1 del imobilizacija na enzim invertaza

Imobilizacija na enzimot invertaza vrz razli~ni nosa~i

Avtori : Nata{a Angelkovska Kiril Lisi~kov Julijana Savi}

Mentor : Dr. Slobodanka Kuzmanova

TMF -Skopja Institut za biotehnologija

Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog

e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991 , vo 2009 god.

Imobilizacija na enzimot invertaza razli~ni nosa~i

vrz

N.Angelkovska, K. Lisi~kov, J. Savi} Mentor : S. Kuzmanova Tehnolo{ko-Metalur{ki fakultet , Skopje Enzimot invertaza izoliran od kvasec ( S. cerevisiae) od zbirkata na kulturi na Tehnolo{ko-Metalur{ki fakultet, Skopje e imobiliziran so primena na razli~ni tehniki na razli~ni nosa~i.

Invertazata e apsorbirana na aktiven jaglen, kisel gur, bel opaliziran tuf, silika gel a vronuvaweto e sprovedeno vo vid na alginatni perli. Primeneta e tehnika nakrsno vrzuvawe so glutar aldehid . Imobilizacijata e izveduvana vo stati~ki i dinami~ki uslovi.

Sporedbata na efikasnosta na razli~ni nosa~i e napravena preku sporeduvawe na aktivnosta na slobodniot i imobiliziraniot enzim.

Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog

e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991

Imobilizacija na razli~ni nosa~i

invertazata

vrz

Imobiliziran e enzimot invertaza vrz razli~ni nosa~i preku vrzuvawe vrz povr{inata na nositelot so atsorpcija i so vklu~uvawe vo nosa~ite so jonotropno `elirawe. Ispituvana e pogodnosta na nosa~ite za dobivawe na imobiliziran sistem. Celta na imobilizacijata e da go stabilizira kataliti~kiot potencijal na enzimot vo to~no definiran oblik optimalen za tehnolo{ka i analiti~ka upotreba.

Postapkata na rabota se sostoi od dobivawe i pre~istuvawe na enzimot, tehniki na imobilizacija i merewe na aktivnosta na imobiliziraniot sistem. Imobilizacijata so atsorpcija e najednostavna, no ima i svoi nedostatoci. Vrz stabilnosta na sistemot vlijaat i nezna~itelni promeni na pH, temperatura, priroda na rastvoruva~, jonski sili i dr. seto toa mo`e da predizvika desorpcija, no atsorpcijata e takov metod na imobilizacija koj po pravilo slabo vlijae na na kataliti~kata aktivnost na enzimot.

Ispituvana e i pogodnosta na nosa~i so cel da se dobie najdobar nosa~ pri isti uslovi za site imobilizacii. Raboteno e pri uslovi na optimalna aktivnost na enzimot pH = 5, T= 28 o C .

Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog

e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991

Izolacija i pre~istuvawe na enzimot invertaza 1.Izolacija :

1.2 postapka : 1.

Kvasno mleko 150 ml

Trihlor eten 0.3 ml

1.1 materijali : 1. presuvan kvasec masa m = 50 g

Termoliza vo ultratermostat temperatura t = 50 o C ; vreme t = 2.5 h

2. destilirana voda volumen v = 100 ml

Homogenizacija so magnetna me{alka vreme t = 30 min

3. trihlor eten volumen v = 0.3 ml

Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min vreme t = 10 min

2.Pre~istuvawe: 2.1 materijali : 1. supernatant so enzimot invertaza 2. CH3 COOH 0.1 M 3. CH3 CH2 OH 4. mraz 5. glicerin voden rastvor 25% volumen v = 15 ml

talog

Supernatant so enzimot invertaza

2.2. postapka : 2.

Se dodava CH3 COOH 0.1M do pH =5 Se ladi na temperatura t = 00 C

Se dodava CH3 CH2 OH o laden na t = 0 C vo koli~ina 1 : 1.5 Talo`ewe vo vreme t = 30 min , 0 na temperatura t= 0 C

Centrifugirawe so n = 3000vrt/min vreme t = 10 min Se dodava glicerin voden rastvor 25% volumen v = 15 ml

talog

supernatant

Rastvor na invertaza na optimalni uslovi 0 temperatura t = 28 C, pH= 5

Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog

e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991

Jonotropno `elirawe na enzimot invertaza Na - alginat 1%

1. Alginatni perli :

1.2 postapka : 1.

enzim invertaza rastvor volumen v = 3 ml

1.1 materijali : 1. Na - alginat 1% 2. enzim invertaza rastvor volumen v = 3 ml 3. Ca Cl2 0.1 M volumen v = 200 ml

Se kapnuvaat kapki vo r-or Ca Cl2 0.1 M , volumen v = 200 ml

Perlite se `eliraat vo r-or Ca Cl2 0.1 M vreme t = 24 h

Gotovi alginatni perli

2. Alginatni perli so gluteraldehid: 2.2 postapka : 1.

smesa : 1. i-propanol volumen v = 35 ml 2.destilirana voda volumen v = 20 ml 3. gluteraldehid 25% volumen v = 2 ml

