%d0%b0%d0%b2%d1%82%d0%be%d1%80%d0%b5%d1%84%d0%b5%d1%80%d0%b0%d1%82

На правах рукописи

Изместьев Сергей Валерьевич ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ КОМПЕНСАЦИИ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ (Клинико-экспериментальное исследование) 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Чита – 2013

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Цыбиков Намжил Нанзатович Официальные оппоненты: Ефремов Анатолий Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, членкорреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии Семинский Игорь Жанович, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет», заведующий кафедрой патологии с курсом клинической иммунологии и аллергологии Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Барнаул Защита состоится «____» ____________ 2013 г. в 9.00 на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения России, 672090, г.Чита, ул. Горького, 39 а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации Автореферат разослан «____» ____________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.118.01 д.м.н., профессор

И.Н. Гаймоленко 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Согласно современным представлениям, одним из независимых факторов риска атеросклероза и тромбоза коронарных, церебральных и других сосудов является повышение уровня в плазме крови гомоцистеина, который инициирует повреждение эндотелиальных клеток и тем самым запускает процесс образования атеросклеротической бляшки, активирует систему гемокоагуляции, тромбоцитарный гемостаз (Цыбиков Н.Н., 2007; Смирнова О.А., 2008; Шмелева В.М., 2010). Метаболизм гомоцистеина протекает преимущественно в печени и почках двумя основными путями: реметилирование с образованием метионина (при участии ферментов: метионинсинтетазы и метилентетрагидрофолатредуктазы) и транссульфирование с превращением в цистеин (фермент – цистатионин-βсинтетаза). В основе гипергомоцистеинемии лежит наследственная или приобретенная недостаточная активность ферментов, осуществляющих его метаболизм. В последнее время появились сведения о том, что действие гомоцистеина не ограничивается повреждением эндотелия с запуском атеротромбоза. Описана способность этого аминотиола связываться с особой группой глутаматных рецепторов (NMDA-рецепторов), имеющихся на мембранах нейронов, кардиомиоцитов, лейкоцитов, эритроцитов, мегакариоцитов и других клеток (Арзуманян Е.С., 2008; Машкина А.П., 2010; Болдырев А.А., 2012; Gill S., 2007), при этом развиваются окислительный стресс, повреждение и гибель клетки. В настоящее время актуален вопрос об эффективном и своевременном выявлении гипергомоцистеинемии, которую делят на явную и скрытую (Selbum J., 1992). Приблизительно у 50% обследуемых лиц с нормальным уровнем гомоцистеина натощак существуют скрытые нарушения его метаболизма. Для диагностики скрытой гипергомоцистеинемии используют нагрузочный метиониновый тест (Гуржий А.А., 2008). Данная проба предполагает многократный забор венозной крови в течение суток: до, через 4, 6, 24 часа после перорального приема метионина. В связи с этим представляются актуальными исследования для создания неинвазивной технологии проведения метионинового теста с исследованием уровня гомоцистеина в ротовой жидкости. В циркуляции гомоцистеин присутствует в свободной форме, в виде дисульфидов, но большая его часть образует связь с белками, особенно, с альбумином (Блашко Э.Л., 2007). Суммарное количество этих форм составляет общий гомоцистеин. Конъюгаты с белками плазмы крови образует и гомоцистеинтиолактон. Комплексы альбумина с гомоцистеином и альбумина с гомоцистеинтиолактоном обладают аутоантигенными свойствами и вызывают образование аутоантител (Jakubowski H., 2005; Undas A. 2007). Сформированные иммунные комплексы могут явиться как фактором повреждения эндотелия, так и дополнительным механизмом элиминации гомоцистеина. Данный вопрос в доступной нам литературе до настоящего времени освещен не достаточно.

3

Целью исследования явилось изучение иммунных механизмов элиминации гомоцистеина при гипергомоцистеинемических состояниях. В связи со сказанным решались следующие задачи: 1. Получить конъюгат сывороточного альбумина человека и крысы с гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном (модифицированный альбумин).

2. Определить уровень гомоцистеина и аутоантител к альбумину, модифицированному гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном у интактных крыс и животных с экспериментальным иммунодефицитом.

3. Изучить морфологические изменения миокарда и количественные показатели гемограммы у крыс на фоне гипергомоцистеинемии. Оценить экспрессию тканевого фактора у животных при высокой концентрации гомоцистеина.

4. Определить содержание гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину в сыворотке крови и смешанной слюне у здоровых лиц и больных сердечно-сосудистой патологией.

5. Изучить уровень циркулирующих иммунных комплексов у экспериментальных животных и человека.

