Лікарське рослинництво: від досвіду минулого до новітніх технологій: матеріали четвертої Міжнародної науково–практичної інтернет–конференції. – Полтава, 14-15 травня 2015 р.
УДК: 581.192 1 Землянухина О.А., канд.биол.наук., ст. науч. сотр., 2Калаев В.Н., профессор, докт. биол. наук. 1 Всероссийский НИИ сахарной свеклы и сахара, г. Рамонь, Россия, 2 Воронежский государственный университет, г. Воронеж, Россия СПЕЦИФИКА МЕТАБОЛИЗМА ПЯТИ ВИДОВ ПОЛЫНЕЙ В КУЛЬТУРЕ БОТАНИЧЕСКОГО САДА ВОРОНЕЖСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Ключевые слова: род полынь, Artemisia, интродукция, активность ферментов, изоферменты, адаптация Род Полынь (Artemisia) относится к сем. Астровых и в настоящее время насчитывает от 200 до 400 видов, которые широко представлены в различных регионах мира. Многие виды полыни занесены в Красную книгу, что связано с сокращением их видового разнообразия из-за целого комплекса причин. Это и хозяйственная деятельность человека, и нарушение правил землепользования, и экологическая загрязненность. Во флоре Центрального Черноземья отмечены 13 видов полыней, в том числе 8 охраняемых на региональном и государственном уровнях. Нарушение численности популяций в данном регионе происходит из-за выпаса скота, добычи известняка, строительства дорог и т.д. Поэтому необходимо создание механизмов сохранения и восстановления ценных видов, проведение фундаментальных исследований их биологии для оценки хозяйственной, медицинской и других ценностей. Полынь собрала в себе огромное количество ценных веществ, используемых для лечения множества самых разнообразных заболеваний, а также перспективна как пищевое, пряно-ароматическое, эфиромасличное, инсектицидное растение. Известно, что все виды полыни в надземной части содержат каротин, эфирное масло, флавоноиды, кумарины, алкалоиды. В эфирном масле полыни обнаружены сабинен (до 65%), мирцен (10%), сесквитерпеновая фракция (5%), ρ-метаоксикоричный альдегид (0,5%) и смола (15%), метилхавикол, оцимен, феландрен, каротин. Тем не менее, до сих пор нет результатов об изменениях в регуляции метаболических процессов различных видов полыни в результате действия антропогенных факторов и других стрессовых процессов. Поэтому целью настоящего исследования было изучение метаболических особенностей видов полыней региональной флоры, культивируемой в ботаническом саду им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета. В предлагаемой работе у пяти видов полыней были проанализированы активности ферментов основных метаболических циклов клетки: цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), пентозо-фосфатного пути, глиоксилатного цикла, альтернативного ЦТК цикла, представленного Са-чувствительной NADH-дегидрогеназой, а также фермента, отвечающего за стрессовое (адаптивное) состояние растений, пероксидазы. Материалы и методы исследования. В качестве объектов исследования были выбраны пять видов полыней, интродуцированных в коллекции и экспозиции природной флоры и растительности Центрального Черноземья, включая редкие и уязвимые, охраняемые на региональном и федеральном уровнях. 1. Полынь беловойлочная (Artemisia hololeuca Bieb. ex Bess.) занесена в Красную книгу России, статус 2, и Красную книгу Белгородской области, статус 6 [1]. Стелющийся по меловым обнажениям полукустарничек, эндемик бассейна Дона и северного Донца. Посадочный материал растений мобилизован из природных местообитаний Богучарского района Воронежской области в 2006 г. В культуре цветет, но не дает всхожих семян. 2. Полынь армянская (Artemisia armeniaca Lam.). Редкий охраняемый в регионе вид [2]. Растет по степным склонам, на опушках дубрав с карбонатной подпочвой. Посадочный 104
Лікарське рослинництво: від досвіду минулого до новітніх технологій: матеріали четвертої Міжнародної науково–практичної інтернет–конференції. – Полтава, 14-15 травня 2015 р.
