На правах рукописи
Батаева Елена Петровна
РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ IL-4 (С589Т) И TNFα (G308А) В ПАТОГЕНЕЗЕ ОСТРОГО ПОСТСТРЕПТОКОККОВОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА И ПИЕЛОНЕФРИТОВ У ДЕТЕЙ
14.03.03 – патологическая физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
2
Чита – 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия Росздрава»
Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор
Витковский Юрий Антонович
Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор
Малежик Лидия Павловна
кандидат медицинских наук
Егорова Ольга Николаевна
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ», г. Красноярск
Защита состоится «09» ноября 2010 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия Росздрава» (672090, г. Чита, ул. Горького, 39-а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия Росздрава».
Автореферат разослан «06» октября 2010 г. Ученый секретарь
3
диссертационного совета, д.м.н., профессор Гаймоленко И.Н. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Большинство хронических заболеваний органов мочевой (ОМС) начинается в детском возрасте и отличается затяжным характером течения, сравнительно низкой эффективностью терапевтических мероприятий, достаточно высоким уровнем инвалидизации и смертности (Мухин Н.А., Козловская Л.В., Кутырина И.М. и др., 2003). В последние десятилетия отмечается увеличение встречаемости нефропатий в детской популяции: по эпидемиологическим данным в России в 70-80 годы их частота составляла 29 больных на 1000 детского населения, в 90-е годы возросла до 60:1000 детей и в экологически загрязненных регионах до 187:1000 детей (Игнатова М.С., 2003). В структуре детской заболеваемости по Забайкальскому краю в течение последних трех лет болезни мочевой системы занимают пятое место после органов дыхания, кожи, зрения, желудочно-кишечного тракта и инфекционных заболеваний. Одними из наиболее значимых для педиатрии и здравоохранения в целом являются постинфекционные поражения почечной ткани иммунной природы, поскольку, несмотря на благоприятный отдаленный прогноз, могут протекать тяжело и вызывать серьезные осложнения в остром периоде (Шишкин А.Н., 2005; Цыгин А.Н., 2003). Не менее важными являются микробновоспалительные заболевания почек, которые нередко, даже при адекватном и своевременном лечении приводят к их склерозированию, развитию артериальной гипертензии (АГ), почечной недостаточности и возможной гибели органа (Игнатова М.С., Коровина Н.А., 2007). Все накопленные знания по реакциям иммунной системы при почечной патологии теми или иными патогенами достаточно глубоки, но они часто меняются, так как равновесие между ними динамично и постоянно эволюционирует (Чеботарева В.Д., Багдасарова И.В., 2006; Хворостов И.Н., Смирнова И.Е., Зоркин С.Н., 2007; Абрамова Т.В., 2005). В течение последних лет в клиническую практику достаточно успешно внедрен тест лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА), характеризующий сдвиги в иммунной системе и гемостазе (Витковский Ю.А. и др., 1999-2010; Солпов А.В., 2002-2005; Кузник Б.И. и др., 2006, 2007, 2009). Однако у больных с нефропатиями изучение этого явления до настоящего времени не проводилось. Одним из современных подходов к предупреждению развития той или иной патологии является генетическое прогнозирование риска ее формирования. В последние годы открывается все больше факторов, свидетельствующих о генетической предрасположенности к развитию многих почечных заболеваний, что позволяет относить ряд нефропатий к мультифакториальной патологии, где неблагоприятные воздействия внешней среды проявляются только при наличии указанного предрасположения (Игнатова М.С., 1998-2008).
4
В современной педиатрической нефрологии пересматриваются представления о прогрессировании различных нефропатий, причем появились данные о том, что независимо от этиологии неблагоприятное течение связано с едиными механизмами, требующими дальнейшего изучения (Тотолян А.Н. и др., 2006; Паунова С.С., 2005; Басалаева М.С., 2007; Мукашева С.Б., 2007; Рябов С.И., Ракитянская И.А., Наджиб Ваза АбуАсба, 2008; Смирнов А.В., Есаян А.М., Каюков И.Г. и др., 2005; Suzuki Y., Gomez-Guerrero C., Shirato I. et al., 2003). В настоящее время известно, что в пределах каждой популяции у индивидуумов имеются наследственные вариации в последовательности ДНК, называемые полиморфизмами, которые встречаются в человеческом геноме с частотой 1 на 1000 пар оснований (Pui-Van Kwok., 2003). Несмотря на столь высокую распространенность, лишь небольшая из них является функционально значимой, т.е. приводит к изменению продукции белков, в частности цитокинов, тем самым, определяя индивидуальный ответ организма на повреждающие факторы (Гинтер Е.К., 2003). Предполагается, что полиморфизм генов цитокинов может влиять на интенсивность воспалительного процесса и скорость развития фиброза у больных. (Абдуллаев С.М., 2007, Рязанцева Н.В., Наследникова И.О., Коненков В.