Estudio medico 01

Actividad Neuroprotectora

Diferencial de dos diferentes Extractos de semilla de uva

Keishi Narita1, Masashi Hisamoto2, Tohru Okuda2, Sen Takeda1* 1 Department of Anatomy and Cell Biology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine & Engineering, University of Yamanashi, Yamanashi, Japan, 2 The Institute of Enology and Viticulture, University of Yamanashi,Yamanashi, Japan

Resumen

L

a Excitotoxicidad del glutamato es uno de los principales eventos que tienen lugar durante varias lesiones neurotóxicas como la isquemia.

Hemos preparado extractos de semilla de uva, a partir de dos variedades diferentes, que contienen altas cantidades de polifenoles, pero poco resveratrol. Sus efectos neuroprotectores se investigaron mediante cultivo primario de neuronas del hipocampo de ratones en etapa neonatal tratados con una concentración de excitotoxicidad del glutamato. Koshu, una variedad blanca, locales de V. vinifera, alivió la inactivación de ERK1 / 2 y la retracción de dendritas en las neuronas del hipocampo en cultivo expuestas a una concentración tóxica de glutamato (1,0 ng / ml). Por el contrario, Muscat Bailey A, a, variedad híbrida rojo (Muscat Humburg 6Bailey), no se presentó ningún efecto neuroprotector.A diferencia de factor neurotrófico derivado del cerebro y otras citoquinas neuroprotectores, extracto de Koshu no lo hizo inducir la fosforilación de Akt. Extracto de Koshu también aumentó la tasa de supervivencia de la neurona 24 horas después de la toxicidad del glutamato.

La comparación de polifenoles entre las dos muestras por cromatografía líquida / espectrometría de masas de tiempo de vuelo, Koshu demostrado que tenía mayores cantidades de polifenoles de bajo peso molecular

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junto con-específica Koshu varios oligómeros de procianidinas. Estos datos sugieren la presencia de dianas moleculares de alta afinidad para los polifenoles en el hipocampo, neuronas, que inducen efectos neuroprotectores de una manera diferente de BDNF, y la importancia de bajo peso molecular polifenoles de peso y / u oligómeros de procianidina para la neuroprotección.

Citation: Narita K, Hisamoto M, Okuda T,Takeda S (2011) Differential Neuroprotective Activity of Two Different Grape Seed Extracts. PLoS ONE 6(1): e14575. doi:10.1371/journal.pone.0014575 Editor: Kazutaka Ikeda, Tokyo Institute of Psychiatry, Japan Received June 11, 2010; Accepted December 27, 2010; Published January 24, 2011 Copyright: _ 2011 Narita et al. This is an openaccess article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Funding:This study was supported by a University Yamanashi Grape Polyphenols project from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science & Technology. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * E-mail: stakeda@yamanashi.ac.jp

Introducción: Los polifenoles son un grupo grande de compuestos químicos que posee grupos fenólicos, que exhiben propiedades antioxidantes.

Miles de compuestos polifenolicos son de origen natural, se cree que existen en las plantas, incluidas las frutas y verduras. Los estudios epidemiológicos sugieren que el aumento de consumo de verduras y frutas, tiene efectos beneficiosos sobre la salud humana, porque los polifenoles naturales han sido considerados como la principales elementos responsables [1]. Por ejemplo, la relativamente baja incidencia de ataques cardíacos en la población francesa es atribuible en parte al consumo de vino tinto, que es rico en polifenoles [2].

Hasta ahora, los polifenoles mejor caracterizados en este contexto son el resveratrol estilbeno uva y el té galato de epigalocatequina flavonoide (EGCG). Se ha demostrado que los polifenoles no sólo actúan como antioxidantes simples, sino también interactuar con dianas moleculares específicas directa e indirectamente dentro de la célula, la modulación de las vías de señalización celular distinta a entre sí [3,4,5]. Por ejemplo, Balasubramanian y Eckert demostraron que el EGCG estimulo la diferenciación de queratinocitos, mientras que la apigenina y la curcumina exhibe lo contrario efecto [6]. Del mismo modo, Yazawa et al. Reporto que el mecanismo neuroprotector de la curcumina, ácido tánico y (+) - catequina son diferentes unos de otros [7].

El resveratrol ha demostrado que diversos efectos biológicos beneficiosos, tales como protector contra enfermedades cardiovasculares, anti-inflamatorio o actividades anticancerígenas. El

resveratrol también ha demostrado que puede pasar la barrera hematoencefálica (BBB) y ejercer efecto neuroprotector, y por lo tanto su uso para la prevención y tratamiento de ambas enfermedades neurodegenerativas agudas y crónicas, tales como isquemia cerebral y la enfermedad de Alzheimer, se ha investigado [8,9,10]. Teniendo en cuenta la gran diversidad estructural de compuestos polifenólicos, uno podría esperar que habria muchos otros polifenoles y / o sus diversas combinaciones eso sería inducir efectos biológicos únicos beneficos para nuestra salud.