Gotovi alginatni perli

2.1 materijali : 1. gotovi alginatni perli 2. smesa : 1. i-propanol volumen v = 35 ml 2.destilirana voda volumen v = 20 ml 3. gluteraldehid 25% volumen v = 2 ml

Se dodava smesata na perlite i se ostava vreme t = 60 min , temperatura t = 25 oC

Gotovi alginatni perli so gluteraldehid 3. CMC Karboksimetil Celuloza 3.1 materijali 1. Na-CMC Masa m= 0.5 g 2. smesa 2.1. destilirana voda volumen v= 5 ml 2.2. enzimski preparat Volumen v= 3 ml 2.3. citraten pufer Volumen v= 0.1 ml pH = 5 3. citraten pufer Volumen v= 10 ml pH = 5

Na-CMC, m= 0.5 g Karboksimetil Celuloza

Smesa: 1. destilirana voda , v= 5 ml 2. citraten pufer , v= 0.1 ml , pH=5 3. enzimski preparat , v= 3ml

CMC i smesata se ostava na tresilka Vreme t = 60 min , n = 90 vrte`i/ min

Centrifugirawe Vreme t = f (nosa~) , n = 3000 vrte`i/ min

Talogot se promiva so Citraten pufer , v = 10 ml

Centrifugirawe Vreme t = f (nosa~) , n = 3000 vrte`i/ min Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog

Supernatant

Supernatant

Na Talogot se dodava Citraten pufer , v = 10 ml

e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991

Atsorpcija 1.Nosa~i :

1.2 postapka :

1.1 aktiven jaglen 5g 1.2 kiselgur 5g 1.3 opaliziran tuf 5g 1.4 silika gel 5g 2. Materijali : 1. rastvor invertaza volumen v = 3 ml 2. destilirana voda volumen v = 15 ml 3. citraten pufer pH = 5

1. Dinami~ka Atsorpcija Nosa~ 5g

Destilirana voda 15 ml

Invertaza r-or 3 ml

Smesata se ostava na tresilka Vreme t = 60 min , n = 90 vrte`i/ min temperatura t = 50 o C

Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min

Se dodava pufer volumen v = 18 ml

Promivawe na talogot so pufer so volumen v =18 ml

supernatant

Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min

Se dodava pufer volumen v = 18 ml

talog

supernatant

Se dobiva ENZIM-NOSA^ kompleks so Dinami~ka Atsorpcija

Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog

e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991

Atsorpcija 1.Nosa~i :

1.2 postapka :

1.1 aktiven jaglen 5g 1.2 kiselgur 5g 1.3 opaliziran tuf 5g 1.4 silika gel 5g

1. Stati~ka Atsorpcija Nosa~ 5g

Destilirana voda 15 ml

Invertaza r-or 3 ml

Smesata se ostava da odstoi Vreme t = 60 min

2. Materijali : 1. rastvor invertaza volumen v = 3 ml 2. destilirana voda volumen v = 15 ml 3. citraten pufer pH = 5

Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min

Se dodava pufer volumen v = 18 ml

Promivawe na talogot so pufer so volumen v =18 ml

supernatant

Centrifugirawe so n = 3000 vrt/min

Se dodava pufer volumen v = 18 ml

talog

supernatant

Se dobiva ENZIM-NOSA^ kompleks so Stati~ka Atsorpcija

Stati~kata atsorpcija se izveduva analogno kako {to se izveduva dinami~kata atsorpcija samo bez prestojuvawe na tresilka.

Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog

e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991

Ispituvawe na aktivnost na imobilizirani sistemi 1.Materijali :

Enzim i Nosa~

Saharoza 10% r-or 100 ml

1.1 site nosa~i so enzimot invertaza 1.2 10 % saharoza So citraten pufer Volumen v = 10 ml, pH = 5

Smesata se ostava da odstoi Vreme t = 40 min Vo tekot na toa vreme se zemaat probi

Se zemaat 8 probi, v= 4ml, na sekoi 5 min

1.3 DNS reagens Probata so volumen v= 4 ml se inaktivira so zagrevawe do vriewe

Po potreba se filtrira i se zema od proba volumen v= 1ml za DNS analiza

Se dobivaat podatoci od spektrofotometar

Se ~itaat od standardna kriva Procentot % na reduktivni {e}eri vo probata

Se vnesuvaat podatocite vo tabeli

Se prika`uvaat podatocite so grafici

Kontakt podatoci Julijana Savi}-Dineva Dipl.in`. biotehnolog

e-mail : savicdineva@yahoo.com Obrabotka na istra`uva~ki trud od 1991 god. TMF Skopje, Tehnologijada BUDVA 1991