Sondas

lo tanto, a medida que aumenta el número de copias de genes durante la reacción, también lo hace la fluorescencia, lo que indica el progreso de la reacción.

Las etapas de la Q-PCR son las mismas que la PCR convencional, sin embargo, hay que considerar que dentro de cada ciclo existe una etapa de detección de señal la cual depende de la tecnología de fluorescencia sea esta un florocromo intercalate de ADN como el SYBR Green o una sonda como por ejemplo las sondas Taqman que son las más utilizadas. La señal emitida es captada por un detector y enviada a la computadora después de la conversión a una señal digital que se muestra en la pantalla. La señal se puede detectar cuando sube el nivel del umbral (nivel de detección más bajo del detector o CT). Esta metodología puede partir de ADN o de ARN mediante una previa conversión a ADN complementario mediante retrotranscripción (RT-QPCR).

Ejemplo de los dos métodos de fluorescencia más usados en Q-PCR. Tomado de https://microbenotes.com/real-time-pcr-principle-process-markersadvantages-applications/

Tipos de fluorescencia en la Q-PCR

- SYBR Green:

Este es un colorante intercalante de ADN tinte que emite una señal fluorescente prominente cuando se une al surco menor del ADN bicatenario, de manera inespecífica. También se pueden utilizar otros tintes fluorescentes como el bromuro de etidio o el naranja de acridina, entre otros, pero es mejor utilizar SYBR Green por su mayor intensidad de señal y menor toxicidad.

El SYBR Green es más versátil y económico, sin embargo, no tiene la misma especificidad que presentan las sondas y su fluorescencia puede ser detectada de manera inespecífica.

Esquema de la detección con SYBR Green o similares. Tomado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Elsevier Health Sciences, (p.206).

- Sondas

Existen varios tipos de sondas utilizadas en Q-PCR, las más populares son las sondas de hidrólisis o sondas Taqman que llevan un colorante indicador (Reporter), a menudo fluoresceína (FAM) en su extremo 5 'y un inhibidor (Quencher) de tetrametilrodamina (TAMRA), unido al extremo 3' del oligonucleótido.

En condiciones normales, la sonda permanece enrollada sobre sí misma llevando el reporter cerca del quencher, que inhibe o apaga la señal fluorescente del tinte. El quencher trabaja a modo de interruptor del reporter, cuando están juntos, la señal está “apagada”.

La sonda tiene una región homóloga con el gen diana y, por tanto, cuando la secuencia diana está presente en la mezcla se hibridan. A medida que la taq polimerasa comienza a formar una nueva cadena de ADN en la etapa de extensión, provoca la degradación de la sonda por la actividad nucleasa del extremo 5 'y el reporter de fluoresceína se separa del quencher como resultado de lo cual se genera la señal de fluorescencia.