На правах рукописи
Гергесова Екатерина Евгеньевна
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ GPIIIa (Leu33-Pro), GPIa (C807-T) И ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ У ЛИЦ С РАЗНЫМИ ГРУППАМИ КРОВИ АВ0 В НОРМЕ И ПРИ ГРИППЕ А(H1N1)2009 03.03.01 - физиология 14.03.03 - патологическая физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Чита - 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Витковский Юрий Антонович Доктор медицинских наук, профессор Кузник Борис Ильич Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Цыбиков Намжил Нанзатович Кандидат медицинских наук Герасимов Александр Александрович Ведущая организация: ФГУ «Российский НИИ Гематологии Минздравсоцразвития РФ», г. Санкт-Петербург
и
трансфузиологии
Защита состоится «____» ____________ 2011 года в 9.00 на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГОУ ВПО ЧГМА Минздравсоцразвития РФ, 672000, г.Чита, ул. Горького, 39 а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ЧГМА Минздравсоцразвития РФ. Автореферат разослан «______» апреля 2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор
И.Н. Гаймоленко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
2
Актуальность проблемы. В настоящее время не вызывает сомнений существование единой клеточно-гуморальной системы защиты организма, объединяющей иммунитет и гемостаз (Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., 1989-2005; Витковский Ю.А., 2000-2010), одним из способов реализации
свойств
которой является функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (Солпов А.В., 2005). Изучена молекулярная база этого взаимодействия (Витковский Ю.А., Кузник Б.И., 2002; Solpov A.et al., 2002; Солпов А.В., 2005; Li N., 2008), накоплены данные о роли ЛТА в патогенезе различных заболеваний (Витковский Ю.А. и совт., 2007; Батаева Е.П., Витковский Ю.А., 2007; Емельянова А.Н., Витковский Ю.А., 2009 и др.). Однако к настоящему моменту нет данных о возможных генных механизмах регуляции этой физиологической функции, существование которых, тем не менее, бесспорно. Показатель ЛТА, особенно лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ), отражающий
адгезивность
тромбоцитов
на
лимфоцитах,
позволяет
характеризовать функциональное состояние кровяных пластинок, чему в доступной
литературе
уделено
сравнительно
недостаточно
внимания.
Функции же тромбоцитов зависят как от генетических (Newman P.J.et a1., 1989; Lane D.A., Grant P.J., 2000; Michelson A.D. et al., 2000; Weiss E.J. et al., 1996 и др.), так и от некоторых конституциональных факторов, например групп крови АВ0 (Wiggins K.L. et al., 2006; Garcia A.A. et al., 2006; Sousa N.C. et al., 2007; Jenkins P.V., O,Donnell J.S., 2006; Boven D.J., 2003). В свою очередь, функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в норме у лиц с различной групповой принадлежностью крови АВ0 не изучалась. Кроме того, несомненным
является
участие
тромбоцитов
в
реакциях
как
неспецифического, так и специфического (вирусного, бактериального) воспаления (Hansson G.K., 2005; Shiraki R. Et al., 2004; Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004; Cognasse F. Et al., 2005; Fitzgerald J. R. Et al., 2006 и
3
др.), однако, эти реакции не изучены с позиций конституциональной тромбогенности «ненулевых» групп крови АВ0. Таким образом, представляется интересным изучить особенности функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов в связи с генетическими особенностями тромбоцитарных рецепторов у лиц с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 как в норме, так и в условиях воспаления. Целью
работы
явилось
изучение
роли
полиморфизмов
генов
тромбоцитарного рецептора фибриногена GpIIIa (интегрина в3) (Leu33-Pro), тромбоцитарного рецептора коллагена GpIa (интегрина б2) (C807-Т) и системы АВ0 в регуляции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов у здоровых лиц и больных гриппом А(H1N1)2009. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Оценить состояние функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов у здоровых лиц с различной групповой принадлежностью
крови
по
системе
АВ0.
Выявить
частоту
встречаемости полиморфных вариантов генов тромбоцитарного рецептора
фибриногена
GPIIIa
(интегрина
β3)
(Leu33-Pro)
и
тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) у здоровых лиц с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0. Проследить влияние носительства полиморфных вариантов изучаемых генов на функции тромбоцитов.
