18_polukonova_et_al by Serge

Лікарське рослинництво: від досвіду минулого до новітніх технологій: матеріали четвертої Міжнародної науково–практичної інтернет–конференції. – Полтава, 14-15 травня 2015 р.

УДК: 615.28 * Полуконова Н.В., профессор, *Наволокин Н.А., аспирант, *Курчатова М.Н., аспирант, * Райкова С.В., доцент, *Бучарская А.Б., директор ЦКП, *Дурнова Н.А., заведующая кафедрой, *Маслякова Г.Н., заведующая кафедрой, **Тырнов В.С., заведующий кафедрой * Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского, Саратов, Россия ** Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТА СЫРЬЯ АНТОЦИАНОВОЙ ФОРМЫ КУКУРУЗЫ ОБЫКНОВЕННОЙ И ПЕРСПЕКТИВЫ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Ключевые слова: антоциановая диплоидная форма кукурузы обыкновенной Zеа mays L., биофлавоноиды, новые лекарственные средства, доклинические исследования, лабораторные животные, антимикробное действие, антимутагенная активность Антоциановая диплоидная форма кукурузы обыкновенной Zеа mays L. обладает доминантными генами маркера «коричневый Саратовский» и была получена генетиками СГУ им. Н.Г. Чернышевского путем гибридизации диких гетерозиготных форм кукурузы с целью создания нового красного красителя для фармацевтической и пищевой промышленности [4,5]. Отсутствие антрагликозидов, дубильных веществ, кумаринов, кардиотонических гликозоидов и алкалоидов делает экстракты на основе данного сырья нетоксичными. Ранее было установлено, что в сырье антоциановой формы кукурузы обыкновенной содержится целый комплекс биологически активных веществ [4,5], за счет наличия которых экстракты из сырья могут быть перспективными для разработки новых лекарственных средств [5,11,12,17]. Ранее установлено, что при использовании в качестве первоначального экстрагента 95% этилового спирта, активность экстракта существенно повышается [13]. Исследуются противоопухолевое и протекторное действия такого экстракта в экспериментах in vivo на животных с перевиваемыми опухолями и in vitro – на клеточных культурах опухолей человека и животных [2,9,14,16,20-21,]. Показано также, что данный экстракт слаботоксичен и не обладает канцерогенной и мутагенной активностью [7,11,19,]. Цель настоящей работы: исследовать биологическую (антимикробную in vitro и антимутагенную in vitro) активность экстракта сырья антоциановой формы кукурузы и оценить перспективы его использования для разработки новых лекарственных средств. Материалы и методы. В работе использовано сырье кукурузы антоциановой, выращенной на экспериментальном участке в окрестностях г. Петровска. Числовые показатели сырья: влажности – менее 12%, золы общей – менее 10%, органических примесей – менее 1%, неорганических примесей - менее 1%, что соответствовало ГОСТу «Трава кукурузы гибридной» [5]. Исследован флавоноидсодержащий водный раствор сухого экстракта оберток початков антоциановой формы кукурузы, полученный способом двойной спиртовой экстракции с последующим осаждением неполярных веществ (алкалоидов и гликозидов и др.) хлороформом [10]. Среднее значение полученных определений кверцетина в смеси составило 0,7 мкг/мл, количество кверцетина в сухом остатке (на 260 мг экстрактивных веществ) - 350 мкг; найдено 16,46 мкг/мл флавоноидов в пересчете на рутин; массовое процентное содержание флавоноидов в экстракте - 15,8 %. Кроме того, экстракт содержал: этиловый эфир гексадекановой кислоты; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; 1-(4метоксифенил)-метоксипропан; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); этиловый эфир линоленовой кислоты; 9,12-октадекановая кислота; 2-(5-хлор-2-метоксифенил) пиррол. 249

