УДК 631.147+631.526.3+631.527 Дитченко Т.И., канд. биол. наук, доцент Вюйтрих А.Д., студентка Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь РАЗРАБОТКА ПРИЕМОВ ДЕПОНИРОВАНИЯ IN VITRO КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ЭХИНАЦЕИ ПУРПУРНОЙ И ЭХИНАЦЕИ БЛЕДНОЙ Ключевые слова: каллусная культура, эхинацея пурпурная, эхинацея бледная, депонирование, гипотермия, D-маннит В настоящее время метод культуры клеток и тканей растений находит широкое применение в различных областях биологии. Преимущества работы с растительными клетками в контролируемых условиях in vitro по сравнению с использованием целых растений сделали этот метод одним из наиболее универсальных в биологии. Культуры клеток растений нашли широкое применение в самых разнообразных фундаментальных и прикладных исследованиях. На основе культивируемых клеток и тканей растений в настоящее время созданы и активно развиваются перспективные, принципиально новые технологии для различных отраслей промышленности и сельского хозяйства. В первую очередь, культуры клеток могут служить возобновляемым источником ценных фармакологически активных соединений. Интерес к культурам тканей растений-продуцентов возрастает в связи с тем, что природные ресурсы либо истощаются, либо не в полной мере удовлетворяют интересам человека. Разработка методов длительного культивирования in vitro клеток и тканей растений позволяет формировать банки клеточных линий, обладающих определенными генетическими и биохимическими свойствами. Наиболее актуальным это направление является в случае получения клеточных линий, синтезирующих большее по сравнению с интактными растениями количество вторичных метаболитов, то есть более продуктивных. Для исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в тканях, также требуются стандартные исходные культуры, чем вызвана необходимость сохранять материал в течение определенного промежутка времени при проведении серийных экспериментов. Для сохранения растительных объектов в условиях in vitro используются различные методические подходы. В одних случаях хранение культур осуществляется без нарушения процесса роста, в других – при замедлении или полной остановке роста. При работе с пересадочными коллекциями необходимо стабильно поддерживать условия выращивания (температуру, свет, влажность), а также не изменять состав питательной среды. Строгое соблюдение этих требований способствует длительному сохранению различных признаков объекта. Однако этот метод является достаточно трудоемким в связи с необходимостью регулярных пересадок каллусных культур каждые 28-30 суток, требует значительных затрат, как на приготовление питательных сред, так и на выполнение работ по субкультивированию. Кроме того, при длительном культивировании, как правило, происходит снижение способности клеток к регенерации целого растения [1]. Поэтому сейчас достаточно интенсивно разрабатываются различные способы депонирования коллекций, т.е. приемы, позволяющие изменить кинетику роста культуры и увеличить время между пересадками. Депонирование коллекций – сохранение коллекций без частых пересадок. Существует несколько способов лимитирования ростовых процессов. Среди них доступным и достаточно распространенным приемом является снижение температуры, при которой происходит культивирование. Выбор температуры определяется холодостойкостью вида растения. Для культур, обычно растущих при 20–25 °С, 51
Индекс роста
рекомендуют использовать температуры 4–10 °С, а для культур, нормально растущих при температуре около 30 °С, – плюс 15–20 °С [2]. Другой прием заключается в добавлении к среде для культивирования соединений, способных замедлять рост растений. В качестве таких регуляторов могут выступать вещества, оказывающие осмотическое действие на клетки (маннит, сорбит, сахароза в повышенных концентрациях) или вещества гормональной природы (абсцизовая кислота, гидразид малеиновой кислоты, диметилгидразид янтарной кислоты, хлорхолинхлорид). В редких случаях для депонирования коллекций используют снижение содержания кислорода – гипоксию, применяя смесь 90 % азота и 10 % кислорода. Для отдельных культур показано, что наибольшего эффекта можно достигнуть в результате комбинирования разных приемов лимитирования роста [2]. Целью настоящей работы явилось исследование эффектов гипотермии и осмотического агента D-маннита на показатели прироста биомассы каллусных культур двух представителей рода Echinacea – эхинацеи пурпурной и эхинацеи бледной, которые продуцируют комплекс фенилпропаноидов и представляют собой альтернативу традиционному сырью. Объектами исследования служили каллусные культуры, полученные из эксплантов листового происхождения. В работе использовалась питательная среда по прописи Мурасиге и Скуга [3], включающая 30 г/л сахарозы, 7 г/л агар-агара и фитогормоны (среда МС). В качестве ауксинов среда содержала 2,4дихлорфеноксиуксусную кислоту в концентрации 0,2 мг/л и β-индолил-3-уксусную кислоту в концентрации 1 мг/л. В качестве цитокинина использовался кинетин в концентрации 0,5 мг/л. В контроле культивирование каллусов осуществлялось в темноте в условиях термостата при температуре 25 ºС. Для депонирования каллусных культур эхинацеи пурпурной и эхинацеи бледной были использованы подходы, заключающиеся как в однокомпонентном, так и совместном действии D-маннита в концентрации 5 % и пониженной температуры (10 ºС). Культивирование каллусов в указанных условиях осуществлялось в течение более чем 3 месяцев (95 суток). На 30-е, 65-е и 95-е сутки проводили анализ данных, который включал определение индекса роста культур и содержания сухого вещества. Как видно из рисунка 1, выращивание каллусной ткани эхинацеи пурпурной при