И., 2007). В последние годы появились работы, посвященные изучению генетических мутаций, изменению иммунного статуса, гемостаза у больных при хронических пиелонефритах, люпус-нефритах, наследственных нефропатиях, нефротическом синдроме и др. (Смольникова В.Ф., Прокофьев В.Ф., Сизякина Л.П. и др., 2002; Петросян Э.К., Цыгин А.Н., Шестаков А.Е., 2006; Аллахвердиева Л.И., Эюбова А.А., 2007; Наследникова И.О., 2009; Bahr M.J., Menuawy М., Boeker К.Н. et al., 2003; Robson M.G., Cook H.T., Pusey C.D. et al., 2003). Однако сведения о полиморфизме сигнальных молекул – цитокинов при заболеваниях почек у детей весьма скудны. Исследования в этом направлении могут обеспечить хорошие ресурсы для анализа мутаций в ассоциированных исследованиях, углубить представления об иммунном звене патогенеза и разработать новые эффективные методы прогнозирования течения болезней почек у детей. Целью исследования явилось выяснение роли аллельных вариантов IL4 (C589T) и TNFα (G308A) в иммунологическом звене патогенеза острого постстрептококкового гломерулонефрита и пиелонефритов у детей. Задачи исследования: 1. Определить частоту встречаемости полиморфизма генов IL-4 и TNFα среди здоровых детей и детей при первичном и вторичном пиелонефритах, остром постстрептококковом гломерулонефрите. 2. Исследовать лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию, концентрацию цитокинов (IL-1β, IL-8, IFNγ, TNFα, IL-4), иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, содержание лизосомальных катионных
5
белков (ЛКБ) нейтрофилов у детей при пиелонефритах в периодах разгара и ремиссии и остром гломерулонефрите – в фазах активных проявлений и обратного развития. 3. Оценить клинические особенности течения пиелонефритов и острого гломерулонефрита у носителей полиморфизмов IL-4 и TNFα. 4. Сравнить лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию, содержание цитокинов (IL-1β, IL-8, IFNγ, TNFα, IL-4), иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, показатель СЦК (средний цитохимический коэффициент) у больных пиелонефритами и острым гломерулонефритом, имеющих различные аллельные варианты TNFα, IL-4. Научная новизна. Впервые установлена распространенность аллельных вариантов генов IL-4 (C589T) и TNFα (G308A) среди здоровых детей, проживающих в Забайкалье. При пиелонефритах у детей их встречаемость выше по сравнению со здоровыми. Полиморфизм С589Т гена IL-4 (генотипы С/Т и Т/Т) способствует высокому риску возникновения осложнений при ОПГН. Присутствие мутации G308А гена TNFα (генотип А/A) предрасполагает к развитию нефросклероза при обструктивном пиелонефрите у детей. Впервые установлено, что при пиелонефритах и остром постстрептококковом гломерулонефрите у детей, повышается лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия. У больных при ОПГН, отягощенных мутацией С589Т гена IL-4 процентное содержание лимфоцитарнотромбоцитарных коагрегатов уменьшается. Показатель ЛТА обратно коррелирует с тяжестью течения ОПГН. Повышение уровня ЛТА имеет положительную связь с выраженностью клинических проявлений при пиелонефритах необструктивного генеза. Впервые обнаружено, что полиморфизм С589Т гена IL-4 сопровождается более низкой концентрацией иммуноглобулинов субклассов G1 и G2 при ОПГН и субкласса G1 в начале лечения при пиелонефритах. У больных ОПГН, имеющих в генотипе полиморфизм С589Т гена IL-4, уровень IL-4, IL8 ниже, а содержание ЛКБ нейтрофилов выше по сравнению с детьми, не обладающими данной мутацией. Присутствие аллельного варианта С589Т гена IL-4 у пациентов с пиелонефритами сопровождается более низкими значениями концентрации IL-8 в начале заболевания. Теоретическая и практическая значимость. В результате исследования получены новые данные о патогенезе острого постстрептококкового гломерулонефрита и пиелонефритов у детей, отражающие роль полиморфизмов IL-4 (C589T) и TNFα (G308A) в развитии иммунных реакций. Носительство аллелей IL-4 (C589T) и TNFα (G308A) влияет на содержание цитокинов, иммуноглобулинов, лизосомальных катионных
6
белков нейтрофилов, лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию в зависимости от нозологической формы, периода и тяжести течения болезни почек у детей. Выявленные факты позволяют оценить риск заболевания острым постстрептококковым гломерулонефритом и пиелонефритами у детей и разработать новые методы прогнозирования течения этих заболеваний. Полученные сведения о наличии полиморфизмов IL-4 (C589T) и TNFα (G308A) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими полиморфизмами использоваться для оценки риска развития почечной патологии у детей. Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Здоровый ребенок» (Чита, 2007); на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (Чита, 2008), посвященной 55летию Читинской государственной медицинской академии; на научнопрактической конференции «Здоровый ребенок», посвященной 55-летнему юбилею КДКБ (Чита, 2009); на XXΙ Международном конгрессе «International Society on Thrombosis and Haemostasis» (Женева, 2007). Внедрение результатов исследования. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной физиологии, патологической физиологии, пропедевтики детских болезней ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия, а также в лечебный процесс отделения нефрологии Краевой детской клинической больницы № 1 г. Читы. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в т.ч. 1 статья в издании, определенном Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, включающего 227 работ, из них – 172 отечественных и 55 зарубежных авторов, иллюстрирована 23 таблицами. Положения, выносимые на защиту: 1. У детей с патологией почек изменения показателей иммунитета зависят от нозологической формы заболевания и типа мутаций. У больных при ОПГН, отягощенных мутацией С589Т гена IL-4 процентное содержание лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов ниже, чем без таковой. Функция ЛТА обратно коррелирует с тяжестью течения ОПГН. При первичных пиелонефритах ЛТА повышается соответственно тяжести заболевания. Полиморфизм С589Т гена IL-4 сопровождается более низкой концентрацией иммуноглобулинов субклассов G1 и G2 при ОПГН и субкласса G1 в начале заболевания при пиелонефритах. У больных ОПГН, имеющих в генотипе полиморфизм С589Т гена IL-4, уровень IL-4, IL-8 ниже, а содержание ЛКБ нейтрофилов выше по сравнению с детьми, не обладающими данной
7
мутацией. Присутствие аллельного варианта С589Т гена IL-4 у пациентов с пиелонефритами сопровождается более низкими значениями концентрации IL-8 в периоде разгара. 2. Полиморфизм С589Т гена IL-4 (генотипы С/Т и Т/Т) способствует высокому риску возникновения осложнений при ОПГН. Присутствие мутации G308А гена TNFα (генотип А/A) предрасполагает к развитию нефросклероза при обструктивном пиелонефрите у детей. Среди здоровых детей, проживающих в Забайкалье, вариант С589Т полиморфизма гена IL-4 выявляется чаще, чем вариант G308А гена TNFα. При пиелонефритах у детей гетерозиготная форма носительства мутантного гена IL-4 выше по сравнению со здоровыми. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.). Клиническая часть работы выполнена на базе Краевой Детской Клинической больницы отделения нефрологии (главный врач Комаров В.В.) г. Читы за период с 2006 по 2008 годы. Обследовано 60 детей обоего пола в возрасте от 1 до 14 лет, из них 24 ребенка с острым постстрептококковым гломерулонефритом (13 мальчиков и 11 девочек) и 36 детей с первичными и вторичными пиелонефритами (29 девочек и 7 мальчиков). Для диагностики заболеваний использовались стандартные клинические и лабораторные критерии. Первый забор материала для оценки показателей иммунитета осуществлялся в первые двое суток от момента госпитализации, что соответствовало периоду активных проявлений для ОПГН и разгара – для ПН. Второе исследование крови происходило в период завершения стационарного лечения, когда интенсивность клинических проявлений снижалась и отмечалась нормализация или улучшение лабораторных показателей (период обратного развития для ОПГН и ремиссии – для ПН). Контрольную группу составили 100 здоровых детей обоего пола от 1 года до 14 лет, из них 30 человек обследованы для определения иммунологических показателей крови и 70 человек – для исследования генетических маркеров. Для сравнительной характеристики исследуемых признаков в зависимости от тяжести заболевания, мы провели оценку состояния детей при пиелонефритах и остром гломерулонефрите, разработав клинические индексы (КИ), которые тем выше, чем тяжесть состояния больше. В основу бальной оценки легла выраженность следующих признаков в зависимости от нозологической формы: артериальная гипертензия, отеки, мочевой, интоксикационный, болевой синдромы и степень нарушения почечных функций (табл. 1, 2).
8
В зависимости от наличия или отсутствия полиморфизмов генов IL-4 (С589Т) и TNFα (G308А), все больные были разделены на группы: Ι группа − дети с ОПГН (n=24): Ιа (n=16) – с отсутствием аномальных генов; Ιв (n=7) − с полиморфизмом С589Т гена IL-4, из них 3 гомозиготных варианта; Ιс (n=1) – с полиморфизмом G308А гена TNFα. ΙΙ группа – дети с пиелонефритами (n=36), из них n=20 – с необструктивными ПН, n=16 – с обструктивными ПН: ΙΙа подгруппа (n=11) – с отсутствием аномальных генов; ΙΙв подгруппа (n=20) – с полиморфизмом С589Т гена IL-4, в т.ч. 1 гомозигота; ΙΙс подгруппа (n=7) – с полиморфизмом G308А гена TNFα, из них 2 гомозиготных варианта и 2 – с сочетанием полиморфизмов генов IL-4 и TNFα. Таблица 1 Ренальные и экстраренальные проявления ОПГН у детей Признак 0 баллов 1 балл 2 балла Отеки Отсутствуют Умеренно Выраженные, до выраженные анасарки Артериальная Отсутствует Умеренная (от Выраженная (свыше гипертензия 120до150мм.рт.ст.) 150 мм.рт.ст.) Лихорадка Отсутствует Повышение Повышение температуры до температуры от 38°С 38°С до 39,5°С Мочевой Невыраженная Умеренно выра- Выраженный (макросиндром эритроцитурия женный (геммату- гематурия, умерен– до 20 эр./сут., рия от 20 – до 100 ные протеинурия, протеинурия до эр./сут., протеину- цилиндрурия) 1 г/сут.) инурия до 2г/сут., цилиндрурия) Болевой Отсутствует Умеренный Выраженный Нарушение почечных функций
Отсутствует
Порционные или комбинированные нарушения
Синдром ОПН
Таблица 2 Ренальные и экстраренальные проявления пиелонефритов у детей Признак Интоксикация
