INGENIERÍA BIOQUÍMICA
ACIDO DESXORRIBONUCLEICO NANOTUBOS LIPOSOMAS NANOHIDROXIAPATITA
Jessica N Figuera H CONTENIDO • Interacción entre el factor SigD de Bacillus subtilis y el factor anti-sigma FlgM fusionado a una cola de histidinas en Escherichia coli. • Formulaciones biofarmacéuticas desoxiribonucléicos en liposomas.
de
ácidos
• Caracterizacion de nanotubos de carbono recubiertos con nanohidroxiapatita. • Clases de reacciones químicas
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La Ingeniería Bioquímica se relaciona con la simplificación o creación de procesos industriales de alimentos, tales como: los vinos, cereales, cárnicos y sobre todo conservantes, además trata la industria farmacéutica y nutrición. No debe confundirse con la Ingeniería Biomédica, que manipula las interacciones químicas entre organismos y los materiales artificiales. La ingeniería Bioquímica hoy en día permite diseñar y desarrollar procesos de conservación, reutilización y producción de alimentos de alta calidad con una visión amplia para proponer posibilidades de transformación de recursos alimentarios con el menor impacto en el ambiente. Esta carrera perite desarrollar, adaptar, controlar, seleccionar y optimizar procesos industriales para el aprovechamiento integral de productos naturales y alimentos. Los Ingenieros bioquímicos pueden integrase a la bioindustria:
Tratamiento y valoración de subproductos agrícolas e industriales y sus derivados. Producción de compuestos orgánicos, tales como enzimas, ácidos orgánicos, solventes, aldehídos, cetonas, alcoholes, vitaminas, hormonas, y otras. Energías Alternativas - Producción de biogás. Tratamiento de desechos sólidos. Tratamiento de aguas residuales Uso y protección de la biodiversidad y medio ambiente. Recuperación y extracción de productos biológicos
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Interacción entre el factor SigD de Bacillus subtilis y el factor anti-sigma FlgM fusionado a una cola de histidinas en Escherichia coli RESUMEN FlgM es el factor anti-sigma específico del factor SigD de la síntesis flagelar en Bacillus subtilis y es responsable del acoplamiento entre la expresión de los genes tardíos del sistema flagelar y el completamiento de las estructuras primarias del flagelo. En el presente trabajo se muestra la interacción entre el factor SigD y el factor anti-sigma FlgM fusionado a una cola de histidina en extractos de proteínas celulares de Escherichia coli. Se copurificaron ambos factores proteicos mediante cromatografía de afinidad. Ambas proteínas se expresaron en la misma célula y se logró obtener in vivo un complejo estable SigD:FlgM-(His)6 de forma soluble. Se discute el posible papel biológico de esta interacción. Palabras claves: coexpresión, factor anti-sigma, factor sigma, interacción ABSTRACT Interaction between Bacillus subtilis SigD and the anti-sigma factor FlgM-(His)6 in Escherichia coli. FlgM is an anti-sigma factor specific for the flagellar SigD factor in Bacillus subtilis. It is responsible for the coupling of late flagellar gene expression and the completion of hook-basal body structure. The present work shows the interaction between sigma factor SigD and the anti-sigma factor FlgM-(His)6 in E. coli cellular protein extracts, from which both proteins co-purify by affinity chromatography. Expressing both SigD and FlgM-(His)6 proteins in the same cells, we obtained a soluble and stable SigD:FlgM-(His)6 complex in vivo. The possible role of this interaction is discussed. Keywords: anti-sigma factor, coexpression, interaction, sigma factor
INTRODUCCIÓN El inicio de la transcripción de un gen específico está determinado, entre otros factores, por proteínas de unión al ADN que interactúan directamente con la región promotora del gen. Recientemente se han descrito proteínas que regulan negativamente la transcripción por su interacción directa con factores
sigma específicos, designándose como factores anti- [1]. Esto añade un nuevo nivel de regulación transcripcional de la expresión génica por la inhibi- ción de factores que son específicos.
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Los factores antide impedir al factor
se definen por su habilidad unirse al núcleo de la ARN
polimerasa. Como resultado de esta acción, se inhibe la transcripción a partir de un grupo de promotores cuyas secuencias son reconocidas únicamente por el factor con el cual el antiinteractúa directamente [2].
MATERIALES Y MÉTODOS
Los detalles del mecanismo molecular de acción de los factores anti- no han sido aún esclarecidos, no obstante se sabe que ejercen su actividad por interacciones proteína-proteína altamente específicas
Cepas bacterianas y plásmidos
La cepa de E.coli DH5 [14] fue usada para la multiplicación y purificación de los plásmidos empleados, y la cepa BL21(DE3) [15] se usó exclusivamente para la expresión de los genes flgM y sigD, que codifican para las proteínas FlgM y SigD respectivamente. Los genes fueron clonados en vectores de la serie pET (Novagen, EE.UU.) que usa el sistema de expresión regulado por el promotor del fago T7. Este sistema de expresión permite la obtención de altos niveles de pro- teínas recombinantes [15]. La proteína FlgM se obtie- ne fusionada a una cola de 6 histidinas en su extremo carboxilo, que facilita su purificación con IMAC [16]. Los plásmidos utilizados en el trabajo se describen acontinuación:
El factor anti- FlgM fue descrito inicialmente en
Salmonella typhimurium como regulador negativo del
factor (FliA) específico para la síntesis flagelar [7, 8]; posteriormente se demostró que éste interactúa con FliA formando un complejo estable [6]. En Bacillus subtilis se ha descrito también la proteína FlgM y se ha podido establecer que al igual que su homólogo en S. typhimurium constituye el principal Factor regulador de la actividad del factor y, por lo tanto, de la expresión de los genes flagelares tardíos Mediante análisis de transcripción in vitro a partir de promotores dependientes de SigD, se ha demostrado que FlgM inhibe el inicio de la transcripción solamente si está presente antes de dicho factor. Una vez formado el complejo de la holoenzima, FlgM no es capaz de inhibir el inicio de la transcripción
• pDBB3: PT7-flgM Ampr, derivado del pET22b+ [13]. • PBGB10: PT7-sigD- Ter T7, Cmr, derivado del pACYC184 (construido en este trabajo). • pYFC-11: PT7-sigD Ampr, derivado del pET11a
En el presente trabajo se utiliza la proteína FlgM fusionada a una cola de histidina (FlgM-(His)6), se muestra la interacción entre SigD y FlgM-(His)6 en extractos de proteínas totales de Escherichia coli y se emplea la cromatografía de afinidad (IMAC) para purificar el complejo formado. Posteriormente, ambas proteínas se coexpresaron en E. coli y se logró obtener y purificar el complejo SigD:FlgM-(His)6 soluble y estable. Se discute la relevancia biológica de esta interacción.
Expresión y purificación de FlgM-(His)6 La proteína FlgM-(His)6 se expresó a partir de la cepa BL21(DE3) transformada con el plásmido pDBB3 y se purificó mediante IMAC siguiendo el procedimiento descrito por González y colaboradores [18]. Las frac- ciones que contenían la proteína se unieron y dializaron contra la solución tampón TMC (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, MgCl2 10 mM, NaCl 150 mM). Se usó un sistema Centricon-3 de Amicon. Expresión y purificación del factor D La proteína SigD se expresó en las células de BL21(DE3) transformadas con el plásmido pYFC-11 y se purifi- có de acuerdo al método descrito por Chen y Helmann [17], para posteriormente ser utilizada en el ensayo de unión in vitro a FlgM-(His)6.
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Análisis de las proteínas expresadas y purificadas
Las proteínas purificadas se analizaron por electroforesis SDS-PAGE al 15% en condiciones desnaturalizantes. Para los análisis inmunoquímicos por Western blot, las proteínas separadas por SDS-PAGE se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Hybond C según Towbin y colaboradores [19]. La inmunoidentificación de las proteínas se realizó utilizando anticuerpo policlonal obtenido a partir de suero de conejo inmunizado con los péptidos NPYQKNYDKQAVQK y KNMINFYKKQ, que corresponden respectivamen- te a los residuos del 12 al 25 y del 79 al 88 de la secuencia aminoacídica de FlgM [9]. Los filtros se trataron de acuerdo con las indicaciones del sistema ECL (Amersham-PharmaciaBiotech, Suecia).
inmediatamente se trataron con DSS. Los productos de todas las reacciones se anali- zaron por SDS-PAGE al 15%. Copurificación de SigD y FlgM-(His)6 a través de IMAC Para extraer las proteínas totales de las células de la cepa de E. coli BL21(DE3) transformada con el plásmido pYFC-11, se partió de dos cultivos de 50 mL. Las células se colectaron por centrifugación, se resus- pendieron en 5 mL de clorhidrato de guanidina 6 M en solución tampón TMC y se incubaron a temperatura ambiente por 1 h con agitación. La suspensión se centrifugó a temperatura ambiente durante 15 min a 6 000 rpm y el sobrenadante del extracto de las proteínas celulares se dializó contra 1 L de tampón TMC durante toda la noche a 4 ºC. El extracto dializado se centrifugó a 15 000 rpm durante 15 min a 4 ºC, para separar todo el material precipitado y posteriormente se dividió en dos porciones. Una de ellas se incubó durante 1 h con 2 mg de la proteína FlgM-(His)6 pre- viamente purificada por IMAC y la otra fracción se usó como control. Ambas fracciones se sometieron al mismo procedimiento de purificación por IMAC.
