Imobilizacija na enzimot invertaza vrz razli~ni nosa~i
Avtori : Nata{a Angelkovska Kiril Lisi~kov Julijana Savi}
Mentor : Dr. Slobodanka Kuzmanova
TMF -Skopja Institut za biotehnologija
Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog
e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991 , vo 2009 god.
Imobilizacija na enzimot invertaza razli~ni nosa~i
vrz
N.Angelkovska, K. Lisi~kov, J. Savi} Mentor : S. Kuzmanova Tehnolo{ko-Metalur{ki fakultet , Skopje Enzimot invertaza izoliran od kvasec ( S. cerevisiae) od zbirkata na kulturi na Tehnolo{ko-Metalur{ki fakultet, Skopje e imobiliziran so primena na razli~ni tehniki na razli~ni nosa~i. Invertazata e apsorbirana na aktiven jaglen, kisel gur, bel opaliziran tuf, silika gel a vronuvaweto e sprovedeno vo vid na alginatni perli. Primeneta e tehnika nakrsno vrzuvawe so glutar aldehid . Imobilizacijata e izveduvana vo stati~ki i dinami~ki uslovi. Sporedbata na efikasnosta na razli~ni nosa~i e napravena preku sporeduvawe na aktivnosta na slobodniot i imobiliziraniot enzim.
Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog
e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991
Imobilizacija na razli~ni nosa~i
invertazata
vrz
Imobiliziran e enzimot invertaza vrz razli~ni nosa~i preku vrzuvawe vrz povr{inata na nositelot so atsorpcija i so vklu~uvawe vo nosa~ite so jonotropno `elirawe. Ispituvana e pogodnosta na nosa~ite za dobivawe na imobiliziran sistem. Celta na imobilizacijata e da go stabilizira kataliti~kiot potencijal na enzimot vo to~no definiran oblik optimalen za tehnolo{ka i analiti~ka upotreba.
Postapkata na rabota se sostoi od dobivawe i pre~istuvawe na enzimot, tehniki na imobilizacija i merewe na aktivnosta na imobiliziraniot sistem. Imobilizacijata so atsorpcija e najednostavna, no ima i svoi nedostatoci. Vrz stabilnosta na sistemot vlijaat i nezna~itelni promeni na pH, temperatura, priroda na rastvoruva~, jonski sili i dr. seto toa mo`e da predizvika desorpcija, no atsorpcijata e takov metod na imobilizacija koj po pravilo slabo vlijae na na kataliti~kata aktivnost na enzimot.
Ispituvana e i pogodnosta na nosa~i so cel da se dobie najdobar nosa~ pri isti uslovi za site imobilizacii. Raboteno e pri uslovi na optimalna aktivnost na enzimot pH = 5, T= 28 o C .
Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog
e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991
Izolacija i pre~istuvawe na enzimot invertaza 1.Izolacija :
1.2 postapka : 1.
Kvasno mleko 150 ml
Trihlor eten 0.3 ml
1.1 materijali : 1. presuvan kvasec masa m = 50 g
Termoliza vo ultratermostat temperatura t = 50 o C ; vreme t = 2.5 h
2. destilirana voda volumen v = 100 ml
Homogenizacija so magnetna me{alka vreme t = 30 min
3. trihlor eten volumen v = 0.3 ml
Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min vreme t = 10 min
2.Pre~istuvawe: 2.1 materijali : 1. supernatant so enzimot invertaza 2. CH3 COOH 0.1 M 3. CH3 CH2 OH 4. mraz 5. glicerin voden rastvor 25% volumen v = 15 ml
talog
Supernatant so enzimot invertaza
2.2. postapka : 2. Se dodava CH3 COOH 0.1M do pH =5 Se ladi na temperatura t = 00 C
Se dodava CH3 CH2 OH o laden na t = 0 C vo koli~ina 1 : 1.5 Talo`ewe vo vreme t = 30 min , 0 na temperatura t= 0 C
Centrifugirawe so n = 3000vrt/min vreme t = 10 min Se dodava glicerin voden rastvor 25% volumen v = 15 ml
talog
supernatant
Rastvor na invertaza na optimalni uslovi 0 temperatura t = 28 C, pH= 5
Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog
e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991
Jonotropno `elirawe na enzimot invertaza Na - alginat 1%
1. Alginatni perli :
1.2 postapka : 1.