материал взят из заповедника «Галичья гора» Липецкой области. Размножается делением куста. 3. Полынь широколистная (Artemisia latifolia Ledeb.) занесена в региональные Красные книги [2]. Растет по степям, опушкам. В культуре ботанического сада с 1962 г. (из заповедника «Галичья гора»). На коллекционном участке вегетативно хорошо разрастается, ежегодно цветет и плодоносит. В качестве контроля взяты два эвритопных и устойчивых вида - полынь обыкновенная и полынь эстрагон. 4. Полынь эстрагонная (или Эстрагон, или Тархун, Artemisia dracunculus L.) растет в прибрежных экотипах и по солонцеватым лугам [2]. В культуре ботсада с 1970 г. Посадочный материал получен из семян поймы р.Дон. Устойчивый в коллекции вид, формирует длинное корневище. 5. Полынь обыкновенная (Artemisia vulgaris L.) растет агрессивно как сорно-луговое растение, наблюдается обильный самосев. Ферментативный препарат получали с помощью центрифугирования в течение 7 мин при 4200 g растертых со стеклом листьев в 0.1 М трис-НС1 буфере, рН 7.5. Все работы проводили при температуре 4 0С. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта за 1 мин при 25оС с учетом коэффициента молярной экстинкции (общая активность, ФЕ/мл) или без учета (для Удельную активность рассчитывали, относя общую активность к пероксидазы). содержанию белка в 1 мл ферментативной жидкости (ФЕ/мг). Надосадочные жидкости сохраняли в эппендорфах в твердотельном термостате BIOSAN СН-100 при -3оС. Активность ферментов определяли по Землянухину А.А. [4]. Измерение оптической плотности проводили в 1-см кварцевых кюветах на СФ-102 в течение 3-15 мин. Изучались активности следующих энзимов: изоцитратдегидрогеназы (ИДГ; КФ 1.1.1.42), изоцитратлиазы (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1), NADH-дегидрогеназы (NADH-ДГ; КФ 1.6.99.1), малатдегидрогеназы (МДГ; КФ 1.1.1.37), малик-энзима (МЭ; КФ 1.1.1.3), глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (гл.-6-Ф-ДГ; КФ 1.1.1.49), неспецифической эстеразы (ЭСТ; КФ 3.1.1.1), пероксидазы (ПО: КФ 1.11.1.7). Изоферментный спектр супероксиддисмутазы (СОД; КФ 1.15.1.1), NADH-ДГ, МЭ, неспецифической эстеразы (ЭСТ; КФ 3.1.1.1) выявляли по стандартному методу Дэвиса в вертикальных пластинах ПААГ (7.5%) в окрашивающей смеси [5,6,7] в нашей модификации [8]. Гели высушивали на стеклянных пластинах, в целлофане, в растворе спирт : глицерин (1:1), а затем сканировали с разрешением 300 dpi. Определение количества растворимого белка проводили по методу Брэдфорда [9]. В таблицах и на рисунках даны значения средних арифметических, вычисленных на основании измерений трех биологических повторностей. Результаты исследования и их обсуждение. Применение биохимических методов имеет большое значение в анализе адаптации интродуцированных видов любых растений, и, в частности, полыней, их стрессорного состояния с целью составления шкалы приспособленности в культуре ботанического сада Воронежской области. Пероксидаза - фермент, принимающий участие в ряде важных физиологических процессов, таких как адаптация к стрессорным факторам внешней среды, каталитическое окисление органических соединений, дыхание, синтез лигнина и др. Ранее был выявлен широкий полиморфизм растений по активности данного фермента [10]. Результаты измерения активности ПО (а) и количества общего белка (б) представлены на рисунке1. В результате анализа активности ПО установлена степень приспособленности видов полыней в культуре ботанического сада, которую можно выразить последовательностью (по мере улучшения адаптации): полынь беловойлочная < полынь широколистная < полынь армянская < полынь эстрагон < полынь обыкновенная. Электрофоретические данные по распределению изоформ ПО у различных видов полыни представлены в таблице 1.
105
Лікарське рослинництво: від досвіду минулого до новітніх технологій: матеріали четвертої Міжнародної науково–практичної інтернет–конференції. – Полтава, 14-15 травня 2015 р.
Результаты ЭФ-исследований показывают видоспецифичный характер активности ПО. Можно отметить сходство изоферментного спектра полыни обыкновенной и п. эстрагон: оба вида имеют по 5 общих изоформ, тогда как остальные 3 вида - по 1-2 формы фермента. б) Общий растворимый белок
ФЕ/мг
а) Удельная активность ПО
№№
0,6 ФЕ/мг
В д полыни
0,5
№1
0,4
Полынь беловойлочная Полынь армянская Полынь широколистная Полынь эстрагон Полынь обыкновенная
№2 №3
0,3 0,2 0,1
№4 №5
0 №1
№2
№3
№4
№5
Белок, мг/мл 3.23 3.82 5.71 9.80 8.21
вид
Рис. 1 - Распределение удельной активности ПО и общего растворимого белка у пяти видов полыней Таблица 1 Распределение изоформ пероксидазной активности в пластинах ПААГ по электрофоретической подвижности (R f ) Rf 0.53 0.54 0.56 0.57 0.61 0.62 0.64 0.67 0.69 0.73 0.82
полынь беловойлоч ная
полынь армянская
+
+
полынь широколис тная
полынь эстрагон
полынь обыкновен ная
+
+
+ +
+
+ +
+
+ + + +
+ + + +
+ +
+ + + +
Результаты измерения активности ферментов ИДГ, ИЦЛ, NADH-ДГ, МДГ, МЭ приведены в таблице 2. У ИДГ и ИЦЛ, для функционирования которых нужен субстрат изоцитрат, наблюдается одинаковый характер распределения активностей, однако, различающийся по значениям на порядок. Максимум активности ИДГ обнаружен в листьях п. беловойлочной (2.39х10-3 ФЕ/мг), а минимум - у п. обыкновенной (0.41х10-3 ФЕ/мг). Максимум активности ИЦЛ также отмечен в листьях п. беловойлочной (0.61х10-3 ФЕ/мл), минимум - у п. эстрагон (0.09х10-3 ФЕ/мг), т.е. разница в обоих случаях составляет от 6 до 6.8 раза. Исходя из результатов изучения активности вышеуказанных двух ферментов, метаболические процессы у пяти видов полыни идут в одном направлении, а снижение их активности при утилизации изоцитрата, идет в направлении полынь беловойлочная → п. армянская → п. широколистная → п. эстрагон → п. обыкновенная.