2. Исследовать состояние функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов у больных гриппом A(H1N1)2009 с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0. Сравнить
функцию
лимфоцитарно-тромбоцитарной
адгезии
и
4
агрегацию тромбоцитов у здоровых лиц и больных гриппом A(H1N1)2009.
3. Выявить частоту встречаемости полиморфных вариантов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) у больных гриппом A(H1N1)2009 с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0.
4. Оценить функцию лимфоцитарно-тромбоцитарной агрегации
тромбоцитов
у
больных-носителей
адгезии
и
полиморфных
вариантов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т). Научная новизна. Впервые установлено, что у здоровых лиц с «ненулевыми»
группами
крови
снижена
способность
тромбоцитов
образовывать коагрегаты с лимфоцитами. У больных гриппом A(H1N1)2009 повышается лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия, что не зависит от группы крови АВ0. У больных с гриппом A(H1N1)2009 спонтанная агрегация тромбоцитов повышается, а индуцированная снижается, особенно у лиц с I (0) группой крови. Впервые выявлено, что среди здоровых лиц аномальные варианты гена тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) чаще встречаются у обладателей «ненулевых» групп крови. Гетерозиготный вариант гена тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) 33LeuPro чаще обнаруживается у женщин с «ненулевыми» группами крови, чем у мужчин. Сочетание мутантных генотипов тромбоцитарных рецепторов чаще встречается у обладателей II (A) группы крови, причем у мужчин реже,
5
чем у женщин. Функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии усилена у здоровых GpIIIa 33LeuPro гетерозигот со II (A) группой крови. Впервые
показано,
что
распределение
частот
встречаемости
полиморфных вариантов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) практически не различается среди здоровых лиц и больных гриппом А(H1N1)2009. У больных-носителей гомозиготного 807ТТ генотипа тромбоцитарного рецептора коллагена
GPIа (интегрина α2)
способность тромбоцитов взаимодействовать с лимфоцитами усиливается, а спонтанная и коллаген-индуцированная агрегация снижается. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные сведения о генетическом полиморфизме адгезивных молекул углубляют представление
о
механизмах
лимфоцитарно-тромбоцитарной
адгезии,
агрегации тромбоцитов у здоровых лиц и в патогенезе гриппа A(H1N1)2009. Данные о связи полиморфизма адгезивных молекул и системы АВ0 могут быть включены в генетический паспорт индивидуума и совместно с другими
полиморфизмами
использоваться
для
прогнозирования
тромботического риска у лиц с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0. Внедрение в практику. Сведения об особенностях тромбоцитарных функций, зависящих от генетических и конституциональных факторов, внедрены в учебный процесс кафедр нормальной и патологической физиологии, гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия», в работу НИИ медицинской экологии ЧГМА.
6
Апробация диссертации. Основные положения работы доложены на: VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), Всероссийской научнопрактической
конференции,
посвященной
55-летию
Читинской
государственной медицинской академии (Чита, 2008), I Международной научно-практической
интернет-конференции
«Состояние
здоровья:
медицинские и психологические аспекты» (Чита-Славянск, 2009), XXXIII Мировом конгрессе Международного общества гематологии (Иерусалим, Израиль,
2010),
XI
Европейском
симпозиуме
по
иммунобиологии
тромбоцитов и гранулоцитов (Бон, Франция, 2010), Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Итоги эпидемии гриппа
A(H1N1)»
(Чита,
2010),
заседании
Читинского
отделения
физиологического общества имени И.П. Павлова (Чита, 2010). По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ. Основные положения, выносимые на защиту: 1.
Частоты
встречаемости
полиморфных
вариантов
гена
тромбоцитарного рецептора фибриногена GрIIIa (Leu33-Pro) не имеют особенностей у здоровых обладателей разных групп крови АВ0. Гомозиготный мутантный вариант 807ТТ коллагенового рецептора GpIa тромбоцитов чаще встречается у здоровых лиц со II (A) группой крови, а нормальный 807СС вариант гена GpIa обнаруживается реже. Частота встречаемости сочетания мутантных гентипов GpIIIa и GpIa выше у женщин и у лиц со II (A) группой крови. 2. Агрегационная
функция
тромбоцитов
и
лимфоцитарно7
тромбоцитарная адгезия зависят от групп крови АВ0, тромбогенные свойства которых определяются в том числе и полиморфизмом генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GpIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GpIa (интегрина α2) (C807-T). 3.
