In Vitro

ENRAIZAMIENTO IN VITRO Fisiología del enraizamiento

En números anteriores vimos como podíamos reducir las condiciones estériles del cultivo in Vitro gracias al uso de agua oxigenada. También vimos los diferentes usos que se le pueden dar a este tipo de cultivo, centrándonos especialmente en la micropropagación. Ya que el enraizamiento es una etapa indispensable en cualquier sistema de reproducción vegetativa, estudiaremos los procesos fisiológicos de la misma. Posteriormente realizaremos un ensayo práctico, teniendo en cuenta algunos de los principios aprendidos.

Bud Spencer

Clasificación de las raíces

Las principales funciones de la raíz son las de fijar la planta al suelo así como las de absorción de agua y nutrientes.

Según su procedencia se pueden clasificar en tres tipos:

Embrional: Cuando procedente de la radícula del embrión. Lateral: Cuando se desarrolla a partir de otra raíz. Adventicia: Cuando se desarrollan en un tallo u otra parte de la planta que no sea una raíz.

Los sistemas radiculares se pueden categorizar por su forma de desarrollo:

Pivotante: Formado por una raíz principal y varias raíces laterales. Es el que forma una planta procedente de semilla. Fasciculado: Formado por un conjunto de de raíces de aproximadamente del mismo diámetro, sin raíz principal. Es el que forma una planta procedente de esqueje.

ubicados, uno en el extremo del tallo y otro en el extremo de la raíz, por lo que también se les denomina meristemos apicales. Son los responsables del crecimiento en longitud y de la formación de nuevos meristemos primarios. Meristemos secundarios: Se forman en la etapa postembrionaria y es una delgada capa de células que se ubica en los tallos y las raíces, entre los haces vasculares del centro y la corteza del exterior. Son los responsables del crecimiento en grosor formando nuevos haces vasculares en un sentido (cámbium) y nueva corteza en el otro (felógeno). También son los principales responsables de la formación de raíces adventicias.

Estos meristemos responden de forma distinta ante distintas concentraciones hormonales. Así pues, las auxinas producidas por la yema apical de cada rama se translocan en sentido descendente, inhibiendo la brotación de las yemas axilares. Esta inhibición será mayor cuanto más cerca esté se esté de la yema apical ya que existe un gradiente en la concentración de la hormona, siendo mayor en este punto.

Otro caso sería la aplicación exógena de auxina a los tallos de los esquejes. Estas hormonas por lo general tienen baja movilidad, por lo que sólo actúan sobre la zona tratada, fomentando en este caso que las células del meristemo secundario del tallo se diferencien para producir raíces.

Fisiología del enraizamiento

Los meristemos son aquellas zonas de la planta que poseen células sin diferenciar, que son capaces de transformarse en cualquier otra célula vegetal y que son responsables del nuevo crecimiento. Existen dos tipos de meristemos:

Meristemos primarios: Se forman originalmente en el embrión y están

Material necesario.

Factores que influyen en el enraizamiento

Factores ambientales: o Temperatura: La tempera tura óptima del medio de enraizamiento es de unos 25ºC. Una temperatura ambiental pocos gra dos más baja que la del medio de enrai zamiento favorece el enraizamiento. o Humedad: Los explantos, al carecer de sistema radicular, necesitan obtener el agua a través de la humedad ambien tal. o Iluminación: Favorece el enraiza- miento si no es excesi va.

Características del explanto: o Presencia de hojas: Efecto estimu- lante debido a la pro ducción de carbo hidratos y auxinas. o Longitud: Favorece el enraiza miento ya que a mayor logitud, mayor número de hojas y yemas productoras de auxinas. o Grosor: A más grosor mayor facili dad de enraizamiento ya que habrá más reservas de car bohidratos en forma de almi dón, pero si se utiliza hormona de enraizamiento tendrá menor penetración.

Estado de la planta madre: o Juvenilidad: La capacidad para formar raíces disminuye con la edad de la planta. o Cantidad de nitrógeno: Su reduc- ción fomenta la formción de raíces.

o Cantidad de fósforo, potasio,

magnesio y calcio: Su carencia inhibe la formación de raíces. o Ahilamiento: Es el alarga miento de los nudos por falta de luz. Esto pro mueve el enrai zamiento ya que estimula leve mente la producción de aunas. o Etapa de desarrollo: Enraizaran más fácilmente los explantos de una planta en la etapa vegetativa que los de una en floración.

