Dorjieva

На правах рукописи

Доржиева Надежда Эдуардовна РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ МОЛЕКУЛ IL-4 (C589T), IL-10 (С819Т), IL-10 (G1082A) В ПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО ПАРОДОНТИТА У РЕЗИДЕНТОВ ЗАБАЙКАЛЬСКОГО КРАЯ 14.03.03 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Чита-2011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор медицинских наук, профессор

Витковский Юрий Антонович

Официальные оппоненты: Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор

Пинелис Иосиф Семенович

кандидат медицинских наук

Герасимов Александр Александрович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России. Защита диссертации состоится «____» декабря 2011 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России (672090, г. Чита, ул. Горького, 39а). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России. Автореферат разослан «___»____________2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 208. 118. 01 д.м.н., профессор 2

И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Среди основных стоматологических заболеваний хронический генерализованный пародонтит (ХГП) занимает 2-е место по частоте после кариеса зубов (Шмидт Д.В., 2008). Воспалительнодеструктивные процессы в зубочелюстной системе и последующая потеря зубов вследствие ХГП ведут к снижению жевательной функции, психоэмоциональной неустойчивости пациентов, к нарушению секреторносократительной функции желудочно-кишечного тракта, эндокринным, сердечно-сосудистым расстройствам и т.д. (Гильмияров Э.М. и соавт., 2008; Грудянов А.И., Безрукова И.В., 2000; Грудянов А.И., Овчинникова В.В., 2007; Michel H., 2002; Scanapieco F.A., 2005). Высокая распространенность пародонтита (ПТ) во всем мире, рост его заболеваемости, отрицательное влияние на качество жизни, сложность патогенеза, тяжесть и упорность течения, длительная реабилитация, серьезные медико-социальные последствия определяют значимость данной проблемы (Фабрикант Е.Г. и соавт., 2008). Пародонтит, как и многие распространенные заболевания, относится к сложным мультифакторным болезням. Характерной чертой данной патологии является то, что в начале своего развития она имеет мало выраженную клиническую картину, медленно прогрессирует и со временем приобретает хроническое течение. Хотя в патогенезе ПТ основное внимание уделяется пародонтопатогенным бактериям и факторам окружающей среды (таким как курение, стресс и др.), однако роль генетических факторов очевидна (Michalowicz B.S. et al., 2000). Каждый человек обладает индивидуальной ответной реакцией на бактериальное воздействие, которая определяет его восприимчивость к развитию болезни (Laine M.L. et al., 2010). В настоящее время существует большое количество статей, посвященных роли генов и их полиморфизмов в ответной реакции организма при ПТ (Царев В.Н., Николаева Е.Н., 2007; Почтаренко В.А. и соавт., 2006; Sumer A.P. et al., 2007). Перспективной группой генов-кандидатов, которые потенциально могут быть связаны с формированием риска ПТ, являются гены цитокинов, сравнительное исследование которых в разных популяциях мира признается весьма актуальным в стоматологии (Kornman K.S., di Giovine F.S., 1998; Laine M.L. et al., 2010). Генетические полиморфизмы могут в некоторых ситуациях вызывать изменения в белке или его экспрессии, что приводит к изменениям во врожденном и приобретенном иммунитете (Laine M.L. et al., 2010). Полиморфизмы цитокинов могут быть связаны с восприимчивостью, степенью тяжести и клиническими исходами ХГП (Havemose-Poulsen А. et al., 2007). Следует отметить, что в настоящее время нет сведений о достоверных маркерах для оценки предрасположенности человека к развитию ХГП и определения прогноза заболевания. Это затрудняет раннюю диагностику и, как следствие, эффективную своевременную профилактику и лечение. Также 3

не в полной мере изучена эпидемиология, этническая и расовая принадлежность данной патологии, а имеющиеся данные о вкладе разных аллелей генов интерлейкинов в развитие ХГП остаются противоречивыми. В связи с этим, исследование роли генетических полиморфизмов цитокинов в развитии ПТ является актуальной задачей, решение которой позволит углубить представления о патогенезе и разработать новые эффективные методы прогнозирования и ранней диагностики заболевания. Цель и задачи исследования. Основной целью исследования явилось изучение частоты аномальных аллельных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A) и оценка их клинико-прогностического значения для развития хронического генерализованного пародонтита средней степени тяжести у лиц русской и бурятской этнических групп Забайкальского края. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: 1. Выявить и оценить частоту встречаемости аномальных аллельных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A), их сочетаний среди больных хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести и практически здоровых резидентов в русской и бурятской этнических группах.

2. Изучить клинические параметры у лиц с различными аллельными вариантами генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A) и их комбинациями в этнических группах.

3. Сравнить содержание провоспалительных IL-1β, TNFα, IL-8 и противовоспалительных цитокинов IL-4, IL-10 в ротовой жидкости больных ХГП и здоровых лиц с учетом различных аллельных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A), их сочетаний в русской и бурятской этнических группах.