Ensayo de unión in vitro entre SigD y FlgM-(His)6 Los ensayos de unión se realizaron en solución tampón TMC con cantidades equimolares de SigD y FlgM- (His)6 a concentraciones de 277 g/mL y 75 g/mL respectivamente. La mezcla se incubó durante 10 min a 25 ºC y se mantuvo durante 12 h 4 ºC. El complejo
Para realizar IMAC, 1 mL de resina ProbondTM activada con NiCl2 se equilibró previamente con solu- ción tampón TMC. El material adsorbido en la columna se lavó con 20 mL cada vez de: TMC, imidazol 10 mM en TMC e imidazol 50 mM en TMC. La elución se realizó con 3 mL de imidazol 350 mM en TMC y posteriormente se lavó la columna con imidazol 1 M en TMC. Las proteínas eluídas se analizaron por SDS- PAGE al 15%.
SigD:FlgM-(His)6 se purificó por cromatografía de exclusión molecular en FPLC con una columna Superosa-12 HR 10/30 con solución tampón TMC.
Coexpresión de FlgM-(His)6 y SigD en E. coli
Muestras del complejo purificado se analizaron posteriormente mediante entrecruzamiento químico (crosslinking) con el reactivo homobifuncional disuccinimidil suberato (DSS), (Sigma, EE.UU.) en las mismas condiciones utilizadas por Bertero y colaboradores [12]. La velocidad de formación del com- plejo se evaluó cualitativamente; para ello, cantidades equivalentes de ambas proteínas purificadas por se- parado se mezclaron e
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El fragmento Bgl II-Eco RV de 990 pb del pYFC-11 que contiene el promotor T7 seguido del gen sigD y el terminador del fago T7, se subclonaron en el vector pACYC184 [20] en los sitios de restricción BamHI y EcoRV. Con el plásmido obtenido, pBGB10, se transformó la cepa BL21(DE3) portadora del plásmido pDBB3 que expresa el gen flgM. La cepa cotransfor- mada se cultivó y la inducción de la expresión de am- bas proteínas, FlgM-(His)6 y SigD, se llevó a cabo de acuerdo al método descrito por González y colabora- dores [18]. Las células colectadas por centrifugación se lisaron por ultrasonido y la fracción soluble de las proteínas totales se sometió a IMAC de acuerdo con el procedimiento descrito en el epígrafe anterior. Las fracciones con las dos proteínas SigD y FlgM-(His)6 se unieron y
concentraron. Las proteínas se repurifi- caron posteriormente por una columna de exclusión molecular FPLC Superosa-12 HR 10/30 en solución tampón TMC.
(His)6 previamente puri- ficada se aplicó a la columna de afinidad. En la Figura 2 se observa que ambas proteínas son retenidas en la columna (carril 6) y son eluídas posteriormente con imidazol (carriles 7 y 8). Como control se utilizó el extracto, sin FlgM-(His)6, al que se le aplicó el mismo procedimiento. Se observó que la proteína SigD no se retenía en la columna de afinidad (Figura 2, carril 2). La proteína SigD tampoco se hizo ver en las fracciones correspondientes a la elución con imidazol (Figura 2, carril 3).
RESULTADOS
Teniendo en cuenta el resultado anterior se proce- dió a coexpresar ambas proteínas en E. coli y probar la formación del complejo mediante la extracción y purificación del mismo con el empleo de IMAC. Coexpresión de FlgM-(His)6 y SigD en E. coli Los resultados mostraron que se obtuvieron altos ni- veles de expresión de las proteínas SigD y FlgM- (His)6 (carril 1) en E. coli (Figura 3). El complejo SigD:FlgM-(His)6 se encontró en la fracción soluble, de donde se purificó mediante IMAC (carriles 3-5). La cromatografía de exclusión molecular permitió separar en dos fracciones las proteínas purificadas por IMAC. Una fracción mayoritaria correspondió al complejo SigD:FlgM-(His)6 (carril 6) y otra minorita- ria correspondió a FlgM-(His)6 (carril 7).
Interacción in vitro entre SigD y FlgM-(His)6 Las proteínas SigD y FlgM-(His)6 formaron un com- plejo estable que eluyó de la columna de gel filtración en un volumen de 13-14 mL (datos no mostrados), similar a lo publicado para la proteína FlgM [12].
El extracto de E. coli que contenía la proteína SigD incubado con la proteína FlgM-(His)6 previamente purificada se aplicó a la columna de afinidad. En la Figura 2 se observa que ambas proteínas son retenidas en la colum-
Como se muestra en la Figura 1, el complejo purificado SigD:FlgM-(His)6 migró a una altura aproxima- da de 40 kD (carril 2), que se corresponde con un heterodímero, tal y como se demostró para el comple- jo FlgM:SigD [12].
na (carril 6) y son eluídas posteriormente con imidazol (carriles 7 y 8). Como control se utilizó el extracto, sin FlgM-(His)6, al que se le aplicó el mismo procedimiento. Se observó que la proteína SigD no se retenía en la columna de afinidad (Figura 2, carril 2). La proteína SigD tampoco se hizo ver en las fracciones correspondientes a la elución con imidazol (Figura 2, carril 3).
En el caso que se mezclaron ambas proteínas inmediatamente antes de la incubación con DSS, se observó igualmente la formación del complejo demostrado por la banda a la altura de los 40 kD (carril 4). La interacción de FlgM-(His)6 con SigD se comportó de modo similar al de la proteína FlgM sin fusión a la cola
DISCUSION.
de histidinas
La interacción in vitro entre FlgM y SigD ha sido estudiada y caracterizada, demostrándose la formación de un complejo heterodimérico con una constante de disociación, Kd, estimada de 10-6 M o menor [12].
Copurificación de SigD y FlgM-(His)6La proteína FlgM-(His)6 purificada mediante cromatografía de afinidad, se obtuvo con más de 90% de pureza determinado por SDS-PAGE y tinción con azul de Coomasie. El extracto de E. coli que contenía la proteína SigD incubado con la proteína FlgM-
FlgM-(His)6 interactúa in vitro con SigD del mismo modo que ha sido descrito para FlgM [12], lo cual
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sugiere que la presencia de las histidinas en el extremo carboxilo no interfiere en su actividad como factor anti- . La interacción observada entre FlgM-(His)6
y SigD se correspondió con la alta afinidad del complejo formado por FlgM y SigD [12]. Teniendo en cuenta todo lo antes expuesto, se pue- de afirmar que FlgM ejerce la actividad como factor anti- en las células de B. subtilis mediante su interacción directa con el factor . Esto guarda semejanzas con los mecanismos descritos para el factor antiFlgM en S. typhimurium. De esta forma se explica cómo el factor anti- FlgM regula la actividad del fac tor D, impidiendo la transcripción de los genes tardíos de la síntesis flagelar mientras no se completa el ensamblaje de las estructuras primarias de los flagelos. Probablemente, al igual que ocurre en S. typhimurium, una vez que finaliza el completamiento de las estructuras flagelares basales, el factor antiFlgM es secretado al medio a través de ellas, y el factor D libre promueve la transcripción de los genes flagelares tardíos. De hecho, estudios inmunoquímicos prelimina res mostraron la presencia de FlgM en el sobrenadante
del medio del cultivo durante la fase estacionaria del mismo (resultados no mostrados). A partir de los resultados expuestos quedó evidente que la cola de histidinas fusionada al extremo carboxilo de FlgM no interfiere en la interacción entre el factor anti- y SigD. Este hecho reviste gran utilidad en estudios estructurales de la naturaleza de dicha interacción. Asímismo, la capacidad de la proteína FlgM-(His)6 de interactuar in vivo con SigD, abre el camino para su empleo en posteriores estudios con vistas a esclarecer los mecanismos moleculares de regulación del factor anti- FlgM y del sistema flagelar. AGRADECIMIENTOS Agradezco a Daniela Barilla y John Helmann por facilitarme los plásmidos pDBB3 y pYFC-11 respectivamente, a Alessandro Galizzi por los sueros anti-FlgM y las opiniones acerca del trabajo, a Guillermo Selman- Housein por las discusiones y críticas constructivas del trabajo y Alberto Salazar por la lectura crítica del manuscrito y sus oportunas sugerencias.