106
Лікарське рослинництво: від досвіду минулого до новітніх технологій: матеріали четвертої Міжнародної науково–практичної інтернет–конференції. – Полтава, 14-15 травня 2015 р.
Из результатов, представленных в таблице 2, видно, что активность NADH-ДГ как общая, так и удельная, находятся в пределах активностей других исследуемых ферментов видов, за исключением полыни беловойлочной, где значения показателя составляют 21.21 х 10-3 ФЕ/мл. Вероятно, такое распределение фермента зависит от природы вида и не связано с его адаптивными признаками. Таблица 2 Активность ферментов ИДГ, ИЦЛ, NADH-ДГ, МДГ, МЭ у представителей 5 видов рода Полынь (х10-3) № ИДГ ИЦЛ NADH-ДГ МДГ Малик-энзим № ФЕ/м ФЕ/м ФЕ/м ФЕ/м ФЕ/м ФЕ/м ФЕ/м ФЕ/м ФЕ/м ФЕ/м л г л г л г л г л г 1 7.71 2.39 1.98 0.61 21.21 6.57 4.82 1.99 2.89 0.89 2 5.30 1.39 0.72 0.19 2.89 0.76 11.09 2.91 5.78 1.51 3 7.23 1.27 1.62 0.28 4.82 0.84 13.50 2.36 8.19 1.43 4 3.37 0.41 1.62 0.20 6.75 0.82 10.12 1.23 0 0 5 8.19 0.84 0.90 0.09 5.3 0.54 9.16 0.94 0 0 В метаболизме клеток, подверженных стрессовому воздействию, обычно происходят значительные изменения, направленные на нейтрализацию негативных эффектов. В регуляции нейтрализации участвует малат с помощью малатдегидрогеназ и малик-ферментов. Благодаря их слаженному действию осуществляется регулировка отдельных метаболических процессов в клетках [11]. Наибольшая общая активность как МДГ, так и малик-энзима обнаруживается в растениях полыни широколистной (13.50 и 8.19х10-3 ФЕ/мл, соответственно) и полыни армянской (11.09 и 5.78 х10-3 ФЕ/мл, соответственно). Удельные активности ферментов также укладываются в этот максимум. Наименьшая активность МДГ измеряется в полыни обыкновенной и полыни эстрагон, а активность у них малик-энзима равна 0. Это еще раз показывает, что наиболее адаптированными, нормально функционирующими видами полыни являются полынь обыкновенная и полынь эстрагон. В наших исследованиях активности гл.-6-Ф-ДГ - фермента, активность которого в значительной степени связана с условиями окружающей среды, - не обнаружено, что может свидетельствовать об относительно благополучном состоянии пяти видов полыни [12]. Результаты изоферментного анализа показывают следующее. Проявление ПААГ гелей на активность ИДГ и МДГ не выявило зон активности этих энзимов. Изозимного анализа изоцитратлиазы не проводилось, поскольку существующие методы для выявления активности этого фермента показывают у всех растений наличие одной слабо различимой и быстро исчезающей изоформы [13]. По результатам ЭФ можно отметить, что все 5 изученных видов полыни имеют сходные электрофореграммы по МЭ и представлены тремя изоформами, расположенными в анодной части геля. Изозимный спектр NADH-ДГ выражен двумя изоформами, одна из которых с R f 0.073 проявилась у всех пяти видов, а другая, с R f 0.033, - только у четырех видов, отсутствуя у п. обыкновенной. СОД выявляется в виде четырех изоформ, но все 4 присутствуют только у полыни обыкновенной и полыни эстрагон, хотя у п. широколистной две зоны активности представлены широкой полосой, состоящей из двух изоформ. Наибольшее количество изоформ выявилось у фермента ЭСТ: 12 зон активности фермента. Распределение их неравномерно, каждый вид полыни индивидуален, что говорит о видовой специфичности фермента и предполагает идентификацию того или иного вида растения по профилю ЭСТ. 107
Лікарське рослинництво: від досвіду минулого до новітніх технологій: матеріали четвертої Міжнародної науково–практичної інтернет–конференції. – Полтава, 14-15 травня 2015 р.