Методика исследования антимикробной активности. Антимикробную активность экстракта изучали в отношении стандартных штаммов Pseudomonas aeruginosa АТСС27853 и Staphylococcus aureus АТСС 29213 из коллекции культур кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского. Стандартный инокулюм, соответствующий мутности 0,5 по стандарту McFarland и содержащий 1,5x108 КОЕ/мл доводили до концентрации 102 КОЕ/мл г. Водный раствор экстракта смешивали с агаром и наносили на поверхность питательной среды (стафилококки на желточно– солевой агар, синегнойную палочку на мясо – пептонный агар). Опыт сопровождался двумя контролями: жизнеспособности штаммов микроорганизмов (без экстракта) и стерильности экстракта. Активность экстракта определяли путем подсчета выросших колоний на поверхности твердых питательных сред, через 24 ч и 48 ч инкубированния в термостате [1]. Методика исследования антимутагенной активности. Оценку действия экстракта проводили методом микроядерного анализа [3] на белых беспородных мышах-самцах со средней массой 20-24 г. В качестве мутагена был выбран диоксидин в дозе 200 мг/кг фирмы «Фармакон» (Санкт-Петербург). Животные были разделены на четыре группы (по 6 животных в каждой): 1) группа, получавшая дистиллированную воду внутрибрюшинно (негативный контроль); 2) группа, получавшая экстракт в дозе 200 мг/кг перорально; 3) группа, получавшая диоксидин в дозе 200 мг/кг внутрибрюшинно (позитивный контроль); 4) группа, получавшая экстракт в дозе 200 мг/кг перорально и диоксидин (в дозе 200 мг/кг) – внутрибрюшинно. Эксперименты проводили при разных режимах введения. В остром эксперименте мыши получали диоксидин и исследуемый экстракт однократно; забор крови и приготовление мазков осуществляли на первые сутки после введения препаратов. В подостром эксперименте мыши получали диоксидин и исследуемый экстракт ежедневно; забор крови и приготовление мазков осуществляли на пятые сутки после введения препаратов [15]. Применение различных путей введения диоксидина и экстракта позволило исключить их возможное прямое взаимодействие. В первом эксперименте мыши получали диоксидин и исследуемый экстракт однократно, забор крови и приготовление мазков осуществляли на первые сутки после введения препаратов. Во втором эксперименте мыши получали диоксидин и исследуемый экстракт ежедневно, забор крови и приготовление мазков осуществляли на пятые сутки после введения препаратов. Приготовление препаратов осуществляли в модификации Папенгейма [18]. Подсчет эритроцитов с микроядрами у каждого животного проводили в расчете на 3000 эритроцитов и выражали в промиллях (‰). О наличии эффекта судили по снижению числа эритроцитов с микроядрами по сравнению с группой позитивного контроля и фоновым уровнем числа микроядер. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистических программ «Stadia». Сравнение выборок осуществляли с использованием Х-критерия Ван-дер-Вардена, для парных данных применяли критерий Вилкоксона. Влияние фактора дня и типа воздействия определяли с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (факторный план – повторяемый с фиксированными эффектами). Сила влияния определяли согласно рекомендациям Снедекора (в %). Результаты исследований. Антимикробная активность экстракта. При исследовании антимикробной активности во всех сериях, проводимых для проверки стерильности спиртового экстракта, роста бактерий не отмечалось. Количество выросших колоний синегнойной палочки в опытной группе после 24ч - инкубирования было меньше на 85,2% по сравнению с контролем, через 48 ч - на 24,7%. Количество выросших колоний стафилококков в опытной группе после 24 ч-инкубирования было меньше на 55, 2% по сравнению с контролем, через 48 ч – на 40,1%. Полученные данные свидетельствуют о наличии выраженной антимикробной активности изучаемого экстракта кукурузы в отношении тест-штаммов синегнойной палочки и стафилакокка. 250

