Научный результат. Физиология by Niki

аучный результат

серия «ФИЗИОЛОГИЯ»

ESEARCH ESULT

SERIES «PHYSIOLOGY»

Свидетельство о регистрации средства массовой информации Эл. № ФС77-55674 от 28 октября 2013 г.

Mass media registration certificate El. № FS 77-55674 of October 28, 2013

Включен в библиографическую базу данных научных публикаций российских ученых РИНЦ

Included into bibliographic database of scientific publications of Russian scientists registered in the Russian Science Citation Index

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

ONLINE SCHOLARLY PEER-REVIEWED JOURNAL First published online: 2013. Frequency of publications: quarterly

Издается с 2013 г., ежеквартально ISSN 2409-0298

№ 1(1), 2014 Учредитель:

ФГБОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

ISSN 2409-0298

Volume

1(1), 2014

Founded by: Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Professiona Education ”Belgorod State National Research University” (Belgorod State University)

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР СЕРИИ:

EDITOR-IN-CHIEF OF A SERIES:

Присный А.А., кандидат биологических наук, доцент

Andrey A. Prisny, Ph.D. in Biology, Associate Professor

ЗАМЕСТИТЕЛЬ ГЛАВНОГО РЕДАКТОРА СЕРИИ:

DEPUTY EDITOR-IN-CHIEF A SERIES:

Скоркина М.Ю., кандидат биологических наук, доцент

Marina Yu.. Skorkina, Ph.D. in Biology, Associate Professor

ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕДАКТОР СЕРИИ:

SERIES EDITOR:

Зубарева Е.В., кандидат биологических наук

Ekaterina V. Zubareva, Ph.D. in Biology

РЕДАКТОР АНГЛИЙСКИХ ТЕКСТОВ СЕРИИ:

ENGLISH TEXT EDITOR:

Ляшенко И.В., кандидат филологических наук, доцент

Igor V. Lyashenko, Ph.D. in Philology, Associate Professor

ЧЛЕНЫ РЕДАКЦИОННОЙ КОЛЛЕГИИ:

EDITORIAL BOARD:

Зотин А.А., доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Alexey A. Zotin, Doctor of Biology

Илюха В.А., доктор биологических наук Сафонова Т.А., доктор биологических наук, профессор Шапошников А.А., доктор биологических наук, профессор

Viktor A. Ilukha, Doctor of Biology Tatyana A. Safonova, Doctor of Biology, Professor Andrey A. Shaposhnikov, Doctor of Biology, Professor

РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ:

EDITORIAL TEAM:

Кэкули-Дуарте, PhD, Ирландия

Thomaé Kakouli-Duarte, Ph.D. in Biology, Lecturer in Biosciences, Ireland

Липунова Е.А., доктор биологических наук, профессор, Россия Литвинов Ю.Н., кандидат биологических наук, доцент, Россия Маслова М.Н., доктор биологических наук, профессор, Россия Чернявских С.Д., кандидат биологических наук, доцент, Россия

Elena A. Lipunova, Doctor of Biology, Professor, Russia Yuri N. Litninov, Ph.D. in Biology, Associate Professor, Russia Marina N. Maslova, Doctor of Biology, Professor, Russia Svetlana D. Chernyavskikh, Ph.D. in Biology, Associate Professor, Russia

СОДЕРЖАНИЕ

Скоркина М.Ю. МОРФОЛОГИЯ И УПРУГОЭЛАСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЛЯГУШЕК ........................................................5 Сладкова Е.А. ОЦЕНКА СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА МИТОГЕНТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ............................................. 12 Шамрай Е.А., Кротова Е.Е. МИГРАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ЛЕЙКОЗОМ...........................21 Зубарева Е.В. ВЛИЯНИЕ ИНТЕНСИВНОЙ ТЕПЛОВОЙ НАГРУЗКИ НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ КРЫС..............................................................27 Чернявских С.Д., Горбунова О.А. ВЛИЯНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАГРУЗОК НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭЭГ............35 Кулько С.В. ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СТАТУСА ГЕМОЦИТОВ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КЛАССА GASTROPODA (MOLLUSCA) В УСЛОВИЯХ ОСМОТИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ.....................................................42 Гребцова Е.А. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК И ИМАГО ZOPHOBAS MORIO.49 Пигалева Т.А. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА ЦЕЛОМОЦИТОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА LUMBRICUS (АННЕЛИДЫ, ОЛИГОХЕТЫ) ..............................................56 Погребняк Т.А., Горшков Г.И. ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СЕРДЦА ПТИЦ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДЕСИНХРОНОЗА........................................63

АУЧНЫЙ CONTENTS

РЕЗУЛЬТАТ

Skorkina M.Yu. MORPHOLOGY AND ELASTIC PROPERTIES OF ERYTHROCYTES SURFACE IN FROGS .....................................5 Sladkova E.A. THE STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STATUS OF MITOGEN-TRANSFORMED LYMPHOCYTES ...........................................12 Shamray E.A., Krotova E.E. THE MIGRATION ACTIVITY OF THE LYMPHOCYTES IN HEALTHY DONORS AND PATIENTS WITH LEUKEMIA..........21 Zubareva E.V. THE INFLUENCE OF INTENSE HEAT LOAD ON MORPHOMETRIC PARAMETERES AND FUNCTIONAL ACTIVITY OF BLOOD LEUCOCYTES’ IN RATS .......27 Chernyavskikh S.D., Gorbunova O.A. THE INFLUENCE OF FUNCTIONAL LOADS ON EEG............................................35 Kulko S.V. DYNAMICS OF ENERGY STATUS INDECIES OF HEMOCYTES IN SOME GASTROPOD (MOLLUSCA) SPECIES IN OSMOTIC STRESS CONDITIONS .............................................. 42 Grebtsova E.A. THE COMPARATIVE ANALYSIS OF CELL COUNTS IN LARVAE AND ADULTS OF ZOPHOBAS MORIO ......................................................... 49 Pigaleva T.A. THE COMPARATIVE ANALYSIS OF THE MORPHOFUNCTIONAL STATUS OF COELOMOCYTES IN REPRESENTATIVES OF THE GENUS LUMBRICUS

(ANNELIDA, OLIGOCHAETA) ..................56 Pogrebnyak T.A., Corshkov G.I. REGULATORY FEATURES OF ELECTRIC ACTIVITY OF THE HEART IN BIRDS IN THE CONDITIONS OF THE EXPERIMENTAL DESYNCHRONOSIS MODEL ..........63

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Скоркина М.Ю.

МОРФОЛОГИЯ И УПРУГО-ЭЛАСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЛЯГУШЕК

УДК 576.3

СКОРКИНА М.Ю.

SKORKINA M.YU.

МОРФОЛОГИЯ И УПРУГО-ЭЛАСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЛЯГУШЕК MORPHOLOGY AND ELASTIC PROPERTIES OF ERYTHROCYTES SURFACE IN FROGS

Аннотация

Abstract

Методом атомно-силовой микроскопии изучены особенности морфологии поверхности и упруго-эластические свойства нативных эритроцитов лягушек. На модели с адреналиновой нагрузкой показано увеличение жесткости клеток на 64% (р<0,05) которое сопровождалось уменьшением числа глобулярных структур на участке мембраны эритроцитов на 50% (р<0,05), а увеличением их высоты на 254% (р<0,05), по сравнению с контролем. В параллельных опытах с антагонистом адреналина – обзиданом, существенных различий в жесткости клеток и морфологии поверхности не выявлено. Установленная взаимосвязь между упруго-эластическими свойствами и морфологией поверхности может быть использована в качестве диагностического критерия при оценке функционального состояния клетки.

The author has studied the features of morphology and elastic properties of native erythrocytes in frogs with the use of the atomic force microscopy method. On the model of adrenal load, the study demonstrated the increase in the stiffness of cells by 64% (p<0.05) accompanied by the decrease in the number of globular structures on the membrane of erythrocytes by 50% (p<0.05), and their height was increased by 254% (p<0.05) as compared to a control set. In the parallel experiments with antagonist adrenaline – propranalol, the study has not revealed any significant differences in the morphology and elastic properties of the surface. The discovered relationship between elastic properties and morphology of the surface can be used as a diagnostic criterion in the evaluation of the functional state of the cell.

Ключевые слова: эритроциты лягушек; упруго-эластические свойства; рельеф поверхности; атомно-силовая микроскопия.

Key words: erythrocytes of frogs; elastic properties; surface relief pattern; atomic force microscopy.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Упругость клеток, их морфология, а также регуляция фундаментальных физиологических процессов зависит от упаковки структур цитоскелета [1]. К настоящему моменту известно, что образование агрегированных доменов и выпячиваний на поверхности мембраны сопровождается концентрацией в этих местах фосфорилированных белков цитоскелета – α-актинина [2]. Однако, элементы цитоскелета определяют не только «рисунок» рельефа поверхности, но и упруго-эластические свойства мембран. Согласно данным параллельных исследований, выполненных на атомно-силовом и конфокальном лазерном сканирующем микроскопе, установлена тесная связь между снижением модуля Юнга в клетках крови больных лейкозом и организацией актиновых филаментов [3]. В связи с чем, представляет особый интерес вопрос о взаимосвязи между морфологией поверхности и ее упруго-эластическими свойствами, что в дальнейшем может послужить важным критерием в оценке функционального состояния клетки неинвазивными методами. Целью исследования было выявить взаимосвязь между особенностями морфологии и упруго-эластическими свойствами поверхности на модели полноценных ядерных эритроцитов лягушек. Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на эритроцитах лягушек Rana ridibunda Pall., находящихся в состоянии физиологического анабиоза. Кровь брали путем пункции сердца, стабилизировали гепарином (5 Ед/мл). С целью выявления взаимосвязи между упруго-эластическими свойствами и «морфологическим рисунком» поверхности клеток в проведенном исследовании использован метод функциональных нагрузок, включающий инкубацию

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

клеточных суспензий с адреналином и обзиданом. Выбор адреналина и обзидана, в качестве неселективного блокатора β-адренорецеторов, обусловлен участием β-адренорецепторов в модуляции упруго-эластических свойств клеточной мембраны, посредством фосфорилирования белков цитоскелета [4]. Кроме того, α-адренорецепторы в клетках крови не вовлекаются в регуляцию цАМФ, концентрация которого прямо пропорциональна деформируемости эритроцитов. Адреналиновую нагрузку осуществляли путем инкубации 30 мкл клеточной суспензии в 150 мкл среды Хенкса, содержащей 10-9ммоль/л адреналина в течение 15 мин. Пробу с обзиданом проводили путем инкубации 30 мкл суспензии в 150 мкл среды Хенкса, содержащей 10-9ммоль/л обзидана в течение 15 мин. Инкубацию проб осуществляли при комнатной температуре, по окончании времени воздействия, пробы центрифугировали, 5 мин при 1500 об/ мин, надосадочную жидкость убирали и готовили препараты нативных клеток для сканирования. Морфологию поверхности эритроцитов изучали с использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) ИНТЕГРА Вита (конфигурация на базе инвертированного оптического микроскопа Olympus IX-71). Суспензию эритроцитов наносили на чистые обезжиренные стеклянные подложки, которые помещали во влажную камеру [5] для сохранения их жизнеспособности. Проводили сканирование 25 клеток из каждой опытной и контрольной пробы в полуконтактном режиме с частотой развертки 0,6-0,8 Hz, используя кантилевер серии NSG03, с жесткостью 1,1Н/м и радиусом закругления 10 нм. На полученных сканах с помощью программного обеспечения «Nova» (Зеленоград, 2009) строили

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Скоркина М.Ю.

МОРФОЛОГИЯ И УПРУГО-ЭЛАСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЛЯГУШЕК

профили поверхности эритроцитов в виде кривых, на которых измеряли габаритные размеры и высоту клеток. Упруго-эластические свойства эритроцитов в опытных и контрольных образцах крови изучали методом эластографии с использованием модифицированных кантилеверов. Количественно упругость клеток (модуль Юнга) оценивали по экспериментальным силовым кривым, снятым с поверхности клеток при проведении процедуры силовой спектроскопии. Получаемые в эксперименте,силовые кривые преобразовывали из системы координат D-z в систему F-Δh, где D - ток рассогласования фотодиода, z – расстояние, на которое перемещается кантилевер пьезосканером АСМ при подводе к поверхности [6], затем переводили сигнал рассогласования фотодиода в силу взаимодействия зонда и образца по формуле [7]. Модуль Юнга системы образец-игла рассчитывали по формуле [8]. Результаты экспериментальных исследований обрабатывали методами вариационной статистики. Экспериментальные данные представлены в виде среднеарифметических значений с их средними

стандартными ошибками. Статистический анализ результатов экспериментов проведен с применением критерия Стьюдента для 5%-го уровня значимости. Результаты исследования и их обсуждение. Эритроциты лягушек имеют эллипсоидную форму с центрально расположенным ядром, в центре которого наблюдается углубление, связанное с особенностями расположения хроматина - в виде центральных скоплений, реже – по периферии ядра. Рельеф поверхности нативных эритроцитов лягушек, отсканированных в аутологичной плазме, характеризуется наличием небольшого количества глобулярных образований и углублений в мембране. Углубления представляют собой кластеры, диаметр которых составлял 171,62±12,25 нм, глубина – 16,85±1,25 нм. Высота глобулярных образований (рис. 1) порядка 48,12±8,62 нм, их количество на участке поверхности не превышало 8±0,02. Модуль Юнга эритроцитов лягушек составил 2,37±0,15 µРа, глубина погружения кантилевера – 694,92±7,54 нм.

Рис.1. 3-D-скан участка поверхности нативного эритроцита лягушки в плазме: 1- углубления в виде кластеров, 2 – глобулярные выступы

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Под влиянием адреналиновой нагрузки эритроциты утратили эллипсоидную форму (рис. 2а), а в пробах с обзиданом клетка вытянулась по длинной оси (рис. 2б) по сравнению с контролем (рис. 2в).

Рис.2. АСМ- изображения нативных эритроцитов лягушки: а – под влиянием адреналина; б – под влиянием обзидана; в – контроль (клетки в плазме). Под влиянием адреналиновой нагрузки на поверхности мембраны глобулярные образования укрупнялись (рис. 3а), по сравнению с контролем (рис. 3в). Под воздействием обзидана визуальных изменений в рельефе участков поверхности не выявлено (рис. 3б). Под влиянием адреналиновой нагрузки жесткость эритроцитов увеличилась на 64% (р<0,05). при этом количество глобулярных выступов на участке мембраны уменьшилось на 50% (р<0,05), а их высота

возросла на 254% (р<0,05), по сравнению с контролем (табл. 1). Количество углублений в мембране клеток возросло на 100% (р<0,05), при этом их диаметр и глубина увеличились соответственно на 358% и 60% (р<0,05) по сравнению с контролем. Под влиянием обзидана жесткость клеток достоверно не изменилась по сравнению с контролем, при этом число углублений увеличилось на 12,5% (р<0,05), а их диаметр и высота возросли соответственно на 62% и 76% (р<0,05).

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Скоркина М.Ю.

МОРФОЛОГИЯ И УПРУГО-ЭЛАСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЛЯГУШЕК

Рис.3. Сканограммы участков мембраны эритроцитов лягушек: а – под влиянием адреналина; б - под влиянием обзидана; в – контроль. Таблица 3 Параметры морфологических образований поверхности и упруго-эластические свойства эритроцитов лягушек Типы структур поверхности Глобулярные выступы

Контроль

Адреналин

Обзидан

Высота, нм

48,12±8,62

170,24±15,60*

34,69±3,70^

Количество

24±2,56*

15±1,08*

21±2,04

Углубления в мембране

Диаметр, нм

171,62±12,25

786,12±10,29*

277,67±13,34*

Глубина, нм

16,85±1,25

26,98±2,23*

29,66±1,38*

Количество

8±0,2

16±0,4*

9±0,15*

2,37±0,15

3,89±0,01*

2,16±0,05

Жесткость

Модуль Юнга, µРа Глубина погружения кантилевера, нм

694,92±7,54

209,23±1,50*

693,11±4,14

* – Достоверность различий между значениями в пробах с адреналином/обзиданом и контролем по критерию Стьюдента (р<0,05).

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

membranes containing TA-B-cyclodextrin / Ferreira Q., Coelhoso I.M., Ramalhete N., Marques H.M.C. // Separation Science and Technology. 2006. V. 41 (16). P. 3553-3568. 12. Anderson R., Ramafi G., Theron A.J. Membrane stabilizing anti-oxidative interactions of propranalol and dexpropranalol with neutrophils // Biochemical Pharmacology. 1996. V. 52 (2). P. 341-349. References: 1. Desai A., Mitchison T. J. - Annu. Rev. Cell Develop. Biol. V.13. (1997): pp. 83-117. 2. Babkov V.N., Bobkov D.E., Petukhova O.A., Turoverova L.V., Kropacheva I.V., Podolskay E.P., Pinaev G.P. Alfa-aktinin i sub’edinitsa p65/RelA transkriptsionnogo faktora NF-kβ v kletkah AU31 lokalizuyutsya sovmestno i migriruyut v yadro pri deistvii epidermalnogo faktora rosta // Tsitologiya [Alpha-actinin and р65/RelA Subunit of the Transcription NF-kβ Factor in U31 Cells Localize and Migrate into the Nucleus under the Influence of Epidermal Growth Factor // Cytology]. V.46. no. 12 (2004): pp.1065-1073. 3. Cai X., Xing X., Cai J., Chen Q., Wu S., Haung F. Connection Between Biomechanics and Cytoskeleton Structure of Lymphocyte and Jurkut Cells: An AFM study // PMID. V. 41. no 3 (2010): pp. 257-262. 4. Tuvia S., Moses A., Gulayev N., Levin S., Korenstein R. β-Adrenergic agonists regulate cell membrane fluctuations of human erythrocytes // J. of Physiol. V. 516 no. 3 (1999): pp. 781-792. 5. Skorkina M.Yu., Chernyavskiy S.D., Fedorova M.Z., Zabinyakov N.A., Sladkova E.A. Evaluation of morphometric parameters of native blood cells by atomic force microscopy // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. V. 150. no. 2 (2010): pp. 238-240. 6. Lebedev D.V., Chulkanov A.P., Buharaev A.A., Druginina O.C. Izmerenie modulya Junga biologicheskih ob’ektov v zhidkoi srede s pomoschyu spetsialnogo zonda atomno-silovogo mikroskopa // Pisma v ZhTF [The Assessment of Joung’s Modulus of Biological Objects in the Liquid Medium with the Help of a Special Atomic Force Microscope Probe Unit // Letters in Journal of Theoretical Physics]. V. 35. no. 8 (2009): pp. 54-61. 7. Butt H.J., Capella B., Kappl M. Force

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and application // Surf. Sci. Rep. V.59 (2005): pp. 1-152. 8. Capella B., Dietlr G. Force-distance curves by atomic force microscopy // Surf. Sci. Rep. // Surf. Sci. Rep. V.34 (1999): pp. 1-104. 9. Hilario S., Saldanha C., Martins S.J. An in vitro study of adrenaline effect on human erythrocyte properties in both gender // Clinical hemoreology and microcirculation. V.28. no. 2 (2003): pp. 89-98. 10. Dumplis M.A., Kudryashova N.I. Antiaritmicheskie sredstva: klassifikatsiya, struktura, mekhanizm deistviya // Khimiko-farmatsevticheskiy Zhurnal [Antiarrhythmics: Classification, Structure, Mechanism of Action // Chemical and Farmacol. Journal]. no. 10 (1983): pp. 1159-1169. 11. Ferreira Q., Coelhoso I.M., Ramalhete N., Marques H.M.C. Resolution of racemic propranalol in liquid membranes containing TA-B-cyclodextrin // Separation Science and Technology. V.41. no.16 (2006): pp. 3553-3568. 12. Anderson R., Ramafi G., Theron A.J. Membrane stabilizing anti-oxidative interactions of propranalol and dexpropranalol with neutrophils // Biochemical Pharmacology. V. 52 no. 2 (1996): pp. 341-349.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ Скоркина Марина Юрьевна кандидат биологических наук, доцент Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: skorkina@bsu.edu.ru DATA ABOUT THE AUTHOR Skorkina Marina Yuryevna PhD in Biology, Associate Professor Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: skorkina@bsu.edu.ru

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Скоркина М.Ю.

МОРФОЛОГИЯ И УПРУГО-ЭЛАСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЛЯГУШЕК

В целом, в условиях адреналиновой нагрузки существенно возрастает жесткость эритроцитов параллельно с этим в рельефе поверхности установлено снижение числа глобулярных структур, высота которых увеличивается. В параллельных опытах с обзиданом жесткость клеток, а также морфология глобулярных структур достоверно не различались по сравнению с контролем. Выявленные морфологические изменения поверхности мембраны эритроцитов могут быть связаны с участием в метаболизме катехоламинов – выполнять функцию транспортировки и депо адреналина. В экспериментах на эритроцитах человека установлено, что отдельные участки поверхности могут выступать резервуарами для адреналина и норадреналина, регулирующими парциальное давление кислорода в процессах оксигенации [9]. В противоположность, наблюдаемые изменения рельефа поверхности в условиях блокады β-адренорецепторов, вероятнее всего, связаны с высоким сродством обзидана к липидному бислою мембран, который оказывает мембранностабилизирующее действие [10]. На нейтрофилах показано: проникая в липидный бислой, обзидан изменяет его свойства [11], подавляет аденилатциклазу и уменьшает образование цАМФ [12]. Заключение. Изменения морфологии и рельефа поверхности клеток тесно связаны с упруго-эластическими свойствами клеточных мембран. Увеличение жесткости эритроцитов сопровождается снижением числа глобулярных структур на поверхности мембраны, причем высота их существенно возрастает. Выявленная взаимосвязь имеет большое значение в области диагностики функционального состояния клетки неинвазивными методами.

