УДК: 615.322:582.734.4 1 Коновалова О.Ю., д. фарм.н., проф., 2Остапчук А.М., к.б.н. завідуючий лабораторією біологічних полімерних сполук, 1Рибак Л.М., к.фарм.н., 1Шураєва Т.К., к.фарм.н., доцент, 1Геращенко І.І., д.фарм.н., проф., 1Гергель Є.М., к.фарм.н. доцент, 1 Жигота Ю.Ю., студентка 1 ПВНЗ «Київський медичний університет Української асоціації народної медицини», Київ, Україна 2 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ, Київ, Україна ДОСЛІДЖЕННЯ АМІНОКИСЛОТНОГО СКЛАДУ СЕРЕЖОК ЛІЩИНИ ЗВИЧАЙНОЇ (CORYLUS AVELLANA L.) Ключові слова: сережки, ліщина звичайна, амінокислоти, високоефективна рідинна хроматографія. Ліщина звичайна - деревовидний кущ 2-4 м заввишки. Кора - темно-сіра з характерними сочевичками. Гілки дугоподібно розходяться в різні боки, утворюючи оберненоконусоподібну крону. Пагони й молоді листки опушені. Бруньки заокруглені з війчастими лусочками. Листки - чергові, оберненояйцеподібні, широкі (7-16 см завдовжки і 4-8 см завширшки), при основі скошеносерцеподібні, нерівномірно зубчасті, на коротких черешках. Тичинкові квітки без оцвітини, зібрані у видовжені (35 см завдовжки) сережки, луски їх густо опушені, а голі пиляки мають вгорі характерний пучок волосків. Маточкові квітки у двоквіткових розвилках, що розміщені в пазусі покривної луски і приховані в черепичастій кулястій бруньці, з якої виступають червонуваті приймочки. Ліщина - однодомна рослина, що має на різних гілках тичинкові і маточкові квітки. Тільки після цвітіння починають розпускатися листя на кущах ліщини. З зав'язей запилених квіток утворюються горіхи, а навколишня зав'язь приквітки розростаються в зелену плюску, прикриваючу горіх. Плід - горіх (1520 мм у діаметрі) у зеленій дзвіноподібній обгортці, вкритій оксамитовим пушком. Ліщина звичайна цвіте у березні-квітні, плоди достигають у серпні [1, 2]. Ліщина звичайна росте в підліску листяних і мішаних лісів. Тіньовитривала рослина. Поширена по всій Україні, крім крайнього півдня. Можлива в культурах. Райони заготівель — Київська, Вінницька, Сумська, Полтавська, Кіровоградська, Черкаська області, південна частина Волинської, Рівненської та Житомирської областей. Запаси сировини ліщини звичайної є значними [1, 2]. Гілки і листя ліщини містять дубильні речовини, флавоноїди, ефірна олія, сапоніни, вітамін С, каротин, антоціани і пальмітинову кислоту. У плодах знайдені білкові речовини (14,4-18,4%), в т. ч. специфічний для ліщини білок - корелин, вуглеводи, цукру, азот (2,2-2,6%), каротин, вітаміни В1, В3, Е, РР і велика кількість жирного масла (62,1-71,6%), у складі якого є насичені та ненасичені жирні кислоти. Горіхове масло має у своєму складі ненасичені жирні кислоти (олеїнову, лінолеву, міристинова, пальмітинову, стеаринову) [3]. Метою даної роботи було провести амінокислотний аналіз сережок ліщини звичайної (Corylus avellana L.). Об’єктами даного дослідження були сережки ліщини звичайної Corylus avellana L. Даний вид належать до роду Березові (Betulaceae). Сировина була зібрана у фенофазу цвітіння на дослідних ділянках ботанічного саду ім. акад. О.В. Фоміна (м. Київ) у березні 2014 року. Для досягнення поставленої мети було використано метод високоефективної рідинної хроматографаії. Метод заснований на екстракції вільних амінокислот із рослинної сировини та кислотному гідролізі рослинних препаратів з наступним аналізом гідролізатів методом високоефективної рідинної хроматографії з перердколоночною дериватизацією 9-флуоренілметоксикарбоніл хлоридом (FMOC) та o-фталевим альдегідом (OPA) з наступною детекцією флоресцентним детектором [4, 5, 6]. 216
Хроматографічне розділення проводили на рідинному хроматографі Agilent 1200 (Agilent technologies, USA). Колонка Zorbax AAA довжиною 150 мм, внутрішнім діаметром 4,6 мм, діаметр зерна сорбента 3 мкм. Мобільна фаза А - 40 mM Na2HPO4 pH 7.8; В - ACN:MeOH: water (45:45:10, v/v/v). Режим розділення градієнтний із постійною швидкістю потоку 1,5 мл/хв. Температура термостату колонки 40°С. Передколоночну дериватизацію проводили в автоматичному програмованому режимі з використанням FMOC реагенту (Agilent 5061-3337) та OPA реагенту (Agilent 50613335). Детекція дериватизованих амінокислот реалізовувалася за допомогою флуоресцентного детектора. Пробопідготовка та аналіз рослинної сировини здійснювали таким чином: 1) Вільні амінокислоти. Наважку перетертого до порошкоподібного стану препарату поміщали у віалу, додавали 2 мл водного розчину 0,1 N соляної кислоти та витримували на ультразвуковій бані при 50 0С впродовж 3 годин. 2) Загальні амінокислоти. Наважку препарату поміщали у віалу, додавали 2 мл водного розчину 6 N соляної кислоти та поміщали в термостат при 110°С. Гідроліз проводили впродовж 24 годин. 