Gergesova

На правах рукописи

Гергесова Екатерина Евгеньевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ GPIIIa (Leu33-Pro), GPIa (C807-T) И ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ У ЛИЦ С РАЗНЫМИ ГРУППАМИ КРОВИ АВ0 В НОРМЕ И ПРИ ГРИППЕ А(H1N1)2009 03.03.01 - физиология 14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Чита - 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Витковский Юрий Антонович Доктор медицинских наук, профессор Кузник Борис Ильич Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Цыбиков Намжил Нанзатович Кандидат медицинских наук Герасимов Александр Александрович Ведущая организация: ФГУ «Российский НИИ Гематологии Минздравсоцразвития РФ», г. Санкт-Петербург

и

трансфузиологии

Защита состоится «____» ____________ 2011 года в 9.00 на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГОУ ВПО ЧГМА Минздравсоцразвития РФ, 672000, г.Чита, ул. Горького, 39 а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ЧГМА Минздравсоцразвития РФ. Автореферат разослан «______» апреля 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор

И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

2

Актуальность проблемы. В настоящее время не вызывает сомнений существование единой клеточно-гуморальной системы защиты организма, объединяющей иммунитет и гемостаз (Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., 1989-2005; Витковский Ю.А., 2000-2010), одним из способов реализации

свойств

которой является функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (Солпов А.В., 2005). Изучена молекулярная база этого взаимодействия (Витковский Ю.А., Кузник Б.И., 2002; Solpov A.et al., 2002; Солпов А.В., 2005; Li N., 2008), накоплены данные о роли ЛТА в патогенезе различных заболеваний (Витковский Ю.А. и совт., 2007; Батаева Е.П., Витковский Ю.А., 2007; Емельянова А.Н., Витковский Ю.А., 2009 и др.). Однако к настоящему моменту нет данных о возможных генных механизмах регуляции этой физиологической функции, существование которых, тем не менее, бесспорно. Показатель ЛТА, особенно лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ), отражающий

адгезивность

тромбоцитов

на

лимфоцитах,

позволяет

характеризовать функциональное состояние кровяных пластинок, чему в доступной

литературе

уделено

сравнительно

недостаточно

внимания.

Функции же тромбоцитов зависят как от генетических (Newman P.J.et a1., 1989; Lane D.A., Grant P.J., 2000; Michelson A.D. et al., 2000; Weiss E.J. et al., 1996 и др.), так и от некоторых конституциональных факторов, например групп крови АВ0 (Wiggins K.L. et al., 2006; Garcia A.A. et al., 2006; Sousa N.C. et al., 2007; Jenkins P.V., O,Donnell J.S., 2006; Boven D.J., 2003). В свою очередь, функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в норме у лиц с различной групповой принадлежностью крови АВ0 не изучалась. Кроме того, несомненным

является

участие

тромбоцитов

в

реакциях

как

неспецифического, так и специфического (вирусного, бактериального) воспаления (Hansson G.K., 2005; Shiraki R. Et al., 2004; Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004; Cognasse F. Et al., 2005; Fitzgerald J. R. Et al., 2006 и

3

др.), однако, эти реакции не изучены с позиций конституциональной тромбогенности «ненулевых» групп крови АВ0. Таким образом, представляется интересным изучить особенности функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов в связи с генетическими особенностями тромбоцитарных рецепторов у лиц с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 как в норме, так и в условиях воспаления. Целью

работы

явилось

изучение

роли

полиморфизмов

генов

тромбоцитарного рецептора фибриногена GpIIIa (интегрина в3) (Leu33-Pro), тромбоцитарного рецептора коллагена GpIa (интегрина б2) (C807-Т) и системы АВ0 в регуляции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов у здоровых лиц и больных гриппом А(H1N1)2009. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Оценить состояние функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов у здоровых лиц с различной групповой принадлежностью

крови

по

системе

АВ0.

Выявить

частоту

встречаемости полиморфных вариантов генов тромбоцитарного рецептора

фибриногена

GPIIIa

(интегрина

β3)

(Leu33-Pro)

и

тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) у здоровых лиц с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0. Проследить влияние носительства полиморфных вариантов изучаемых генов на функции тромбоцитов.

