UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS DE LA SALUD CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
CONTROL DE MEDICAMENTOS TEMA:
Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). DOCENTE: Dr. Carlos García. Mg.Sc CURSO: Quinto Año “A” INTEGRANTES:
Vicente Orellana Hurtado Arelis Rogel Galarza
Introducción Los avances en el campo de la biotecnología han requerido el uso de técnicas más eficaces para la separación y purificación de biomoléculas. La cromatografía de líquidos ha resultado ser una herramienta muy poderosa y eficiente para la separación de mezclas complejas tanto de compuestos de bajo peso molecular como de proteínas y ácidos nucleicos (Esquivel & Leal, 2004). En la cromatografía líquida de alta resolución, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La separación cromatografía en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria (Ozores, M. 2014). A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra (Ozores, M. 2014). La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase
estacionaria
activa.
Ofreciendo
una
mayor
variedad
de
fases
estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación (Ozores, M. 2014).
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla.
Consiste en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl . La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a determinar (Miranda, & Martín, 2013).
Aplicaciones Campos de Aplicación de HPLC (Ozores, M. 2014): •
Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
•
Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
•
Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
•
Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes
•
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
•
Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
•
Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.
Equipo de HPLC La cromatografía de líquidos de alta resolución utiliza presiones elevadas para hacer pasar un flujo de fase móvil a través de una columna empacada con partículas micrométricas. Sin la aplicación de presión sería prácticamente imposible que el diluyente pasara a través de la columna. Un equipo de HPLC básicamente debe contar con un sistema de bombeo que impulse el flujo de la fase móvil a través de la columna, una columna que separe los componentes de la muestra, un detector que mida alguna característica de dichos componentes conforme van saliendo de la columna y un procesador que
convierta la señal electrónica del detector en un cromatograma (Esquivel & Leal, 2004).
Diagrama de flujo de proceso del HPLC
Partes del Equipo de HPLC Sistemas para el tratamiento de los disolventes Los recipientes que contienen los solventes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos, como oxígeno y nitrógeno, que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o sistemas de difusión que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Para poder hacer eluciones por gradiente, los equipos de HPLC modernos cuentan con recipientes conectados a una mezcladora, lo que permite variar la relación de los disolventes en forma programada y modificar los valores de manera lineal o exponencial (Esquivel & Leal, 2004).
Sistemas de bombeo La bombas recíprocas son las más usadas, el 90 % de los equipos de HPLC modernos cuentan con este sistema de bombeo. El disolvente es expulsado de una cámara por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Las bombas recíprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones que se manifiesta como ruido en la línea base del cromatograma (Esquivel & Leal, 2004).
Sistemas de inyección de la muestra El método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra utiliza dispositivos en forma de bucle, que pueden introducir la muestra a presiones de hasta 7000psi con una precisión aceptable (Esquivel & Leal, 2004). .Columnas Para aumentar la vida de la columna analítica se coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. La composición del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de la partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de presión (Esquivel & Leal, 2004). .
Tipos de relleno de la columna Los rellenos de partículas porosas para HPLC están formados por micro partículas porosas con diámetros entre 3 y 10 μm y con la menor dispersión posible para un tamaño determinado. La sílice es el material más comúnmente empleado para este tipo de columnas, debido a que se pueden producir partículas con diámetros muy uniformes (Esquivel & Leal, 2004).
Proceso de pulverización de la muestra Aspersión Pesar 1000 g de muestra (Hortalizas,
frutas,
etc.). Para seleccionar la
muestra, se mide los parámetros de color, L, a* y b* con el colorímetro (Arias y col., 2000). Se extrae el jugo de la muestra y se mide los parámetros de color al jugo extraído para tenerlos como referencia. Después se determina los sólidos solubles totales con el refractómetro. De acuerdo con el porcentaje de sólidos determinado y al peso de jugo extraído, se calcula la cantidad en gramos. El jugo con el encapsulante se coloca en el secador por aspersión, donde se selecciona la temperatura del aire de entrada, cuyos valores son de 170 y 180 ºC. La velocidad de alimentación se ajusta de manera que la temperatura máxima del aire, a la salida fuera de 80°C. Una vez obtenido el polvo de la muestra en cada tratamiento, se coloca en bolsas de polietileno dentro de un frasco de vidrio y posteriormente se cubren con papel aluminio. Luego se almacenan en un lugar fresco y seco, debidamente etiquetado. (Candelas y col., 2005).
Nebulización Un secado por nebulización comprende básicamente la cámara de secado, por lo general de fondo cónico, el atomizador y un sistema de separación de polvos y gotas, además de un apropiado sistema de bombeo, calentador de aire, etc (Vita Jato, 2008).
Secadero por nebulización: 1) tanque de alimentación, 2) atomizador centrífugo, 3) cámara de desecación, 4) filtro de aire, 5) ventilador, 6) calentador de aire, 7) conducto, 8) dispersador de aire ajustable, 9) ventilador de aire frío, 10) cámara del producto, 11) colector del producto, y 12) ventilador.