6. Исследовать динамику концентрации гомоцистеина в сыворотке крови и ротовой жидкости при проведении метионинового нагрузочного теста. Научная новизна Получен комплекс сывороточного альбумина крысы и человека с гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном в условиях in vitro. Впервые установлено, что у животных при введении в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона уровень общего гомоцистеина плазмы крови остается на исходном уровне на фоне резкого повышения титра аутоантител к модифицированному альбумину. При моделировании гуморального иммунодефицита у крыс выявлено резкое увеличение как исходного уровня общего гомоцистеина в плазме крови, так и после введения в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона. Впервые выполнен анализ уровня гомоцистеина в ротовой жидкости пациентов при проведении метионинового нагрузочного теста, что позволяет избежать многократного инвазивного вмешательства, связанного с забором крови. Теоретическая ценность работы Описанный механизм элиминации гомоцистеина при повышении его уровня в организме путем развития гуморального иммунного ответа с образованием аутоантител к белкам, модифицированным гомоцистеином и гомоцистеинтиолактоном, расширяет представления о регуляторной роли иммунной системы. Внедрение результатов работы 4

Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс кафедр патологической физиологии, нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ. Положения, выносимые на защиту 1. Иммунная система способна регулировать уровень общего гомоцистеина в плазме крови в пределах физиологических значений путем образования аутоантител против комплекса гомоцистеина с сывороточным альбумином.

2. При физиологических значениях уровня гомоцистеина и гипергомоцистеинемии происходит сенсибилизация к модифицированным гомоцистеином белкам, образованные антитела класса S-IgA поступают в секреты, в том числе, в ротовую жидкость, что обеспечивает быструю элиминацию гомоцистеина и может быть зарегистрировано при проведении нагрузочного метионинового теста.

3. Гомоцистеин оказывает токсическое действие на клетки и структуры организма, несущие на поверхности NMDA-рецепторы, через активацию последних и усиление экспрессии тканевого фактора в эндотелиоцитах, но не в фибробластах и нейтрофилах. Апробация работы Основные результаты работы были представлены на I Всероссийской научнопрактической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» г. Барнаул, 2011 г.; III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» г. Новосибирск, 2011 г.; IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» г. Новосибирск, 2012 г.; Научно-практической конференции «I Съезд терапевтов Забайкальского края» г. Чита, 2013 г.; V Международной научно-практической конференции «Экология. Здоровье. Спорт» г. Чита, 2013 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию ЧГМА «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» г. Чита, 2013 г. Публикации По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, включает введение, 4 главы: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты 5

собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», выводы, список литературы. Диссертация содержит 18 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 50 отечественных и 114 зарубежных источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.). Экспериментальные исследования проводились в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в исследовательских и других научных целях» (Strasburg, 1986). На первом этапе работы получали модифицированный крысиный и человеческий альбумин: гомоцистеин в концентрации 150 мкмоль/л ("Fluco", Германия) инкубировали с 5% раствором сывороточного альбумина в течение 24 ч при 4°С и 1 ч при 37°С. Полученную смесь центрифугировали (15 мин при 14000 g) с ультрафильтрацией при помощи микрофильтров AmiconUltra с порогом разделения 50 кДа (Millipore, USA) с целью отделить свободный гомоцистеин от образовавшего связь с белком, после чего методом ВЭЖХ определяли концентрацию гомоцистеина в образцах до, после фильтрации и в фильтрате. Полученный белок использовали в качестве тест-системы для определения аутоантител. Экспериментальная часть работы Изучение аутоантител к комплексу крысиного альбумина с гомоцистеином, гомоцистеина, циркулирующих иммунных комплексов В эксперименте использовано 40 беспородных крыс-самцов, средней массой 150 г. У 20 животных вызывали иммунодефицит, 20 составили контрольную группу. Модель иммунодефицита получали путем внутрибрюшинного введения раствора циклофосфана (ООО «ЛЭНС-фарм») в дозе 100 мг/м 2 3 раза в неделю в течение 2 недель. Расчет площади поверхности тела животных производили по формуле: S (см2) = К3√m2 (г), где К – коэффициент, равный для крысы – 9,13–11,05. Наличие иммунодефицита подтверждали определением иммунограммы методом проточной цитофлюориметрии. После контрольного забора крови 10 животным из каждой группы вводили гомоцистеин в дозе 100 мкмоль на 1 мл ОЦК, другим 10 крысам из каждой группы – гомоцистеин-тиолактон в той же концентрации (расчет ОЦК крысы осуществляли в соответствии с соотношением 6 мл/100 г). Через 6 ч кровь забирали вновь, затем ежедневно в течение 9 суток вводили указанные аминотиолы, после чего осуществляли последний забор крови. Аутоантитела к комплексу альбумина с гомоцистеином в сыворотке крови иммунодефектных и интактных крыс определяли методом реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Сыворотку делили на 2 части: к одной части добавляли раствор цистеина для определения IgG (согласно методическим рекомендациям по 6