Частоты встречаемости полиморфных вариантов генов GpIIIa
(Leu33-Pro) и GpIa (C807-T) у больных гриппом A(H1N1)/2009 не отличаются от здоровых лиц. При гриппе A(H1N1)2009 усиливается функция
лимфоцитарно-тромбоцитарной
спонтанной агрегации
агрегации кровяных
тромбоцитов. пластинок
адгезии
и
скорость
Скорость
индуцированной
снижается.
Тромбогенность
«ненулевых» групп крови при гриппе A(H1N1)2009 проявляется увеличением адгезивности тромбоцитов на лимфоцитах. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, глав результатов собственных
исследований,
обсуждения
полученных
результатов,
выводов и указателя литературы, включающего 216 работ, из них – 59 отечественных и 157 зарубежных авторов, иллюстрирована 38 таблицами и 3 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые
Хельсинкской
Декларацией
Всемирной
Медицинской
Ассоциации, World Medical Association Declaration of Helsinki (1964). 8
Объектами наблюдения явились: стабилизированная 3,8% раствором цитрата натрия кровь здоровых людей в возрасте 18–35 лет (322 образца) и больных гриппом в период эпидемии А(H1N1)/09 (200 образцов). Методы исследования Методы изучения функций тромбоцитов: Подсчет тромбоцитов и лейкоцитов проводился в камере Горяева с использованием общепринятых методик. окрашенных
Число лимфоцитов определяли в фиксированных мазках, азур-II-эозином
по
Романовскому-Гимзе.
Определение
показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии проводили по методике Ю.А. Витковского (1999), лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ) оценивали
как
среднее
арифметическое
количество
тромбоцитов,
присоединившихся к одному лимфоциту. Оценку агрегационной способности тромбоцитов осуществляли турбидиметрическим методом по G. Born (1962) с помощью лазерного анализатора агрегации Biola (НПФ «Биола», Москва): исследовали спонтанную, АДФ-, адреналин- и коллаген-индуцированную агрегацию с использованием соответствующих реактивов, выпускаемых ООО «Технология-стандарт» (Барнаул). Определение групп крови АВ0: группы крови АВ0 определялись общепринятым методом с использованием реакции изогемагглютинации на планшете при помощи цоликлонов анти-А и анти-В (ООО «Гематолог», Россия, Москва). Молекулярно-генетическое исследование: выделение ДНК из цельной крови и постановка ПЦР с целью выявления мутаций генов GpIIIa (Leu33Pro) и GpIa (C807-T) проводились с использованием соответствующих наборов, выпускаемых НПФ «Литех» (Москва). Детекция продуктов
9
амплификации осуществлялась путем горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле. Статистическая обработка результатов выполнена параметрическими и непараметрическими методами с использованием пакета программ Microsoft Office Excel 2007, STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc., США), с определением статистической значимости различий при p<0,05. Изучаемые показатели
представлены
в
виде
средних
величин
со
стандартным
отклонением (M±SD). При нормальном распределении признака применялся критерий Стьюдента (t-тест), при распределении, отличном от нормального – критерий Манна–Уитни (U-тест). Для сравнения групп по качественному бинарному признаку применялся критерий
2
(Пирсона). Для оценки
статистической значимости между группами признаков использовался коэффициент ранговой корреляции
Спирмена,
значимым
признавался
результат rs>0,3 при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Распространенность полиморфных вариантов генов GpIIIa (Leu33-Pro) и GpIa (C807-T) у здоровых лиц с разными группами крови АВ0 и функции тромбоцитов. В группе здоровых лиц обнаружено 135 нормальных 33LeuLeu-гомозигот (R=0,68) тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3), 42 носителя 33LeuPro гетерозиготного генотипа (R=0,21), 23 мутантные 33ProPro-гомозиготы (R=0,11). Полиморфные варианты тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) распределились следующим образом: 105 нормальных 807CC-гомозигот (R=0,53), 46 носителей 807CТ 10
гетерозиготного варианта (R=0,23) и 49 мутантных 807ТT-гомозигот (R=0,24). Среди испытуемых обладатели I (0) группы крови составили 36%, II (А) – 30%,
III (B) – 26% и IV (AB) – 8%. Полученные о группах крови данные
соответствуют сведениям, имеющимся в литературе для Европейской части России (Томилин В.В., Гуртовая С.В., 1999; Жибурт Е.Б., 2002; Кузник Б.И., Максимова О.Г., 2007). По причине малого количества испытуемых обладатели IV(AB) группы из наблюдений были исключены. Обнаружено, что частоты встречаемости полиморфных вариантов гена тромбоцитарного рецептора фибриногена GрIIIa (интегрина β3) у обладателей разных групп крови не различались, в то время как частота встречаемости гомозиготного мутантного варианта 807ТT коллагенового рецептора тромбоцитов интегрина α2 оказалась выше у обладателей второй группы крови по сравнению с первой. Вместе с тем носительство нормального гомозиготного генотипа обнаружилось у них реже (рис.1). 60 50 40 30
*
*
I (0) II (A) III (B)
20 10 0 GpIa 807CC
GpIa 807CT
GpIa 807TT
Рис.1. Частота встречаемости (%) полиморфных вариантов гена GpIa (С807-Т) у здоровых лиц с разными группами крови АВ0, % (χ2 – тест, * р<0,05), n=200.
