Karpova

На правах рукописи

Карпова Наталья Игоревна ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЙ ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА, СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА И МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ПРИ РЕСПИРАТОРНОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ЧАСТО БОЛЕЮЩИХ ДЕТЕЙ

14.03.03. – Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Чита – 2011

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России. Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Малежик Лидия Павловна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Бишарова Галина Ивановна

кандидат медицинских наук Ведущая организация:

Фефелова Елена Викторовна ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России.

Защита

состоится

диссертационного

22

совета

декабря Д

2011

208.118.01

года при

в

ГБОУ

9.00

на

ВПО

заседании «Читинская

государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 672090, г. Чита, ул. Горького, 39 а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_____» ______________2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

И.Н. Гаймоленко 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. К группе часто длительно болеющих относят детей с повторными респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), возникающими более 5-6 эпизодов в год (Беляков В.И. и др. 2001; Шерстобоев Е.Ю. и др. 2002; Самсыгина Г.А., Коваль Г.С. 2008; Аминова А.И. и др. 2009). Такие дети характеризуются повышенной восприимчивостью к инфекционным агентам. Ряд авторов (Железникова Г.Ф. 1995; Самсыгина Г.И., 2005, 2010; Ярцев М.Н. и др., 2006, Харламова Ф.С. и др., 2009) считает, что причиной тому является функциональная незрелость иммунной системы. Патогенетические

нарушения

в

системе

иммунитета

могут

формироваться в любом звене иммунного ответа. Нас интересовало состояние первого звена – рецепторов, воспринимающих действие патогена. К таким рецепторам

относятся

иммунокомпетентных

Toll

–

клетках

рецепторы, и

присутствующие

эпителиоцитах,

на

всех

контактирующих

с

инфекционными агентами. Структурные изменения в Toll-рецепторах возможны при полиморфизме генов, кодирующих эти рецепторы. В случае генетических аномалий осуществляется

неполноценный

контакт

рецептора

с

патогеном,

ограничивается внутриклеточная сигнализация и синтез медиаторов воспаления (Симбирцев А.С., Громов А.Ю., 2005). В настоящее время известно 10 разновидностей Toll-рецепторов у людей. Нас заинтересовал Toll-4, лигандом для которого является липополисахарид бактерий и ДНК вирусов и Toll-6, реагирующий на ЛПС грамотрицательных бактерий. Основываясь

на

инициирующей

роли

Toll-рецепторов

противоинфекционной защите, мы попытались связать их

в

генетические

дефекты с уровнем врожденного и приобретенного иммунитета у часто болеющих детей, а также состоянием системы гемостаза и степенью адгезивной

3

активности форменных элементов крови, определяющей реологические свойства крови и микроциркуляцию. Цель исследования: изучить состояние систем иммунитета, гемостаза, коагрегации

форменных

элементов

крови

при

респираторно-вирусных

инфекциях у часто болеющих детей, и выявить роль генетических аномалий Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов в их функционировании. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Выявить частоту встречаемости генетических дефектов Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов среди здоровых и часто болеющих детей.

2. Исследовать уровень врожденного и адаптивного иммунитета при ОРВИ у часто болеющих детей и оценить роль полиморфизма Toll-4(Asp299Gly) и Toll6 (Ser249Pro) рецепторов в функциональной активности элементов иммунной защиты.

3. Изучить состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза и коагуляционного потенциала при респираторно-вирусной инфекции, и выяснить влияние полиморфизма генов Toll-4(Asp299Gly)

и Toll-6(Ser249Pro)

рецепторов на

функции тромбоцитов и уровень гемостаза у обследуемых детей.

4. Определить адгезивные свойства лимфоцитов, эритроцитов и тромбоцитов при ОРВИ у часто болеющих детей и влияние полиморфизма генов Toll4(Asp299Gly)

и

Toll-6(Ser249Pro)

рецепторов на образование клеточных

ассоциаций. Научная новизна. Установлено, что одной из причин дисфункции в системе иммунитета у детей часто болеющих ОРВИ является генетический дефект в Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторах, воспринимающих действие патогена. Среди таких детей 55,6% являются носителями мутаций в Toll-4 и 75% в Toll-6 рецепторах. Предрасположены к частым заболеваниям ОРВИ дети-носители аллели G гена Toll-4(Asp299Gly) рецептора и аллели P гена Toll-6(Ser249Pro) рецептора. Выявлено, что генетические дефекты в Toll-4(Asp299Gly) и (Ser249Pro)

Toll-6

рецепторах обусловливают снижение противоинфекционной 4

защиты за счет несостоятельности врожденного иммунитета, ограничения синтеза иммуноглобулинов (sIgA, IgA, IgM, IgG