Las Semillas de la uva, que se eliminan como orujo, durante el proceso de elaboración del vino, también son conocidas por ser una rica fuente de polifenoles. A diferencia de la piel, se conoce que las semillas de uva para contienen poco resveratrol [11]. En el presente estudio, con el fin de investigar los posibles efectos neuroprotectores de polifenoles y en que se diferencias con el resveratrol, elegimos extractos de semilla de uva (GSE) de dos diferentes variedades.

Koshu (KOS) es un blanco,Yamanashinativa variedad de V. vinifera, que se dice que han sido importados de China a Japón, hace 800 a 1200 años [12]. Muscat Bailey A (MBA) es un híbrido rojo. Mediante el análisis de los primeros cambios de culta las neuronas del hipocampo en respuesta a una concentración de exitoxinas del glutamato, se demuestra que la KOS pero no posee MBA actividades neuroprotectoras. Además, por comparación del contenido de polifenoles entre las dos GSE, también se demuestran diferencias en la composición de polifenoles y entre KOS MBA.

RESULTADOS. Extracto de semilla de uva Koshu protege ERK1 / 2 fosforilación en las neuronas del hipocampo en cultivo durante la excitotoxicidad del glutamato.

Para evaluar los efectos neuroprotectores de la KOS y MBA GSE, las neuronas del hipocampo de ratón en cultivo se trataron con una concentración excitotoxicidad del glutamato en presencia de diversos concentraciones de GSE, y los niveles de ERK1 / 2 fosforilación se cuantificaron por el Western Blot. Tratamiento en el que cultivaron las neuronas del hipocampo con glutamato 50 mM solo durante 30 min causando una severa reducción de ERK1 / 2 fosforilación a casi niveles no detectados (Figura 1A). Sin embargo, cuando se trataron células con glutamato 50 mM en presencia de diferentes concentraciones de KOS GSE, un modesto, pero significativo, de protección de ERK1 / 2 fosforilación se observó a 1,0 ng / ml (Figura 1A). Superior concentraciones de KOS GSE no alivian ERK1 / 2 desfosforilación. De hecho, un tratamiento durante la noche con 0,100 ng / ml Solo KOS GSE parecía ser citotóxico, ya que altera la morfología de las neuronas del hipocampo en cultivo celular y reducida número (datos no presentados). Por el contrario, MBA GSE no protegió ERK1 / 2 fosforilación durante la excitotoxicidad del glutamato con toda las concentraciones ensayadas (Figura 1A). KOS GSE no tuvo ningún efecto sobre Fosforilación de Akt en las neuronas cultivadas (Figura 1B).T ambién se realizo otro experimento de control para ver el efecto de KOS GSE perse en la fosforilación de ERK, en ausencia de glutamato lesión. El tratamiento con diferentes concentraciones de KOS GSE solo durante 30 min no mostró ningún efecto significativo sobre Erk1 / 2 fosforilación en las neuronas del hipocampo en cultivo (Figura 1C). Estos datos demuestran que colectivamente KOS GSE específicamente protege Erk1 actividad / 2 en las neuronas del hipocampo en cultivo durante estrés de excitotoxicidad, en un rango de concentración estrecho (1,0 ng / ml).

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Koshu GSE también protege la dendrita de procesamiento de las neuronas del hipocampo durante la excitotoxicidad del glutamato A continuación, se validó el efecto protector del GSE basado en morfología neuronal. En condiciones normales, del hipocampo en cultivos de neuronas en 8 días in vitro (DIV) se extienden mucho, altamente ramificadas las dendritas y están fuertemente conectadas una a otra, como asociada a microtúbulos demostrada por inmunotinción para proteína 2 (MAP2) (Figura 2A y B). Sin embargo, cuando las neuronas fueron tratados con glutamato durante 30 min, destacaron las neuronas que exhibieron cambios morfológicos.

Los efectos perjudiciales de glutamato en morfología neuronal fueron reconocidos tan bajo como 10-20 mM, en que algunas dendritas MAP2positivos mostraron una irregular tinción puntiforme, indicativo de daño neuronal (datos no presentados).