Литература: 1. Desai A., Mitchison T. J. Microtubule polymerization dynamics //Annu. Rev. Cell Develop. Biol. 1997. V.13. P. 83-117. 2. Альфа-актинин и субъединица р65/ RelA транскрипционного фактора NF-kβ в клетках AU31 локализуются совместно и мигрируют в ядро при действии эпидермального фактора роста / Бабаков В.Н., Бобков Д.Е., Петухова О.А., Туроверова Л.В., Кропачева И.В., Подольская Е.П., Пинаев Г.П. // Цитология. 2004. Т. 46 (12). С. 1065-1073. 3. Connection between biomechanics and cytoskeleton structure of lymphocyte and Jurkut cells: An AFM study / Cai X., Xing X., Cai J., Chen Q., Wu S., Haung F // PMID. 2010. V. 41(3). P. 257-262. 4. β-Adrenergic agonists regulate cell membrane fluctuations of human erythrocytes / Tuvia S., Moses A., Gulayev N., Levin S., Korenstein R. // J. of Physiol. 1999. V. 516 (3). P. 781-792. 5. Evaluation of morphometric parameters of native blood cells by atomic force microscopy / Skorkina M.Yu., Chernyavskiy S.D., Fedorova M.Z., Zabinyakov N.A., Sladkova E.A. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2010. V. 150(2). P. 238-240. 6. Измерение модуля Юнга биологических объектов в жидкой среде с помощью специального зонда атомно-силового микроскопа / Лебедев Д.В., Чулканов А.П., Бухараев А.А., Дружинина О.С. // Письма в ЖТФ. 2009. Т. 35 (8). С. 54-61. 7. Butt H.J., Capella B., Kappl M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and application // Surf. Sci. Rep. 2005. V. 59. P. 1-152. 8. Capella B., Dietlr G. Force-distance curves by atomic force microscopy // Surf. Sci. Rep. 1999. V. 34. P. 1-104. 9. Hilario S., Saldanha C., Martins S.J. An in vitro study of adrenaline effect on human erythrocyte properties in both gender // Clinical hemoreology and microcirculation. 2003. V.28 (2). P. 89-98. 10. Думплис М.А., Кудряшова Н.И. Антиаритмические средства: классификация, структура, механизм действия // Химико-фармацевтический журнал. 1983. №10. С.1159-1169. 11. Resolution of racemic propranalol in liquid

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

УДК 576.08

СЛАДКОВА Е.А. SLADKOVA E.A.

ОЦЕНКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА МИТОГЕН-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ THE STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STATUS OF MITOGEN-TRANSFORMED LYMPHOCYTES

Аннотация

Abstract

С использованием методов атомносиловой микроскопии получены новые данные о структуре и свойствах трансформированных лимфоцитов. Показано, что конкановалин А-стимулированные клетки имеют рифленую плазмалемму с преобладанием крупных глобул. Одновременно происходит увеличение жесткости и потенциала их поверхности. Установленные структурно-функциональные особенности пролиферирующих in vitro лимфоцитов могут быть использованы в качестве модели для исследования опухолевого перерождения клеток крови.

The new data on the structure and properties of mitogen-transformed lymphocytes’ was obtained using the methods of atomic-force microscopy. The study demonstrates that Con-A-stimulated cells have grooves in the plasmalemma with the predominance of large globules. Their stiffness and potential surface increase simultaneously. The discovered structural and functional features of proliferating in vitro lymphocytes can be used as a model in the studies of tumor blood cell degeneration.

Ключевые слова: трансформация лимфоцитов; митоген; упруго-эластические свойства; потенциал поверхности; рельеф поверхности, атомно-силовая микроскопия. Трансформированные клетки, в том числе лимфоциты, существенно отличаются от нормальных по своей морфологии [1]. Показано, что трансформацию клеток как in vivo, так и in vitro могут вызывать различные стимулы (вирусы, канцерогены и т.п.). Однако не зависимо от природы трансформирующего фактора,

Key words: lymphocytes transformation; mitogen; elastic properties; surface charge; surface form; atomic-force microscopy.

интерес к изучению структурно-функциональных особенностей перерождающихся лимфоцитов продиктован возможностью определения ключевых моментов в формировании опухолевого фенотипа клеток в организме человека. Рядом работ показаны аналогии в поведении клеток, трансформированных in vitro и прошедших опу-

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Сладкова Е.А.

ОЦЕНКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА МИТОГЕН-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ

холевое перерождение [2]. В частности, у таких клеток происходят однотипные нарушения регуляции адгезии и подвижности [3], обусловленные перестройками структур цитоскелета [4], что способствует распластыванию клеток или приобретению ими шаровидной формы [5]. Кроме того, трансформация лимфоцитов непосредственно связана с изменением структуры и функций их плазмалеммы, прежде всего ее электрических [6] и механических свойств [7]. Целью нашей работы явилась оценка структуры и функциональных свойств митоген-стимулированных лимфоцитов. Материалы и методы исследования. Экспериментальная работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии живых организмов НИУ «БелГУ». Объект исследования – лимфоциты периферической крови здоровых доноров, стимулированные Кон А. Контролем служили лимфоциты, культивированные в питательной среде без митогена. Забор периферической крови здоровых доноров осуществляли из локтевой вены с участием специализированного медперсонала клинической лаборатории областной больницы г. Белгорода. Для сбора крови использовали вакуумные пробирки Vacuette K3E, содержащие сухую ЭДТА в концентрации 2,0 мг на 1 мл крови. Разделение пробы крови на лейкоциты и эритроциты проводили путем центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об./мин, полученную надосадочную жидкость и лейкоцитарное кольцо отбирали, затем центрифугировали еще 10 мин при той же скорости. В конечном результате получали суспензию лейкоцитов. Для исследований готовили по 25 проб опытной группы из лейкосуспензии, культивированной с Кон А, и контрольной –

без митогена. Культивирование лимфоцитов осуществляли по следующей схеме: для приготовления 1 пробы 1 мл свежевыделенной суспензии лейкоцитов соединяли с 5 мл питательной смеси [8] и инкубировали в течение 48 часов при 37°C в присутствии 5% CO2. В опытной группе к культуральной среде добавляли 0,02 мл Кон А. Доза митогена была выбрана согласно известным методикам [9]. По окончании времени инкубации из каждой пробы отбирали 4,5 мл питательной среды, оставшуюся часть которой перемешивали с лейкоцитарной массой, находящейся на дне инкубационной пробирки. Морфологию и микрорельеф поверхности лимфоцитов изучали в полуконтактном режиме на АСМ ИНТЕГРА Вита фирмы NT-NDT (конфигурация на базе инвертированного оптического микроcкопа Olympus IX-71). Пробоподготовку для АСМ-исследования проводили следующим образом: суспензию лейкоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло и помещали во влажную камеру. Сканирование 15 клеток из пробы осуществляли согласно разработанному «Способу исследования нативных клеток крови» (патент № 2009125268). На полученных сканах измеряли геометрические параметры лимфоцитов и анализировали неоднородности их клеточной поверхности, используя при этом следующие программные продукты: для расчета высоты (h, мкм) и диаметра (d, мкм) клеток – Nova (NT-MDT, Россия), для расчета площади (S, мкм2) и объема (V, мкм3) клеток Gwyddion (Gwyddion.net). С целью оценки структурных неоднородностей клеточной поверхности строили кривые профиля бокового сечения (рис. 1).

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Рис.1. Профиль бокового сечения лимфоцита Проводили подсчет количества, измеряли линейные размеры углублений и глобулярных выступов на участке плазмалеммы площадью 3×3 мкм. Упруго-эластические свойства лимфоцитов изучали в режиме силовой спектроскопии [10]. Исследования проводили с использованием модифицированного зонда, изготовленного на основе полимерных микросфер, прикрепленных к типлессу серии CSG 11, согласно «Способу определения упругости клеток крови» (патент № 2466401). Регистрировали силовые кривые отвода и подвода кантилевера с поверхности 30 клеток из каждой пробы. Полученные силовые кривые обрабатывали на основе модели Герца в модификации Снедона [11]. С целью изучения потенциала поверхности (ПП) в одиночных лимфоцитах проводили его измерение в режиме зонда Кельвина на АСМ [10]. Суспензию лейкоцитов для измерения потенциала поверхности (ПП) готовили согласно «Способу регистрации изменения поверхностного заряда» (патент РФ № 2027188). Готовили препараты на обезжиренной металлической подложке. Измерение потенциала поверхности (ПП) осуществляли с помощью кантилевера с токопроводящим

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

титановым покрытием серии NSG03/TiN (Nanoworld, USA). Из каждой пробы сканировали по 15 клеток и проводили обработку полученных сканов в программе Nova (Зеленоград, 2009). Миграционную активность белых клеток крови оценивали с помощью реакции торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ) [12]. Использовали методику РТМЛ в прямом капиллярном тесте [13]. Вычисляли процент мигрировавших клеток по методу Новикова Н.Д. [14]. С целью изучения пространственного расположения и измерения длины пучков филаментов цитоскелетных структур лимфоцитов здоровых доноров и больных лейкозом готовили цитологические препараты. Методика приготовления цитологических препаратов включала следующие этапы: стабилизация элементов цитоскелета, лизис мембран, фиксация клеток и их окраска для световой микроскопии [15]. Анализ цитологических препаратов осуществляли с помощью комплекса аппаратно-программной (АПК) визуализации изображения «ВидеоТестМастерМорфология» (производитель НПФ «ВидеоТест», Санкт-Петербург, рег. удостоверение № 29/20010702/6102-04 от 16.02.2004). Для визуализации цитоскелетных структур использовали программное обеспечение «Видео-Тест-Размер 5.0» (НПФ «ВидеоТест», Санкт-Петербург). На полученных препаратах наблюдали лимфоцитарные формы с темноокрашенным ядром и просветленной цитоплазмой, в области которой выявляли сеть фибрилл. На каждом препарате изучали по 30 клеток. Определяли особенности расположения структур цитоскелета в клетках и измеряли длину пучков филаментов, отдельные нити фибрилл визуализировать не удалось. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Сладкова Е.А.

ОЦЕНКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА МИТОГЕН-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ

Результаты исследования и их обсуждение. В лейкосуспензии здоровых доноров, инкубированной с Кон А, обнаружены субпопуляции клеток разных размеров. На основе величин диаметров лимфоциты были разделены на 3 группы: микроциты – клетки в диаметре до 5 мкм, нормоциты – 5,1-10 мкм, бласты – свыше 10 мкм. Микроциты и нормоциты имели округлую форму. Лимфобласты обладали неправильными контурами цитоплазмы, располагающейся широким ободком вокруг ядра.

В рельефе поверхности микроцитов доноров отмечено присутствие глобулярных образований (рис. 2). Переход субпопуляции микроцитов в более зрелые формы – нормоциты – сопровождался потерей большей части морфологических образований плазмалеммы. Глобулярные выступы плазмалеммы нормоцитов имели округлую форму, крупных инвагинаций не выявлено. Рельеф лимфобластов был сглажен.

Рис. 2. Рельеф поверхности лимфоцитов: а – без воздействия Кон А; б – микроцыты; в – нормоциты; г – бласты

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Элементы цитоскелета в субпопуляции микроцитов, культивированных с Кон А, представлены сетью, направленной радиально от ядра клетки к периферии (рис. 3). В субпопуляции нормоцитов наблюдали смещение ядра к полюсу клетки, в результате чего сеть элементов цитоскелета располагалась с одной стороны, прони-

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

зывая слой не полностью лизированной цитоплазмы. В лимфобластах визуализировали густую сеть из тонких пучков элементов цитоскелета, располагающихся в зоне перинуклеарного пространства, отдельные пучки которых расходились радиально к периферии.

Рис. 3. Элементы цитоскелета лимфоцитов: а – без воздействия; Кон А; б – микроцыты; в – нормоциты; г – бласты (стрелкой показаны пучки цитоскелетных структур, располагающихся вокруг ядра)

Проанализированы морфология и функциональные параметры субпопуляции митоген-стимулированных нормоцитов. В качестве контроля были нормоциты без митогенной стимуляции. В результате проведенного анализа установлено снижение площади поверхности и объема клеток, стимулированных Кон А, соответственно на 8% и 3% (р<0,05) по сравнению с контрольной группой (табл. 1).

Заряд клеточной поверхности под влиянием Кон А увеличился на 77% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 1). Жесткость плазмалеммы возросла на 110% (р<0,05). Под действием Кон А длина структур цитоскелета «жестких» нормоцитов достоверно не отличалась от контроля, но двигательная активность снизилась на 61% (р<0,05).

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Сладкова Е.А. ОЦЕНКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА МИТОГЕН-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ

Морфофункциональные параметры лимфоцитов

Таблица 1

Нормоциты без воздействия Кон А

Нормоциты, инкубированные с Кон А

Площадь поверхности, мкм2

80,4±0,3а

74,1±0,2

Объем, мкм3

39,1±0,8а

39,9±0,6

Диаметр, мкм

6,3±0,8

5,9±0,2

Высота, мкм

0,9±0,1

Модуль Юнга, мПа

3,9±0,1а

8,2±0,9

Потенциал поверхности, мВ

-37,3±0,2а

-21,1±0,5

Длина пучков цитоскелета, мкм

0,78±0,2

0,9±0,2

Процент мигрировавших клеток, %

20,3±0,8а

7,9±0,3

Параметр

Статистически достоверные различия между значениями лимфоцитов без воздействия Кон А и инкубированных с Кон А

В условиях митогенной стимуляции существенно изменилась морфология клеточной поверхности нормоцитов. Под влиянием Кон А глубина и ширина инваги-

наций возросли соответственно на 47% и 55% (р<0,05) по сравнению с нормоцитами контрольной группы (рис. 4).

60 50 40 30 20 10 0 контроль Количество глобул Количество инвагинаций

Кон А Высота глобул, нм Глубина инвагинаций, нм

Ширина глобул, нм Ширина инвагинаций, нм

Рис. 4. Морфометрические параметры структурных образований поверхности лимфоцитов

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Ширина глобулярных образований нормоцитов снизилась на 79% (р<0,05). При этом количество глобул и инвагинаций на поверхности уменьшилось соответственно на 71% и 70% (р<0,05) по сравнению с контролем. Нами проведено исследование влияния Кон А на лимфоциты здоровых людей с целью создания модели интенсивной пролиферации клеток с последующим изучением особенностей их морфофункциональной организации. Под влиянием Кон А лимфоциты вступали в цикл деления. В результате чего наблюдали появление нескольких субпопуляций клеток, различающихся как морфологически, так и функционально. Установлено увеличение размеров и сглаживание рельефа поверхности в ряду микроциты – нормоциты – бласты. Кон А-стимулированные нормоциты характеризуются мелкими размерами и повышенной жесткостью по сравнению с контролем. Вероятно, под действием Кон А в таких клетках происходят активные процессы биосинтеза цитокинов [16], которые упаковываются в гранулы и скапливаются в подмембранном слое, способствуя повышению жесткости клетки. Известно, что упруго-эластические свойства клеток крови тесно связаны с организацией подмембранных структур цитоскелета [17], однако в проведенном исследовании существенных различий в расположении и длине элементов цитоскелета между нормоцитами опытной и контрольной групп не выявлено. При активации лимфоцитов Кон А происходит поток ионов Са2+ внутрь клетки [18], что в свою очередь ведет к деполяризации клеточной мембраны [19]. Данная схема изменения ПП согласуется с полученным нами результатами в пробах с Кон А. Изменение свойств поверхности Кон Астимулированных нормоцитов сопровождалось появление крупных глобулярных образований и снижением двигательной активности. По данным литературы митоген-сти-

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

мулированные лимфоциты активно синтезируют фактор LMIF, снижающий скорость полимеризации актиновых филаментов [20]. В свою очередь локализация G-актина в отдельных участках клетки может спровоцировать кластеризацию ее мембраны [21]. Заключение. Использование АСМ-инструментария позволило установить изменения ультраструктуры, упруго-эластических свойств и потенциала поверхности Кон А-стимулированных лимфоцитов, которые могут быть использованы в качестве индикатор трансформации клеток. Появление на поверхности Кон А-стимулированных лимфоцитов крупных глобул сопровождается увеличением жесткости и потенциала поверхности, что обуславливает снижение их двигательной активности. Выявленные особенности морфофункциональной организации лимфоцитов при интенсивной пролиферации in vitro могут быть использованы для понимания ключевых моментов, способствующих опухолевому перерождение лимфоцитов в организме человека. Литература: 1. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells / Mani S.A., Guo W., Liao M.J., Eaton E.N., Ayanan A., Zhou A.Y., Brooks M., Reinhard F., Zhang C.C., Shipitsin M., Campbell L.L., Polyak K., Brisken C., Yang J., Weinberg R.A. // Cell. 2008. V.133. P. 704-715. 2. Фултон А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клетки. [Пер. С англ.] М.: Мир, 1987. 120 с. 3. Yamazaki K., Allen T.D. Ultrastructural morphometric study of efferent nerve terminals on murine bone marrow stromal cells and the recognition of a novel anatomical unit: The ‘neuro-reticular complex’ // Am J Anat. 1990. V. 187. P. 261-276. 4. Шутова М.С. Изменения актинового цитоскелета и динамики клеточного края, определяющие характер клеточной миграции при трансформации фибробластов: Автореф. дис. … к-та биол. наук. 2010. 23 с.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Сладкова Е.А.

ОЦЕНКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА МИТОГЕН-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ

5. Small J. V. The actin cytockeleton. Electron Microsc. Rev.1998. V. 1. P. 155-174. 6. Тарасова И.М. Изменение физико-химических свойств лимфоцитов в процессах развития индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение: Дис. … к-та физ.-мат. наук. Москва.1985. 187 с. 7. Горло Е.И. Структурно-функциональное состояние мембран клеток крови и лимфы у онкологических больных при различных химиотерапевтических воздействиях: Автореф. … к-та биол. наук. Ростов-на-Дону. 2000. 24 с. 8. Фролова И.В. Готовая форма питательной среды для культивирования лимфоцитов периферической крови человека // Биотехнология. 1994. № 9. С. 22-25. 9. Эшмен Р.Ф. Активация лимфоцитов // Иммунология. [Под ред. У. Пола]. М.: Мир. 1987. Т.1. С. 414-469. 10. Руководство пользователя «Зондовая нанолаборатория Интегра Вита». Зеленоград: Copyright НТМДТ. 2006. 57 с. 11. Wojcikiewicz E., Zhang X., Moy V. Force and compliance measurements on living cells using atomic force microscopy // Biol. Proced. Online. 2004. V.6(1). P. 1-9. 12. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В., Истамов X. И. Экологическая иммунология. М.: ВНИРО. 1995. 219 с. 13. Новиков Д.К., Новиков П.Д., Титова И.Д. Иммунокоррекция, иммунопрофилактика, иммунореабилитация. Витебск: ВГМУ. 2006. 198 с. 14. Эшмен Р.Ф. Активация лимфоцитов // Иммунология. [Под ред. У. Пола]. М.: Мир. 1987. Т.1. С. 414-469. 15. Ченцов Ю.С., Воробьев И.А., Надеждина Е.С. Простой способ выявления центриолей и цитоскелета в клетках культуры ткани с помощью световой микроскопии // Цитология. 1982. Т. 34, № 3. С. 65-71. 16. Signaling pathways involved in the effects of different fatty acids on interleukin-2 induced human lymphocyte proliferation / Gorjao R., Hirabara1 S., Cury-Boaventura M., Martins de Lima T., Passos M., Curi R. // Immunology. 2013. V. 4. P. 1-13. 17. Stossel T.T., Janmey P.A., Zanner K.S. The cortical cytoplasmic actin gel // Cytomechanics. 1987. P. 131-153.

18. Toyoshima S., Hoshikawa T., Miyashita M. Contribution of the body parts to throwing performance // Biomechanics. 1976. P. 169-174. 19. Шестакова С.В. Физико-химические механизмы активации лимфоцитов лектинами: Автореф. … к-та биол. наук. Москва. 1985. 25 с. 20. Scielzo C., Ghia P., Conti A. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses // J. Clin. Invest. 2005. V. 115(6). P. 1644-1650. 21. Sechi A.S., Wehland J. The actin cytoskeleton and plasma membrane connection: PtdIns(4,5)P(2) influences cytoskeletal protein activity at the plasma membrane // J. Cell Sci. 2000. V.113. P. 3685–3695. References: 1. Mani S.A., Guo W., Liao M.J., Eaton E.N., Ayanan A., Zhou A.Y., Brooks M., Reinhard F., Zhang C.C., Shipitsin M., Campbell L.L., Polyak K., Brisken C., Yang J., Weinberg R.A. The Epithelial-Mesenchymal Transition Generates Cells with Properties of Stem Cells // Cell, no. 133. (2008): pp. 704-715. 2. Fulton A. Tsitoskelet. Arkhitektura i khoreografiya kletki [Cytoskeleton. The Architecture and Choreography of the Cell]. Moscow: Mir, 1987. 120 p. 3. Yamazaki K., Allen T.D. Ultrastructural morphometric study of efferent nerve terminals on murine bone marrow stromal cells and the recognition of a novel anatomical unit: The ‘neuro-reticular complex’ // Am J Anat. 1990. V. 187. pp. 261-276. 4. Shutova M.S. Izmeneniya aktinovogo tsitoskeleta i dinamiki kletochnogo kraya, opredelyayuschie kharakter kletochnoi migratsii pri transformatsii fibroblastov: Avtoref. dis. … k-ta biol. nauk [Changes in the Actinic Cytoskeleton and Dynamics of Cistic Edge Determining the Character of Cell Migration in Fibroblast Transformation: Abstract of PhD Thesis in Biology]. Moscow, 2010. 23 p. 5. Small J. V. The actin cytockeleton. Electron Microsc. Rev.1998. V. 1. pp. 155-174.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

6. Tarasova I.M. Izmenenie fiziko-khimicheskih svoistv limfotsitov v protsessah razvitiya indutsirovannogo kantserogeneza i obschei reaktsii na povrezhdenie: Dis. … k-ta fiz.-mat. Nauk [Changes in Physical and Chemical Properties of Lymphocytes in the Processes of Induced Carcenogenesis and General Reaction to the Damage: PhD Thesis in Physics and Mathematics]. Moscow. 1985. 187 p. 7. Gorlo E.I. Strukturno-funktsionalnoe sostoyanie membran kletok krovi i limphy u onkologicheskih bolnyh pri razlichnyh khimioterapevticheskih vozdeistviyah: Avtoref. … k-ta boil. nauk [Structural and Functional Condition of Blood and Lymph Cell Membranes in Cancer Patients in Various Chemotherapy Treatments: Abstract of PhD Thesis in Biology]. Rostov-on-Don. 2000. 24 p. 8. Frolova I.V. Gotovaya forma pitatelnoy sredy dlya kultivirovaniya limfotsitov perifericheskoy krovi cheloveka // Biotekhnologiya [A Finished Form of Nutrient Solution for Cultivation of Lymphocytes of Human Peripheral Blood // Biotechnology]. no. 9. (1994): pp. 22-25. 9. Eshmen R.F. Aktivatsiya limfotsitov // Immunologiya [Activation of Lymphocytes // Immunology]. no.1. (1987): pp. 414-469. 10. Rukovodstvo polzovatelya “Zondovaya nanolaboratoriya Integra Vita” [The Manual “Probe Nanolaboratory Integra Vita]. Zelenograd. Copyright NTMDT. 2006. 57 p. 11. Wojcikiewicz E., Zhang X., Moy V. Force and Compliance Measurements on Living Cells Using Atomic Force Microscopy // Biol. Proced. Online. 2004. V.6 (1). pp. 1-9. 12. Khaitov R. M., Pinegin B. V., Istamov Kh.I. Ekologicheskaya immunologiya [Ecological Immunology]. Moscow: VNIRO, 1995. 219 p. 13. Novikov D.K., Novikov P.D., Titova I.D. Immunokorrektsiya, immunoprofilaktika, immunoreabilitatsiya [Immunocorrection, Immunoprophylaxis, Immunorehabilitation]. Vitebsk: VGMU, 2006. 198 p. 14. Eshmen R.F. Aktivatsiya limfotsitov // Immunologiya [Activation of Lymphocytes // Immunology]. no.1. (1987): pp. 414-469. 15. Chentsov Yu.S., Vorobyev I.A., Nadezhdina Ye.S. Prostoy sposob viyavleniya tsentrioley i tsitoskeleta v kletkah kultury tkani s pomoschyu svetovoy mikroskopii // Tsitologiya [A Simple

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Method of Identifying Centrioles and Cytoskeleton in Culture Cells with the Use of Light Microscopy // Citology]. no. 34, no. 3. (1982): pp. 65-71. 16. Gorjao R., Hirabara1 S., Cury-Boaventura M., Martins de Lima T., Passos M., Curi R. Signaling pathways involved in the effects of different fatty acids on interleukin-2 induced human lymphocyte proliferation // Immunology. 2013. V. 4. pp. 1-13. 17. Stossel T.T., Janmey P.A., Zanner K.S. The Cortical Cytoplasmic Actin Gel // Cytomechanics. 1987. pp. 131-153. 18. Toyoshima S., Hoshikawa T., Miyashita M. Contribution of the body parts to throwing performance // Biomechanics. 1976. pp. 169-174. 19. Shestakova S.V. Fiziko-khimicheskie mekhanizmy aktivatsii limfotsitov lektinami: Avtoref. … k-ta biol. nauk [Physical and Chemical Mechanisms of Activating Lymphocytes with Lectins: Abstract of PhD Thesis in Biology]. Moscow, 1985. 25 p. 20. Scielzo C., Ghia P., Conti A. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses // J. Clin. Invest. 2005. V. 115(6). pp. 1644-1650. 21. Sechi A.S., Wehland J. The actin cytoskeleton and plasma membrane connection: PtdIns (4,5)P(2) influences cytoskeletal protein activity at the plasma membrane // J. Cell Sci. 2000. V.113. pp. 3685–3695.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ Сладкова Евгения Анатольевна аспирант

Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: evgenija-sladkova00@rambler.ru

DATA ABOUT THE AUTHOR Sladkova Evgeniya Anatolievna Postgraduate Student Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: evgenija-sladkova00@rambler.ru

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Шамрай Е.А., Кротова Е.Е.

МИГРАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ЛЕЙКОЗОМ

УДК 576.322.2

ШАМРАЙ Е.А., КРОТОВА Е.Е SHAMRAY E.A., KROTOVA E.E.

МИГРАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ЛЕЙКОЗОМ THE MIGRATION ACTIVITY OF THE LYMPHOCYTES IN HEALTHY DONORS AND PATIENTS WITH LEUKEMIA Аннотация

Abstract

С использованием метода торможения миграции лимфоцитов изучена двигательная активность лимфоцитов здоровых доноров и больных различными формами лейкоза. Установлено, что двигательная активность лимфоцитов больных как острым, так и хроническим типами лейкоза снижена в среднем на 27-82% по сравнению со здоровыми донорами. В тестах с митоген стимулированными клетками показано, что под влиянием ФГА миграционная активность лимфоцитов больных острым миелобластным лейкозом возрастает на 10%, в группах больных другими типами лейкоза снижается на 10-55% по сравнению со здоровыми донорами. Под влиянием Кон А двигательная активность лимфоцитов больных лейкозом снижена на 42-57% относительно контрольной группы. Активация лимфоцитов в присутствии митогенов представляет удобную модель для изучения процессов роста и пролиферации клеток млекопитающих.

Using the method of inhibition of lymphocyte migration, the authors have studied the migration activity of lymphocytes in healthy donors and patients with leukemia. The study proves that the lymphocytes migration activity in both acute and chronic types of leukemia has decreased by about 27-28% as compared with healthy donors. The tests with mitogen stimulation cells demonstrate that under the influence of PHGA, the migration activity of lymphocytes in patients with acute mieloblastic leucosis has increased by 10%, and in the groups with other types of leucosis it has decreased by 10-55% as compared with healthy donors. Under the influence of Con A, the migration activity of lymphocytes in patients with leukemia has decreased by 4257% as compared with a control group. The activation of lymphocytes in the presence of mitogens is a convenient model for studying the processes of growth and proliferation of cells in mammals.

Ключевые слова: лимфоциты; миграционная активность; лейкоз; митогены. Миграционная активность лимфоцитов является важным показателем функционального состояния клеток, отклонение которого от нормы происходит вслед-

Key words: lymphocytes; activity; leucosis; mitogens.

migration

ствие перестроек в структуре элементов цитоскелета [1]. Удобной моделью для изучения процессов трансформации элементов цитоскелета является стимуляция

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

лимфоцитов митогенами. По данным литературы, митогенная стимуляция лимфоцитов индуцирует изменение компонентов мембран [2], перестройку структур цитоскелета [3], увеличивает уровень сенсибилизации клеток [4]. Целью выполненного исследования было изучение особенностей миграционной активности лимфоцитов здоровых доноров и больных различными типами лейкоза в условиях митоген стимулированной трансформации. Материалы и методы исследования. В экспериментальной части работы использовали венозную кровь здоровых доноров (100 человек) в возрасте от 25 до 45 лет. В работе исследована кровь больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) и хроническим лимфобластным лейкозом (ХЛЛ) (120 человек). В качестве контроля использовали кровь здоровых доноров (100 человек). Кровь получали путем венепункции. Миграционную активность лимфоцитов оценивали с помощью реакции торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ). Получали лейкоцитарную суспензию путем центрифугирования при 1500 об./мин, которую делили на три пробы по 1 мл в каждой. Первую пробу инкубировали без добавления митогенов, вторую – с добавлением 0,02 мл фитогемагглютинина (ФГА), третью – с 0,02 мл конканавалина А (Кон А). Использовали методику РТМЛ в прямом капиллярном тесте с учетом жизнеспособности лимфоцитов не менее 95% [5]. Жизнеспособность клеток проверяли в камере Горяева после окраски трипановым синим [6]. Заполняли стеклянные капилляры клеточной суспензией (по 0,1 мл). С одного конца капилляр запаивали; другой, содержащий клетки, погружали в агарозные лунки, заполненные 1 мл среды № 199. Для каждой суспензионной пробы в затвердевшем геле пробивали 5 лунок. Капилляры инкубировали при 37°С в течение 24 ч в вертикальном положении. Мигрировавшие из них клетки ресу-

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

спендировали, оценивали их жизнеспособность описанным выше способом. Для определения количества лимфоцитов в 1 мкл крови использовали стандартные методики. Расчет числа лимфоцитов проводили по формуле: , (1) где Х – число лимфоцитов в 1 мкл крови; а – число лимфоцитов в 25 больших квадратах; б – разведение крови; в – число подсчитанных малых квадратов. Вычисляли индекс подавления миграции лимфоцитов митогеном в сравнении со спонтанной (без митогена) миграцией. Расчет индекса проводили по следующим формулам: , (2) , (3) где ИТМЛ – индекс торможения миграции лимфоцитов; n (к) – количество мигрировавших лимфоцитов без воздействия митогенов (контроль); n (о) – количество лимфоцитов, мигрировавших под влиянием митогенов ФГА или Кон А (опыт). Статистическую обработку данных осуществляли с использованием электронных таблиц «Microsoft Excel 7.0». Достоверность полученных данных оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты исследования и их обсуждение. В группе здоровых доноров процент мигрировавших клеток в контрольных пробах составил 20,3±0,8%. У больных ОМЛ количество мигрировавших лимфоцитов в пробах без воздействия митогенов составило 14,9±1,0% от начального. В группе больных ОЛЛ двигательная активность лимфоцитов в контроле составила 14,3±0,7%. На стадии ремиссии ОЛЛ

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

миграционная активность лимфоцитов в контроле достоверно не различалась с фазой острого протекания заболевания и составила 11,1±0,4%. В группе больных ХЛЛ количество мигрировавших клеток составило 3,6±0,3%.

Шамрай Е.А., Кротова Е.Е.

МИГРАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ЛЕЙКОЗОМ

Установлено существенное снижение миграционной активности в группе больных людей по сравнению со здоровыми донорами (рис. 1).

Рис. 1. Процент мигрировавших лимфоцитов в группах здоровых доноров и больных лейкозом в норме У здоровых доноров количество лимфоцитов до миграции в пробах с ФГА было снижено на 20% (р<0,05), а после проведения теста на миграцию – на 38% (р<0,05) по сравнению с контролем. В пробах с Кон А число лимфоцитов до миграции достоверно не различалось с контролем, а после миграции снизилось на 64 % (р<0,05). В целом, при добавлении митогенов в инкубационную среду миграционная активность лимфоцитов существенно снижается. Наиболее выраженное тормозящее влияние на двигательную активность белых клеток крови оказывал Кон А. В группе больных ОМЛ в пробах с ФГА число клеток до миграции было снижено на 76,6% (р<0,05), в то же время после миграции – 69% (р<0,05) по сравнению с контролем. При добавлении в инкубационную среду Кон А число лимфоцитов до миграции было снижено на 62% (р<0,05), а после миграции – на 91% (р<0,05) по сравнению с контролем. Двигательная

активность лимфоцитов больных ОМЛ существенно замедляется под влиянием КонА и ускоряется при добавлении в среду инкубации ФГА. У больных ОЛЛ под влиянием ФГА количество лимфоцитов до миграции было снижено на 35% (р<0,05), в то время как после миграции – на 60,5% (р<0,05) по сравнению с контролем. При добавлении в среду Кон А число лимфоцитов до миграции уменьшилось на 41% (р<0,05), а после миграции – на 85,7% (р<0,05) по сравнению с контролем. В группе больных ОЛЛ в стадии ремиссии под влиянием ФГА число лимфоцитов до миграции было снижено на 27% (р<0,05), а после миграции – на 32,5% (р<0,05) по сравнению с контролем. При добавлении в среду Кон А число клеток до миграции практически не отличалось от значений контроля, а после миграции снизилось на 58% (р<0,05) по сравнению с контролем. Под влиянием митогенов миграцион-

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

ная активность лимфоцитов больных ОЛЛ снижается. Наиболее выраженное торможение миграции лимфоцитов под влиянием митогенов установлено в группе больных ОЛЛ с острым течением болезни. У больных ХЛЛ в пробах с ФГА количество лимфоцитов до миграции было снижено на 71% (р<0,05), а после миграции – на 37% (р<0,05) по сравнению с контролем. При добавлении в инкубационную среду Кон А число клеток до миграции снизилось на 66,7% (р<0,05), а после миграции – на 61,5% (р<0,05) по сравнению с контролем.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Под влиянием ФГА миграционная активность лимфоцитов больных ХЛЛ возрастает, а при добавлении КонА снижается по сравнению с контролем. Под влиянием ФГА миграционная активность лимфоцитов больных ОМЛ возрастает, а в группах больных ОЛЛ, ОЛЛ в ремиссии и ХЛЛ снижается по сравнению со здоровыми донорами. Под влиянием Кон А миграционная активность лимфоцитов больных различными типами лейкоза снижена по сравнению с группой здоровых доноров (рис. 2).

Рис. 2. Процент мигрировавших лимфоцитов под влиянием

ФГА и Кон А в группе здоровых доноров и больных лейкозом Установлено увеличение ИТМЛ лимфоцитов больных лейкозом под влиянием

митогенов, вследствие снижения их двигательной активности (табл.).

ИТМЛ лимфоцитов здоровых доноров и больных лейкозом Группы обследованных пациентов

Таблица

ФГА

Кон А

24,1±4,1

58,3±2,6

Больные ОМЛ

69,3±2,9*

90,9±1,1*

Больные ОЛЛ

64,6±5,7*

86,2±2,9*

Больные ОЛЛ в стадии ремиссии

44,8±4,6*

60,2±0,8

Больные ХЛЛ

37,9±7,3*

65,0±2,9*

Здоровые доноры

* – достоверность различий между группами здоровых доноров и больных лейкозом по критерию Стьюдента (р<0,05).

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

В группе больных ОМЛ при добавлении ФГА ИТМЛ увеличился на 187% (р<0,05), а под влиянием Кон А – на 56% (р<0,05) по сравнению с ИТМЛ лимфоцитов здоровых доноров. В группе больных ОЛЛ ИТМЛ возрос в пробах с ФГА на 168% (р<0,05), с Кон А – на 48% (р<0,05) по сравнению с ИТМЛ здоровых доноров. В стадии ремиссии болезни ИТМЛ в пробах с Кон А существенно не отличался от значений группы здоровых доноров, а в пробах с ФГА увеличился на 85% (р<0,05). В группе больных ХЛЛ ИТМЛ возрастал на 57% и 11,4% (р<0,05) соответственно при добавлении ФГА и Кон А. Установленное в результате проведенных экспериментов снижение миграционной активности лимфоцитов здоровых доноров при добавлении в среду митогенов обусловлено, согласно данным литературы, их сенсибилизацией. Сенсибилизированные к митогену лимфоциты резко снижают скорость передвижения в среде, выделяя при этом фактор, ингибирующий миграцию клеток (LMIF) [7]. Реакция осуществляется при непосредственном взаимодействии антигенспецифических рецепторов с митогеном. Митоген-активируемые киназы, функционирующие в лимфоцитах, отвечают на внеклеточные стимулы и регулируют многие клеточные процессы, такие как экспрессию генов, деление, дифференцировку и апоптоз [8]. По данным литературы, нормальные лимфоциты, активированные in vitro ФГА и Кон А, синтезируют и выделяют значительное количество фактора LMIF по сравнению с клетками в нестимулированных культурах, под влиянием которого снижается пластичность цитоплазматической мембраны, а также уменьшается скорость полимеризации актиновых филаментов [9]. Выявленное нами тормозящее влияние Кон А и ФГА на двигательную активность лимфоцитов больных различными формами лейкоза, возможно, связано с влиянием

Шамрай Е.А., Кротова Е.Е.

МИГРАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ЛЕЙКОЗОМ

митогенов на элементы цитоскелета. Миграционная активность лимфоцитов больных лейкозом существенно снижена на 27-82% в зависимости от разновидности лейкоза по сравнению с клетками здоровых доноров. Согласно данным литературы под влиянием митогенного стимула в атипичных клетках крови происходят изменения филаментов цитоскелета, ферментативных систем, липид-липидных соотношений и белковых компонентов в мембранах [10]. Заключение. Анализ результатов проведенных исследований и сопоставление их с данными, полученными ранее, свидетельствует о том, что миграционная активность лимфоцитов больных лейкозом существенно снижена по сравнению с клетками здоровых доноров. Добавление в среду митогенов тормозит двигательную активность, как лимфоцитов здоровых доноров, так и больных различными формами лейкоза. Влияние митогенов на миграцию клеток крови обусловлено их взаимодействием с рецепторным аппаратом клетки, что инициирует каскад внутриклеточных процессов (дифференцировка, перестройка клеточных структур, синтез ферментов, факторов, ингибирующих миграцию). Литература:

1. Friedl P., Brocker E.B. T-cell migration in 3-D extracellular matrix: guidance by polarity and sensations // Dev. Immunol. 2000. № 7. P. 249-266. 2. Schwartz M.A., Shattil S.J. Signaling networks linking integrins and rho family GTPases // Trends Biochem. Sci. 2000. № 25. P. 388-391. 3. Friedl P., Borgmann S., Bröcke E.-B. Amoeboid leukocyte crawling through extracellular matrix: lessons from the Dictyostelium paradigm of cell movement // Journal of Leukocyte Biology. 2001. № 70. P. 491-509. 4. Ghia P., Chiorazzi N., Stamatopoulos K. Microenvironmental influences in chronic

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

lymphocytic leukaemia: the role of antigen stimulation // J. Intern. Med. 2008. № 264(6). P. 549-562. 5. Новиков Д.К. Медицинская иммунология. Минск: Выcш. Шк., 2005. 301 с. 6. Золотницкая Р.П. Методы гематологических исследований. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 2007. 148 с. 7. Faixl J., Rottner K.The making of filopodia // Current Opinion in Cell Biology. 2006. № 18. P. 18-25. 8. Translocation of spectrin and protein kinase C to a cytoplasmic aggregate upon lymphocyte activation / Gregorio C.C., Kubo R.T., Bankert R.B., Repasky E.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. № 89. P. 49-47. 9. Actin cytoskeletal dynamics in T-lymphocyte activation / Samstag Y., Sybille M.E., Klemke M., Wabnitz G.H. // Journal of Leukocyte Biology. 2003. № 73. P. 30-48. 10. Hume D.A., Weidemann M.J. Mitogenic Lymphocyte Transformation // Elsevier. 2000. № 202. P. 731-739. References: 1. Friedl P., Brocker E.B. – Dev. Immunol. no. 7. (2000): 249-266. 2. Friedl P., Borgmann S., Bröcke E.-B. – Journal of Leukocyte Biology. no. 70. (2001): pp. 491-509. 3. Schwartz M.A., Shattil S.J. – Trends Biochem. Sci. no.25. (2000): pp. 388-391. 4. Ghia P., Chiorazzi N., Stamatopoulos K. – J. Intern. Med. V. 264. no 6. (2008): pp. 549-562. 5. Novikov D.K. Meditsinskaya immunologia [Medical Immunology]. Minsk, 2005. 301 p. 6. Zolotnickaya R.P. Metody gematologicheskih issledovniy. Laboratornye metody issledovaniy v klinike [The Methods of Hematology Investigations. The Laboratory Methods in the Clinic]. Moscow, 2007. 148 p. 7. Faixl J., Rottner K.  Current Opinion in Cell Biology. no. 18. (2006): pp. 18-25.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

8. Gregorio C.C., Kubo R.T., Bankert R.B., Repasky E.A. – Proc. Natl. Acad. Sci. USA. no. 89. (2002): pp.49-47. 9. Samstag Y., Sybille M.E., Klemke M., Wabnitz G.H. – Journal of Leukocyte Biology. no. 73. (2003): pp.30-48. 10. Hume D.A., Weidemann M.J. – Elsevier. no. 202. (2000): pp. 731-739.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Шамрай Елена Александровна студент Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: elenashamray@yandex.ru Кротова Екатерина Евгеньевна студент Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: elenashamray@yandex.ru DATA ABOUT THE AUTHORS Shamray Yelena Aleksandrovna Student Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: elenashamray@yandex.ru Krotova Yekaterina Yevgenyevna Student Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: elenashamray@yandex.ru

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Зубарева Е.В.

ВЛИЯНИЕ ИНТЕНСИВНОЙ ТЕПЛОВОЙ НАГРУЗКИ НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ КРЫС

УДК 576.32/36

ЗУБАРЕВА Е.В. ZUBAREVA E.V.

ВЛИЯНИЕ ИНТЕНСИВНОЙ ТЕПЛОВОЙ НАГРУЗКИ НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ КРЫС THE INFLUENCE OF INTENSE HEAT LOAD ON MORPHOMETRIC PARAMETERES AND FUNCTIONAL ACTIVITY OF BLOOD LEUCOCYTES’ IN RATS Аннотация

Abstract

Целью работы явилось исследование морфофункциональных характеристик белых клеток крови крыс в условиях действия тепловой нагрузки в опытах in vivo. Животных подвергали действию экзогенной гипертермии при температуре 38ºС в течение 120 минут. Оценивали изменения со стороны надпочечников и тимико-лимфатической системы с целью установления развития в организме стресс-реакции. Исследовали морфометрические показатели, осмотическую резистентность, локомоционную активность, поглотительную способность лейкоцитов и резервные возможности мембраны клеток. Установлено, что в условиях острого перегревания на фоне развивающейся в организме стресс-реакции происходит уменьшение размеров лимфоцитов, сопровождающееся снижением коэффициента уплощенности, более экономное использование клетками мембранного резерва в гипоосмолярной среде и повышение функциональной активности лейкоцитов, выражающееся в увеличении миграционной и поглотительной способности лейкоцитов.

The purpose of the research was to investigate the morphofunctional properties of white blood cells in rats under high ambient temperature conditions in in vivo experiments. The animals were exposed to the exogenous hyperthermia (38 ºС) during 120 minutes. The changes in adrenal glands and thymicolymphatic system were estimated to assess the development of stress-reaction in the organism. The leucocytes’ morphometric characteristics, osmotic resistance, locomotion activity, absorbing capacity and reserve abilities of the cell membrane were investigated. It was revealed that in extreme overheating and resulting stress-reaction of the body one can note a reduction in the size of leucocytes accompanied by the decrease in the coefficient of flattening, a more economical use of membrane reserve by cells in hypoosmotic medium, and the increase in the functional activity of leucocytes manifesting itself in the increase of migration and absorbing capacity. The obtained data on changes in morphofunctional properties of leucocytes in the conditions of exogenous hyperthermia enlarge and extend the current knowledge of cells mechanisms of adaptation of the body to the heat load.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Полученные данные об изменении морфофункциональных свойств лейкоцитов крови в условиях экзогенной гипертермии расширяют и углубляют существующие представления о клеточных механизмах адаптации организма к действию тепловой нагрузки. В связи с тем, что белые клетки крови выполняют в организме комплекс важных функций, в том числе участвуют в осуществлении специфических и неспецифических защитных реакций, в реализации процессов микроциркуляции, особенный интерес представляет исследование морфофункциональных характеристик лейкоцитов в условиях действия на организм экстремальных факторов. Несмотря на значительное количество работ по изучению клеточных механизмов адаптации к действию гипертермии [1, 2, 3, 4, 5], эта проблема остаётся актуальной для современной физиологии. Исследование динамики морфометрических показателей и реактивности клеток в условиях экзогенного перегревания в опытах in vivo позволит оценить влияние клеточных изменений на адаптивные возможности организма [6, 7] и раскрыть механизмы действия гипертермии [8, 9]. Цель работы – исследование морфофункциональных характеристик белых клеток крови крыс в условиях действия экзогенной гипертермии в опытах in vivo. Материалы и методы исследования. Исследование проведено на лабораторных белых крысах-самцах линии Вистар, весом 300-350 граммов. При изучении действия интенсивной тепловой нагрузки на морфофункциональные характеристики лимфоцитов животных делили на две группы по 10 особей. Первая группа – «Контроль» – интактные животные. Вторая группа – «Перегревание животного» – крыс подвергали действию интенсивной тепловой нагрузки в камере объёмом 0,8 м3 с автоматизированным воздухообменом и относитель-

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Ключевые слова: лейкоциты; мембранный резерв; объём клеток; экзогенная гипертермия. Key words: leucocytes; membranous reserve; cell volume; exogenous hyperthermia.