и его подклассов),

уменьшения количества провоспалительных цитокинов (IL-1β, ФНО-α, IL-8) и увеличения иммуносупрессирующих факторов – IL-10 и IL-1RA. Обнаружено, что гиперкоагуляция, развивающаяся при ОРВИ у часто болеющих детей более выражена при наличии аномалий в Toll-рецепторах. Агрегационная функция тромбоцитов изменяется в зависимости от состояния Toll-рецепторов. При мутациях в Toll-4(Asp299Gly) рецепторах индукторы агрегации (адреналин, АДФ, коллаген) усиливают агрегационную активность тромбоцитов; при аномалиях в Toll-6(Ser249Pro) рецепторах – уменьшают. У

детей

часто

болеющих

индуцированы

адгезивные

увеличением

числа

ОРВИ

свойства

при

очередном

форменных

элементов

лимфоцитарно-тромбоцитарных,

заболевании крови

с

эритроцитарно-

тромбоцитарных и эритроцитарно-лейкоцитарных коагрегатов в крови. При генетических дефектах в Toll-4 и Toll-6 рецепторах клеточные ассоциации выражены значительнее, чем у больных детей, не отягощенных мутациями в сигнальных рецепторах. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные о состоянии систем врожденного и адаптивного иммунитета, гемостаза и адгезивных свойств форменных элементов крови у часто болеющих детей с полиморфными вариантами генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов, позволят расширить представление о патогенетических особенностях течения ОРВИ при различной врожденной предрасположенности к респираторным заболеваниям. Проведенный анализ частоты встречаемости полиморфных вариантов генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов и выявление генетических маркеров ОРВИ позволит создать группу диспансерного наблюдения с индивидуальной профилактикой и лечением ОРВИ. Внедрение в практику. Теоретические положения, раскрываемые в диссертации внедрены в учебный процесс кафедры патологической физиологии и кафедры детских инфекций ГБОУ ВПО Читинская государственная 5

медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Апробация

диссертации.

Основные

положения

и

результаты

исследования доложены на: I Международной научно-практической интернетконференции «Состояние здоровья: медицинские и психологические аспекты» (Чита-Славянск,

2009), II Международной научно-практической интернет-

конференции «Состояние здоровья: медицинские и психологические аспекты» (Чита-Славянск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции посвященной 55-летию Читинской государственной медицинской академии (Чита,

2008),

VII

международной

конференции:

гемореология

и

микроциркуляция (Ярославль, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Итоги эпидемии гриппа А (H1N1)» (Чита, 2010), Научно-практической конференции с международным участием «Медицина - новое в теории и практике» (Шарджа, 2011). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из которых 2 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ. Основные положения, выносимые на защиту 1.

Среди детей с частыми заболеваниями ОРВИ выявлены генетические

дефекты в Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторах, регулирующих врожденный и адаптивный иммунитет. В 55,6% случаев отмечены мутации в генах кодирующих Toll-4 рецепторы и в 75% – в генах Toll-6 рецепторов. Подобные дефекты встречаются и среди здоровых детей, эпизодически болеющих респираторными инфекциями. Из них 17,1% являются носителями генетических дефектов в Toll-4 рецепторах и 65% в Toll-6 рецепторах.

2.

Выявленные аномалии в Toll-4 и Toll-6 рецепторах сказываются на

несостоятельности врожденного и адаптивного иммунитета. Иммунодефицит у детей с частыми эпизодами ОРВИ проявляется низкой фагоцитарной активностью, снижением концентрации провоспалительных цитокинов (IL-1β,

6

IL-8, ФНО-α) и повышенным содержанием иммуносупрессирующих факторов IL-10 и IL-1RA. Респираторно-вирусная инфекция у часто болеющих детей увеличивает синтез IgG, IgM и уменьшает содержание sIgA и IgA. Наличие генетических дефектов в Toll-рецепторах сопряжено с уменьшением синтеза отмеченных иммуноглобулинов по сравнению с группой больных детей, не являющихся носителями генетических мутаций.

3.

У детей в острый период при респираторных инфекциях в крови

развивается гиперкоагуляция, степень которой увеличивается при генетических изменениях в Toll-4 и Toll-6 рецепторах за счет большей концентрации фибриногена, РФМК и ингибиции фибринолиза. Агрегационная функция тромбоцитов зависит от состояния Toll-рецепторов. При генетических дефектах в Toll-4(Asp299Gly) рецепторах индукторы агрегации (адреналин, АДФ, коллаген) увеличивают агрегационные свойства тромбоцитов. При аномалиях в Toll-6(Ser249Pro) рецепторах – уменьшают.

