caracteriza por tener un cuerpo alargado y un flagelo que les permite el movimiento, ésta forma al ser inoculada dentro de los hospederos se transforma en el segundo estado morfológico conocido como amastigote. Los amastigotes se caracterizan por ser redondeados, sin la presencia del flagelo, de 2 a 4 micras de diámetro con un núcleo y un kinetoplasto (estructura mitocondrial especializada que contiene ADN), ésta forma parasitaria es la visualizada en los frotis y biopsias para el diagnóstico de la enfermedad. Los amastigotes son exclusivamente intracelulares pero pueden encontrarse en el intersticio en los casos en los que el parásito se replica hasta producir la ruptura de la célula hospedera.

Morfología de Trypanosoma: Presenta tres formas distintas: amastigota, epimastigota y tripomastigota.

•

Amastigota: esférico u ovalado, es la forma reproductiva en el interior

de las células mamíferas.

•

Epimastigota: Alargada y con el cinetoplasto localizado anteriormente al

núcleo, es la forma reproductiva en el tracto digestivo de los invertebrados y en medios de cultivo.

Manual de Parasitología General

35

•

Tripomastigota: también alargado, pero con el cinetoplasto localizado

posteriormente al núcleo. Se encuentra en la sangre de los mamíferos y es la forma infectante de ellos. Esta forma no se divide.

Material: 

Materia Biológico ( sangre)



Portaobjetos



Microscopio



colorante de Wright



colorante de Giemsa

Técnica: 1. En un portaobjetos dejar caer 2 gotas de sangre y hacer una extensión, dejar secar al aire.

2.- Teñir con solución colorante de Wright durante 1 a 3 minutos.

3.- Pasado este tiempo lavar con agua destilada. Dejar escurrir y secar al aire.

4.- Observar con objetivos de 10X, 40X y 100X utilizando con éste último aceite de inmersión.

Datos del parásito. a) Nombre del parásito _________________________________________________ b) A que grupo taxonómico pertenece _____________________________________ c) Estadío desarrollado ________________________________________________ d) A que órgano (s) sitio (s) invade o parásita ______________________________

Manual de Parasitología General

36

e) Menciona que tipo de técnica se llevo a cabo, especificando si fue en fresco ó en tinción ___________________________________________________________ f) Describe las características y /o criterios morfológicos. ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________

Cuestionario 2. ¿De qué color se observa el núcleo de los trofozoítos de Plasmodium teñidos con el colorante de Giemsa? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 3. ¿Cómo se transmite la Leishmaniosis? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

Bibliografía: 1.- http://ciencianet.com.ar/77/vacuna-contra-el-chagas-pero-para-animales-dom-sticos 2.- http://www.facmed.unam.mx/dirije/index.php?dir_ver=11 3.- Becerri Flores, Romero Cabello (2004). Parasitología médica de las moléculas a la enfermedad. México, DF: McGraw-hill Interamericana.

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Práctica No. 8 Morfología de los protozoarios flagelados en cavidades Microunidad de competencia: El alumno identifique las características morfológicas del los protozoarios flagelados mediante técnicas permanentes, efímeras obteniendo así una conciencia social.

Generalidades: Morfología de trichomonas: Trichomonas vaginalis es un protozoo flagelado patógeno, cuyo hábitat es el tracto genitourinario.

Otros

tricomonánidos,

tales

como

Trichomonas

tenax

y

Pentatrichomonas hominis se han asociado a patología bucal y respiratoria, e intestinal, respectivamente.

Trofozoíto: presenta un tamaño 10-20 μm de longitud y una morfología piriforme.

Posee 5 flagelos: cuatro son anteriores y libres, y el quinto se dirige hacia la parte posterior del cuerpo celular asociado a la superficie celular formando una membrana ondulante que no tiene porción libre del flagelo. Paralelo a dicha membrana se dispone, en el interior de la célula, un haz de microtúbulos denominado costa. El trofozoíto es la forma vegetativa que se alimenta, se reproduce e infecta Trofozoítos no teñidos En productos biológicos provenientes

de exudados vaginales

y uretrales, T.

vaginalis presenta varias formas. En algunos organismos se encuentra su clásica forma ovoide con movimientos muy rápidos debido a sus flagelos; en individuos pequeño el axostilo sobre sale el cuerpo hacia la zona más posterior, aunque en la mayoría de los queda dentro del citoplasma. La membrana ondulante es más corta que el cuerpo. En los exámenes en fresco, debido al movimiento de estos parásitos es difícil observar con detalle algunos de los aspectos morfológicos descritos.

Trofozoitos con tinción permanente Manual de Parasitología General

38

Con hematoxilina tiene un color gris o azul grisáceo, miden 15 de largo por 10 µm en promedio; tienen formas variables, son más grandes que las otras especies. Cuatro flagelos anteriores se extienden

a partir de sus blefaroplastos, los cuales están

ordenados dentro de la membrana. La membrana ondulante y la costa son cortas, recorren dos tercios

del cuerpo del parásito. El núcleo se encuentra cerca

extremo anterior, contiene

del

un número de gránulos, generalmente ordenados en

forma de flor. El citoplasma no se observa con facilidad. El citoplasma se encuentra lleno de vacuolas con restos alimenticios. El axostilo puede o no sobresalir el cuerpo del organismo.