Cuando las neuronas se expusieron a 50 mM de glutamato, la longitud y el ramificación de las dendritas en las redes neuronales, se redujo fuertemente (Figura 2B). Un análisis morfométrico indicó que la media de la longitud de las dendritas de las neuronas estresadas se redujo en un 50%, en comparación con el control sin tratar (Figura 2C). Cuando las células fueron tratadas con glutamato 50 mM en presencia de 1,0 ng / ml KOS GSE, la red dendrítica tiende a conectar neuronas distantes, así como el número de ramas parecía estar mejor conservado en comparación con las células tratadas con glutamato solo (Figura 2B). El tratamiento con KOS GSE también alivia la reducción en la media dendrita longitud significativamente

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(Figura 2C). Por otra parte, 1,0 ng / ml MBA GSE no mostró ningún efecto protector sobre arborización dendrítica durante la excitotoxicidad del glutamato, que era consistentes con los datos de fosforilación de ERK1 / 2. estos datos indicado que KOS, pero no MBA GSE, dendrítica protegida arborización de las neuronas del hipocampo expuesto a excitotóxica concentraciones de glutamato.

Efectos neuroprotectores de Koshu GSE después de glutamato en tratamiento Para determinar el efecto neuroprotector de KOS GSE en neuronas expuestas al glutamato, se realizó un experimento de supervivencia celular. Las neuronas del hipocampo fueron tratadas con 50 mM glutamato en presencia o ausencia de 1,0 ng / ml para KOS GSE 10 min, y se dejó recuperar en un medio condicionado durante 24 horas.

Las células se fijaron y se inmunotiñeron para MAP2 (Figura 3A) a identificar neuronas supervivientes y analizar la longitud de las dendritas.

En las muestras tratadas con glutamato solo, aproximadamente el 15% de las neuronas sobrevivido (Figura 3B). La tasa de supervivencia aumentó a 23% después de KOS GSE durante la agresión con glutamato (Figura 3B). El análisis morfométrico demostró también que la dendrita media longitud en las neuronas tratadas con KOS GSE era más largo que los tratados con glutamato solo (Figura 3B). Estos datos indicaron que KOS GSE no sólo protegió la arborización dendrítica, sino también la supervivencia celular aumentada

de las neuronas del hipocampo en cultivo después de la Agresión con glutamato. Para profundizar en los mecanismos moleculares de la neuroprotección por KOS GSE, se investigó los niveles de caspasa-3 activa por Western blot.

epicatequina y procianidinas B1 y B2, fueron detectado en el GSE tanto de KOS y MBA (Figura 5 y Tabla 1).Además de estas cuatro principales polifenoles, ácido gálico También se detectó como un compuesto fenólico común.Además, varios picos adicionales se observaron sólo en el KOS GSE eluyente de la Cuando se examinaron los niveles columna de cromatografía líquida (Figura de caspasa-3 activa inmediatamente 5). después de un tratamiento de 30 min con glutamato 50 mM en la presencia La mayoría de estos compuestos de concentraciones variables de únicos para KOS fueron identificados KOS GSE, se observó un aumento como procianidina oligómeros por la en los niveles de caspasa-3 activa siguiente masas de tiempo de vuelo en todas las muestras tratadas con espectrometría (Tabla 1, asteriscos). No glutamato, sin correlación con las se detectó Resveratrol en cualquiera concentraciones KOS GSE (Figura de GSE. En KOS GSE, la molécula más 4A). Sin embargo, 6 horas después abundante fue epicatequina, seguido de de la lesión, los niveles de activos catequina y procianidinas B1 y B2 en caspasa-3 reducidos y retornaron a MBA GSE, el contenido de catequina los niveles normales en las neuronas y epicatequina fueron similares a cada tratadas con 1,0 ng / ml KOS GSE, uno otra. Las cantidades totales de estos mientras que las neuronas tratadas compuestos eran 154 y 60 mg / g GSE sin KOS GSE mostró una activación para KOS y MBA, respectivamente sostenida de la caspasa-3 (Figura 4B). (Cuadro 2). El resto del peso total Estos datos sugieren que la vía de la fue más probable compuesto de alto apoptosis puede ser un objetivo de peso molecular polifenoles tales como KOS GSE. proantocianidinas. Estos datos indicaron que KOS y MBA GSE contienen Comparación de los contenidos diferente composición en polifenoles polifenólicosentredosextractos compuestos, y que KOS GSE mostró un mayor contenido de pequeños de semilla de uva polifenoles peso molecular y oligómeros de procianidina de MBA. La cuantificación de fenoles totales en las dos GSE por la libre ensayo de depuración radical demostró que las cantidades eran 85,5% y 73,7% para KOS y MBA, respectivamente para investigar la diferencia en la composición del polifenólico contenidos entre KOS y MBA GSE, se sometieron muestras a cromatografía líquida / espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC /TOFMS) análisis como se describe en los Materiales y Métodos.

Cuatro relativamente pequeños polifenoles peso molecular, catequina,

Figura 1

Figura 2

Figura 3

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Figura 1. Koshu GSE alivia la inactivación inducida por el glutamato de ERK1 / 2 en las neuronas del hipocampo en cultivo. (A) Top, la detección de fosforilados ERK1 / 2 en las neuronas del hipocampo en cultivo por Western blot. Las neuronas fueron tratados con glutamato 50 mM solas o en presencia de concentraciones indicadas (en ng / ml) de KOS o MBA durante 30 min.