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Formulaciones biofarmacéuticas de ácidos desoxiribonucléicos en liposomas RESUMEN En este artículo se evalúa el desarrollo actual de las formulaciones liposomales de ADN como producto biofarmacéutico. La discusión se enfoca específicamente en la potencialidad comercial de estas formulaciones, los resultados de la mayoría de los diferentes ensayos clínicos en que han sido probadas y las características de las tecnologías empleadas para su fabricación. Se discute además, cómo la propiedad intelectual existente en este campo marca los límites del desarrollo comercial de estos productos basados en liposomas. Por último, se analizan las tendencias actuales de las investigaciones encaminadas al mejoramiento de los sistemas de administración de genes basados en liposomas, que incluyen la síntesis química de nuevas estructuras lipídicas de una menor toxicidad y mayor eficiencia de transfección, el desarrollo de nuevas tecnologías de formulación de estos lípidos, así como el desarrollo de la selectividad de la acción de las medicinas de genes formuladas en liposomas. ABSTRACT Biopharmaceutical Formulations of Liposome-associated Desoxyribonucleic Acids. In this paper the current development of liposome-based DNA formulations as a biopharmaceutical product is evaluated. The discussion is focused on the commercialization potential of these formulations, results of different clinical trials where they have been tested and features of technologies used for their production. It is also discussed how the intellectual property in this field marks the limits of the commercial development of these liposome-based products. Finally, it is analyzed current trends on the research of liposome-based gene delivery systems, including chemical synthesis of new lipid structures with lower toxicity and higher transfection efficiency, development of new formulation technologies of these lipids, as well as development of the selectivity of action of these liposome-based gene medicines. Keywords: delivery system, gene therapy, liposome
INTRODUCCIÓN Fraley y colaboradores en el año 1980 utilizaron, por primera vez, los liposomas para la administración de genes al interior de las células. En estos experimentos, sin embargo, los liposomas sólo encapsulaban del 30 al 50% de los plásmidos [1]. Posteriormente, Felgner y colaboradores [2] trabajaron en la solución de este problema tecnológico y para ello idearon preparar liposomas en los que algunos de los lípidos estándares fueran reemplazados por otros que llevaran una carga positiva en su extremo hidrofílico. En 1983 había
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muy pocos ejemplos de lípidos cargados positivamente (catiónicos) que tuvieran la estructura adecuada para formar liposomas, pero ya en 1987 el grupo de Felgner sintetizó variantes de lípidos catiónicos que encapsularon al 100% de los plásmidos de ADN [2]. Estos primeros trabajos y otros que demostraron las potencialidades del uso de los liposomas como sistema de administración de ADN en la terapia génica [3-6] fueron las bases para una investigación intensa en este campo que, en un tiempo relativamente corto, progresó hacia la realización de ensayos clínicos. Al mismo tiempo, sobre la base de la propiedad intelectual generada
se formaron varias compañías dedicadas al desarrollo de productos para esta terapia. En este artículo se evalúa el desarrollo actual de las formulaciones liposomales de ADN como producto biofarmacéutico. Se discute la potencialidad de estas for- mulaciones desde el punto de vista comercial, se ex- ponen los resultados de la mayoría de los ensayos clínicos en los que han sido probadas y las características de las tecnologías empleadas para su fabricación. Se muestra cómo la propiedad intelectual existente en este campo marca los límites del desarrollo comercial de los produc- tos basados en liposomas. Por último, se analizan las tendencias actuales de la investigación encaminada al mejoramiento de los sistemas de administración de genes basados en liposomas. Estos sistemas incluyen la sínte- sis química de nuevas estructuras lipídicas de una menor toxicidad y mayor eficiencia de transfección, el desarro- llo de nuevas tecnologías de formulación de estos lípidos, así como el desarrollo de la selectividad de la acción de las medicinas de genes formuladas en liposomas. PERSPECTIVAS COMERCIALES DE LAS FORMULACIONES DE ADN BASSADA EN LIPOSOMAS No existen actualmente en el mercado productos farmacéuticos que contengan ADN encapsulado en liposomas, ni hay alguno que haya sido aprobado por las autoridades reguladoras de Estados Unidos (FDA) o de la Unión Europea (EMEA) para su uso en huma- nos [7-11]. Se pudiera especular que ello está asociado, fundamentalmente, al poco tiempo que lleva el ADN como producto farmacéutico, y en menor grado, a las dificultades enfrentadas en su desarrollo, tales como la limitada eficiencia o inseguridad de los métodos actua- les de administración de genes, y la inmunogenicidad relativamente baja mostrada por el ADN como candidato vacunal en ensayos clínicos.
Algunas formulaciones de ADN encapsulado en liposomas se encuentran en distintas fases de ensayos clínicos. Entre las más adelantadas, la formulación del gen HLA-B7 del sistema principal de histocompatibilidad (MHC) en liposomas catiónicos, que fue desarrolla- da por la compañía Vical Inc. (EE.UU.) para el tratamiento del melanoma metastático y el cáncer de cabeza y cuello no operable, se encuentra en ensayo clínico fase III. Se prevé por parte de esta compañía que este producto estará disponible comercialmente en el año 2005. En la Tabla 1 se muestran las formulaciones de ADN encapsulado en liposomas que actualmente se prueban en ensayos clínicos. Como característica común de las formulaciones usadas se puede indicar que to- das incluyen un lípido catiónico en su composición, y que el gen administrado ha sido empleado en la mayo- ría de los casos con propósitos terapéuticos. Las afecciones tratadas están relacionadas principalmente con el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, y la fibrosis quística. En comparación, la utilización de los liposomas con propósitos vacunales en humanos es mucho más incipiente. Se han obtenido sólo modestos resultados en la inmunización con complejos ADNlípido catiónico, donde las respuestas inmunes han sido similares [14] o ligeramente superiores [15] a las obtenidas con la inmunización de ADN solo Los resultados de los estudios clínicos mostraron que la administración de los genes en liposomas, en cantidades terapéuticamente activas, es segura. Lo estudios clínicos con genes de citoquinas mostraron lo atractivo de su empleo como alternativa al uso de citoquinas directamente. La eficacia de la aplicación del gen terapéutico de la interleuquina 2 (IL-2) en un ensayo clínico de fase I/II fue de 14 %, comparable a la que se obtuvo con la aplicación de la citoquímica directamente y osciló entre 10 y 20% TENDENCIAS DE LA INVESTIGACIÓN SOBRE LOS SISTEMAS DE
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ADMINISTRACIÓN DE GENES BASADOS EN LIPOSOMAS La mayoría de las formulaciones de ADNliposoma que se encuentran en ensayos clínicos son complejos de ADN con lípidos catiónicos, las cuales se recono- cen en la literatura como mejorables en término de eficiencia de transfección, toxicidad y estabilidad de la formulación in vitro e
in viv.