0 баллов Отсутствует
1 балл Умеренно выраженная
2 балла Выраженная
9
Лихорадка Отсутствует До 38,5°С Болевой синдром Отсутствует Умеренный Мочевой Небольшая лей- Умеренные просиндром коцитурия – до теинурия – от 30 20-30 в п/зр.) до 100 в п/зр., бактериурия, незначительная протеинурия) Дизурический Отсутствует Умеренный Нарушение почечных функций
Отсутствует
Порционные нарушения
От 38,5°С до 40°С Выраженный Выраженный (пиурия, эритроцитурия, цилиндрурия) Выраженный Комбинированные нарушения
В клинической группе исследовались показатели: ЛТА, ЛИИ (лейкоцитарный индекс интоксикации), содержание прои противовоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-4, IL-8, IFNγ и TNFα), иммуноглобулинов (А, М, G с подклассами G1, G2, G3, G4), уровень лизосомальных катионных белков нейтрофилов, наличие полиморфных аллелей С589Т в гене IL-4 и G308А в гене TNFα. Определение показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, относящегося к функциональным тестам оценки иммунокомпетенных клеток, проводили по методу, предложенному Ю.А. Витковским и соавт. (1999). Подсчет ЛИИ осуществлялся по формуле, предложенной Т.П. Бондарь (2003): ЛИИ= GRA· WBC/(LYM + MON) · 10, где GRA – гранулоциты, WBC – общее количество лейкоцитов, LYM – лимфоциты, MON – моноциты. Измерение уровня цитокинов и иммуноглобулинов проводили методом твердофазного ИФА с помощью двойных антител с применением наборов реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Исследование уровня ЛКБ нейтрофилов осуществлялось с помощью лизосомально-катионного теста (Меньшиков В.В., 1992). Полиморфизм генов изучался методом высокоочищенной ПЦР с помощью реактивов фирмы «Литекс» (Москва). Детекцию амплификатов осуществляли с помощью электрофореза в 3% агарозном геле (Иллариошкин С.Н., 2004). Статистическая обработка полученных данных осуществлена при помощи электронной программы (Microsoft Office 2003 for Windows XP Professional). Различия между двумя средними значениями при нормальном распределении признака и большой выборке оценивали по критерию Стьюдента. Для оценки непараметрических не связанных между собой показателей использовали критерий Манна-Уитни, связанных – критерий Уилкоксона. При расчете корреляционных связей использовали коэффициент Пирсона. Соответствие наблюдаемых распределений частот генотипов
10
теоретически ожидаемым по уравнению Харди-Вайнберга оценивали с использованием критерия χ2. Различия сравниваемых показателей считали достоверными при p<0,05. Для оценки ассоциаций рассчитывали относительный риск ОR по формуле ОR=аd/bc. Где а – число лиц с наличием анализируемого маркера среди больных, b – его отсутствие; с и d – число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера в контрольной группе. Величина ОR = 1 указывает на отсутствие ассоциации, ОR>1 – свидетельствует о положительной ассоциации (фактор риска) и ОR<1 – указывает на отрицательную ассоциацию аллеля с генотипом, расценивается как фактор устойчивости (Зайцев В.М., 2006). РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Частота встречаемости мутантных аллелей С589Т в гене IL-4 и G308А в гене TNFα Молекулярно-генетические исследования показали, что среди обследованных здоровых детей гетерозиготное (C/Т) носительство IL-4 (С589Т) встречается у 30,3% и гомозиготное (Т/Т) – у 6% детей. Частота встречаемости полиморфизма TNFα (G308А) среди здоровых детей составила 20% – все они явились носителями гетерозиготного варианта (табл. 3). Половых и возрастных различий в распределении частот и генотипов среди детей отмечено не было. Таблица 3 Распространенность полиморфизмов генов IL-4 (С589Т) и TNFα (G308А) среди здоровых детей и больных с почечной патологией Полиморфизм Контроль (n=66) ОПГН (n=24) ПН (n=36) Ген IL-4 генотип С/Т Ген IL-4 генотип Т/Т Ген TNFα генотип G/A Ген TNFα генотип А/A Сочетанная мутация
абс.ч. 20 4 14 0 6
% 30,3 6,06 20 8,8
абс.ч. 4 3 1 0 0
% 16,6 12,5 4,1 -
абс.ч. 19 1 5 2 2
% 52,7 2,7 13,8 5,5 5,5
Нами обнаружено, что больше половины больных, страдающих ПН явились носителями варианта С/Т полиморфного участка С589Т гена IL-4 (табл. 4). Так 19 из 36 детей (52,7%) оказались гетерозиготами по данному аллелю, в 1 случае встретился гомозиготный вариант (2,7%). Основной процент носителей аллельных вариантов С589Т гена IL-4 (65% − 13 человек из 20) в данной группе пришелся на первичные пиелонефриты. У детей, имеющих какие-либо уродинамические нарушения врожденного характера, повлекшие за собой наслоение инфекционного процесса, процент встречаемости полиморфных генов оказался значительно ниже (35%). Расчет отношения шансов (OR) выявил положительную ассоциацию аллеля Т и
11
генотипа С/Т с ПН, что указывает на повышенный риск развития данной патологии у детей, имеющих полиморфизм С589Т в гене IL-4. Таблица 4 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С589Т гена IL-4 у больных с пиелонефритами в сравнении с контрольной группой Генетический Контроль (n=66) Больные ПН р OR маркер (n=36) Аллель С 0,79 0,68 >0,05 0,28 Аллель Т 0,21 0,32 <0,05 2,15 Генотип С/С 0,64 0,30 >0,05 0,26 Генотип С/Т 0,30 0,55 <0,05 2,54 Сочетанная 0,06 0 >0,05 0,2 мутация Примечание: р - значимость различий по отношению к группе контроля