11
Среди носителей сочетания мутаций тромбоцитарных рецепторов преобладали лица со II (A) группой крови (табл.1). Сочетанные мутации у женщин встречались чаще, чем у мужчин (табл.2). Таблица 1 Частота встречаемости (R) разных групп крови АВ0 у здоровых лиц носителей сочетания мутантных аллелей тромбоцитарных рецепторов GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro) I (0) n=7 0,13
II (A) III (B) n=9 n=8 0,23 0,09 р<0,05 Примечание: χ2-тест, р – статистическая значимость различий по сравнению с первой группой крови. Таблица 2 Частота встречаемости (R) сочетания мутантных аллелей тромбоцитарных рецепторов GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro) у здоровых мужчин и женщин с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 I (0)
II (A)
III (B)
Муж
Жен
Муж
Жен
Муж
Жен
n=24 0,08
n=38 0,16
n=32 0,13
n=48 0,25
n=16 0,13
n=22 0
Р1<0,05
р<0,05
Р1<0,05 Примечание: χ2-тест, р – статистическая значимость различий по сравнению с первой группой крови в пределах одного пола, р 1 – статистическая значимость гендерных различий.
В следующей серии исследований установлено, что у людей со II (A) и III (В) группами крови содержание тромбоцитов выше, чем с I (0), хотя не выходит за пределы референтных значений. Вместе с тем абсолютное содержание присоединившихся к лимфоцитам тромбоцитов в 1 мкл оказалось меньше у лиц с III (В) группой крови (табл. 3). 12
Таблица 3 Число тромбоцитов ЛТА и ЛТИ у обладателей разных групп крови по системе АВ0 (MSD) Группы крови
Число
ЛТА
ЛТА (в 1
ЛТИ
Число тромбоцитов,
тромбоцитов
(%)
мкл
Абсолютное
присоединившихся к
крови)
число
лимфоцитам в 1 мкл
(тысяч в 1 мкл крови)
крови
I (0)
205±5
13±2,5
298±19
3,1±0,2
1068±79
(n=41) II (A)
243±8
15±2,7
337±21
2,9±0,2
962±66
(n=38) III (B)
р<0,01 231±9
15±2,8
317±22
3,3±0,2
824±65
(n=33) р<0,01 р<0,05 Примечание: t-тест, р – статистическая значимость различий по сравнению с I (0) группой крови.
Скорость спонтанного образования тромбоцитарных агрегатов оказалась увеличена у здоровых лиц со II (А) группой крови (средний радиус агрегатов в I (0) группе 1,1±0,1отн.ед., во II (A) – 1,4±0,1отн.ед.; скорость их образования в I (0) группе 0,4±0,1 отн.ед./мин., во II (A) – 0,7±0,1; t-тест, р<0,05). Кроме того, у обладателей II (А) и III (В) групп, по сравнению с I (0), агрегация оказалась повышенной, если в качестве лиганда использовался коллаген (средний радиус агрегатов в I, II и III группах соответственно 6,7±2,5, 7,3±1,9 и 8,5±1,6 отн.ед.; скорость их образования 19,1±4,7, 15,9±3,2 и 24,6±5,2 отн.ед./мин.; по показателю светопропускания - 53,5±11,8, 73,4±12,0 и 66,1±14,1%; 65,9±15,5, 85,7±15,0 и 92,0±15,6%/мин.; t-тест, р<0,05).