Material: 

Materia Biológico (Secreciones)



NaCl 0.85 % (ver miscelánea de reactivos)



Pipeta Pasteur con bulbo



Cubreobjetos



Portaobjetos



Microscopio

Técnica: 1.- Se coloca a la paciente en posición ginecológica.

2.-Introducir con cuidado el espejo vaginal.

3.- Con un hisopo tomar la muestra del fondo de saco posterior.

4.- Depositar la primera toma en un portaobjetos limpio y hacer un extendido.

5.- La segunda toma depositarla en un tubo de ensaye con solución salina conservando a 37°C. 6.- Una vez seco el extendido se procede a teñir con el colorante de Wright de 1 a 3 min.

7.- Se observa al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a éste último aceite de inmersión.

8.- Con una pipeta Pasteur se toma una gota del fondo del tubo de ensaye y se deposita en un portaobjetos y se cubre.

9.- Examinar con objetivos de 10X y 40X. Manual de Parasitología General

39

10.Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

Datos del parásito. a) Nombre del parásito _________________________________________________ b) A que grupo taxonómico pertenece _____________________________________ c) Estadío desarrollado ________________________________________________ d) A que órgano (s) sitio (s) invade o parásita ______________________________ e) Menciona que tipo de técnica se llevo a cabo, especificando si fue en fresco ó en tinción ___________________________________________________________ f) Describe las características y /o criterios morfológicos. ____________________________________________________________________

Manual de Parasitología General

40

Práctica No. 9 Morfología de los Helmintos de importancia médica Microunidad de competencia: El alumno identifique las características morfológicas de los helmintos

de

importancia medica de una manera ética y responsable.

Generalidades: El término gusano o verme, es amplio; se utiliza en el lenguaje popular para hacer referencia a invertebrados de forma alargada, sin apéndices y que se desplazan arrastrándose: lombriz de tierra, larva de mosca, tenias, etc.

Helminto: es un nombre general, no taxonómico, utilizado para designar a los gusanos parásitos y a los de vida libre.

Morfología de los principales grupos de helmintos:

Céstodos: Su morfología se caracteriza por la presencia de un órgano anterior de fijación, el escólex, provisto de ganchos y ventosas, que le permite fijarse a la mucosa intestinal, y una parte posterior en forma de cinta de aspecto segmentado, denominada estróbilo, formado de una sucesión continua de proglótides. Desde la base del escólex, las proglótides del estróbilo quedan encadenadas de modo que las más antiguas o maduras van quedando en la parte posterior del estróbilo. Las proglótides cercanas al escólex se denominan inmaduros, ya que crecerán paulatinamente en tamaño, formando un aparato reproductor masculino y femenino completo, o dos, a medida que van siendo desplazadas por la formación de nuevos anillos inmaduros. De esta forma, se pueden observar los distintos estados de maduración dentro del estróbilo, como si hubiéramos recogido una serie de fotogramas de su evolución y puede llegar a medir más de 5 metros.

Tremátodos: Los tremátodos se caracterizan por tener un cuerpo no segmentado, con frecuencia en forma de hoja, y revestido por un tegumento no ciliado formado por una cutícula no quitinosa, generalmente gruesa; por debajo de ella existe un epitelio sincitial y, bajo éste, fibras musculares longitudinales y circulares.

Manual de Parasitología General

41

En las especies anaerobias, endoparásitos del tubo digestivo el glucógeno se usa en un tipo especial de fermentación que libera CO2 y ácidos grasos.

Nemátodos: Los nemátodos son gusanos redondos, tienen el cuerpo alargado, cilíndrico y no segmentado con simetría bilateral. Con frecuencia, el macho tiene un extremo posterior curvado o helicoidal con espículas copulatorias y, en algunas especies, una bolsa caudal denominada bursa. El extremo anterior del adulto puede tener ganchillos orales, dientes, o placas en la cápsula bucal, que sirven para la unión a tejidos, y pequeñas proyecciones de la superficie corporal conocidas como cerdas o papilas, que se cree que son de naturaleza sensitiva. Se denominan fastidios o deiridios según la porción del cuerpo donde se localicen Material:



Materia Biológico ( Heces, Secreciones, Viales positivo proporcionados por el catedrático )



Formaldehído al 10 % (ver miscelánea de reactivos)



Abatelenguas



Lugol (ver miscelánea de reactivos)



NaCl 0.85 % (ver miscelánea de reactivos)



Aplicador de madera



Cubreobjetos



Portaobjetos



Microscopio



Laminillas permanentes de las diversas especies.

Técnica: Coproparasitoscópico microscópico directo: 1. En un portaobjeto se colocan, separadamente, una gota de solución salina y otra de lugol.

2. Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcla con la solución salina.

3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.