El inmunoblot para el total de ERK1 / 2 muestra la igualdad de carga. Abajo, la cuantificación de fosfato ERK1 / 2 niveles de análisis de imágenes (n = 5).

Se muestran los valores relativos a los controles no tratados (grupo al 100%). *, P, 0,05 frente a no tratada y controlada. (B) Las neuronas del hipocampo fueron tratados con glutamato 50 mM con o sin concentraciones indicadas (en ng / ml) de KOS GSE durante 30 min, y 200 mg de proteína total fueron cargados en cada carril para análisis de estern blot para fosfo y Akt total.

La fosforilación de Akt basal apareció disminuido ligeramente a agresión con glutamato. KOS GSE no mostró ningún efecto protector sobre los niveles basales de fosforilación de Akt. (C) El efecto de KOS GSE solo en ERK1 / 2 fosforilación en las neuronas del hipocampo en cultivo.

A

doi: 10.1371 / journal.pone.0014575.g002

B

Las células se trataron con las concentraciones indicadas (en ng / ml) de KOS GSE para 30 min. Top, representativas imágenes de Western blot de fosfo y total de ERK1 / 2. En pocas palabras, una cuantificación del fosfato ERK1 / 2 niveles por imagen análisis (n = 3).

doi: 10.1371 / journal.pone.0014575. g001 Neuroprotección por semillas de uva PLoS

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Figura 2. Koshu GSE protege procesamiento de dendritas de las neuronas del hipocampo en cultivo expuestas a una concentración tóxica de glutamato.

(A) Imagen Representante de las neuronas del hipocampo sin tratar a las 8 DIV inmunotiñó para MAP2. Bar, 100 mm. (B) imágenes binarias representativos de las neuronas del hipocampo en cultivo inmunoteñidas para MAP2 con ningún tratamiento o después de un tratamiento de 30 minutos con glutamato 50 mM solo, 50 mM glutamato más 1,0 ng / ml KOS, o glutamato 50 mM más 1,0 ng / ml MBA. Bar, 100 mm. (C) Cuantificación de la longitud media por dendrita análisis morfométrico (n = 10). ***, P, 0,001 frente a los controles no tratados.

C

Discusión.

Efecto neuroprotector de extracto de semilla de uva Koshu contra la excitotoxicidad del glutamato.

A

B

C

D

La excitotoxicidad y el estrés oxidativo son los principales eventos inducidos por isquemia cerebral y después de la reperfusión, lo que lleva a daño neuronal [13]. Namura et al. informó una reducción severa en ERK1 / 2 fosforilación en el hipocampo del ratón durante la prueba experimental de isquemia del cerebro [14]. Nuestro presente estudio demostró que KOS GSE alivió la disminución inducida por el glutamato de fosforilados ERK1 / 2 niveles en las neuronas del hipocampo en cultivo (Figura 1) y protegido las dendritas de retracción durante una 30-min insulto glutamato (Figura 2).

Esta observación es consistente con observaciones anteriores de Almeida et al., informes que brainderived factor neurotrófico (BDNF) aumentó ERK1 / 2 fosforilación en las neuronas del hipocampo en cultivo y las células protegidas desde glutamato inducida por apoptosis [15].

Limatola et al. también demostró que las neuronas del hipocampo protegidas CX3CL1 de fractalquina la excitotoxicidad del glutamato a través de la activación de la Erk1 / 2 [16]. Curiosamente, se reportan estas moléculas para inducir la fosforilación de Akt. Sin embargo, a diferencia de estas citoquinas, Koshu GSE no activó la Akt vía de señalización en el hipocampo neuronas (Figura 1). Estos datos sugieren que las dianas moleculares de Koshu GSE en las neuronas del hipocampo son algo diferentes de las de BDNF o CX3CL1, lo que implica la posibilidad del desarrollo

Figura 3. Koshu GSE aumenta la supervivencia celular de las neuronas del hipocampo en cultivo después del tratamiento excitotoxicidad.