13
Обнаружено, что у здоровых лиц носителей мутантного гомозиготного 807ТТ генотипа GpIa ослаблена способность тромбоцитов взаимодействовать с
лимфоцитами
(ЛТИ),
в
то
время
как
процент
лимфоцитарно-
тромбоцитарных коагрегатов в циркуляции не зависит от генетического полиморфизма
коллагенового
рецептора
тромбоцитов.
Кроме
того,
гетерозиготный генотип не оказывает влияния на функцию лимфоцитарнотромбоцитарной адгезии (табл.4). При этом скорость спонтанной агрегации кровяных пластинок оказалась выше у здоровых лиц носителей 807ТT варианта (скорость спонтанного образования агрегатов из тромбоцитов у 807СC-гомозигот,
807СТ-гетерозигот
и
807ТT-гомозигот
составила
соответственно 0,3±0,1, 0,3±0,1 и 0,7±0,2 отн.ед./мин; U-тест, р<0,05). Тромбоциты реагировали сильнее на коллаген у носителей гетерозиготного генотипа (средний радиус образующихся при индукции коллагеном агрегатов из тромбоцитов у 807СС-гомозигот, 807СТ-гетерозигот и 807ТТ-гомозигот соответственно 6,6±3,7, 8,1±3,9, 6,5±2,2 отн.ед., скорость их образования 18,4±11,9, 26,3±7,9, 19,2±6,0 отн.ед./мин.; U-тест, р<0,05). Вместе с тем, у здоровых носителей 33ProPro генотипа GpIIIa увеличивается средний размер и скорость спонтанно образующихся агрегатов из тромбоцитов (средний радиус агрегатов у 33LeuLeu-гомозигот, 33LeuPro-гетерозигот и 33LeuLeuгомозигот соответственно составил 1,0±0,4; 1,1±0,2 и 1,6±0,5 отн.ед., скорость их образования - 0,1±0,1, 0,2±0,1 и 0,5±0,2 отн.ед./мин.; U-тест, р<0,05).
Таблица 4 Функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у здоровых лиц носителей полиморфных вариантов гена GpIa (С807-Т) (M±SD) ЛТА, %
GpIa (807CС) 14,3±4,4
GpIa (807CT) 14,6±2,1
GpIa (807TТ) 14,3±3,9 14
ЛТИ, отн.ед.
4,1±1,0
3,6±0,7
2,6±1,1
р<0,05 Примечание: U-тест, р – статистическая значимость различий по сравнению с группой носителей нормального гомозиготного 807С варианта.
Сочетание мутантных генотипов GpIa 807CT, 807TТ и GpIIIa 33LeuPro, 33ProPro приводило к увеличению размера спонтанно образующихся агрегатов из тромбоцитов (рис. 2). 2
*
1,5
без сочетания мутаций
1
носители сочетанных мутаций
0,5 0 степень агрегации
Рис.2. Максимальное значение среднего размера спонтанно образующихся агрегатов из тромбоцитов, отн.ед. (U-тест, * - р<0,05). 2. Функции тромбоцитов и полиморфизм генов GpIa (C807-T) и
GpIIIa (Leu33-Pro) у больных гриппом А(H1N1)/2009 и различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0. Оценка состояния функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов у больных гриппом в период эпидемии А(H1N1)/2009 выявила, что индекс адгезивности тромбоцитов на лимфоцитах (ЛТИ) в группе больных выше, чем у здоровых (рис. 3), в то время как скорость
15
спонтанного образования агрегатов из тромбоцитов у больных оказывается выше, а скорость ответа на индукторы - ниже (табл. 5).
*
4 3,5 3 2,5 2
здоровые больные
1,5 1 0,5 0 ЛТИ, отн.ед.
