Diseño de cebadores

Esquema de las etapas de una PCR estándar. Tomado de Herráez, Á. (2012). Biología Molecular e Ingeniería Genética. Elsevier Health Sciences, (p.203).

Esquema de la amplificación de un fragmento de ADN por PCR. Tomado de https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa

El diseño adecuado de los cebadores es básico para garantizar la especificidad de la PCR. Un primer debe cumplir con los siguientes parámetros:

- Especificidad: Reconocer una secuencia única dentro del ADN templado. Así un cebador no puede unirse a más de una región del ADN y debe hacerlo en la dirección correcta para la síntesis (5’a 3’).

http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/seq_anal/primer_design/primer_design .htm

- Longitud: es recomendable que los primers tengan entre 18 y 30 nucleótidos.

Esto garantiza la especificidad.

http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/seq_anal/primer_design/primer_design .htm

- Contenido de CG: Se recomienda que el contenido de citocinas y guaninas en la secuencia sea de entre 40 y 60%. Se debe evitar tramos de polipurinas o polipirimidinas.

PoliC, PoliG o PoliG/C provoca unión más fuerte por lo tanto hibridación no específica. PoliT, PoliA o PoliA/T provoca unión más débil, por lo tanto se puede separar el complejo primer-templado en esa zona.

- Temperatura de hibridación (temperatura de annealing Ta): lo óptimo es que sea de entre 55 y 80C a menor tempreatura menor especificidad, a mayor temperatura menos rendimiento de la PCR. Depende de la longitud y composición del primer.

La Ta depende de la Temperatura de melting o fusión (Tm) de los primers. La Tm es la temperatura a la cual la mitad de las moléculas de primer están apareadas con el ADN molde y se calcula con la siguiente fórmula Tm= 2 (A+T) + 4(G+C). Los primers no deben tener Ta muy diferentes entre sí, no más de 5°C.

- Composición de las regiones terminales 3': se deben evitar secuencias de 3 o más Cs o Gs en las regiones terminales 3' ya que pueden provocar amplicones inespecíficos.

- Complementariedad de secuencia: las terminaciones 3' no deben ser complementarias, ya que esto puede llevar a la formación de dímeros. Con complementariedad en más de 3 pb el primer se pliega sobre sí mismo en una estructura doble cadena (hairpin).