Manual de Parasitología General

42

4. Se coloca el cubreobjetos.

5. Se efectúa la misma operación en la gota del lugol y se observa.

Datos del parásito. a) Nombre del parásito _________________________________________________ b) A que grupo taxonómico pertenece

____________________________________

c) Estadío desarrollado _________________________________________________ d) A que órgano (s) sitio (s) invade o parásita _______________________________ e) Menciona que tipo de técnica se llevo a cabo, especificando si fue en fresco ó en tinción ___________________________________________________________ f) Describe las características y /o criterios morfológicos. ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ Cuestionario 1.- ¿cuál es la forma infectante de Fasciola hepática? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 2.- ¿Cómo se realiza el diagnostico de Teniasis? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 3.- ¿Cuál es la fase infectiva de Áscaris lumbricoides para el humano? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ Bibliografía: 1. http://www.facmed.unam.mx/dirije/index.php?dir_ver=11 2. http://mundo-pecuario.com/tema132/trematodos.html 3.

De Haro Arteaga I.,Salazar Schettino P., Cabrera Bravo M. (1995) “Diagnostico Morfológico de las Parasitosis” Editorial Méndez Editores. Segunda edición.

Manual de Parasitología General

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Práctica No.10 Morfología de los Apicomplexa Microunidad: El alumno aprenderá a identificar las diferentes estructuras morfológicas de los Apicomplexas mediante técnicas permanentes de manera ordenada y cuidadosa.

Generalidades: Apicomplexas es un extenso grupo protistas caracterizado por la presencia de un orgánulo único denominado complejo apical. Son unicelulares, forman esporas y exclusivamente parásitos de animales. Las estructuras móviles tales como flagelos o seudópodos están ausentes excepto en ciertas etapas de los gametos. Algunas enfermedades causadas por estos organismos son: •

Malaria (Plasmodium)

•

Babesiosis (Babesia)

•

Coccidiosis, incluyendo: o

Criptosporidiosis (Cryptosporidium parvum)

o

Ciclosporosis (Cyclospora cayetanensis)

o

Toxoplasmosis (Toxoplasma gondii)

o

Isosporiasis (Isospora belli)

Morfología

Isospora belli: Apicomplexa: roptrias. Oportunista. Ooquiste: 20-23 µm. 23 x13 µm.

Habita en el intestino delgado. Zoonosis. Contaminación oro-fecal directa. La fase infectante en el ser humano es el ooquiste, producto de la reproducción sexual del parásito. Isospora belli infecta por vía bucal al ser humano cuando éste ingiere alimentos contaminados.

Manual de Parasitología General

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Material:



Material Biológico



Formaldehído al 10 % (ver miscelánea de reactivos)



Abatelenguas



Lugol (ver miscelánea de reactivos)



NaCl 0.85 % (ver miscelánea de reactivos)



Aplicador de madera



Cubreobjetos



Portaobjetos



Microscopio



Laminillas permanentes de las diversas especies.

Técnica: Coproparasitoscópico microscópico directo: 1. En un portaobjeto se colocan, separadamente, una gota de solución salina y otra de lugol.

2. Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcla con la solución salina.

3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.

4. Se coloca el cubreobjetos.

5. Se efectúa la misma operación en la gota del lugol y se observa.

Datos del parásito. a) Nombre del parásito _________________________________________________ b) A que grupo taxonómico pertenece _____________________________________ c) Estadío desarrollado _________________________________________________ d) A que órgano (s) sitio (s) invade o parásita _______________________________ e) Menciona que tipo de técnica se llevo a cabo, especificando si fue en fresco ó en tinción ___________________________________________________________ f) Describe las características y /o criterios morfológicos.

Manual de Parasitología General

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____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ Cuestionario 1. ¿Cuál es la fase Isospora belli en el ser humano? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 2. ¿Cuál es la vía de infección de Isospora belli? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 3. ¿Qué técnica se emplea para el diagnóstico de la Isosporiosis? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

Bibliografía: 1. - http://www.parasitologia.blogcindario.com/2007/05/00001-parasitologia.html - 63k 2.- wapedia.mobi/es/Ciliophora 3.- Becerri Flores, Romero Cabello (2004). Parasitología médica de las moléculas a la enfermedad. México, DF: McGraw-hill Interamericana.

4. De Haro Arteaga I., Salazar Schettino P., Cabrera Bravo M. (1995) “Diagnostico Morfológico de las Parasitosis” Editorial Méndez Editores. Segunda edición.

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Práctica No.11 Tinciones permanentes de parásitos Microunidad de competencia: Que el alumno se familiarice con las diferentes técnicas de tinción de parásitos para poder distinguirlos al microscopio y utilizarlas en el diagnóstico de manera ética y responsable.

Generalidades: En la mayoría de los casos los protozoarios intestinales se pueden observar bien con tinciones temporales, como en el caso de los exámenes directos con lugol, solución salina y sudán.

En algunas ocasiones es necesario teñir los parásitos en forma definitiva para obtener preparaciones permanentes; otras veces estas tinciones son necesarias por que se necesita distinguir algunas de sus estructuras celulares, utilizando tinciones especiales permanentes para poder observarse.