постановке РПГА с цистеиновой пробой); в другой части (без цистеина) определяли все классы иммуноглобулинов. Трижды отмытый физиологическим раствором осадок эритроцитов фиксировали глутаровым альдегидом 30 мин при 0°С при периодическом перемешивании. Фиксированные эритроциты отмывали 5 раз 0,15 М NaCl и 5 раз дистиллированной водой. К отмытому осадку фиксированных эритроцитов добавляли полученный комплекс альбумина с гомоцистеином. Смесь инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной отмывки эритроциты, сенсибилизированные комплексом крысиного альбумина с гомоцистеином, использовали для проведения РПГА, в качестве контроля – эритроциты, сенсибилизированные нативным крысиным альбумином и несенсибилизированные эритроциты. Уровень гомоцистеина в сыворотке крови крыс оценивали с помощью ВЭЖХ по методу Дутова А.А. (2010 г.) Концентрацию ЦИК в сыворотке крови крыс определяли методом преципитации с растворами полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) в концентрации 3,5%, 7% и 10% с последующей спектрофотометрической детекцией плотности раствора. Иммунограмму у экспериментальных животных определяли методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител CD3-FITC, CD4-PC7, CD8-APC, CD45RA-PC7, CD161a-APC (Beckman Coulter, USA). Изучение морфологических изменений миокарда, периферической крови, экспрессии тканевого фактора крыс на фоне гипергомоцистеинемии Эксперимент поставлен на 40 беспородных крысах, которых разделили на 4 группы по 10 животных. Крысам 1 и 2 групп вводили физиологический раствор, а животным 3 и 4 групп – гомоцистеин в концентрации 0,001 мг на 1 мл ОЦК. С целью сопоставить динамику изменений животных 1 и 3 групп вывели из эксперимента на седьмые сутки, а крыс 2 и 4 групп – на четырнадцатые. Микроскопию миокарда крыс осуществляли с окрашиванием препаратов гематоксилин-эозином и по Ван Гизону с оценкой морфологических изменений в 10 полях зрения. Общий анализ крови экспериментальных животных выполнен с помощью автоматического анализатора PENTRA 120 Retic. Оценка экспрессии тканевого фактора в миокарде крыс проведена иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител TF9-10H10 (Santa Cruz biotechnology, USA). Результат оценивали как отрицательный, если окрашенных клеток определялось менее 10%; в остальных случаях положительный результат оценивался по шкале от 1 до 4 баллов (1 балл – 10-25% окрашенных клеток; 2 балла – 25-50%; 3 балла – 50-75%; 4 балла – более 75%). Подсчет клеток осуществляли в 10 полях зрения. Клинические исследования Обследовано 77 лиц (средний возраст 61,2±9,7 лет), находившихся на лечении в отделении кардиологии НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Чита-2 ОАО «РЖД», с диагнозами: гипертоническая болезнь I стадии, 1-2 степени, риск 2 7

(10 человек); гипертоническая болезнь II стадии, 2-3 степени, риск 3 (33 человек); ИБС: стабильная стенокардия III ФК, НК II A, III ФК (12 человек); ИБС: прогрессирующая стенокардия, НК II A, III ФК (12 человек); ИБС: Q-инфаркт миокарда, острая стадия (10 человек). Контрольную группу составили 22 человека без выявленной сердечно-сосудистой патологии, сопоставимые по полу и возрасту. Материалом исследования явились сыворотка крови и ротовая жидкость. Аутоантитела к комплексу альбумина с гомоцистеином в сыворотке крови и ротовой жидкости человека определяли методом ИФА с использованием анти-IgGантител для образцов сыворотки крови и анти-S-IgA-антител для образцов ротовой жидкости ("Вектор-бест", Новосибирск). Уровень гомоцистеина в сыворотке крови и ротовой жидкости человека оценивали с помощью ВЭЖХ по методу Дутова А.А.

(2010 г.). Концентрацию ЦИК в сыворотке крови и ротовой жидкости определяли методом преципитации с раствором полиэтиленгликоля со спектрофотометрической детекцией плотности раствора. Метиониновый нагрузочный тест проведен с оценкой уровня гомоцистеина в сыворотке крови и ротовой жидкости до и через 4 часа после перорального приема таблетированного метионина в дозе 100 мг/кг. Статистическая обработка Полученные данные обработаны с использованием программы STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., USA). Статистическую значимость различий в группах оценивали с помощью критерия Манна-Уитни для сравнения двух независимых переменных и Уилкоксона для двух зависимых переменных. Корреляционный анализ проведен по методу Спирмена. Значимыми считали различия при р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты экспериментального исследования Получение комплекса альбумина с гомоцистеином При инкубации гомоцистеина с раствором сывороточного альбумина получен следующий результат: содержание гомоцистеина в образце до фильтрации составило 189,3 нг/мкл, после фильтрации и десорбции с фильтра - 74,3 нг/мкл, в фильтрате 120 нг/мкл. Таким образом, 40% гомоцистеина комплексировалось с альбумином в условиях in vitro. В условиях in vivo, как известно из литературных источников, около 70% гомоцистеина в плазме крови образует связь с альбумином (Блашко Э.Л., 2007). Титр аутоантител и уровень гомоцистеина у интактных крыс Как видно из табл. 1 у интактных крыс до нагрузки гомоцистеином и гомоцистен-тиолактоном обнаруживаются аутоантитела IgG и других классов к комплексу альбумина с гомоцистеином. Через 6 ч после введения аминотиолов титр аутоантител возрастает. Спустя 9 суток титр аутоантител выше исходного у крыс, получавших гомоцистеин.