4.

При ОРВИ у часто болеющих детей в крови индуцированы адгезивные

свойства форменных элементов крови с увеличением числа лимфоцитарнотромбоцитарных,

эритроцитарно-тромбоцитарных

и

лейкоцитарно-

эритроцитарных коагрегатов. При замене аллелей в генах Toll-4 и Toll-6 рецепторах клеточные ассоциации выражены значительнее, чем у больных детей без генетических аномалий. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания

материалов

и

методов

исследования,

главы

собственных

исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций, содержит 24 таблицы, иллюстрирована 7 рисунками. Указатель литературы включает 243 источника, из которых 156 отечественных и 87 зарубежных.

7

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые

Хельсинской

Декларацией

Всемирной

Медицинской

Ассоциации (World Medikal Association Declaraition of Helsinki 1964, 2000 ред.). Клиническое и лабораторное обследование проведено у 100 детей обоего пола в возрасте от 2 до 3 лет, поступивших в детскую инфекционную больницу г. Чита. Дети включались в группу часто болеющих детей на основании критериев, предложенных В.Ю. Альбицким и А.А. Барановым (1986г.). Критерии включения: частота эпизодов ОРВИ более 6 раз в году. Наличие ОРВИ на момент обследования. Критерии бронхолегочной

исключения: системы,

наличие

соматическая

хронических патология

заболеваний

различных

органов,

аллергические заболевания. Из числа обследуемых у 49 % был диагностирован грипп, у 26 % – парагрипп, у

5% – аденовирусная инфекция, у 4 % – респираторно-

синцитиальный вирус. У 16 % этиология ОРВИ не определена. Контрольную группу составили 35 детей с редкими эпизодами ОРВИ, сопоставимыми по возрасту и полу с группой часто болеющих. На генетический полиморфизм Toll-4 и Toll-6 рецепторов обследовано 76 здоровых детей и 100 часто болеющих ОРВИ. Методы исследования Молекулярно-генетическое исследование для выявления генетических мутаций проводилось методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами (НПФ «Литех», Россия, Москва). Выделение ДНК осуществлялось при помощи наборов «ДНК-экспресс кровь» (НПФ «Литех», Россия, Москва). Детекция продуктов амплификации проводилась электрофоретическим способом в 3 % агарозном геле.

8

Определение фагоцитарной активности нейтрофилов. Базальную (без продигиозана) и стимулированную (продигиозаном) фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали по их способности поглощать частицы латекса (Меньшиков В.В., 1987). Исследование

системы

комплемента.

Компоненты

комплемента

определяли методом твердофазного ИФА с применением набора реагентов ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург). Измерение уровня цитокинов (lL-1ß, IL-4, TNFα, IL-10, IL-8, IL-1RA) и иммуноглобулинов (IgA, sIgA, IgM, IgG и его подклассов) проводили методом твердофазного ИФА с использованием реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Оценку

агрегационной

функции

тромбоцитов

осуществляли

турбодиметрическим методом по G. Born (1962). Для исследования спонтанной, АДФ, адреналин и коллаген индуцированной агрегации использовали соответствующие реактивы ООО «Технология-стандарт» (г. Барнаул). Исследование

системы

гемостаза

(АЧТВ,

МНО,

концентрацию

фибриногена и фибринмономерных комплексов – РФМК, эуглобулиновый фибринолиз,

экспрессию

тканевого

фактора)

проводили

методами,

изложенными в современных руководствах (Баркаган З.С., Момот А.П.). Лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию (ЛТА и ЛТИ) определяли методом, предложенным Ю.А. Витковским (1999). Исследование лейкоцитарно-эритроцитарных (ЛЭА) и эритроцитарнотромбоцитарных агрегатов (ТЭА) осуществляли камерным методом в мазках крови. Статистическая

обработка

материала:

полученные

данные

обработаны методом вариационной статистики для связанных и не связанных между собой наблюдений с помощью пакетов программ Microsoft Excel 2007, STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc., США), с определением значимости различий при достигнутом уровне значимости

p<0,05. Перед началом анализа

вариационные ряды тестировались на нормальность с использованием критерия 9

Шапиро-Уилка

W.

При

нормальном

распределении

использовались

параметрические методы статистики – критерий Стьюдента (t-тест). Изучаемые показатели представлены в виде средних величин со стандартным отклонением (M±SD). При ненормальном распределении признака применялся критерий Манна

–

Уитни

(U-тест).

Для

сравнения

качественных

показателей

использовался критерий χ2 (Пирсона). Для оценки ассоциаций рассчитывали относительный риск OR по формуле OR=ad/bc. Где а – число лиц с наличием анализируемого маркера среди больных, b – его отсутствие; с и d – число лиц соответственно с наличием

и отсутствием маркера в контрольной группе.