Рис.3. Лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс у здоровых и больных гриппом А(H1N1)2009 (U-тест, * - р<0,05). Таблица 5 Максимальный радиус агрегатов (отн.ед.) и максимальный наклон (отн.ед.в мин.) кривых агрегации тромбоцитов у здоровых лиц и больных гриппом А(H1N1)2009 (M±SD) Здоровые
Больные
Макс. значение Макс. наклон
(n=122) 1,2±0,2 0,4±0,3
(n=100) 1,4±0,6 0,7±0,4
Макс. значение Макс. наклон
8,7±2,6 25,7±2,1
р<0,05 7,9±2,5 18,9±2,4
Макс. значение
7,3±3,6
р<0,05 6,4±2,5
Макс. наклон
12,9±3,9
8,4±3,7
Макс. значение Макс. наклон
7,9±2,7 19,2±4,4
р<0,05 6,8±2,8 16,5±4,6
спонтанная
АДФ
адреналин
коллаген
р<0,05
16
Примечание: t-тест, Р – статистическая значимость различий между больными и здоровыми.
Показатели спонтанной агрегации кровяных пластинок оказались выше у больных с I (0) группой крови по сравнению со II (A) (максимальный радиус агрегатов 1,6±0,1отн.ед., во II и III группах соответственно 1,2±0,1 и 1,4±0,2; t-тест, р<0,05). Вместе с тем скорость наступления индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов была снижена у пациентов с III (B) группой крови (максимальный наклон кривых агрегации в I, II и III группах соответственно 19,9±5,9, 22,7±4,9, 14,6±3,4 отн.ед./мин.; t-тест, р<0,05). В
следующей серии исследований
в группе больных гриппом
А(H1N1)/2009 обнаружено 140 нормальных 33LeuLeu-гомозигот (R=0,7) гена тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3), 47 носителей 33LeuPro
гетерозиготного
варианта
(R=0,24),
13
мутантных33ProPro-
гомозигот (R=0,06). Полиморфные варианты гена тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) распределились следующим образом: 95 нормальных
807CC-гомозигот
(R=0,48),
71 носитель
807CТ
гетерозиготного генотипа (R=0,36) и 34 мутантные 807ТT-гомозиготы (R=0,16), что не отличается от распределения частот в группе здоровых лиц (χ2-тест,
р≥0,05).
При
этом
показатели
спонтанной
и
коллаген-
индуцированной агрегации кровяных пластинок были меньше у больных носителей мутантного 807ТT генотипа GpIa, а у 807СТ-гетерозигот скорость коллаген-индуцированной агрегации оказалась выше (табл.6). Адгезивность тромбоцитов на лимфоцитах усиливалась у больных носителей мутантного 807ТТ-генотипа
GpIa
(табл.
7).
Сочетание
мутантных
аллелей
тромбоцитарных рецепторов у больных приводило к уменьшению процента лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов в циркуляции (ЛТА в группе пациентов-носителей
сочетанных
мутаций
12,1±9,8%,
в
группе
без 17
сочетанных мутаций – 17,6±9,2%; U-тест, р<0,05) и размера, а также скорости спонтанного образования агрегатов из тромбоцитов (максимальное значение радиуса агрегатов в группе больных носителей сочетанных мутаций 1,0±0,3 отн.ед., в группе без сочетанных мутаций - 1,7±0,4 отн.ед.; максимальный наклон кривых агрегации соответственно 0,3±0,2 отн.ед./мин. и 0,9±0,2 отн.ед./мин.; U-тест, р<0,05). Таблица 6 Максимальный радиус агрегатов (отн. ЕД) и максимальный наклон (отн.ед.в мин.) кривых спонтанной и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов у больных носителей полиморфных вариантов тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) (MSD)
спонтанная
807СC n=95 1,4±0,8
807CТ n=71 1,4±0,7
0,6±0,3
0,7±0,4
807ТT n=34 1,2±0,7 р<0,05 0,6±0,3
6,7±2,1
7,0±4,4
6,3±2,4
Макс.знач. Макс.накл.
коллаген
Макс.знач. 16,1±8,0
19,4±8,1 12,8±10,1 Макс.накл. р<0,05 р<0,05 Примечание: U-тест, Р – статистическая значимость различий с группой носителей гомозиготного 807СС генотипа.