2. Исследовать состояние функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов у больных гриппом A(H1N1)2009 с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0. Сравнить

функцию

лимфоцитарно-тромбоцитарной

адгезии

и

4

агрегацию тромбоцитов у здоровых лиц и больных гриппом A(H1N1)2009.

3. Выявить частоту встречаемости полиморфных вариантов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) у больных гриппом A(H1N1)2009 с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0.

4. Оценить функцию лимфоцитарно-тромбоцитарной агрегации

тромбоцитов

у

больных-носителей

адгезии

и

полиморфных

вариантов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т). Научная новизна. Впервые установлено, что у здоровых лиц с «ненулевыми»

группами

крови

снижена

способность

тромбоцитов

образовывать коагрегаты с лимфоцитами. У больных гриппом A(H1N1)2009 повышается лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия, что не зависит от группы крови АВ0. У больных с гриппом A(H1N1)2009 спонтанная агрегация тромбоцитов повышается, а индуцированная снижается, особенно у лиц с I (0) группой крови. Впервые выявлено, что среди здоровых лиц аномальные варианты гена тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) чаще встречаются у обладателей «ненулевых» групп крови. Гетерозиготный вариант гена тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) 33LeuPro чаще обнаруживается у женщин с «ненулевыми» группами крови, чем у мужчин. Сочетание мутантных генотипов тромбоцитарных рецепторов чаще встречается у обладателей II (A) группы крови, причем у мужчин реже,

5

чем у женщин. Функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии усилена у здоровых GpIIIa 33LeuPro гетерозигот со II (A) группой крови. Впервые

показано,

что

распределение

частот

встречаемости

полиморфных вариантов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) практически не различается среди здоровых лиц и больных гриппом А(H1N1)2009. У больных-носителей гомозиготного 807ТТ генотипа тромбоцитарного рецептора коллагена

GPIа (интегрина α2)

способность тромбоцитов взаимодействовать с лимфоцитами усиливается, а спонтанная и коллаген-индуцированная агрегация снижается. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные сведения о генетическом полиморфизме адгезивных молекул углубляют представление

о

механизмах

лимфоцитарно-тромбоцитарной

адгезии,

агрегации тромбоцитов у здоровых лиц и в патогенезе гриппа A(H1N1)2009. Данные о связи полиморфизма адгезивных молекул и системы АВ0 могут быть включены в генетический паспорт индивидуума и совместно с другими

полиморфизмами

использоваться

для

прогнозирования

тромботического риска у лиц с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0. Внедрение в практику. Сведения об особенностях тромбоцитарных функций, зависящих от генетических и конституциональных факторов, внедрены в учебный процесс кафедр нормальной и патологической физиологии, гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия», в работу НИИ медицинской экологии ЧГМА.

6

Апробация диссертации. Основные положения работы доложены на: VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), Всероссийской научнопрактической

конференции,

посвященной

55-летию

Читинской

государственной медицинской академии (Чита, 2008), I Международной научно-практической

интернет-конференции

«Состояние

здоровья:

медицинские и психологические аспекты» (Чита-Славянск, 2009), XXXIII Мировом конгрессе Международного общества гематологии (Иерусалим, Израиль,

2010),

XI

Европейском

симпозиуме

по

иммунобиологии

тромбоцитов и гранулоцитов (Бон, Франция, 2010), Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Итоги эпидемии гриппа

A(H1N1)»

(Чита,

2010),

заседании

Читинского

отделения

физиологического общества имени И.П. Павлова (Чита, 2010). По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ. Основные положения, выносимые на защиту: 1.

Частоты

встречаемости

полиморфных

вариантов

гена

тромбоцитарного рецептора фибриногена GрIIIa (Leu33-Pro) не имеют особенностей у здоровых обладателей разных групп крови АВ0. Гомозиготный мутантный вариант 807ТТ коллагенового рецептора GpIa тромбоцитов чаще встречается у здоровых лиц со II (A) группой крови, а нормальный 807СС вариант гена GpIa обнаруживается реже. Частота встречаемости сочетания мутантных гентипов GpIIIa и GpIa выше у женщин и у лиц со II (A) группой крови.

2. Агрегационная

функция

тромбоцитов

и

лимфоцитарно7

тромбоцитарная адгезия зависят от групп крови АВ0, тромбогенные свойства которых определяются в том числе и полиморфизмом генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GpIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GpIa (интегрина α2) (C807-T).

