ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Μέθοδοι για την εργαστηριακή διερεύνηση της λειτουργικότητας των αιµοπεταλίων Αλέξανδρος Δ. Τσελέπης, MD, PhD Καθηγητής Βιοχηµείας - Κλινικής Χηµείας
Platelet Aggregation
Διαπερατότητα, %
0.5 µΜ ADP
1.0 µΜ ADP
2.5 µΜ ADP
5.0 µΜ ADP
1 min
10 µΜ ADP
Χρόνος, min
Υπολοιπόµενη Αιµοπεταλιακή Ενεργότητα Θεραπευτικό παράθυρο
Mahla E, et al. JACC;2009:857–9
Υπολοιπόµενη Αιµοπεταλιακή Ενεργότητα
Φαρµακοκινητικές µέθοδοι
ABCB1
Φασµατοµετρία Μάζας Το συνολικό ιόν της κλοπιδογρέλης
Φάσµα MS της κλοπιδογρέλης Φάσµα MS2 του κύριου ιόντος m/z 322
Πορεία θραυσµατοποίησης της κλοπιδογρέλης
κύριο ιόν m/z 322
Φάσµα MS2 του κύριου ιόντος m/z 322
Πρότυπο του ανενεργού µεταβολίτη SR26334 Το συνολικό ιόν MRM σε buffer του SR26334 σε συγκέντρωση 5 µg/ ml (Rt = 0.6 min)
: ΦάσµαMS Φάσµα MS2 2του τουκύριου κύριουιόντος ιόντοςm/z m/z 322 308
Φάσµα MS2 του κύριου ιόντος m/z 308
κύριο θυγατρικό ιόν m/z 198
The clopidogrel-induced platelet inhibition are improved in clopidogrel non-responders at 30 days of therapy with 75 mg/day
Responders
Nonresponders
Kalantzi KI, et al. J Thromb Haemost. 2011;9:875-878
Φαρµακοδυναµικές µέθοδοι
Platelet function tests for the detection of Clopidogrel resistance
Michelson AD, et al. Am J Cardiol 2006;98[suppl]:4N–10N
Platelet function tests for the detection of Aspirin resistance
Michelson AD, et al. Am J Cardiol 2006;98[suppl]:4N–10N
<>
Whole Blood/Optical Lumi-Aggregometer (Chrono-log)
Light transmittance aggregometry (LTA) Whole blood aggregometry (Electrical impedance aggregometry) ATP release by the luminescence method
Platelet Aggregation PRP
Whole blood
Ανταπόκριση των αιµοπεταλίων στην Κλοπιδογρέλη σε ACS ασθενείς Ασπιρίνη: 75mg/ ηµέρα, Κλοπιδογρέλη: 300mg, 75mg/ηµέρα Αντίσταση 10 µΜ ADP
Φυσιολογική ανταπόκριση
30 ηµέρες
πριν την κλοπιδογρέλη
5 ηµέρες
<>
Flow Cytometer (FACSCalibur)
Pathways Activated Following Stimulation of P2Y12 by ADP
VASP: Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein
Kleiman NS, et al. JACC. 2008; 51: 1412-1414
VASP Test
Anti-VASP-P mAb (Flow Cytometry)
Platelet Reactivity Index (PRI)
PRI: Kακή ανταπόκριση στην κλοπιδογρέλη PRI: Καλή ανταπόκριση στη κλοπιδογρέλη)
VASP test: Kακή ανταπόκριση στην κλοπιδογρέλη Mab VASP-P, PGE1
Mab VASP-P, PGE1+ADP
PRI = 74%
Αρνητικό control, PGE1+ADP
VASP analysis with Flow Cytometry Clopidogrel responder PRI= 17,6%
Clopidogrel nonresponder PRI= 76,4%
P-selectin and PAC-1 with Flow Cytometry
Study design
VASP index was measured 24 h after the first 600-mg bolus of clopidogrel
Bonello et al. JACC 2008;51:1404â&#x20AC;&#x201C;11
Effects of Each Additional Bolus of Clopidogrel on the VASP Index in the VASP-Guided Group
After the initial dose up to 3 additional boluses of 600 mg may be given in 24 h increments. The VASP index was assessed after 12 h until a VASP index below 50% was obtained Bonello et al. J Am Coll Cardiol 2008;51:1404â&#x20AC;&#x201C;11
Kaplan-Meier Analysis for 30-Day Major Adverse Cardiovascular Events (MACE) VASP-guided group
Control group
Bonello et al. J Am Coll Cardiol 2008;51:1404â&#x20AC;&#x201C;11
Point of care platelet function testing
Platelet function assays for the bedside evaluation of antiplatelet therapy
Price M. Circulation 2009; 119: 2625-2632
Determination of platelet function with the VerifyNow system
Simple - Whole blood, samples require no preparation for analysis Rapid - Platelet response is reported in 5 min or less Results in P2Y12 reaction units (PRU) Is not usable in the presence of GPIIb/IIIa inhibitors CV < 8% in volunteers and <3.2% in CAD patients The diagnostic performance by receiver-operating characteristics curve (ROC) analysis