El inmunodiagnóstico puede realizarse recurriendo a las tinciones con anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes, permitiendo identificación más fácil.

Las preparaciones fecales permanentes son hechas por diferentes razones ya que proporcionan información sobre el material estudiado.

Una buena técnica de tinción debe reunir los siguientes requisitos: •

La coloración de las estructuras nucleares y citoplasmáticas debe ser selectiva.

•

Las soluciones que se utilizan deben ser fáciles de preparar

•

Deben tener la capacidad de teñir las diferentes fases del parásito en la misma muestra

•

Durante su realización se deben emplear el menor numero de soluciones

•

El paso en el cual se lleva a cabo diferenciación debe ser rápido.

Manual de Parasitología General

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•

Que presente una de las tonalidades para facilitar la identificación de estructuras parasitarias.

Independientemente del método que se elija se deben tener las siguientes precauciones para la obtención de mejores resultados.

•

No permitir que la preparación a teñir se seque durante el método de tinción.

•

Todas las soluciones empleadas deben estar perfectamente tapadas para evitar evaporación

•

Escurrir siempre el portaobjeto antes de introducirlo en la siguiente solución tocando el extremo por dos segundos con papel absorbente.

•

La solución de yodo se debe de cambiar de una a tres semanas; pero si al utilizarla se torna pálida se remplaza o se le adiciona más solución madre lugol.

•

Cuando se tiñe un gran número de portaobjeto el colorante se va diluyendo, afectando la calidad de la tinción.

•

Cuando se utilice el alcohol etílico absoluto o xilol en la tinción, se deben de mantener en frasco perfectamente cerrado para evitar que se hidraten.

•

Si su resina sintética se encuentran muy densos, adicione xilol y coloque l frasco a 37% para homogeneizar y utilizar hasta 24 horas

Técnicas: Preparaciones efímeras.

Son fáciles rápidas y útiles para poder observar, discriminar y diagnosticar estructuras parasitarias después de realizar los métodos coproparasitoscópicos (CPS): directo en fresco, de concentración/flotación (faust, Ferreira) o concentración sedimentación (Ritchie). La solución de lugol es de uso generalizado.

Lugol Técnica: a) El procedimiento consiste en colocar la muestra de materia fecal sobre un portaobjetos limpio y desengrasado b) Emulsionarla con una gota de lugol, cubrirla con cubreobjetos evitando la formación de burbujas d aire Manual de Parasitología General

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c) Observar al microscopio con los objetivos de 10x confirmando la observación con el objetivo 40x. d) Anotar resultados de la observación.

Preparaciones permanentes Para fijar trofozoitos flagelados (Trichomonas vaginalis, Giardia lamblia).

Técnica: 1. En una caja petri colocar un triangulo de la varilla de vidrio, y adicione unos cristales de yodo metálico 2. Con la ayuda de una pipeta deposite el material biológico (secreción vaginal, sedimento urinario) sobre un portaobjetos sin extenderlo introducir este porta en la caja petri con la gota resuspendida hacia abajo con la finalidad que los vapores de yodo fijen a los protozoarios dejar actuar de 5 a 10 segundos, hasta obtener una mezcla de color ámbar homogénea.

3. Sacar inmediatamente la preparación de la caja petri (cuidando de los vapores del yodo ya que fijan la retina del ojo).

4. Inmediatamente después, adicionar una gota de sangre con EDTA y realizar posteriormente un extendido sanguíneo delgado.

5. Dejar secar a temperatura ambiente y posteriormente fijarlo con metanol por un tiempo de 1 minuto.

6. Teñir la preparación con Giemsa o Wrigth según técnicas hematológicas7. Observar al microscopio con aceite de inmersión.

8. Las trichomonas teñidas se observan de coloración rosa tenue con flagelos oscuros.

9. Se tiene que realizar una dilución del colorante Giemsa o Wright por cada mililitro de colorante se adicionan 2 ml de agua destilada, se tiñe por 5 minutos.

10. Se monta con resina sintética o en su defecto con Entellan de Merck.

Merthiolate-yodo-formaldehído (MIF)

Manual de Parasitología General

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El MIF es fácil de hacer. Fija y tiñe en forma simultánea. Es un buen fijador de quistes, trofozoítos, huevo y larvas.

Técnica 1.- Homogenizar una muestra tamizada de un vial del producto biológico de protozoo en una relación de 1 ml de MIF más 2 ml de la suspensión del vial suspendido en formol al 10%.

2.- se homogeniza el vial, posteriormente se toma con una pipeta de transferencia 100 micro litros aproximadamente en un portaobjetos para después colocare el cubreobjetos.

3.- se lleva la preparación al microscopio en seco débil (10x) para buscar huevos, quistes o larvas 4.- la identificación se hace por las tonalidades de las propiedades de la eosina que contrasta la morfología nítida de los quistes, huevos o larvas.

Giardia lamblia 1. Poner una gota de material fecal o contenido duodenal.