Таблица 7 ЛТА (%) и ЛТИ (отн.ед) у больных носителей полиморфных вариантов тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) (MSD)
ЛТА
807СC n=95 16,5±9,6
807CT n=71 16,2±8,6
807ТT n=34 17,1±10,5
ЛТИ
3,1±0,9
3,9±1,6
6,2±2,7 Р<0,05 18
Примечание: U-тест, Р –статистическая значимость различий с группой носителей гомозиготного 807СС генотипа.
Частота встречаемости разных групп крови АВ0 в группе больных гриппом А(H1N1)/2009 не отличалась от группы здоровых лиц (χ2-тест, р≥0,05). Обнаружено, что аномальный 33ProPro-вариант гена GPIIIa чаще встречается у больных со II (A) группой крови, также как и гомозиготный мутантный 807ТT генотип тромбоцитарного рецептора коллагена GPIa (табл. 8). При этом среди носителей сочетанных мутаций тромбоцитарных рецепторов преобладают больные со II (A) группой крови (частота встречаемости I, II и III групп соответственно 0,15, 0,34 и 0,1; χ2-тест, р<0,05). Таблица 8 Частота встречаемости (R) полиморфных вариантов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) в группе больных гриппом А(H1N1)2009 с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 33LeuLeu
GpIIIa 33LeuPro
33ProPro
807CC
GpIa 807CТ
807TT
I (0) n=66 0,6 0,3 0,1 0,55 0,35 0,1 II (A) 0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 0,4 n=46 р<0,05 р<0,05 р<0,05 р<0,05 III (B) 0,73 0,27 0 0,5 0,4 0,1 n=36 Примечание: χ2-тест, р – достоверность различий по сравнению с I (0) группой крови.
Таким образом, все полученные данные позволяют говорить о том, что функции кровяных пластинок как в норме, так и при патологии зависят от полиморфизма генов GpIa (C807-T), GpIIIa (Leu33-Pro) и групповой принадлежности крови по системе АВ0. При этом, учитывая общность адгезивных молекул, способствующих реализации функции лимфоцитарно-
19
тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов (Солпов А.В., 2005), правомерно говорить о конкуренции за сайты связывания. Исход такого конкурентного взаимодействия зависит от конкретной физиологической или патофизиологической ситуации. Так, если у здоровых лиц тромбогенность «ненулевых» групп крови проявляется усилением агрегации тромбоцитов и снижением их адгезивности к лимфоцитам, то при воспалении происходит сдвиг в сторону образования лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов. Генетические маркеры изменения функций тромбоцитов вместе с групповой принадлежностью крови по системе АВ0 позволяют прогнозировать исход реакций воспаления при патологии, а также вероятность тромботического риска у здоровых лиц. ВЫВОДЫ 1. Здоровые лица обладатели «ненулевых» групп крови характеризуются
усилением агрегационного потенциала кровяных пластинок на фоне снижения их способности к формированию гетеротипических межклеточных контактов. Протромботические мутантные варианты генов GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro), а также их сочетание чаще выявляются у здоровых людей со II (A) группой крови, способствуя усилению агрегационной функции тромбоцитов. 2. У больных гриппом A(H1N1)/2009 усилена функция лимфоцитарно-
тромбоцитарной адгезии и спонтанная агрегация тромбоцитов по сравнению со здоровыми лицами, при этом активность кровяных пластинок у них выше при I (0) группе крови. 3. Частоты встречаемости полиморфных вариантов генов GpIa (C807-T)
и GpIIIa (Leu33-Pro) у больных гриппом A (H1N1)/2009 не отличаются от группы здоровых лиц. Аномальные генотипы тромбоцитарных
20
рецепторов и их сочетание чаще выявляются у больных со II (A) группой крови. 4. Аномальные варианты генов GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro) и их
сочетание у больных гриппом A (H1N1)/2009 обусловливают усиление адгезивности
тромбоцитов
на
лимфоцитах,
что
приводит
к
уменьшению процента лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов в циркуляции и способствует ослаблению агрегации пластинок in vitro. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гергесова Е.Е. Функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии,
агрегация тромбоцитов и группы крови / Е.Е. Гергесова, Ю.А. Витковский, В.М. Черепанов // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины : тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 55-летию ЧГМА. – Чита, 2008. – С. 174-175. 2. Степень
лимфоцитарно-тромбоцитарной
адгезии
зависит
от
количества тромбоцитов и имеет особенности у лиц с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 / Е.Е. Гергесова, Ю.А. Витковский, А.М. Гринь, И.В. Осипов // VI Сибирский физиологический съезд : тезисы докладов. – Барнаул, 2008. – С. 91-92. 3. Новый подход к определению ЛТА / Е.Е. Гергесова, Ю.А. Витковский,
А.М. Гринь, И.В. Осипов // VI Сибирский физиологический съезд : тезисы докладов. – Барнаул, 2008. – С. 92. 4. Гергесова Е.Е. Лимфоциты, тромбоциты и группы крови / Е.Е.