У 5 больных ПН (13,9%) наблюдалось гетерозиготное, а у 2 детей (5,55%) – гомозиготное носительство полиморфизма G308А гена TNFα. Среди гетерозигот 2 ребенка имели сочетанный полиморфизм генов IL-4 и TNFα. Только 11 пациентов (30,5%), страдающих микробновоспалительными заболеваниями почек, не имели диагностированных мутаций (табл. 5). Несмотря на преобладающее количество детей женского пола среди исследуемых пациентов, носителями сочетанных полиморфизмов в указанных генах явились 2 мальчика. Таблица 5 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G308А гена TNFα у больных с пиелонефритами в сравнении с контрольной группой Генетический маркер Аллель G Аллель A Генотип G/G Генотип G/А Генотип А/А
Контрольная группа (n=70) 0,9 0,1 0,8 0,2 0
Больные ПН (n=36) 0,12 0,87 0,8 0,13 0,05
р >0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,05
Примечание: р - значимость различий по отношению к группе контроля
OR 0,77 1,28 0,9 0,64 10,2
12
В группе больных ОПГН мутация С589Т гена IL-4 обнаружилась в 7 случаях (29%), из них 4 ребенка (16,6%) имели гетерозиготный полиморфизм и 3 (12,5%) – гомозиготный (табл. 6). Таблица 6 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С589Т гена IL-4 у больных с острым постстрептококковым гломерулонефритом в сравнении с контрольной группой Генетический маркер Аллель С Аллель Т Генотип С/С Генотип С/Т Генотип Т/Т
Контроль (n=66) 0,79 0,21 0,64 0,3 0,06
Больные ОПГН (n=23) 0,79 0,21 0,71 0,17 0,12
р
OR
>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05
1,02 0,07 1,39 0,46 2,21
Примечание: р - значимость различий по отношению к группе контроля
По этническому признаку выявлено, что гетерозиготные мутации встречались у 3 русских и 1 бурята, а гомозиготные − у 2 бурят и 1 русского. Всего из пациентов с гломерулонефритами 29,1% оказались бурятами, а среди носителей полиморфизма – 42,8%. По половому признаку существенных различий отмечено не было: среди детей, имеющих мутации, оказались 4 мальчика и 3 девочки. Один ребенок с ОПГН явился носителем гетерозиготной мутации G308А в гене TNFα. Состояние клеточного и гуморального иммунитета у детей при патологии почек, имеющих аллели С589Т в гене IL-4 и G308А в гене TNFα У большинства исследуемых пациентов выявлялась повышенная способность лимфоцитов образовывать коагрегаты с тромбоцитами. Так, показатель лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии возрастал до 18,7±0,9% при пиелонефритах (р<0,005) и до 21,4±1,25% при острых гломерулонефритах (р<0,001), в то время как у здоровых детей он составил 14±0,9%. Одновременно у больных нарастало и абсолютное содержание адгезированных лимфоцитов. В группе больных первичными ПН отмечалась положительная корреляционная зависимость между ЛТА и степенью тяжести патологического процесса (r=0,66, р<0,005). Установлена прямая корреляционная связь средней силы между процентным содержанием коагрегатов и уровнем IL-1β в начале заболевания у детей при ОПГН (r=0,47, р<0,006). и обратная связь средней силы между выраженностью клинических проявлений и процентным содержанием коагрегатов (r=-0,44, р<0,05).
13
Обнаружено понижение процентного уровня ЛТА в группе Ιв (с ОПГН и полиморфизмом С589Т гена IL-4) в сравнении с контролем (р<0,05) (рис. 1). Абсолютное содержание общих и адгезированных лимфоцитов не имело значимых различий в сравниваемых группах, что напрямую связано с некоторой разницей в степени лейкоцитоза и абсолютным количеством лимфоцитов у детей в зависимости от возраста. 30 ЛТА (%) 25 20
* * *
15 10 5 0 ОПГН (n=24)
ПН (n=36)
Контроль (n=30) Без мутаций Мутация гена IL-4 (С589Т) Мутация TNFα (G308A)
Рис. 1. Уровень ЛТА у детей при ОПГН и ПН в начале исследования, отягощенных и неотягощенных полиморфизмами генов IL-4 (С589Т) и TNFα (G308А). Примечание: * − значимость различий по отношению к группе контроля, ** − значимость различий по отношению к группе, не имеющей мутацию гена IL4. Установлено, что при ОПГН больные имели повышенный ЛИИ более, чем в 2,5 раза (р<0,005), что свидетельствовало о наличии умеренного воспалительного процесса в организме и отражало легкую степень эндотоксикоза. При пиелонефритах наблюдалось увеличение показателя в 4 раза в сравнении с таковым здоровых детей (р<0,001). Это отражало выраженную воспалительную реакцию и тяжелую степень эндотоксикоза. Зависимости ЛИИ от наличия и вида исследуемых полиморфизмов не установлено. Оценивая показатели цитокинов при ОПГН, мы обнаружили, что синтез большинства из них в период активных проявлений оказался повышен: так наблюдались высокие концентрации IL-4, IL-8 и TNFα. Уровень IFN-γ оказался ниже нормального, а IL-1β не отличался от контроля. В период обратного развития отмечалась нормализация содержания TNFα, снижение уровня IL-8 и повышение противовоспалительного IL-4. Значения показателей IL-1β и IFN-γ оставались на прежних цифрах. Среднее увеличение концентрации IL-4 происходило за счет детей, не имеющих изучаемых полиморфизмов, р<0,05 (рис. 2).