Величина OR=1 указывает на отсутствие ассоциации, OR>1 – имеет место при положительной ассоциации (фактор риска) и OR<1 – отрицательная ассоциация аллеля с генотипом, расцениваемый как фактор устойчивости (Зайцев В.М., 2006). РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Распространенность полиморфных вариантов генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов среди здоровых детей и часто болеющих ОРВИ, проживающих в г. Чите Молекулярно-генетические исследования показали, что среди здоровых детей 82,9 % являются носителями нормальной гомозиготы (Аsp/Asp) в гене Toll-4 (Asp299Gly) рецептора, 9,3 % – обладают гетерозиготным вариантом (Asp/Gly), в 7,8 % – обнаружена полная замена аллелей (Gly/Gly). Таким образом, здоровые дети проживающие в г. Чите, в 17,1 % являются носителями генных мутаций в Toll-4 рецепторе. Среди детей, часто болеющих ОРВИ, 44,4 % обладают нормальной аллелью в гене Toll-4 рецептора (генотип Asp/Asp), 20 % имеют гетерозиготный вариант гена (генотип Asp/Gly) и 35,6 % обладают мутантной аллелью (генотип Gly/Gly). В общей сложности у этой группы детей генетические дефекты в Toll-4 рецепторе встречаются в 55,6 %.

10

Таблица 1 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Asp299Gly гена Toll-4 рецептора у детей с острой вирусной инфекцией в сравнении с контрольной группой Генетический маркер Аллель А Аллель G Генотип Asp/Asp Генотип Asp/Gly Генотип Gly/Gly

Контрольная группа (n=76) 0,875 0,125 63(82,9 %) 7(9,3 %) 6(7,8 %)

Больные ОРВИ (n=90) 0,423 0,577 40(44,4 %) 18(20 %) 32(35,6 %)

P

OR

p<0,05 p<0,05 p<0,05 p<0,05 p<0,05

0,5 4,6 0,5 2,1 5,6

Примечание: χ2 – тест, p – значимость различий между показателями больных и здоровых детей Расчет отношения шансов (OR) выявил положительную ассоциацию аллеля G и генотипа Gly/Gly при респираторной инфекции, что указывает, на повышенный риск развития данной патологии у детей, имеющих полиморфизм (Asp299Gly) в гене Toll-4 рецептора (табл. 1). Среди ЧБД процент мутаций в гене (Ser249Pro) Toll-6 рецептора увеличен до 75 %. Мутантных гомозигот 25 % (Pro/Pro), что в 1,5 раза больше, чем у здоровых (табл. 2). Таблица 2 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Ser249Pro гена Toll-6 рецептора у детей с респираторно-вирусной патологией в сравнении с группой контроля Генетический Контрольная Больные p OR маркер группа ОРВИ (n=100) (n=100) Аллель S Аллель P Генотип Ser/Ser Генотип Ser/Pro Генотип Pro/Pro

0,655 0,345 35(35 %) 48(48 %) 17(17 %)

0,375 0,625 25(25 %) 50(50 %) 25(25 %)

p<0,05 p<0,05 p<0,05 p>0,05 p<0,05

0,8 1,4 0,7 1,2 1,5

Примечание: χ2 – тест, p – значимость различий между показателями больных и здоровых детей. Расчет отношения шансов (OR) выявил положительную ассоциацию аллеля P с генотипом Pro/Pro. Это дает основание предполагать, что мутантная аллель Р маркирует повышенный риск высокой восприимчивости детей к

11

ОРВИ. Кроме того, среди больных детей выявлены 4 носителя сочетанных мутантных аллелей генов Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов.

2. Состояние врожденного и адаптивного иммунитета при ОРВИ у часто болеющих детей, имеющих полиморфизм генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов Основную роль в противовирусной защите играют элементы врожденного иммунитета. У часто болеющих детей в период ОРВИ снижена фагоцитарная активность (фагоцитарный индекс и фагоцитарное число) по сравнению с показателями здоровых детей. После стимуляции продигиозаном в условиях in vitro фагоцитарная активность крови больных детей несколько увеличивается, до 34,4±3,9 %, но фагоциты реагируют в 2 раза слабее, чем аналогичные клетки здоровых детей - 61±4,2 %. Это говорит о дефиците резервных возможностей фагоцитов у часто болеющих детей. Фагоциты детей, носителей генетических дефектов Toll-4 рецепторов реагируют на стимуляцию продигиозаном очень слабо, особенно при гетерозиготном варианте (Asp/Gly) – 29,4±3,1 %, при контроле 61±4,2 %. Фагоцитарный индекс и фагоцитарное число при этом значительно ниже, чем у больных с нормальным генотипом (Asp/Asp). Особенно ярко выражен фагоцитарный дефект при генетических мутациях в Toll-6 рецепторах. Фагоцитарный индекс и поглотительная активность у мутантных генотипов Ser/Pro – 26,1±2,1 % и Pro/Pro – 30±3,2 % ниже, чем у нормального генотипа Ser/Ser – 44,3±4,2 %.

