Tselepis 1

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Μέθοδοι για την εργαστηριακή διερεύνηση της λειτουργικότητας των αιµοπεταλίων Αλέξανδρος Δ. Τσελέπης, MD, PhD Καθηγητής Βιοχηµείας - Κλινικής Χηµείας

Platelet Aggregation

Διαπερατότητα, %

0.5 µΜ ADP

1.0 µΜ ADP

2.5 µΜ ADP

5.0 µΜ ADP

1 min

10 µΜ ADP

Χρόνος, min

Υπολοιπόµενη Αιµοπεταλιακή Ενεργότητα Θεραπευτικό παράθυρο

Mahla E, et al. JACC;2009:857–9

Υπολοιπόµενη Αιµοπεταλιακή Ενεργότητα

Φαρµακοκινητικές µέθοδοι

ABCB1

Φασµατοµετρία Μάζας Το συνολικό ιόν της κλοπιδογρέλης

Φάσµα MS της κλοπιδογρέλης Φάσµα MS2 του κύριου ιόντος m/z 322

Πορεία θραυσµατοποίησης της κλοπιδογρέλης

κύριο ιόν m/z 322

Φάσµα MS2 του κύριου ιόντος m/z 322

Πρότυπο του ανενεργού µεταβολίτη SR26334 Το συνολικό ιόν MRM σε buffer του SR26334 σε συγκέντρωση 5 µg/ ml (Rt = 0.6 min)

: ΦάσµαMS Φάσµα MS2 2του τουκύριου κύριουιόντος ιόντοςm/z m/z 322 308

Φάσµα MS2 του κύριου ιόντος m/z 308

κύριο θυγατρικό ιόν m/z 198

The clopidogrel-induced platelet inhibition are improved in clopidogrel non-responders at 30 days of therapy with 75 mg/day

Responders

Nonresponders

Kalantzi KI, et al. J Thromb Haemost. 2011;9:875-878

Φαρµακοδυναµικές µέθοδοι

Platelet function tests for the detection of Clopidogrel resistance

Michelson AD, et al. Am J Cardiol 2006;98[suppl]:4N–10N

Platelet function tests for the detection of Aspirin resistance

Michelson AD, et al. Am J Cardiol 2006;98[suppl]:4N–10N

<>

Whole Blood/Optical Lumi-Aggregometer (Chrono-log)

Light transmittance aggregometry (LTA) Whole blood aggregometry (Electrical impedance aggregometry) ATP release by the luminescence method

Platelet Aggregation PRP

Whole blood

Ανταπόκριση των αιµοπεταλίων στην Κλοπιδογρέλη σε ACS ασθενείς Ασπιρίνη: 75mg/ ηµέρα, Κλοπιδογρέλη: 300mg, 75mg/ηµέρα Αντίσταση 10 µΜ ADP

Φυσιολογική ανταπόκριση

30 ηµέρες

πριν την κλοπιδογρέλη

5 ηµέρες

<>

Flow Cytometer (FACSCalibur)

Pathways Activated Following Stimulation of P2Y12 by ADP

VASP: Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein

Kleiman NS, et al. JACC. 2008; 51: 1412-1414

VASP Test

Anti-VASP-P mAb (Flow Cytometry)

Platelet Reactivity Index (PRI)

PRI: Kακή ανταπόκριση στην κλοπιδογρέλη PRI: Καλή ανταπόκριση στη κλοπιδογρέλη)

VASP test: Kακή ανταπόκριση στην κλοπιδογρέλη Mab VASP-P, PGE1

Mab VASP-P, PGE1+ADP

PRI = 74%

Αρνητικό control, PGE1+ADP

VASP analysis with Flow Cytometry Clopidogrel responder PRI= 17,6%

Clopidogrel nonresponder PRI= 76,4%

P-selectin and PAC-1 with Flow Cytometry

Study design

VASP index was measured 24 h after the first 600-mg bolus of clopidogrel

Bonello et al. JACC 2008;51:1404â&#x20AC;&#x201C;11

Effects of Each Additional Bolus of Clopidogrel on the VASP Index in the VASP-Guided Group

After the initial dose up to 3 additional boluses of 600 mg may be given in 24 h increments.