3.

Частоты встречаемости полиморфных вариантов генов GpIIIa

(Leu33-Pro) и GpIa (C807-T) у больных гриппом A(H1N1)/2009 не отличаются от здоровых лиц. При гриппе A(H1N1)2009 усиливается функция

лимфоцитарно-тромбоцитарной

спонтанной агрегации

агрегации кровяных

тромбоцитов. пластинок

адгезии

и

скорость

Скорость

индуцированной

снижается.

Тромбогенность

«ненулевых» групп крови при гриппе A(H1N1)2009 проявляется увеличением адгезивности тромбоцитов на лимфоцитах. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, глав результатов собственных

исследований,

обсуждения

полученных

результатов,

выводов и указателя литературы, включающего 216 работ, из них – 59 отечественных и 157 зарубежных авторов, иллюстрирована 38 таблицами и 3 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые

Хельсинкской

Декларацией

Всемирной

Медицинской

Ассоциации, World Medical Association Declaration of Helsinki (1964).

8

Объектами наблюдения явились: стабилизированная 3,8% раствором цитрата натрия кровь здоровых людей в возрасте 18–35 лет (322 образца) и больных гриппом в период эпидемии А(H1N1)/09 (200 образцов). Методы исследования Методы изучения функций тромбоцитов: Подсчет тромбоцитов и лейкоцитов проводился в камере Горяева с использованием общепринятых методик. окрашенных

Число лимфоцитов определяли в фиксированных мазках, азур-II-эозином

по

Романовскому-Гимзе.

Определение

показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии проводили по методике Ю.А. Витковского (1999), лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ) оценивали

как

среднее

арифметическое

количество

тромбоцитов,

присоединившихся к одному лимфоциту. Оценку агрегационной способности тромбоцитов осуществляли турбидиметрическим методом по G. Born (1962) с помощью лазерного анализатора агрегации Biola (НПФ «Биола», Москва): исследовали спонтанную, АДФ-, адреналин- и коллаген-индуцированную агрегацию с использованием соответствующих реактивов, выпускаемых ООО «Технология-стандарт» (Барнаул). Определение групп крови АВ0: группы крови АВ0 определялись общепринятым методом с использованием реакции изогемагглютинации на планшете при помощи цоликлонов анти-А и анти-В (ООО «Гематолог», Россия, Москва). Молекулярно-генетическое исследование: выделение ДНК из цельной крови и постановка ПЦР с целью выявления мутаций генов GpIIIa (Leu33Pro) и GpIa (C807-T) проводились с использованием соответствующих наборов, выпускаемых НПФ «Литех» (Москва). Детекция продуктов

9

амплификации осуществлялась путем горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле. Статистическая обработка результатов выполнена параметрическими и непараметрическими методами с использованием пакета программ Microsoft Office Excel 2007, STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc., США), с определением статистической значимости различий при p<0,05. Изучаемые показатели

представлены

в

виде

средних

величин

со

стандартным

отклонением (M±SD). При нормальном распределении признака применялся критерий Стьюдента (t-тест), при распределении, отличном от нормального – критерий Манна–Уитни (U-тест). Для сравнения групп по качественному бинарному признаку применялся критерий

2

(Пирсона). Для оценки

статистической значимости между группами признаков использовался коэффициент ранговой корреляции

Спирмена,

значимым

признавался

результат rs>0,3 при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Распространенность полиморфных вариантов генов GpIIIa (Leu33-Pro) и GpIa (C807-T) у здоровых лиц с разными группами крови АВ0 и функции тромбоцитов. В группе здоровых лиц обнаружено 135 нормальных 33LeuLeu-гомозигот (R=0,68) тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3), 42 носителя 33LeuPro гетерозиготного генотипа (R=0,21), 23 мутантные 33ProPro-гомозиготы (R=0,11). Полиморфные варианты тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) распределились следующим образом: 105 нормальных 807CC-гомозигот (R=0,53), 46 носителей 807CТ 10

гетерозиготного варианта (R=0,23) и 49 мутантных 807ТT-гомозигот (R=0,24). Среди испытуемых обладатели I (0) группы крови составили 36%, II (А) – 30%,