4. Определить концентрацию sIgA, α-дефензинов (HNP 1-3), кателицидина (LL-37) в ротовой жидкости резидентов русской и бурятской национальностей в зависимости от аллельных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A) и их комбинаций.

5. Оценить вклад изучаемых показателей в патогенез хронического генерализованного пародонтита. Научная новизна. Впервые установлена частота встречаемости аномальных аллельных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A) среди больных хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести и здоровых резидентов, проживающих на территории Забайкальского края, отмечены этнические особенности носительства аномалий. Выявлено, что сочетание полиморфизмов генов IL-4 и IL-10 сопровождается повышенной продукцией IL-10, IL-4, IL-1β, IL-8, TNFα, снижением содержания sIgA, α-дефензинов, кателицидина в ротовой жидкости в большей степени у пациентов русской национальности, чем у лиц бурятской национальности.

4

Впервые обнаружено, что присутствие полиморфного аллельного варианта гена IL-10 (G1082A) у больных бурятской национальности обуславливает снижение уровня IL-10 и увеличение – sIgA, HNP 1-3, LL-37 в ротовой жидкости. Установлено, что генотипы А/А и G/A IL-10 (G1082A), T/T IL-10 (C819T) играют важную роль в развитии пародонтита у русских. Гомозиготы по аномальной аллели IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T), курение вносят наибольший вклад в патогенез данного заболевания у бурят. Теоретическая и практическая значимость работы. В ходе исследования установлены новые данные о распространенности различных аллельных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A) в Забайкальском крае, а также об их влиянии на развитие хронического генерализованного пародонтита средней степени в русской и бурятской этнических группах. Полученные результаты могут послужить основой для разработки новых подходов к профилактике, прогнозированию и ранней диагностике этой патологии в регионе. Выявленные сведения о наличии полиморфизмов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими полиморфизмами использоваться для оценки риска формирования ХГП. Внедрение результатов работы. Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс кафедр нормальной и патологической физиологии, хирургической стоматологии ГБОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ. Апробация диссертации. Результаты исследований доложены на VI Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011), заседании Читинского отделения физиологического общества имени И.П. Павлова (Чита, 2011). Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки РФ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 273 работы, из них – 141 отечественных и 132 зарубежных авторов, иллюстрирована 45 таблицами, 3 рисунками. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Распределение полиморфизмов генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL10 (G1082A) у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности. Распространенность аномальных аллельных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A) и их сочетаний выше среди больных бурятской национальности, чем русской.

5

2. Содержание цитокинов в ротовой жидкости зависит от носительства аллельных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A) и их сочетаний у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом в русской и бурятской этнических группах. На клинические показатели влияет наличие полиморфизма генов IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A), их комбинации.

3. Концентрация sIgA, α-дефензинов, кателицидина в ротовой жидкости зависит от носительства полиморфных вариантов генов IL-4, IL-10 и их сочетаний в русской и бурятской этнических группах. Ведущими факторами патогенеза хронического пародонтита у русских являются генотипы А/А, G/A IL-10 (G1082A), T/T IL-10 (C819T), у бурят – гомозиготы А/А IL-10 (G1082A), T/T IL-10 (C819T), курение. Материалы и методы исследования В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.). Методом сплошной выборки обследовано 250 больных от 35 до 62 лет, страдающих хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести, которые обратились по поводу лечения в стоматологическую клинику Читинской государственной медицинской академии и стоматологический кабинет «Денталь» (пос. Агинское) в период с 2008 по 2010 год. С целью изучения этнического компонента все больные были разделены на 2 группы: 1. Первая группа – 150 больных пародонтитом (45 мужчин и 105 женщин) русской национальности; 2. Вторая группа – 100 больных пародонтитом (32 мужчины и 68 женщин) бурятской национальности. Контрольную группу составили 250 человек в возрасте от 18 до 30 лет, не имеющие на момент исследования острых и хронических заболеваний пародонта, а также соматической патологии. Они также были разделены на 2 этнические группы: 1. Первая группа – 150 относительно здоровых лиц (40 мужчин и 110 женщин) русской национальности; 2. Вторая группа – 100 относительно здоровых лиц (35 мужчины и 65 женщин) бурятской национальности. Больные хроническим генерализованным пародонтитом и здоровые индивидуумы прошли клиническое обследование: опрос (жалобы, анамнез заболевания и жизни), осмотр полости рта и дополнительные методы исследования. Для определения состояния пародонта использовались обратимые индексы: пародонтальный индекс (PI) по Russel, папиллярно-маргинально-