Las neuronas del hipocampo plantada a 2,06105 células / cm2 fueron tratados con glutamato 50 mM en presencia o ausencia de 1,0 ng / ml KOS GSE durante 10 min y se dejó recuperar en condiciones medias durante 24 horas. (A) Imágenes representativas de las neuronas del hipocampo después del tratamiento. Bar, 100 mm. (B) La densidad media de MAP2-positivas neuronas supervivientes 24 horas después del tratamiento glutamato (n = 8). ***, P, 0,001; *, P, 0,05. (C) Cuantificación de la longitud media por dendrita análisis morfométrico (n = 8). ***, P, 0,001; *, P, 0,05. doi: 10.1371 / journal.pone.0014575.g003

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de un nuevo objetivo de tratamiento Nuestra especulación actual para isquémico. explicar esta observación es que las neuronas del hipocampo en cultivo También se examinaron la tasa de fueron heterogéneo en términos supervivencia de las células y dendritas de su sensibilidad o respuesta de las neuronas cultivadas longitud cinética a glutamato y KOS GSE 24 hr después del tratamiento protegidos relativamente resistentes de glutamato para confirmar el o lentamente responder población efecto neuroprotector de los KOS de la apoptosis.

GSE (Figura 3). Los mecanismos moleculares de la neuroprotección Concentración efectiva por KOS GSE aún no se han aclarado. de extracto de semilla de Desde nuestro presente estudio uva Koshu en neurona del demostró que KOS GSE solo no tuvo ningún efecto significativo hipocampo sobre la ERK1 / 2 fosforilación (Figura 1C), se especula que podría Hemos demostrado que KOS GSE inhibir la actividad de receptores exhibió su efecto neuroprotector de glutamato o sus moduladores en 1,0 ng / ml (Figuras 1 y 2). La directos para paliar la condición concentración eficaz que parecía neuronal durante la excitotoxicidad ser extremadamente bajo en del glutamato. Curiosamente, Gao et comparación con numerosos al. demostrado que trans-resveratrol anterior informes que muestran en concentraciones de 10-100 mM diversos efectos biológicos de los inhibe los receptores de glutamato polifenoles en mg / ml rangos. Por postsinápticos en el hipocampo ejemplo, Suenaga et al. demostrado neuronas, con los receptores NMDA que 3- 10 mg / ml resveratrol ser más sensible que Receptores aumentó la expresión de TGF-b2 en AMPA [17].

A549 células epiteliales del pulmón humano [20].

La inhibición de fosfatasas ERK [18,19] puede también explicar el aumento Fujishita et al. también informó de observado en la fosforilación de ERK que la concentración efectiva de en células estimuladas con glutamato KOS GSE para inducir la expresión en la presencia de la KOS GSE. Desde de IL-6 en astrocitos era 30-100 otro punto de vista,nuestro análisis de mg / ml [11]. Considerando la alta Western blot para la activa caspasa-3 concentración de polifenoles que demostró que KOS GSE no inhibió se informó anteriormente, estos la temprana niveles de comienzo de efectos no fueron mediados por la caspasa-3 de activación inducida los receptores específicos para los por el glutamato, pero reducidos 6 polifenoles. Sin embargo, Han et al. horas después de la lesión (Figura 4). Ha demostrado que el resveratrol Debido a la caspasa-3 es un efector radiomarcado unido a la fracción de caspasa, cuya activación se produce membrana de plasma de cerebro de en la fase de ejecución para matar rata con una afinidad aparente de las células indiscriminadamente, 220.645 nM (, 50 ng / ml) y diversos nuestros datos no pueden sugerir polifenoles compitieron resveratrol que KOS GSE protege neuronas por unión específica, lo que sugiere que revertir la apoptosis. un sitio de unión al receptor común se enriqueció en el membrana

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Figura 4 Efecto de Koshu GSE en caspasa-3 activa. (A) Las neuronas del hipocampo tratadas con glutamato 50 mM solos o en presencia de el.

Se analizaron las concentraciones indicadas (en ng / ml) de KOS GSE durante 30 min para activa la caspasa-3 por Western blot. Los números por debajo de la caspasa-3 activa bandas indican sus intensidades relativas cuantificados por análisis densitométrico. Neuronas (B) de hipocampo tratadas con glutamato 50 mM en presencia o ausencia de 1,0 ng / ml KOS GSE durante 30 min y se incubaron en medio de cultivo normal para 0, 3, 6 horas, se analizaron para la activa-caspasa-3 por Western blot. Los números por debajo de los activos de la caspasa-3 bandas indican sus intensidades relativas cuantificados por análisis densitométrico. doi: 10.1371 / journal.pone.0014575.g004

Figura 5. perfil cromatografía líquida típica de Koshu y Extractos de semilla de uva de MBA. Los polifenoles se detectaron en el eluato por absorbancia a 280 nm. Los picos fueron asignados por TOF-MS como se muestra en la Tabla 1. doi: 10.1371 / journal.pone.0014575.g005

plasmática cerebro [21].

Del mismo modo, Campos-Esparza et al. También informaron que las concentraciones neuroprotectores de mangiferina y morin fueron 100 nM (, 42 ng / ml para mangiferina y , 32 ng / ml para morin) [22].