2. Resuspenda sobre un portaobjetos y extienda la gota.

3. Deje secar a temperatura ambiente 4. Fije con metanol y dejar secar.

5. Tiña con Giemsa durante 45 minutos. (2ml de agua de la llave con 1 gota de solución madre de Giemsa).

6. Montar con Entellan de Merck.

Alcohol, formaldehído, ácido acético (AFA) El AFA se utiliza para conservar metazoarios (tremátodos y cestodos) Procedimiento para fijar tremátodos Para no dañar la morfología de los metazoarios, éstos se manipularán extremando cuidados, y antes de fijarlos hay que someterlos a una fase de relajación: Manual de Parasitología General

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a) Para relajarlos los trematodos se colocan en agua destilada durante 5 a 10 minutos (no dejar más de 20 minutos debido a que las estructuras internas se destruyen por la lisis osmótica). La incubación de los tremátodos adultos en agua también favorecen la salida de huevo, lo cual es benéfico debido a que se observarán mejor las estructuras internas. b) El espécimen se coloca entre dos portaobjetos en posición dorsoventral y se presionan con cuidado sin macerarlo. c) Por un extremo de los portaobjetos se seca el exceso de agua con una gasa; por el otro extremo se añade el fijador (AFA) y se deja reposar 10 minutos. d) Los trematodos se separan de los portaobjetos y se colocan en el fijador (AFA) durante 48 horas e) Se transfieren a un recipiente con etanol al 70%; en estas condiciones, los trematodos se pueden almacenar en forma permanente o quedan listos para la tinción.

Procedimiento para fijar cestodos Los cestodos, igual que los tremátodos, primero se relajan. a) Se colocan en agua destilada o solución isotónica a 37°C durante 5 a 30 minutos (más tiempo ocasionará lisis osmótica de varios órganos internos).

Otra opción es utilizar etanol al 5.0% a temperatura ambiente. b) Si el parásito es de un tamaño medio, se coloca entre dos portaobjetos en posición dorsoventral y se presionan con cuidado sin macerarlo. c) Por un extremo de los portaobjetos se seca el exceso de agua con una gasa; por el otro extremo se añade el fijador (AFA) y se deja reposar 30 minutos. d) El ejemplar se retira y se coloca en un recipiente con el fijador (AFA) durante 24 horas. e) Los cestodos se transfieren a un recipiente con etanol al 70%.

Procedimientos para fijar nemátodos.

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Para hacer una buena observación de las estructuras internas de los nematodos, éstos necesitan tinciones. Basta con un procedimiento adecuado para aclararlos y fijarlos. a) Debido a que el fijador puede contraer la estructura de los nematodos vivos, éstos se colocan durante 30 segundos en ácido acético glacial frío y después en etanol al 70%. b) Los nematos pueden almacenarse de manera permanente en etanol alo 70% con 5% de glicerol (que suaviza y aclara). Si se desean preparaciones fijas, entonces se usa el glicerogel.

Tinción tricrómica de Gomori-Wheatley Al principio la tinción de Gomori se utilizó en tejidos y Wheatley la uso en parásitos.

Este método es más rápido que el de hematoxilina férrica. Es útil para diferenciar protozoarios intestinales en donde se pueden ver algunos detalles del citoplasma y el núcleo. La tinción se puede hacer en frotis de muestra previamente preservadas en PVA o en frotis con muestras frescas y fijas con Schaudinn. (Para preparación de reactivos ver anexos) Fundamento Esta técnica combina un colorante plasmático (Cromotropo 2R) y un colorante de fibras conectivas (verde luz/azul de anilina) en una solución de ácido fosfotúngstico y ácido acético glacial. El tratamiento previo de las secciones con solución de Bouin caliente intensifica la tinción. El ácido fosfotúngstico favorece la coloración roja de músculo y citoplasmas. Las fibras de colágeno toman los iones de tungstato formando un complejo al que se une el verde luz. El baño de ácido acético hace los colores más trasparentes pero no altera el balance de color Procedimiento a) La preparación de las laminillas y la fijación se realizan de manera similar al descrito en la tinción de hematoxilina. b) Para eliminar el exceso de cloruro de mercurio del fijador de Schaudinn, las laminillas se colocan el alcohol 70%-yodo durante un minuto Manual de Parasitología General

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c) Se lavan dos veces con etanol al 70%, durante minutos. d) Las laminillas se colocan en solución concentrada durante 5 a 10 minutos e) Se transfieren a etanol al 90% con un 1% de ácido acético (10-15 segundos) f) Se sumergen dos veces en etanol absoluto. g) Se ponen en etanol absoluto durante 30 segundos h) Se meten en xileno durante un minuto. i) Las preparaciones se cubren con resina o bálsamo de Canadá, se les coloca un cubre objeto de numero 1 y se dejan secar.

Resultados 1. Fibras musculares, fibrina y citoplasma: rojo.