6

альвеолярный индекс – РМА по Parma, упрощенный индекс гигиены полости рта (OHI-S) по Green-Wermillion. У обследуемых лиц производили забор буккального эпителия и ротовой жидкости. Ротовую жидкость собирали утром натощак после обработки полости рта 10 мл физиологического раствора, замораживали, хранили в холодильнике при t-20оС для последующего определения содержания цитокинов, секреторного иммуноглобулина А, α-дефензинов, кателицидина. Буккальный эпителий переносили с помощью одноразовых стерильных зондов в пробирку с реагентом, перемешивали, зонд извлекали и плотно закрывали, замораживали и хранили в холодильнике для последующего выделения ДНК. Молекулярно-генетическое исследование. Для выявления полиморфизмов генов были выбраны три точечные мутации: IL-4 (C589T), IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A). Для получения образцов ДНК использовался буккальный эпителий. Выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов для биологических проб (НПФ «Литех», Россия, Москва). Выявление мутаций проводилось методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами (НПФ «Литех», Россия, Москва). Амплификация выполнялась на термоциклере модели 110 (ООО «Биоком», Москва). Детекция продуктов амплификации осуществлялась электрофоретическим способом. Определение концентрации цитокинов. В ротовой жидкости пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом и здоровых лиц измеряли концентрацию провоспалительных (IL-1β, TNFα, IL-8) и противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10) методом иммуноферментного анализа с применением тест-систем (ЗАО «ВекторБест», Новосибирск). Определение уровня секреторного иммуноглобулина А, αдефензинов, кателицидина. Секреторный иммуноглобулин А (sIgA), αдефензины (HNP 1-3), кателицидин LL-37 в ротовой жидкости исследовали методом иммуноферментного анализа («HBT», Голландия). Статистическая обработка. Полученные данные обработаны с применением программы STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc., США) и определением статистической значимости различий при p<0,05. При сравнении количественных показателей использовались непараметрические методы в связи с ненормальным распределением значений в вариационных рядах. Исследуемые параметры представлены в виде медианы (Me [25й; 75й перцентили]). Статистически значимые различия между группами по количественным признакам оценивались при помощи критерия Манна – Уитни (U-тест). Для сравнения групп по качественному бинарному признаку применялся критерий χ2 (точный критерий Фишера). Для определения частот аллельных вариантов генов использовался закон Харди-Вайнберга. Для проверки статистических гипотез при сравнении независимых выборок применяли непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса и медианный тест. Для построения математической модели прогноза развития

7

хронического генерализованного пародонтита использовали пошаговую логистическую регрессию. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Распространенность полиморфизмов генов IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T) в этнических группах Забайкальского края Полиморфизм гена IL-4 (C589T) Выявлено, что нормальная аллель (С) преобладает у здоровых резидентов русской этнической группы – 83% по сравнению с бурятской группой – 69% (χ2 = 12,657, р<0,001). Наоборот, встречаемость аномальной аллели (Т) выше среди бурят – 31%, тогда как у русских – 17% (χ2 = 12,657, р<0,001). Нормальные гомозиготы (С/С) чаще наблюдаются среди здоровых лиц русской национальности (χ2=9,718, р=0,002), а патологические гомозиготы (Т/Т) – среди бурятской (χ2 = 4,9, р=0,027) (Рис. 1).

Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с группой здоровых; v - статистически значимые различия между русскими и бурятами. Рис.1. Полиморфизм гена IL-4 (C589T)среди резидентов Забайкальского края.

В русской этнической группе встречаемость аллели С выше у здоровых (83%), чем у больных резидентов (68,7%) (χ2 =16,042, р<0,001). Распространенность Т-аллели превалирует у лиц с ХГП (31,3%) в отличие от лиц без ХГП (17%) (χ2 = 16,042, р<0,001). Генотип С/С чаще выявляется среди здоровых (χ2 = 15,08, р<0,001), а Т/Т – среди пациентов (χ2 = 4,613, р=0,032) (Рис.1). В бурятской этнической группе нормальная аллель оказалась более распространенной среди здоровых (69%), чем больных лиц (41%) (χ2 =30,556, 8

р<0,001). В то время как аномальная аллель чаще наблюдается в группе пациентов с ХГП (59%) по сравнению с группой контроля (31%) (χ2 =30,556, р<0,001). У больных полностью отсутствует генотип С/С в отличие от здоровых (χ2 = 50,909, р<0,001). Т/Т гомозиготы преобладают у пациентов с ХГП (χ2=39,928, р<0,001) (Рис.1). Среди лиц, страдающих ХГП обеих национальностей гомозиготы С/С и аллель С чаще наблюдаются у русских (χ2 =51,144, р<0,001; χ2 = 36,486, р<0,001), а гомозиготы Т/Т и аллель Т – у бурят (χ2 = 49,721, р<0,001; χ2=36,486, р<0,001 соответственно) (Рис. 1). Таким образом, больные обеих этнических групп чаще являются носителями полиморфного варианта гена IL-4, чем здоровые лица. Установлено, что нормальные аллельные варианты преобладают среди лиц без патологии пародонта в отличие от лиц, страдающих ХГП. Частота аномальных аллельных вариантов выше среди здоровых и больных резидентов бурятской национальности по сравнению с таковыми русской национальности. Полиморфизм гена IL-10 (G1082A) Не обнаружено различий в распределении аллельных вариантов гена IL-10 (G1082A) среди здоровых лиц обеих национальностей. В русской этнической группе нормальная аллель (G) является более распространенной среди здоровых (70%), чем больных резидентов (56%) (χ2 = 12,019, р<0,001). Частота аномальной аллели (А) выше у лиц с ХГП (44%) по сравнению с лицами без патологии пародонта (30%) (χ2 = 12,019, р<0,001). Гомозиготы G/G превалируют среди здоровых (χ2 = 6,889, р=0,009), в то время как гомозиготы А/А – среди пациентов с ХГП (χ2 = 10,231, р=0,001) (Рис.2).

Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с группой здоровых; v - статистически значимые различия между русскими и бурятами. Рис.2. Полиморфизм гена IL-10 (G1082A) среди резидентов Забайкальского края.

9

В бурятской этнической группе наблюдается аналогичная тенденция. Встречаемость G-аллели больше среди здоровых (76,5%), чем больных резидентов (50,5%) (χ2 =28,055, р<0,001). Распространенность А-аллели выше у лиц, страдающих ХГП (49,5%) по сравнению с лицами, не имеющими ХГП (23,5%) (χ2 =28,055, р<0,001). Генотип G/G чаще встречается среди здоровых (χ2 = 45,489, р<0,001), а генотип А/А – среди пациентов (χ2 =14,858, р<0,001) (Рис.2). Выявлено, что частота нормальных гомозигот выше у пациентов русской национальности (χ2 =13,238, р<0,001), а гетерозигот – у бурят (χ2=4,437, р=0,035) (Рис. 2). В итоге установлено, что у пациентов с ХГП обеих национальностей больше наблюдаются аномальные аллельные варианты гена IL-10 (G1082A). Здоровые лица чаще являются носителями нормальных аллельных вариантов, чем больные в обеих этнических группах. Встречаемость генотипа G/G выше среди больных русской национальности, а генотипа G/T – среди пациентов бурятской национальности. Полиморфизм IL-10 (C819T) Не обнаружено различий в распространенности аллельных вариантов гена IL-10 (С819Т) среди здоровых лиц обеих национальностей. Выявлено, что в русской этнической группе нормальная аллель (С) больше распространена среди здоровых (83,3%), чем больных резидентов (76,3%) (χ2=4,141, р=0,042). Встречаемость патологической аллели (Т) выше у лиц с ХГП (23,7%) по сравнению с лицами без ХГП (16,7%) (χ2 =4,141, р=0,042). С/С гомозиготы преобладают у здоровых представителей в отличие от больных русской национальности (χ2 =4,322, р=0,038) (Рис. 3).

Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с группой здоровых; v - статистически значимые различия между русскими и бурятами. Рис.3. Полиморфизм гена IL-10 (C819T) среди резидентов Забайкальского края.

10

В бурятской этнической группе частота аллели С выше среди лиц без патологии пародонта (82,5%), чем среди лиц с наличием последней (63,5%) (χ2=17,364, р<0,001). В то время как распространенность аллели Т больше у больных (36,5%) по сравнению со здоровыми резидентами (17,5%) (χ2=17,364, р<0,001). Генотип С/С чаще встречается в группе контроля в отличие от группы пациентов (χ2 =22,082, р<0,001) (Рис. 3). Установлено, что в этническом аспекте нормальные гомозиготы и нормальная аллель больше распространены среди пациентов русской этнической группы (χ2 =13,234, р<0,001; χ2 =9,022, р=0,003 соответственно), аномальная аллель – среди бурятской (χ2 =9,022, р=0,003) (Рис. 3). Таким образом, здоровые резиденты обеих наций чаще являются носителями нормальных аллельных вариантов гена IL-10 (C819T), чем больные. Частота Т-аллели выше у лиц с ХГП в отличие от лиц без патологии пародонта в обеих этнических группах. Встречаемость аномальной аллели IL-10 (C819T) больше среди больных бурятской национальности, чем русской. Содержание цитокинов и sIgA, α-дефензинов, кателицидина в ротовой жидкости больных ХГП и здоровых лиц русской и бурятской национальностей Установлено, что у пациентов русской этнической группы уровень провоспалительных интерлейкинов выше (IL-1β, TNFα в 2 раза; IL-8 в 2,5 раза, р<0,001), а противовоспалительных – ниже (IL-4 в 1,6 раза, р<0,001; IL10 в 1,2 раза, р=0,034), чем у здоровых резидентов. У больных бурятской нации наблюдается такая же тенденция – повышение количества IL-1β в 1,9 раза (р=0,022), IL-8 в 1,7 раза (р=0,02), TNFα в 1,8 раза (р<0,001) и снижение IL-4 в 1,8 раза (р=0,027), IL-10 в 1,6 раза (р=0,038) в отличие от лиц без патологии пародонта. Причем содержание IL-1β (р=0,041), IL-8 (р=0,047) больше среди пациентов бурятской национальности по сравнению с русскими. Уровень sIgA оказался в 1,3 раза (р=0,037), HNP 1-3 – в 2,2 раза (р<0,001), LL-37 – в 1,5 раза (р<0,001) выше в ротовой жидкости здоровых лиц, чем больных русской национальности. У бурят отмечаются подобные различия: концентрация sIgA в 1,4 раза (р=0,03), HNP 1-3 в 2 раза (р<0,001), LL-37 в 1,4 раза (р<0,001) больше у лиц без патологии пародонта в отличие от лиц с наличием последней. Более высокое содержание кателицидина выявлено у больных бурятской национальности, чем русской (р=0,044). Следовательно, у пациентов с ХГП в обеих этнических группах установлена повышенная концентрация IL-1β, IL-8, TNFα и пониженная – IL-4, IL-10, sIgA, HNP 1-3, LL-37 по сравнению с показателями здоровых лиц.