4,00
30 сут
3,50 3,00
65 сут 95 сут
2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00
МС 1 25ºС
МС+маннит 2 25ºС
МС 3 10ºС
МС+маннит 4 10ºС
Условия культивирования
Рис. 1 Влияние однокомпонентного и сочетанного действия пониженной температуры (10 ºС) и маннита (5 %) на индекс роста каллусной культуры эхинацеи пурпурной в зависимости от продолжительности культивирования 52
25 ºС в присутствии в питательной среде маннита приводило в среднем к 4-х кратному снижению прироста биомассы на 30-е сутки. При увеличении продолжительности культивирования до 65 и 95 суток исследуемый осмотический агент вызывал менее выраженный ингибирующий эффект, что возможно связано со снижением его концентрации в среде вследствие поглощения и метаболического превращения клетками каллусной культуры. Гораздо более эффективное торможение ростовых процессов отмечалось в условиях гипотермии. Снижение индекса роста уже на 30-е сутки культивирования достигало в среднем 10 раз. При последующем увеличении продолжительности культивирования (65 суток) индекс роста оставался практически на том же уровне. На 95-е сутки ингибирование роста достигало максимальной величины. В случае сочетанного воздействия гипотермии и маннита прирост биомассы каллусов был еще ниже, чем при действии только пониженной температуры. Следует отметить, что к 95 суткам прирост сырой биомассы полностью отсутствовал, что вероятно связано с их сильным обезвоживанием. Действительно определение содержания воды и сухого вещества в клетках исследуемой каллусной культуры показало, что содержание сухого вещества существенно возрастало (от 2,5 до 9 %) в результате инкубации на среде с маннитом. Культивирование в условиях гипотермии приводило к менее выраженному снижению степени оводненности культуры. Содержание сухого вещества в каллусных тканях не превышало 5,9 %. При сочетанном действии маннита и гипотермии содержание сухого вещества в исследуемой каллусной культуре достигало наиболее высокого уровня – 10,1 %. На рисунке 2 представлены результаты, полученные для каллусной культуры эхинацеи бледной. 3,00
30 сут 65 сут
Индекс роста
2,50
95 сут
2,00 1,50 1,00 0,50 0,00
МС 1 25ºС
МС+маннит 2 25ºС
МС 3 10ºС
МС+маннит 4 10ºС
Условия культивирования
Рис. 2 Влияние однокомпонентного и сочетанного действия пониженной температуры (10 ºС) и маннита (5 %) на индекс роста каллусной культуры эхинацеи бледной в зависимости от продолжительности культивирования Добавление в питательную среду маннита приводило к снижению индекса роста каллусов в 4,5 раза на 30-е сутки культивирования, в 1,5 раза – на 65-е сутки. На 95-е сутки исследуемый осмотический агент не вызывал достоверного изменения ростовой активности культуры по сравнению с контролем. Снижение температуры, а также сочетанное воздействие гипотермии и маннита в равной степени практически 53
полностью ингибировали рост каллусов. Анализ данных по влиянию гипотермии и маннита на содержание сухого вещества в клетках каллусной культуры эхинацеи бледной позволил обнаружить аналогичные закономерности, что и для каллусов эхинацеи пурпурной. Таким образом, каллусная культура эхинацеи бледной оказалась гораздо более чувствительной к ростингибирующему действию гипотермии по сравнению с каллусной культурой эхинацеи пурпурной. Однако эффективность применения осмотического агента маннита для замедления роста данной культуры является крайне низкой уже после 30-ти суточного культивирования. Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что наиболее сильное ингибирование роста каллусной культуры эхинацеи пурпурной происходит в результате одновременного снижения температуры культивирования до 10 ºС и добавления в среду маннита в концентрации 5 %, что может быть рекомендовано для ее депонирования. В случае каллусной культуры эхинацеи бледной при сравнении двух способов депонирования – воздействие температуры 10 ºС и комбинированное действие гипотермии и маннита – не выявлено различий по степени ингибирования ростовых процессов. Однако следует отметить, что для обеих культур при совместном влиянии гипотермии и маннита происходило в 2 раза более сильное возрастание процента сухого вещества, чем под влиянием только пониженной температуры. Вполне вероятно, что более выраженное обезвоживание клеток будет тормозить восстановление ростовой активности культур при переносе их в стандартные условия культивирования. В результате можно заключить, что для каллусных культур эхинацеи пурпурной и эхинацеи бледной наиболее целесообразным вариантом депонирования является культивирование в условиях гипотермии. Установленная способность клеток исследуемых каллусных культур адаптироваться к пониженной температуре дает возможность изменить кинетику их роста и в 3 раза увеличить период времени между пересадками. Библиография. 1. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. – М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. – 160 с. 2. Endress, R. Plant Cell Biotechnology / R. Endress / Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1994. – 353 p. 3. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. – 1968. – Vol. 15, №13. – P. 473-497.
54