Puede haber neuronal específica proteínas de la membrana plasmática que demostrarían alta afinidad a polifenoles, incluyendo las moléculas presentes en KOS GSE. en este Al respecto, el presente estudio propone un nuevo paradigma en la molecular mecanismos de polifenol para las neuronas.

mostrar ningún efecto positivo en todas las concentraciones ensayadas (Figura 1). Por lo tanto, la diferencia entre KOS y MBA en el contenido compuestos fenólicos del total o la cantidad de polifenoles principales serían insuficiente para explicar su diferencia en las actividades neuroprotectoras.

Diferencia entre los extractos de semilla de uva Koshu y MBA El KOS GSE se ha demostrado que contienen catequina, epicatequina, procianidinas B2 y proantocianidinas [11]. en el presente estudio, hemos identificado los mismos componentes moleculares (Figura 5, Tablas 1 y 2), lo que demuestra la fiabilidad de nuestra datos. La comparación de KOS y MBA han demostrado una marcada diferencia en la cantidad de pequeños polifenoles peso molecular (Tabla 2).

Esto parece ser diferente de los informes de los Kammerer et al. y Guendez et al., demostrando no significativa diferencias en el contenido de polifenoles de uva entre rojo y blanco semillas [23,24].

Si la diferencia entre KOS y MBA fueron constantes, con independencia de las cosechas o viñedos se abordarán En el futuro. Sin embargo, nuestros datos de valoración para la protección de ERK1 / 2 actividad durante la excitotoxicidad del glutamato indicó que no MBA para

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Curiosamente, nuestra LC / TOF-MS de datos demostró la presencia picos de KOS-específicas, oligómeros mayoría de los cuales fueron procianidina (Figura 5 y Tabla 1). Oligómeros de procianidinas, incluyendo procianidinas B1 y B2, están formadas en su mayoría por la condensación de las catequinas, epicatequinas y otros flavonoides.

Las estructuras de procianidina oligómeros son diversos, ya que las combinaciones de unidades de monómero, las posiciones y los tipos de vinculación, así como el grado de reacción de la condensación tiene muchas posibilidades [25].

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Existen varios informes lo que demuestra que el grado de oligomerización de polifenoles de semilla de uva afecta a su actividad biológica para captar el oxígeno reactivo [26,27]. Entre los diversos KOS-específica procianidina oligómeros, algunos podrían tener estructuras favorables para interactuar con receptores específicos de neuronas putativos exhiban propiedades de neuroprotector.

Similar a nuestra noción,Takahashi et al. Ha demostrado que los oligómeros de procianidina de semilla de uva exhiben mayor growthpromoting

actividad que el monómero o hacia otros flavonoides murinos células epiteliales del pelo in vitro e in vivo, lo que sugiere que el efecto específico podría estar asociado con la estructura [28].

La composición de polifenoles y proporciones relativas en el presencia de polifenoles de menor importancia también puede ser inducida por efectos sinérgicos en KOS GSE. Teniendo en cuenta que los diversos polifenoles compiten por el sitio de unión específica resveratrol [21], esta idea puede explicar los resultados actuales. Esto también puede explicar por qué KOS GSE tan bajo como 1,0 ng / ml podrían proporcionar un efecto neuroprotector.

GSE también puede ser beneficioso para la otra excitotóxica insultos cerebrales, como la epilepsia [29].

Materiales y métodos Materiales

La semilla de uva KOS se obtuvo de enólogos locales en Yamanashi en 2005, La semilla de uva MBA se obtuvo del viñedo experimental de la Universidad de Yamanashi en 2005 El GSE polvo liofilizado se preparó como se ha descrito previamente [11]. En ambas preparaciones, polifenoles totales representaron el 90% de peso seco neto (datos no mostrados). El polvo resultante se disolvió en dimetil sulfóxido (DMSO) / etanol / H2O (50:25:25) Perspectivas terapéuticas. y se usó para los experimentos de cultivo celular. Fenoles totales en las Nuestro presente estudio demostró dos GSE estaban cuantificado como que KOS GSE protege las neuronas se describe anteriormente [30]. del hipocampo en cultivo contra los insultos inducida por glutamato Poli-L-lisina, papaína, deoxyrobo de aguda ERK1 / 2 inactivación y la - n u c l e a s e ( D N a s a ) , c i t o s i n a retracción de la dendrita. Será de - a r a b i n o f u r a n ó s i d o ( A r a - C ) , gran interés para comprobar si los L-glutamato y el ratón anti-MAP2 componentes activos de KOS GSE anticuerpo (M9942) fueron de influir directamente en la actividad Sigma-Aldrich. Leibovitz L-15 medio, celular de las neuronas o mejorar la medio Neurobasal-A, suplemento condiciones celulares a través de los B27, así como fosfatasa alcalina mecanismos de la glia mediada [11]. o Alexa Fluor 488-secundario Sin embargo, como la isquemia cerebral induce daño a la BBB, una efectiva concentración podría lograrse fácilmente mediante la administración intravenosa. Por ejemplo, Hwang et al. informaron que la administración oral de Corea del Sur GSE 30 minutos antes o después experimental isquemia protegida neuronas del hipocampo del cerebro anterior de oxidativo Daño en el DNA [10], lo que sugiere la posibilidad de GSE como terapéutica.

conjugado anticuerpos se obtuvieron de Invitrogen. El filtro de células con Malla de 100 mm de nylon fue de BD. El ácido tricloroacético (TCA) y el ensayo de proteínas Bicinconinato Kit eran de Nakalai Tesque.