8

Таблица 1 Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином у интактных крыс (Ме (25-й; 75-й)) Через 6 ч после введения После 9 дней введения гомоцистеингомоцистеингомоцистеина гомоцистеина тиолактона тиолактона Все Все Все Все Все классы IgG классы IgG классы IgG классы IgG классы Ig Ig Ig Ig Ig 1:60 1:480* 1:720* 1:480* 1:960* 1:480* 1:960* 0 1:480 (1:15; (1:480; (1:480; (1:480; (1:960; (1:480; (1:480; (0; 0) (1:60; 1:60) 1:480) 1:960) 1:480) 1:960) 1:960) 1:960) 1:960)

До нагрузки IgG 1:30 (0; 1:30)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с уровнем до нагрузки. Наличие аутоантител к альбумину, модифицированному гомоцистеином, у интактных крыс до введения им экзогенного тиола говорит о том, что этот комплекс вызывает иммунизацию при физиологических концентрациях гомоцистеина. Сформировавшийся гуморальный иммунный ответ сопровождается сохранением Вклеток памяти, которые при последующей антигенной стимуляции обеспечивают вторичный иммунный ответ. Этим можно объяснить возрастание титра аутоантител у интактных крыс через 6 ч после поступления в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона. Через 6 ч после инъекции гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона и после девятидневного их введения уровень эндогенного гомоцистеина у интактных крыс не отличался от значений, зарегистрированных при заборе крови до нагрузки экзогенными тиолами (табл. 2). Таблица 2 Уровень гомоцистеина в сыворотке крови интактных крыс (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)) До нагрузки 3,81 (3,03; 4,38)

Через 6 ч после введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона 2,92 3,90 (2,02; 2,99) (3,57; 4,54)

После 9 дней введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона 4,24 4,48 (3,74; 5,52) (3,73; 5,25)

Ожидаемого увеличения уровня общего гомоцистеина в сыворотке крови после введения экзогенных тиолов не происходит, это может быть связано с повышением титра аутоантител к комплексу сывороточного альбумина с гомоцистеином, что свидетельствует об их регуляторной функции, направленной на поддержание концентрации гомоцистеина в пределах физиологических значений. Уровень аутоантител и гомоцистеина у крыс с ИДС 9

У животных, получавших циклофосфан, в сравнении с показателями интактных крыс, отмечалось снижение абсолютного количества В-лимфоцитов на 30%; увеличение процентного содержания Т-лимфоцитов на 34%; уменьшение соотношения Т-хелперы/Т-киллеры в 5 раз со снижением Т-хелперов на 39% и увеличением количества Т-киллеров на 42%. Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином у крыс с ИДС до введения экзогенных тиолов сопоставим с данными у интактных животных (табл. 3). Спустя 6 ч после введения как гомоцистеина, так и тиолактона содержание иммуноглобулинов значимо ниже по сравнению с интактными крысами, у которых на этом сроке эксперимента наблюдается подъем титра аутоантител. После девятидневного введения гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона содержание аутоантител также значимо меньше, чем у интактных крыс на том же сроке эксперимента. Таблица 3 Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином у крыс с ИДС (Ме (25-й; 75-й)) До нагрузки IgG 0 (0; 0)

Все классы Ig 1:30 (1:30; 1:60)

Через 6 ч после введения После 9 дней введения гомоцистеингомоцистеингомоцистеина гомоцистеина тиолактона тиолактона Все Все Все Все IgG классы IgG классы IgG классы IgG классы Ig Ig Ig Ig 1:30* 1:60* 1:30* 1:60* 1:15* 1:30* 0 1:60* (1:30; (1:60; (1:30; (1:60; (0; 1:30) (0; 1:60) (0; 1:30) (0; 1:60) 1:30) 1:60) 1:30) 1:60)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями у интактных крыс. У крыс с ИДС уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови почти в 2 раза выше, чем у интактных крыс при заборе крови до введения экзогенного гомоцистеина (табл. 4). Таблица 4 Уровень гомоцистеина в сыворотке крови крыс с ИДС (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)) До нагрузки 7,18* (6,61; 7,59)

Через 6 ч после введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона ∆ 6,20* 9,38* (4,92; 10,2) (7,65; 12,1)

После 9 дней введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона 7,50* 8,67* (6,05; 9,29) (6,73; 9,50)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями группы контроля; ∆ р<0,05 в сравнении с уровнем до нагрузки.