11

Cодержание цитокинов, sIgA, α-дефензинов, кателицидина в ротовой жидкости и клинические показатели у больных ХГП в зависимости от аллельных вариантов гена IL-4 (C589T) В связи с тем, что у больных бурятской национальности отсутствовали лица, несущие нормальную аллель (C), нами не установлено различий в уровне цитокинов, иммуноглобулина и антимикробных пептидов (АМП), клинических показателях в зависимости от аллельных вариантов гена IL-4. У носителей полиморфной аллели (T) IL-4 русской национальности выявлена большая концентрация провоспалительных цитокинов (IL-1β в 1,3 раза, р=0,047; IL-8 в 1,4 раза, р=0,045; TNFα в 1,3 раза, р=0,046) по сравнению с носителями нормальной аллели. Нами не выявлено различий в клинических показателях между носителями вариантов аллелей IL-4 в обеих этнических группах. В русской этнической группе содержание α-дефензинов в ротовой жидкости в 1,3 раза (р=0,009) ниже у больных, имеющих аномальную аллель, чем у лиц с отсутствием последней. У пациентов, несущих полиморфную аллель гена IL-4 бурятской национальности, выявлено большее количество HNP 1-3, кателицидина по сравнению с таковыми русской национальности (р=0,039; р=0,037 соответственно). Таким образом, носительство аномальной аллели IL-4 (C589T) сопровождается увеличением количества провоспалительных цитокинов, снижением содержания α-дефензинов у больных русской национальности. В бурятской этнической группе уровень АМП выше у пациентов, которые несут полиморфный вариант аллели IL-4, в отличие от таковых русской группы. Содержание цитокинов, sIgA, α-дефензинов, кателицидина в ротовой жидкости и клинические показатели у больных ХГП в зависимости от аллельных вариантов гена IL-10 (G1082A) В бурятской этнической группе индекс РМА выше в 1,25 раза у пациентов, несущих аномальную аллель (A) IL-10 (G1082A) по сравнению с пациентами, несущими нормальную аллель (G) (р=0,042). Установлено, что среди носителей G-аллели значения индекса гигиены OHI-S больше в 1,2 раза (р=0,045), а пародонтального индекса – в 1,5 раза (р=0,039) у больных бурятской национальности, чем русской. В группе больных ХГП русской национальности большее содержание в ротовой жидкости IL-1β, IL-8, TNFα (в 2 раза, р<0,001), IL-4 (в 2 раза, р=0,045), IL-10 (в 15 раз, р<0,001) выявлено у носителей полиморфной аллели, чем носителей нормальной аллели (Рис. 4). У пациентов, имеющих полиморфизм гена IL-10 бурятской национальности обнаружена более высокая концентрация TNFα (в 1,2 раза, р=0,039) и низкая – IL-10 (в 1,3 раза, р=0,011) по сравнению с лицами, не имеющими данного полиморфизма (Рис. 4).

12

Содержание в ротовой жидкости IL-1β, TNFα в 2 раза (р<0,001), IL-4 в 2,3 раза (р=0,037), IL-10 в 12 раз (р<0,001) больше у бурят, которые несут Gаллель, чем русских. Уровень IL-10 выше в 1,6 раза у представителей европеоидной расы, которые имеют аномалию гена IL-10 (G1082A) в отличие от представителей монголоидной расы (р<0,001). пг/мл

Русские

*

*

* *

* *

Буряты

пг/мл

*

v

v

v

*v

v

Нормальная аллель

Аномальная аллель

Примечание: * - статистически значимые различия между вариантами аллелей; v - статистически значимые различия между русскими и бурятами. Рис. 4. Уровень цитокинов в ротовой жидкости больных ХГП в зависимости от аллелей гена IL-10 (G1082A).