Las investigaciones para el mejoramiento de estas formulaciones comprenden dos áreas principales: i) la síntesis química de nuevas estructuras lipídicas de una menor toxicidad y mayor eficiencia de transfección, y ii) la obtención de nuevas tecnologías de formulación de estos lípidos. Obtención de las Formulaciones de ADN Aplicadas en Ensayos Clínicos
La primera generación de liposomas catiónicos de ADN, los complejos ADN-lípido catiónico, que actualmente se prueban en ensayos clínicos, tienen las siguientes características [26]: i) no son mutagénicos ni inmunogénicos, ii) Un ejemplo de la tecnología de obtención de es- tas formulaciones se muestra en la Figura, la que aparece referida en la patente de Vical Inc. (EE.UU.) No. 6,147,055 y que describe la obtención de com- plejos
del ADN de la IL-2 con la mezcla lipídica de marca comercial DMRIE y DOPE. Estos complejos alveolar y la intravascular (Tabla 1). La vía intralesional fue utilizada en varios de estos estudios ya que permitió alcanzar, de forma sencilla, una adecuada biodisponibilidad del complejo ADN-lípido catiónico en el tejido enfermo, y disminuyó en gran parte los efectos adversos asociados a la toxicidad de los lípidos catiónicos. En cambio, la administración del ADN con lípidos catiónicos por las vías intravenosa y alveolar resultó ser menos eficiente o producir una mayor can- tidad de efectos adversos por lo que es necesario dis- poner de un diseño y una optimización más cuidadosa de las formulaciones. Sin embargo, no existe una infor- mación detallada sobre estos estudios clínicos y las características de las formulaciones usadas, puesto que algunos de ellos no han concluido o no han sido publi- cados los resultados por parte de las compañías que los realizan. Bossart y Pearson en el año 1995 [30] propusieron una jerarquía de la propiedad intelectual en la que las patentes con reivindicaciones dirigidas a conceptos de tratamiento de enfermedades tienen un impacto más amplio, ya que éstas excluyen del mercado el mayor número de productos. Le siguen por su forta- leza para bloquear el desarrollo de productos alter- nativos las patentes que reivindican la secuencia del gen terapéutico, ya que usualmente no existen susti- tutos para un gen terapéutico determinado. Con me- nor grado de fortaleza se ubican las relacionadas con los sistemas de liberación de genes, basados en polímeros, lípidos, etc. y en último lugar las que rei- vindican sistemas de expresión de genes ya sean pro- motores, potenciadores etc. Otra patente, la USP 5,676,954 inventada por Kenneth Brigham fue otorgada en Octubre de 1997 a la Universidad de Vanderbilt (Nashville, Tennessee, EE.UU.), la cual la había autorizado a la compañía GeneMedicine Inc. (EE.UU.). La compañía Valentis Inc. (EE.UU.) asumió esta autorización al ocurrir la fusión de las compañías GeneMedicine con Megabios Inc. (EE.UU.). Esta patente demanda ampliamente el uso de complejos de lípido catiónico con ADN administrados por vía intravenosa o por inhalación. Por otro lado, a la compañía Megabios Inc se le habían autorizado la patente USP 5,827,703 y la USP 5,756,353 de la Universidad de California (EE.UU.). Estas patentes plantean variaciones
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sutiles del siste- ma de liberación formado por complejos de lípido catiónico con ADN, que fueron descritas en la inven- ción de Kenneth Brigham. Las patentes sobre la síntesis y el uso de lípidos catiónicos que actualmente se prueban en ensayos clínicos fueron concedidas a las compañías patrocinadoras en los años 1993-1995 Tendencias de la Investigación sobre los Sistemas de Genes Basados en Administración de Liposomas.
La mayoría de las formulaciones de ADN-liposoma que se encuentran en ensayos clínicos son complejos de ADN con lípidos catiónicos, las cuales se recono- cen en la literatura como mejorables en término de eficiencia de transfección, toxicidad. Las investigaciones para el mejoramiento de estas formulaciones comprenden dos áreas principales: i) la síntesis química de nuevas estructuras lipídicas de una menor toxicidad y mayor eficiencia de transfección, y ii) la obtención de nuevas tecnologías de formulación de estos lípidos. Síntesis química de nuevas estructuras lipídicas Para identificar moléculas lipídicas más eficaces fue necesario que los investigadores sintetizaran un gran número de moléculas estructuralmente relacionadas que luego fueron probadas en ensayos in vivo. Como un ejemplo del desarrollo en este campo de
investigación, Felgner de la compañía Vical Inc. (EE.UU.), ob- tuvo en el año 1996 estructuras lipídicas que produjeron un incremento en la expresión del transgén en el pulmón de ratón de 1 000 veces comparado con la obtenida cuando se usaron las estructuras lipídicas de sus estudios iniciales en el año 1993 A pesar que de que la eficacia de estas formulaciones liposomales de ADN, medida en término de la expresión total del transgén (masa total de proteína expresada), se acerca a la lograda con vectores virales, todavía los virus son sistemas de administración degenes mucho más eficientes . Por ejemplo, los adenovirus son típicamente usados in vitro a una multiplicidad de infección de cerca de 100. En estas condiciones, en las que cada célula se expone a un promedio de sólo 100 partículas de virus funcionales, la mayoría de ellas pueden ser transfectadas. Para lograr niveles comparables de la expresión del transgén con liposomas catiónicos, las células deben ser expuestas a cerca de 10 6 de copias del plásmido por célula, 5 µg de plásmido/millón de células. Diferencias similares en la eficiencia de estos dos sistemas de administración de genes son aparentes en los estudios in vivo. En el pulmón de ratón, fueron usadas cerca de 2 x 1013 copias del plásmido que corresponde a 130 µg ADN formuladas en liposomas, mientras que en un estudio típico de vector de adenovirus se administraron sólo 109 partículas de virus. Por lo tanto, la eficacia es comparable para los liposomas catiónicos y los vectores virales, pero las eficiencias relativas, en términos del número de copias del transgén requeridas para lograr una expresión del gen óptima y segura, difieren al menos 104 veces. A pesar de estas diferencias, los liposomas representan una alternativa al uso de sistemas virales de administración de genes in vivo. Los sistemas no-virales de administración de genes, en particular los liposomas catiónicos, tienen como características una expresión temporal del producto del gen y una menor eficiencia de transfección, mientras que no generan una apreciable respuesta de anticuerpos contra sus estructuras al ser administrados repetidamente. Por su parte los vectores virales como el asociado a adenovirus (VAA) tienen como propiedades la expresión prolongada del producto del gen, tienen una alta eficiencia de transfección y generan una respuesta de anticuerpos contra sus estructuras al ser administrados repetidamente.
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Esto hace que los liposomas catiónicos sean más apropiados para las aplicaciones en las que hay que administrar el gen repetidamente y se necesite una expresión temporal del gen. Este es el caso del tratamiento con genes de citoquinas como la IL-2, el interferón alfa (IFN-alfa) o el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) para el tratamiento de cé- lulas que se dividen con rapidez como son las del cáncer o las del tejido endotelial vascular. Los vectores virales como el VAA son más apropiados, sin embargo, para las aplicaciones en las que se necesita una sola administración del gen y la expresión del mismo por tiempo muy prolongado. Este es el caso de la generación de una respuesta inmune protectora mediante la aplicación de vacunas de ADN. La diferencia en eficiencia de transfección entre los liposomas y los vectores virales define la oportunidad para el desarrollo de una nueva generación de sistemas sintéticos de administración de genes. Esta tercera generación de formulaciones de liposomas debe ser varios órdenes de magnitud más eficiente que las formulaciones que actualmente están en investigación.
Nuevas tecnologías de formulación de liposomas A diferencia de las formulaciones de vectores virales, los complejos ADN-liposomas catiónicos no son estables en término de tamaño de partícula [37-39]. Ha sido difícil obtener complejos ADNliposomas catiónicos con una distribución de tamaño de partícu- la adecuado para la inyección sistémica, y, en la mayo- ría de los estudios publicados, se han utilizado preparaciones inestables. Frecuentemente, estos com- plejos fueron usados dentro de un período de tiempo de 30 min hasta unas pocas horas. En estudios clíni- cos en los que se usaron lípidos catiónicos para la formulación de ADN terapéutico, los dos componen- tes fueron mezclados al lado de la cama del paciente y usados inmediatamente [39]. La inestabilidad estruc- tural junto con la pérdida de la eficiencia de transfección de los complejos de ADN-liposomas catiónicos han sido importantes obstáculos para el desarrollo de la terapia génica basada en liposomas.
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empleado en la formulación de los complejos de ADN-liposomas catiónicos para obtener preparacio- nes de ADN estables. Los complejos estables de ADN liposomas catiónicos se obtuvieron al solubilizar los liposomas catiónicos en octilglucósido al 1 % y mezclar el ADN con el lípido en presencia del detergente La eliminación del detergente mediante una diálisis produjo una suspensión de lípido-ADN que fue capaz de transfectar las células cultivadas de tejido hasta 90 días después de su almacenamiento a 4 ºC, sin ninguna pérdida en su eficiencia de transfección. Se obtuvieron niveles similares en la transferencia de los genes cuando se mezclaron los lípidos catiónicos en forma de liposomas con el ADN justo antes de añadirlo a las células. Sin embargo, la capacidad de transfectar las células se perdió completamente pasadas 24 h. Como una alternativa para la disminución de la toxi- cidad de las formulaciones de ADN-liposomas se elaboraron formulaciones de ADN-liposomas que evitan el uso de lípidos catiónicos. En una de estas nuevas tecnologías [43], el ADN se compacta con el policatiónespermina, en una emulsión de agua-cloroformo estabilizada con fosfolípidos. Después de eliminar el solvente orgánico, las partículas formadas pueden ser homogeneizadas hasta un tamaño promedio de alrede- dor de 200 nm, que retienen en su interior el ADN que se protege de la digestión con nucleasas. Estas prepara- ciones liposomales fueron activas en la transfección de varias líneas celulares, y su eficiencia de transfección en cultivo tuvo el mismo orden de magnitud que la obteni- da con los lípidos catiónicos, no obstante fueron mu- cho menos tóxicas para las células.