10

Изначально высокая концентрация этого вещества у животных с ИДС может подтверждать регуляторную роль иммунной системы. Значимо большее содержание общего гомоцистеина в сыворотке крови крыс с ИДС по сравнению с уровнем у интактных сохраняется на всех сроках эксперимента. Через 6 ч после введения гомоцистеина наблюдалось повышение его уровня в сыворотке крови в сравнении с уровнем до инъекции, чего не отмечалось у животных с интактной иммунной системой. После 9 дней введения тиолов концентрация гомоцистеина у крыс с ИДС возвращалась к исходному значению (до нагрузки), что возможно, объясняется работой известных механизмов элиминации гомоцистеина (реметилирование и транссульфирование). Уровень циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови крыс Наиболее значимые различия между группами зарегистрированы при определении ЦИК низкой молекулярной массы (табл. 5) Таблица 5 Уровень ЦИК у экспериментальных крыс (ед. оп. пл. OD450) (Ме (25-й; 75-й)) Группа

До нагрузки

Интактные крысы Крысы с ИДС

0,338 (0,178; 0,629) 0,142 (0,007; 0,775)

Через 6 ч после введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона 0,184 0,093 (0,05; 0,328) (0,025; 0,347) 0,627* 0,765* (0,303; 1,133) (0,647; 0,978)

После 9 дней введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона 0,792 0,535 (0,581; 1,041) (0,005; 0,781) 0,168* 0,154 (0,128; 0,24) (0,028; 0,275)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы Возрастание количества ЦИК после введения экзогенных гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона у крыс с ИДС, возможно, указывает на связывание последних аутоантителами к модифицированному альбумину. Тот факт, что у интактных животных увеличения уровня ЦИК не происходит, объясняется, повидимому, более быстрой элиминацией иммунных комплексов из кровотока путем фагоцитоза, который нарушен у животных, получавших цитостатик. Изменения в морфологии миокарда и периферической крови у животных на фоне гипергомоцистеинемии Содержание гомоцистеина в сыворотке крови животных с экспериментальной гипергомоцистеинемией (третья группа) составило 4,46 (3,9; 4,81) мкмоль/л (Ме (25й; 75-й)), что не отличалось от концентрации в контроле. У крыс четвертой группы – 14,6 (10,5; 16,2) мкмоль/л (Ме (25-й; 75-й)), что значимо выше по сравнению с уровнем у крыс, получавших физиологический раствор.

11

При изучении гистологического строения миокарда в обеих группах крыс, получавших гомоцистеин, зафиксировано уменьшение диаметра кардиомиоцитов, снижение числа одноядерных клеток с соответствующим изменением соотношения одноядерных к многоядерным кардиомиоцитам (табл. 6). Таблица 6 Морфометрические показатели миокарда левого желудочка крыс (Mе (25-й; 75-й)) Показатель Диаметр кардиомиоцитов (мкм) одноядерных двух- и многоядерных соотношение одноядерных к многоядерным

1 группа 2 группа 12,2 12,7 (11,5; 13,0) (12,0; 14,0) Количество клеток (%) 16,5 17,0 (15,0; 18,0) (16,0; 18,5) 83,5 83,0 (82,0; 85,0) (81,5; 84,0)

3 группа 9,75* (9,0; 10,5)

4 группа 8,5* (7,0; 10,0)

12,2* (12,0; 13,0) 88,0* (87,0; 88,5)

9,5* (8,0; 11,0) 90,5* (89,0; 92,0)

0,2 (0,18; 0,22)

0,14* (0,14; 0,15)

0,1* (0,09; 0,12)

0,2 (0,19; 0,23)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы. Гистоморфологически миокард экспериментальных животных характеризовался межклеточным отеком, белковой дистрофией основной массы кардиомиоцитов наряду с неравномерной диффузно-очаговой гипертрофией части мышечных волокон и диффузным перимускулярным кардиосклерозом. Причем дистрофические и склеротические процессы в миокарде четвертой группы животных были выражены резче, чем в тканях животных третьей группы. Так же в ряде случаев, на четырнадцатые сутки, в строме были отмечены формирование диффузных лимфогистиоцитарных инфильтратов с примесью плазматических клеток, фибриноидное набухание периваскулярной стромы и признаки васкулитов и капилляритов. Структура молекулы гомоцистеина и продукта его аутоокисления – гомоцистеиновой кислоты имеет сходство с N-метил-D-аспартатом (NMDA). Описано наличие в кардиомиоцитах NMDA-рецепторов (Gill S., 2007). Исходя из этого, в основе токсического эффекта гомоцистеина на миокард лежит способность самого гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты активировать NMDA-рецепторы, создавая в клетках повышенный уровень ионов кальция и активных форм кислорода, что приводит к повреждению и гибели клеток. Окислительный стресс считается основным механизмом патогенного действия гомоцистеина. В нашей работе мы получили подтверждение этого: количество кардиомиоцитов уменьшилось, в тканях миокарда появились признаки воспаления, репаративные процессы снизились, развилась рабочая гипертрофия кардиомиоцитов.

