MANUAL DE PROCEDIMIENTOS LABORATORIO ANÁLISIS DE AGUAS Y ALIMENTOS
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MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION La microbiología como herramienta diagnostica se ha desarrollado gracias al estudio de los microorganismos a nivel in Vitro y esto solo se puede realizar gracias a la utilización de los medios de cultivo, que permiten fomentar el crecimiento microbiano de forma que puedan comprobarse sus características en cultivo. De igual manera facilita el desarrollo de las características bioquímicas que luego pueden ser demostrables por observación directa o indirecta por la reacción en presencia de algunos reactivos.
“ Los microorganismos pueden ser aislados y cultivados fuera de su nicho ecológico natural” Koch.
DEFINICION Son alimentos artificiales que semejan un ambiente natural de desarrollo, contienen en forma asimilable, nitrógeno, hidrocarbonados, lípidos, sustancias orgánicas y sales minerales; son de presentación usualmente deshidratados y su reconstitución necesita solamente la adición de agua destilada no necesariamente estéril a la cantidad necesaria para guardar la proporción según las instrucciones de preparación encontradas en la etiqueta de frasco.
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CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo se clasifican según su constitución, presencia o no de sustancias inhibitorias y a su naturaleza así :
1. CONSTITUCION Líquidos Sólidos Semisólidos
2. COMPONENTES Básicos Enriquecidos Selectivos
3. NATURALEZA Natural Artificial
1. Constitución: La constitución de los medios de cultivo esta determinada por la concentración de Agar (Polisacárido obtenido de algas marinas, químicamente es un galactano formado por moléculas de galactosa y con la propiedad de ser resistente a la acción degradativa de la mayoría de las bacterias y de no desintegrarse por los medios físicos empleados en su preparación) Se usa en reemplazo de la gelatina porque esta ultima se funde a 37ºC y a la temperatura de las incubadoras adquiere consistencia de caldo, mientras que el agar mantiene su forma de gel a temperaturas de incubación.
Las concentraciones de agar determinan 3 tipos de medios de cultivo : Medios de cultivo sólidos: Aquellos con concentraciones de 1,5% de agar. Medios Semisólidos: Aquellos con concentraciones de 0,7% de agar Medios Líquidos: Aquellos con ausencia total de agar.
2. Componentes: Los componentes determinan diversos tipos de medios de cultivo de acuerdo a la ausencia o presencia de estos. Medios de Cultivo Básicos Son aquellos medios de cultivo simples, solo contienen algunos extractos carne (fuente proteica y vitamínica, pequeñas cantidades de Carbono, Nitrógeno e Hidrogeno) , peptona, sal, agua y agar. Ej. Caldo Nutritivo, Caldo BHI, Caldo Tioglicolato, Agar nutritivo, Agar Tripticase soya Medio de Cultivo Enriquecido: Medios de cultivo básicos que han sido suplementados con líquidos corporales, Vitaminas especificas, aminoácidos, proteínas y otras cargas nutricionales Ej. Agar Sangre de Cordero, Agar Chocolate Medio de cultivo Selectivos: Son usualmente medios de cultivo básicos o enriquecidos a los cuales se les han agregado sustancias que impiden el
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desarrollo de algunas bacterias en particular, permitiendo por lo tanto el aislamiento solo de bacterias seleccionadas. Este tipo de medios se utilizan en muestras que contienen grandes cargas Microbiológicas. Los medios Selectivos pueden clasificarse a su vez en :
Medios de cultivo bajamente selectivos : Aquellos que contienen bajas concentraciones de sustancias inhibitorias y permiten la recuperación de familias bacterianas. Ej. Agar MacConkey, Agar EMB (Eosina – Azul de Metileno)
Medios de cultivo medianamente selectivos : Aquellos que contienen concentraciones medias de sustancias inhibitorias y permiten la recuperación de géneros bacterianos. Ej. Agar XLD (Xilosa – Lisina - Desoxicolato), Agar HE (Hektoen enterico), Agar S/S (Salmonella – Shiguella)
Medios de cultivo altamente selectivos : Aquellos que contienen altas concentraciones de sustancias inhibitorias y permiten la recuperación únicamente de especies bacterianas. Ej. Agar Bismuto Sulfito.
Actualmente existen los medios de cultivo fluorogenos o con sustrato especifico para determinados microorganismos, que no requieren de periodos de incubación prolongados, además permiten reacciones muy especificas en cada microorganismo, disminuyendo de esta forma el tiempo de análisis y son una garantía en la calidad del diagnostico. Entre estos tenemos: Caldo LMX Fluorocult (MUG): Para determinar NMP Coliformes Caldo Fluorocult Lauryl Sulfato (MUG): Para determinar NMP Coliformes Caldo Brilla Fluorocult (MUG) Para determinar NMP Coliformes Agar Chomocult – Recuento de Coliformes Agar Colistant – recuento de Coliformes Agar Rambach – Salmonella
3. Naturaleza: Se refiere al tipo de componentes con los que han sido preparados los medios de cultivo, permitiendo ser clasificados en : Medios de cultivo naturales : Aquellos que dentro de su composición tienen alto contenido de productos naturales Ej. : La Leche Medios de cultivo artificiales : Son los que tienen mayor concentración de componentes químicos sintéticos.