Complejos estables de ADN-liposomas catiónicos se han podido obtener mediante dos estrategias: i) la adición de pequeñas cantidades de un conjugado de polietilenglicol con fosfolípido que es incorporado en la estructura del liposoma, y ii) la compactación del ADN con pequeños polímeros catiónicos (poliaminas) antes de la formación del complejo ADN-liposoma. Estas preparaciones fueron estables a 4 ºC por varios meses y dieron altas y reproducibles eficiencias de transfección del gen después de ser administradas en ratones por vía intravenosa [40]. En cambio, las formulaciones similares pero no estabilizadas perdie- ron completamente su capacidad de transfectar las células en sólo 4 días. Otra de las estrategias que han sido utilizadas para la estabilización de los complejos ADN-liposomas catiónicos fue la adición del surfactante Tween 80. Las formulaciones así obtenidas forman complejos estables con el ADN que no experimentan un cambio en su eficiencia de transfección o tamaño de partícula al ser almacenadas a 4 °C durante al menos 10 días. Adicionalmente, la eficiencia de transfección de estas formulaciones no se afectó por la presencia de suero en los experimentos in vitro. Se supone que la estabilización de los complejos ADN-liposomas catiónicos por parte del Tween 80 se produce por la presencia en la superficie de las partículas lipídicas de las estructuras ramificadas de polietilenglicol presen- tes en el Tween 80, las cuales forman una barreraestérica que minimiza las interacciones entre el ADNy los lípidos catiónicos, responsables de la agregación de los complejos.
En otra de las tecnologías que evita el uso de lípidos catiónicos [44] se produce una eficiente encapsulación del ADN en liposomas neutros pequeños mediante la adición de etanol y cloruro de calcio a una mezcla acuosa de vesículas unilaminares pequeñas (SUVs) y ADN plasmídico. Los complejos lipídicos neutros, compuestos por 1,2-dioleoyl-snphosphatidylcholi- ne (DOPC), DOPC/DOPE (1,2-dioleoyl-sn-phosphatidylethanolamine) (1:1) o DOPC/DOPE/colesterol (1:1:1), tienen un diámetro promedio efectivo de me- nos de 200 nm y encapsulan hasta el 80% del ADN el cual es retenido a pH 4,0 y en el suero a 37 ºC. Se espera que la toxicidad de esta formulación sea signifi- cativamente menor que la de otros sistemas no-virales de administración de genes. Desarrollo de la selectividad de la acción de las medicinas de genes formuladas en liposomas
Como materia prima para la producción de complejos ADN-liposomas, el Tween 80 es atractivo ya que su uso en humanos ha sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration, EE.UU.) pero además, esta sustancia sintética puede ser comprada a las compañías suministradoras en grandes cantidades y con una alta pureza a precios relativamente bajos. Estas formulaciones de ADN no tienen que ser preparadas al momento de usarse, ya que pueden ser elaboradas como un solo producto listo para su uso, el cual es estable durante su almacenamiento y transportación. El detergente octilglucósido es otro surfactante que se ha
14
la transferrina o un fragmento de anticuerpo contra el receptor de la transferrina han mostrado un alto nivel de expresión del transgén en modelos preclíni- cos de cáncer humano de mama, próstata y cabeza y cuello. También se han utilizado diferentes ligandos, como el beta-sitosterol beta-D-glucósido (Sit-D), para dirigir las formulaciones liposomales hacia el hígado. Los comple- jos de ADN/liposoma-Sit-D, de un tamaño promedio pequeño de 100 a 250 nm, produjeron una expresión alta y selectiva del gen marcador de luciferasa en el híga- do de ratones una vez administrados por vía intravenosa [50]. Mediante la inclusión de la transferrina en la formulación de ADN liposomal fue posible expresar el transgén marcador beta-galactosidasa exclusivamente en la masa de un tumor de carcinoma hepatocelular implan- tado en el hígado de ratones, después de ser aplicada esta formulación en la arteria hepática [51]. Para que las formulaciones de ADN-liposomas tengan una alta eficacia al ser administradas por vía sistémica, es necesario además que éstas se manten-
Si bien la vía de administración intra-lesional es la más utilizada por su simplicidad, también se ha presenta- do la necesidad de desarrollar formulaciones de ADN- liposoma que puedan ser aplicadas con efectividad por vía sistémica.
gan en el torrente sanguíneo por un tiempo prolongado en concentraciones relativamente altas. Los complejos de ADN-liposoma ordinarios, de carga su-
Entre los problemas que aparecen en el desarrollo de formulaciones para la aplicación por esta vía está la
perficial positiva y tamaño de partícula grande son eliminados con facilidad por el sistema retículoendotelial, por lo que tienen un tiempo de vida en
posibilidad de diseminación de estas medicinas en varios órganos y tejidos del organismo [45, 46], que pue- den conducir a una mayor toxicidad del tratamiento y una menor efectividad de su acción terapéutica
sangre relativamente corto y sus mayores niveles de actividad son sólo observados en determinados órganos como los pulmones, el bazo y el hígado.
Una estrategia que se ha planteado para solucionar este problema es el desarrollo de sistemas de administración de genes basados en liposomas que se puedan dirigir a regiones específicas del organismo, como pue- den ser un órgano o un tejido, en los que se quiere combatir la enfermedad
En la actualidad se desarrollan formulaciones de ADN-liposomas que tienen un mayor tiempo de circulación en sangre. Estas nuevas formulaciones se obtuvieron a través del acople en sus estructuras de
Esta especificidad se logra mediante el acoplamiento en la superficie de los liposomas de ligandos o frag-
polímeros como el polietilenglicol [49] o con un menor tamaño promedio de partícula,70 nm, y carga
mentos de anticuerpos, llamados inmunoliposomas que tienen una alta afinidad por receptores o antígenos que se expresan en el exterior de las células del tejido enfermo.
más, la absorción y eliminación de estas formulaciones al disminuir la interacción con las estructuras
superficial neta neutra. Estos polímeros evitan, ade-
del sistema retículo-endotelial y los componentes de la sangre [52].
Liposomas dirigidos con ligandos como el folato,
15
CONCLUCIONES: Los liposomas catiónicos han sido utilizados en muchas aplicaciones de la terapia génica. A pesar de que las investigaciones en este campo se encuentran en etapas tempranas, un número de estudios ya tienen resultados en humanos y mostrado la baja toxicidad del tratamiento. Aunque no hay una evidencia inequívoca de la eficacia, se han demostrado cambios fisiológicos que son relevantes para el proceso de las enfermedades tratadas.
Unos de los mayores retos que todavía enfrenta este campo es el diseño de formulaciones más eficientes. Los sistemas actuales de administración de genes serán, indudablemente, vistos como en su infancia cuando sean comparados con los desarrollados en el futuro. Es poco probable que alguna vez exista una formulación de liposomas universal, sino que serán varias formulaciones diseñadas específicamente para determinados sitios de órganos y determinadas enfermedades.
16
CARACTERIZACAÓN DE NANOTUBOS DE CARBONO RECUBIERTOS CON NANOHIDROXIAPATITA
I. Boyera*, A. Karam a, C.Albano b, W. García a, C. Urbina de Navarroc, G. Gonzálezd Laboratorio de Polímeros, Centro de Química, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Caracas,*E-mail: iboyer@ivic.gob.ve. RESUMEN La funcionalización de los nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM) se realizó por tratamiento oxidativo con una mezcla ácida. La síntesis del compuesto nanohidroxiapatita-nanotubo de carbono (HA-NTC) se llevó a cabo por el método de precipitación química incorporando 1% de nanotubo. Por medio de MET se pudo observar que este tratamiento ácido permitió obtener una mejor interacción entre los compuestos a pesar de que disminuye el número de paredes presentes en el NTC. Los cuatro modos vibracionales de los grupos fosfatos y la banda del grupo hidroxilo de la HA fue observado por FTIR y por espectroscopia de Raman. La relación de intensidades entre las bandas D y G antes y después de la funcionalización no mostró cambio alguno. Al comparar por medio de FTIR las bandas características de la HA con las bandas del compuesto HA-NTCf se observaron ligeros desplazamientos en las bandas correspondientes al grupo hidroxilo a 3586 y 961 cm-1 y en la banda del grupos fosfato 1112 cm-1, siendo estos posibles lugares por donde se puede estar dando la interacción entre la HA y el NTCf.