14
Цитокины пкг/мл
Изменений в концентрации IL-1β при ОПГН относительно группы контроля и в зависимости от наличия полиморфизма не отмечено. Обнаружен одинаково низкий уровень IFNγ у всех детей с острым гломерулонефритом в периодах активных проявлений и обратного развития (р<0,001), что вероятно, связано с ингибирующим влиянием противовоспалительного IL-4 на функцию Т-хелперов 1 клона, принимающих участие в синтезе интерферона (рис. 2). Повышение содержания TNFα в 2 раза в период активных проявлений (р<0,001) и последующая его нормализация при ОПГН в сравниваемых группах отразило протекание активных иммунопатогенетических механизмов, происходящих в гломерулах. У носителей полиморфного гена IL-4 (С589Т) при ОПГН и пиелонефритах периоде активных проявлений концентрация IL-8 оказалась ниже относительно групп без присутствия мутаций (р<0,05). Вероятно, более высокие значения IL-8 у детей, не имеющих мутацию С589Т гена IL-4, являются критериями адекватного иммунного ответа в условиях атаки токсинами и иммунными комплексами в сравнении с больными, имеющими мутантный аллель (рис. 2,3). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
* *
*
* **
**
* IL-4
IL-8
Контроль (n=30)
IL-1β
Без мутаций (n=16)
IFN-γ
* TNF-α
Мутация гена IL-4(С589Т) (n=7)
Рис. 2. Содержание цитокинов у детей при ОПГН в начале исследования в зависимости от наличия мутации гена IL-4. Примечание: * − значимость различий по отношению к группе контроля; ** − значимость различий по отношению к группе, не имеющей полиморфизма. При пиелонефритах выявлено повышение концентрации IFN-γ внутри сравниваемых групп, что явилось необходимым условием активации клеточного иммунитета и частично обеспечило пирогенный эффект (рис. 3). Наблюдалось увеличение содержания IL-1β у всех пациентов с бактериальным воспалением почек в периоде активных проявлений в 1,5 раза, однако в группе больных, носителей полиморфизма G308А гена TNFα высокие концентрации интерлейкина сохранялись и на момент выписки
15
(р<0,05). Это могло продлить воспалительную реакцию в организме, и не исключало риск развития склеротических процессов (рис.3). Выявлена высокая (более, чем в 2 раза) концентрация TNFα у всех детей при пиелонефритах в периоде активных проявлений (р<0,001), которая не имела различий в зависимости от наличия и типа мутаций.
Цитокины пкг/мл
140 120
**
100 80 60
* *
40
*
*
**
*
* *
*
*
*
*
*
20 0 IL-4
IL-8
IL-1β
IFN-γ
TNF-α
Контроль (n=30)
Без мутаций (n=11)
Мутация в гене IL-4 (C589Т)
Мутация в гене TNF-α (n=7)
Рис. 3. Уровень цитокинов у детей при пиелонефритах в начале исследования в зависимости от наличия мутаций генов IL-4 (С589Т) и TNFα (G308A). Примечание: * − достоверность в сравнении с контролем, ** − достоверность в сравнении с группой, не имеющей мутации В результате исследований выявились отчетливые различия в содержании подклассов IgG, являющихся главными эффекторами гуморального иммунитета, так как составляют 75% от общего количества антител и осуществляют борьбу с патологическим процессом на протяжении всего периода заболевания (Офицеров В.И., 2005). Установлено, что содержание IgG1 у больных с ОПГН ниже в сравнении с контрольной группой (р<0,005). Уровень IgG3 коррелировал со степенью нарушения почечных функций и выраженностью клинических синдромов – самые низкие показатели отмечались у больных, имеющих только мочевой синдром и отсутствие нарушения почечных функций, что подтвердилось прямой связью средней силы (r=0,53, р<0,04).. Концентрация IgG1 в группе Ιа отличалась от нормальных показателей менее значимо в периоде активных проявлений, а в периоде обратного развития показатель вернулся к нормальному значению (рис. 4). В группе Ιв отмечено понижение исследуемого показателя почти в два раза в сравнении с группой Ιа (р<0,005). Отчасти, это связано с более низкими значениями активатора гуморального иммунитета – IL-4 у таких больных. Уровень IgG2 оказался пониженным в группе ΙΙв (р<0,005) (рис. 4). Концентрация IgG3 у больных при ОПГН повышалась в 3 раза в сравнении с контролем, р<0,001. Влияния генотипов С/Т и Т/Т
16
полиморфного IL-4 на уровень IgG3 при ОПГН не выявлено. Содержание IgG4 в начале заболевания в исследуемых группах Ιа и Ιв оказалось выше нормальнго (р<0,05). Уровень IgА повышался в периоде активных проявлений в группе детей с ОПГН независимо от наличия полиморфных аллелей (р<0,05). Показатель IgМ у больных острым гломерулонефритом не отличался от такового контрольной группы. Сравнительная количественная оценка его между больными Ιа и Ιв не выявила значимых особенностей. Как наиболее ранний, вероятно, его синтез активируется в латентный период, когда клинические проявления заболевания отсутствуют. 8 7 IgG мг/мл
6 5
*
4
* **
3 2
**
1
*
*
0 IgG1 Контроль (n=30)
IgG2 Без мутаций (n=16)
IgG3 Мутация гена IL-4(С589Т) (n=7)
Рис.4. Содержание подклассов IgG в начале исследования в зависимости от наличия мутации гена IL-4 у детей при ОПГН. Примечание: * − значимость различий по отношению к группе контроля, ** − значимость различий по отношению к группе, не имеющей мутацию гена IL-4. В группе детей с пиелонефритами содержание IgG1 также оказалось значимо ниже контрольных показателей (р<0,05), более выраженных у больных, носителей мутантного гена IL-4. У больных с первичными ПН уровень IgG1 находился в обратной зависимости от степени тяжести состояния (r=-0,53, р<0,03). Больные, имеющие полиморфизм G/А в положении 308 гена TNFα отличались низкими показателями IgG1 в сравнении с контрольной группой, но не имели различий в его содержании относительно остальных сравниваемых групп. Концентрация IgG2 у детей с пиелонефритом оказалась существенно ниже нормы независимо от присутствия и типа мутации (р<0,001). Уровень IgG3 у больных ПН не отличался от контрольных значений, что, возможно, также помогало уменьшить создавшийся дефицит гуморального звена за счет субклассов IgG1 и IgG2 (рис. 5). При пиелонефритах изменений в содержании IgG4 за период наблюдения выявлено не было, как относительно группы контроля, так и между собой.