Концентрация α-дефензинов в 1,3 раза (р=0,023), кателицидина в 1,1 раза (р=0,042) выше у пациентов русской национальности, несущих нормальную аллель, чем мутантную. В группе больных бурятской национальности содержание sIgA, HNP 1-3 в 1,2 раза (р=0,037, р=0,009 соответственно) ниже у носителей G-аллели гена IL-10-1082, чем носителей A-аллели. Выявлено, что концентрация данных веществ выше в 1,3-1,5 раза (р=0,039, р<0,001) у лиц, которые несут полиморфные варианты гена IL-10 (G1082A) бурятской национальности по сравнению с русской. В итоге, аномальная аллель гена IL-10 (G1082A) способствует повышению продукции IL-10 у русских и его снижению – у бурят. При этом содержание в ротовой жидкости IL-10 выше у пациентов русской национальности в отличие от пациентов бурятской национальности. Носительство полиморфизма IL-10 сопровождается снижением концентрации α-дефензинов, кателицидина у русских и увеличением – sIgA, HNP 1-3 у бурят. Более значительное содержание иммуноглобулина и АМП установлено у пациентов бурятской национальности, несущих аномальную аллель по сравнению с таковыми русской национальности.

13

Содержание цитокинов, sIgA, α-дефензинов, кателицидина в ротовой жидкости и клинические показатели у больных ХГП в зависимости от аллельных вариантов гена IL-10 (C819T) У пациентов бурятской национальности, несущих аномальную аллель (T) IL-10 (C819T), индекс гигиены полости рта по Грину-Вермильону больше в 1,4 раза, чем у лиц, несущих нормальную аллель (С) (p=0,003). Данный показатель выше в 1,2 раза у русских носителей C-аллели по сравнению с бурятами (р=0,034). В русской этнической группе уровень IL-4 в 2,9 раза (р=0,022), IL-10 в 3,3 раза (р<0,001) выше у лиц, которые несут полиморфную аллель в отличие от лиц, которые несут нормальную аллель. У пациентов, страдающих ХГП бурятской национальности концентрация TNFα ниже в 1,3 раза у Сносителей, чем Т-носителей (р=0,031). Установлено, что содержание IL-8 больше в 1,4 раза у носителей патологической аллели монголоидной расы, чем европеоидной (р=0,048). Уровень IL-4 выше в 3 раза (р=0,029), IL-10 в 2 раза (р=0,028 ) у бурят, несущих нормальную аллель по сравнению с таковыми русскими. В русской этнической группе α-дефензинов выявлено больше в 1,2 раза (р=0,046) у носителей С-аллели по сравнению с носителями Т-аллели. Аналогичная тенденция наблюдается в бурятской группе, где HNP 1-3 содержится больше в 1,2 раза (р=0,042) у лиц, которые имеют нормальную аллель, чем у лиц с аномальной аллелью. Следовательно, в русской этнической группе аномальная аллель гена IL-10 (C819T) способствует повышению выработки IL-10. У больных обеих национальностей уровень HNP1-3 ниже у носителей полиморфной аллели по сравнению с носителями нормальной. Сочетания полиморфных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T) в русской и бурятской этнических группах Частота сочетаний полиморфных вариантов трех генов (20%) выше среди больных, чем здоровых (7,3%) как в русской (χ2=6,868, р=0,009), так и в бурятской этнических группах (51% и 13% соответственно; χ2=16,263, р<0,001). А встречаемость комбинаций аномальных вариантов генов IL-4, IL-10 больше у пациентов с ХГП бурятской национальности по сравнению с русской (χ2=12,094, р<0,001). У больных ХГП русской национальности более высокие показатели цитокинов (IL-1β, TNFα в 2 раза, IL-4 в 6,4 раза, IL-10 в 3,5 раза) выявлены при сочетании полиморфных вариантов генов, чем нормальных (р<0,001) (Рис. 5). В группе пациентов бурятской национальности уровни всех интерлейкинов (IL-1β, IL-8, TNFα в 1,8-1,9 раз, IL-4 в 2,5 раза, IL-10 в 2,3 раза) также выше у лиц, несущих комбинации аномальных аллелей (р<0,001) (Рис.5).

14

пг/мл

Русские

*

* *

* * пг/мл

Буряты

* v

v v

*v

*v *v

v

*v

Сочетание нормальных вариантов генов

Сочетание полиморфных вариантов генов

Примечание: * - статистически значимые различия между сочетаниями вариантов аллелей; v - статистически значимые различия между русскими и бурятами. Рис. 5. Уровень цитокинов в ротовой жидкости больных ХГП в зависимости от сочетания полиморфных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T).