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PREPARACION Una vez realizados los cálculos para el agar deshidratado y el agua, la preparación homogeneizada se lleva a ebullición y posteriormente se lleva a esterilización a 121ºC a 15 lb. de presión por un tiempo no mayor a 15 minutos. Una vez terminado este proceso, se dejan enfriar a temperatura ambiente hasta mas o menos 45ºC, se deja solidificar en el tubo o se sirven en cajas de petri, posteriormente se conservan en temperaturas de refrigeración. CONDICIONES CONTROLADAS Para garantizar la recuperación microbiana se deben controlar las condiciones químicas del medio como el pH que debe encontrarse cercano a la neutralidad y depende del tipo y las especificaciones del medio de cultivo, las concentraciones de Oxigeno y las condiciones físicas como el tiempo y la temperatura .
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AISLAMIENTO Y CONSERVACION DE MICROORGANISMOS
Para lograr aislar microorganismos se hace necesario elegir el medio de cultivo adecuado que proporcione las características necesarias de enriquecimiento que permita el desarrollo bacteriano para posteriormente realizar las técnicas de inoculación. El propósito de las técnicas de inoculación es introducir artificialmente una porción de muestra (inoculo) en un medio de cultivo adecuado con el fin de iniciar su crecimiento. MATERIALES Se cuenta con el medio de cultivo previamente seleccionado y para realizar las técnicas de inoculación primaria se recomienda la utilización de una asa (alambre de nicromo o platino, recto o circular), un hisopo o mediante el uso de la punta de una pipeta volumétrica de vidrio en el caso que la muestra provenga de una dilución.
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PROCEDIMIENTO Existes diversas técnicas de aislamiento microbiano dependiendo del propósito de la inoculación :
Aislamiento por agotamiento - Siembra por agotamiento Fundamento : Es diluir (Agotar) el inoculo sobre la superficie de un agar para lograr obtener UFC (Unidades Formadoras de Colonia) aisladas, las cuales se pueden luego subcultivar (repicar) individualmente transfiriéndolas a otros medios de cultivos. Material : Asa en argolla, medio de cultivo sólido en caja de Petri, material Microbiológico diluido (En solución liquida o en solución salina) Procedimiento : a. Antes de realizar las estrías, el asa debe esterilizarse con ayuda del mechero, lo que se evidencia por un color rojo encendido a lo largo del alambre b. Enfriar el asa en un borde del medio de cultivo a utilizar c. Tomar la muestra y depositarla en un extremo de la caja d. Realizar siembra masiva en una pequeña porción del agar e. Posteriormente realizar estrías en cuatro lados con el fin de obtener crecimiento aislado
2. Aislamiento por estría - Siembra por estría Fundamento: Es agotar el inoculo sobre la superficie de un agar para lograr realizar recuento de UFC. Material: Asa en argolla, medio de cultivo sólido en caja de Petri, material Microbiológico diluido (En solución liquida o solución salina) Procedimiento: Antes de realizar las estrías, el asa debe esterilizarse con ayuda del mechero, lo que se evidencia por un color rojo encendido a lo largo del alambre Enfriar el asa en un borde del medio de cultivo a utilizar Tomar la muestra y depositarla en el extremo superior de la caja y suavemente deslizarlo hacia el extremo inferior Posteriormente realizar estrías sobre toda la superficie del agar 4 . Aislamiento por Profundidad - Siembra por profundidad Fundamento : Es mezclar el inoculo con el agar para lograr realizar recuento de UFC (Unidades Formadoras de Colonia) Material : Pipeta volumétrica, medio de cultivo sólido en caja de Petri, material Microbiológico diluido (Solución liquida, solución salina) Procedimiento: Agregar 1 ml de la muestra previamente diluida en la aja de petri . Verter el medio de cultivo a una temperatura de 40ºC , en la caja de Petri con el ml de muestra diluida. Mezclar con el fin de homogeneizar bien la muestra con el medio de cultivo Dejar solidificar
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5. Aislamiento en superficie - Siembra en superficie Fundamento : Es diluir el inoculo sobre la superficie del agar para lograr realizar recuento de UFC Material : Pipeta volumétrica , medio de cultivo sólido en caja de Petri, material Microbiológico diluido (En solución liquida o solución salina) Procedimiento : Agregar 0.1 ml de la muestra previamente diluida sobre la superficie del medio de cultivo sólido. Distribuir la muestra por toda la superficie del agar con la ayuda de un rastrillo Microbiológico o con la punta de una pipeta volumétrica estéril, con el fin de obtener UFC aisladas. 6. Aislamiento por Picadura - Siembra por Picadura Fundamento : Facilitar el desarrollo de las características bioquímicas microbianas Material : Asa recta, medio de Cultivo sólido o semisólido en tubo, colonia pura del microorganismo a evaluar Procedimiento : Antes de realizar la picadura, el asa debe esterilizarse con ayuda del mechero, lo que se evidencia por un color rojo encendido a lo largo del alambre Enfriar el asa en un borde del medio de cultivo a utilizar Tomar la muestra y depositarla en el medio de cultivo mediante picadura, procurando que el asa entre y salga en la misma dirección 7. Aislamiento Mixto - Siembra Mixta Fundamento : Facilitar el desarrollo de las características bioquímicas microbianas Material: Asa recta, medio de Cultivo sólido en disposición inclinada en tubo (Pico de flauta), Colonia pura del microorganismo a evaluar Procedimiento : Antes de realizar la siembra, el asa debe esterilizarse con ayuda del mechero, lo que se evidencia por un color rojo encendido a lo largo del alambre Enfriar el asa en un borde del medio de cultivo a utilizar Tomar la muestra y depositarla en el medio de cultivo mediante picadura, procurando que el asa entre y salga en la misma dirección Posteriormente realizar estría por la superficie del agar inclinado.
