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Laser de Baixa Potência sobre Culturas Celulares de Interesse Odontológico Márcia Martins Marques Leila Soares Ferreira Maria Stella N. A. Moreira
INTRODUÇÃO A terapia com laser de baixa potência (TLBP) tem sido estudada tanto in vivo quanto in vitro, em especial na busca do entendimento de seus mecanismos de ação. Mais especificamente, esses estudos buscam compreender a resposta dos mais diferentes tipos celulares a essa terapia. Na verdade, a utilização de células em cultura tem demonstrado que vários tipos celulares respondem de forma diferente à irradiação laser em função dos parâmetros das irradiações, ou seja, dos comprimentos de onda utilizados, da potência, da energia, da densidade de potência e da densidade de energia aplicadas. Sabendo-se que os cromóforos que absorvem os comprimentos de onda mais utilizados na TLBP estão presentes nos diferentes compartimentos das células e que, ao serem irradiados, irão iniciar diferentes cascatas de eventos que representam a resposta à TLBP, nada mais lógico do que estudar a resposta da TLBP em nível celular. No momento em que esses eventos celulares forem desvendados, será possível entender todo o processo dessa terapia e, assim, suas melhores formas de aplicação. Desse modo, utilizando técnicas de cultivo celular, pesquisadores têm examinado a resposta das células à TLBP por meio da mensuração de número de células e de viabilidade celular, observação de dano ao DNA e da integridade de membrana, além da análise de síntese e secreção de proteínas, morfologia celular, e morfologia no nível ultraestrutural. O cultivo celular é uma técnica relativamente jovem, já que se iniciou no início do século passado com os experimentos de Harrison (1907) e Carrel (1912)1. Esse método de pesquisa utiliza células provenientes do crescimento de células dissociadas de seu tecido de origem por migração espontânea ou por dispersão mecânica e/ou enzimática. Graças ao uso de antibióticos, meios de cultivo específicos, técnicas de assepsia e equipamentos para a manutenção dessas células, o processo de execução do cultivo celular é eficiente e reprodutível. Em cultura, as células apresentam a capacidade de se multiplicar fora do organismo, em placas ou frascos de cultura, em condições específicas, mantendo o máximo de suas características fisiológicas, bioquímicas e genéticas originais. Mais ainda: essas células são passíveis de congelamento e podem ser descongeladas a qualquer momento para serem novamente utilizadas na mesma pesquisa ou em novas investigações. Como exemplo podemos citar a linhagem de células epiteliais denominada Hela, que foi obtida por Carré em 1912 e que vem sendo utilizada até os dias atuais em diversas pesquisas, inclusive nos estudos dos efeitos da TLBP2. As aplicações da técnica de cultivo celular são inúmeras, desde aplicações básicas até aplicadas, em que os estudos podem ser realizados no âmbito da biologia celular e também molecular1. Entre as aplicações destacam-se a análise da atividade intracelular e do fluxo intracelular e o estudo da interação célula/célula. Mais ainda: existem aplicações na genética, na produção de proteínas, no estudo da farmacologia, na toxicologia e, mais recentemente, na engenharia tecidual. Todas essas aplicações podem e vêm sendo utilizadas nos estudos dos efeitos biológicos da TLBP. O nosso grupo de pesquisa vem, desde 19983-15, estudando os efeitos da TLBP sobre células em cultivo. De fato, pretendemos neste capítulo apresentar os resultados destes trabalhos e dos demais publicados na literatura que utilizaram a técnica de cultivo celular, mostrando os avanços e as dificuldades que foram encontrados nessa trajetória. Serão apresentados, ainda, detalhes das metodologias de pesquisa na área da TLBP sobre células em cultivo.
METODOLOGIA PARA A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS EM CULTURA PARA SE ANALISAR OS EFEITOS BIOLÓGICOS DA TLBP Antes de apresentarmos os trabalhos que estudaram os efeitos da TLBP sobre células em cultura, exibiremos alguns dados metodológicos de importância que têm sido utilizados em estudos publicados na literatura e empregados em nossos trabalhos de pesquisa. 44
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No decorrer das pesquisas foram verificadas algumas condições experimentais de importância que deveriam ser obedecidas para se obter o correto desenvolvimento dos trabalhos e garantir a sua reprodutibilidade. Em primeiro lugar, como em qualquer estudo sobre efeitos biológicos da TLBP, no seu uso laboratorial ou clínico, a apresentação de todos os dados referentes a parâmetros utilizados nas irradiações deve ser a mais completa e fiel possível. Os trabalhos devem fornecer dados sobre: comprimento de onda, nem que seja ao menos informado se vermelho ou infravermelho, potência, densidade de potência, energia, densidade de energia, área do feixe ou área irradiada, método de irradiação, número de irradiações, duração da irradiação, intervalo entre as irradiações e o tempo entre a irradiação final e a obtenção dos resultados. Há também a necessidade de se medir a potência de saída do laser antes e depois dos experimentos para se ter certeza de que as células receberão a energia correta designada para cada grupo experimental. Além dos dados citados, outros detalhes experimentais também devem ser utilizados nos estudos com cultivo celular para garantir que, se efeitos existem, estes sejam não só observados com clareza, mas também possam ser confiáveis e reprodutíveis. Entre eles destacamos: indução das condições experimentais ideais para a análise dos efeitos da TLBP sobre células em cultura, condições de estresse celular, homogeneidade nas condições experimentais, direção do feixe laser, localização das culturas dentro das placas a serem irradiadas, irradiação de todas as células nos poços ou placas e tipos celulares utilizados nos estudos. Esses aspectos serão apresentados a seguir.