2. Colágeno, cartílago, mucinas y membranas basales: verde.

3. Núcleos: azul negruzco Nota: los portaobjetos se pueden teñir rápidamente pasando por una serie de frascos Coplin que contengan cada uno de los reactivos. Otra estrategia s usar un solo frasco Coplin, al que se le van cambiando los reactivos. Con cualquiera de esas dos maniobras se pueden colorear por lo menos 10 lamillas en un solo tren de tinción. Los protozoarios adquieren diferentes tonalidades. El fondo se ve sobre todo rojo o verde, en tanto que los protozoarios toman un color más neutro, casi siempre gris o verde pálido. Los cuerpos cromatoides y eritrocitos toman tanto el color rojo como el colorante verde con lo que se genera un fuerte contraste con el citoplasma.

Por lo regular los elementos nucleares se tiñen de un color más oscuro.

Ziehl-Neelsen La tinción para organismos resistentes al ácido y al alcohol se empezó a usar en parasitología cuando hicieron su aparición organismos oportunista de los géneros

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Crytosporidium, Cyclospora y otros más del grupo de los microsporidios. El procedimiento para realizar la tinción es muy sencillo.

Procedimiento: a) Sobre un portaobjeto se hace un frotis de heces, de preferencia delgado. b) La muestra se fija con metanol absoluto (la laminilla se cubre con metanol absoluto y se deja que el alcohol se evapore). c) Se cubre la preparación con un papel filtro (2X3 cm). d) Se aplican de 5 a 7 gotas de carbolfucsina para que el papel filtro que completamente húmedo, luego se calienta la laminilla hasta que produzca vapores (si que la laminilla se seque). Y se sigue aplicando la carbolfucsina durante 3 a 5 minutos. e) Con una pinza de disección se retira el papel filtro, se lava con agua y se deja que la laminilla se seque. f) Se decolora con alcohol-ácido hasta que no quede color en el lavado. g) Se lava la laminilla con agua de la llave. h) Luego se aplica el azul de metileno durante un minuto. i) Después se lava y se seca con el aire durante uno a 2 minutos. j) Observar con el objetivo de inmersión (100X) Hematoxilina férrica modificada La hematoxilina férrica es una de las técnicas de tinción más aceptada aunque el procedimiento es largo. Para obtener buenas tinciones se recomienda usar el fijador de Schaudinn.

Procedimiento: a) Hacer un frotis en un portaobjetos y emulsionarlos con solución salina isotónica: es necesario que la capa quede delgada. Antes de que las heces se sequen. Se fija con schaudinn durante 60 minutos (se puede dejar toda la noche en fijador). b) Par eliminar los cristales del cloruro de mercurio, las preparaciones se colocan en una solución de etanol al 70%-yodo durante 5 minutos. (la solución de alcohol-yodo se preparar añadiendo unas gotas de yodo al 3% al etanol al Manual de Parasitología General

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70%). Posteriormente en etanol al 95% y en etanol al 70% (en ambos pasos durante 5 minutos). Se lavan con agua durante 10 minutos. c) Los portaobjetos se colocan en solución de trabajo durante 5 minutos. d) Se lavan con agua durante 10 minutos. e) Se deshidratan en etanol al 70%, 95% y en etanol absoluto (cada paso será en 5 minutos). f) Las laminillas se transfieren a xileno durante 10 minutos. g) Las laminillas se cubren con bálsamo de Canadá, se coloca un cubreobjetos del numero 1 y deja secar.

En todos los pasos hay que evitar que las laminillas se sequen. El bálsamo de Canadá debe aplicarse cuando el portaobjeto todavía esta húmedo de xileno. En el paso de etanol absoluto a xileno se puede formar precipitados calizos; para evitarlos, se recomienda utilizar etanol absoluto y xileno nuevos. Si hay precipitado se deben repetir esos pasos.

Tinción de kinyoun para coccidios Fundamento: La observación de presencia o ausencia de B.A.A.R sin usar calor.

Técnica: 1. Realizar un extendido de heces frescas o conservadas en formaldehido al 10% sobre un portaobjeto y dejar secar al aire durante 20 minutos.

2. Fijar los extendidos colocando metanol durante 1 minuto y dejar secar al aire.

3. Colocar sobre el extendido un cuarto de papel filtro de manera que lo cubra en su totalidad y agregar el colorante carbol-fucsina, teñir durante 5 minutos, (no es necesario calentar).

4. Lavar con agua de la llave.

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5. Decolorar con alcohol ácido por goteo hasta que no escurra más colorante y lave ron agua de llave.

6. Cubrir los extendidos con azul de metileno durante un minuto, lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.

7. Observar al microscopio con el objetivo de 100x. si se quiere guardar la lámina hacer montaje con resina sintética.

Solución de azul de metileno de Loeffler: Fundamento: Se utilizan para observar morfología, agrupación, elementos celulares, leucocitos, células epiteliales, etc.

Técnica Disolver 0.3 gramos de azul de metileno en 30 ml de alcohol etílico al 95% y adicionar 100 ml de hidróxido de Potasio al 0.01%.

1. Extienda la muestra problema y dejar secar 2. Fije con metanol durante 1 minuto 3. Cubra el extendido con un cuadro de papel filtro, de manera que lo cubra en su totalidad.