ной влажностью 50-60% при температуре 38ºС в течение 120 минут [10]. По окончании действия тепловой нагрузки у животных брали кровь. Критерием развития стресс-реакции у крыс группы «Перегревание животного» в условиях экзогенной гипертермии, служили морфологические изменения со стороны надпочечников. В цельной крови определяли количество и соотношение различных форм лейкоцитов унифицированным методом [11]. Также определяли процентное содержание лейкоцитов в красном костном мозге [12]. Кровь у животных брали путём декапитации после дачи лёгкого эфирного наркоза. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в количестве 10 ед./мл. Из цельной крови получали суспензию лейкоцитов. Для этого кровь центрифугировали, собирали лейкоцитарное кольцо, примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония [13, 14] и отмывали клетки изотоническим раствором хлорида натрия. Суспензию лейкоцитов использовали для изучения влияния экзогенной гипертермии на морфофункциональные характеристики белых клеток крови. Локомоционную активность лейкоцитов оценивали в тест-системе миграции клеток под агарозой [13] в модифицированном варианте [15]. Ареал спонтанного распространения клеток служил критерием самопроизвольной миграции. Площадь распространения лейкоцитов в присутствии супернатанта дрожжевых клеток – стимулированной миграции. Для изучения поглотительной способности лейкоцитов использовали методику фагоцитоза нейтрофилами дрожжевых клеток [13]. Определяли фагоцитарную

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Зубарева Е.В.

активность (ФА) и фагоцитарный индекс (ФИ) нейтрофилов. Для оценки влияния перегревания организма на осмотическую стойкость лейкоцитов и использование клеткой мембранного резерва применяли модифицированный комплексный метод [15]. Осмотическую стойкость лейкоцитов высчитывали как долю клеток, оставшихся в сильно гипотоническом растворе после инкубации суспензии лейкоцитов в этой среде в течение часа, от количества клеток в изотоническом растворе. С целью оценки использования резерва плазмалеммы клетками по прошествии времени инкубации лимфоцитов в растворах различной осмолярности из клеток готовили мазки, фиксировали их глутаровым альдегидом (в конечной концентрации 2,5%) и исследовали геометрические параметры (диаметр, высоту, объём) методом полуконтактной атомно-силовой микроскопии на воздухе (СЗМ ИНТЕГРА Вита, фирмы НТ-МДТ, Россия). Используя полученные методом АСМ данные, высчитывали площадь поверхности клеток по формуле для шарового сегмента [16]. Мембранный резерв оценивали как разность между площадью поверхности в сильно гипотоническом растворе (истинная площадь поверхности) и площадью поверхности клетки в изотоническом растворе (видимая площадь поверхности). С целью сравнения использования мембранного резерва в гипотонической среде клетками животных контрольной и опытных групп опре-

деляли долю мембранного резерва в истинной площади поверхности клетки. Коэффициент уплощенности рассчитывали как отношение площади соприкосновения клетки с подложкой к высоте. Результаты исследования и их обсуждение. Экспериментально установлено, что действие на организм животного экзогенной гипертермии интенсивностью 38°С в течение 120 минут опосредует нарушение процессов терморегуляции и увеличение температуры тела крысы, в среднем, на 5ºС. По данным научной литературы, развивающаяся в условиях экзогенной гипертермии стресс-реакция вызывает рост температуры тела животного, в среднем, на 1,4ºC [17, 18]. Подтверждением запуска стресс-реакции в организме в ответ на действие интенсивной тепловой нагрузки являются морфологические изменения в надпочечниках: относительное увеличение коркового слоя надпочечников (с 70,7±0,7% до 77,1±0,7%, p<0,01), в котором находится пучковая зона, вырабатывающая основные стрессовые гормоны (кортизол, кортизон, кортикостерон); снижение митотического индекса клеток пучковой зоны коры надпочечников (с 0,12±0,01‰ до нуля, p<0,01) и увеличение диаметра ядер клеток пучковой зоны (с 5,10±0,01 мкм до 5,50±0,02 мкм, p<0,01). Лимфоцитоз, моноцитопения, нейтропения и эозинопения в красном костном мозге экспериментальных животных (табл. 1) также являются индикаторами развития в организме стресс-реакции [19] и свидетельствуют о значительной интенсивности действующего фактора [20].

Лейкоцитарная формула костного мозга Группа Контроль Перегревание животного

Таблица 1

Л, %

М, %

Н, %

Э, %

Б, %

21,17±1,19

4,67±0,33

65,83±1,28

8,33±0,33

44,17±1,40*

1,50±0,43*

52,50±0,72*

1,83±0,54*

Примечание: (M ± m); Л – лимфоциты, М – моноциты, Н – нейтрофилы, Э – эозинофилы, Б – базофилы; * – достоверность различий по сравнению с группой «Контроль» (t-критерий Стьюдента, p<0,01).

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Действие экзогенной гипертермии на организм приводит к снижению количества лейкоцитов в крови животных с

17,9•109/л до 9,2•109/л, и специфическому изменению соотношения разных пулов белых клеток крови животного (табл. 2). Таблица 2

Лейкоцитарная формула крови Группа Контроль Перегревание животного

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Л, %

М, %

Н, %

Э, %

Б, %

69,20±1,20

2,00±0,06

28,20±1,10

0,40±0,05

0,20±0,03

78,50±0,90*

2,50±0,10*

18,10±0,90*

0,60±0,06

0,30±0,05

При этом снижение процентного содержания нейтрофилов в крови в условиях перегревания организма может быть опосредовано выходом клеток во внесосудистое пространство с целью устранения повреждённых элементов. В результате действия на организм интенсивной тепловой нагрузки происходит компактизация клеточных структур, о чём свидетельствует уменьшение объёма лимфоцитов в изотонической среде на 39,1%, в сильно гипотоническом рас-

творе – на 60,9%, по сравнению с соответствующими показателями клеток группы «Контроль» (табл. 3). Экзогенная гипертермия приводит к снижению использования клетками мембранного резерва в гипотонической среде. У лимфоцитов контрольной группы доля используемого мембранного резерва в гипоосмолярных условиях составляет 33,2%, у лимфоцитов группы «Перегревание животного» данный показатель сокращается до 16,6%. Таблица 3

Морфометрические характеристики лимфоцитов в растворах хлорида натриям различной осмолярности Показатель, единица измерения

Группа

Контроль

D, мкм 8,00 ± 0,35

h, мкм 1,14 ± 0,19

S, мкм2 28,7

V, мкм3 54,94 ± 9,20

СГ

10,12 ± 0,76 ○

1,12 ± 0,10

35,4

87,35 ± 11,94 ○

6,62 ± 0,37 *

0,94 ± 0,07 *

19,5

33,46 ± 4,59 *

7,21 ± 0,49 *○

0,89 ± 0,09 *○

20,1

34,14 ± 3,96 *

Перегревание И животного СГ

Примечание: И – изотонический раствор NaCl; СГ – сильно гипотонический раствор NaCl, время инкубации 1 минута; D – диаметр клетки (M±m); h – высота клетки (M±m); V – объём клетки (M±m); S – площадь поверхности клетки; * - достоверность различий по сравнению с контрольной группой; ○ – то же по сравнению с изотоническим раствором NaCl; достоверность различий оценивали по непарному критерию Вилкоксона (p<0,05).

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Зубарева Е.В.

величины коэффициента уплощённости (табл. 4).

Экзогенная тепловая нагрузка вызывает также уменьшение распластанности лейкоцитов, что проявляется в снижении

Таблица 4

Коэффициент уплощённости лимфоцитов крови (отн.ед.) Раствор, время инкубации

Группа Контроль Перегревание животного

СГ, 1 мин

74,1±21,8

109,7±38,6

39,4±4,9

64,2±14,7

Примечание: (M±m); И – изотонический раствор (0,9% NaCl); СГ – сильно гипотонический раствор (0,2% NaCl).

Действие интенсивной тепловой нагрузки на организм сопровождается повышением осмотической резистентности лейкоцитов c 69,0 % до 84,0 % (p<0,05). Экзогенная гипертермия стимулирует локомоционные реакции белых клеток крови, повышая площадь спонтанной (на

39,6%) и стимулированной (на 30,7%) миграции лейкоцитов (рис. 1), а также фагоцитарную активность (с 12,7±0,9 % до 20,0±1,0%, p<0,01) и фагоцитарный индекс нейтрофилов (с 1,09±0,03 отн.ед. до 1,12±0,03 отн.ед.).

2 мм 15

11,5

8,8

6,7

4,8

Sсп. Sст .

Конт роль

Перег ревание живот ног о

Рис. 1. Площадь спонтанной и стимулированной миграции лейкоцитов под агарозой (M±m): Sсп. – площадь спонтанной миграции клеток под агарозой (мм2), Sст. – площадь миграции клеток под агарозой, стимулированной дрожжевым супернатантом (мм2); * – достоверность различий по сравнению с группой «Контроль» (t-критерий Стьюдента, p<0,01)

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Таким образом, экзогенная гипертермия приводит к изменению участия цитоплазматической мембраны в клеточных реакциях (осмотическая резистентность, пластичность, локомоционная активность и поглотительная способность). При этом регистрируемое в условиях действия тепловой нагрузки повышение функциональной активности и осмотической стойкости лейкоцитов крови сочетается с компактизацией клеточных структур и переходом клеток на «сберегающий» тип реагирования, о чём свидетельствует более экономное использование ими мембранного резерва в условиях гипотонии. Выявленные изменения геометрических характеристик клеток могут рассматриваться в качестве подтверждения высокой физиологической значимости исследуемых морфометрических параметров, модификация которых является одним из компонентов сложного механизма клеточной реакции адаптации животного к действию интенсивной тепловой нагрузки. Заключение. Проведенные исследования подтвердили данные научной литературы, свидетельствующие о том, что экзогенная гипертермия способна повышать защитные свойства организма [21, 22]. Установлено, что при действии на организм интенсивной тепловой нагрузки в условиях развивающейся стресс-реакции происходит увеличение площади спонтанной (на 39,6%) и стимулированной (на 30,7%) миграции лейкоцитов, фагоцитарной активности нейтрофилов (до 20,0±1,0%), при некотором повышении фагоцитарного индекса лейкоцитов. Кроме того под влиянием экзогенной гипертермии происходит не только стимуляция функциональных свойств белых клеток крови, обеспечивающих реализацию защитных реакций, но и активация механизмов, стабилизирующих геометрические показатели лейкоцитов. В условиях острого перегревания организма про-

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

исходит компактизация структур клеток, сопровождающаяся снижением их объёма, пластичности и более экономным использованием ими мембранного резерва в среде с пониженной осмолярностью. Литература: 1. Васильев Н.В., Захаров Ю.М., Коляда Т.И. Система крови и неспецифическая резистентность в экстремальных климатических условиях. Новосибирск: Наука, 1992. 257с. 2. Киншт Д.Н., Киншт Н.В. Общая управляемая гипертермия: теория, практика, моделирование процессов. Владивосток: Дальнаука, 2006. 194 с. 3. Управляемая гипертермия / Баллюзек Ф.В., Баллюзек М.Ф., Виленский В.И., Горелов С.И., Жигалов С.А., Иванов А.А., Кузьмин С.Н., Определяков Г.А. СПб.: Невский диалект, 2001. 128 с. 4. Экспериментальные основы применения гипертермии в онкологии / Курпешев О.К., Лебедева Т.В., Светицкий П.В., Мардынский Ю.С., Чушкин Н.А. Ростовна-Дону: Изд-во «НОК», 2005. 164 с. 5. Жаврид Э.А., Осинский С.П., Фрадкин С.З. Гипертермия и гипергликемия в онкологии. – Киев: Наукова думка, 1997. 256 с. 6. Горичева В.Д. Функциональные свойства и реактивность лейкоцитов крови в условиях гипертермии: Дис. … к.б.н. Ярославль: ЯГПУ им. К.Д. Ушинского, 2000. 133 с. 7. Moseley P.L. Heat shock proteins and heat adaptation of the whole organism // Journal of applied physiology. 1997. Vol.83. Issue 5. P. 1413-1417. 8. Козлов Н.Б. Гипертермия: биохимические основы патогенеза, профилактики, лечение. Воронеж: Изд-во Воронежского государственного университета, 1990. 104 с. 9. Пути практического использования интенсивного теплолечения (Второе сообщение) / Сувернев А.В., Иванов Г.В., Василевич И.В., Гальченко В.Н., Алейников Р.П.,

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Зубарева Е.В.

Новожилов С.Ю. Новосибирск: Академическое изд-во «Гео», 2009. 109 с. 10. Фёдорова М.З., Левин В.Н., Горичева В.Д. Функциональная активность и механические свойства лейкоцитов крови крыс при внешней тепловой нагрузке // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2000. № 12. С. 1624-1629. 11. Медицинские лабораторные технологии / Под ред. Карпищенко А.И. – СПб.: Интермедика, 2002. 408 с. 12. Алексеев Н.А. Клинические аспекты лейкопений, нейтропений и функциональных нарушений нейтрофилов. СПб: Фолиант, 2002. 416с. 13. Дуглас С.Д., Куи П.Г. Исследование фагоцитоза в клинической практике. М.: Медицина, 1983. 112 с. 14. Зимин Ю.И., Редькин А.П. Угнетение нестимулированными лимфоцитами спонтанной миграции лейкоцитов под агаром // Иммунология. 1987. № 1. С. 71-73. 15. Фёдорова М.З., Левин В.Н. Метод комплексного исследования геометрии, площади поверхности, резервных возможностей мембраны и осморегуляции лейкоцитов крови // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. №11. С. 44-46. 16. Выгодский М.Я. Справочник по элементарной математике. М.: АСТ: Астрель, 2006. 509 с. 17. Effect of acute heat stress on rat adrenal glands: a morphological and stereological study / Koko V., Djordjeviæ J., Cvijiæ G., Davidoviæ V. // The Journal of Experimental Biology. 2004. Vol.207. P.4225-4230. 18. Kluger M.J., Long N.C., Vander A.J. Stress-induced rise of body temperature in rats is the same in warm and cool environments // Physiology and behavior. 1990. Vol.47. No.4. P. 773-775. 19. Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови. М.: Медицина, 1983. 240 с. 20. Селье Г. Стресс без дистресса. М.: Прогресс, 1979. 123 с.

21. The effect of mild whole-body hyperthermia on systemic levels of TNF-alpha, IL-1beta, and IL-6 in patients with ankylosing spondylitis / Tarner I.H., Müller-Ladner U., Uhlemann C., Lange U. // Clin. Rheumatol. 2009. Vol.28. P.397-402. 22. Whole body hyperthermia at 43.544°C: dreams or reality? / Suvernev A.V., Ivanov G.V., Efremov A.V., Tchervov R. // Hyperthermia in Cancer Treatment: A Primer. Medical Intelligence Unit. 2006. Section III. P.227-236. References: 1. Vasil'ev N.V., Zakharov Yu.M., Kolyada T.I. Sistema krovi i nespetsificheskaya rezistentnost' v ekstremal'nykh klimaticheskikh usloviyakh [Blood System and Nonspecific Resistance under Extreme Climatic Conditions]. Novosibirsk: Nauka, 1992. 257 p. 2. Kinsht D.N., Kinsht N.V. Obshchaya upravlyaemaya gipertermiya: teoriya, praktika, modelirovanie protsessov [General Regulated Hyperthermia: Theory, Practice, Modeling of Processes]. Vladivostok: Dal'nauka, 2006. 194 p. 3. Ballyuzek F.V., Ballyuzek M.F., Vilenskiy V.I., Gorelov S.I., Zhigalov S.A., Ivanov A.A., Kuz'min S.N., Opredelyakov G.A. Upravlyaemaya gipertermiya [Regulated Hyperthermia]. SPb.: Nevskiy dialekt, 2001. 128 p. 4. Kurpeshev O.K., Lebedeva T.V., Svetitskiy P.V., Mardynskiy Yu.S., Chushkin N.A. Eksperimental'nye osnovy primeneniya gipertermii v onkologii [Experimental Foundations of Hyperthermia Usage in Oncology]. Rostov-na-Donu: Izd-vo «NOK», 2005. 164 p. 5. Zhavrid E.A., Osinskiy S.P., Fradkin S.Z. Gipertermiya i giperglikemiya v onkologii [Hyperthermia and Hyperglycemia in Oncology]. Kiev: Naukova dumka, 1997. 256 p. 6. Goricheva V.D. Funktsional'nye svoystva i reaktivnost' leykotsitov krovi v usloviyakh gipertermii // Dis. … k.b.n. [Functional Properties and Reactivity of Blood Leucocytes under Hyperthermia Conditions // PhD Thesis in Biology]: Yaroslavl': YaGPU im. K.D. Ushinskogo, 2000. 133 p.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

7. Moseley P.L. Heat shock proteins and heat adaptation of the whole organism. Journal of applied physiology. 1997. Vol.83. Issue 5. pp. 1413-1417. 8. Kozlov N.B. Gipertermiya: biokhimicheskie osnovy patogeneza, profilaktiki, lechenie [Hyperthermia: The Biochemical Basis of Pathogenesis, Prevention, Treatment]. Voronezh: Izd-vo Voronezhskogo gosudarstvennogo universiteta, 1990. 104 p. 9. Suvernev A.V., Ivanov G.V., Vasilevich I.V., Gal'chenko V.N., Aleynikov R.P., Novozhilov S.Yu. Puti prakticheskogo ispol'zovaniya intensivnogo teplolecheniya (Vtoroe soobshchenie) [The Ways of Practical Usage of Intense Warm-treatment (The second report)]. Novosibirsk: Akademicheskoe izd-vo «Geo», 2009. 109 p. 10. Fedorova M.Z., Levin V.N., Goricheva V.D. Rossiyskiy fiziologicheskiy zhurnal im. I.M. Sechenova [Russian Physiological Journal]. 2000. № 12. pp. 1624-1629. 11. Meditsinskie laboratornye tekhnologii / Pod red. Karpishchenko A.I. SPb.: [Medical Laboratory Technologies]. Intermedika, 2002. 408 p. 12. Alekseev N.A. Klinicheskie aspekty leykopeniy, neytropeniy i funktsional'nykh narusheniy neytrofilov [Clinical Aspects of Leukocytopenia, Granulocytopenia and Neutrophils’ Functional Damages]. SPb: Foliant, 2002. 416 p. 13. Duglas S.D., Kui P.G. Issledovanie fagotsitoza v klinicheskoy praktike [Investigation of Phagocytosis in Clinical Practice]. M.: Meditsina, 1983. 112 p. 14. Zimin Yu.I., Red'kin A.P. Immunologiya [Immunology]. 1987. № 1. pp. 71-73. 15. Fedorova M.Z., Levin V.N. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika [Clinical Laboratory Diagnostics]. 1997. №11. pp. 44-46. 16. Vygodskiy M.Ya. Spravochnik po elementarnoy matematike [Elementary Mathematics Guide]. M.: AST: Astrel', 2006. 509 p. 17. Koko V., Djordjeviæ J., Cvijiæ G., Davidoviæ V. Effect of Acute Heat Stress on Rat

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Adrenal Glands: A Morphological and Stereological Study. The Journal of Experimental Biology. 2004. Vol.207. pp. 4225-4230. 18. Kluger M.J., Long N.C., Vander A.J. Stress-induced Rise of Body Temperature in Rats is the Same in Warm and Cool Environments. Physiology and Behavior. 1990. Vol.47. No.4. pp. 773-775. 19. Gorizontov P.D., Belousova O.I., Fedotova M.I. Stress i sistema krovi [Stress and Blood System]. M.: Meditsina, 1983. 240 p. 20. Sel'e G. Stress bez distressa [Stress without Distress]. M.: Progress, 1979. 123 p. 21. Tarner I.H., Müller-Ladner U., Uhlemann C., Lange U. The effect of mild wholebody hyperthermia on systemic levels of TNF-alpha, IL-1beta, and IL-6 in patients with ankylosing spondylitis. Clin. Rheumatol. 2009. Vol.28. pp.397-402. 22. Suvernev A.V., Ivanov G.V., Efremov A.V., Tchervov R. Whole body hyperthermia at 43.5-44°C: dreams or reality? Hyperthermia in Cancer Treatment: A Primer. Medical Intelligence Unit. 2006. Section III. pp.227-236.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ Зубарева Екатерина Владимировна кандидат биологических наук, старший преподаватель

Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: zubareva-e@yandex.ru

DATA ABOUT THE AUTHOR Zubareva Ekaterina Vladimirovna PhD in Biology, Senior Lecturer Belgorod State National Research University

85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: zubareva-e@yandex.ru

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Чернявских С.Д., Горбунова О.А.

ВЛИЯНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАГРУЗОК НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭЭГ

УДК 612.825.1

ЧЕРНЯВСКИХ С.Д., ГОРБУНОВА О.А. CHERNYAVSKIKH S.D., GORBUNOVA O.A.

ВЛИЯНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАГРУЗОК НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭЭГ THE INFLUENCE OF FUNCTIONAL LOADS ON EEG

Аннотация

Abstract

Изучено влияние функциональных нагрузок на показатели электроэнцефалограммы у практически здоровых и с разными формами нарушений испытуемых. Установлено, что у последних значительно снижена реакция на функциональные пробы. Нарушения биоэлектрической активности головного мозга, вызванные сосудистыми патологиями, а также заболеваниями, обусловленными черепно-мозговыми травмами и хронической дисциркуляторной энцефалопатией, выявляют пробы активации и гипервентиляции. Проба фотостимуляции позволяет оценить функциональные изменения биоэлектрической активности головного мозга, вызванные алкогольной интоксикацией организма.

The article covers the influence of functional loads on electroencephalography readings in healthy people and patients with various disorders. It was established that patients with various disorders have a significantly lower response to functional tests. The malfunctions of brain bioelectricity caused by vascular pathologies and diseases caused by head injuries and chronic cerebropathy are revealed by activation and hyperventilation tests. The photostimulation test makes it possible to estimate the functional changes in brain bioelectricity generated by alcohol intoxication.

Ключевые слова: электроэнцефалография; реакция активации; фотостимуляция; гипервентиляция. Различным уровням физиологического состояния мозга, а также разным уровням сознания соответствуют неодинаковые формы биоэлектрической активности, регистрируемой с поверхности черепа [1, 4, 7]. Функциональная и морфологическая неоднородность коры определяет особенности электрической активности различных областей мозга [10, 11, 18]. Поскольку электроэнцефалограмма отображает измене-

Key words: electroencephalography; arousal reaction; photostimulation; hyperventilation.