В ходе выполнения исследовательской работы были изучены биохимические различия между пятью видами полыни региональной флоры. Показано, что увеличение количества белка в листьях, вероятно, свидетельствующее о лучшей функциональности метаболических процессов, происходит в следующем порядке: полынь беловойлочная, полынь армянская, полынь широколистная, полынь эстрагон и полынь обыкновенная. Это можно было бы объяснить следующим образом. В листьях первых двух видов полыни превращение жиров в углеводы и накопление запасных веществ идет, вероятно, с опережением по сравнению с интродуцированными видами. Для уточнения ответа на такую интересную особенность в биохимии пяти видов полыней следовало бы провести оценку накопления сахаров и других запасающих веществ, что выходит за рамки данной статьи. Можно сказать, что устойчивость растения на данном типе почвы, в данных условиях произрастания зависит от дыхательных процессов: чем ниже норма активности того или иного фермента, тем устойчивее растений. Чем выше - тем усиленнее растение дышит, тем сильнее стресс. Кроме того, на основе активности ПО выявлена пятибалльная шкала приспособленности пяти видов полыни к условиям ботанического сада Воронежского госуниверситета: 5 баллов - п. обыкновенная, 4 балла - п. эстрагон, 3 балла - п. широколистная, 2 балла - п. армянская, 1 балл - п. беловойлочная. Совокупные данные по изучению распределения активности восьми ферментных активностей, представляющих все основные метаболические циклы растительной клетки, позволяют сделать предварительный вывод. Он заключается в том, что устойчивость растений в ландшафтно-экологических условиях ботанического сада возрастает в ряду полынь беловойлочная, полынь армянская, полынь широколистная, полынь эстрагон и полынь обыкновенная, что подтверждается многолетними интродукционными испытаниями этих видов в культуре ботсада. Библиография. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
9. 10. 11. 12.
13.
Красная книга Российской Федерации (растения, грибы). - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. - 855 с. Голицын С.В., Доронин Ю.А. Реликтовая флора и растительность // Памятники природы Воронежской области. - Воронеж, 1970. - С.107-118. Маевский П.Ф. Флора средней полосы европейской части России. - 10-е изд. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2006. - 600 с. Землянухин А.А., Землянухин Л.А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений: учебное пособие для вузов. – Воронеж: Изд-во ВГУ, 1996. - 186 с. Маурер Г. Диск-электрофорез / М.: Мир, 1971. - 222 с. Davis B.J. Disc Electrophoresis.II. Method and application to human serum proteins / B.J.Davis // Ann.N.Y.Acad.Sci. - 1964. - V.121. - P.404-427. Wendel J.F., Weedel N.F. Isozymes in plant biology/ Edited by D.E.Soltis, P.S.Soltis Visualization and Interpretation of Plant Isozymes. Chapter 1. P.5 - 45. Землянухина О.А., О.С.Машкина, И.В.Саблина, Ю.Н.Исаков, А.Т.Епринцев. Активность и изозимный спектр пероксидазы клонов карельской березы, размноженных in vitro // Межрегион. сб. науч. работ. Вып. 5. ВГУ. - Воронеж, 2003. - С.46-52. Bradford V.V. A rapid and sensitive method for the quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal.Biochem. - 1976. - V.72, N4. - P.417-422. Куприянова Е.В. Внутривидовой полиморфизм генов пероксидаз у Arabidopsis thaliana /Автореф. дисс. канд.биол.наук. Москва, 2008. - 130 с. Иванищев В.В., Курганов Б.И. Ферменты метаболизма малата: характеристика, регуляция активности и биологическая роль// Биохимия, Т.57, вып.5, 1992. С.653-661. Кондрашова М.Н., Маевский Е.И., Бабаян Г.В. Адаптация к гипоксии посредством переключения метаболизма на превращение янтарной кислоты. / Митохондрии. Биохимия и ультраструктура: М.- 1973. C.112-128. Землянухин А.А., Землянухин Л.А., Епринцев А.Т., Игамбердиев А.У. Глиоксилатный цикл растений. / Воронеж: Изд-во ВГУ, 1986. 148 с.
108