Фагоциты

гетерозиготного варианта Ser/Pro и гомозиготного Pro/Pro практически не отвечают на стимуляцию. Следовательно, при полиморфизме генов сигнальных рецепторов Toll-4 и Toll-6 снижается способность к распознаванию соответствующего лиганда, что ограничивает активацию фагоцитов после встречи с патогеном. Врожденный иммунитет обеспечивается не только фагоцитозом, но и системой комплемента, которая обладает выраженной цитотоксичностью по 12

отношению к патогену. Наши исследования показали, что система комплемента у больных ОРВИ активирована

с увеличением концентрации С5а и С1-

ингибитора. У детей, имеющих полиморфные варианты генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов содержание анафилотоксина С5а и С1-ингибитора значительно выше, чем в крови больных, не имеющих генетических изменений в Tollрецепторах. Для Toll-4 рецепторов концентрация С5а с генотипом Asp/Gly – 58,6 нг/мл, Gly/Gly – 50,5 нг/мл, С1 ингибитора у полиморфных Gly/Gly – 1021,7 нг/мл. Для Toll-6 рецепторов концентрация С5а у носителей генотипа Ser/Pro – 30,4 нг/мл, Pro/Pro – 60,5 нг/мл; С1 ингибитора Pro/Pro – 947,5 нг/мл. В контроле содержание С5а – 12,2 нг/мл, С1 ингибитора – 346,6 нг/мл. Чрезмерная индукция анафилотоксина С5а у больных с полиморфными вариантами генов Toll – рецепторов может играть неблагоприятную роль в течении ОРВИ, так как С5а вызывает массивный отек слизистых, который определяет клинические особенности местных проявлений инфекции. Функциональная несостоятельность сигнальных Toll-рецепторов при полиморфизме в кодирующих их генах отражается на внутриклеточных реакциях и продукции медиаторов воспаления. Нас интересовал уровень цитокиновых реакций при респираторно-вирусных инфекциях и особенно их продукция при наличии полиморфных вариантов

в рецепторах

Toll-4

(Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro). Наши исследования показали, что в общей группе часто болеющих детей, включающих

все

генотипы,

при

ОРВИ

повышалась

концентрация

провоспалительных цитокинов (IL-1β, ФНО-α) и хемокина IL-8.

13

Рис. 1. Концентрация цитокинов IL-1β, IL-8 у больных ОРВИ-носителей полиморфного варианта генаToll-6 (Ser249Pro) рецепторов (U-тест) *– значимость различий от нормальных гомозигот Ser/Ser. Это естественная реакция, направленная на борьбу с вирусами. Содержание противовоспалительного цитокина IL-4 не изменяется в первые дни заболевания, но увеличивается концентрация IL-10 и ИЛ-1RA (антагониста рецепторов к IL-1β). Эти цитокины оказывают иммуносупрессорный эффект. Усиленная

их

ингибированию

экспрессия

в

Th1-клеточного

первые

дни

пути

заболевания

иммунитета,

способствует свойственного

противовирусной защите. При генетических аномалиях в Toll-4 рецепторах мы не отметили четкой разницы в концентрации цитокинов между генотипами. Замена аллелей отразилась лишь на синтезе IL-1RA. Его содержание у детей с генотипом Gly/Gly выше, чем при других полиморфных вариантах. При генетических дефектах в Toll-6 рецепторах у больных ОРВИ уменьшался синтез IL-1β, ФНО-α, IL-8, и увеличивался IL-1RA по сравнению с группой детей без аномальных нарушений в сигнальных рецепторах (рис.1). Такая реакция иммунокомпетентных клеток в первые дни заболевания неблагоприятно сказывается на организации противоинфекционной защиты, и местное воспаление слизистой может приобрести затяжной характер с возможными бактериальными осложнениями.

14

Цитокины, выделенные в месте локального воспаления при ОРВИ регулируют синтез иммуноглобулинов.