17
Количественных отличий в уровне IgA между сравниваемыми группами у детей с ПН не найдено. Содержание IgМ у детей при пиелонефритах наблюдалось одинаково повышенным во всех исследуемых группах (р<0,005). 8 7
IgG мг/мл
6 5 4
*
3
**
*
2
*
*
*
1
*
*
0 IgG1 Контроль (n=30)
IgG2 Без мутаций
Мутация гена IL-4 (С589Т)
IgG3 Мутация TNFα (G308A)
Рис. 5. Содержание подклассов IgG в зависимости от наличия мутации гена IL-4 у детей при пиелонефритах в начале исследования. Примечание: * − значимость различий по отношению к группе контроля; ** − значимость различий по отношению к группе, не имеющей мутацию гена IL-4. Установлено, что при остром постстрептококковом гломерулонефрите содержание ЛКБ нейтрофилов снижалось в начале лечения (р<0,05). При этом наблюдалась обратная корреляционная зависимость средней силы между степенью клинико-лабораторных проявлений (КИ) и уровнем СЦК (r=0,54, р<0,05). Содержание ЛКБ в Ιв группе не отличалось от нормального, что определило влияние мутации гена IL-4 на активацию фагоцитарных реакций у детей с постинфекционным воспалением почечных клубочков в условиях дефицита иммуноглобулинов-стимуляторов фагоцитоза (рис. 6). К концу госпитализации в исследуемых группах показатель заметно нарастал в сравнении с началом заболевания (р<0,05). При пиелонефритах показатель ЛКБ нейтрофилов также оказался ниже в сравнении с контрольной группой. Отмечена обратная корреляционная зависимость средней силы между уровнем IL-1β и величиной СЦК нейтрофилов при обструктивных пиелонефритах (r=-0,63, р<0,02). К концу наблюдения у больных вторичными пиелонефритами, имеющих аллель G308А в гене TNFα отмечалась тенденция к снижению содержания лизосомально-катионных белков, что определило вероятность роли данного полиморфизма в хронизации воспаления при условии недостаточной элиминации возбудителя.
18
Снижение готовности нейтрофилов к фагоцитозу у больных с почечной патологией на фоне низких показателей иммуноглобулинов G1,G2 и повышенного уровня IL-8, IL-1β, вероятно, связано с развитием у больных «феномена лейкоцитарной депрессии» (Витковский Ю.А., 1999). 1,6 1,4 1,2 СЦК
1 0,8
*
**
*
*
0,6 0,4 0,2 0 ОПГН Контроль (n=30)
Перв ПН (n=20) Без мутаций
Мутация IL-4
Втор ПН (n=16) Мутация TNFα
Рис. 6. Уровень лизосомально-катионных белков у детей при ОПГН и первичных и вторичных пиелонефритах в зависимости от наличия полиморфизмов генов IL-4 и TNFα в начале исследования. Примечание: * − значимость различий по отношению к группе контроля, ** − значимость различий по отношению к группе, не имеющей мутацию гена IL-4. Таким образом, выявленные особенности в иммунологических реакциях у больных с указанной почечной патологией, отягощенных мутациями в гена IL-4 (С589Т) и TNFα (G308A), определяет их прямое влияние на индивидуальные реакции в процессе развития иммунного ответа. Обратимость большинства показателей клеточного и гуморального иммунитета при острой почечной патологии позволяет определить более тонкий подход к уместности и характеру иммуномодулирующей терапии. Особенности клинического течения пиелонефритов и ОПГН у детей, отягощенных мутациями С589Т в гене IL-4 и G308А в гене TNFα При оценке клинического течения гломерулонефрита, выяснилось, что у всех детей с гетерозиготным полиморфизмом С589Т в гене IL-4 отмечались комбинированные нарушения почечных функций (фильтрационной, водовыделительной, концентрационной), сопровождающиеся отеками различной степени выраженности, артериальной гипертензией во всех случаях. Все дети, имеющие гомозиготные варианты гена цитокина имели клинические и лабораторные проявления почечной недостаточности острого периода, а у одного ребенка наблюдались клинические и рентгенологические критерии отека легкого. Анализ тяжести состояния больных ОПГН, проводимый с помощью разработанных клинических индексов показал, что у детей Ιв группы КИ повышался относительно группы Ιа, р=0,046.