INTERPRETACION Partiendo de las observaciones iniciales el microbiólogo se encuentra en capacidad de : Analizar y evaluar el desarrollo de UFC : Realizar el protocolo de análisis de crecimiento teniendo en cuenta : tamaño, forma, elevación, margen, color superficie, densidad , consistencia y hemólisis (solo en medio de agar sangre)
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Determinar la pureza del cultivo : Dependiendo del numero de microorganismos diferentes que pueden desarrollarse en el medio se catalogan como : Cultivo Puro : Aquel donde solo se obtiene un tipo de crecimiento bacteriano. Solo un tipo de bacteria, Solo un tipo de UFC. UFC: Son los descendientes de una sola bacteria; tras muchos ciclos reproductivos cada bacteria individual genera por fisión binaria una colonia compuesta de millones de millones de células similares a la original unidas para hacerse visibles microscópica. Cultivo Mixto : Aquel que contiene dos o mas tipos diferentes de organismos. Dos o mas tipos de UFC. Analizar y decidir si se requieren procedimientos adicionales de identificación
METODOS DE SIEMBRA EN ALIMENTOS Los métodos de Siembra en alimentos siempre parten de la dilución del alimento con el fin de poder facilitar el recuento de UFC para entregar un reporte.
Diluciones: Para la dilución del alimento utilizamos Agua Peptonada al 0,1%, conservando la relación 1 en 10 ósea 1g o ml del alimento con 9 ml de diluyente. Entre mayor sea la cantidad del alimento utilizado mucho mas representativo para determinar la calidad del producto. Para estas diluciones normalmente utilizamos: 10 g o ml del alimento con 90 ml de agua Peptonada al 0,1% 5 g o ml del alimento con 45 ml de agua Peptonada al 0,1% 1 g o ml del alimento con 9 ml de agua Peptonada al 0,1%
Dependiendo del tipo de alimento se realizan tres o mas diluciones manteniendo siempre la misma relación.
SIEMBRA. Desinfectar el área donde se va a trabajar, evitar las corrientes de aire, utilizar la indumentaria adecuada: Gorro, guantes, tapabocas, delantal blanco de laboratorio con cremallera, manga larga. En una balanza colocar el frasco con el diluyente o una bolsa estéril, pesar 10 g del alimento, llevar a homogenizar en una bolsa estéril al homogenizador de alimentos (Stomacher, Ultraturrax). Una vez Homogenizado el alimento, realizar las diluciones tomando del primer frasco o bolsa (Dilución 10 -1) 10 ml y pasarlos a otro frasco con 90 ml de Agua Peptonada al 0,1%, esta queda dilución 10 -2, y así sucesivamente según la cantidad de diluciones que se vayan a realizar.
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Posteriormente pasar 1 ml de cada dilución a cajas de petri, agregar el medio de cultivo e incubar según el microorganismo en estudio.
3. AISLAMIENTO, MICROORGANISMOS.
IDENTIFICACIÓN
Y
RECUENTO
DE
Toma de muestra: La muestra debe ser recogida en la empresa de manera aséptica, la persona encargada de realizar el muestreo debe tener la dotación adecuada: Delantal blanco manga larga, Gorro, Guantes, Tapabocas y debe contar con el material necesario para la toma de las muestras; Cubiertos estériles, Frascos estériles, Bolsas estériles. Debe lavarse y desinfectarse las manos inmediatamente antes y después de realizar el muestreo, de ser necesario realizar lavado y desinfección entre cada toma de muestra. Las nuestras se deben transportar al laboratorio en el menor tiempo posible en neveras plásticas o de icopor con gel refrigerante. Recepción de la muestra: La muestra debe ser recogida en la empresa de manera aséptica y generalmente como se va a entregar al consumidor (Empaque original), llevada al laboratorio en el menor tiempo posible y en las condiciones requeridas por la muestra como es el caso de los productos refrigerados o congelados. Una vez la muestra se encuentre en el laboratorio, proceder a marcarla con el código respectivo: 01: Alimentos 02: Aguas 03: Físico Químico los últimos dos dígitos del año, y su respectivo numero consecutivo de llegada de la muestra al laboratorio.
Procesamiento de la muestra : Muestras Liquidas: Realizar diluciones 1/10 del producto. Utilizar frascos de compota con 45 ml de agua peptonada al 0,1% estéril, con pipeta estéril agregar 5 ml de la muestra previamente homogenizada y realizar las diluciones (manteniendo la relación 1/10) que sean necesarias según el producto.
Muestras Sólidas: Realizar diluciones 1/10 del producto. Utilizar frascos de compota con 45 ml de agua peptonada al 0,15 estéril, pesar en la balanza el frasco con tapa, retirar la tapa, colocarla boca arriba en el plato de la balanza, llevar la balanza a cero. Con cubiertos estériles cortar porciones del alimento (parte externa e interna) agregar al frasco con el agua peptonada hasta alcanzar los 5g, proceder a homogenizar la muestra con la ayuda del homogenizador de alimentos y realizar las diluciones que sean necesarias según el producto.