Рис. 2. Концентрация sIgА, IgM в крови у больных ОРВИ-носителей полиморфных вариантов гена Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов (U-тест) *– значимость различий от нормальных гомозигот Ser/Ser. Полиморфизм генов, кодирующих Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторы ограничивает синтез всех иммуноглобулинов (IgA, sIgA, IgM, IgG), поэтому их продукция у больных с аномальными аллелями оказалась ниже, чем у аналогичных больных без генетических мутаций (рис. 2). Следовательно, генетические ограничения выработки антител являются одной из возможных причин несостоятельности противоинфекционной защиты у ЧБД.

3. Состояние гемостаза и влияние полиморфизма генов (Asp299Gly) Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6 рецепторов на его уровень у детей при частых ОРВИ Несмотря на то, что основная нагрузка при вирусной защите падает на систему иммунитета, гемостатические реакции обязательно сопровождают иммунное реагирование (Кузник Б.И., Васильев В.Н., Цыбиков Н.Н., 1989; Витковский Ю.А., 1997; Кузник Б.И., 2010). В

наших

исследованиях

показано,

что

агрегационная

функция

тромбоцитов зависит от наличия полиморфизма генов, кодирующих Toll4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторы.

15

При мутациях в гене Toll-4 рецептора, индукция АДФ, адреналином и коллагеном

увеличивает

способность

тромбоцитов

к

агрегации.

При

генетических дефектах Toll-6 рецепторов индукция теми же агонистами уменьшает агрегационные свойства стимулированных тромбоцитов. Мы полагаем, что различные эффекты индуцированной агрегации связаны с количеством экспрессированных рецепторов для используемых индукторов и состоянием

белков трансмембранной передачи сигнала.

Возможно, при генетических дефектах в Toll-6 рецепторах срабатывает система ингибиции внутриклеточной сигнализации. Изменение в функциональной активности тромбоцитов сопряжено с реакциями коагуляционного гемостаза. У детей больных ОРВИ развивается гиперкоагуляция, которая выражается в укорочении времени рекальцификации, увеличении

концентрации

фибриногена

и

числа

фибрин-мономерных

комплексов (РФМК). На фоне ускоренного образования фибрина угнетён фибринолиз.

При

генетических дефектах в Toll-рецепторах степень гиперкоагуляции более выражена в трех показателях: концентрации фибриногена, числе фибринмономерных комплексов и скорости фибринолиза.

4.

Особенности адгезивных свойств клеток крови у детей, больных

ОРВИ при полиморфизме генов (Asp299Gly) Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6 рецепторов Гиперкоагуляция, имеющаяся в крови детей при ОРВИ нарушает белковый состав крови, который отражается на адгезивных свойствах форменных элементов. Нас интересовали три варианта розеток при ОРВИ: лимфоцитарнотромбоцитарные,

лейкоцитарно-эритроцитарные,

тромбоцитарно-

эритроцитарные коагрегаты. Проведенные исследования показали, что при ОРВИ увеличивается лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия почти в два раза, что свидетельствует о 16

напряженности клеточного иммунитета (Витковский Ю.А., и др. 2005-2010; Кузник Б.И., 2005-2010). Тромбоциты образуют клеточные кооперации не только с лимфоцитами, но и эритроцитами (ТЭА). У здоровых детей такие ассоциации составляют 5,0±0,4 %, у больных ОРВИ-32,1±2,8 % из 200 тромбоцитов, присоединивших к себе эритроциты. Адгезивности подвержены эритроциты с пониженной резистентностью и деформированной мембраной. С ними ассоциируют наряду с тромбоцитами и лейкоциты, образуя лейкоцитарно-эритроцитарные коагрегаты (ЛЭА). У детей, страдающих ОРВИ, отмечено увеличение ЛЭА в 5 раз (24,9±2,9 %) по сравнению со здоровыми (5,3±0,6 %). Лейкоцитарно-эритроцитарные агрегаты представлены в основном нейтрофилами

и

моноцитами.

Преобладают

коагрегаты,

образованные

нейтрофилами (88,6±2,5 %), реже моноцитами (12,4±2,2 %). Эритроциты, подвержены

ассоциированные

экзоцитарному

лизису,

с что

тромбоцитами обусловлено

и

лейкоцитами,

цитотоксичными

свойствами контактных клеток. При этом у эритроцитов выделяются прокоагулянтные факторы, поддерживающие гиперкоагуляцию. Экзоцитарный лизис приводит к уменьшению числа эритроцитов у больных. Генетические дефекты в Toll-4 и Toll-6 не отражаются на степени тромбоцитарно-эритроцитарных ассоциаций. Однако количество образованных эритроцитарно-лейкоцитарных розеток (ЛЭА) увеличивается при мутациях в генах (Asp299Gly) Toll-4 и (Ser249Pro) Toll-6 рецепторов (табл.3). Патогенетическое

значение

образованных

коагрегатов

форменными

элементами крови связано с нарушением микроциркуляции и увеличением прокоагулянтного потенциала крови.