ния функциональной активности нейронов, ее картина зависит не столько от этиологии заболевания, вызывающего эти изменения, сколько от перестроек взаимодействия процессов возбуждения и торможения, вовлеченных в патологический процесс мозговых структур [2, 3, 5, 6, 15, 16]. Основными вопросами, на который может дать ответ электроэнцефалография, являются констатация наличия поражения головного

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

мозга, динамика состояния мозга, характер патологических изменений активности, локализация поражения [8, 9, 13, 17]. При этом использование функциональных проб при проведении электроэнцефалографии открывает некоторые дополнительные возможности диагностики в норме и при различного рода патологиях [7, 8, 9, 14]. Цель работы – изучение влияния функциональных нагрузок на показатели электроэнцефалограммы. Материалы и методы исследования. Изучено функциональное состояние головного мозга по данным электроэнцефалограммы у практически здоровых и с разными формами нарушений испытуемых. Всего было обследовано 75 мужчин. Возраст испытуемых варьировал от 22 до 42 лет. Для обследования было сформировано пять групп (по 15 человек в группе): I группа – контрольная – практически здоровые мужчины, II группа – испытуемые с нарушениями сосудистого характера (вегетососудистая дистония), III группа – пациенты с нарушениями травматического характера (с черепно-мозговыми травмами), IV группа – больные с алкогольной зависимостью, V группа – испытуемые с хронической дисциркуляторной энцефалопатией (ХДЭ). Отбор практически здоровых лиц проводили на основе изучения медицинских карт и анамнестических данных. Элекроэнцефалограммы записывали в покое и при функциональных пробах в течение 40-60 мин. В качестве функциональных нагрузок использовали пробы с закрыванием и открыванием глаз (реакция активации), фотостимуляции, а также гипервентиляции. Электроэнцефалограммы записывали на компьютерном электроэнцефалографе «Телепат-104» (г. Санкт-Петербург) в 21 отведении по международной схеме «1020». Для оценки спектров мощности и индексов частот использовали программное обеспечение электроэнцефалографов. При оценке спектров мощности каждой из частотных составляющих выбранного без-

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

артефактного фрагмента электроэнцефалограммы в каждом отведении проводили спектральный анализ полученных данных. Полученный цифровой материал был обработан статистически с использованием персонального компьютера [12]. При определении достоверности между группами был использован критерий Стъюдента. Результаты рассматривали как достоверные, начиная со значения p<0,05. Результаты исследования и их обсуждение. При проведении исследований у испытуемых всех групп регистрировали α- и низкочастотный ß-ритмы. Изучаемые показатели данных ритмов при фоновом обследовании здоровых и имеющих различного рода нарушения пациентов представлены в таблице 1. Согласно полученным данным, модулированность a-ритма у испытуемых контрольной и опытных групп была умеренной. При этом у пациентов контроля был выявлен организованный тип электроэнцефалограммы, у испытуемых с нарушениями различного характера отмечены умеренные диффузные изменения биопотенциалов головного мозга или легкая дезорганизация a-ритма. Локальной и пароксизмальной патологической активности как в контрольной, так и в опытных группах выявлено не было. Наряду с фоновыми показателями нами были изучены данные электроэнцефалограмм при проведении функциональных проб (табл. 2). При открывании глаз (реакция активации) значения по индексу a-ритма в I, II, III, IV и V группах были на 63, 62, 57, 47 и 80% соответственно ниже по сравнению с фоновой активностью. При закрывании глаз показатели a-ритма были ниже фона на 29, 77 и 44% во II, III и V группах. При фотостимуляции максимально усваиваемая частота ритма отличалась от доминирующего ритма в покое только у испытуемых с алкогольной интоксикацией. Разница по сравнению с фоном составила практически 100%.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Чернявских С.Д., Горбунова О.А.

ВЛИЯНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАГРУЗОК НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭЭГ

Показатели ЭЭГ при фоновом обследовании Показатели, ед. изм.

Таблица 1

Группы испытуемых I

III

Показатели α-ритма Max амплитуда над левым полушарием, мкВ

65,25± 6,43

74,66± 2,77

42,52± 2,80

67,28± 3,27

48,50± 4,28

Средняя амплитуда над левым полушарием, мкВ

11,02± 1,11

25,50± 1,77

9,52± 1,88

7,02± 0,36

12,50± 1,25

Max амплитуда над правым полушарием, мкВ

64,33± 7,76

106,02± 2,56

44,52± 3,60

69,28± 3,36

35,20± 3,38

Средняя амплитуда над правым полушарием, мкВ

11,33± 2,20

24,52± 2,25

20,25± 2,24

6,25± 0,65

11,28± 1,28

Межполушарная асимметрия,%

6,11± 1,15

5,20± 0,18

5,12± 1,02

23,03± 2,28

10,52± 0,98

Доминирующая частота, Гц

9,80± 0,94

10,15± 0,50

10,52± 1,54

9,32± 1,15

9,65± 0,66

Индекс, %

11,66± 2,50

51,28± 1,80

19,52± 1,80

11,11± 1,23

26,10± 1,20

Показатели низкочастотного ß-ритма 43,28± 3,27

58,55± 1,56

31,50± 4,40

35,50± 2,45

18,50± 2,25

Средняя амплитуда, мкВ

5,50± 0,36

6,55± 0,40

7,20± 1,28

4,02± 0,02

5,50± 1,45

Индекс ритма над левым полушарием, %

2,55± 0,02

2,75± 1,02

8,06± 0,09

4,55± 0,08

3,85± 0,03

Индекс ритма над правым полушарием, %

2,85± 1,11

3,50± 0,06

8,80± 0,90

5,03± 0,08

3,75± 0,05

Max амплитуда, мкВ

Исходя из полученных данных, нарушения биоэлектрической активности головного мозга, вызванные сосудистыми и травматическими патологиями, а также заболеваниями, обусловленными хронической дисциркуляторной энцефалопати-

ей, позволяет оценить проба активации, тогда как изменения деятельности головного мозга, вызванные алкогольной интоксикацией организма, выявляет проба фотостимуляции.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Показатели ЭЭГ при функциональных пробах Показатели, ед. изм.

Таблица 2

Группы испытуемых I

III

5,22± 1,43#

5,24± 0,05#

12,20± 2,22

14,52± 1,25#

3,22± 1,03#

11,00± 0,26

Проба активации (открывание глаз) Индекс a-ритма, %

4,33± 0,73#

19,27± 2,13#

8,48± 1,47#

Проба активации (закрывание глаз) Индекс a-ритма, %

7,53± 0,63

36,55± 2,25#

4,52± 1,55#

Проба фотостимуляции Мах усваиваемая частота ритма, Гц

9,20± 2,40

9,23± 0,63

7,55± 2,42

Примечание: здесь и далее: # - достоверность различий в сравнении с фоновой активностью (р<0,05).

При гипервентиляции у испытуемых также были отмечены определенные различия по сравнению с состоянием покоя (табл. 3). При этом средние значения амплитуды a-ритма над левым полушарием при данной функциональной пробе, в сравнении с показателями фоновой активности, изменялись незначительно. Разница по сравнению с фоновыми значениями по показателю максимальной амплитуды a-ритма над левым полушарием была только у лиц с алкогольной интоксикацией. Показатели a-ритма над правым полушарием у испытуемых, имеющих различного рода черепно-мозговые травмы, при данной функциональной пробе в сравнении с фоном были вдвое ниже. Индекс a-ритма при гипервентиляции у испытуемых II группы был на 31% ниже, у пациентов из IV группы на 58% выше по сравнению с покоем. Показатели максимальной амплитуды низкочастотного ß-ритма у испытуемых II груп-

пы при данной пробе снизились на 41%, V – повысились более, чем в два раза по сравнению с фоновыми значениями. Индекс данного ритма над левым полушарием при гипервентиляции у испытуемых IV группы снизился на 34% по сравнению с фоном. Соответствующий показатель над правым полушарием повысился у испытуемых контроля, у лиц с умеренной дозой алкоголя и у пациентов с ХДЭ. В I группе испытуемых при гипервентиляции наблюдали значительное снижение максимальной амплитуды высокочастотного ß-ритма по сравнению с фоном (см. табл. 3). У испытуемых с вегетососудистой дистонией максимальная амплитуда данного ритма увеличилась на 61%, у пациентов с различного рода черепномозговыми травмами снизилась на 42% по сравнению с фоном. Значительное снижение данного показателя наблюдали также у испытуемых IV группы по сравнению с состоянием покоя.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Чернявских С.Д., Горбунова О.А. ВЛИЯНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАГРУЗОК НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭЭГ

Показатели ЭЭГ при гипервентиляции Показатели, ед. изм.

Таблица 3

Группы испытуемых I

III

Показатели α-ритма Max амплитуда над левым полушарием, мкВ

57,50± 2,13

86,50± 6,17

47,22± 3,19

77,44± 1,11#

41,50± 0,80

Средняя амплитуда над левым полушарием, мкВ

11,33± 1,11

26,50± 3,21

9,53± 0,08

6,28± 0,44

10,50± 1,12

Max амплитуда над правым полушарием, мкВ

55,33± 6,17

164,52± 12,18#

42,24± 2,13

38,33± 1,45#

45,50± 3,16#

Средняя амплитуда над правым полушарием, мкВ

8,33± 2,33

26,50± 2,43

10,10± 0,17#

6,28± 1,65

11,55± 1,66

10,07± 0,09 13,00± 1,44

10,40± 1,12 35,50± 3,13#

10,62± 0,16 16,00± 2,13

10,20± 0,80 17,55± 1,72#

10,10± 0,08

Доминирующая частота, Гц Индекс, %

21,55±2,20

Показатели низкочастотного ß-ритма Max амплитуда, мкВ Средняя амплитуда, мкВ

40,44± 1,17 6,60± 0,06#

34,33± 2,43# 7,45± 1,13

24,50± 2,50 7,50± 1,48

42,33± 2,45 4,25± 0,25

43,65± 2,45# 5,50± 0,09

Индекс ритма над левым полушарием, %

2,27± 0,22

2,55± 0,14

7,33± 1,33

3,02± 0,12#

3,55± 0,40

Индекс ритма над правым полушарием, %

9,27± 0,44#

3,55± 0,44

9,33± 2,45

6,02± 0,07#

4,55± 0,06#

Средние значения амплитуды при изучаемой функциональной пробе в сравнении с фоном снизились только в контроле, в остальных группах достоверной разницы не зарегистрировано. Индекс ритма над левым полушарием в контроле повысился при гипервентиляции вдвое, в остальных группах не изменился. Изменений по соответствующему показателю над

правым полушарием при изучаемой функциональной пробе также не зарегистрировано. Исходя из полученных данных, проба гипервентиляции, также как и реакция активации, позволяет оценить нарушения общемозговой деятельности, вызванные сосудистыми и травматическими патологиями, а также заболеваниями, обусловленными ХДЭ.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Заключение. Таким образом, при фоновой записи электроэнцефалограммы у практически здоровых испытуемых выявлен организованный тип ЭЭГ, у пациентов с различными нарушениями – умеренные диффузные изменения биопотенциалов головного мозга или легкая дезорганизация a-ритма. Локальной и пароксизмальной патологической активности как в контрольной, так и в опытных группах не зарегистрировано. У пациентов с нарушениями разного характера выявлена более низкая реактивность на функциональные пробы по сравнению с практически здоровыми испытуемыми. Пробы активации и гипервентиляции являются действенными методами оценки нарушений биоэлектрической активности головного мозга сосудистого, травматического характеров, а также связанных с хронической дисциркуляторной энцефалопатией. Проба фотостимуляции выявляет изменения общемозговой деятельности, обусловленные алкогольной интоксикацией организма. Литература: 1. Агаджанян Н.А., Катков А.Ю. Резервы нашего организма. М.: Знание, 1981. 173 с. 2. Бехтерева Н.П. Здоровый и больной мозг человека. Л.: Наука, 1980. 262 с. 3. Бехтерева Н.П. Камбарова Д.К., Поздеев В.К. Устойчивое патологическое состояние при болезнях мозга. Л.: Медицина, 1978. 240 с. 4. Биоэлектрическая активность мозга человека у представителей различных типов темперамента / Русалов В.М., Русалова М.Н., Калашникова И.Г. и др. // Журн. высш. нервн. деят. 1993. Т. 43. N3. С. 530. 5. Болезни нервной системы / Под ред. Н.Н. Яхно, Д.Р. Штульмана. М.: Медицина, 2003. 744 с. 6. Гриндель О.М. Оптимальный уровень когерентности ЭЭГ и его значение в оценке функционального состояния мозга человека. // Журн. высш. нерв. деят. 1980. Т.30. №1. С.62-70.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

7. Гусельников В.И. Электрофизиология головного мозга. М.: Высшая школа, 1976. 423 с. 8. Зенков Л.Р. Клиническая электроэнцефалография с элементами эпилептологии. М.: МЕДпресс-информ, 2002. 356 с. 9. Казначеев В.Г., Баевский Р.М., Берсенева А.Г. Донозологическая диагностика в практике массовых обследований населения. Астрахань: Медицина, 1980. 235 с. 10. Каминская Г.Т. Основы элекроэнцефалографии. М.: Изд-во МГУ, 1984. 87с. 11. Кирой В.Н. Пространственно-временная организация электрической активности мозга человека в состоянии спокойного бодрствования и при решении мыслительных задач. ЖВНД. 1987. Т.37, №6. С. 1025-1033. 12. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980. 293 с. 13. Aarts J.H.P. Selective cognitive impairment during focal and generalized epileptiform activity / J.H.Р. Aarts, C.D. Binnie, A.M. Smit, A.J. Wilkins // Brain. 1984. V. 107. P. 293-308. 14. Beaumanoir A. Secondary bilateral synchrony: significant EEG pattern in frontal lobe seizures. // In: Frontal lobe seizures and epilepsies in children. / A. Beaumanoir, F. Andermann, P. Chauvel, L. Mira, B. Zifkin. Paris: John Libbey Eurotext, 2003. P. 195-205. 15. Blume W.T. Lennox-Gastaut syndrome and secondary bilateral synchrony acomparison. // In: Epileptic seizures and syndromes. / Eds. P. Wolf. London, 1994. P. 285-297. 16. Сhabot R. Quantitative electroencephalographic profiles of chidren with attention deficit disorder / R. Сhabot, G. Serfontein // Biol. Psychiatry. 1996. Vol. 40. P. 951-963. 17. Farah M.J. Тhe neural basis of mental image // Trends in Neuroscience. 1989. Vol. 12. P. 395-399. 18. Tukel K. The electroencephalogram in parasagittal lesions / K. Tukel, Н. Jasper // Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol., 1952. V.4. P. 481-494.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Чернявских С.Д., Горбунова О.А.

ВЛИЯНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАГРУЗОК НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭЭГ

References: 1. Agadzhanyan N.A., Katkov A. Rezervy nashego organizma [Reserves of Our Body]. M: Znanie, 1981. 173 p. 2. Bekhtereva N.P. Zdoroviy i bolnoy mozg cheloveka [The Healthy and Diseased Human Brain]. Leningrad: Nauka, 1980. 262 р. 3. Bekhtereva N.P., Kambarov D.K., Pozdeev V.K. Ustoichivoe patologicheskoe sostoyanie pri boleznyah mozga [Sustainable Pathological Condition in Diseases of the Brain]. L.: Medicine, 1978. 240 р. 4. Rusalov V.M., Rusalova M.S., Kalashnikov I.G. and others Bioelektricheskaya aktivnost mozga cheloveka u predstaviteley razlichnyh tipov temperamenta [Bioelectrical Activity of the Human Brain in People of Different Temperaments // The High Nerve. Аctivities Journal]. no 3 (1993): p. 530. 5. Yakhno N.N., Stollman D.R. Bolezni nervnoy sistemy [Nervous System Diseases]. M: Medicine, 2003. 744 р. 6. Grindel O.M. Optimalniy uroven kogerentnosti EEG i ego znachenie v otsenke funktsionalnogo sostoyaniya mozga cheloveka [The Optimal Level of ECG Coherence and its Meaning in Assessment of the Functional Condition of the Human Brain // The High Nerve. Аctivities Journal]. No. 1 (1980): pp. 62-70. 7. Guselnikov V.I. Elektrofiziologiya golovnogo mozga [Electrophysiology of the Brain]. M: High School, 1976. 423 р. 8. Zenkov L.R. Klinicheskaya elektroentsefalografiya s elementami epileptologii [Clinical Electroencephalography with Elements of Epileptology]. M: Medpress-inform, 2002. 356 р. 9. Кaznacheev V.G., R.M. Baevsky, Berseneva A.G. Donozologicheskaya diagnostika v praktike massovyh obsledovaniy naseleniya [Prenosological Diagnostics in the Practice of Mass Population Surveys]. Astrakhan: Medicine, 1980. 235 р. 10. Кaminskaya G.T. Osnovy elektroentsefalografii [Fundamentals of Electroencephalography]. M: MSU Publishing House, 1984. 87 р. 11. Kira V.N. JUND. V.37, no 6 (1987): pp. 1025-1033.

12. Lakin G.F. Biometriya [Biometrics]. M: Vysshaya SHKOLA, 1980. 293 p. 13. Ааrts J.H.P., Binnie C.D., Smit A.J., Wilkins A.M. Selective cognitive impairment during focal and generalized epileptiform activity. Brain. 1984. V. 107. pp. 293-308. 14. Вeaumanoir A., Andermann F., Chauvel P., Mira L., Zifkin B.. In: Frontal lobe seizures and epilepsies in children, Paris: John Libbey Eurotext, (2003): pp. 195-205. 15. Blume W.T. In: Epileptic seizures and syndromes. Wolf. London, (1994): pp. 285297. 16. Сhabot R. Biol. Psychiatry,no 40 (1996): pp. 951-963. 17. Farah M.J. Trends in Neuroscience, no 12 (1989): pp. 395-399. 18. Tukel K. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol., no 4 (1952): pp. 481-494. СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Чернявских Светлана Дмитриевна, кандидат биологических наук, доцент

Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: Chernyavskikh@bsu.edu.ru

Горбунова Ольга Александровна, студент

DATA ABOUT THE AUTHORS Chernyavskikh Svetlana Dmitrievna, PhD in Biology, Associate Professor Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: Chernyavskikh@bsu.edu.ru

Gorbunova Olga Aleksandrovna Student

Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: Chernyavskikh@bsu.edu.ru

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

УДК 591.111.7:594.382.4

КУЛЬКО С.В. KULKO S.V.

ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СТАТУСА ГЕМОЦИТОВ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КЛАССА GASTROPODA (MOLLUSCA) В УСЛОВИЯХ ОСМОТИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ DYNAMISCS OF ENERGY STATUS INDECIES OF HEMOCYTES IN SOME GASTROPOD (MOLLUSCA) SPECIES IN OSMOTIC STRESS CONDITIONS Аннотация

Abstract

В статье рассматриваются особенности энергетических реакций гемоцитов некоторых представителей типа Mollusca в ответ на инкубацию в растворах с различной осмолярностью. Исследование было произведено при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа, с окраской гемоцитов родамином Б, и позволило доказать, что наибольшими энергетическими затратами обладают большие амебоциты всех изученных видов-представителей.

The article discusses the features of hemocyte energy reactions in some representatives of Mollusca type in response to incubation in solutions with different osmolarity. The study was conducted with the use of a confocal laser scanning microscope, with hemocytes coloring by rhodamine B. The study proves that large amoebocytes have the highest energy consumption.

Ключевые слова: гемолимфа; гемоциты; митохондрии; энергетический статус; осмотическая нагрузка. Гемоциты – циркулирующие клетки гемолимфы моллюсков, обладают рядом функций, среди которых важную роль играют эффекторные функции. Являясь действующими единицами иммунного ответа, гемоциты, несомненно, должны обладать большими энергетическими требованиями, поскольку фагоцитоз предусматривает изменение конформации клетки и непосредственные затраты на ликвидацию чужеродных агентов, попавших в гемолимфу [1,2]. Морфологические исследования, подтвер-

Key words: hemolymph; hemocytes; mitochondries; energetic status; osmotic stress.

ждающие наличие в цитоплазме большого числа митохондрий [3,4,5] еще не доказывает их активность в конкретный момент времени [6]. Кроме того, гемоциты должны обладать достаточно высокой осморезистентностью, чтобы иметь возможность выполнять специфические функции в различных условиях. Гемоциты, в особенности, клетки, способные к самостоятельному передвижению, несущие эффекторные функции в иммунной системе моллюсков, безусловно,

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Кулько С.В. ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СТАТУСА ГЕМОЦИТОВ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КЛАССА GASTROPODA (MOLLUSCA) В УСЛОВИЯХ ОСМОТИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ

имеют большие энергозатраты, что, отчасти, подтверждается в морфологических исследованиях отечественных и зарубежных ученых [7,8,9]. Разумно предположить, что особенно высокие энергетические требования присущи фагоцитирующим клеткам, которые обладают способностью к амебоидному движению и поглощению чужеродных агентов [10]. Материалы и методы исследования. Исследование энергетической активности митохондрий в условиях осмотической нагрузки было произведено в 2013-2014 году на базе кафедры анатомии и физиологии живых организмов НИУ «БелГУ» с использованием КЛСМ Nikon Digital Eclipse Ti-E и программного обеспечения C1. Для проведения исследования брали половозрелых моллюсков Helix pomatia, Stenomphalia ravergieri, Viviparus viviparus, Achatina fulica, Planorbarius corneus, Lymnaea stagnalis и Ampullaria australis, по 12 особей от каждого вида. Гемолимфу от каждой особи каждого вида-представителя отбирали стандартным методом [11] и делили на три пластиковые

чашки Петри, по 5 мкл на чашку. В пробы приливали по 5 мкл 0,01 mM раствора родамина Б [12], приготовленного с использованием растворов различной осмолярности: (изотонический раствор - 171,6 мосмоль/л NaCl, гипотонический - 41.19 мосмоль/л NaCl, и гипертонический – 212,79 мосмоль/л NaCl [11]) и после 30-минутной инкубации облучали лазером с длиной волны 545 nm. Для получения результатов измеряли по 10 клеток каждого типа от каждой изученной особи каждого изученного вида. Результаты исследования и их обсуждение. При изучении гемоцитов H. pomatia было выявлено, что наибольшей энергетической активностью обладают большие амебоциты (БА) (табл. 1), и показатели резко возрастают в гипертонической среде, в то время как в гипотонической среде достоверных изменений не наблюдается. Малые амебоциты (МА) в целом ведут себя аналогичным образом, а малые гранулярные (МГ) и круглые клетки (КК) слабо реагируют на изменение осмотичности среды.