Una vez preparadas las diluciones proceder a realizar la siembra del producto:
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RECUENTO DE MICROORGANISMOS MESOFILOS AEROBIOS. Son diferentes microorganismos, patógenos y no patógenos que nos dan un indicativo de la calidad higiénico sanitaria en la cual fue elaborado un producto. Todos los microorganismos patógenos son Mesófilos, entre ellos tenemos Estafilococo, Salmonella, Escherichia coli, etc. Pero no todos los microorganismos Mesófilos son patógenos. Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la dilución y pasar a cajas de petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el consecutivo de recepción, la dilución y el microorganismo en estudio), agregar el medio de cultivo (Agar Plate Count), a una temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra con el medio de cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. Recuento: Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución que mejor lo permita, donde encontremos colonia aisladas, sacar el promedio de las dos cajas, multiplicar por el factor de dilución e informar como Recuento de Microorganismos Mesófilos aerobios.
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS. Son microorganismos que nos dan un indicativo de la calidad del ambiente donde fue elaborado un producto o del almacenamiento y manejo de las materias primas. El riesgo de la presencia de los hongos es que además de darle mal aspecto al producto, producen toxinas causantes de intoxicación alimentaria, en cuanto a las levaduras son las que dan inicio a los procesos de fermentación, no son patógenas pero producen sustancias que no son adecuadas para el consumo humano. Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar la siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la dilución y pasar a cajas de petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el consecutivo de recepción, la dilución y el microorganismo en estudio), agregar una gota de suspensión de Cloranfenicol, para inhibir el crecimiento de bacterias contaminantes, luego agregar el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) o Saboraud Dextrosa Agar (SDA) a una temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra con el medio de cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar e incubar a temperatura ambiente de 5 a 7 días. Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución que mejor lo permita, donde encontremos colonia aisladas e informar como recuento de Mohos y Levaduras. NOTA:
Todos los medios de cultivo para aislamiento de Mohos y levaduras requieren de un suplemento antibiótico para evitar el crecimiento de Bacterias.
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NMP DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES. Son enterobacterias, microorganismos patógenos y no patógenos que nos dan un indicativo de la calidad higiénica de la manipulación del producto. Entre los Coliformes totales tenemos microorganismos patógenos como la Salmonella, y el coliforme fecal es la Escherichia coli, indeseable en cualquier producto puesto que su presencia indica contaminación con materia fecal. Aislamiento: De las diluciones realizadas, sembrar una serie de nueve tubos, por triplicado cada dilución, tomar 1 ml de la dilución y pasar a cada uno de los tubos, tres para la primera dilución, tres para la segunda y tres para la tercera. Homogenizar bien la muestra con el caldo de cultivo suavemente por inversión, incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. Una vez cumplido el tiempo observar las siguientes reacciones, según el caldo de cultivo donde se haya realizado el aislamiento: Caldo LMX Fluorocult, no requiere campana de Durham. El medio inicialmente es amarillo muy claro y transparente, la presencia de Coliformes Totales se evidencia por un viraje del medio de amarillo a azul turquesa, la fluorescencia frente a una lámpara de luz ultravioleta evidencia la presencia de Coliformes Fecales lo cual se confirma con la prueba de Indol, agregando unas gotas de reactivo de Kovac´s a los tubos que dieron positivos para Coliformes Totales (Viraje a azul), la reacción que presenta es la formación de un anillo color rojo cereza lo cual nos confirma la presencia de fecales. Las reacciones se comparan con la tabla de NMP. Caldo Lauryl Sulfato Fluorocult: requiere campana de Durham. El caldo inicialmente es amarillo muy claro y transparente, la presencia de Coliformes Totales se evidencia la turbidez del medio y la producción de gas que hace que la campana se ubique en la superficie del tubo, la fluorescencia frente a la lámpara de luz ultravioleta evidencia la presencia de Coliformes Fecales lo cual se confirma con la prueba de Indol, agregando unas gotas de reactivo de Kovac´s a los tubos que dieron positivos para Coliformes Totales (Turbidez y formación de gas), la reacción que presenta es la formación de un anillo color rojo cereza lo cual nos confirma la presencia de Escherichia coli. Las reacciones se comparan con la tabla de NMP y se informa como NMP de Coliformes totales o fecales.
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la dilución y pasar a cajas de petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el consecutivo de recepción, la dilución y el microorganismo en estudio), agregar el medio de cultivo (Agar Chomocult, Colinstan Chomogenic Agar), a una temperatura +/- 40ºC (El medio no
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requiere esterilización), homogenizar bien la muestra con el medio de cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. Recuento: Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución que mejor lo permita, donde encontremos colonia aisladas, realizar el conteo de todas las UFC para Coliformes Totales (Colonias Rojas y Azules), proceder a realizar el recuento solo de las color azul para determinar Coliformes Fecales, sacar el promedio de las dos cajas, multiplicar por el factor de dilución e informar como Recuento de Coliformes Totales y Recuento de Coliformes Fecales.