17

Таблица 3 Содержание ауторозеток у пациентов носителей полиморфных аллелей Ser249Pro в гене Toll-6 и Asp299Gly в гене Toll-4 (медиана, 25-75 перцентили) 299Asp (n=40) ТЭА 37,1

Asp299Gly Asp299Gly (n=18) 30,3

299Gly (n=32) 33,8

249Ser (n=25) 33,5

Ser249Pro Ser249Pro (n=50) 32,3

249Pro (n=25) 22,8

(%)

[34,5-42,3]

[20,8-31]

[29,5-40]

[23,3-45]

[31-40]

[11-32]

ЛЭ

17,5

p*<0,05 23,5

26,3

21,5

27

p*<0,05 29,8

[11,8-18,8]

[17,5-25,8]

[17,8-33,5]

[20,5-42,3]

[24,5-42,3]

[22,5-42,3]

p*<0,05

p*<0,05

p*<0,05

p*<0,05

А (%)

Примечание: U-тест, P*–значимость различий по сравнению с группой носителей гомозиготного Asp/Asp генотипа для гена Toll-4 и Ser/Ser генотипа для гена Toll-6. Таким образом, одной из причин высокой восприимчивости к ОРВИ является наследственная предрасположенность, обусловленная мутациями в генах Toll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов. Генетические дефекты в

сигнальных

рецепторах

снижают

функциональную

активность

иммунокомпетентных клеток, что определяет низкую противоинфекционную защиту. ВЫВОДЫ 1.

Одним из патогенетических механизмов нарушений в системе

иммунитета, гемостаза и адгезивных свойств форменных элементов крови у детей, часто болеющих ОРВИ, являются генетические дефекты в Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторах. Среди таких детей 55,6 % являются носителями мутации в Toll-4 рецепторах рецепторов.

и 75 % в генах Toll-6

Маркерами высокой восприимчивости детей к респираторно-

вирусным инфекциям являются аллель G гена Toll-4(Asp299Gly) рецептора и аллель P гена Toll-6(Ser249Pro) рецептора.

18

2.

У

часто

болеющих

детей

снижена

фагоцитарная

активность.

Индуцирована система комплемента с увеличением уровня анафилатоксина С5а и С1-ингибитора. У больных, носителей мутаций в генах Toll-4 и Toll-6 рецепторов, несостоятельность врожденного иммунитета выражена более значительно.

3.

При ОРВИ в первые дни заболевания увеличена концентрация

провоспалительных

цитокинов

IL-1ß,

ФНОα,

хемокина

IL-8

и

противовоспалительных цитокинов IL10 и IL-1RA. При аномалии в рецепторах Toll-4 и Toll-6 синтез отмеченных цитокинов уменьшался

у носителей

гетерозиготных вариантов Asp/Gly в гене Toll-4 рецептора, а при мутациях в гене Toll-6 снижался у гетерозигот Ser/Pro и гомозигот Pro/Pro. 4.

В крови детей часто болеющих ОРВИ увеличено содержание IgM, IgG и

его подклассов, уменьшена концентрация IgA и sIgA. При генетических мутациях в Toll-4 и Toll-6 рецепторах синтез отмеченных иммуноглобулинов снижен, по сравнению с группой детей, не имеющих генетических дефектов в рассматриваемых рецепторах.

5.

При ОРВИ, в первые дни заболевания спонтанная агрегация тромбоцитов

не отличается от контроля. При индукции АДФ, адреналином и коллагеном агрегационная

активность

тромбоцитов

больных

детей

увеличивается

независимо от наличия или отсутствия генетических дефектов Toll-4 и Toll-6 рецепторов. Однако, аномальные аллели гена Toll-6 рецептора (Ser249Pro) ограничивают индуцированную активность.

6.

В остром

периоде

у

часто

болеющих детей

развивается

гиперкоагуляция, которая сопровождается укорочением АЧТВ, увеличением концентрации фибриногена и фибрин-мономерных комплексов (РФМК), ингибицией фибринолиза. У больных с мутациями в генах Toll-4 и Toll-6 рецепторов отмеченные изменения выражены в большей степени.

7.