Palabras Claves: Nanohidroxiapatita, Nanotubos de carbono, Funcionalización, Biomateriales
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CHARACTERIZATION OF CARBON NANOTUBES COATED WITH NANOHYDROXYAPATITE ABSTRACT The functionalization of multiwall carbon nanotubes (MWCNT) was performed by oxidative treatment with an acid mixture. The synthesis of nanohydroxyapatite-carbon nanotubes composite (HA-CNTf) was carried out by chemical precipitation method incorporating 1% nanotube. TEM analysis of the sample showed that a better interface interaction HA-MWCNT was obtain in the composites treated with the acid treatment, despite decreasing the number of walls in the CNT. The four vibration modes of the phosphate groups and the band of the hydroxyl group of HA were observed by FTIR and Raman spectroscopy. The intensity ratio was the same before and after functionalization. Comparing FTIR through the characteristic bands of HA with bands in the composite HA- CNTf slight shift observed in the bands corresponding to the hydroxyl group at 3586 and 961cm-1 and phosphate groups band 1112 cm-1, being these possible places where you can be giving the interaction between HA and CNTf.
Keywords: Nanohydroxyapatite, Carbon nanotubes, Functionalization, Biomaterials.
18
funcionalizados
INTRODUCCIÓN
vía
precipitación
química.
En años recientes se ha incrementado el interés en el desarrollo de materiales compuestos que combinan dos o más
componentes,
cuyas
excelentes
propiedades
permiten su uso en diferentes áreas. Uno de los materiales
que
ha
presentado un alto interés es la
hidroxiapatita (HA), [Ca10(PO4)6(OH)2], una biocerámica con alta bioactividad, la cual es usada para simular y reemplazar material óseo. Sin embargo, la HA posee deficientes propiedades mecánicas que limitan su uso en aplicaciones clínicas específicamente en zonas que tengan que resistir altos esfuerzos [1,2]. Por otra parte, los nanotubos de carbono (NTC) han presentado gran interés por sus excelentes propiedades físicas y químicas,
MATERIALES Y MÉTODOS
entre las que destacan su extraordinaria resistencia mecánica; la cual combinada con su baja densidad los hacen candidatos ideales para reforzar materiales [3-8].
Acido nítrico (HNO3) 70% Riedel de Haën, Acido
Debido a que los NTC son químicamente inertes se
sulfúrico (H2SO4) 97% Riedel de Haën, Fosfato de
requiere de modificaciones en su superficie para mejorar
amonio dibásico (NH4)2HPO4 98,5% Fisher Scientific, Hidróxido de calcio Ca (OH)2 96.89% Fisher Scientific,
la interacción con otros materiales [9]. El método de oxidación
química
permite
incorporar
grupos
Nanotubos de Carbono de Pared Múltiple (NTC) 88%
carboxílicos, hidroxilos y carbonilos en su superficie, los cuales pueden actuar como sitios de nucleación
Nanocyl S.A Bélgica y agua desionizada.
[10]
.
Varias aplicaciones han sido propuestas recientemente
FUNCIONALIZACIÓN
para los NTC, muchas de las cuales se añade pequeñas
CARBONO
cantidades de éstos a matrices cerámicas para producir materiales cerámicos más resistentes [11-15].
HNO3-H2SO4 (70%-98%) 1:3 v/v, y se sometió a reflujo durante 30 min a 80ºC. Finalizado el tiempo, se filtró en
las propiedades mecánicas de los NTC y en este sentido, del
presente
trabajo
fue
DE
para ello se colocó en un balón, 1g NTC y una mezcla
que permite combinar la osteconductividad de la HA y objetivo
NANOTUBOS
Esta modificación se realizó por tratamiento oxidativo,
Por esta
razón desarrollar un material HA/NTC es atractivo ya
el
DE
un frit de placa porosa y se realizaron lavados con agua
sintetizar
desionizada. Se secaron en una estufa de vacío para luego
nanohidroxiapatita sobre los nanotubos de carbono
ser tamizados. SINTESIS DE LOS COMPUESTOS HA-NTC Los compuestos HA-NTC fueron sintetizados por el método de precipitación química de la HA incorporando
19
1% de NTC funcionalizado y 1% sin funcionalizar antes de la adición
de Ca(OH)2 y luego adicionando
(NH4)2HPO4. Los compuestos de HA-NTC se lavaron con agua desionizada y fueron secados en una estufa a
RESULTADOS Y DISCUSION CARACTERIZACIÓN DE LOS NANOTUBOS DE CARBONO
80ºC por 72 horas, para luego ser tamizados. Por medio de MET se pudo observar la morfología tubular del nanotubos antes y después del tratamiento oxidativo. En la imagen de campo claro de MET (Fig 1A) se observó un diámetro promedio de NTC sin funcionalizar de 13.3 ± 0.4 nm. En la imagen de alta resolución (Fig 1B) se presenta la sección transversal de un nanotubo de aproximadamente de 11 paredes, la distancia entre paredes fue de 0.33 ± 0.03 nm, similar al espaciamiento planos.
PREPARACION
DE
LAS
MUESTRAS
PARA
MICROSCOPIA ELECTRONICA DE TRANSMISION (MET) Para la caracterización de
los materiales se utilizó un
Microscopio Electrónico Jeol JEM 2100 con un voltaje acelerador de 100keV. Las muestras analizadas por MET se prepararon vía suspensión húmeda. En el cual se colocó la muestra en un vial y se le añadió una mezcla etanol/agua al 40% y se colocó en ultrasonido, luego con una pipeta Pasteur se tomó una gota y se colocó sobre una rejilla previamente cubierta con una película de colodión.
20
encontrado
en
el grafito para los
Al comparar los NTC antes y después del tratamiento oxidativo (Fig 2A) se observó una disminución a 8 en el número de paredes, con la distancia entre paredes de 0.35± 0.03 nm. 2857cm-1 correspondientes a las vibraciones se encontraron en 3578, 1104, 1040, 969, de HA 612, y 564cm-1 (Fig 4c) y al comparar dichas bandas con las del compuesto HA-NTCf (Fig. 4d) se observaron ligeros desplazamientos en las bandas correspondientes al grupo hidroxilo a 3586 y 961 cm-1 y en la banda del grupos fosfato 1112 cm-1, siendo estos posibles lugares por donde se puede estar dando la interacción entre la HA y el NTCf.
Numerosos autores [16,17] han propuesto el uso de la relación de las bandas D y G, denotada como ID/G, para la caracterización del grado de desorden estructural presente en las muestras analizadas, lo cual es muy importante
para
indicar
la
eficiencia
de
la
funcionalización. Las relaciones de intensidades de estas bandas, así como las posiciones específicas de las mismas se presentan en la Tabla 1.
Intensidad
Posición del pico (cm-1)
(u. a.) Banda Banda
ID/G
Banda
Banda
D
G
D
G
NTC
1345
1577
5359
5042
1,06
NTCf
1346
1574
2192
2062
1,06
Al comparar los nanotubos funcionalizados con los pristinos no se observó cambio alguno en dicha relación ID/G,
lo
cual
permite
suponer
que
con
este
procedimiento el grado de funcionalización alcanzado fue bajo.
En las microscopias obtenidas por MET del compuesto sin funcionalizar (HA-NTCsf) (Fig 5A y 5B), los NTC
SINTESIS DE LOS MATERIALES HA NTC
presentaron diámetro promedio de 13.3 ± 0.03 nm (Fig.