Интенсивность флуоресценции гемоцитов H. pomatia, инкубированных в средах с различной осмолярностью

Таблица 1

Среда/тип клеток

БА

МА

МГ

КК

гипотония

250,20±22,58

203,56±19,87

162,50±18,26

169,44±12,27

изотония

263,30±16,31

213,89±15,96

183,20±20,34

164,50±16,68

гипертония

367,89±16,04*

279,56±20,59*

202,00±19,52

162,75±26,92

Примечание: * – достоверность различий по сравнению с изотонией (p<0,05); достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента

При исследовании клеток гемолимфы S. ravergieri было выявлено, что наибольшей энергетической активностью обладают большие амебоциты (табл. 2), однако их энергетическое состояние в ответ на снижение осмотичности среды не претерпевает достоверных изменений, что верно

и для малых амебоцитов. Малые гранулярные клетки и круглые клетки несколько снижают энергетическую активность при понижении осмотичности среды, а на повышение осмотичности достоверной реакции не проявляют.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ Таблица 2

Интенсивность флуоресценции гемоцитов S. ravergieri, инкубированных в средах с различной осмолярностью Среда/тип клеток

БА

МА

МГ

КК

гипотония

320,90±27,59

264,25±20,68

177,00±20,49*

138,20±11,37*

изотония

332,00±18,84

267,00±20,88

221,83±14,14

166,00±17,70

гипертония

362,80±19,26

260,29±14,59

206,60±29,07

144,90±14,91

Примечание: * – достоверность различий по сравнению с изотонией (p<0,05); достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

Из всех гемоцитов V. viviparus наибольшей энергетической активностью обладают большие амебоциты (табл. 3), причем они резко реагируют на понижение осмотичности среды снижением энергетических показателей. Малые амебоциты, ма-

лые гранулярные клетки и креглые клетки на инкубацию в гипертоническом растворе отвечают повышением напряженности энергетических прноцессов, в то время как на снижение осмотичности среды достоверной реакции не показывают. Таблица 3

Интенсивность флуоресценции гемоцитов V. viviparus, инкубированных в средах с различной осмолярностью Среда/тип клеток

БА

МА

МГ

КК

гипотония

160,40±18,60*

141,50±16,11

121,60±14,39

129,60±11,50

изотония

260,50±28,22

184,20±27,38

135,60±16,27

123,10±12,40

гипертония

298,80±23,39

292,10±14,78*

220,40±20,91*

195,70±22,29*

При изучении гемоцитов A. fulica было выявлено, что наибольшими значениями энергетических показателей (табл. 4) обладают большие амебоциты, эти показатели достаточно резко возрастают в гипоосмотической среде, а на повышение осмотичности клетки не проявляют достоверной реакции. Наименьшими показателями обладают круглые клетки, их энергетическая активность с изменением

осмотичности среды не изменяется. Аналогичные реакции показывают и малые гранулярные клетки. Малые амебоциты отчетливо реагируют на снижение осмотичности, в то время как повышение осмотичности раствора практически не оказывает влияния на клетки данного типа.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Таблица 4

Интенсивность флуоресценции гемоцитов A. fulica, инкубированных в средах с различной осмолярностью Среда/тип клеток

БА

МА

МГ

КК

гипотония

379,50±20,58*

270,30±12,46*

213,60±21,46

145,40±18,84

изотония

306,70±17,58

215,50±15,30

193,00±15,44

158,10±16,87

гипертония

323,30±22,87

213,90±16,56

172,40±12,54

128,20±19,40

В гемолимфе P. corneus наибольшими энергетическими показателями (табл. 5) обладают большие амебоциты. На изменение осмотичности среды энергетические показатели клеток данного типа практически не реагируют. Наименьшими показателями обладают круглые клетки, из-

менения в их энергетических процессах, связанные с инкубацией в растворах с различной осмотичностью также недостоверны. Малые амебоциты и малые гранулярные клетки аналогично не проявляют очевидных реакций. Таблица 5

Интенсивность флуоресценции гемоцитов P. corneus, инкубированных в средах с различной осмолярностью Среда/тип клеток

БА

МА

МГ

КК

гипотония

193,90±18,22

181,70±15,95

181,10±16,83

147,30±17,86

изотония

214,40±20,98

181,10±16,67

174,80±14,00

153,10±18,35

гипертония

212,00±22,64

221,70±12,19

157,00±18,46

150,20±12,03

Наибольшей интенсивностью флуоресценции среди гемоцитов L. stagnalis обладают большие амебоциты (табл. 6), их энергетическая активность не показывает достоверных изменений в ответ на изменения осмотичности среды. Малые амебоциты показывают возрастание

энергетических показателей в гипоосмотическом растворе. Круглые клетки не проявляют реакций на изменение концентрации солей в инкубационном растворе.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ Таблица 6

Интенсивность флуоресценции гемоцитов L. stagnalis, инкубированных в средах с различной осмолярностью Среда/тип клеток

БА

МА

МГ

КК

гипотония

367,70±23,66

307,20±17,18*

156,10±12,76

145,40±18,84

изотония

317,90±25,78

260,00±16,53

151,10±17,23

158,10±16,87

гипертония

345,70±18,33

237,60±14,49

157,40±17,12

128,20±19,40

При исследовании гемоцитов A. Australis было выявлено, что наибольшими значениями флуоресценции обладают большие амебоциты (табл. 7), и эти показатели достоверно снижаются при инкубации в гиперосмотическом растворе. При инкубации в гипоосмотическом растворе клетки не проявляют выраженных реакций.

Малые амебоциты отвечают снижением напряженности энергетических процессов на любое изменение осмотичности среды, круглые клетки отвечают снижением показателей на инкубацию в гиперосмотическом растворе, а инкубация их в гипоосмотической среде не вызывает достоверных изменений энергетического статуса. Таблица 7

Интенсивность флуоресценции гемоцитов A. australis, инкубированных в средах с различной осмолярностью Среда/тип клеток

БА

МА

МГ

КК

гипотония

256,50±15,69

163,20±12,20*

181,90±19,83

147,30±17,86

изотония

270,89±17,31

205,67±18,25

194,20±15,74

153,10±18,35

гипертония

153,40±18,71*

117,10±10,53*

101,00±7,09*

150,20±12,03

Заключение. Максимальный уровень флуоресценции зафиксирован у больших амебоцитов всех изученных видов. Это представляется закономерным, исходя из их специфических функций – большие амебоциты имеют, вероятно, наибольшие энергетические запросы в связи со способностью к активному передвижению и фагоцитозу, который требует быстрого изменения формы клетки. Минимальный уровень флуоресценции показали круглые клетки; очевидно,

их низкая энергопотребность объясняется пассивным передвижением и отсутствием способности к образованию псевдоподий, а также к поглощению чужеродных агентов. Наиболее чувствительными к изменению концентрации солей в окружающем растворе являются малые амебоциты, большие амебоциты и в несколько меньшей степени, круглые клетки. Малые гранулярные клетки на изменения осмолярности инкубационного раствора реагируют слабо.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Литература:

1. Adema C.M., Harris R.A., Van Deutekom-Mulder E.C. A comparative study of hemocytes from six different snails: morphology and functional aspects. J. Inv. Path., 1992. 59: 24-32. 2. Adamowicz A., Bolaczek M. Blood cells morphology of the snail Helix aspersa maxima (Helicidae), 2003 3. Chang S. J., Tseng S. M., Chou H. Y. Morphological Characterization via Light and Electron Microscopy of the Hemocytes of two Cultured Bivalves: A Comparison Study between the Hard Clam (Meretrix lusoria) and Pacific Oyster (Crassostrea gigas). Zoological Studies, 2005. 44:144153. 4. Cima, F., V. Matozzo, M. G. Marin & L. Ballarin. 2000. Haemocytes of the clam Tapes philippinarum (Adams and Reeve, 1850): morphofunctional characterisation. Fish Shellfish Immunol. 10:677-693. 5. Ruddell C. L. The fine structure of the granular amebocytes of the Pacific oyster, Crassostrea gigas. J. Invertebr. Pathol. 1971 - 18:269-275. 6. Donaghy L., Artigaud S., Sussarellu R., Lambert C., Le Goïc N., Hégaret H., Soudant P. Tolerance of bivalve mollusc hemocytes to variable oxygen availability: a mitochondrial origin. Aquatic Living Resources, 26, pp 257-261. 2013 7. Sminia T. Structure and function of blood and connective tissue cells of the freshwater pulmonate Lymnaea stagnalis studied by electron microscopy and enzyme histochemistry. Z Zellfosch 1972 – 130:497-526. 8. Wen C. H., Kou G. H., Chen S. N. Light and electron microscopy of hemocytes of the hard clam, Meretrix lusuria (Roding). Comp. Biochem. Physiol. 1994 - 108:270286.

9. Zbikowska E. Comparative quantitative studies of hemocytes of the snails: Helix pomatia L. and Lymnea stagnalis (L.) (Gastropoda: Pulmonata). Biol. Bull. Poznañ 1998 - 35:25-32. 10. Accorsi A., Bucci L., Eguileor M., Ottaviani E., Malagoli D., Comparative analysis of circulating hemocytes of the freshwater snail Pomacea canaliculata – Fish and sellfish immunology, 2013. 1-9. 11. Присный А.А. Практикум по физиологии беспозвоночных животных, Белгород: Изд-во БелГУ, 2013 г. 12. Reungpatthanaphong P.L., Dechsupa S., Meesungnoen J., Loetchutinat C., Mankhetkorn S. Rhodamine B as a mitochondrial probe for measurement and monitoring of mitochondrial membrane potential in drug-sensitive and -resistant cells. – J. Biochem. Biophys. Methods. 2003 – 57(1):1-16. References: 1. Adema C.M., Harris R.A., Van Deutekom-Mulder E.C. A comparative study of hemocytes from six different snails: morphology and functional aspects. J. Inv. Path., 1992. 59: pp. 24-32. 2. Adamowicz A., Bolaczek M. Blood cells morphology of the snail Helix aspersa maxima (Helicidae), 2003. 3. Chang S. J., Tseng S. M., Chou H. Y. Morphological Characterization via Light and Electron Microscopy of the Hemocytes of two Cultured Bivalves: A Comparison Study between the Hard Clam (Meretrix lusoria) and Pacific Oyster (Crassostrea gigas). Zoological Studies, 2005. 44: pp. 144-153. 4. Cima, F., V. Matozzo, M. G. Marin & L. Ballarin. 2000. Haemocytes of the clam Tapes philippinarum (Adams and Reeve, 1850): morphofunctional characterisation. Fish Shellfish Immunol. 10: pp. 677-693.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

5. Ruddell C. L. The fine structure of the granular amebocytes of the Pacific oyster, Crassostrea gigas. J. Invertebr. Pathol. 1971 - 18:269-275. 6. Donaghy L., Artigaud S., Sussarellu R., Lambert C., Le Goïc N., Hégaret H., Soudant P. Tolerance of bivalve mollusc hemocytes to variable oxygen availability: a mitochondrial origin. Aquatic Living Resources, 26, pp. 257-261. 2013. 7. Sminia T. Structure and function of blood and connective tissue cells of the freshwater pulmonate Lymnaea stagnalis studied by electron microscopy and enzyme histochemistry. Z Zellfosch 1972 – 130: pp. 497-526. 8. Wen C. H., Kou G. H., Chen S. N. Light and electron microscopy of hemocytes of the hard clam, Meretrix lusuria (Roding). Comp. Biochem. Physiol. 1994 - 108:270286.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ

9. Zbikowska E. Comparative quantitative studies of hemocytes of the snails: Helix pomatia L. and Lymnea stagnalis (L.) (Gastropoda: Pulmonata). Biol. Bull. Poznañ 1998 - 35:25-32.

Кулько Светлана Владимировна

10. Accorsi A., Bucci L., Eguileor M., Ottaviani E., Malagoli D., Comparative analysis of circulating hemocytes of the freshwater snail Pomacea canaliculata – Fish and sellfish immunology, 2013. pp. 1-9.

Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия

11. Prisny A.A. Praktikum po fiziologii bespozvonochnyh zhivotnyh [Practical Course on Physiology of Invertebrate Animals]. Belgorod: BSU Publ., 2013.

E-mail: psychonautica@inbox.ru DATA ABOUT THE AUTHOR

12. Reungpatthanaphong P.L., Dechsupa S., Meesungnoen J., Loetchutinat C., Mankhetkorn S. Rhodamine B as a mitochondrial probe for measurement and monitoring of mitochondrial membrane potential in drug-sensitive and -resistant cells. – J. Biochem. Biophys. Methods. 2003 – 57(1):1-16.

Kulko Svatlana Vladimirovna

аспирант

Postgraduate Student Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: psychonautica@inbox.ru

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Гребцова Е.А. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК И ИМАГО ZOPHOBAS MORIO

УДК 591.111.1:595.76

ГРЕБЦОВА Е.А. GREBTSOVA E.A.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК И ИМАГО ZOPHOBAS MORIO THE COMPARATIVE ANALYSIS OF CELL COUNTS IN LARVAE AND ADULTS OF ZOPHOBAS MORIO Аннотация

Abstract

Поведен сравнительный анализ клеточного состава гемолимфы личинок и имаго Zophobas morio. Для обеих групп доминирующим типом форменных элементов гемолимфы являются плазмоциты. Веретеновидные клетки у личинок появляются лишь через некоторое время после повреждения покровов. Определены показатель упругости гемоцитов и параметры, служащие для характеристики шероховатости поверхности клеток. Максимальные значения Модуля Юнга демонстрируют плазмоциты личинок.

The author compares the cell counts in larvae and adults of Zophobas morio. Plasmatocytes are the dominant type of the formed elements of hemolymph in both groups. Larval vermicytes appear within some minutes after damaging the integument. The study reveals the parameter of elasticity and characteristics of the cell surface roughness. Larval plasmatocytes demonstrate a maximum value of Young's modulus. Key words: hemocytes; Young's modulus; elasticity; cell surface roughness.

Ключевые слова: гемоциты; Модуль Юнга; упругость; шероховатость поверхности клеток.

Общее физиологическое состояние организма насекомых может быть охарактеризовано общим количеством гемоцитов в единице объема и соотношением их типов [5, c.1740-1755; 7, c.7-65; 9, c.7-20]. Формула гемолимфы существенно изменяется в разных стадиях развития вида и даже на протяжении одной стадии [1, с.73-79; 4, c.5971-5982]. Шероховатость поверхности, т.е. совокупность неровностей, образующих микрорельеф поверхности c относитель-

но малыми шагами, является причиной того, что истинная площадь поверхности выше, чем геометрическая [8, c.421-423; 10, c. 942-944]. Количественная оценка шероховатости поверхности мембран имеет важное практическое значение, так как позволяет выявить влияние гомогенности или гетерогенности поверхности на процессы захвата инородных объектов и устойчивость к гипоосмотическим нагрузкам (3, c. 557–575; 6, c. 919-929].

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Материалы и методы исследования. Пробы гемолимфы Zophobas morio брали у каждой особи по 2 раза, с промежутком в 1 час. Фиксировали изменения гемоцитарного состава с течением времени. После окукливания личинок провели повторную серию экспериментов с двукратным отбором гемолимфы. Прижизненные особенности клеток изучали в физиологическом растворе с использованием инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E. Провели типологизацию форменных элементов гемолимфы. В результате подсчета 100 гемоцитов строили гемограмму – запись морфологического состава гемолимфы каждой особи. На основании сопоставления гемограмм выводили формулу гемолимфы насекомых данного вида [1, c. 73-79]. Высушенные на воздухе нефиксированные препараты исследовали с помощью атомно-силового микроскопа. Данные по свойствам упругости и адгезии были получены в режиме атомно-силовой спектроскопии при наложении нагрузки в 16 локальных участках клеточной поверхности. Анализ зависимости деформации образца от приложенной нагрузки позволил количественно оценить модуль упругости и сравнить этот показатель на разных участках клеточной поверхности. С помощью программного приложения Image Analysis P9 проведен анализ амплитудных (или, так называемых, высотных) среднестатистических параметров, служащих для характеристики нерегулярности поверхности в вертикальном направлении [2, c. 32-40]. Cредняя квадратическая шероховатость Sq (Square Roughness, nm) – является определяющей характеристикой шероховатости. Параметры Sp (Maximum Peak Height, nm) и Sv (Maximum Valley Depth, nm) определяются как высота самого высокого пика и глубина самой глубокой впадины, отсчитанные от средней плоскости. Поскольку

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

по определению величина Sv равна расстоянию от нижней точки поверхности до уровня средней плоскости, то Sv соответствует средней толщине поверхностного слоя. Асимметрия Ssk (Skewness) – характеризует скошенность распределения профиля, когда один спад крутой, а другой – пологий; Эксцесс Sku (Kurtosis) характеризует протяженность распределения профиля. Параметр Sz (Maximum height of the scale limited surface) – максимальная высота рельефа поверхности, определяемая как разность высот между самой высокой и самой низкой точками поверхности на выборочной площади. Этот параметр соответствует толщине поверхностного слоя, заключенного между плоскостями, проходящими через самую низкую и самую высокую точки поверхности. Ниже этого слоя лежит сплошной материал. Таким образом, Sz можно рассматривать как параметр, характеризующий толщину поверхностного, возмущенного слоя, не полностью заполненного материалом, в котором происходит изменение рельефа. Так же были определены значения одного из функциональных параметров, характеризующих рельеф в локальной области и степень гладкости поверхности – плотность вершин (пиков) Sds (1/μm2). Данный показатель демонстрирует количество вершин на единицу площади, составляющих поверхность. Результаты исследования и их обсуждение. Гемоцитарный состав Z. morio неодинаков для исследуемых групп. Было выявлено различие в процентном соотношении разных типов клеток (табл. 1). Выявлено 3 типа форменных элементов гемолимфы: прогемоциты, плазмоциты и вермициты (рис. 1).

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Гребцова Е.А. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК И ИМАГО ZOPHOBAS MORIO

Рис.1. Нативные форменные элементы гемолимфы Z. morio: A – прогемоцит, B – плазмоцит, С – веретеновидный гемоцит

Прогемоциты – округлые клетки, диаметром от 5 до 7 μm. Ядро занимает большую часть цитоплазмы. Не способны к активному передвижению, псевдоподий не образуют. Плазмоциты – полиморфные клетки. Быстро распластываются по подложке, постепенно формируя широкий цитоплазматический обод по периферии.

Способны к образованию филоподий длиной до 1,8 μm и коротких ризоподий. Вермициты сильно уплощены в дорзо-вентральном направлении, имеют веретеновидную или листовидную форму. На полюсах клеток могут образовываться пучки коротких неветвящихся псевдоподий. Таблица 1

Гемоцитарная формула Z. morio на разных стадиях развития

Типы гемоцитов

Pro

Личинки (первый отбор проб)

24%

76%

–

Личинки (второй отбор проб спустя 1 час)

13%

65%

22%

–

68%

32%

Имаго

Pro – прогемоциты, Pl – плазмоциты, Ve – веретеновидные гемоциты

В гемолимфе личинок веретеновидные клетки (Ve) возникали лишь после повторного взятия пробы, что можно объяснить как реакцию организма на по-

вреждение покровов (рис. 2). У взрослых особей данный тип форменных элементов был обнаружен сразу после первого отбора гемолимфы.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Рис.2. Веретеновидный гемоцит Z.morio

Прогемоциты (Pro), являющиеся родоначальниками остальных форменных элементов гемолимфы, присутствовали лишь на личиночной стадии развития (рис. 3).

Рис.3. Прогемоцит Z.morio

Доминирующим типом клеток в обеих группах были плазмоциты (Pl), активно участвующие в процессах фагоцитоза (рис. 4).

Рис.4. Плазмоцит Z.morio

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Гребцова Е.А. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК И ИМАГО ZOPHOBAS MORIO

Линейные размеры гемоцитов среди исследуемых групп не имеют достоверных отличий (табл. 2). Таблица 2 Линейные размеры гемоцитов личинок и имаго Z. morio Тип гемоцитов

Длина клетки

Ширина клетки

Длина ядра

Ширина ядра

Pro Pl Ve Pl Ve

7,5±0,6 11,80±0,8 14,7±1,7 11,4±0,8 13,2±

6,9±0,7 7,9±0,5 6,1±0,1 7,3±0,3 5,9±0,3

4,7±0,5 5,8±0,3 5,3±0,2 5,9±0,1 4,8±0,4

4±0,2 5,1±0,3 4,0±0,05 5,3±0,4 4,8±0,1

Личинки Имаго

Модуль Юнга, характеризующий упругость поверхности гемоцитов, принимает максимальные значения для плазмоцитов (Pl) личинок (45,6±0,5 nN). У взрослых особей этот показатель не превышает 30,7 nN. Упругость веретеновидных гемоцитов (Ve) обеих групп насекомых составляет 45,5±0,4 nN. Поверхность всех клеток характеризуется отсутствием экстремальных пиков и впадин, о чем свидетельствует значение параметра Sku=2,5. Ssk>0 и не превышает трех, что говорит о приблизительно равном соотношении выростов и углублений мембраны.

Толщина поверхностного возмущенного слоя у плазмоцитов больше, чем у веретеновидных клеток (табл. 3). Величина параметра Sz у гемоцитов личинок превышает таковую у имаго, однако число выступов на единицу площади (Sds) у гемоцитов взрослых особей почти в 2 раза выше. Углубления максимальной величины (≈300 nm) характерны для вермицитов. Выросты же на поверхности клеток для исследуемых групп находятся в диапазоне 350-450 nm. .