0,5 мл відцентрифугованого екстракту/гідролізату упарювали на роторному випаровувачі, тричі промивали дистильованою водою для видалення соляної кислоти. Ресуспендували в 0,5 мл дистильованої води та фільтрували крізь мембранні фільтри із регенерованої целюлози з порами 0,2 мкм. Отримання флуоресцентних похідних проводили в автоматичному програмованому режимі перед введенням проби в хроматографічну колонку. Ідентифікацію амінокислот проводили шляхом порівняння часів утримання з сумішшю стандартів амінокислот (Agilent 5061-3334). Вміст зв‘язаних амінокислот визначали шляхом віднімання вмісту вільних амінокислот від їх загального вмісту. У результаті дослідження у сережках ліщини звичайної було ідентифіковано 16 вільних та зв’язаних амінокислот.Результати амінокислотного аналізу сережок ліщини звичайної наведені у таблиці. Таблиця Кількісний вміст амінокислот у сережках ліщини звичайної Кількісний вміст цукрів у мкг/мг Час № абсолютно сухої сировини (n=5) утримуАмінокислоти п/п вання, хв Вільні Зв’язані Загальні 1 2 3 4 5 6 1 2,614 L-аспартатна кислота 0,15* 17,08 16,92 2 4,916 L-серин 0,06 10,11 10,05 3 7,419 L-глютамінова кислота 0,67 9,07 8,41 4 8,274 L-гістидин 0,21 5,11 4,89 5 8,665 Гліцин 0,03 6,57 6,54 6 8,845 L-треонін 0,23 5,26 5,02 7 9,377 L-аргінін 1,48 8,76 7,29 8 10,064 L-аланін 0,19 5,79 5,59 9 11,151 L-тирозин 0,24 3,57 3,33 10 13,121 L-валін 0,46 6,07 5,62 11 13,315 L-метіонін 0,03 0,55 0,53 12 14,513 L-фенілаланін 0,18 5,60 5,42 13 14,719 L-ізолейцин 0,49 6,06 5,57 14 15,333 L-лізин 0,47 12,64 12,18 15,583 0,09 5,77 5,68 15 L-лейцин 19,066 1,79 11,06 9,27 16 L-пролін Сума 6,77 112,30 119,07 * Примітка – RSD складає не більше 2,0%, довірчий інтервал в межах від ± 0,01 до 0,5.
Як випливає з одержаних результатів сережки ліщини звичайної містять досить низький вміст вільних амінокислот, і основна їх кількість припадає на зв’язані 217
амінокислоти. Мажоритарними компонентами вільних амінокислот є – аргінін та пролін. Найбільша частка від суми зв’язаних амінокислот припадає на аспартатну кислоту, лізин, пролін і серин, і складає – 17,08 мкг/мг, 12,64 мкг/мг, 11,06 мкг/мг і 10,11 мкг/мг від маси абсолютно сухої сировини, відповідно. Після повного гідролізу найбільше зростає кількісний вміст таких амінокислот, як гліцину (у 218 раз), серину (у 167 раз), аспартатної кислоти ( у майже 113 раз) і лейцину (у 63 рази). Кількісний вміст амінокислот після повного гідролізу зростає майже в 18 разів. Хроматограма вільних амінокислот випробувананого зразку наведена на рисунку.
Рис. 1. Хроматограма (ВЕРХ) амінокислотного складу (вільні амінокислоти) сережок ліщини звичайної. Висновки 1) Методом високоефективної рідинної хроматографії встановлено якісний склад і кількісний вміст вільних, зв’язаних та загальних амінокислот у сережках ліщини звичайної. 2) Ідентифіковано 16 амінокислот у складі як вільних так і зв’язаних амінокислот. 3) Мажоритарними компонентами вільних амінокислот є – аргінін та пролін. Найбільша частка від суми зв’язаних амінокислот припадає на аспартатну кислоту, лізин, пролін і серин. 4) Кількісний вміст амінокислот після повного гідролізу зростає майже в 18 разів. 5) Отриманні результати амінокислотного складу у сережках ліщини звичайної мають практичне значення для подальшого поглибленого вивчення, а саме встановлення зв’язку фармакологічної дії з кількісним вмістом амінокислот у її сировині. Дане дослідження є фрагментом комплексної роботи, що присвячена порівняльному фармакогностичному вивченню сережок ліщини звичайної і берези повислої. Бібліографія 1. Определитель высших растений Украины / Д. Н. Доброчаева, М. И. Котов, Ю.Н Прокудин [и др]. – Киев: Фитосоциоцентр, 1999. – 548 с. 2. Мінарченко В.М. Атлас лікарських рослин України (хорологія, ресурси та охорона) / В. Мінарченко, І. Тимченко. — К. : Фітосоціоцентр, 2002. — 172 с. 3. Fitschen J. Flora von Deutschland und angrenzender Länder / J. Fitschen, O. Schmeil. – Hamburg : Quelle & Meyer, 2003. – 503 р. 4. Jámbor A. Amino acid analysis by high-performance liquid chromatography after derivatization with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride. Literature overview and further study. / A. Jámbor, I. Molnár-Perl // Journal of Chromatography A. – №1216. – 2009. – р. 3064–3077. 5. Jámbor A. Quantitation of amino acids in plasma by high performance liquid chromatography: Simultaneous deproteinization and derivatization with 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride / A.Jámbor, I. Molnár-Perl // Journal of Chromatography A.– №1216.– 2009. – p. 6218–6223. 6. Rapid, Accurate, Sensitive, and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acids Amino Acid Analysis Using Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC / John W. Henderson, Robert D. Ricker, Brian A. Bidlingmeyer [et al.] // Agilent Technical Note. –1999. – p.1193–5980.
218