enzim invertaza rastvor volumen v = 3 ml
1.1 materijali : 1. Na - alginat 1% 2. enzim invertaza rastvor volumen v = 3 ml 3. Ca Cl2 0.1 M volumen v = 200 ml
Se kapnuvaat kapki vo r-or Ca Cl2 0.1 M , volumen v = 200 ml
Perlite se `eliraat vo r-or Ca Cl2 0.1 M vreme t = 24 h
Gotovi alginatni perli
2. Alginatni perli so gluteraldehid: 2.2 postapka : 1.
smesa : 1. i-propanol volumen v = 35 ml 2.destilirana voda volumen v = 20 ml 3. gluteraldehid 25% volumen v = 2 ml
Gotovi alginatni perli
2.1 materijali : 1. gotovi alginatni perli 2. smesa : 1. i-propanol volumen v = 35 ml 2.destilirana voda volumen v = 20 ml 3. gluteraldehid 25% volumen v = 2 ml
Se dodava smesata na perlite i se ostava vreme t = 60 min , temperatura t = 25 oC
Gotovi alginatni perli so gluteraldehid 3. CMC Karboksimetil Celuloza 3.1 materijali 1. Na-CMC Masa m= 0.5 g 2. smesa 2.1. destilirana voda volumen v= 5 ml 2.2. enzimski preparat Volumen v= 3 ml 2.3. citraten pufer Volumen v= 0.1 ml pH = 5 3. citraten pufer Volumen v= 10 ml pH = 5
Na-CMC, m= 0.5 g Karboksimetil Celuloza
Smesa: 1. destilirana voda , v= 5 ml 2. citraten pufer , v= 0.1 ml , pH=5 3. enzimski preparat , v= 3ml
CMC i smesata se ostava na tresilka Vreme t = 60 min , n = 90 vrte`i/ min
Centrifugirawe Vreme t = f (nosa~) , n = 3000 vrte`i/ min
Talogot se promiva so Citraten pufer , v = 10 ml
Centrifugirawe Vreme t = f (nosa~) , n = 3000 vrte`i/ min Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog
Supernatant
Supernatant
Na Talogot se dodava Citraten pufer , v = 10 ml
e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991
Atsorpcija 1.Nosa~i :
1.2 postapka :
1.1 aktiven jaglen 5g 1.2 kiselgur 5g 1.3 opaliziran tuf 5g 1.4 silika gel 5g 2. Materijali : 1. rastvor invertaza volumen v = 3 ml 2. destilirana voda volumen v = 15 ml 3. citraten pufer pH = 5
1. Dinami~ka Atsorpcija Nosa~ 5g
Destilirana voda 15 ml
Invertaza r-or 3 ml
Smesata se ostava na tresilka Vreme t = 60 min , n = 90 vrte`i/ min temperatura t = 50 o C
Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min
Se dodava pufer volumen v = 18 ml
Promivawe na talogot so pufer so volumen v =18 ml
supernatant
Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min
Se dodava pufer volumen v = 18 ml
talog
supernatant
Se dobiva ENZIM-NOSA^ kompleks so Dinami~ka Atsorpcija
Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog
e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991
Atsorpcija 1.Nosa~i :
1.2 postapka :
1.1 aktiven jaglen 5g 1.2 kiselgur 5g 1.3 opaliziran tuf 5g 1.4 silika gel 5g
1. Stati~ka Atsorpcija Nosa~ 5g
Destilirana voda 15 ml
Invertaza r-or 3 ml
Smesata se ostava da odstoi Vreme t = 60 min
2. Materijali : 1. rastvor invertaza volumen v = 3 ml 2. destilirana voda volumen v = 15 ml 3. citraten pufer pH = 5
Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min
Se dodava pufer volumen v = 18 ml
Promivawe na talogot so pufer so volumen v =18 ml
supernatant
Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min
Se dodava pufer volumen v = 18 ml
talog
supernatant
Se dobiva ENZIM-NOSA^ kompleks so Stati~ka Atsorpcija
Stati~kata atsorpcija se izveduva analogno kako {to se izveduva dinami~kata atsorpcija samo bez prestojuvawe na tresilka.
Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog
e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991
Ispituvawe na aktivnost na imobilizirani sistemi 1.Materijali :
Enzim i Nosa~
Saharoza 10% r-or 100 ml
1.1 site nosa~i so enzimot invertaza 1.2 10 % saharoza So citraten pufer Volumen v = 10 ml, pH = 5
Smesata se ostava da odstoi Vreme t = 40 min Vo tekot na toa vreme se zemaat probi
Se zemaat 8 probi, v= 4ml, na sekoi 5 min
1.3 DNS reagens Probata so volumen v= 4 ml se inaktivira so zagrevawe do vriewe
Po potreba se filtrira i se zema od proba volumen v= 1ml za DNS analiza
Se dobivaat podatoci od spektrofotometar
Se ~itaat od standardna kriva Procentot % na reduktivni {e}eri vo probata
Se vnesuvaat podatocite vo tabeli
Se prika`uvaat podatocite so grafici
Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog
e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991