INDUÇÃO DAS CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS IDEAIS PARA A ANÁLISE DOS EFEITOS DA TLBP SOBRE CÉLULAS EM CULTURA Uma das preocupações relacionadas com os estudos dos efeitos da TLBP sobre células em cultivo dizia respeito à correta interpretação dos resultados obtidos. Na verdade, muitos pesquisadores não acreditavam nos efeitos da TLBP porque, após experimentos de irradiação de células em cultura, não era possível se observar diferenças significativas nas respostas de culturas irradiadas e culturas não irradiadas. Na nossa experiência, isso inicialmente também ocorreu. Num primeiro momento, quando trabalhávamos com fibroblastos oriundos de culturas primárias de mucosa bucal humana (linhagem LMF)3,4 e com linhagem estabelecida de fibroblastos murinos (linhagem NIH-3T3)5, as diferenças nos resultados obtidos eram quase imperceptíveis quando comparadas culturas irradiadas com diversos parâmetros e culturas controle não irradiadas. Foi só depois de muita reflexão e estudos sobre o que já se conhecia sobre os mecanismos de ação da TLBP é que passamos a trabalhar com células estressadas por déficit nutricional. De fato, a TLBP é capaz de restabelecer as condições metabólicas ideais de células submetidas a situações de estresse ou pela participação em processos patológicos, quanto na cicatrização de feridas. Assim, a irradiação de células crescidas e mantidas nas suas condições ideais de cultivo não poderia levar a alterações marcantes no seu metabolismo, quer seja na sua taxa de proliferação, quer na sua capacidade de produzir proteínas, por exemplo.
CONDIÇÕES DE ESTRESSE CELULAR Para melhor observar os efeitos da TLBP sobre células em cultura tem sido adotada pelo nosso grupo de pesquisa, bem como por outros autores, a situação de estresse por déficit nutricional. Células de mamíferos em cultura, em especial as de interesse odontológico, que em geral são obtidas por cultivos primários de tecidos bucais, necessitam de uma suplementação de soro fetal bovino no meio de cultivo. Esse soro contém hormônios e fatores de crescimento, entre outras substâncias, que são essenciais para o crescimento e a manutenção da viabilidade dessas células1. Cada tipo celular necessita de uma concentração específica desse soro para a sua manutenção. Assim, quando essa concentração é diminuída, as células passam a apresentar um comportamento metabólico aquém do seu potencial basal. Então, antes de iniciar qualquer protocolo experimental para analisar os efeitos da TLBP sobre células em cultura, é necessário determinar a concentração ideal de soro para colocar estas células em estresse. Para se determinar essa concentração, em geral, há que se construir curvas de crescimento de células cultivadas em meios contendo soro fetal bovino em diversas concentrações, que variem desde a ideal e recomendada para aquele tipo celular até a ausência total de soro. Diante dos resultados, a escolha da concentração ideal para ser usada nos futuros experimentos com a TLBP será determinada quando se obtiver uma curva em que se observe crescimento significativo das células no decorrer do tempo experimental. Esse crescimento, mesmo que significativo do primeiro até o último dia do experimento, deve ser significativamente menor do que o observado nas culturas crescidas na concentração de soro ideal e recomendada para aquele tipo celular estudado. De posse da concentração de soro fetal bovino que leve as células a crescerem menos que o controle positivo, porém de maneira progressiva, teremos então a condição de estresse nutricional e este será então considerado o grupo controle negativo. E será sobre células crescidas nas mesmas condições do grupo controle negativo que se aplicará a TLBP, e os melhores resultados serão aqueles que se mostrarem significativamente maiores que os do grupo controle negativo não irradiado e que chegarem o mais próximo possível dos resultados do grupo-controle positivo não irradiado, mas que foi mantido nas condições ideais de cultivo. Na nossa experiência, células oriundas de cultivo primário são mais sensíveis a mudanças na composição do meio de cultivo, e para estas células uma diminuição da concentração em um terço ou metade já é capaz de colocar as mesmas em estresse3,4,5-8,11,12,14, enquanto células oriundas de linhagens celulares já estabelecidas, em especial de ratos, são menos sensíveis e, nestes casos há que se diminuir a concentração do soro fetal bovino em um quarto5.