Immobilon-P membrana era de Millipore. De conejo anti-Erk 1/2 (# 9102), anti-fosfato ERK1 / 2 (# 9101), anti-Akt (# 9272), antiphosphoAkt (Ser473; # 4051) y anticaspasa-3 (# 9662) anticuerpos eran

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de Señalización Celular Tecnología. nitro azul cloruro de tetrazolio (NBT) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, sal de toluidina (BCIP) eran de Roche Diagnostics.

Cultivo celular Los detalles completos del estudio en ratones fueron aprobados por el Institutional Animal Care y el una comision de la Universidad de Yamanashi (Número de autorización: 19-92). Todos los ratones fueron manejados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Laboratorio Animales. El cultivo primario de neuronas del hipocampo se prepararon desde cachorros murinos neonatales (C57BL / 6J, Charles River Laboratories) como se describe por Berbari et al [31], con modificaciones.

final concentración de 5 mM para prevenir la proliferación glial.

Para evaluar los efectos neuro protectores del GSE, del hipocampo en cultivo de neuronas en 8 DIV que fueron tratados con glutamato 50 mM por 30 min, en presencia o ausencia de diversas concentraciones de GSE. El volumen de DMSO / etanol / H2O disolvente se establece en 0,5% (v / v) de medio. Después del tratamiento, las células fueron rápidamente fija con 10% enfriado con hielo (v / v) TCA y se utiliza para transferencia de western o inmunotinción

Western blot

Cantidades iguales de proteína (20 mg / carril, o 200 mg / carril para detectar la fosforilación de Akt basal) se separaron por electroforesis en 10% (v / v) o 5-20% (v / v) SDS geles y poli-acrilamida se transfirieron Brevemente, el tejido del hipocampo a membranas Immobilon-P. Para aislado de los ratones recién inhibir la fosfatasa actividades, se nacidos (P1) fue tratados con 0.375 añadió fluoruro de sodio 1 mM a la mg / ml de papaína y 50 mg / ml lisis de la muestra tampón. de DNasa en Leibovitz L-15 medio que contiene 0,2 mg / ml de suero Tras el bloqueo con solución salina bovino albúmina durante 15 min a tamponada con Tris con Tween 20 37uC. El tejido se lavó tres veces (TBST) que contiene 10% (w / v) con Neurobasal-Un medio que de leche en polvo sin grasa durante contiene B-27 y suavemente trituró 1 habitación temperatura (RT), los por 10 golpes con una micropipeta blots se incubaron con el primario de 1000 ml, seguido de otros 20 anticuerpos diluido 1: 500 en el golpes con una micropipeta de 200 tampón de bloqueo y se incubaron ml. después de la centrifugación durante la noche a 4UC. a 2006g durante 5 min a 4UC, las neuronas del hipocampo eran Las transferencias se lavaron resuspendieron en Neurobasal-A a continuación con TBST y / B-27 que contiene 5 mg / ml de se incubaron con anticuerpo DNasa, pasado a través de un filtro secundario conjugado con fosfatasa de células con una malla de 100 alcalina diluido 1: 500 en el mm, y se sembraron en 1.06105 tampón de bloqueo a temperatura células / cm2 en placas de cultivo ambiente durante 1 h. después o cubreobjetos de vidrio con lavado con TBST, se visualizaron las capa preliminar con poli-D-lisina. bandas inmunorreactivas utilizando A las 3 de DIV, Ara-C esta en una sustratos NBT / BCIP.

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Análisis de -citoquímica y métrico

inmuno 24 bits adquiridos se dividieron en morfo- rojo, verde, y azul canales, y el canal

verde que contiene la información de la Alexa Fluor 488 cromóforo se digitalizan a blanco y negro el uso Las neuronas fijas en cubreobjetos de un nivel de umbral común que de vidrio se permeabilizaron con sería mejor separar la estructura 220uC metanol, se bloquearon con dendrítica y el fondo.