12

При исследовании периферической крови отличия с данными интактных животных обнаружены у крыс четвертой группы (т.е. с гипергомоцистеинемией). Изменения заключаются в трехкратном снижении числа тромбоцитов, снижении количества эритроцитов и уровня гемоглобина, уменьшении относительного числа лимфоцитов и эозинофилов, повышении количества моноцитов и нейтрофилов (табл. 7). Таблица 7 Показатели периферической крови крыс (Ме (25-й; 75-й)) Показатель Гемоглобин (г/л) Эритроциты (×1012/л) Тромбоциты (×109/л) Лейкоциты (×109/л) Лимфоциты (%) Моноциты (%) Нейтрофилы (%) Эозинофилы (%) Базофилы (%)

2 группа 149 (144; 156) 7,8 (7,7; 8,1) 718 (627; 760) 7,45 (5,15; 9,75) 69,7 (66; 74,1) 5,4 (4,2; 6,6) 18,9 (16,9; 21,2) 7,4 (6,65; 8,15) 1 (0,95; 1,05)

4 группа 138* (136; 140) 6,99* (6,5; 7,1) 238* (200; 248) 6,45 (4,4; 8,7) 54,4* (43; 60,1) 12,1* (11,6; 16,7) 27,3* (25,6; 29,8) 1,65* (0,3; 2,2) 1,2 (0,9; 2,3)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями интактных крыс. Выявленные нами сдвиги в количественных показателях периферической крови согласуются с литературными данными, из которых известно, что при инкубации эритроцитов с гомоцистеиновой кислотой усиливается их гемолиз, вызываемый различными факторами (Арзуманян Е.С., 2008). На мембране эритроцитов обнаружен белок, реагирующий с антителами к NMDA-рецепторам. Этот протеин вызывает поступление кальция в эритроциты после их инкубации с Nметил-D-аспартатом (Болдырев А.А., 2009). Сказанное позволяет предположить, что данный белок является молекулярной мишенью токсического действия гомоцистеина, так как большая часть несвязанного с белками гомоцистеина в плазме крови подвергается окислению с образованием гомоцистеиновой кислоты.

NMDA-рецепторы имеются на мегакариоцитах (Болдырев А.А., 2009), исходя из этого можно предположить токсическое действие гомоцистеина на предшественники тромбоцитов в костном мозге. Зарегистрированная лимфоцитопения также может объясняться действием гомоцистеина на NMDA-рецепторы лимфоцитов (Владыченская Е.А., 2006; Машкина А.П., 2010), что вызывает вход ионов кальция в клетку с последующей индукцией апоптоза, а также рост содержания активных форм кислорода в цитоплазме и гибель клеток. Таким образом, в этой серии экспериментов получено подтверждение токсичного влияния гомоцистеина на кардиомиоциты, эритроциты, тромбоциты и лимфоциты, связанное с воздействием тиола на NMDA-рецепторы, экспрессируемые этими клетками.

13

Экспрессия тканевого фактора у экспериментальных животных У интактных крыс (первой группы) средний балл экспрессии тканевого фактора эндотелиоцитами соответствует 1 (10 – 25% окрашенных клеток), в то время как у животных с гипергомоцистеинемией (четвертой группы) – 2 баллам (25 – 50% окрашенных клеток). Интенсивность экспрессии тканевого фактора фибробластами у крыс обеих групп одинакова и соответствует 1 баллу. При оценке окрашивания нейтрофилов и фиброцитов в обеих группах получен отрицательный результат (менее 10% окрашенных клеток). Результаты исследования больных сердечно-сосудистой патологией Гомоцистеин и аутоантитела к модифицированному альбумину По результатам проведенного ИФА следует отметить наличие аутоантител к комплексу сывороточного альбумина человека с гомоцистеином в сыворотке крови и ротовой жидкости здоровых лиц, что указывает на сенсибилизацию организма к данному антигену в физиологических условиях (табл. 8). Известно, что сывороточный альбумин человека содержится в смешанной слюне в количестве 0,05 – 0,3 г/л (Rantonen P., 2000) и также комплексируется с гомоцистеином, приобретая иммуногенные свойства. Уровень аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином в сыворотке крови максимален у больных стабильной и прогрессирующей стенокардией. В то же время у таких больных отмечается минимальный уровень аутоантител в ротовой жидкости в сравнении с содержанием в группе контроля. У пациентов с острым инфарктом миокарда уровень аутоантител в сыворотке крови не отличался от значения контрольной группы (табл. 8), несмотря на высокую концентрацию гомоцистеина у этих больных (табл. 9), что можно объяснить наличием вторичного иммунодефицитного состояния на фоне данной патологии. Таблица 8 Содержание аутоантител к комплексу гомоцистеин-альбумин (ед. оп. пл.) (Ме (25-й; 75-й)) Группа Контрольная группа (n=12) Стабильная стенокардия (n=12) Прогрессирующая стенокардия (n=12) Острый инфаркт миокарда (n=10)

в сыворотке крови 0,026 (0,010; 0,038) 0,075* (0,000; 0,076) 0,066* (0,039; 0,111) 0,043 (0,026; 0,049)

в ротовой жидкости 0,014 (0,010; 0,057) 0,010 (0,000; 0,057) 0,012* (0,001; 0,020) 0,023* (0,007; 0,038)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы.