Lugar de corte : o Ramas laterales: Tienen mayor facilidad para enraizar, sobre todo cuanto más aleja das estén de los ápices de creci miento.

Anatomía de la raíz

Transversalmente una raíz se compone de diferentes capas:

Tejido vascular: Ubicado en el centro, donde se encuentran el xilema, un tejido encargado de transportar agua y nutrientes minerales (sabia bruta) en sentido ascendente, y el floema, encargado de transportar agua y azúcares producidos por las hojas (sabia elaborada) en sentido descendente. Periciclo: Es una capa de células que pueden desdiferenciarse para multiplicarse y volverse a diferenciar para formar raíces laterales, que atravesarán el resto de capas hasta llegar al exterior, formando una “ramificación” en la raíz de la que proceden. Estás células también formarán los meristemos secundarios. Endodermis: También está formada por una sola capa de células, cuyas paredes están recubiertas de suberina, una sustancia impermeable, por lo que el agua no puede atravesarlas, la función de este tejido es la de regular el paso de sustancias hacia el interior. Parénquima cortical: Está formado siempre por varias capas de células y ocupa el mayor volumen de la raíz.

Su función es la del almacenamiento de reservas. Epidermis: Es el tejido externo, por el que se absorben el agua y los nutrientes, principalmente a través de los pelos absorbentes que desarrolla.

Longitudinalmente pueden distinguirse las siguientes zonas:

Caliptra: Formada por un conjunto de células en el extremo de la raíz que protegen el meristemos apical de la misma. Zona meristemática: Formada por el meristemo apical. Zona de crecimiento: Formada por células meristemáticas que se han diferenciado y alargado, produciendo un aumento de longitud. Zona pilífera: La epidermis de esta zona contiene muchos pelos absorbentes y se demoniza rizodermis. Zona suberificada: La suberificación consiste en la formación en la epidermis de láminas de suberina, un polímero con funciones de barrera que conforma lo que se conoce como exodermis.

Explantos preparados.

Enraizamiento in Vitro

En el caso del cultivo in Vitro se suele añadir una auxina al medio de enraizamiento. Normalmente se utilizan: ácido indolbutírico (IBA), ácido naftalenacético (NAA) o ácido indolacético (IAA), pero este último tiene una acción más débil y se descompone con la luz.

Hay que tener en cuenta que estos compuestos son termolábiles, es decir, que se alteran con el calor, por lo que tendrán que introducirse después de la esterilización, una vez el medio se haya enfriado lo suficiente.

Para evitar la introducción de patógenos en el medio estéril, deben aplicarse mediante microfiltración.

Caso práctico

Hay que tener en cuenta que el material que vamos a enraizar procede de madres cultivadas ex Vitro, que poseen cutículas y estructuras lignificadas que impiden la infección de sus tejidos. No incluiremos

Crecimiento radicular.

nutrientes al medio para evitar que los posibles microorganismos que puedan invadirlo, tengan a su alcance una fuente de nitrógeno asimilable. Además le añadiremos agua oxigenada, que como ya hemos visto en otra ocasión, ayuda a mantenerlo libre de contaminaciones.

En caso de utilizar material cultivado in Vitro habrá que trabajar en condiciones estériles y añadir la hormona al medio de enraizamiento como se ha explicado anteriormente.

Para el desarrollo del experimento utilizaremos el siguiente material:

PH Down. Medidor de pH. Agar. Báscula. Vaso de precipitados. Varilla de vidrio. Agua oxigenada 10 vol. (3% H202). Jeringuilla de 10 ml. Tubos de ensayo de 20 ml. Gradilla (soporte para los tubos). Papel de aluminio. Tijeras. Pinzas largas. Tubo Eppendorf. Hormona de enraizamiento. Si no se dispone de una gradilla, se puede fabricar una fácilmente utilizando las planchas de poliestireno expandido (poliespan) que se utilizan para embalar.