Prospective Studies Examining the Relationship Between the VerifyNow Assay and Clinical Outcome After PCI
Price M. Circulation 2009; 119: 2625-2632
Relation between CV event rates and residual platelet reactivity after clopidogrel exposure stratified by quartile (Q) of PRU in 3 prospective observational studies using the VerifyNow assay CV death, MI, TVR, 30 d
CV death, MI, 12 mo
CV death, MI, ST, 6 mo
Price M. Circulation 2009; 119: 2625-2632
Multiple electrode platelet aggregometry (MEA) (Dynabyte, Munich, Germany)
Platelet Function Assay (PFA-100® System)
The PFA-100 System quickly and easily measures platelet plug formation on a collagen/ADP or collagen/epinephrin-coated membrane under high-shear flow in a small whole blood sample (800 µL) and reports a ”closure time” of an apetrure in 5–8 min Assesses the platelet dysfunction due to the effect of Aspirin It can not distinguish thienopyridine effect
<>
Plateletworks (Helena Laboratories)
Plateletworks ADP Kit
Plateletworks Collagen Kit
Plateletworks Arachidonic Acid Kit
ICHOR速 Hematology Analyzer
<>
Thromboelastography Platelet Mapping (Hemoscope Corp.)
Correlations between the maximal aggregation (%) of LTA with various platelet assays
Gremmel T, et al. Thromb Haemost 2009; 101: 333â&#x20AC;&#x201C;339
Prevalence of aspirin resistance determined by various platelet function assays
Lordkipanidze M. Eur Heart J 2007;28:1702-1708
Εργαστηριακά κριτήρια ορισµού της αντίστασης στην κλοπιδογρέλη PRI >50%, µε τη µέθοδο VASP PRU >235-240, µε τη συσκευή Verify Now P2Y12 MPA (Maximal Platelet Aggregation) >46% στα 5-µmol/l ΑDP, µε τη µέθοδο LTA >468 units/min µετά από ενεργοποίηση µε ADP µε τη συσκευή Multiplate analyzer.
Bonello L. J Am Coll Cardiol. 2010; 56: 919-33
Pharmacogenetis
20-30% στους Καυκάσιους
Varenhorst Ch, et al. Eur Heart J. 2009;30:1744–1752
Association between the CYP2C19*2 Reduced-Function Allele and the Primary Efficacy Outcome or Stent Thrombosis in Subjects Receiving Clopidogrel
Mega JL, et al. N Engl J Med 2009;360:354-62
CYP2C19*17 genotypes Platelet aggregation
Incidence of TIMI bleedings
Sibbing D, et al. Circulation. 2010;121:512-518
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ I Η ελλιπής ανταπόκριση στη θεραπεία µε αντιαιµοπεταλιακά φάρµακα αποτελεί παράγοντα κινδύνου για ισχαιµικά επεισόδια µετά από PCI Ο έλεγχος της λειτουργίας των αιµοπεταλίων στην κλινική πράξη στις καρδιολογικές κλινικές προσφέρει σηµαντική βοήθεια στη διάγνωση της ελλιπούς ανταπόκρισης των ασθενών στην αντιαιµοπεταλιακή αγωγή Επίσης ο έλεγχος της λειτουργίας των αιµοπεταλίων είναι χρήσιµος οδηγός για τη διαπίστωση του κατάλληλου χρόνου χειρουργικής επέµβασης µετά τη διακοπή της αντιαιµοπεταλιακής θεραπείας Οι µέθοδοι ελέγχου της λειτουργικότητας των αιµοπεταλίων πρέπει να είναι αξιόπιστες και έγκυρες, εύκολες στη χρήση τους, να καθορίζουν µε ακρίβεια τις τιµές του διαγνωστικού cutoff και να µην έχουν υψηλό κόστος
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ IΙ Καµία µέθοδος µέχρι στιγµής δεν πληρεί όλες τις παραπάνω προϋποθέσεις Προοπτικές τυχαιοποιηµένες µελέτες που έχουν ως στόχο να διερευνήσουν εάν ο έλεγχος της αιµοπεταλιακής λειτουργίας µπορεί επαρκώς και µε ασφάλεια να οδηγήσει στην επιλογή της κατάλληλης αντιαιµοπεταλιακής αγωγής µε στόχο τη µείωση των θροµβωτικών επεισοδίων σε ασθενείς υψηλού κινδύνου, βρίσκονται σε εξέλιξη