Los FTIR de los NTC pristinos y funcionalizados, HA y
5A), lo cual indica que la presencia de la HA
del compuesto HA-NTCf se muestran en la Fig 4 donde
nanométrica no está modificando el diámetro del NTC
los NTC pristinos (Fig 4a) mostraron las bandas a 22928 y 2857cm-1
correspondientes
a
ni la distancia entre las paredes, la cual fue de 0.34±
las
0.02 nm.
vibraciones . Las micrografías del compuesto HA-NTCf (Fig 6A y 6B) SINTESIS DE LOS MATERIALES HANTC. Los FTIR de los NTC pristinos y funcionalizados, HA y del compuesto HANTCf se muestran en la Fig 4 donde los NTC pristinos (Fig 4a) mostraron las bandas a 2928 y
muestran una mayor interacción de la HA con el nanotubo funcionalizado al compararlos con el sistema HA-NTCsf (Fig 5). El diámetro promedio del material HA-NTCf fue de 10.55± 0.40 nm, el cual fue medido y señalado
21
mediante
flechas
en
la
Fig.
6B,
observándose una disminución importante con respecto HA-NTCsf y confirmando con
estas medidas las
dimensiones nanométricas que presenta el material. Para el material HA-NTCf fue muy difícil observar la distancia entre paredes del NTC. De igual forma en la Figura 6B se observa la distribución no homogénea de la HA sobre la superficie del NTCf debido a que la oxidación química del NTC fue baja y por ello se observan zonas donde no hay HA debido a la ausencia de grupos funcionales. CONCLUSIONES
La baja funcionalización lograda en los nanotubos de carbono,
mejoró la interacción de la HA con la
superficie del nanotubo funcionalizado en comparación al
REFERENCIAS
material HA-NTCsf,. La metodología empleada de funcionalización originó una disminución en el número
[1] Qinggang T., Ke Z.,Shuying G.,Jie R. (2009) “Mineralization of surfactant functionalized multi-
de paredes del NTC.
walled carbon nanotubes (MWNTs) to prepare hydroxyapatite/MWNTs
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Toward Applications” Science 297: 787-792.
Por espectroscopia de Raman
se observó que al
[4] Lan L., Yinghao Z., Yong Z., Christopher O., Sharon (2008)
“Reinforcement
comparar los nanotubos funcionalizados con los pristinos
G.,
no se observó cambio en la relación ID/G, lo cual permite
carboxylated nitrile–butadiene rubber by multi-
suponer que con este procedimiento el grado de
walled carbon nanotubes” Applied Surface Science
funcionalización alcanzado fue muy bajo pero suficiente 255:2162–2166.
para lograr una mejora en el compuesto HA-NTCf.
22
of
hydrogenated
[5] Seeger T.,G. de la Fuente2,Maser W.K ,Benito A.
M.,Callejas M.A, Martinez M.T (2003) “Evolution of multiwalled carbon-nanotube/SiO2 composites via laser treatment” Nanotechnology 14: 184–187. [6] Gojny F.H., Nastalczyk J.,Roslaniec Z., Schulte K., (2003) “Surface modified multi walled carbon nanotubes
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CNT/epoxy-composites”
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Composites”
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23
“CLASES DE REACCIONES QUÍMICAS” Jéssica Figueroa. Ing. Ignacio Echeverria, Egda. Jéssica Chamorro Primero “A” Bioquímica FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS (FCIAL). UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO (UTA). Ciudadela Huachi, Casilla 18-01-0334. E – mail: fcial@uta.edu.ec AMBATO – ECUADOR Palabras claves: Oxido reducción, reacción, materiales, reactivos, combustión, descomposición, energía, ecuación, balanceo. RESUMEN La reacciones químicas se encuentran en varios aspectos de la vida diaria, estas están conformadas por dos elementos fundamentales los cuales son los reactivos y productos; los reactivos son aquellos presentes el principio de la reacción, mientras los productos son aquellos que se forman cuando reaccionan los reactivos en donde existen diferentes clases de reacciones químicas las cuales conoceremos por medio de la práctica, para así poder establecer una relación entre los principios teóricos y los hechos experimentales, en lo cual nos permitiremos diferenciar los tipos de reacciones, ¿cómo? y ¿por qué? se producen, y extraer provecho de ellas. Además de la posibilidad de predecir la reacción de la sustancia en caso futuro y señalando con las evidencias hechas que ocurrió un cambio químico. ABSTRACT The chemical reactions are in various aspects of daily life, these are made up of two key elements which are the reactants and products; reagents are those present the beginning of the reaction, while the products are those formed when reacting the reactants in which there are different kinds of chemical reactions which know through practice, in order to establish a relationship between the theoretical principles and experimental facts, which allow us to differentiate the types of reactions, how? and why? occur, and extracted out of them. Besides the possibility to predict the reaction of the substance in future case and pointing to the evidence made that a chemical change occurred.
24
INTRODUCCIÓN Las reacciones químicas ocurren continuamente en la naturaleza, pero también pueden reproducirse en un laboratorio de forma controlada. Existen varios tipos de procedimientos por medio de los cuales se forman los compuestos dependiendo además del tipo de reacción al que se encuentre sometido, estas reacciones o cambios químicos es todo un proceso donde paso a paso, interactúan una o más sustancias o reactivos, dándole paso a una transformación con propiedades y características distintas.( Contreras S. 2005) Todo esto debido a un factor energético que hace posible que los átomos que forman los reactivos de lugar a los productos. Se conocen millones de reacciones diferentes, y cada día se descubren algunas mas, muchas son de enorme importancia vital o industrial. En ocasiones no es fácil detectar el transcurso de una reacción química. Algunos hechos pueden servirnos como indicativos de un cambio químico; la aparición repentina de sustancias sólidas (Precipitados); el desprendimiento de gases, el aumento o disminución bruscos de temperatura y los cambios de color son, quizás, los más destacados. La importancia de dichas reacciones es notoria en muchos aspectos de la vida diaria en fenómenos tales como explosiones; procesos vitales tales como alimentación, respiración etc. Todas las sustancias que a diario utilizamos son o fueron producto de reacciones químicas con las que en esta práctica nos familiarizaremos. (Gonzalo G, 2014).
1 espátula Papel filtro Clavos de hierro Tubos de ensayo
REACTIVOS Azufre (s) Hierro (s) NH4Cl (s) (NH4)2 Cr2O7 (s) KClO3 (s) Fenolftaleína HCl concentrado HCl diluido H2SO4 concentrado CuSO4 1M NaOH 0,1 M Na2CO3 0,1 M Pb(NO3)2 0,1 M Agua destilada
METODOLOGÍA a) Combinación Hierro (Fe)
Colocar
Azufre (S)
Dejar que se enfríe
Calentar
Añade HCl
Pape filtro
Preparar
Pb(NO3)2 0,1 M
Se ennegrece
Observar
Debido a PbS
OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Identificar los tipos de reacciones químicas que se producen a nivel de laboratorio. OBJETIVO ESPECÍFICOS
Elaborado por: Jéssica Figueroa Fuente: Laboratorio de Química Básica
Observar cuando ocurren dichas reacciones Escribir las ecuaciones químicas que representan a las reacciones de la práctica realizada.
b) Descomposición
MATERIALES Y METODOLOGÍA MATERIALES
1 gradilla 1 mechero 1 pinzas de madera 1 varilla de vidrio
25
Pequeñas bolitas
Tubo de ensayo
Preparar
Papel filtro
Agua destilada
H2SO4 concentrado
Calentar
KClO3
Fundir
Bolitas de papel
La reacción
KClO3
Colocar
Añadir
Observar
Tubo de ensayo
Gota a gota
Anota
Elaborado por: Jéssica Figueroa. Fuente: Laboratorio de Química Básica Lo sucedido
f) Endotérmica Observar
Elaborado por: Jéssica Figueroa Fuente: Laboratorio de Química básica
NH4Cl (s)
Disolver
Tubo de ensayo
El enfriamiento
Observar
Anota
C) Sustitución
CuSO4 1M
Colocar
Tubo de ensayo
Elaborado por: Jéssica Figueroa Fuente: Laboratorio de Química Básica g) Ácido- Base
Un clavo de hierro
Un clavo
HCl
Desprendimiento
Añadir
Colocar
NaOH 0,1 M
Tubo de ensayo
Añadir
Observar
Una gota
Colocar
Tubo de ensayo
Añadir
Fenolftaleína
Cambio de clor
Obeservar
HCl 0,1 M
Añadir
Anota
Elaborado por: Jéssica Figueroa Fuente: Laboratorio de Química básica
Queda incoloro
Elaborado por: Jéssica Figueroa. Fuente: Laboratorio de Química Básica DATOS OBTENIDOS
e) Exotérmica
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Tabla N° 1: Obtención de distintas reacciones químicas
Tipo de reacción Combinación
Descomposició n
Sustitución
Reacción
Observaciones
Fe + S
Se calientan el mechero transformándose a líquido de color rojo que luego se torna negro produciendo un olor desagradable y un color amarillo del humo que se desprende. Se le calienta en el mechero luego alcanza su punto de fusión rápido poniéndose liquido donde se le agrega papel filtro el cual se quema desprendiendo oxígeno. Oxidación del clavo de hierro
KClO3 + papel filtro
CuSO4 + clavo de Fe Na2CO3 + Pb(NO3 )2
En las reacciones químicas realizadas en el laboratorio se obtuvo los siguientes resultados como combinación que es en donde dos reactantes sencillos se combinan para formar un solo producto complejo. Muchos elementos reaccionan con otro de esta manera para formar compuestos como:
Fe(s) + S(s) === Fe S(s)
Donde el hierro se une con el azufre formando sulfuro de hierro las cuales son sustancias puras donde se produjo un olor desagradable por causa del S al contacto con el fuego donde cambio de color y se puso en estado líquido produciendo humo amarillento, esta sustancia dejándola a temperatura ambiente se vuelve sólida. En las reacciones de descomposición se produce cuando una sustancia compleja por acción de diferentes factores, se descompone en otras más sencillas como:
2 KClO3(S) === 2 KCl (l) + 3O2(g)
En esta fórmula unas 2 moléculas de clorato de potasio sólido se descomponen o dividen al momento que se calientan para formar 2 moléculas de cloruro de potasio líquido el cual ayuda a desprender tres moléculas de oxígeno, las cuales son más sencillas que la primera siendo esta una reacción exotérmica.