14

В сыворотке крови лиц контрольной группы и страдающих гипертонической болезнью уровень гомоцистеина находился в пределах нормы (табл. 9). У больных стабильной стенокардией концентрация гомоцистеина также не выходила за пределы верхней границы нормы (15 мкмоль/л), однако регистрировалось повышение этого показателя по сравнению с данными здоровых лиц. У пациентов с прогрессирующей стенокардией и острым инфарктом миокарда, как в момент поступления в стационар, так и по прошествии 7 суток лечения уровень гомоцистеина в сыворотке крови можно было расценивать как умеренную гипергомоцистеинемию. В ротовой жидкости, в связи с большим размахом значений концентрации гомоцистеина, значимых отличий среди показателей исследованных групп не выявлено. Таблица 9 Содержание гомоцистеина (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)) Группа Контрольная группа (n=12) Гипертоническая болезнь I – II ст. (n=22) Стабильная стенокардия (n=12) Прогрессирующая стенокардия (n=12) Острый инфаркт миокарда (n=10) Инфаркт миокарда 7 суток (n=10)

Сыворотка крови 5,99 (5,08; 7,88) 8,11 (7,08; 10,82) 10,21* (9,06; 12,01) 17,13* (12,28; 27,86) 24,91* (23,68; 28,45) 28,94* (27,27; 31,13)

Ротовая жидкость 0,23 (0,08; 0,28) 0,23 (0,15; 0,51) 0,37 (0,2; 0,45) 0,11 (0,04; 0,17) 0,26 (0,21; 0,3) 0,13 (0,1; 0,17)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с содержанием в группе контроля. Уровень ЦИК у исследованных лиц Содержание ЦИК средней и низкой молекулярной массы в сыворотке крови значимо возрастало у лиц со стабильной и прогрессирующей стенокардией (табл.

10), следует отметить, что в этих же группах отмечается максимальный уровень аутоантител (табл. 8). У пациентов с острым инфарктом миокарда концентрация ЦИК значимо ниже, чем в группе контроля, что можно объяснить активной элиминацией их путем фагоцитоза на фоне имеющегося при данной патологии нейтрофильного лейкоцитоза. Таблица 10 Уровень ЦИК в сыворотке крови (ед. оп. пл. OD450) (Ме (25-й; 75-й)) Группа

Контроль (n=12)

ГБ I ст. (n=10)

ГБ II ст. (n=12)

ИБС: ИБС: Острый Острый стабильная прогресс. инфаркт инфаркт стенокард. стенокард. миокарда миокарда (n=12) (n=12) (n=10) 7 суток 15

Средней молек. массы Низкой молек. массы

0,206 (0,112; 0,255) 0,236 (0,1; 0,267)

0,223 (0,144; 0,293) 0,209 (0,123; 0,273)

0,214 (0,147; 0,341) 0,151 (0,137; 0,283)

0,284* (0,197; 0,312) 0,275* (0,275; 0,383)

0,282* (0,169; 0,324) 0,174 (0,138; 0,266)

0,125* (0,075; 0,16) 0,1* (0,07; 0,11)

(n=10) 0,184 (0,113; 0,221) 0,118 (0,114; 0,18)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с уровнем в группе контроля. Метиониновый нагрузочный тест У здоровых лиц после проведения метиониновой нагрузки в сыворотке крови наблюдалось повышение уровня общего гомоцистеина на 60% от исходного. В смешанной слюне при этом, напротив, отмечалось снижение концентрации гомоцистеина на 30% (табл. 11). Таблица 11 Динамика уровня гомоцистеина (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)) Группа

Сыворотка

Ротовая жидкость

До нагрузки

После нагрузки

До нагрузки

После нагрузки

Контроль (n=10)

4,25 (3,33; 4,81)

6,95* (5,56; 8,89)

0,04 (0,01; 0,08)

0,03* (0,01; 0,03)

Гипертоническая болезнь (n=20)

5,96∆ (5; 6,7)

7,77 (5,56; 9,41)

0,92∆ (0,33; 2,42)

0,78*∆ (0,37; 1,22)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с уровнем до нагрузки; ∆ р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы. У пациентов с гипертонической болезнью исходный уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови выше на 50%, чем у лиц контрольной группы. В ротовой жидкости исходный уровень гомоцистеина у больных гипертонической болезнью более чем в 20 раз выше, чем у лиц контрольной группы. Этот факт позволяет предполагать, что один из возможных механизмов компенсации гипергомоцистеинемии может быть связан со «сбросом» избытка этого метаболита в различные секреты, в том числе в ротовую жидкость. После метионинового теста у гипертоников также отмечалось повышение уровня сывороточного гомоцистеина. В слюне, аналогично данным контрольной группы имело место снижение концентрации гомоцистеина на 20%, при этом его уровень, по прежнему, более чем в 20 раз превышал таковой у здоровых лиц. ВЫВОДЫ 16

1. Инкубация сывороточного альбумина с гомоцистеином in vitro сопровождается 2.

3.

4.

5.

6.