The VASP index was assessed after 12 h until a VASP index below 50% was obtained Bonello et al. J Am Coll Cardiol 2008;51:1404â&#x20AC;&#x201C;11

Kaplan-Meier Analysis for 30-Day Major Adverse Cardiovascular Events (MACE) VASP-guided group

Control group

Bonello et al. J Am Coll Cardiol 2008;51:1404â&#x20AC;&#x201C;11

Point of care platelet function testing

Platelet function assays for the bedside evaluation of antiplatelet therapy

Price M. Circulation 2009; 119: 2625-2632

Determination of platelet function with the VerifyNow system

Simple - Whole blood, samples require no preparation for analysis Rapid - Platelet response is reported in 5 min or less Results in P2Y12 reaction units (PRU) Is not usable in the presence of GPIIb/IIIa inhibitors CV < 8% in volunteers and <3.2% in CAD patients The diagnostic performance by receiver-operating characteristics curve (ROC) analysis

Prospective Studies Examining the Relationship Between the VerifyNow Assay and Clinical Outcome After PCI

Price M. Circulation 2009; 119: 2625-2632

Relation between CV event rates and residual platelet reactivity after clopidogrel exposure stratified by quartile (Q) of PRU in 3 prospective observational studies using the VerifyNow assay CV death, MI, TVR, 30 d

CV death, MI, 12 mo

CV death, MI, ST, 6 mo

Price M. Circulation 2009; 119: 2625-2632

Multiple electrode platelet aggregometry (MEA) (Dynabyte, Munich, Germany)

Platelet Function Assay (PFA-100® System)

The PFA-100 System quickly and easily measures platelet plug formation on a collagen/ADP or collagen/epinephrin-coated membrane under high-shear flow in a small whole blood sample (800 µL) and reports a ”closure time” of an apetrure in 5–8 min Assesses the platelet dysfunction due to the effect of Aspirin It can not distinguish thienopyridine effect

<>

Plateletworks (Helena Laboratories)

Plateletworks ADP Kit

Plateletworks Collagen Kit

Plateletworks Arachidonic Acid Kit

ICHOR速 Hematology Analyzer

<>

Thromboelastography Platelet Mapping (Hemoscope Corp.)

Correlations between the maximal aggregation (%) of LTA with various platelet assays

Gremmel T, et al. Thromb Haemost 2009; 101: 333â&#x20AC;&#x201C;339

Prevalence of aspirin resistance determined by various platelet function assays

Lordkipanidze M. Eur Heart J 2007;28:1702-1708

Εργαστηριακά κριτήρια ορισµού της αντίστασης στην κλοπιδογρέλη PRI >50%, µε τη µέθοδο VASP PRU >235-240, µε τη συσκευή Verify Now P2Y12 MPA (Maximal Platelet Aggregation) >46% στα 5-µmol/l ΑDP, µε τη µέθοδο LTA >468 units/min µετά από ενεργοποίηση µε ADP µε τη συσκευή Multiplate analyzer.

Bonello L. J Am Coll Cardiol. 2010; 56: 919-33

Pharmacogenetis

20-30% στους Καυκάσιους

Varenhorst Ch, et al. Eur Heart J. 2009;30:1744–1752

Association between the CYP2C19*2 Reduced-Function Allele and the Primary Efficacy Outcome or Stent Thrombosis in Subjects Receiving Clopidogrel

Mega JL, et al. N Engl J Med 2009;360:354-62

CYP2C19*17 genotypes Platelet aggregation

Incidence of TIMI bleedings

Sibbing D, et al. Circulation. 2010;121:512-518

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ I Η ελλιπής ανταπόκριση στη θεραπεία µε αντιαιµοπεταλιακά φάρµακα αποτελεί παράγοντα κινδύνου για ισχαιµικά επεισόδια µετά από PCI Ο έλεγχος της λειτουργίας των αιµοπεταλίων στην κλινική πράξη στις καρδιολογικές κλινικές προσφέρει σηµαντική βοήθεια στη διάγνωση της ελλιπούς ανταπόκρισης των ασθενών στην αντιαιµοπεταλιακή αγωγή Επίσης ο έλεγχος της λειτουργίας των αιµοπεταλίων είναι χρήσιµος οδηγός για τη διαπίστωση του κατάλληλου χρόνου χειρουργικής επέµβασης µετά τη διακοπή της αντιαιµοπεταλιακής θεραπείας Οι µέθοδοι ελέγχου της λειτουργικότητας των αιµοπεταλίων πρέπει να είναι αξιόπιστες και έγκυρες, εύκολες στη χρήση τους, να καθορίζουν µε ακρίβεια τις τιµές του διαγνωστικού cutoff και να µην έχουν υψηλό κόστος

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ IΙ Καµία µέθοδος µέχρι στιγµής δεν πληρεί όλες τις παραπάνω προϋποθέσεις Προοπτικές τυχαιοποιηµένες µελέτες που έχουν ως στόχο να διερευνήσουν εάν ο έλεγχος της αιµοπεταλιακής λειτουργίας µπορεί επαρκώς και µε ασφάλεια να οδηγήσει στην επιλογή της κατάλληλης αντιαιµοπεταλιακής αγωγής µε στόχο τη µείωση των θροµβωτικών επεισοδίων σε ασθενείς υψηλού κινδύνου, βρίσκονται σε εξέλιξη