RECUENTO DE ESPORAS DE Clostridium SULFITO REDUCTOR. Los Clostridios son Bacilos esporulados que se encuentran normalmente en el ambiente, se aíslan de productos cárnicos, derivados de frutas, frutas procesadas, concentrados para animales, enlatados. Preparación de la muestra: De las diluciones realizadas, seleccionar una, colocar 10 ml en un tubo estéril y llevar al Baño María a 80ºC durante 10 minutos, luego llevar el tubo con la muestra a una cubeta con hielo durante 5 minutos, con el fin de activar las esporas de Clostridium que se encuentren presentes en la muestra mediante choque térmico. Aislamiento: Tomar 1 ml de la dilución previamente calentada 10 minutos a 80ºC y posteriormente enfriada en hielo durante 5 minutos para activar la espora, pasar a tubos tapa rosca estériles agregar el medio de cultivo (Agar SPS - Sulfito Polimixina Sulfadiazina, de color verde), a una temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra con el medio de cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar, una vez solidificado el agar, agregar otra capa de agar, o de glicerina y llevar a incubar normalmente. Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución que mejor lo permita, donde encontremos colonia negras aisladas y se informa como recuento de Esporas de C.S.R.
RECUENTO DE Estafilococo COAGULASA POSITIVO. Es un coco Gram. positivo, microorganismo patógeno, produce intoxicación alimentaria, se encuentra en productos Cárnicos, Lácteos y de Repostería, principalmente.
Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar siembra en la superficie del Agar Baird Parker de color amarillo (El medio tiene suspensión de yema de huevo por lo tanto no es posible realizar siembra en profundidad puesto que al calentar el medio esta se desnaturaliza) y por duplicado, tomar 0,1 ml de la dilución homogenizar en la superficie del agar con la ayuda de un rastrillo bacteriológico o de la punta de una pipeta, dejar secar un poco la muestra e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. Una vez cumplido el tiempo se observan colonias negras por la conversión del telúrito a teluro metálico, las colonias de Estafilococo epidermidis
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presentan la misma característica, las colonias que presentan halos de acalaramiento alrededor, halos de lipólisis y proteolisis son presumibles de Estafilococo aureus. Confirmación: De las colonias que sean características, negras y con halos, seleccionar algunas y realizarles la prueba de Coagulasa, tomar una colonia y emulsionarla en un tubo con 0,5 ml de plasma de conejo, incubar a 37ºC durante 4 horas y observar la formación del coagulo. Si hay formación de un coagulo estable es positivo para Estafilococo aureus y se informa como Recuento de Estafilococo Coagulasa positivo. Suspensión de Yema de huevo: Desinfectar los huevos, dejarlos en alcohol durante cinco minutos, en área estéril separar la clara de la yema. Para 500 ml de yema de huevo, agregar: 4,25g de NaCl y 2,1g de Telurito de Potasio, ajustar a 1000 ml con agua destilada estéril. Agitar con fuerza. Agregar al medio de cultivo base ya esterilizado y a una temperatura de 45ºC 50ml de Suspensión de Yema de Huevo por 950 ml de medio de cultivo preparado estéril, mezclar y servir en cajas de petri. Almacenar en refrigeración
RECUENTO DE Bacillus cereus. Los Bacillus son bacilos Gram. positivos esporulados, microorganismos patógenos, produce intoxicación alimentaría, se encuentra normalmente en el suelo, polvo, cereales, productos deshidratados o liofilizados como harinas, féculas, leche en polvo, café. Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar siembra en la superficie del Agar Mossel (De color rosa, el medio tiene emulsión de yema de huevo por lo tanto no es posible realizar siembra en profundidad puesto que al calentar el medio esta se desnaturaliza) y por duplicado, tomar 0,1 ml de la dilución homogenizar en la superficie del agar con la ayuda de un rastrillo bacteriológico o de la punta de una pipeta, dejar secar un poco la muestra e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. Una vez cumplido el tiempo se observan colonias secas similares a la parafina y el medio vira a color amarillo por fermentación del azúcar . Confirmación: De las colonias que sean características, seleccionar algunas y realizarles catalasa (+), Hidrólisis del almidón (+), licuefacción de la gelatina (+) y coloración de Gram.
PRESENCIA /AUSENCIA DE Salmonella. (Método Sustrato Definido) Es una enterobacteria, Coliforme total, microorganismo patógeno, produce intoxicación alimentaría, se encuentra en carnes y sus derivados, leches y derivados, huevos y derivados. Preenriquecimiento: Pasar 25 g del Alimento a un erlemmeyer con 225 ml de caldo de Preenriquecimiento Salmosyst, incubar a 37ºC durante 8 horas. Una vez cumplido el
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tiempo tomar con pipeta estéril 10 ml del caldo y pasar a un tubo tapa rosca estéril, agregar una pasta del suplemento selectivo Salmosyst, (no agitar) dejar reposar durante media hora, agitar fuertemente e incubar 24 h. Si no se tiene el caldo Salmosyst, realizar el procedimiento de Preenriquecimiento en un caldo BHI, Tioglicolato o Lauryl. Aislamiento: Del tubo incubado con el suplemento selectivo realizar siembra por agotamiento en agar Rambach de color rosado (Sustrato especifico), incubar 24 h a 37ºC, al cabo de los cuales se observan: Colonias Rojas: Salmonella Colonias Azules: Echerichia coli
Informar como presencia o ausencia de Salmonella en 25 g.