Содержание в ротовой жидкости IL-1β, IL-8, TNFα в 1,4 раза, IL-4 в 2 раза больше у носителей сочетаний нормальных вариантов генов монголоидной расы, чем европеоидной. Концентрация провоспалительных цитокинов ниже в 1,2 раза у русских с комбинациями полиморфизмов, чем бурят. Однако, уровень IL-10 выше в ротовой жидкости лиц, которые несут сочетания аномальных аллелей генов IL-4, IL-10 русской национальности по сравнению с бурятской (р=0,030) (Рис. 5). В группе больных русской национальности пародонтальный индекс больше в 1,36 раз у лиц с комбинацией полиморфных вариантов аллелей (р=0,022). У монголоидов папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс в 1,3 раза (р=0,009) и индекс гигиены полости рта в 1,4 раза (р=0,023) выше у носителей сочетанных полиморфизмов генов. Индексы РМА в 1,2 раза (р=0,047) и OHI-S в 1,36 раза (р=0,049) больше у русских, а PI в 1,3 раза (р=0,041) – у бурят, несущих комбинации нормальных аллелей. У больных русской этнической группы уровень sIgA в 1,2 раза (р=0,043), HNP 1-3 в 1,6 раза (р<0,001), LL-37 в 1,3 раза (р=0,024) выше у носителей комбинаций нормальных аллелей генов IL-4, IL-10, чем носителей комбинаций мутантных аллелей. В бурятской этнической группе отмечается аналогичная тенденция: уровень sIgA в 1,2 раза (р=0,034), α-дефензинов и кателицидина в 1,3 раза (р=0,007, р=0,004 соответственно) выше у пациентов, несущих сочетания нормальных вариантов генов по сравнению с несущими сочетания полиморфных вариантов.

15

В этническом плане концентрация данных пептидов выше у бурят, имеющих комбинации полиморфизмов генов, чем таковых русских. Более высокий уровень кателицидина установлен у носителей сочетаний нормальных аллелей бурятской национальности по сравнению с русской (р=0,045). В итоге, при сочетании полиморфных вариантов генов у пациентов с ХГП обеих этнических групп наблюдается преобладание как про-, так и противовоспалительного пула цитокинов, причем провоспалительных цитокинов больше у бурят, чем русских. Однако, содержание в ротовой жидкости IL-10 выше у больных русской национальности, имеющих комбинации полиморфизмов генов IL-4, IL-10 по сравнению с таковыми бурятской национальности. В обеих этнических группах уровень иммуноглобулина, дефензинов, кателицидина ниже у лиц с сочетанием аномальных аллелей генов. При этом среди последних, концентрация данных веществ выше у больных бурятской национальности в отличие от больных русской национальности. Для оценки патогенетической роли изучаемых параметров в развитии хронического воспаления пародонта, мы провели многофакторный регрессионный анализ. В математическую модель были включены следующие показатели: пародонтальный индекс (PI), генотипы IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T), интерлейкины (IL-1β, IL-8, IL-4, IL-10, TNFα), секреторный иммуноглобулин А, антимикробные протеины (αдефензины, кателицидин) курение, пол. Выявлено, что в русской этнической группе ведущими факторами, способствующими развитию пародонтита являются наличие полиморфных гомозигот (35%) и гетерозигот (22%) гена IL-10 (G1082A), генотип T/T (20%) IL-10 (C819T). В бурятской группе к таким факторам относят аномальные гомозиготы гена IL-10 (G1082A) (31%), IL-10 (C819T) (20%), курение (17%) (Рис.6). Русские

Буряты Генотип A/A IL-10 (G1082A) Генотип A/A IL-10(G1082A)

Генотип Т/Т IL-10 (С819Т)

Генотип G/A IL-10 (G1082A)

Курение

Генотип Т/Т IL-10 (С819Т)

IL-1β

IL-10

HNP1-3 LL-37

HNP1-3 -0,5

0

0,5

1

-0,5

0

0,5

beta – регрессионный коэффициент

Рис.6. Многофакторная модель прогнозирования развития ХГП.

16

Таким образом, наличие сочетания полиморфизмов генов IL-4 и IL-10 в наибольшей степени влияет на изменение иммунологических и клинических показателей. Установлено, что при комбинации полиморфных вариантов генов выработка IL-10 выше, а sIgA, HNP 1-3, LL-37 ниже у пациентов русской национальности, чем бурятской. Генотипы А/А, G/A IL-10 (G1082A) и Т/Т IL-10 (C819T) играют важную патогенетическую роль в изменении иммунологической реактивности при ХГП у русских. В то время как гомозиготное носительство аномальной аллели гена IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T) вносит наибольший вклад в развитие данного заболевания у бурят. В итоге, полиморфизмы генов IL-10 (C819T), IL-10 (G1082A), сочетаний генов IL-4, IL-10 обуславливают снижение защитных функций полости рта в большей степени у представителей русской этнической группы, чем бурятской. ВЫВОДЫ: 1. Больные хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести в обеих этнических группах чаще являются носителями полиморфизмов генов IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T) и их комбинаций (24-59%), чем здоровые (17-31%).

2. Частота встречаемости аномальной аллели IL-4 (C589T) в 1,9 раза, IL-10 (C819T) в 1,5 раза, а также сочетаний полиморфных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T) в 1,5 раза выше среди больных ХГП бурятской национальности по сравнению с больными русской национальности.