III (B) – 26% и IV (AB) – 8%. Полученные о группах крови данные

соответствуют сведениям, имеющимся в литературе для Европейской части России (Томилин В.В., Гуртовая С.В., 1999; Жибурт Е.Б., 2002; Кузник Б.И., Максимова О.Г., 2007). По причине малого количества испытуемых обладатели IV(AB) группы из наблюдений были исключены. Обнаружено, что частоты встречаемости полиморфных вариантов гена тромбоцитарного рецептора фибриногена GрIIIa (интегрина β3) у обладателей разных групп крови не различались, в то время как частота встречаемости гомозиготного мутантного варианта 807ТT коллагенового рецептора тромбоцитов интегрина α2 оказалась выше у обладателей второй группы крови по сравнению с первой. Вместе с тем носительство нормального гомозиготного генотипа обнаружилось у них реже (рис.1).

60 50 40 30

*

*

I (0) II (A) III (B)

20 10 0 GpIa 807CC

GpIa 807CT

GpIa 807TT

Рис.1. Частота встречаемости (%) полиморфных вариантов гена GpIa (С807-Т) у здоровых лиц с разными группами крови АВ0, % (χ2 – тест, * р<0,05), n=200.

11

Среди носителей сочетания мутаций тромбоцитарных рецепторов преобладали лица со II (A) группой крови (табл.1). Сочетанные мутации у женщин встречались чаще, чем у мужчин (табл.2). Таблица 1 Частота встречаемости (R) разных групп крови АВ0 у здоровых лиц носителей сочетания мутантных аллелей тромбоцитарных рецепторов GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro) I (0) n=7 0,13

II (A) III (B) n=9 n=8 0,23 0,09 р<0,05 Примечание: χ2-тест, р – статистическая значимость различий по сравнению с первой группой крови. Таблица 2 Частота встречаемости (R) сочетания мутантных аллелей тромбоцитарных рецепторов GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro) у здоровых мужчин и женщин с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 I (0)

II (A)

III (B)

Муж

Жен

Муж

Жен

Муж

Жен

n=24 0,08

n=38 0,16

n=32 0,13

n=48 0,25

n=16 0,13

n=22 0

Р1<0,05

р<0,05

Р1<0,05 Примечание: χ2-тест, р – статистическая значимость различий по сравнению с первой группой крови в пределах одного пола, р 1 – статистическая значимость гендерных различий.

В следующей серии исследований установлено, что у людей со II (A) и III (В) группами крови содержание тромбоцитов выше, чем с I (0), хотя не выходит за пределы референтных значений. Вместе с тем абсолютное содержание присоединившихся к лимфоцитам тромбоцитов в 1 мкл оказалось меньше у лиц с III (В) группой крови (табл. 3).

12

Таблица 3 Число тромбоцитов ЛТА и ЛТИ у обладателей разных групп крови по системе АВ0 (MSD) Группы крови

Число

ЛТА

ЛТА (в 1

ЛТИ

Число тромбоцитов,

тромбоцитов

(%)

мкл

Абсолютное

присоединившихся к

крови)

число

лимфоцитам в 1 мкл

(тысяч в 1 мкл крови)

крови

I (0)

205±5

13±2,5

298±19

3,1±0,2

1068±79

(n=41) II (A)

243±8

15±2,7

337±21

2,9±0,2

962±66

(n=38) III (B)

р<0,01 231±9

15±2,8

317±22

3,3±0,2

824±65

(n=33) р<0,01 р<0,05 Примечание: t-тест, р – статистическая значимость различий по сравнению с I (0) группой крови.

Скорость спонтанного образования тромбоцитарных агрегатов оказалась увеличена у здоровых лиц со II (А) группой крови (средний радиус агрегатов в I (0) группе 1,1±0,1отн.ед., во II (A) – 1,4±0,1отн.ед.; скорость их образования в I (0) группе 0,4±0,1 отн.ед./мин., во II (A) – 0,7±0,1; t-тест, р<0,05). Кроме того, у обладателей II (А) и III (В) групп, по сравнению с I (0), агрегация оказалась повышенной, если в качестве лиганда использовался коллаген (средний радиус агрегатов в I, II и III группах соответственно 6,7±2,5, 7,3±1,9 и 8,5±1,6 отн.ед.; скорость их образования 19,1±4,7, 15,9±3,2 и 24,6±5,2 отн.ед./мин.; по показателю светопропускания - 53,5±11,8, 73,4±12,0 и 66,1±14,1%; 65,9±15,5, 85,7±15,0 и 92,0±15,6%/мин.; t-тест, р<0,05).