4. Adicionar en frío la solución de Fucsina sobre el papel filtro, tiña por 5 minutos.

5. Enjuague con agua de la llave.

6. Decolore con alcohol etílico ácido por goteo hasta que no escurra colorante.

7. Enjuague con agua inmediatamente.

8. Adicione azul de metileno de Loeffler durante un minuto.

9. Lave con agua de la llave y deje secar.

10. Observe la precipitación en objetivo de 100x con aceite de inmersión-

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Cuestionario

1. ¿Por qué es necesario usar colorantes para teñir a los protozoarios parásitos? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 2. ¿Cuál es la diferencia entre tinciones efímeras y tinciones permanentes? ¿En qué circunstancias se recomienda se cada una de ellas? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ¿Por qué es necesario fijar las estructuras parasitarias? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 3. ¿Cuál es la solución fijadora que se utiliza con mayor frecuencia para las preparaciones permanentes del frotis de heces? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

Bibliografía: 1.

http://bvs.minsa.gob.pe/archivos/INS/165_NT37.pdf

2. Becerri Flores, Romero Cabello (2004). Parasitología médica de las moléculas a la enfermedad. México, DF: McGraw-hill Interamericana.

3. Francisco Trujillo Contreras, Ángeles Villanueva Yerenas, Miguel Raygoza Anaya (2001). Enfermedades Parasitarias. Guadalajara, Jal.: Ediciones Cuéllar.

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ANEXO NO. 1 MISCELÁNEA DE REACTIVOS: a) Merthiolate-yodo-formaldehído (MIF) Solución concentrada: Tintura de merthiolate Formaldehído USP Glicerina Agua destilada

200.0ml 25.0 ml 5.0 ml 250.0 ml

Solución de yodo (lugol): Yoduro de potasio

10.0g

Yodo cristaloide

5.0g

Agua destilada

100.0ml Manual de Parasitología General

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Solución de trabajo: Solución concentrada

2.35 ml

Solución de yodo

0.15 ml

Solución concentrada. El merthiolate (No.99 Lilly 1:1000) se homogeneiza con el formaldehído, glicerina y agua. La solución se almacena en un frasco ámbar y puede durar hasta un año.

La solución de yodo tiene un tiempo de vida corto (menos de una semana) por tal razón se debe preparar sólo la necesaria y almacenarla en frascos de color ámbar.

La solución de trabajo se prepara en el momento en que se va a preservar la muestra. En un recipiente se mezcla la muestra de matera fecal con la solución de trabajo, pero conservando una relación de 1:3-5 (muestra: MIF). b) Hematoxilina férrica modificada Solución concentrada A Hematoxilina

10.0 g

Etanol absoluto 1000.0ml Solución concentrada B Sulfato ferroso de amonio

10.0g

Sulfato férrico de amonio

10.0g

Ácido clorhídrico

10.0 ml

Agua destilada

1000.0 ml

Las soluciones se almacenan a temperatura ambiente y su vida media es de 6 meses.

Solución de trabajo Solución concentrada A

15ml

Solución concentrada B

15ml

La solución de trabajo tiene vida media de 7 días c) Solución de formalina o formaldehído al 10 % Reactivos: Formalina Agua de la llave Procedimiento: Se mezclan 10 ml de formalina y 90 ml de agua de la llave, se envasa en frascos con tapón de plástico.

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La solución de formalina al 10 %, esta indicada para preservar muestras en la cuales se desconoce su contenido parasitario, se recomienda esta solución, aunque los huevos de áscaris y tricocéfalos siguen en desarrollo, esto no importa para su identificación posterior.

Para usar adecuadamente esta solución, se mezcla una parte de heces con 3 de la misma.

Debido que el formol es el conservador ideal para quistes, huevos y larvas, se debe de escoger la parte más consistente de la muestra. d) Lugol parasitológico Reactivos: Yodo cristaloide Yoduro de potasio Procedimiento: Se disuelven 10 grs. de yoduro de potasio en 100ml de agua destilada y enseguida se agregan 5 grs. de yodo cristaloide, se agita constantemente para que se disuelva la mayor cantidad posible, se guarda el frasco ámbar. No importa que quede exceso de yodo en el fondo; esto se hace para que la solución permanezca con la concentración deseada durante mucho tiempo e inclusive se puede reintegrar el volumen con adición de agua destilada. e) Solución salina isotónica Reactivos: Agua destilada Cloruro de sodio Procedimiento: Se pesan 8.5 de NaCl, se disuelve en agua destilada y se completa el volumen a 1000 ml en matraz volumétrico. f) Solución saturada de NaCl (salmuera) Reactivos: Cloruro de sodio comercial, resulta más práctico y económico utilizar sal de cocina.