Антимутагенная активность экстракта. Диоксидин повышал уровень клеток с микроядрами (P<0,01), как по сравнению с группой мышей, которым вводили дистиллят (таблица). На первые сутки в группе мышей, получавшей экстракт, частота клеток с микроядрами увеличилась (таблица). Совместное введение экстракта и диоксидина на первые сутки не вызвало достоверного снижения частоты эритроцитов с микроядрами (P<0,05). Частота в этой группе составила 3,83 ±0,06667‰, по сравнению с группой, получавшей только диоксидин, где частота нарушений составила 4,20±0,3795‰. На пятые сутки в группе получавшей и экстракт и диоксидин, количество клеток с микроядрами достоверно снижалось и составило 2,98±0,1493‰ по сравнению с группой, получавшей только диоксидин, в которой частота нарушений составила 4,64±0,3818‰ (P<0,01), однако до контрольных значений показатели в этой группе не опустились (таблица). Таким образом, установлено антимутагенное действие водного раствора экстракта антоциановой формы кукурузы, которое на пятый день выше по сравнению с первым. Таблица Частота встречаемости эритроцитов с микроядрами (в ‰) в периферической крови мышей при введении экстракта кукурузы и диоксидина Группа

Количество клеток с микроядрами, в ‰ Первые сутки Пятые сутки Негативный контроль 1,48±0,3628 1,73±0,3221 a ii хх Экстракт (200 мг/кг) 2,62 ±0,2167 2,10±0,405 х ii Позитивный контроль 4,20±0,3795б 4,64±0,3818б б Экстракт (200 мг/кг) + диоксидин (200 мг/кг) 3,83 ±0,06667 2,98±0,1493сс а ii Обозначения: сс - различия с первым днем достоверны (P<0,01); а – различия с негативным контролем достоверны (P<0,05); б - различия с негативным контролем достоверны (P<0,01); ii - различия с позитивным контролем достоверны (P<0,01); х – различия с количеством клеток с микроядрами при введении экстракта кукурузы антоциановой + диоксидин достоверны (P<0,05); хх – различия с количеством клеток с микроядрами при введении экстракта кукурузы антоциановой + диоксидин достоверны (P<0,01).

Выводы. Экстракт антоциановой кукурузы, полученный двойной спиртовой экстракцией, открывает перспективы создания на его основе лекарственного бактерицидного средства для лечения широкого спектра бактериальных инфекций вызываемых синегнойной палочкой и стафилакокками, что является весьма актуальным и значимым в современных условиях потери рабочих антибиотиков из-за развития устойчивости микроорганизмов к последним. Установленные антимутагенные свойства экстракта позволяют использовать его в дальнейшем для снижения негативных последствий действия химических мутагенов. Библиография. 1. Баронец И.Г., Адлова Г.П., Мельникова В.А. Влияние экстрактов лекарственных растений на рост микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии – 2001. – № 5. – С.71-72. 2. Ивличев А.В., Наволокин Н.А., Афанасьева Г.А., Мудрак Д.А., Тычина С.А., Воронков М.О., Корчаков Н.В., Полуконова Н.В., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Активность перекисного окисления липидов на фоне перевиваемого рака печени РС-1 при пероральном введении флавоноидсодержащего экстракта кукурузы антоциановой // Российский биотерапевтический журнал. 2015. Т. 14, №1. С. 85. 3. Ильинских Н.Н., Новицкий В. В., Ванчугова Н. Н., Ильинских И. Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. Томск: изд-во том. Ун-та, 1991. – 272 с. 4. Купчак Т.В. Фитохимическая характеристика гибридной формы кукурузы Zea mays L. и технология антоцианового красящего препарата. Автореф. дисс. …к.фарм.н. СПб 1998. 23 с. 5. Купчак Т.В., Николаева Л.О., Шимолина Л.Л. Выделение и идентификация антоцианов из гибридной кукурузы // Фармацевтический журнал. 1995. №6. С. 62-64.

251

6. 7.

10.

11.

12.

13. 14.

15. 16.

17.

18. 19.

20. 21.