Para la preparación del medio de enraizamiento primero necesitaremos agua con el pH ajustado entre 5,5 y 5,8. Si el agua de nuestra zona fuera dura, sería recomendable utilizar agua desmineralizada.

Pondremos 100 ml de esta agua en una olla junto con 0,7 g de agar y la llevaremos a ebullición removiendo de vez en cuando. Cuando el agar se haya disuelto, verteremos la mezcla en el vaso de precipitados y esperaremos hasta el momento justo en el que aún estando caliente, pueda sostenerse desde la base con la mano sin quemarse.

En este momento añadiremos 0,8 ml de agua oxigenada y removeremos con la varilla de vidrio. A continuación, verteremos 10 ml en cada uno de los tubos de ensayo, poniéndolos en posición vertical y ayudándonos con la jeringuilla para evitar, en la medida de lo posible, que se manchen las paredes del tubo. Taparemos sus bocas con papel de aluminio y los dejaremos enfriar.

Una vez se haya solidificado el agar, procederemos a la preparación de los explantos. Cortaremos segmentos de rama de entre 3 y 5 nudos de longitud, eliminaremos todas las hojas grandes cortándolas por la base del peciolo y recortaremos aquellas otras que sean demasiado largas (teniendo en cuenta que tendrán que caber posteriormente en los tubos de ensayo).

Después, llenaremos el tubo Eppendorf de hormona de enraizamiento comercial líquida o en gel. Este tipo de hormonas suelen incluir algún fungicida, por lo que nos ayudará en gran medida a que nuestros explantos no se infecten por su extremo inferior.

La técnica de separar en otro recipiente la cantidad de hormona que vamos a utilizar, ayuda a mantener la parte no utilizada fresca, libre de contaminaciones y suciedad. El recipiente se puede limpiar fácilmente con alcohol después de su uso.

Ahora cogeremos los segmentos, sumergiremos el primer centímetro del extremo basal de cada uno de ellos en la hormona y los introduciremos en los tubos con la ayuda de las pinzas, clavándolos en el agar, teniendo cuidado de no manchar las paredes.

Por último, cerraremos cada uno de los tubos y anotaremos el nombre de la variedad y la fecha. También cubriremos con papel de aluminio la mitad inferior del tubo, donde se encuentra el agar, para evitar que las futuras raíces se vuelvan verdes por la luz. Esto también se podría haber hecho añadiendo al medio de enraizamiento algún agente opaquizante como el polvo de grafito, pero entonces no hubiéramos podido observar el crecimiento de las raíces hasta que estas llegaran a las paredes del tubo.

Resultados

Se pusieron los tubos sobre una manta térmica, bajo una mezcla de fluorescentes de luz cálida y fría, con un régimen lumínico de 20 horas. La temperatura ambiental se mantuvo sobre los 21 ºC.

Al décimo día ya podía verse la formación de callo en algunos de lo explantos, observándose la aparición de nuevas raíces unos días después.

En torno a los veinte días, al haber desarrollado raíces secundarías, se extrajeron de los tubos con las pinzas, se eliminó la mayor parte del agar adherido con agua tibia y se trasplantaron a pequeñas macetas llenas de fibra de coco.

Para su primer riego se utilizó una solución con estimulador radicular y hongos micorriza, emergiendo los pocos días, las puntas de las raíces por lo orificios de la maceta.

Conclusiones

A pesar de ser una técnica viable, tiene muchos inconvenientes si la comparamos con técnicas tradicionales.

Las raíces formadas tienen menor grosor, carecen de pelos absorbentes, tienden a formar menos raíces secundarias y su crecimiento hasta el trasplante es más lento, sobre todo si las comparamos con aquellas iniciadas en sistemas de clonación aeropónicos. Algunas raíces pueden partirse.

Además, es un sistema incómodo, lento de preparar y que tiene mayor riesgo de perdidas por contaminación, tanto en su realización como en su posterior trasplante.

Como única ventaja nos quedaría el hecho de que una vez introducidos los explantos en el medio de enraizamiento, el mantenimiento de los mismos es nulo, siendo útil tal vez en periodos en los que vayamos a pasar varios días fuera de casa.

Transplante.