Si no se tiene Agar Rambach se puede utilizar Agar XLD de color rojo, HE de color azul, Bismuto Sulfito de color verde , S/S de color salmón, pero es necesario realizar pruebas confirmatorias, por medio de una batería.
PRESENCIA /AUSENCIA DE Salmonella. (Método rápido de Screening: Lateral Flow System) Preenriquecimiento: Pasar 25 g del Alimento a un erlemmeyer con 225 ml de caldo de Preenriquecimiento Dupont, incubar a 37ºC durante 8 horas. Una vez cumplido el tiempo tomar con pipeta estéril 10 ml del caldo y pasar a un tubo tapa rosca estéril, introducir la tira Lateral Flow System. Esperar 10 minutos. Interpretación: Luego de los 10 minutos retirar la tira del tubo y esperar la aparición de la línea de color rojo que indica la reacción. Una sola línea es Negativo, Dos líneas es Positivo para Salmonella.
Informar como presencia o ausencia de Salmonella en 25 g.
PRESENCIA /AUSENCIA DE Listeria monocytogenes. Es un bacilo o coco bacilo Gram. positivo, con extremos redondeados, se encuentra en el suelo, polvo, agua, aguas residuales, forraje, fango, abonos naturales, agua de río, carnes, leches, hortalizas. Preenriquecimiento: Pasar 25g del Alimento a un erlemmeyer con 225 ml de caldo L- Palcam de color vino tinto, incubar a 37ºC durante 24 horas. Una vez cumplido el tiempo realizar siembra por agotamiento en agar Palcam, incubar 24 h a 37ºC, en ambiente microaerofilico (Bombonera con vela) al cabo de los cuales se observan colonias color verde grisáceo con un halo color marrón negro sobre el fondo rojo cereza del medio inicial.
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Confirmación: De las colonias que sean características, seleccionar algunas y realizarles catalasa (+), Movilidad (+) típico en forma de sombrilla, coloración de Gram. y Prueba de CAMP. Informar como presencia o Ausencia de Listeria monocytogenes en 25 g
PRESENCIA/AUSENCIA DE Pseudomona aeruginosa. Es un bacilo Gram. negativo, su determinación es importante a nivel de productos cosméticos.
Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar siembra en la superficie del Cetrimide por agotamiento o siembra masiva con 0,1 ml de la dilución con la muestra, dejar secar un poco la muestra e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. Una vez cumplido el tiempo se observan colonias verdes con olor característico. Confirmación: A las colonias que sean características, realizarles confirmación con una prueba de oxidasa que es positiva, informar como positivo o negativo.
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DETERMINACION DE CAPACIDAD DESINFECTANTE Conservar cepas puras (ATCC) de los microorganismos que se vayan a avaluar, repicar a caldo BHI incubar durante 24 h, realizar lectura de la suspensión de microorganismos en espectrofotómetro a 540 nm, hasta obtener absorbancia de 0,1 que equivale a 10 6 microorganismos. Aparte en tubos estériles adicionar 5 mililitros del desinfectante en cada tubo y agregar en cada uno 0,5 ml del cultivo de cada microorganismo a evaluar con una absorbancia de 0,1, inmediatamente realizar la siembra en profundidad con Agar Tripticase Soya, repetir la siembra a los 10, 15, 30, 45 y máximo 60 minutos de contacto del desinfectante con el microorganismo. NOTA: es importante controlar el tiempo de contacto con un reloj o cronometro y mantener los medios de cultivo a la temperatura adecuada para la siembra en el momento exacto de cumplirse el tiempo de contacto. Dejar solidificar, montar un control (+) con 0,1 ml de la suspensión del microorganismo y control negativo solo con el desinfectante. Incubar 24 h a 37ºC, una vez cumplido el tiempo realizar la lectura, lo ideal es que a partir del tiempo 0, o contacto inmediato no haya crecimiento de ninguno de los microorganismos es estudio, verificar la turbidez frente al control positivo (Turbio o con colonias visibles) y al control negativo (Completamente transparente).
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PROCEDIMIENTO PARA CONTROLES DE PROGRAMA DE L&D De una correcta Toma, Manipulación y Transporte de las muestras depende la adecuada custodia de estas para garantizar resultados reales. El transporte debe en ser refrigeración y no tardar mas de una (1) hora para iniciar el proceso de análisis, de lo contrario mantener refrigeradas a 4ºC hasta el momento de procesarlas. Dependiendo del proceso se utilizan diferentes medios de cultivo, si se va a realizar la validación de un desinfectante post proceso de L&D utilizar Caldo Leethen en lugar de Agua Peptonada para inactivar el desinfectante y la siembra de Mesófilos Aerobios realizarla en Agar Tripiticase Soya en lugar de Agar Plate Count, si solo se va a verificar la calidad higiénico sanitaria durante el proceso, utilizar Peptona y Plate Count.
FROTIS DE MANOS
Toma de muestra: El muestreo se debe realizar en cualquier momento durante el proceso de elaboración de productos en la empresa, sin previo aviso puesto que la finalidad es determinar la calidad higiénico sanitaria del personal manipulador en la planta de proceso. Solicitar educadamente al manipulador el favor de facilitarnos sus manos para realizar la toma de la muestra.