У детей при ОРВИ усилена лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия

(ЛТА), увеличен лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс (ЛТИ), повышено число

лейкоцитарно-эритроцитарных

и

тромбоцитарно-эритроцитарных 19

ассоциаций. При наличии полиморфных генотипов Gly/Gly Toll-4 рецептора и Pro/Pro Toll-6 рецептора число лейкоцитарно-эритроцитарных коагрегатов увеличено в большей степени, чем у больных, не имеющих дефектов в соответствующих генах. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Проведенный анализ частоты встречаемости полиморфных вариантов генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов и выявление генетических маркеров ОРВИ позволит создать группу диспансерного наблюдения с индивидуальной профилактикой и лечением ОРВИ. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Карпова Н.И. Врожденный и адаптивный иммунитет при острой респираторной вирусной патологии у часто болеющих детей [Электронный ресурс] / Н.И. Карпова // Забайкальский медицинский вестник. – 2011. №2. – С. 66 - 69. - Режим доступа: http: //www.medacadem.chita.ru/zmv (10 октября 2011г.).

2. Кузник Б.И. Состояние системы гемостаза и взаимодействие форменных

элементов

крови

у

детей,

часто

болеющих

острыми

респираторными вирусными инфекциями / Б.И. Кузник, Л.П. Малежик, Н.И. Карпова // Кубанский научный медицинский вестник. – 2010. - №8. – С. 110 - 115.

3. Карпова Н.И. Фагоцитарная активность, особенности гемостаза у детей часто болеющих ОРВИ / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины : тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 55-летию ЧГМА. – Чита, 2008. – С. 183.

4. Карпова Н.И. Состояние гемостаза, неспецифической резистентности и ауторозеткообразования

у

детей

с

рецидивирующими

обструктивными 20

ларингитами / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик, Н.А. Мироманова // Медицинские аспекты

состояния

здоровья

:

материалы

I

Международной

научно-

практической интернет конференции «Состояние здоровья: медицинские и психолого-педагогические аспекты». – Чита - Славянск, 2009. - С.139 - 140.

5.

Карпова

Н.И.

Гемореологические

нарушения

у

детей

со

стенозирующими ларинготрахеитами вирусной этиологии / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик //

Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-

сосудистой хирургии : материалы четвертой Всероссийской конференции (с международным участием) – Москва, 2009. – С.196.

6. Карпова Н.И. Некоторые патогенетические аспекты респираторных инфекций у часто болеющих детей / Н.И. Карпова и др. //

Материалы I

Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – Москва, 2009. – С. 91 - 92.

7. Карпова Н.И. Эндогенное ауторозеткообразование и лимфоцитарнотромбоцитарная адгезия у детей часто болеющих острыми респираторными вирусными инфекциями / Н.И. Карпова, Н.А. Мироманова, Н.В. Епифанцева // Современные аспекты инфекционной патологии : тезисы докладов научнопрактической конференции студентов и молодых ученых (с международным участием). - Астрахань, 2009. - С. 50.

8.

Карпова

Н.И.

Свертывание

крови,

врожденный

иммунитет

и

ауторозеткообразование у детей, часто болеющих острыми респираторными вирусными инфекциями / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик // Тромбоз, гемостаз и реология. – 2005. - №3. - С. 43 - 48.

9. Карпова Н.И. Некоторые патогенетические особенности нарушения микроциркуляции у детей с респираторно-вирусными инфекциями / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик, Б.И. Кузник // Забайкальский медицинский вестник. – 2010. - №4. – С. 24 - 29.

10. Карпова Н.И. Роль гемостаза и межклеточных агрегаций у детей с острой респираторной вирусной инфекцией / Н.И. Карпова // Системное

21

кровообращение, микроциркуляция и гемореология : тезисы докладов. – Ярославль, 2011. – С. 64.

11. Карпова Н.И. Иммунный статус у детей, часто болеющих острой респираторной вирусной инфекцией / Н.И. Карпова, Л.П. Малежик, Е.Е. Гергесова // Медицинские аспекты состояния здоровья : материалы I Международной научно-практической интернет конференции «Состояние здоровья: медицинские и психолого-педагогические аспекты». - Чита-Славянск, 2011г. - С. 22 - 23.

12. Solpov A. Lymphocyte-platelet adhesion in A H1N1 infected patients / A. Solpov, E. Gergesova, N. Strambovskaya, N. Karpova et al. // Abstracts from the XXXIII World Congress of the International Society of Hematology. – Jerusalem. – 2010. – P. 79. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЛТА – лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия ЛТИ – лимфоцитарно -тромбоцитарный индекс ЛЭА – лейкоцитарно-эритроцитарная адгезия ОРВИ – острая респираторная вирусная инфекция ПЦР – полимеразная цепная реакция ТЭА – тромбоцитарно-эритроцитарная адгезия ЧБД – часто болеющие дети ФИ – фагоцитарный индекс ФЧ – фагоцитарное число ЭДТА – этилендиаминтетраацетат PRR – патоген распознающие рецепторы

22