13

Обнаружено, что у здоровых лиц носителей мутантного гомозиготного 807ТТ генотипа GpIa ослаблена способность тромбоцитов взаимодействовать с

лимфоцитами

(ЛТИ),

в

то

время

как

процент

лимфоцитарно-

тромбоцитарных коагрегатов в циркуляции не зависит от генетического полиморфизма

коллагенового

рецептора

тромбоцитов.

Кроме

того,

гетерозиготный генотип не оказывает влияния на функцию лимфоцитарнотромбоцитарной адгезии (табл.4). При этом скорость спонтанной агрегации кровяных пластинок оказалась выше у здоровых лиц носителей 807ТT варианта (скорость спонтанного образования агрегатов из тромбоцитов у 807СC-гомозигот,

807СТ-гетерозигот

и

807ТT-гомозигот

составила

соответственно 0,3±0,1, 0,3±0,1 и 0,7±0,2 отн.ед./мин; U-тест, р<0,05). Тромбоциты реагировали сильнее на коллаген у носителей гетерозиготного генотипа (средний радиус образующихся при индукции коллагеном агрегатов из тромбоцитов у 807СС-гомозигот, 807СТ-гетерозигот и 807ТТ-гомозигот соответственно 6,6±3,7, 8,1±3,9, 6,5±2,2 отн.ед., скорость их образования 18,4±11,9, 26,3±7,9, 19,2±6,0 отн.ед./мин.; U-тест, р<0,05). Вместе с тем, у здоровых носителей 33ProPro генотипа GpIIIa увеличивается средний размер и скорость спонтанно образующихся агрегатов из тромбоцитов (средний радиус агрегатов у 33LeuLeu-гомозигот, 33LeuPro-гетерозигот и 33LeuLeuгомозигот соответственно составил 1,0±0,4; 1,1±0,2 и 1,6±0,5 отн.ед., скорость их образования - 0,1±0,1, 0,2±0,1 и 0,5±0,2 отн.ед./мин.; U-тест, р<0,05).

Таблица 4 Функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у здоровых лиц носителей полиморфных вариантов гена GpIa (С807-Т) (M±SD) ЛТА, %

GpIa (807CС) 14,3±4,4

GpIa (807CT) 14,6±2,1

GpIa (807TТ) 14,3±3,9 14

ЛТИ, отн.ед.

4,1±1,0

3,6±0,7

2,6±1,1

р<0,05 Примечание: U-тест, р – статистическая значимость различий по сравнению с группой носителей нормального гомозиготного 807С варианта.

Сочетание мутантных генотипов GpIa 807CT, 807TТ и GpIIIa 33LeuPro, 33ProPro приводило к увеличению размера спонтанно образующихся агрегатов из тромбоцитов (рис. 2).

2

*

1,5

без сочетания мутаций

1

носители сочетанных мутаций

0,5 0 степень агрегации

Рис.2. Максимальное значение среднего размера спонтанно образующихся агрегатов из тромбоцитов, отн.ед. (U-тест, * - р<0,05).

2. Функции тромбоцитов и полиморфизм генов GpIa (C807-T) и

GpIIIa (Leu33-Pro) у больных гриппом А(H1N1)/2009 и различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0. Оценка состояния функции лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов у больных гриппом в период эпидемии А(H1N1)/2009 выявила, что индекс адгезивности тромбоцитов на лимфоцитах (ЛТИ) в группе больных выше, чем у здоровых (рис. 3), в то время как скорость

15

спонтанного образования агрегатов из тромбоцитов у больных оказывается выше, а скорость ответа на индукторы - ниже (табл. 5).

*

4 3,5 3 2,5 2

здоровые больные

1,5 1 0,5 0 ЛТИ, отн.ед.