Курчатова М. Н., Дурнова Н. А., Полуконова Н. В. Влияние экстрактов, содержащих биофлавоноиды, на индукцию микроядер диоксидином в эритроцитах крови беспородных белых мышей. // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация, 2014, № 2. С. 58-65. Курчатова М.Н. Анализ токсичности экстракта кукурузы антоциановой формы на белых беспородных мышах // Материалы Первой Общероссийской конференции с международным участием Перельмановские чтения 28 марта 2014 Ярославская государственная медицицинская академия. Ярославль. 2014. С. 218-219. Наволокин Н. А., Полуконова Н. В., Маслякова Г. Н., Бучарская А. Б, Дурнова Н. А. Морфология внутренних органов и опухоли лабораторных крыс с перевитым раком печени Рс-1 при пероральном введении флавоноидсодержащих экстрактов аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) и кукурузы антоциановой (Zea mays L.) // Саратовский научномедицинский журнал. 2013а. Т. 9, № 2. С. 213–220. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н., Скворцова В.В., Байтман Т.П., Бучарская А.Б., Дурнова Н.А. Противоопухолевая активность растительных экстрактов, содержащих биофлавоноиды // Российский биотерапевтический журнал. 2013б. Т. 12. № 2. С. 59-59a. Патент № 2482863. Российская Федерация, МПК A61K36/80, B01D11/02. Способ получения сухого экстракта из растительного сырья, обладающего биологической активностью / Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Дурнова Н.А., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б. № 2012105384/15; заявл. 15.02.2012, опубл. 27.05.2013, Бюл. № 15. 11 с.: ил. Полуконова Н.В., Гопиенко А.В., Тырнов В.С. Токсикологическая, канцерогенная и мутагенная безопасность антоциановой формы кукурузы Zea mays L. как источника красного красителя // Бюллетень ботанического сада СГУ. Вып. 9. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2010. С. 28-31. Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Райкова С.В.. Федорова И.А., Разуваева К.А., Щербаченко А.В., Альмяшев Р.Ш. Анализ химического состава и биологических свойств спиртового экстракта растительного сырья гибридной формы кукурузы Zea mays L. // Материалы IV Всерос. с междунар.участием научно-метод.конфер «Фармобразование 2010». Воронеж. 2010. С. 306-311. Полуконова Н.В., Райкова С.В., Дурнова Н.А., Наволокин Н.А., Курчатова М.Н., Тырнов В.С. Антимикробная активность экстракта антоциановой формы кукурузы Zea mays L. при разных способах получения // Проблемы медицинской микологии. 2014. Т. 16, № 2, С.115. Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Барышникова М.А., Соломко Э.Ш., Степанова Е.В., Рябая О.О., Маслякова Г.Н., Барышников А.Ю. Исследование противоопухолевой активности флавоноидсодержащих растительных экстрактов in vitro // Российский биотерапевтический журнал. 2015. Т. 14, №1. С. 122. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Миронов и др. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. 944 с. Скворцова В.В., Наволокин Н.А., Байтман Т.Н., Полуконова Н.В., Канаева Т.В., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б. Динамика роста перевиваемого рака печени РС-1 и саркомы-45 под действием растительных экстрактов бессмертника песчаного (Helichrisum arenarium), кукурузы антоциановой (Zea mays) // Евразийский онкологический журнал. 2014. 3 (03). С.122. Смиронова А.А., Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Тырнов В.С. Фармакогностическое и фармакологическое исследование сырья кукурузы, содержащей биофлавоноиды, и перспективы использования лекарственных средств на его основе // Лекарственные растения: фундаментальные и прикладные проблемы Материалы I Международной научной конференции (21—22 мая 2013 г., г. Новосибирск). Новосибирск. 2013. С. 408410. Хабриев Р. У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: изд-е 2, 2005. 832 с. Щербаченко А. С., Альмяшев Р. Ш., Полуконова Н.В., Федорова И.А. Анализ токсичности вытяжки сырья гибридной формы кукурузы Zеа mays L. на хирономидах Chironomus plumosus и рыбах Danio rerio // Материалы Междунар.научно-практ.конфер «Беккеровские чтения». Волгоград. 2010. С. 25-30. Navolokin N.A., Polukonova N.V., Maslyakova G.N., Bucharskaya A.B., Durnova N.A. Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with trasplanted liver cancer // Russian Open Medical Journal 2012а. Р. 1-4. Navolokin N.A., Polukonova N.V., Bucharskaya A.B., Maslyakova G.N. Morphofunctional changes in laboratory rats with transplanted liver cancer PC-1 after prolongated per-oral administration of flavonoid containing extracts // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2012б. Вып. 1. С. 277-278.

252