Параметры, характеризующие микрорельеф поверхности гемоцитов и их упругость Показатели

Личинки Pl

Таблица 3

Имаго Ve

Модуль Юнга

45,6±0,7

45,8±0,4

30,7±1,1

45,5±0,3

48,3±13,8

31±4,7

55,6±6,6

26,3±9,4

125±32

321±36

134±37

348±46

335±24

469±38

396±27

377±23

Sku

2,8±0,7

2,5±0,3

2,5±0,1

2,7±0,02

Ssk

0,9±0,2

0,4±0,2

0,4±0,1

0,6±0,1

Sds

1,27±0,4

1,1±0,2

2±0,3

1,9±0,5

210±28

148±10

262±29

148±31

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Заключение. Гемоцитарная формула отличается на разных стадиях развития насекомого. Так, для личинок младших возрастов характерно содержание большого количества прогемоцитов, в то время как у взрослых особей они не были обнаружены. Применение АСМ позволяет оценить такие параметры гемоцитов, как микрорельеф клеточной поверхности, линейные размеры клеток, включая высоту. К числу

Литература: 1. Злотин А.З. Техническая энтомология. – Киев: Наукова Думка, 1989. – С. 73-79. 2. Новак А.В., Новак В.Р. Шероховатость пленок аморфного, поликристаллического кремния и поликристаллического кремния с полусферическими зернами. Письма в ЖТФ, 2013, том 39, вып. 19, С. 32-40 3. Трасатти С. Измерения истинной площади поверхности в электрохимии / С. Трасатти, О.А. Петрий // Электрохимия. – 1993. – Т. 29. – № 4. – С. 557–575. 4. Deng, Z. Applications of atomic force microscopy in biophysical chemistry of cells / Z. Deng, V. Lulevich, F.T. Liu, G.Y. Liu // The journal of physical chemistry. B. – 2010. – Vol.114. – No.18. – P.5971-5982. 5. Hinks C.F., Arnold J.W. Haemopoiesis in Lepidoptera. II. The role of the haemopoietic organs. – Can J Zool – 1977– P.1740–1755. 6. Hörber J.K. Investigation of living cells in the nanometer regime with the scanning force microscope / J.K. Hörber, W. Hiiberle, F. Ohnesorge, G. Binnig, H.G. Liebich, C.P. Czermy, H. Mahnel, and A. Mayr // Scanning Microsc. – 1992. – Vol.6. – P.919-929. 7. Jones J.C. Haemocytopoiesis in Insects. // In: Regulation of Haemocytopoiesis in In-

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

важнейших применений атомно-силовой микроскопии относится использование АСМ для изучения механических (упругих) свойств плазмалеммы. Мембрана вермицитов и плазмоцитов имеет многочисленные выступы и впадины, формирующие мембранный резерв клеток. Максимальный коэффициент шероховатости свойствен гемоцитам, принимающим активное участие в фагоцитозе..

sects, Gordon, A.S. (Ed.). – 1970. – Vol. 1. – P. 7-65. 8. Ushiki T. Atomic force microscopy in histology and cytology / T. Ushiki, J. Hitomi, S. Ogura, T. Umemoto, M. Shigeno // Archives of histology and cytology. – 1996. – Vol.59. – No.5. – P.421-423. 9. Wang C.L., Wang Z.X., Kariuki M.M., Ling Q.Z., Kiguchi K., Ling E.J. Physiological functions of hemocytes newly emerged from the cultured hematopoietic organs in the silkworm, Bombyx mori // Insect Sci. – 2010.–Vol. 17. – P. 7-20. 10. Wu Y. Membrane surface nanostructures and adhesion property of T lymphocytes exploited by AFM / Y. Wu, H. Lu, J. Cai, X. He, Y. Hu, H. Zhao, X. Wang // Nanoscale Res Lett. – 2009. – Vol.4. – P.942-944. References: 1. Zlotin A.Z. Tekhnicheskaya entomologiya [Technical Entomology]. Kiev: Naukova Dumka, 1989. pp. 73-79. 2. Novak A.V., Novak V.R. Sherokhovatost' plenok amorfnogo, polikristallicheskogo kremniya i polikristallicheskogo kremniya s polusfericheskimi zernami. Pis'ma v ZhTF [The Roughness of Amorphous Polycristal Membranes and the Polycristal with Polyspherical Grains. Letters in Journal of Theoretical Physics]. 2013. pp. 32-40.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Гребцова Е.А. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК И ИМАГО ZOPHOBAS MORIO

3. Trassaty S. Izmereniya istinnoy ploshchadi poverkhnosti v elektrokhimii // Elektrokhimiya [Measuring the True Surface in Electrochemistry]. 1993. pp. 557-575. 4. Deng Z. Applications of atomic force microscopy in biophysical chemistry of cells / Z. Deng, V. Lulevich, F.T. Liu, G.Y. Liu // The Journal of Physical Chemistry, 2010. pp. 5971-5982. 5. Hinks C.F., Arnold J.W. Haemopoiesis in Lepidoptera. II. The role of the haemopoietic organs. Can J Zool.1977. pp. 17401755. 6. Hörber J.K. Investigation of living cells in the nanometer regime with the scanning force microscope / J.K. Hörber, W. Hiiberle, F. Ohnesorge, G. Binnig, H.G. Liebich, C.P. Czermy, H. Mahnel, and A. Mayr // Scanning Microsc., 1992. pp. 919-929. 7. Jones J.C. Haemocytopoiesis in Insects. // In: Regulation of Haemocytopoiesis in Insects, Gordon, A.S. (Ed.), 1970. pp. 7-65. 8. Ushiki T. Atomic force microscopy in histology and cytology / T. Ushiki, J. Hitomi, S. Ogura, T. Umemoto, M. Shigeno // Archives of Histology and Cytology, 1996. pp. 421-423. 9. Wang C.L., Wang Z.X., Kariuki M.M., Ling Q.Z., Kiguchi K., Ling E.J. Physiological functions of hemocytes newly emerged from the cultured hematopoietic organs in the silkworm, Bombyx mori. // Insect Sci., 2010. pp. 7-20. 10. Wu Y. Membrane surface nanostructures and adhesion property of T lymphocytes exploited by AFM / Y. Wu, H. Lu, J. Cai, X. He, Y. Hu, H. Zhao, X. Wang // Nanoscale Res Lett., 2009. pp. 942-944.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ Гребцова Елена Александровна аспирант Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: shtirlitz009@mail.ru DATA ABOUT THE AUTHOR Grebtsova Elena Alexandrovna Postgraduate Student Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: shtirlitz009@mail.ru

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

УДК 581.17

ПИГАЛЕВА Т.А. PIGALEVA T.A.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА ЦЕЛОМОЦИТОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА LUMBRICUS (АННЕЛИДЫ, ОЛИГОХЕТЫ) THE COMPARATIVE ANALYSIS OF THE MORPHOFUNCTIONAL STATUS OF COELOMOCYTES IN REPRESENTATIVES OF THE GENUS LUMBRICUS (ANNELIDA, OLIGOCHAETA) Аннотация

Abstract

В статье приведен морфофункциональный анализ целомоцитов представителей трех видов р. Lumbricus. Lumbricus terrestris, Lumbricus rubellus и Lumbricus castaneus обитают в сходных биоценозах, а так же являются родственными видами в соответствии с установленной классификацией аннелид. Целью работы является сравнительный анализ клеток целомической жидкости. Используются методы световой микроскопии. В ходе исследования установлено наличие пяти типов форменных элементов целомической жидкости. Для каждого типа приведено описание и линейные размеры.

The paper presents a morphofunctional analysis of representatives of three types of coelomocytes p. Lumbricus. Lumbricus terrestris, Lumbricus rubellus and Lumbricus castaneus live in similar biological communities. In accordance with the established classification of annelids, they are related species. The aim of the study is a comparative analysis of the coelomic fluid cells. Using the methods of light microscopy, the author identified the presence of five types of formed elements in coelomic fluid. Each type was described and measured.

Ключевые слова: целомоциты; амебоциты; хлорагогенные клетки; дождевые черви. У аннелид функцию распределения несет целом, который выполняет важную роль в циркуляции питательных веществ главным образом при помощи клеточных элементов – целомоцитов [1]. Исследование морфологических особенностей форменных элементов аннелид является одним из актуальных направлений биомониторинга и сравнительной физиологии

Key words: coelomocytes; amoebocytes; Chloragogens; earthworms

[2]. Основоположниками этого направления являются E.A. Stein, E.L. Cooper, которые описали форменные элементы Lumbricus terrestris [3]. G.R. Cameron, R.P. Dales, Y. Kalaç предположили, что целомоциты выполняют функцию иммунной защиты организма [4, 5]. Исследования биохимии форменных элементов целомической жидкости показали наличие

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Пигалева Т.А. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА ЦЕЛОМОЦИТОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА LUMBRICUS (АННЕЛИДЫ, ОЛИГОХЕТЫ)

антимикробных пептидов и биологически активных соединений внутри везикул гранулоцитов [6, 7]. Галактионов обобщил возможные реакции иммунного ответа [8]. Участие целомоцитов в защитных реакциях организма свидетельствует об их тесной связи с окружающей средой, когда факторы, неблагоприятно воздействующие на организм, приводят к активации иммунных механизмов. Большинство работ направлено на всестороннее исследование целомоцитов Lumbricus terrestris, в то время как клетки остальных аннелид остаются описаны недостаточно. Lumbricus terrestris, Lumbricus rubellus и Lumbricus castaneus – это типичные геобионты, родственные виды – представители семейства Lumbricidae, рода Lumbricus. Перель Т.С. относит L. terrestris группе норников, обитающих в глубоких слоях почвы, L. castaneus к – поверхностно-обитающим, а L. rubellus – почвенноподстилочным видам дождевых червей [9]. По нашим наблюдениям представители этих двух видов предпочитают занимать сходные экологические условия, поэтому особый интерес представляет сравнительный морфологический анализ целомоцитов L. terrestris, L. rubellus и L. castaneus.

Материалы и методы исследования. Животные были собраны в пойме реки Везелка, Белгородского района, Белгородской области. Для определения видовой принадлежности использовали соответствующие определители [10]. Целомическую жидкость отбирали непосредственно из целома микропипеткой, после чего каплю помещали во влажную камеру. Наблюдение проводили за живыми целомоцитами в изотонической среде. В качестве физиологического использовали раствор, массовая доля NaCl в котором составляет 0,8%. Клетки исследовали при помощи инвертированного светового микроскопа Nikon Eclipse Ti-E. Отмечали морфологию и особенности поведения форменных элементов. При помощи программы «ВидеоТест - Размер 5.0» (Nikon Eclipse Ti-E, 60х) измеряли линейные размеры клеток по длинной и короткой оси, линейные размеры ядра, длину ложноножек. При описании клеточных типов уделяли внимание наличию гранул, вакуолей, включений, положению ядра, характеру выпускаемых ложноножек и адгезии клетки к подложке. При описании поведения целомоцитов описывали способность и характер передвижения.

Линейные размеры клеток целомической жидкости Lumbricus terrestris

Тип клеток

Линейные размеры клеток по длинной оси (µm)

Таблица 1

Линейные размеры клеток по короткой оси (µm)

Линейные размеры ядра по длинной оси (µm)

Линейные размеры ядра по короткой оси (µm)

Линейные размеры псевдоподий (µm)

БА

9,38±0,64

7,81±0,89

4,20±0,25

3,34±0,22

3,51±0,94

СА

7,91±0,36

7,53±0,27

3,17±0,32

3,05±0,12

0,92±0,03

МА

5,28±0,13

5,29±0,14

2,88±0,32

2,69±0,22

0,88±0,25

НА

8,41±0,42

7,65±0,27

3,26±0,16

3,04±0,21

ХЛ

22,59±0,38

15,56±0,66

5,46±0,61

5,16±0,16

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Результаты исследования и их обсуждение. Среди циркулирующих целомоцитов Lumbricus terrestris выделили пять клеточных типов, которые различались морфологически и функционально (табл. 1). БА – большие амебоциты, клетки не имеют постоянной формы. Цитоплазма наполнена фагоцитарными вакуолями, прозрачными и бурыми гранулами. Ядро не крупное, располагается ближе к центральной части клетки. Амебоциты не способны к направленному передвижению, выпускают длинные филоподии. Данный тип клеток способен к агрегации в группы по 3-7 амебоцитов и активному фагоцитозу. СА – средние амебоциты, клетки, отличительной чертой которых, является способность цитоплазмы растекаться, образуя правильную окружность (рис.1). Если детально рассмотреть ободок цитоплазмы, то можно заметить радиальные поддерживающие фибриллы. Центральная часть амебоцита, которая содержит ядро, органеллы и крупные гранулы, сохраняет объемную форму. Клетки этого типа не перемещаются, а прочно адгезируются к подложке, но способность к фагоцитозу сохраняется.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

чество гранул и обширных вакуолей. Ядро занимает периферическое положение. НА – большие округлые клетки, не способные выпускать ложноножки. Эти клетки имеют небольшое ядро, которое не занимает определенного положения. Цитоплазма прозрачная, содержит небольшое количество вакуолей. ХЛ – хлорагогенные клетки, объединяет различающиеся по размеру клетки, цитоплазма которых заполнена бурыми гранулами (рис. 2).

Рис. 2. Хлорагогенные клетки Lumbricus terrestris, видны бурые хлогагогенные гранулы Рис. 1. Средний амебоцит Lumbricus terrestris, видна циркулярная ламеллоплазма МА – малые амебоциты, клетки округлой формы, оболочка образует большое количество коротких ложноножек, типа филоподий, цитоплазма содержит большое коли-

Среди циркулирующих целомоцитов Lumbricus castaneus выделили пять клеточных типов, которые различались морфологически и функционально (табл. 2).

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Линейные размеры клеток целомической жидкости Lumbricus terrestris

Таблица 2

Линейные размеры клеток по длинной оси (µm)

Линейные размеры клеток по короткой оси (µm)

Линейные размеры ядра по длинной оси (µm)

Линейные размеры ядра по короткой оси (µm)

Линейные размеры псевдоподий (µm)

БА

8,97±0,82

7,71±0,58

3,85±0,55

2,77±0,27

5,45±0,82

СА

7,12±0,23

7,01±0,31

4,01±0,56

3,56±0,12

МА

6,20±0,16

6,23±0,26

2,42±0,24

2,14±0,37

НА

6,20±1,08

6,57±1,24

2,57±0,58

2,03±0,28

ХЛ

16,86±5,98

13,33±4,71

2,98±0,74

2,31±0,14

Тип клеток

БА – большие амебоциты – это клетки непостоянной формы, выпускающие множество длинных филоподий (рис. 3). Ложноножки располагаются равномерно по всему периметру клетки. Цитоплазма прозрачная, содержит много вакуолей и гранул. Ядро некрупное, занимает периферическую часть клетки. Амебоциты этого типа морфофункционально делятся на две группы – способные к активному передвижению и фагоцитозу и плотно адгезирующиеся к субстрату. Вторая группа клеток образует ламеллоплазму в виде циркулярной пластинки, дорзальная поверхность целомоцитов сглаживается.

Рис. 3. Большой амебоцит Lumbricus castaneus, видны ложноножки и вакуоли

СА – средние амебоциты – округлые амебоциты, образуют небольшие ложноножки по типу филоподий, которые располагаются равномерно по периметру клетки. Клетки способны агрегировать в группы в количестве 3-7 экземпляров, активно не перемещаются и не фагоцитируют. Цитоплазма густая, зернистая, заполнена гранулами неясного происхождения. Вакуолей в цитоплазме не наблюдали. Ядро небольшое, округлое занимает положение близкое к центральному. МА – малые амебоциты – округлые клетки, по периметру которых заметны небольшие инвагинации, цитоплазма светлая, прозрачная (рис.4). Характер распластывания говорит об окончании этого процесса: клетка имеет сглаженную дорзльную поверхность, но ламеллярный край или циркулярная пластинка отсутствуют. Ядро занимает положение близкое к центральному. Амебоциты этого типа не способны к активному перемещению и фагоцитозу.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

нулами, поэтому она выглядит зернистой. Ядро занимает краевое положение. ХЛ – хлорагоциты – большие клети, заполненные бурыми гранулами. Форма хлорагоцитов разнообразна, но чаще встречаются овальные, круглые и каплевидные клетки. Целомоциты этого типа не способны образовывать филоподии. Ядро небольшое, занимает краевое положение, Рис. 4. Малый амебоцит ближе к суженому полюсу клетки при каLumbricus castaneus, видны ложноплевидной форме. ножки и инвагинации мембраны Среди циркулирующих целомоцитов НА – неамебоциты – целомоциты этоLumbricus rubellus выделили пять постоянго типа не выпускают филоподий и не пеных клеточных типов, которые различались ремещаются. Цитоплазма заполнена граморфологически и функционально (табл. 3). Таблица 3 Линейные размеры клеток целомической жидкости Lumbricus rubellus Линейные размеры клеток по длинной оси (µm)

Линейные размеры клеток по короткой оси (µm)

Линейные размеры ядра по длинной оси (µm)

Линейные размеры ядра по короткой оси (µm)

Линейные размеры псевдоподий (µm)

БА

8,18±0,26

8,11±0,36

3,86±0,34

3,59±0,19

СА

6,91±0,58

6,04±0,38

3,05±0,57

2,78±0,16

МА

5,32±0,10

5,07±0,21

2,79±0,16

2,42±0,18

НА

5,62±0,23

5,36±0,43

2,74±0,32

2,81±0,18

ХЛ

10,41±0,31

9,91±0,61

3,05±0,02

2,96±0,21

Тип клеток

БА – большие амебоциты – клетки по форме близкие к сферической, способные выпускать филоподии, длина которых не превышает 3-4 мкм. Цитоплазма не гомогенная, заполнена большим количеством гранул и светлых вакуолей, клетки активно не перемещаются и не фагоцитируют. СА – средние амебоциты – в условиях нормальной солености имели гомогенную темную цитоплазму, в которой отмечали небольшое количество крупных вакуолей. Клетки не выпячивали ложноножки, имели угловатую форму, перемещение и фагоцитоз отсутствовал. Ядро круглое, может занимать как центральное, так и периферическое положение.

МА – малые амебоциты – клетки с непостоянной формой, способные выпускать короткие филоподии. Выпячивания цитоплазмы происходило по всей поверхности, что придает клеткам неясные очертания. Эти целомоциты не способны перемещаться, но адгезируются к подложке. Фагоцитоз для этого типа клеток не обнаружен. НА – неамебоциты, круглые клетки, не выпускают ложноножек и активно не перемещаются. В цитоплазме присутствуют гранулы. Ядро небольшое, смещено к периферии. ХЛ – хлорогогенные клетки отличаются тем, что цитоплазма полностью заполнена бурыми гранулами, которые маскируют остальные органоиды и ядро (рис. 5).

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Рис. 5. Хлорагогеноцит Lumbricus rubellus, видна цитоплазма, заполненная хлорагогенными гранулами

Клеточная популяция L. terrestris, L. rubellus и L. castaneus. представлена пятью типами целомоцитов. Функционально они могут быть разделены на амебоциты, выполняющие функцию инкапсуляции и иммунной защиты, и неамебоидные клетки, которые накапливают и переносят питательные вещества. Для каждого представителя червей отметили три типа амебоидных клеток, которые отличаются размером и активностью. Среди популяции амебоцитов каждого представителя имеются активно передвигающиеся, распластывающиеся и выпускающие филоподии амебоциты. Большие амебоциты L. terrestris, и L. castaneus – это активно перемещающиеся клети в толще жидкости, а большие амеЛитература: 1. Беклемишев В.Н. Основы сравнительной анатомии беспозвоночных: Т. 2. Органология. – М: Наука, 1964. – 448 с. 2. Любвина И.В., Рацевский Ю.К., Романюк Г.П. Влияние нефтепромысла на функциональное состояние лесного биогеоценоза. / Ю.К. Рацевский, Г.П. Романюк, И.В. Любвина. – Экология и охрана животных. Куйбышев: Куйбыш. ун-т, 1982. – С.27-43.

боциты L. rubellus – пассивные округлые клетки, заполненные гранулами. Средние амебоциты представителей трех видов демонстрировали различную морфологию и поведение. Средние амебоциты прочно адгезировались к субстрату, активно перемещались или занимали промежуточное положение – не адгезировались и не выпускали длинных филоподий. Что касается малых амебоцитов, то здесь наблюдали характерное поведение для всех исследованных представителей – образование небольших инвагинаций мембраны, отсутствие активного перемещения. Неамебоциты отличались постоянством морфологии для всех исследованных видов рода люмбрикус. У исследованных представителей отметили некоторые различия в линейных размерах целомоцитов. Большие амебоциты имеют наибольший размер у L. terrestris, малые амебоциты – у L. castaneus. Наиболее вариабельны по размеру и форме целомоциты типа ХЛ (таблица 1, 2 и 3), их линейные параметры уменьшаются в ряду – L. terrestris – L. castaneus – L. rubellus. Морфологически наиболее вариабельны СА. Малые амебоциты, неамебоциты и хлорагогенные клетки отличаются постоянством внешнего вида у всех трех представителей р. Lumbricus. Таким образом, отмечаем сходство целомоцитов описанных представителей рода Lumbricus. Отличия в морфофункциональном статусе клеток существуют, но для их уточнения необходимы дальнейшие исследования. 3. Cooper E.L. Oligochaetes. / E.A. Stein, E.L. Cooper. – In N. A. Ratcliffe and A. F. Rowley (eds.), Invertebrate blood cells, Academic Press: New York, 1981. – Vol. 1, pp. 75-140. 4. Cameron G. R. Inflammation in earthworms. – J. Gen. Path. Biol.,1932. – 35. – P. 833-872. 5. Dales R.P. Phagoytic defense by earthworm against pathogenic bacteria. / R.P. Dales, Y. Kalaç. – Comp. Biochem. Physiol., 1992. – 101A. – P. 487-490

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

6. Ratcliffe N.A. Invertebrate Blood Cells. / A.F. Rowley, N.A. Ratcliffe. – Academic Press: London, 1981. – Vol. 2. – 641 p. 7. Valembois P. Etude autoradiographique du role trophique des cellules chloragogenes des vers de terre. / M. Cazaux, P Valembois. – C.R. Soc. Biol., 1970. – 164. – P. 1015-1018 8. Галактионов В.Г. Эволюционная иммунология: Учеб.пособие/ В.Г. Галактионов. – М.: ИКЦ «Академкнига», 2005. – 408 с. 9. Перель Т.С. Распространение и закономерности распределения дождевых червей фауны СССР (с определительными таблицами). – М.: Наука, 1979. – 272 с. 10. Присный А.В. Работы с дождевыми червями / Практические работы школьников по экологии: Ч.2. Методические материалы к практическим работам (модельные методики и ключи для распознавания организмов). – Белгород: Издательство БелГУ, 1999. – 7 с. References: 1. Beklemishev V.N. Osnovy sravnitelnoy anatomii bespozvonochnyh [Fundamentals of Comparative Anatomy of Invertebrates: Vol. 2. Organology]. Moscow: Nauka, 1964. 448 p. 2. Lyubvin I.V., Ratsevsky J.K., Romaniuk G.P. Vliyanie neftepromisla na funktsionalnoe sostoyanie lesnogo biogotsinoza [The Influence of Oil Extracting Industries on the Functional State of Forest Biogeocenosis // Environmental and Animal Welfare]. Kuibyshev: Kuibyshev. Univ., 1982. pp. 27-43. 3. Cooper E.L. Oligochaetes. / E.A. Stein, E.L. Cooper.– In NA Ratcliffe and AF Rowley (eds.), Invertebrate blood cells, Academic Press: New York, 1981. Vol. 1, pp. 75-140. 4. Cameron G. R. Inflammation in earthworms. J. Gen. Path. Biol., 1932. 35. pp. 833-872. 5. Dales R.P. Phagoytic defense by earthworm against pathogenic bacteria. / R.P. Dales, Y. Kalaç. - Comp. Biochem. Physiol., 1992. 101A. pp. 487-490

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

6. Ratcliffe N.A. Invertebrate Blood Cells. / A.F. Rowley, N.A. Ratcliffe. Academic Press: London, 1981. Vol. 2. 641p. 7. Valembois P. Etude autoradiographique du role trophique des cellules chloragogenes des vers de terre. / M. Cazaux, P Valembois. – C.R. Soc. Biol., 1970. – 164. pp. 1015-1018 8. Galaktionov V.G. Evolutsionnaya immunologiya: Ucheb. posobie [Evolutionary Immunology: Textbook]. M.: ICC "Akademkniga", 2005. 408 p. 9. Perel T.S. Distribution and patterns of distribution of earthworm fauna of the USSR (with identification key). Moscow: Nauka, 1979. 272 p. 10. Prisny A.V. Raboty s dozhdevymi chervyami / Prakticheskie raboty shkolnikov po ekologii: Ch.2 Metodicheskie materialy k prakticheskim rabotam (modelnie metodiki i klyuchi dlya raspoznovaniya organizmov) [Working with Earthworms / Practical Work of School-children on Ecology: Part 2. Methodical Materials for Practical Work (Modeling Techniques and Clues for Recognition of Organisms)]. Belgrade: Publisher BSU, 1999. 7 p. СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ Пигалева Татьяна Александровна аспирант Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: pigaleva@bsu.edu.ru DATA ABOUT THE AUTHOR Pigaleva Tatiana Alexandrovna Postgraduate Student Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: pigaleva@bsu.edu.ru

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Погребняк Т.А., Горшков Г.И.

ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СЕРДЦА ПТИЦ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДЕСИНХРОНОЗА

УДК 619: 591.412:636.5.

ПОГРЕБНЯК Т.А., ГОРШКОВ Г.И. POGREBNYAK T.A., CORSHKOV G.I.

ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СЕРДЦА ПТИЦ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДЕСИНХРОНОЗА THE FEATURES OF ELECTRIC ACTIVITY REGULATION OF THE HEART IN BIRDS IN THE CONDITIONS OF THE EXPERIMENTAL DESYNCHRONOSIS MODEL Аннотация

Abstract

Особенности регуляции электрической активности сердца птиц изучены по сопряженности электрофизиологических коррелятов активности миокарда и центральных глубинных структур мозга в условиях экспериментальной модели десинхроноза – скученности. Установлено, что скученность вызывает у птиц устойчивое патологическое напряжение функций со стороны переднего отдела гипоталамуса и ретикулярной формации среднего мозга при подавлении тонуса заднего отдела гипоталамуса и высокой функциональной активности гиппокампа, определяющих переключение электрической проводимости желудочков сердца на более экономный режим функционирования. Одновременное проявление во второй половине скученности у птиц замедления ЧСС с возрастанием зубцов Р и уплощением зубцов Т свидетельствует о высокой активности обоих отделов ВНС, при этом парасимпатическое её звено воздействует на электрическую проводимость атриовентрикулярного узла, а симпатическое – на энергетическое обеспечение данной функции миокарда. Ключевые слова: регуляция электрической активности сердца; десинхроноз; электрофизиологические корреляты стресса.

The authors study some features of regulation of electric activity of the heart in birds on the basis of association of electrophysiological correlates of myocardial activity and central deep structures of the brain in the condition of the experimental model of desynchronosis  crowding. It was established that overcrowding causes in birds a sustainable pathological stress in functions of the anterior part of the hypothalamus and midbrain reticular formation in case of suppression of hypothalamic adjustable tone and high functional activity of the hippocampus which determine the switching of electrical conductivity of the heart ventricles to a more economical mode of operation. The simultaneous manifestation of slowing heart rate with increasing P wave and T wave flattening in the second half of crowding in birds indicates a high activity of both departments ANS, with the parasympathetic link acting on the electrical conductivity of the atrioventricular node, and the sympathetic link acting on the energy supply of the myocardial function. Key words: the regulation of electricity activity of heart; desynchronosis; electrophysiological correlates of stress.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

Проблема повышения продуктивности в птицеводстве актуализирует экспериментальное исследование механизмов адаптации птиц к стрессорам. В этом аспекте создание экспериментальных моделей нейрогенного стресса, вызывающих направленный сдвиг суточных эндогенных и приобретенных ритмов поведенческих и физиологических процессов организма – десинхроноз, дает реальную возможность изучать центральные механизмы адаптации к изменениям условий среды [1, 2, 3]. Скученность, как зоосоциальный стрессор, нарушает ритмичность всех процессов жизнедеятельности организма [4]. Сдвиги электрической активности (ЭА) миокарда и глубинных структур головного мозга являются объективными физиологическими показателями реагирования организма на смоделированные условия десинхронозов и отражают направленность и успешность механизмов регуляции адаптации [5, 6, 7, 8]. Цель исследования: изучение регуляции ЭА сердца птиц к условиям экспериментальной модели десинхроноза – скученности, по сопряженности электрофизиологических коррелятов активности миокарда и центральных глубинных структур мозга – передней и задней гипоталамических областей (Hptn и Hpt3), гиппокампа (Hip) и ретикулярной формации среднего мозга (RF). Материалы и методы исследования. Скученность, или уплотнение посадки птиц, является одним из распространенных в птицеводстве стресс-факторов, Модель хронического нейрогенного стресса создавалась за счет перевода взрослых петухов русской белой породы из индивидуальных клеток на групповое содержание с уплотнением (270 см2/гол). При такой высокой плотности посадки птицы не

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

могли свободно передвигаться – они или стояли, или сидели [4]. В указанные выше структуры мозга петухов стереотаксически биполярно вживляли электроды. Запись ЭЭГ и ЭКГ осуществляли до моделирования десинхроноза (фон) и на 1-е, 3-и, 7-е, 15-е, 23-и и 30-е сут скученности. Эти точки контроля установлены с учетом ритмичности висцеральных функций у животных [9]. Оценивали корреляционную связь между показателями ЭКГ (частоты сердечных сокращений – ЧСС, длительности электрической систолы предсердий – Р-Qинтервал, и электрической систолы желудочков – Q-T-интервал, длительности диастолической паузы – Т-Р-интервал, амплитуды зубца Р и зубца Т) и ЭЭГ (общей частоты потенциалов – ЧП, ά- и θ-индексов) при значении коэффициентов парных корреляций не менее 0,66 (р<0,05; n = 10). Результаты исследования и их обсуждение. В табл. 1 представлена выявленная 30-суточная динамика временных показателей ЭКГ-активности миокарда стрессируемых птиц. Визуальный анализ зарегистрированных ЭКГ птиц в условиях фона и в 30-суточном периоде скученности выявил основную тенденцию в динамике ЭА сердца – усиление отрицательного хронотропного эффекта. Нарастающее с 1-х сут скученности урежение сердечного ритма у петухов с 3-х сут по 30-е сут было достоверно значимым (р<0,05) (табл. 1). ЧСС, снизившись в первые 3-и сут стрессирования на 13,5% (р<0,01), проявлялась на установившемся уровне на 7-е и 15-е сут, но затем она ещё более уменьшилась и на 30-е сут была ниже фоновой на 24,3% (р<0,001). Удлинение кардиоциклов rS–rS с 1-х по 30-е сут стрессирования было достоверным и в целом составило от 11,2 (р<0,05) до 33,0% (р<0,001) соответствен-

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Погребняк Т.А., Горшков Г.И.

но. Интервалы P–Q, несколько удлинившись на 1-е и 3-и сут стрессирования, на 7-е сут соответствовали по значению исходной величине, но с 15-х сут они посте-

пенно удлинялись и были максимально выражены на 30-е сут – на 25,0% (р>0,1) выше фоновых. Таблица 1

Динамика временных ЭКГ-характеристик ЭА сердца птиц в условиях скученности (M±m; n=10) Показатели, ед. изм.

Условия опыта

ЧСС, мин-1

rS–rS, c

P–Q, с

Q–T, с

T–Р, с

Фон

337,5±7,4

0,178±0,004

0,028±0,002

0,133±0,003

0,017±0,001

Скученность n=10 1-е сут

305,0±10,3

0,197±0,008*

0,031±0,001

0,147±0,007

0,018±0,002

3-и сут

285,1±10,5**

0,210±0,009**

0,031±0,002

0,164±0,006*** 0,015±0,001

7-е сут

277,6±13,2**

0,216±0,012**

0,028±0,012

0,171±0,013**

0,017±0,002

15-е сут

285,7±13,6**

0,215±0,011**

0,030±0,002 0,162±0,010**

0,018±0,002

23-и сут

264,1±8,45*** 0,227±0,007*** 0,034±0,003 0,175±0,008*** 0,018±0,002

30-е сут

255,4±29,1*** 0,235±0,010*** 0,035±0,003 0,179±0,01***

0,020±0,002

Здесь и далее: * – р<0,05, ** – р<0,01, *** – р<0,001 С 1-х сут скученности интервалы Q–T удлинялись и с 3-х по 30-е сут их длительность возросла от 20,0 (р<0,01) до 37,8% (р<0,001) соответственно. Длительность интервалов Т–Р в течение первых 7-х сут стрессирования колебалась в пределах фона, но в последующий период она постепенно увеличивалась и на 23-и и 30-е сут в среднем на 17,6% (р>0,1) превышала его (см. табл. 1). Амплитуда зубцов Р возросла против фона на 1-е сут на 50,0% (р<0,05), на 3-и сут. она снизилась к исходному уровню, но на 7-30-е сут. достоверно (р<0,01) его

превышала (табл. 2). На 23-и сут величина зубцов Р была максимально выраженной против фоновой – на 66,2% (р<0,01). Сдвиги амплитуды зубцов rS имели статистически недостоверный характер, но в течение всего периода скученности их величина была выше фоновой и на 7-30-е сут превышала её в среднем на 14,5–15,9% (р>0,1). Аналогично изменялся вольтаж зубцов Т: на 1-е и 7-е сут он проявлялся в пределах фона, а на 3-и и 15-30-е сут был ниже его в среднем на 17,1% (р>0,1) (табл. 2).

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ Таблица 2

Динамика количественных ЭКГ-характеристик ЭА сердца петухов в состоянии скученности (M±m; n=10) Условия Показатели, ед. изм. опыта, Зубец Р, мВ Зубец rS, мВ Зубец Т, мВ ИП, % сут Фон

0,06±0,006

0,67±0,08

0,28±0,028

СП, %

23,6±2,9

75, 5±1,1

Скученность n=10 1-е сут

0,09±0,012*

0,77±0,06

0,27±0,04

28,5±6,8

72,6±1,2

3-и сут

0,07±0,008

0,70±0,05

0,23±0,008

30,4±9,2

75,7±1,6

7-е сут

0,11±0,005*** 0,78±0,06

0,28±0,03

39,3±3,9**

76,1±2,1

15-е сут

0,10±0,008*** 0,79±0,50

0,24±0,03

41,7±5,3**

74,7±1,1

23-и сут

0,113±0,015** 0,80±0,06

0,23±0,02

47,0±4,2***

75,6±1,9

30-е сут

0,102±0,011** 0,79±0,05

0,23±0,01

43,4±2,6**

75,4±1,2

Исходная временная структура кардиоинтервалов птиц в среднем составила: Р–Q – 15,7%, Q–Т – 74,7%, Т–Р – 9,6% (рис.). 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0

T-P P-Q Q-T К

сут

Рис. Динамика временной структуры кардиоциклов петухов в состоянии скученности: Р–Q – электрическая систола предсердий, Q–Т – электрическая систола желудочкой, Т–Р – общая диастола

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Погребняк Т.А., Горшков Г.И.

Временная структура кардиоинтервалов значительно изменилась в течение первой недели стрессирования. Так, в первые трое суток скученности процентная выраженность интервалов Р–Q сохранялась на исходном уровне; интервалов Q–Т увеличилась и на 3-е сут составила 78,1%; интервалов Т–Р уменьшилась в среднем до 7,1%. Процентная доля интервалов Р–Q и Т–Р на 7-е сут скученности снизилась в среднем до 13,0 и 7,9 соответственно, но доля интервалов Q–T возросла до 79,1%. На 15-е сут скученности временнвая структура кардиоциклов установилась в пределах исходной и в последующий период она практически не изменялась и на 30-е сут составила: Р–Q – 14,9%, Q–T – 76,5%, Т–Р – 8,6% (см. рис.). В фоновых условиях получен ряд корреляций ЭКГ-показателей с ЭА структур головного мозга: ЧСС с инактивацией Hip, длительности интервалов Q–Т – с тонусом Hptn, интервалов Р–Q – с активностью Hptn и Hip; амплитуды зубцов Р – с напряжением функций Hptn, и зубцов Т – с активностью Hptn и инактивацией Hip. Скученность изменила характер регуляторных связей. Удлинение интервалов Т–Р на 1-е сут стрессирования было сопряжено с инактивацией Hip. На 3-и сут удлинение интервалов Q–Т коррелировало с активностью Hptn и напряжением функций HptЗ; уменьшение интервалов Т–Р – с активацией РФсм, уплощение зубцов Т – с напряжением функций HptЗ. На 7-е сут скученности длительность интервалов Р–Q коррелировала с активацией Hip и инактивацией HptЗ; длительность интервалов Т–Р – с усилением активности HptЗ, а вольтаж зубцов Т – с её инактивацией. На 15-е сут характер корреляций был более выраженным: удлинение интервалов Р–Q сопровождалось активацией Hip и РФсм, а Т–Р – с напряжением тонуса Hptn, повышение зубцов Р – с инактивацией РФсм, уплощение зубцов Т – с инактивацией Hip. На 23-и сут ску-

ченности урежение ЧСС коррелировало с активностью Hptn и РФсм, удлинение интервалов Р–Q – с активацией РФсм, и Q–Т – с повышением тонуса Hptn. В этот период рост зубцов Р был сопряжен с активацией РФсм. На 30-е сут замедление ЧСС было связано с инактивацией Hptn, удлинение интервалов Р–Q – с активацией HptЗ, РФсм и напряжением тонуса Hip; удлинение интервалов Q–Т – с активностью HptЗ, рост зубцов Р – с функциональным напряжением Hptn и активацией HptЗ, Hip, РФсм; уплощение амплитуды зубцов Т – с подавлением активности Hip. Анализ данных корреляций позволяет отметить определяющее значение регулирующей активности Hpt, которая реализуется на основе активации его вегетативных отделов и их синергизма в организации адекватного приспособления ЭА миокарда сердца опытных петухов к условиям хронического стрессирования. Характер изменений временной структуры кардиоциклов опытных петухов позволяет предположить, что отсутствие возможности результативно использовать в созданных экстракардиальных условиях врожденные формы адаптивного поведения вызвало сильное нервно-эмоциональное напряжение в ЦНС с первых часов скученности. Это определило высокую активацию Hptn – гиперсинхронизацию его ЭА и усиление его регуляторных тормозных влияний на висцеральные системы, в том числе и на активность сердца, устранив возможность их перенапряжения и тем самым, создав условия для развития реально возможных компенсаторно-адаптивных реакций в организме. Увеличение процентной доли электрической систолы желудочков во временной структуре кардиоциклов с 3-х по 30-е сут скученности можно оценивать как синдром гиподинамии миокарда – экономизации его функций под усиленным парасимпатическим контролем в состоянии хронического стресса [3, 10]. Эти результаты позво-

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

ляют предположить, что проявление в экстракардиальных условиях у птиц выраженной брадикардии является одним из компенсаторных механизмов приспособления сердца к гипоксии при жестком ограничении двигательной активности [11]. По-видимому, её механизм генетически обусловлен необходимостью быстрой адаптации сердца к поддержанию высоких энергозатрат организма, связанных с мышечными нагрузками [12] и их экономией в условиях относительного покоя птиц. Очевидно, это сопряжено с существенными сдвигами в степени централизации управления сердечным ритмом и переходом на автономную его регуляцию [13, 14]. Так, смещение пейсмекера синуснопредсердного узла в направлении менее чувствительной к действию ацетилхолина нижней части миокарда [15] ограничивает урежение сердечного ритма и определяет возможность его нормализации по устранению экстракардиальной ситуации [11]. Заключение. Скученность вызывает у птиц устойчивое патологическое напряжение функций со стороны переднего отдела гипоталамуса и ретикулярной формации среднего мозга при подавлении тонуса заднего отдела гипоталамуса и высокой функциональной активности гиппокампа, определяющих переключение электрической проводимости желудочков сердца на более экономный режим функционирования. Одновременное проявление во второй половине скученности у птиц замедления ЧСС с возрастанием амплитуды зубцов Р и уплощением зубцов Т свидетельствует о высокой активности обоих отделов ВНС, при этом парасимпатическое её звено воздействует на электрическую проводимость атриовентрикулярного узла, а симпатическое – на энергетическое обеспечение данной функции миокарда.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Литература: 1. Амигарова М.Г. Нейроэндокринные механизмы эмоционального стресса // Успехи современ. Биологии. 1986. Т. 102. Вып. 1(4). С. 97-107. 2. Ашофф Ю. Обзор биологических ритмов / Биологические ритмы; под ред. Ю.А. Ашоффа. – М.: Мир, 1984. Т. 1. С. 12-21. 3. Пшенникова М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии // Актуальные проблемы в патофизиологии. М.: Медицина. 2001. С. 220-353. 4. Гигиена промышленного производства яиц / Данилова А.К., Найденский М.С., Шпиц И.С., Яворский В.С. М.: Россельхозиздат, 1987. 279 с. 5. Аринчин Н.И. Эволюция и клиническое толкование электрокардиограм-мы и фаз сердечного цикла. Минск: Беларусь, 1966. 221 с. 6. Баевский Р.М. Временная организация функций и адаптивно-приспособительная деятельность организма / Теоретические и прикладные аспекты временной организации биосистем. М.: Наука, 1976. С. 88-111. 7. Gantt W.H. Cardiovascular component of the conditioned reflex to pain, food and ofter stimuli // Physiol. Rev., 1960. Vol. 40. Pt.1. № 2. P. 460-485. 8. Loffelholz, K. Release of acetylcholine in the isolated heart // Am. J. Physiol., 1981. Vol. 240. Р. 431- 440. 9. Погребняк Т.А. Корреляционный анализ биоэлектрической активности структур ствола мозга и вегетативных функций в процессе адаптации птиц к стрессору // Приспособления организмов к действию экстремальных экологических факторов : материалы 7-й междунар. науч.-практ. экол. конф. – Белгород: Издво БелГУ, 2002. С. 62-69.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Погребняк Т.А., Горшков Г.И.

10. Федоров Б.М. Стресс и система кровообращения. М.: Медицина, 1991. 320 с. 11. Галанцев В.П. Электрокардиографический анализ приспособительных изменений автоматизма сердца у ныряющих млекопитающих // Сравнительная электрокардиология. Л.: Наука, 1981. С. 209-211. 12. Сравнительный анализ функций распределения кардио-интервалов у различных представителей классов птиц и млекопитающих / Минеев И.Ф., Гершкович Э.И., Гопадзе И.И., Минеев М.И. // Сравнительная электрокардиология. М.: Наука, 1981. С. 207-209.

4. Danilova A.K., Naidenskii M.S., Shpic I.S., Yavopckii V.S. Gigiyena promyshlennogo proizvodstva yaits [The Hygiene of Industrial Production of Eggs]. Moscow, 1987. 279 p. 5. Arinchin N.I. Evolyucia i klinicheskoe tolkovanie electrokardiogrammy i faz serdechnogo tsikla [The Evolution and Clinical Interpretation of Electrocardiogram and Phases of Cardiac Cycle]. Minsk, 1966. 221 p.

13. Галанцев В.П. Эволюция адаптаций ныряющих животных. Л., 1977. 191 с.

6. Baevskiy R.M Vremennaya organizatsiya funktsiy i adaptivno-prisposobitelnaya deyatelnost organizma / Teoreticheskie i prikladnye aspekty vremennoy organizatsii biosistem [Temporal Organisation of Functions and Adaptive Activity of the Body /Theoretical and Practical Aspects of Existential Organization of Biosystems]. Moscow, 1976. pp. 88-111.

14. Рощевский М.П. Эволюционная электрокардиография. Л., 1972. 252.

7. Gantt W.H. - Physiol. Rev.V. 40. no. 2. (1960): pp. 460-485.

15. Смещение пейсмекера в синуснопредсердном узле кролика, вызванное стимуляцией блуждающего нерва и введением ацетилхолина / Боуман Л.Н., Маккай А.Дж., Бликер В.К., Оп’т Т. Хоф. // Сравнительная электрокардиография. М.: Наука, 1981. С. 40-42.

8. Loffelholz K. - Am. J. Physiol. V. 240. (1981): pp. 431- 440.

References: 1. Amigarova M.G.Neiroendokrinnye mekhanizmy emotsionalnogo stressa // Uspekhi sovremen. biologii [Neuroendocrine Mechanisms of Emotional Stress // Advancecs of Morden Biology]. V. 102. no. 1(4) (1986): pp. 97-107. 2. Ashoff U. Obzor biologicheskih ritmov / Biologicheskie ritmy [Overwie of Biological Rhythms / Biological Rhythms]. Moscow. V. 1. (1984): pp. 12-21. 3. Pshennikova M.G. Fenomen stressa. Emotsionalniy stress i yego rol v patologii // Aktualnye problemi patologii [The Stress Phenomenon. Emotional Stress and its Role in Pathology // Importnat Problems of Pathophysiology]. Moscow, 2001. pp. 220-353.

9. Pogrebnyak T.A. Materialy 7 Mezdunarodnoy nauchno-practich. ecol. conf. “Prisposobleniya organizmov k deystviyu ekstremalnykh ekologicheskikh faktorov” [Correlational Analysis of Bioelectrical Activity of Brain Stem Structures and Vegetative Functions in the Process of Adaptation of Birds to Stress Factors // Adaptation of Organisms to the Influence of Extreme Ecological Factors: Materials of the 7th International Science Ecol. Conference]. Belgorod, 2002. pp. 62-69. 10. Fedorov B.M. Stress i sistema krovoobrashcheniya [Stress and the Circulatory System]. Moscow, 1991. 320 p. 11. Galantsev V.P. Elektrokardiograficheskiy analiz prisposobitelnykh izmeneniy avtomatizma serdtsa u nyryayushchikh mlekopitayushchikh // Sravnitelnaya elektrokardiologiya [The Electrocardiographic Analysis of Adaptive Changes of the Heart in Diving Mammals // Comparative Electrocardiography]. Leningrad, 1981. pp. 209-211.

СЕТЕВОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ СЕРИЯ «физиология»

12. Mineev I.F., Gershkovich E.I. Gopadze I.I. Mineev M.I. Sravnitelnyy analiz funktsiy raspredeleniya kardio-intervalov u razlichnykh predstaviteley klassov ptits i mlekopitayushchikh // Sravnitelnaya elektrokardiologiya [The Comparative Analysis of Functions of Cardio-intervals Distribution in Different Classes of Birds and Mammals]. Moscow, 1981. pp. 207-209. 13. Galancev V.P. Evolyutsiya adaptatsiy nyryayushchikh zhivotnykh [Evolution of Adaptation of Diving Animals]. Leningrad, 1977. 191 p.

АУЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Погребняк Татьяна Алексеевна кандидат биологических наук, доцент Белгородский государственный национальный исследовательский университет ул. Победы, 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: pogrebnyak@bsu.edu.ru

14. Roschevskii M.P. Evolyutsionnaya elektrokardiografiya [Evolutionary Electrocardiography]. Leningrad, 1972. 252 p.

Горшков Григорий Иванович доктор биологических наук, профессор

15. Bouman L.N., Mackay A.J., Blicker B.K., Op’t T. Hof Smeshcheniye peysmekera v sinusno-predserdnom uzle krolika, vyzvannoye stimulyatsiyey bluzhdayushchego nerva i vvedeniyem atsetilkholina [The Displacement of Pacemaker in the Sinuatrial Area of Rabbit Caused by the Stimulation of Nervus Vagus and Administration of Acetylcholinum // Comparative electrocardiography]. Moscow, 1981. pp. 40-42.

Белгородская государственная сельскохозяйственная академия ул. Вавилова, 1, п. Майский, Белгородский район, Белгородской области, 308503, Россия E-mail: pogrebnyak@bsu.edu.ru DATA ABOUT THE AUTHORS Pogrebnyak Tatyana Alekseyevna PhD in Biology, Associate Professor Belgorod State National Research University 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: pogrebnyak@bsu.edu.ru Gorshkov Grigoriy Ivanovich Doctor of Biology, Professor Belgorod State Agricultural Academy 1 Vavilova Street, Mayski Township, Belgorod Region, 308503, Russia E-mail: pogrebnyak@bsu.edu.ru