Procedimiento: Humedecer un aplicador estéril en el tubo con agua peptonada (AP) al 0,1%, eliminar el remanente contra las paredes del tubo y proceder a tomar la muestra de la palma de la mano del manipulador y de los espacios interdigitales, con la punta del aplicador tomar muestra de las uñas del manipulador, introducir nuevamente el aplicador el tubo con AP, quebrar el palo a la altura de la boca del tubo para facilitar la extracción del aplicador en el momento de la siembra y así evitar manipular la muestra. Siembra: realizar la siembra única con el método requerido para Mesófilos aerobios, Mohos y levaduras y para Estafilococo Coagulasa positiva. Para la siembra de Coliformes totales y fecales se hace en un solo tubo, se incuba de la manera acostumbrada. Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas para Mesófilos aerobios, Mohos y Levaduras, informar como UFC/mano. El Estafilococo informarlo como positivo o negativo, para los Coliformes observar la turbidez del caldo y si la prueba de Indol es positiva, informar la prueba cono positiva o negativa según el resultado.
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NOTA:
Informar las observaciones realizadas durante el muestreo, por ejemplo: Unas largas, Cortaduras, Resequedad en las Manos, etc.
FROTIS DE SUPERFICIES
Toma de muestra: El muestreo se debe realizar en cualquier momento durante el proceso de elaboración del producto en la empresa, sin previo aviso si la finalidad es determinar la calidad Microbiológica de la superficie en contacto con el producto durante el proceso. Si se quiere verificar el proceso de limpieza y desinfección, realizar el muestreo a la Superficie Lavada y desinfectada. Procedimiento: Colocar en la superficie una plantilla con área establecida o demarcar el área a muestrear. Humedecer un aplicador estéril en el tubo con agua peptonada (AP) al 0,1%, o con caldo Letheen para inactivar los desinfectantes luego del proceso de L&D; eliminar el remanente contra las paredes del tubo y proceder a tomar la muestra del interior de la plantilla o del área demarcada , en forma horizontal y vertical, introducir nuevamente el aplicador el tubo con AP, quebrar el palo a la altura de la boca del tubo para facilitar la extracción del aplicador en el momento de la siembra y así evitar manipular la muestra. Siembra: realizar la siembra única con el método requerido para Mesófilos aerobios, Mohos y levaduras. Para la siembra de Coliformes totales y fecales se hace en un solo tubo, se incuba de la manera acostumbrada. Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/área. Para los Coliformes observar la turbidez del caldo y si la prueba de Indol es positiva, informar la prueba cono positiva o negativa según el resultado.
FROTIS DE UTENSILIOS
Toma de muestra: El muestreo se debe realizar en cualquier momento durante el proceso en la empresa, sin previo aviso puesto que la finalidad es determinar la calidad Microbiológica de los Utensilios que están en contacto con el producto en la planta de proceso. Procedimiento: Humedecer un aplicador estéril en el tubo con agua peptonada (AP) al 0,1%, eliminar el remanente contra las paredes del tubo y proceder a tomar la muestra del Utensilio que se va a evaluar, introducir nuevamente el aplicador el tubo con AP, quebrar el palo a la altura de la boca del tubo para facilitar la extracción del aplicador en el momento de la siembra y así evitar manipular la muestra.
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Siembra: realizar la siembra única con el método requerido para Mesófilos aerobios, Mohos y levaduras. Para la siembra de Coliformes totales y fecales se hace en un solo tubo, se incuba de la manera acostumbrada. Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/utensilio. Para los Coliformes observar la turbidez del caldo y si la prueba de Indol es positiva, informar la prueba cono positiva o negativa según el resultado.
FROTIS DE EQUIPOS
Toma de muestra: El muestreo se debe realizar en cualquier momento durante el proceso en la empresa, sin previo aviso si la finalidad es determinar la calidad Microbiológica del equipos en el momento del proceso. Si se quiere verificar el proceso de limpieza y desinfección, realizar el muestreo al equipo lavado y desinfectado. Procedimiento: Humedecer un aplicador estéril en el tubo con agua peptonada (AP) al 0,1%, eliminar el remanente contra las paredes del tubo y proceder a tomar la muestra del interior del Equipo, introducir nuevamente el aplicador el tubo con AP, quebrar el palo a la altura de la boca del tubo para facilitar la extracción del aplicador en el momento de la siembra y así evitar manipular la muestra. Siembra: realizar la siembra única con el método requerido para Mesófilos aerobios, Mohos y levaduras. Para la siembra de Coliformes totales y fecales se hace en un solo tubo, se incuba de la manera acostumbrada. Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/equipo. Para los Coliformes observar la turbidez del caldo y si la prueba de Indol es positiva, informar la prueba cono positiva o negativa según el resultado.
CONTROL DE AMBIENTES
Para Empresas de alimentos: Toma de muestra: En el sitio donde se va a realizar el muestreo destapar dos cajas de petri plásticas, previamente marcadas, dejando los agares expuestos al medio ambiente, una caja con Agar Papa Dextrosa con Cloranfenicol para la determinación de mohos y levaduras, la otra con Agar Plate Count para Mesófilos aerobios. Dejar destapadas durante 15 minutos, al cabo de los cuales de tapan las cajas y se llevan al laboratorio para proceder a roturarlas e incubarlas según la necesidad: Mohos y levaduras: temperatura ambiente de 5 a 7 días. Mesófilos aerobios: 37ºC, de 24 a 48 horas Psicrofilos: 5 a 7ºC , durante siete días.