10% (w / v) de leche descremada en fosfato solución salina tamponada Las imágenes binarias resultantes (PBS) durante 30 min, y se incubaron luego fueron tratados con anti-MAP2 anticuerpo (dilución: posteriormente con el comando 1: 200) la noche a 4UC. skeletonize a reducir todas las dendritas binalized a líneas negras Después de lavar con PBS, las con un solo píxel anchura. El área muestras se incubaron con el Alexa total de las dendritas esqueletizadas Fluor 488-anticuerpo secundario en cada imagen, correspondiente a conjugado (1: 200) durante 30 min la longitud total de las dendritas, fue a RT, se lavó de nuevo con PBS y se contada por el comando de análisis montaron en portaobjetos de vidrio de partículas, y el número total de con 49,6-diamidino- 2-fenilindol neuronas en cada imagen se contó (DAPI). Las células teñidas se sobre la base de la tinción nuclear investigaron bajo un microscopio con DAPI. Finalmente, la longitud Olympus IX71 equipado con de la dendrita media se calculó UPlanSApo 106 objetiva y DP72 dividiendo el longitud de la dendrita enfriado cámara a color CCD, y las total por el número total de células. imágenes fueron tomadas con el software DP2-BSW y almacenados La cromatografía líquida / espectrocomo archivos TIFF. Los campos metría de masas de tiempo de fueron elegidos al azar para asegurar vuelo análisis Para el análisis LC / la objetividad del muestreo.

TOF-MS, liofilizados GSE (10 mg) disuelto en 10 ml de 50% (v / v) Sin embargo, como la densidad de DMSO acuoso. La solución se celular afecta a la longitud de la centrifugó a 12,0006g durante 10 dendrita significativamente, y las min, y se filtró a través de 0,2 mm imágenes de alta densidad celular Filtro de PTFE. LC / TOF-MS análisis tienden a subestimar la longitud se llevaron a cabo utilizando un de las dendritas media debido a Acquity Ultra Cromatografía líquida la superposición, las imágenes con de rendimiento del sistema (UPLC) una célula densidad de, se utilizaron (Waters) vinculada simultáneamente 50.615 células / mm2 para el a ambas una matriz de fotodiodos siguiente análisis morfométrico.

PDA 2996 detector (Waters) y una masa premier XE Waters LCT La longitud media de las dendritas espectrometría (Waters), equipado se cuantificó usando el software con una ionización por electrospray ImageJ según se indica, en el que un (ESI) fuente. Dos ml de la solución método de análisis de imágenes para de muestra se inyectó en un recipiente de tumor arquitectura Acquity UPLC columna (HSS T3, [32] se aplicó con modificaciones. En 1.8 mm, 2.0 mm mm6100, Waters), primer lugar, la imágenes en color de que se mantuvo a 40°C. Análisis de

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gradiente lineal se utilizó con fase móvil A, 0,1% (v / v) de ácido fórmico, y fase móvil B, acetonitrilo con un caudal de 0,2 ml / min. Condición de elución se realizó como sigue: 0,0 min, 1% (Mobilephase B, v / v); 3,0 min, 1%; 40,0 min, 60%; 42,0 min, 100%; 44,0 min, 100%; 44,1 min, 1%; 50,0 min, 1%. Todo lo anterior experimentos se repitieron tres veces cada uno.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer Shu-ichiro Maeda apoyo útil y Akihiro Satake para obtener ayuda. Nos gustaría dar las gracias a Kazuko Sawanobori por el apoyo técnico y de secretaría.

Contribuciones de los autores Concebido y diseñado los experimentos: KN A ST. realizado el experimentos: KN MH. Analizados los datos: KN MH ST. Contribuyó El eluato se se introduce en reactivos / materiales / herramientas un detector PDA (exploración de análisis:A. Escribió el documento: rango 200-600 nm, resolución de KN A ST. 1,2 nm) y, posteriormente, en la fuente de ESI en negativo de modo.

El m / z adquirida era de 100 a 2000. la ionización parámetros fueron tensión capilar, 2,8 kV; El voltaje del cono, 60 V; la flujo de gas de desolvatación, 500 l / h; la temperatura de desolvatación, 350uC; y temperatura de la fuente, 120UC. Para el rango dinámico mejora (DRE) lockmass, una solución de leucina-encefalina (Sigma-Aldrich) de 20 ng / ml se infundió a través de la pulverización de bloqueo sonda a una velocidad de flujo de 5 ml / min. Asignaciones de picos se llevaron en base a los tiempos de retención, su Abs. 280 nm y MS espectro.

El análisis estadístico Todos los valores se expresan como la media ± SEM. Diferencias entre dos grupos se compararon mediante la prueba t de dos colas.

Las diferencias entre grupos se analizaron múltiples con un solo sentido ANOVA seguido por el test post hoc de Bonferroni para comparar seleccionado pares.

Los resultados se consideraron significativas a P, 0,05

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