Гергесова // Медицинские аспекты состояния здоровья : материалы I международной
интернет-конференции
«Состояние
здоровья: 21
медицинские и психологические аспекты». – Чита-Славянск, 2009. – С. 138-139. 5. Гергесова
Е.Е.
Группы
крови,
агрегация
тромбоцитов
и
лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия / Е.Е. Гергесова // Тромбоз, гемостаз и реология. – 2009. - №3. – С. 37-42. 6. Гергесова
Е.Е.
Лимфоцитарно-тромбоцитарная
тромбоцитарно-лейкоцитарные,
адгезия,
тромбоцитарно-лимфоцитарные
отношения и агрегация тромбоцитов у мужчин и женщин в зависимости от групповой принадлежности крови / Е.Е. Гергесова // Кубанский научный медицинский вестник. – 2009. - №7. – С. 38-41. 7. Гергесова Е.Е. Полиморфизм генов тромбоцитарного рецептора
фибриногена
GpIIIa
(Leu33Pro),
тромбоцитарного
рецептора
коллагена GpIa (C807T) и молекулы дифференциации тромбоцитов CD14 (С159Т) у пациентов с осложненным течением пандемического гриппа A (H1N1)/2009 / Е.Е. Гергесова, А.А. Петров // Итоги эпидемии гриппа A (H1N1) : материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Чита, 2010. – С. 121-123. 8. Гергесова Е.Е. Полиморфизм генов тромбоцитарного рецептора
фибриногена
GpIIIa
(Leu33Pro)
и
тромбоцитарного
рецептора
коллагена GpIa (C807T) у пациентов с осложненным течением пандемического гриппа A (H1N1)/2009 и различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 / Е.Е. Гергесова // Итоги эпидемии гриппа A (H1N1) : материалы Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием. – Чита, 2010. – С. 123-125. 9. Гергесова Е.Е. Функции тромбоцитов, полиморфизм генов Leu33-Pro
GpIIIa, C807-T GpIa и система АВ0 в норме и патологии / Е.Е. 22
Гергесова // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии : материалы пятой Всероссийской конференции (с международным участием). – Москва, 2011. – С. 129-130. 10. Гергесова
Е.Е.
Агрегация
тромбоцитов,
лимфоцитарно-
тромбоцитарная адгезия и группы крови АВ0 у больных гриппом A(H1N1) / Е.Е. гергесова, Ю.А. Витковский, А.В. Солпов // Забайкальский медицинский вестник. – 2011. - № 1. 11. Гергесова Е.Е. Функции тромбоцитов и генетический полиморфизм
GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro) у здоровых лиц обладателей разных групп крови АВ0 / Е.Е. Гергесова, Н.Н. Страмбовская, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник. – 2011. - № 1. 12. Kuznik B.I. Clinical use of the test of lymphocyte-platelet adhesion / B.I.
Kuznik, A.V. Solpov, E.E. Gergesova et al. // The Journal of Thrombosis and Haemostasis. – 2007. - №5. – suppl. 2. – P. W-303. 13. Gergesova E. The carriage of α2(C807T) integrin and β3(Leu33Pro)
integrin polymorphisms in healthy persons with different AB0 blood groups / E. Gergesova, Y. Vitkovsky // Vox Sanguinis. – 2010. - №99. – suppl. 2. – P. 24. 14. Solpov A. Lymphocyte-platelet adhesion in A H1N1 infected patients / A.
Solpov, E. Gergesova, N. Strambovskaya et al. // Abstracts from the XXXIII World Congress of the International Society of Hematology. – Jerusalem. – 2010. – P. 79.
23