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Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/15 minutos. Para empresas de cosméticos o Farmacéuticas: Toma de muestra: En el sitio donde se va a realizar el muestreo destapar dos cajas de petri plásticas pequeñas, previamente marcadas, dejando los agares expuestos al medio ambiente, una caja con Saboureaud para la determinación de mohos y levaduras, la otra con Agar Tripticase Soya para Mesófilos aerobios. Dejar destapadas durante 30 minutos, al cabo de los cuales de tapan las cajas y se llevan al laboratorio para proceder a roturarlas e incubarlas según la necesidad: Mohos y levaduras: temperatura ambiente de 5 a 7 días. Mesófilos aerobios: 37ºC, de 24 a 48 horas
Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/15 minutos.
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LAVADO, SECADO, ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL Todo el material de vidrio debe lavarse, secarse en el horno secador a una temperatura de 60ºC, una ves este seco, se debe empacar o envolver en papel Kraf y llevar a esterilizar en el autoclave. Una vez estéril secar nuevamente en el horno secador y almacenar para ser utilizado posteriormente. El paquete que se destape no se debe utilizar puesto que corremos el riego de contaminación.
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MANEJO DE DESECHOS (MATERIAL CONTAMINADO) Todo material de desecho Biológico o contaminado se considera de alto riesgo, por lo tanto se debe manejar de la siguiente forma:
Todo material que se utilice para el crecimiento, aislamiento e identificación de microorganismos debe ser llevado al autoclave antes de ser desechado. Las cajas de petri con microorganismos y los tubos de NMP con crecimiento se deben esterilizar en autoclave a una temperatura de 120ºC. 15 Lbs psi durante 15 minutos, posteriormente dejar solificar el agar y descartarlo en bolsa roja. Tener en cuenta como descartar los productos:
Material reciclable: Material para incinerar:
o o o o o
Papel, Cartón, Vidrio (Llevarlo al parqueadero) Descartar en bolsa de color rojo. EMAS recoge la basura semanalmente, en este basurero deben ir depositados los siguientes desechos:
Restos de alimentos que se encuentren contaminados Medios de cultivo estériles y solidificados Cajas de petri desechables Aplicadores Tubos Swab Rinse Kit
Basura común: va para el relleno sanitario, y es la basura que comúnmente se descompone, desechos orgánicos, se arroja por el shut.
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ANALISIS DE AGUAS Las muestras de Agua para análisis Microbiologicos deben ser tomadas asépticamente en frascos estériles y transportadas al laboratorio refrigeradas y en el menor tiempo posible. De no ser así mantenerlas refrigeradas. Las condiciones de la toma de la muestra son iguales a las de alimentos; dotación completa.
Toma de muestra: La muestra debe ser recogida aséptica, la persona encargada de realizar el muestreo debe tener la dotación adecuada: Delantal blanco manga larga, Gorro, Guantes, Tapabocas y debe contar con el material necesario para la toma de las muestras; Frascos estériles, Debe lavarse y desinfectarse las manos inmediatamente antes y después de realizar el muestreo, de ser necesario realizar lavado y desinfección entre cada toma de muestra. Las nuestras se deben transportar al laboratorio en el menor tiempo posible en neveras plásticas o de icopor con gel refrigerante. Recepción de la muestra: Una vez la muestra se encuentre en el laboratorio, proceder a marcarla con el código respectivo: 02: Aguas los últimos dos dígitos del año, y su respectivo numero consecutivo de llegada de la muestra al laboratorio. Procesamiento de la muestra :
Agua Tratada: Agregar a la muestra 0,1 de Tiosulfato para inactivar el cloro. Realizar siembre directa Agua No Tratada: Realizar diluciones 1/10 del agua a analizar. Utilizar frascos de compota con 45 ml de agua peptonada al 0,1% estéril, y realizar las diluciones que sean necesarias según el producto.
RECUENTO DE HETEROTROFOS. Son diferentes microorganismos, patógenos y no patógenos que nos dan un indicativo de la calidad higiénico sanitaria del agua. Aislamiento: Realizar siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la dilución y pasar a cajas de petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el
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consecutivo de recepción, la dilución y el microorganismo en estudio), agregar el medio de cultivo (Agar Plate Count), a una temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra con el medio de cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. Recuento: Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución que mejor lo permita, donde encontremos colonia aisladas, sacar el promedio de las dos cajas, multiplicar por el factor de dilución e informar como Recuento de Heterotrofos.
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES. Son enterobacterias, microorganismos patógenos y no patógenos que nos dan un indicativo de la calidad del agua a analizar. Entre los Coliformes totales tenemos microorganismos patógenos como la Salmonella, y el coliforme fecal es la Escherichia coli, indeseable en cualquier producto puesto que su presencia indica contaminación con materia fecal. Aislamiento: Realizar siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la muestra y pasar a cajas de petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el consecutivo de recepción, la dilución y el microorganismo en estudio), agregar el medio de cultivo (Agar Colistant), a una temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra con el medio de cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. Recuento: Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución que mejor lo permita, donde encontremos colonia aisladas, sacar el promedio de las dos cajas, multiplicar por el factor de dilución e informar como Recuento de Coliformes Totales y fecales así: Coliformes Totales: Colonias transparentes y azul violeta Coliformes fecales. Colonias Azul Violeta.
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