La muestra es liberada en el atomizador por flujo de gravedad o con una bomba apropiada. La velocidad de alimentación se ajusta para que cada gota de líquido atomizado sea completamente desecada antes de que se ponga en contacto con la pared de la cámara de secado, para que así el polvo resultante no se sobrecaliente (Vita Jato, 2008).
Liofilización Es un proceso de desecación donde la muestra con el solvente, por lo general agua, es primero congelado y posteriormente eliminado por sublimación en un entorno de vacío. La temperatura a la que es sometida la muestra está por debajo de aquella a la que muchas sustancias inestables sufren cambios químicos. Debido a la baja temperatura a la cual se opera, la pérdida de constituyentes volátiles es mínima (Vita Jato, 2008).
Artículos Científicos: Validación de un Método de Extracción de Alicina en Ajo y su Cuantificación por HPLC RESUMEN Entre los constituyentes de mayor actividad biológica del ajo destaca la alicina, compuesto sulfurado altamente inestable responsable de sus propiedades farmacológicas además de su olor característico. Debido a la elevada degradabilidad de alicina, es importante el establecimiento de un método eficiente de extracción y de cuantificación que pueda ser usado en procesos de control de calidad en la industria de suplementos alimenticios. En este trabajo se describe un método de extracción de alicina y su cuantificación por HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Se realiza una validación del
método
evaluando
parámetros
de
linealidad,
exactitud,
precisión,
reproducibilidad, selectividad y robustez (Díaz & Jiménez, 2008). Extracción del analito El método incluyó la preparación de una Disolución de Estándar Interno de phidroxibenzoato de etilo diluyendo aproximadamente 0.53 g del compuesto en 1 000 mL de agua. Adicionalmente fue necesaria la preparación de una solución acuosa 1 mM de ácido cítrico cuya función es detener la reacción de formación de alicina (Díaz & Jiménez, 2008). Extracción: Se pesó con exactitud de 0.001 g, aproximadamente de 1 a 5 g de ajo y se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 250 mL seguido de la adición de aproximadamente 30 g de la disolución del estándar interno. La mezcla de ajo y disolución de etilparabeno se homogenizó durante aproximadamente 2.5 min, y al finalizar se mantuvo en reposo a temperatura ambiente por 30 min. Posteriormente se centrifugó a 3 500 rpm durante 10 min. Del sobrenadante se tomaron 2 mL y se aforaron a 10 mL con la disolución de ácido cítrico. Finalmente la disolución final se filtró a través de una membrana Millipore para su análisis por HPLC (Díaz & Jiménez, 2008). Análisis por HPLC: Las condiciones de análisis fueron: fase móvil Metanol/Agua 45/55 a flujo de 0.8 mL/min; Temperatura de análisis 25 °C y detección UV a 230 nm. Cuantificación: Para la determinación de la concentración de alicina, se realizó un análisis cromatográfico usando el Polvo de Ajo Estandarizado como patrón.
El cromatograma obtenido para la muestra de ajo fresco presenta un perfil cromatográfico de una intensidad de la señal de alicina indica que la muestra presenta una alta concentración del metabolito, de manera que la muestra no representaría ninguna limitante para realizar la validación del método (Díaz & Jiménez, 2008).
Extracción y caracterización de principios activos con propiedades antioxidantes y antibacterianas, a partir de residuos del procesamiento de alcachofas. RESUMEN: En
esta
investigación
se
determinó
la
presencia
y
actividad
de
compuestos fenólicos como el ácido cafeico (sin dato) y ácido clorogénico (40.06 - 82.86 mg/L) en brácteas de alcachofa mediante la aplicación de técnicas de extracción sólido-líquido, fenoles totales de Folin-Ciocalteu, actividad antioxidante con el
reactivo
DPPH,
actividad
antibacteriana, cromatografía en capa fina
(TLC) y HPLC. Los resultados demostraron que el extracto con mayor concentración de fenoles totales en equivalentes de quercetina fue el
extracto hidroalcohólico (0.160 mg EQT/100g brácteas frescas), seguido
del extracto alcohólico (0.153 mg
EQT/100g
hidrolizado
EQT/100
sin
calor
(0.142 mg
brácteas g
frescas),
del
brácteas frescas) y, del
hidrolizado con calor (0.001 mg EQT/100g brácteas frescas). Durante la prueba de actividad antioxidante se observó que los extractos, alcohólico e hidroalcohólico, fueron capaces de reducir al reactivo DPPH en 91.46% y 91.28% respectivamente. La prueba de actividad antibacteriana de estos dos
extractos
en
cultivos
de Staphylococcus
aureus y Salmonella spp.
demostró que tienen propiedades antibacterianas. Basado en los resultados, es posible afirmar que las brácteas de alcachofa son un valioso recurso para obtener principios activos útiles como antioxidantes y antibacterianos (Naranjo, 2009).
OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA. Las muestras de brácteas de alcachofa fueron obtenidas de la empresa INAEXPO, perteneciente a PRONACA, en Puembo, Pichincha-Ecuador. La preparación de las muestras consistió en secarlas a una temperatura menor a 40°C para evitar la alteración de los principios activos y, finalmente fueron pulverizadas (Naranjo, 2009). EXTRACCIÓN DE PRINCIPIOS ACTIVOS. Los extractos de brácteas de alcachofa se obtuvieron aplicando técnicas de extracción sólido-líquido recomendadas por. La primera técnica aplicada fue la maceración del pulverizado en etanol durante 30 días, utilizando 10 mL de etanol al 99.6% por cada 10g de brácteas pulverizadas. De este procedimiento se obtuvieron dos extractos, uno alcohólico y otro hidroalcohólico mediante la adición de agua durante la maceración.La segunda técnica aplicada para la extracción de principios activos fue la hidrólisis ácida con ácido clorhídrico (HCl) 6N, utilizando 200 mL de HCl por cada 15g de brácteas pulverizadas durante tres días, luego de la maceración en ácido clorhídrico (HCl) se dejó el extracto en reflujo durante 12 horas. De este procedimiento se obtuvieron dos extractos, un hidrolizado con calor y otro a temperatura ambiente. Finalmente todos los extractos fueron concentrados en rotavapor con vacío y a una temperatura menor de 40°C. (Naranjo, 2009). TAMIZAJE FITOQUÍMICO Y CROMATOGRAFÍA HPLC El tamizaje fitoquímico del pulverizado y la cromatografía HPLC de los extractos alcohólico e hidroalcohólico se realizaron en el laboratorio de Productos Naturales de la Universidad Politécnica Salesiana por el profesor Wilson Tapia MSc. Para la cromatografía HPLC se utilizaron como estándares ácido cafeico, ácido clorogénico y quercetina (Naranjo, 2009). RESULTADOS Rf de los compuestos identificados en los cromatogramas.
Extractos
Alcohólico
Hidroalcohólico
Hidrolizado sincalor
Rf Ác. Cafeico
0.96
0.95
0.95*
Rf Ác. Clorogénico
0.54*
0.54*
0.53
Rf Muestra
0.84
0.82
0.90*
0.71
0.65
0.76
0.59*
0.52*
0.42
El resultado del análisis realizado al extracto alcohólico e hidroalcohólico mediante HPLC revela que las concentraciones de ácido clorogénico son 82.8560 y 40 .0613 mg/L, respectivamente. Estos extract os no contienen ácido cafeico y quercetina según los cromatogramas.
Cromatograma HPLC del extracto alcohólico
Bibliografía:
-Arias R., Lee T., Logendra L.& Janes H. (2000). Correlation of lycopene measured by
aaaaHPLC with the L, a, b color reading of a hidroponic tomato and the relationship of aaaamaturity with color and lycopene content. J. Agric. Food Chem. (48) pp. 16971702. -Candelas M, Alanís M & Olague F. (2005) Extracción y cuantificación por HPLC de aaaalicopeno en tomate y polvo de tomate. Facultad de Ciencias Químicas de la aaaaUJED.(En línea)(Disponible en): www.respyn.uanl.mx/especiales/2005/ee-13aaaa2005/.../CNA37.pdf -Díaz J. & Jiménez L. (2008). Validación de un Método de Extracción de Alicina en Ajo aaaay su Cuantificación por HPLC. Centro de Investigación y de Estudios Avanzados aaaadel Instituto Politécnico Nacional. México. (En línea).(Disponible en): aaaahttps://www.cenam.mx/simposio2008/sm_2008/memorias/S2/SM2008-S2A2aaaa1066.pdf -Esquivel, E & Leal, L. (06/ 2004). Cromatografía De Fase Reversa. Métodos aaaafisicoquímicos en Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma De México aaaaInstituto De Biotecnología. Cuernavaca, Morelos. Pág.6
-Miranda, A & Martín, O (12/2013). Cromatografía Líquida (HPLC).(En línea)(Disponible aaaaen): http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-aaaagases%20l %C3%ADquidos.pdf -Naranjo B. (2009), Comunicación personal, Escuela Politécnica del Ejército, Ecuador. -Ozores, M. (2014). Cromatografía de líquidos HPLC. Laboratorio de Técnicas aaaInstrumentales. ). (En línea).(Disponible en): http://laboratoriotecnicasinstrumentales aaa.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-lquidos-hplc
- Vita Jato. (2008). Aspectos fundamentales de los sistemas farmacéuticos y aaaaoperaciones
básicas.
Tecnología
Farmacéutica.
Facultad
aaaaUniversidad de Santiago de Cornpostela. Vol 1.Pág.482-498
de
Farmacia.