Forma una sustancia precipitada Agua La solución se Exotérmicas destilada + calienta, H2SO4 liberando energía en el medio que esta. Agua La solución se Endotérmicas destilada + pone fría, NH4 Cl absorbiendo energía del medio. NaOH + 1 La solución de Acido-base gota de torna roja y se le fenolftaleí añade HCl hasta na que se vuelve + HCl incolora. Elaborado por: Jessica Figueroa. Fuente: Laboratorio de Química Básica Doble sustitución
CÁLCULOS Y DISCUSIÓN
En las reacciones de sustitución denominadas también de simple desplazamiento cuando una sustancia simple reacciona con otra compuesta, reemplazando a uno de sus componentes es decir:
CuSO4 (s) + Fe (s) === Fe SO4 (s)
27
En donde el sulfato cúprico reacciona con el clavo de hierro en donde este es el que le desplaza a la solución produciendo la oxidación del clavo.
Mientras que en la reacción de doble sustitución llamada también doble desplazamiento ocurren cuando hay intercambio de elementos entre dos compuestos diferentes y de esta manera originan nuevas sustancias como un precipitado:
Usando la fenolftaleína, se comprueba el carácter ácido de la solución al momento de echar la Fenolftaleína al ser esta solución incolora. Igualmente cuando la solución es básica, al echar fenolftaleína se torna con un rojo grosella. CONCLUSIONES
Las conclusiones que podemos llegar después de haber culminado esta serie de experimentos son las siguientes: En la experimentación realizada en el laboratorio se pudo determinar la reacción de cada uno de los reactivos en su intervención de combustión en donde se pudo identificar las distintas reacciones a nivel de laboratorio. En síntesis podemos decir que las reacciones químicas son de suma importancia ya que son fenómenos que vemos a diario en nuestra vida.
En la práctica de laboratorio observamos como ocurren estas reacciones en donde existen varios tipos de reacciones los cuales son: reacción de combinación, de descomposición, de sustitución y de doble sustitución, etc. todos estos muy diferentes pero cumplen la misma función la formación de uno o varias sustancias y/o compuestos nuevos, los cuales pueden ser de
Na2 (CO3) + Pb (NO3) 2 === Pb (CO3)2 + Na (NO3)
Estas reacciones se presentan cuando las sustancias reaccionantes están en estado iónico por encontrarse en solución, combinándose entre sí sus iones con mucha facilidad, para formar sustancias que permanecen estables en el medio reaccionante. Reacciones químicas de acuerdo a su energía, se presentan las reacciones exotérmicas cuando al producirse, hay desprendimiento o se libera calor.
Reacciones Endotérmicas es cuando es necesaria la absorción de calor para que se puedan llevar a cabo. La energía liberada o absorbida se denomina calor de reacción o entalpía En una reacción exotérmica la entalpía es negativa mientras que en una reacción endotérmica la entalpía es positiva. Reacciones Acido-base también conocidas como reacciones de neutralización las cuales consisten en la unión del H+ proveniente del ácido con el OH- de la base, para producir H2O como por ejemplo: HCl + Na(OH) === NaCl + H2O
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mucha utilidad, o también pueden ser dañinos para la naturaleza.
Ser muy observadores y cuidadosos al realizar el método del balanceo ion-electrón, ya que esto nos permitirá obtener un buen resultado en el balanceo de las ecuaciones.
CUESTIONARIO
1.
En la práctica experimental en el laboratorio debe realizar las ecuaciones químicas que son base de las reacciones que se realizaron y observaron en la práctica desarrollada con ayuda del maestro.
se en se la
Establezca similitudes y diferencias entre los tipos de reacciones
La diferencia básica entre las reacciones inorgánicas y las orgánicas es que las primeras son instantáneas y cuantitativas, en cambio las orgánicas son lentas casi siempre necesitan la presencia de un catalizador para que se inicien y rara vez son cuantitativa en las reacciones orgánicas uno de los compuestos reaccionantes contenga dos o más átomos de carbono, mientras que en las reacciones inorgánicas dos compuestos que no contienen carbono.
2.
Elabore un mapa conceptual de las reacciones químicas que existen realice un ejemplo de cada caso Tipos de Reacciones Químicas A) De acuerdo a las sustancias reaccionantes:
Combinacion: 2 o mas reactivos dan un solo producto. N2 +3H2 = 2NH3
RECOMENDACIONES
Las recomendaciones que podemos dar son las siguientes: Atender las recomendaciones que indica el profesor en la clase. Él tiene una mayor experiencia y puede aclarar las dudas que se nos presentan. Al momento de trabajar con soluciones y entre ellas ácidos fuertes y débiles, es indispensable usar guantes de seguridad, máscaras de seguridad y lentes de seguridad. Realizar buenas mediciones y trasvases de los reactivos sin exagerar las mediciones para el uso.
Descomposicion: a partir de un solo recativo se obtienen dos o mas productos. 4AgNO3 + luz = 2AgO + O2 + 4 NO2
Masa molecular Sustitucion: cuando una sustancia simple reacciona con otra compuesta, reemplazando a uno de sus componentes. Zn + 2 HCl = ZnCl2+ h2
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Doble sustitucion: cuando hay intercambio de elementos entre dos compuestos diferentes y de esta manera originan nuevas sustancias. Ag NO3+ HCl = HNO3+ AgCl
De acuerdo a su energía:
Fe(s) + S(s) === Fe S(s) Descomposición 2 KClO3(S) === 2 KCl (l) + 3O2(g) Sustitución
Reacciones Exotérmicas: Cuando al producirse, hay desprendimiento o se libera calor CaO = Ca (OH)2 + Calor
Reacciones Endotérmicas: Cuando es necesario la absorción de calor para que se puedan llevar a cabo. 2 KClO3 + calor= 2 KCl +3O2
CuSO4 (s) + Fe (s) === Fe SO4 (s) Doble sustitución Na2 (CO3) + Pb (NO3) 2 === Pb (CO3)2 + Na (NO3) Exotérmicas H2 O + H2SO4 == H2 O + H2SO4 + 116 K cal Endotérmicas H2O + NH4 Cl == NH4- + ClAcido-base
C) Reacciones Especiales:
HCl + Na(OH) === NaCl + H2O Reacción de Haber: Permite obtener el amoniaco partiendo del hidrógeno y nitrógeno de las sustancias: N2 + 3H2 ? 2NH3
BIBLIOGRAFÍA:
Reacción Termoquímica: En estas reacciones se indica la presión, temperatura y estado físico de los elementos.
Reacción de Combustión: En estas reacciones, el oxígeno se combina con una sustancia combustible y como consecuencia se desprende calor y/o luz. Reacción Catalítica: Se acelera por la intervención de sustancias llamadas catalizadores que permanecen inalterables al final de la reacción.
Reacción REDOX:Reacciones en donde hay variación de los estados de oxidación de las sustancias por transferencia de electrones.
Reacción de Neutralización: Consiste en la reacción de un ácido con una base.
3.
Realice las reacciones que resultaron de la práctica dada
Combinación
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