Рис.3. Лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс у здоровых и больных гриппом А(H1N1)2009 (U-тест, * - р<0,05). Таблица 5 Максимальный радиус агрегатов (отн.ед.) и максимальный наклон (отн.ед.в мин.) кривых агрегации тромбоцитов у здоровых лиц и больных гриппом А(H1N1)2009 (M±SD) Здоровые

Больные

Макс. значение Макс. наклон

(n=122) 1,2±0,2 0,4±0,3

(n=100) 1,4±0,6 0,7±0,4

Макс. значение Макс. наклон

8,7±2,6 25,7±2,1

р<0,05 7,9±2,5 18,9±2,4

Макс. значение

7,3±3,6

р<0,05 6,4±2,5

Макс. наклон

12,9±3,9

8,4±3,7

Макс. значение Макс. наклон

7,9±2,7 19,2±4,4

р<0,05 6,8±2,8 16,5±4,6

спонтанная

АДФ

адреналин

коллаген

р<0,05

16

Примечание: t-тест, Р – статистическая значимость различий между больными и здоровыми.

Показатели спонтанной агрегации кровяных пластинок оказались выше у больных с I (0) группой крови по сравнению со II (A) (максимальный радиус агрегатов 1,6±0,1отн.ед., во II и III группах соответственно 1,2±0,1 и 1,4±0,2; t-тест, р<0,05). Вместе с тем скорость наступления индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов была снижена у пациентов с III (B) группой крови (максимальный наклон кривых агрегации в I, II и III группах соответственно 19,9±5,9, 22,7±4,9, 14,6±3,4 отн.ед./мин.; t-тест, р<0,05). В

следующей серии исследований

в группе больных гриппом

А(H1N1)/2009 обнаружено 140 нормальных 33LeuLeu-гомозигот (R=0,7) гена тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3), 47 носителей 33LeuPro

гетерозиготного

варианта

(R=0,24),

13

мутантных33ProPro-

гомозигот (R=0,06). Полиморфные варианты гена тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) распределились следующим образом: 95 нормальных

807CC-гомозигот

(R=0,48),

71 носитель

807CТ

гетерозиготного генотипа (R=0,36) и 34 мутантные 807ТT-гомозиготы (R=0,16), что не отличается от распределения частот в группе здоровых лиц (χ2-тест,

р≥0,05).

При

этом

показатели

спонтанной

и

коллаген-

индуцированной агрегации кровяных пластинок были меньше у больных носителей мутантного 807ТT генотипа GpIa, а у 807СТ-гетерозигот скорость коллаген-индуцированной агрегации оказалась выше (табл.6). Адгезивность тромбоцитов на лимфоцитах усиливалась у больных носителей мутантного 807ТТ-генотипа

GpIa

(табл.

7).

Сочетание

мутантных

аллелей

тромбоцитарных рецепторов у больных приводило к уменьшению процента лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов в циркуляции (ЛТА в группе пациентов-носителей

сочетанных

мутаций

12,1±9,8%,

в

группе

без 17

сочетанных мутаций – 17,6±9,2%; U-тест, р<0,05) и размера, а также скорости спонтанного образования агрегатов из тромбоцитов (максимальное значение радиуса агрегатов в группе больных носителей сочетанных мутаций 1,0±0,3 отн.ед., в группе без сочетанных мутаций - 1,7±0,4 отн.ед.; максимальный наклон кривых агрегации соответственно 0,3±0,2 отн.ед./мин. и 0,9±0,2 отн.ед./мин.; U-тест, р<0,05). Таблица 6 Максимальный радиус агрегатов (отн. ЕД) и максимальный наклон (отн.ед.в мин.) кривых спонтанной и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов у больных носителей полиморфных вариантов тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) (MSD)

спонтанная

807СC n=95 1,4±0,8

807CТ n=71 1,4±0,7

0,6±0,3

0,7±0,4

807ТT n=34 1,2±0,7 р<0,05 0,6±0,3

6,7±2,1

7,0±4,4

6,3±2,4

Макс.знач. Макс.накл.

коллаген

Макс.знач.

16,1±8,0

19,4±8,1 12,8±10,1 Макс.накл. р<0,05 р<0,05 Примечание: U-тест, Р – статистическая значимость различий с группой носителей гомозиготного 807СС генотипа.

Таблица 7 ЛТА (%) и ЛТИ (отн.ед) у больных носителей полиморфных вариантов тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) (MSD)

ЛТА

807СC n=95 16,5±9,6

807CT n=71 16,2±8,6

807ТT n=34 17,1±10,5

ЛТИ

3,1±0,9

3,9±1,6

6,2±2,7 Р<0,05 18

Примечание: U-тест, Р –статистическая значимость различий с группой носителей гомозиготного 807СС генотипа.