3. У пациентов русской национальности с комбинацией полиморфных вариантов генов IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T) пародонтальный индекс больше в 1,4 раза, чем у лиц без указанных аномалий. Данный показатель выше у больных, несущих нормальную аллель IL-10 (G1082A) в 1,5 раза и сочетания нормальных вариантов аллелей генов IL-4, IL-10 в 1,3 раза бурятской национальности по сравнению с русской.

4. У лиц, страдающих ХГП обеих этнических групп содержание провоспалительных цитокинов выше в 1,7-2,5 раза, а противовоспалительных – ниже в 1,2-1,8 раз, чем у здоровых резидентов. Концентрация IL-10 в 2-3 раза, IL-4 в 3-15 раз больше в ротовой жидкости больных русской национальности, имеющих полиморфизмы молекул IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T). Носительство аномальной аллели IL-10 (G1082A) сопровождается снижением уровня IL-10 в 1,3 раза у пациентов бурятской национальности.

5. При сочетании полиморфных вариантов аллелей генов IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T) в ротовой жидкости пациентов обеих национальностей увеличивается концентрация прои противовоспалительных цитокинов. При этом уровень IL-10 выше в 1,2 раза у русских, чем у бурят.

6. У больных обеих наций содержание в ротовой жидкости sIgA в 1,3-1,4 раза, α-дефензинов в 2-2,2 раза, кателицидина LL-37 в 1,4-1,5 раза ниже, 17

7.

чем у здоровых лиц. В обеих этнических группах при наличии нормальной аллели генов IL-4, IL-10 и их сочетаний отмечается более высокая концентрация данных веществ по сравнению с наличием полиморфных аллелей генов и их сочетаний. Носительство немутантной аллели IL-10 (G1082A) у пациентов монголоидной расы сопровождается снижением в 1,2 раза уровня данных белков в отличие от носительства мутантной аллели. При комбинации полиморфных вариантов генов IL-4, IL-10 содержание sIgA в 1,2 раза, HNP1-3 в 1,5 раза больше у пациентов бурятской национальности, чем русской. Ведущими факторами развития хронического генерализованного пародонтита у русских являются генотипы А/А (35%), G/A (22%) IL-10 (G1082A), T/T IL-10 (C819T) (20%), у бурят – гомозиготы А/А IL-10 (G1082A) (31%), T/T IL-10 (C819T) (20%), курение (17%). ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ С целью повышения ранней диагностики и прогнозирования ХГП следует включать исследование полиморфизмов генов IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A), IL-10 (C819T) в алгоритм обследования больных с начальными проявлениями воспалительных процессов в тканях пародонта. Лицам с тяжелыми клиническими проявлениями данного заболевания рекомендуется проводить медико-генетическое консультирование.

1.

2.

3.

4.

5.

18

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Доржиева Н.Э. Полиморфизмы некоторых цитокинов при хроническом пародонтите в различных этнических группах / Н.Э. Доржиева, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник. – 2010. – № 4. – С.30-35. Доржиева Н.Э. Полиморфизм гена IL-10 (C819T) у больных с воспалительными заболеваниями пародонта в Забайкалье / Н.Э. Доржиева, Ю.А. Витковский, Л.Р. Судакова // Вестник Российского государственного медицинского университета, Специальный выпуск. – 2011. – №1. – С.176. Полиморфизм гена IL-10 (C819T) у больных с воспалительными заболеваниями пародонта в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / Н.Э. Доржиева, Ю.А. Витковский, Л.Р. Судакова, О.Ф. Дагбаева // Забайкальский медицинский вестник. – 2011. – №1. – С.44-48. – Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv (22 марта 2011). Доржиева Н.Э. Полиморфизм гена IL-4 (C589T) у больных с воспалительными заболеваниями пародонта русской и бурятской национальностей в Забайкальском крае / Н.Э. Доржиева, Ю.А. Витковский // Врач-аспирант. – 2011. – №3(46). – С.82-87. Доржиева Н.Э. Аллельный полиморфизм гена IL-4 (C589T) у резидентов Забайкальского края с хроническим пародонтитом /

Н.Э. Доржиева, Ю.А. Витковский, Л.Р. Судакова // Кубанский научный медицинский вестник. – 2011. – №3(126). – С.70-73. АМП ВЗП ДНК ПТ ПЦР ХГП sIgA IL HNP LL-37 OHI-S PI PMA Th TNFα

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ - антимикробные пептиды - воспалительные заболевания пародонта - дезоксирибонуклеиновая кислота - пародонтит - полимеразная цепная реакция - хронический генерализованный пародонтит - секреторный иммуноглобулин А - интерлейкин - α-дефензин - кателицидин - упрощенный индекс гигиены полости рта по Green-Wermillion - пародонтальный индекс - папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс - Т-лимфоцит хелпер - фактор некроза опухолей α

19