образованием комплекса, в котором 40% гомоцистеина конъюгирует с белком. У интактных крыс уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови остается в пределах нормальных значений как до, так и после введения высоких доз экзогенных аминотиолов на фоне увеличения титра аутоантител к модифицированному гомоцистеином альбумину. У животных с иммунодефицитом увеличивается как исходный уровень гомоцистеина, так и его содержание после введения экзогенных аминотиолов при отсутствии динамики со стороны аутоантител. На фоне высокой концентрации гомоцистеина отмечаются структурные нарушения миокарда, уменьшение количества клеток и форменных элементов периферической крови и увеличение экспрессии тканевого фактора эндотелиоцитами, но не фибробластами и нейтрофилами. Наличие аутоантител к комплексу гомоцистеина с альбумином у здоровых лиц свидетельствует о сенсибилизации данным антигеном при нормальных значениях гомоцистеина. У больных сердечно-сосудистой патологией наибольший уровень гомоцистеина в сыворотке крови зарегистрирован при остром инфаркте миокарда, аутоантител – при прогрессирующей стенокардии. У крыс с иммунодефицитом, в отличие от интактных, отмечается увеличение концентрации ЦИК средней и низкой молекулярной массы через 6 часов после введения гомоцистеина и снижение – спустя 9 суток. Среди больных сердечнососудистой патологией уровень ЦИК средней и низкой молекулярной массы наибольший при стабильной стенокардии. При проведении метионинового нагрузочного теста наблюдается повышение концентрации гомоцистеина в сыворотке крови и снижение – в ротовой жидкости через 4 часа после перорального приема метионина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в ведущих научных рецензируемых журналах, определенных ВАК Минобрнауки РФ (3 статьи): 1. Исследование уровня аутоантител к модифицированному сывороточному альбумину и тромбину [электронный ресурс] / С.В. Изместьев [и др.] // Забайкальский медицинский вестник. – 2012. - №2. – С. 112-115. – Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv 2. Аутоантитела к альбумину, модифицированному

гомоцистеином

в

эксперименте [электронный ресурс] / С.В. Изместьев [и др.] // Забайкальский медицинский вестник. – 2013. - №1. – С. 136-140. – Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv 17

3. Уровень гомоцистеина в крови и смешанной слюне после метиониновой нагрузки у больных гипертонической болезнью / С.В. Изместьев [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. – 2013. - №1. – С. 88-91. Публикации в прочих изданиях: 4. Изместьев С.В. Определение гомоцистеина и цистеина в слюне ВЭЖХ методом при проведении теста с метиониновой наргузкой / С.В. Изместьев, А.А. Дутов, Н.Н. Цыбиков // Тюменский медицинский журнал. – 2011. - №2. – С. 57-58.

5. Изместьев С.В. Исследование содержания гомоцистеина в слюне и сыворотке крови / С.В. Изместьев // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (сборник статей). – Барнаул, 2011. – С. 31-32.

6. Изместьев С.В. Исследование содержания гомоцистеина и цистеина в ротовой жидкости методом ВЭЖХ при проведении теста с метиониновой нагрузкой / С.В. Изместьев, А.А. Дутов, Н.Н. Цыбиков // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды III Всероссийской научно-практической конференцией с международным участием. – Новосибирск, 2011. – С. 106-109.

7. Эксперимент по конъюгированию гомоцистеина с человеческим сывороточным альбумином / С.В. Изместьев [и др.] // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Новосибирск, 2012. – С. 97-100.

8. Исследование уровня аутоантител к модифицированному сывороточному альбумину и тромбину у пациентов с сердечно-сосудистой патологией / С.В. Изместьев [и др.] // Материалы научно-практической конференции «I Съезд терапевтов Забайкальского края». – Чита, 2013. – С. 127-128.

9. Фефелова Е.В. Динамика уровня гомоцистеина, интерлейкина 2 и интерферона гамма у больных артериальной гипертензией в зависимости от тяжести заболевания / Е.В. Фефелова, С.В. Изместьев, Н.Н. Цыбиков // Материалы V Международной научно-практической конференции «Экология. Здоровье. Спорт».

– Чита, 2013. – С. 53-55.

10. Уровень гомоцистеина и аутоантител к модифицированному гомоцистеином сывороточному альбумину человека / Е.В. Фефелова, С.В. Изместьев [и др.] // Материалы V Международной научно-практической конференции «Экология. Здоровье. Спорт». – Чита, 2013. – С. 55-59.

11. Морфологические изменения миокарда на фоне действия гомоцистеина / Е.В. Фефелова, С.В. Изместьев [и др.] // Материалы Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием, посвященной 60-летию ЧГМА «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». – Чита, 2013. – С. 189-190.

12. Уровень циркулирующих иммунных комплексов у больных гипертонической болезнью / С.В. Изместьев [и др.] // Материалы Всероссийской научно18

практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию ЧГМА «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». – Чита, 2013. – С. 50-51. ВЭЖХ ГБ ИБС ИДС ИФА кДа ОЦК ПЭГ РПГА ЦИК NMDA IgG S-IgA

Список сокращений – высокоэффективная жидкостная хроматография – гипертоническая болезнь – ишемическая болезнь сердца – иммунодефицитное состояние – иммуноферментный анализ – килодальтон – объем циркулирующей крови – полиэтиленгликоль – реакция пассивной гемагглютинации – циркулирующий иммунный комплекс – N-метил-D-аспартат – иммуноглобулин класса G – секреторный иммуноглобулин класса А

19