Частота встречаемости разных групп крови АВ0 в группе больных гриппом А(H1N1)/2009 не отличалась от группы здоровых лиц (χ2-тест, р≥0,05). Обнаружено, что аномальный 33ProPro-вариант гена GPIIIa чаще встречается у больных со II (A) группой крови, также как и гомозиготный мутантный 807ТT генотип тромбоцитарного рецептора коллагена GPIa (табл.

8). При этом среди носителей сочетанных мутаций тромбоцитарных рецепторов преобладают больные со II (A) группой крови (частота встречаемости I, II и III групп соответственно 0,15, 0,34 и 0,1; χ2-тест, р<0,05). Таблица 8 Частота встречаемости (R) полиморфных вариантов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена GPIIIa (интегрина β3) (Leu33-Pro) и тромбоцитарного рецептора коллагена GPIа (интегрина α2) (С807-Т) в группе больных гриппом А(H1N1)2009 с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 33LeuLeu

GpIIIa 33LeuPro

33ProPro

807CC

GpIa 807CТ

807TT

I (0) n=66 0,6 0,3 0,1 0,55 0,35 0,1 II (A) 0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 0,4 n=46 р<0,05 р<0,05 р<0,05 р<0,05 III (B) 0,73 0,27 0 0,5 0,4 0,1 n=36 Примечание: χ2-тест, р – достоверность различий по сравнению с I (0) группой крови.

Таким образом, все полученные данные позволяют говорить о том, что функции кровяных пластинок как в норме, так и при патологии зависят от полиморфизма генов GpIa (C807-T), GpIIIa (Leu33-Pro) и групповой принадлежности крови по системе АВ0. При этом, учитывая общность адгезивных молекул, способствующих реализации функции лимфоцитарно-

19

тромбоцитарной адгезии и агрегации тромбоцитов (Солпов А.В., 2005), правомерно говорить о конкуренции за сайты связывания. Исход такого конкурентного взаимодействия зависит от конкретной физиологической или патофизиологической ситуации. Так, если у здоровых лиц тромбогенность «ненулевых» групп крови проявляется усилением агрегации тромбоцитов и снижением их адгезивности к лимфоцитам, то при воспалении происходит сдвиг в сторону образования лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов. Генетические маркеры изменения функций тромбоцитов вместе с групповой принадлежностью крови по системе АВ0 позволяют прогнозировать исход реакций воспаления при патологии, а также вероятность тромботического риска у здоровых лиц. ВЫВОДЫ 1. Здоровые лица обладатели «ненулевых» групп крови характеризуются

усилением агрегационного потенциала кровяных пластинок на фоне снижения их способности к формированию гетеротипических межклеточных контактов. Протромботические мутантные варианты генов GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro), а также их сочетание чаще выявляются у здоровых людей со II (A) группой крови, способствуя усилению агрегационной функции тромбоцитов.

2. У больных гриппом A(H1N1)/2009 усилена функция лимфоцитарно-

тромбоцитарной адгезии и спонтанная агрегация тромбоцитов по сравнению со здоровыми лицами, при этом активность кровяных пластинок у них выше при I (0) группе крови.

3. Частоты встречаемости полиморфных вариантов генов GpIa (C807-T)

и GpIIIa (Leu33-Pro) у больных гриппом A (H1N1)/2009 не отличаются от группы здоровых лиц. Аномальные генотипы тромбоцитарных

20

рецепторов и их сочетание чаще выявляются у больных со II (A) группой крови.

4. Аномальные варианты генов GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro) и их

сочетание у больных гриппом A (H1N1)/2009 обусловливают усиление адгезивности

тромбоцитов

на

лимфоцитах,

что

приводит

к

уменьшению процента лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов в циркуляции и способствует ослаблению агрегации пластинок in vitro. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гергесова Е.Е. Функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии,

агрегация тромбоцитов и группы крови / Е.Е. Гергесова, Ю.А. Витковский, В.М. Черепанов // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины : тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 55-летию ЧГМА. – Чита, 2008. – С. 174-175.