19
При анализе шкалы клинического состояния больных пиелонефритами, выявлено, что у детей групп ΙΙв и ΙΙс КИ статистически не отличались от контроля и группы ΙΙа (р=0,4). У двоих пациентов-носителей аллельного варианта G308A (генотип А/А), страдающих пиелонефритами, осложнивших пузырно-мочеточниковый рефлюкс и мочекаменную болезнь, в достаточно короткие сроки был диагностирован нефросклероз с явлениями хронической почечной недостаточности, несмотря на адекватные и своевременные диагностику и терапию. Таким образом, обнаружено неблагоприятное влияние полиморфизма IL-4 (С589Т) (генотипа С/Т и Т/Т) на течение острого постстрептококкового гломерулонефрита и вероятность влияния генотипа А/А полиморфного TNFα на скорость развития склеротических осложнений при пиелонефритах обструктивного генеза. ВЫВОДЫ 1. Среди здоровых детей, проживающих в Забайкалье, вариант С589Т полиморфизма гена IL-4 выявляется чаще, чем вариант G308А гена TNFα. При первичном пиелонефрите и при остром постстрептококковом гломерулонефрите у детей их встречаемость выше по сравнению со здоровыми. 2. Полиморфизм С589Т гена IL-4 (генотипы С/Т и Т/Т) способствует высокому риску возникновения осложнений при ОПГН (нарушениям фильтрационной, водовыделительной, концентрационной функций почек, артериальной гипертензии). Присутствие мутации G308А гена TNFα (генотип А/A) предрасполагает к развитию нефросклероза при обструктивном пиелонефрите у детей. 3. В начале госпитального периода у больных ОПГН увеличиваются показатели ЛТА, концентрации IL-4, IL-8, TNFα, IgA, IgG3, и одновременно уменьшается содержание лизосомальных катионных белков в нейтрофилах и падает уровень IgG1 и IFNγ. К концу этого периода значения ЛТА, СЦК, TNFα и IgA нормализуются, IL-4, IL-8 и IgG3 остаются повышенными, а IgG1 и IFNγ – пониженными. 4. У детей с пиелонефритами в момент поступления концентрации IL-1β, IL-4, IL-8, TNFα повышены, но к моменту выписки нормализуются показатели IL-1β, IL-4 только при необструктивном пиелонефрите. У пациентов при пиелонефритах снижается содержание IgG1, IgG2 и повышается уровень IgM, в большей степени при обструктивных его формах. На протяжении всего периода болезни показатель лизосомальных катионных белков нейтрофилов находится на низком уровне. 5. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия при заболеваниях почек у детей изменяется в зависимости от нозологической формы, тяжести течения и типа мутации. У больных при ОПГН, отягощенных мутацией С589Т гена IL-4 процентное содержание лимфоцитарно-
20
тромбоцитарных коагрегатов уменьшается. Показатель ЛТА обратно коррелирует с тяжестью течения ОПГН. При первичных пиелонефритах ЛТА повышается соответственно тяжести заболевания. При обструктивных пиелонефритах в сравнении с необструктивными количество лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов в период активных проявлений заболевания не изменяется. 6. Полиморфизм С589Т гена IL-4 сопровождается более низкой концентрацией иммуноглобулинов субклассов G1 и G2 при ОПГН и субкласса G1 в начале исследования при пиелонефритах. У больных ОПГН, имеющих в генотипе полиморфизм С589Т гена IL-4, уровень IL-4, IL-8 ниже, а содержание СЦК нейтрофилов выше по сравнению с детьми, не обладающими данной мутацией. Присутствие аллельного варианта С589Т гена IL-4 у пациентов с пиелонефритами сопровождается более низкими значениями концентрации IL-8 в начале заболевания. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Батаева Е.П. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у детей с воспалительными заболеваниями почек / Е.П. Батаева, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник. − 2007. − №3. − С. 29-31. 2. Clinical use of test lymphocyte-platelet adhesion / B. I. Kuznik (RU), A. V. Solpov, E. E. Gergesova, N. I. Goryayev, M. M. Duysebekov, J. G. Kergenskova, K. M Lyanova, S. V. Pershikov, H. N. Galsanamzhilova, A. N. Emelyanova, L. V. IIynykh, Y. A Vitkovsky, E. P. Batayeva, E. V. Sidyakova, A. V. Drakuno // XXΙ Congress of the international Society on Thrombosis and Haemostasis (July 6-12, 2007). – Geneva, Switzerland, – 2007. – P. 303. 3. Батаева Е.П. Заместительная терапия у детей с почечной недостаточностью / Е.П. Батаева // Забайкальский медицинский вестник. – 2007. – №1. – С. 54-57. 4. Батаева Е.П. Динамика некоторых иммунологических показателей у детей, страдающих острым пиелонефритом / Е.П. Батаева, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник. − 2009. – №1. – С. 16-18. 5. Батаева Е.П. Роль про- и противовоспалительных цитокинов в развитии острых постстрептококковых гломерулонефритов у детей / Ю.А. Витковский, Е.П Батаева // Забайкальский медицинский вестник. − 2009. − №3. – С. 4-6. 6. Батаева Е.П. Состояние гуморального иммунитета у детей при некоторой патологии почек / Е.П. Батаева // Забайкальский медицинский вестник. − 2010. − №1. − С. 3-5. 7. Батаева Е.П. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия, содержание лизосомальных катионных белков в нейтрофилах и концентрация иммуноглобулинов у детей при пиелонефритах / Е.П. Батаева, Ю.А. Витковский // Кубанский научный медицинский вестник. – 2010. – №7. – С. 14-16.
21
Условные обозначения АГ – артериальная гипертензия; ИФА – иммуноферментный анализ; КИ – клинический индекс; ЛИИ – лейкоцитарный индекс интоксикации; ЛКБ – лизосомально-каонный белок; ЛТА – лифоцитарно-тромбоцитарная адгезия; ОМС – органы мочевой системы; ОПГН – острый постстрептококковый гломерулонефрит; ПН – пиелонефрит; СЦК – средний цитохимический коэффициент; Ig – иммуноглобулин; IL – интерлейкин; IFN – интерферон; TNF – фактор некроза опухолей.