Agua Procedimiento: En un recipiente de 1 litro, se vierte agua hasta la mitad y se agrega suficiente cloruro de sodio para que se haga una solución sobre saturada, o sea que quede exceso de la sal sin

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disolver en el fondo; el sobrenadante es el que se deberá utilizar. Para acelerar la disolución, se puede calentar la mezcla y se deja enfriar; el exceso de la sal cristalizará. g) solución de alcohol etílico al 70 % Reactivos: Alcohol etílico absoluto Agua Procedimiento: Se disuelven 30 ml de alcohol etílico absoluto en 70 ml de agua de la llave y se guarda en un frasco con tapón. h) hematoxilina concentrada Reactivos: Sulfato doble de aluminio y amonio Alcohol metílico absoluto Glicerina Procedimiento: Primero se va a realizar la solución acuosa saturada de alumbre de amonio. Se solubiliza el sulfato doble de aluminio y amonio en un recipiente, se pone a calentar y se agrega sal, hasta su disolución, cuando se enfría la solución el exceso cristalizara, se utiliza el sobrenadante.

Enseguida se pesan 4 grs. de hematoxilina, se disuelven en 25 ml de alcohol y se añaden 400 ml de la solución de de alumbre de amonio, se deja madurar la solución con el tapón flojo y a la luz del sol durante 15 días, pasados los cuales se agregan 100 ml de alcohol metílico absoluto y 100 ml de glicerina, ambos químicamente puros. Se vuelven a guardar, ahora durante un mes expuesta a la luz solar. Antes de usarla deberá filtrarse. i) solución buffer de fosfatos Reactivos: Fosfato monopotásico Fosfato disódico Procedimiento: Se pesan 0.49 grs. de fosfato monopotásico y 1.14 de fosfato di sódico, se mezclan y se disuelven hasta completar un volumen de 1000 ml en un matraz volumétrico.

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j) solución de trabajo Giemsa Reactivos: Colorante de Giemsa en polvo Glicerina QP. Alcohol metílico Solución buffer de fosfato Procedimiento: Primero se va a realizar la solución madre de giemsa. Se pesan 3.8 grs. de giemsa en polvo, se coloca en un mortero de 500 ml, se agregan 250 ml de glicerina, mientras que con el pistilo se mezcla con mucho cuidado hasta que homogeneice y no haya grumos. Se agregan 250 ml de alcohol metílico absoluto libre de acetona. Se dejan 100 ml de alcohol sin incorporar. La mezcla se vacía en un frasco oscuro, con el resto del alcohol se enjuaga el mortero y el pistilo de tal manera que no queden restos del colorante.

Después de haber realizado la solución madre de giemsa, se mezcla volumen a volumen con la solución buffer de fosfato. k) Colorante de wright Reactivos: Colorante de wright en polvo Alcohol metílico absoluto, libre de acetona.

Procedimiento: Se pesan 0.60 grs. de colorante de wright y se disuelven en 360 ml de alcohol metílico absoluto y libre de acetona. l) Alcohol, formaldehído, ácido acético (AFA) Reactivos Etanol (95%)

30.0ml

Formaldehído

10.0 ml

Agua destilada

50 ml

Ácido acético glacial

10.0ml

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La mezcla de etanol, formaldehído y agua destilada dura varios meses. Cuando se agrega el ácido acético dura un mes. m) Ziehl-Neelsen Carbolfucsina Solución A Fucsina básica

0.3g

Etanol (95%)

10.0 ml

Solución B Fenol (cristales fundidos) 5.0g Agua destilada

95.0ml

Se mezclan las dos soluciones y antes de su uso se dejan reposar una semana n) Azul de metileno alcalino de Loêffler Solución A Azul de metileno

0.3g

Etanol (95%)

30.0 ml

Solución B Hidróxido de potasio (0.10% peso)

100ml

Se mezclan las dos soluciones. o) Alcohol ácido Ácido clorhídrico (HCl)

3.0 ml

Etanol (95%9

97.0 ml

Primero se vierte el etanol y se le agrega después el HCl; la reacción provoca calor.

p) Solución de formalina al 5%.

Se mezclan 5 ml de formalina y 95 ml de agua de la llave, se envasa en frascos con tapón de plástico.

La solución de formalina al 10%, está indicada para preservar muestras en las cuales se desconoce su contenido parasitario, se recomienda esta solución, aunque losa huevos de áscaris y tricocéfalos siguen en desarrollo, esto no importa para su identificación posterior.

Para usar adecuadamente esta solución, se mezcla una parte de heces con tres de la misma. Debido a que el formol es el conservador ideal para quistes, huevos y larvas, se debe de escoger la parte más consistente de la muestra.

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q) Fijador de fenol alcohol y formol (PAF) Esta solución se puede utilizar en lugar del formol; conserva adecuadamente trofozoítos y quistes de protozoos, así como huevos y larvas

de helmintos. El material previamente

preservado con PAF, se puede utilizar para hacer lecturas inmediatas

con o sin tinción

temporal, pues si no se utiliza ésta, los núcleos se ponen perfectamente de manifiesto para observarse sin otro tipo de manipulación. En el caso de que se desee hacer tinciones de tipo temporal se recomienda el uso de colorantes como el azul de metileno o el de tionina.

Como el primero se encuentra prácticamente en cualquier laboratorio, en este caso se indica la forma de preparación de la solución de contraste con este fijador. Si se desea utilizar tionina, se prepara de manera semejante.

ANEXO 2. IMÁGENES

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