2. Степень

лимфоцитарно-тромбоцитарной

адгезии

зависит

от

количества тромбоцитов и имеет особенности у лиц с различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 / Е.Е. Гергесова, Ю.А. Витковский, А.М. Гринь, И.В. Осипов // VI Сибирский физиологический съезд : тезисы докладов. – Барнаул, 2008. – С. 91-92.

3. Новый подход к определению ЛТА / Е.Е. Гергесова, Ю.А. Витковский,

А.М. Гринь, И.В. Осипов // VI Сибирский физиологический съезд : тезисы докладов. – Барнаул, 2008. – С. 92.

4. Гергесова Е.Е. Лимфоциты, тромбоциты и группы крови / Е.Е.

Гергесова // Медицинские аспекты состояния здоровья : материалы I международной

интернет-конференции

«Состояние

здоровья: 21

медицинские и психологические аспекты». – Чита-Славянск, 2009. – С. 138-139.

5. Гергесова

Е.Е.

Группы

крови,

агрегация

тромбоцитов

и

лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия / Е.Е. Гергесова // Тромбоз, гемостаз и реология. – 2009. - №3. – С. 37-42.

6. Гергесова

Е.Е.

Лимфоцитарно-тромбоцитарная

тромбоцитарно-лейкоцитарные,

адгезия,

тромбоцитарно-лимфоцитарные

отношения и агрегация тромбоцитов у мужчин и женщин в зависимости от групповой принадлежности крови / Е.Е. Гергесова // Кубанский научный медицинский вестник. – 2009. - №7. – С. 38-41.

7. Гергесова Е.Е. Полиморфизм генов тромбоцитарного рецептора

фибриногена

GpIIIa

(Leu33Pro),

тромбоцитарного

рецептора

коллагена GpIa (C807T) и молекулы дифференциации тромбоцитов CD14 (С159Т) у пациентов с осложненным течением пандемического гриппа A (H1N1)/2009 / Е.Е. Гергесова, А.А. Петров // Итоги эпидемии гриппа A (H1N1) : материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. – Чита, 2010. – С. 121-123.

8. Гергесова Е.Е. Полиморфизм генов тромбоцитарного рецептора

фибриногена

GpIIIa

(Leu33Pro)

и

тромбоцитарного

рецептора

коллагена GpIa (C807T) у пациентов с осложненным течением пандемического гриппа A (H1N1)/2009 и различной групповой принадлежностью крови по системе АВ0 / Е.Е. Гергесова // Итоги эпидемии гриппа A (H1N1) : материалы Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием. – Чита, 2010.

– С. 123-125.

9. Гергесова Е.Е. Функции тромбоцитов, полиморфизм генов Leu33-Pro

GpIIIa, C807-T GpIa и система АВ0 в норме и патологии / Е.Е.

22

Гергесова // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии : материалы пятой Всероссийской конференции (с международным участием). – Москва, 2011. – С. 129-130.

10. Гергесова

Е.Е.

Агрегация

тромбоцитов,

лимфоцитарно-

тромбоцитарная адгезия и группы крови АВ0 у больных гриппом A(H1N1) / Е.Е. гергесова, Ю.А. Витковский, А.В. Солпов // Забайкальский медицинский вестник. – 2011. - № 1.

11. Гергесова Е.Е. Функции тромбоцитов и генетический полиморфизм

GpIa (C807-T) и GpIIIa (Leu33-Pro) у здоровых лиц обладателей разных групп крови АВ0 / Е.Е. Гергесова, Н.Н. Страмбовская, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник. – 2011. - № 1.

12. Kuznik B.I. Clinical use of the test of lymphocyte-platelet adhesion / B.I.

Kuznik, A.V. Solpov, E.E. Gergesova et al. // The Journal of Thrombosis and Haemostasis. – 2007. - №5. – suppl. 2. – P. W-303.

13. Gergesova E. The carriage of α2(C807T) integrin and β3(Leu33Pro)

integrin polymorphisms in healthy persons with different AB0 blood groups / E. Gergesova, Y. Vitkovsky // Vox Sanguinis. – 2010. - №99. – suppl. 2. – P. 24.

14. Solpov A. Lymphocyte-platelet adhesion in A H1N1 infected patients / A.

Solpov, E. Gergesova, N. Strambovskaya et al. // Abstracts from the XXXIII World Congress of the International Society of Hematology. – Jerusalem. – 2010. – P. 79.

23