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Além do déficit nutricional, outras formas de se obter células que não estejam no seu potencial metabólico ideal ou fisiológico é trabalhar com células em condição de hiperglicemia ou coletadas de pacientes diabéticos ou animais experimentalmente diabéticos, ou mesmo coletadas de áreas em cicatrização, ou de culturas que já atingiram a confluência e que já apresentam inibição de contato e queda do seu potencial metabólico16. O contato de células com substâncias das mais diversas, ou mesmo com vírus, por exemplo, podem estressar as mesmas diminuindo de forma significativa a sua taxa de proliferação. Na nossa experiência, o uso de corticosteroides, como a dexametasona7, de substâncias liberadas por materiais odontológicos, como cimentos endodônticos7 ou clareadores dentais15,e, mesmo, o contato com agentes infecciosos como vírus do herpes simples (HSV-1)10, podem levar diferentes tipos de células ao estresse.
HOMOGENEIDADE NAS CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS Além de se induzir as células ao estresse, deve-se tomar o cuidado de eliminar toda e qualquer outra influência experimental sobre as células dos diversos grupos estudados quando se quer obter resultados específicos da TLBP e que não possam ter sido influenciados por outros fatores ambientais. Para tanto todas as células de todos os grupos experimentais devem ser submetidas às mesmas condições ambientais durante o decorrer de todo o tempo experimental. Assim, mesmo células que não devem ser irradiadas, como as dos controles positivos e negativos, bem como as que receberão a TLBP nos mais diferentes protocolos, devem ser mantidas nas mesmas estufas e pelos mesmos tempos. Na verdade, as células que não receberão irradiação deverão ser mantidas fora da estufa pelo mesmo tempo que aquelas que estiveram fora durante a realização das irradiações. Outro aspecto ambiental de altíssima relevância diz respeito à luz ambiente. Na verdade, desde os primeiros trabalhos utilizando células em cultura para analisar efeitos da TLBP foi observada a necessidade de se realizar os experimentos em ambiente com a menor luz possível. No caso de não haver possibilidade de se controlar a luz ambiente, o que se faz é colocar a placa, ou os frascos a serem irradiados dentro de uma máscara opaca e escura para evitar que a luz interfira de alguma forma no experimento a ser realizado. Além disso, podem-se fazer pequenos orifícios na máscara que deixem somente o poço a ser irradiado exposto à irradiação (Figura 4.1).
DIREÇÃO DO FEIXE LASER As células de interesse odontológico crescem em cultura aderidas ao fundo das placas ou frascos de cultivo celular. Sobre essas células aderidas fica o meio de cultivo celular que, em geral, apresenta cor avermelhada ou alaranjada. A cor do meio é dada pela presença de fenol vermelho na sua composição. O fenol vermelho é um indicador de pH que, quando alaranjado, indica que as células estão crescendo em meio com pH neutro, o que é o ideal. Quando esse meio muda de cor, ele pode passar a exibir cor arroxeada quando o pH está alcalino e amarelada quando o pH está ácido1. Nessas duas situações as células não estarão nas suas condições ideais de cultivo e, portanto, os experimentos podem ser perdidos. Por essa razão é que ainda se utiliza o fenol vermelho nos meios de cultivo celular. No entanto alguns autores acreditam que a cor do meio poderia influenciar na absorção ou no espalhamento do feixe de laser. Isso é de maior importância quando a irradiação é feita não na base do frasco ou placa de cultivo, mas no seu topo. Nesse caso, o feixe passaria pelo meio antes de atingir a monocamada de células. Além disso, nessas condições há que se calcular a real área irradiada, já
Figura 4.1 Ilustração de câmara de fluxo laminar mostrando a disposição do equipamento laser e a placa de cultivo celular coberta por máscara negra. (Fonte: arquivo pessoal.)
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que a área do feixe não poderá ser utilizada para os cálculos da irradiação. Para evitar esses problemas, o ideal é fazer a irradiação pela base do frasco de cultivo, ou placa de cultivo, uma vez que o feixe laser irá atingir a monocamada celular antes de passar pelo meio de cultivo. Além disso, em contato com o fundo da placa a área do feixe pode ser calculada como sendo a área da saída do feixe na ponta do equipamento, o que facilita os cálculos dos parâmetros utilizados e, mais ainda, facilita a reprodutibilidade dos experimentos. De qualquer forma, se o pesquisador optar por irradiar as células por cima da placa, deve-se retirar a tampa delas para evitar reflexão da luz, ou mesmo utilizar placas com laterais e fundos escuros. Se a irradiação for feita a distância, por cima da placa ou em contato com o fundo da placa, será importante medir a potência que chega à monocamada celular. Se a irradiação for feita no topo da placa, o medidor de potência poderá ser colocado no fundo da placa; se a irradiação for feita na base da placa, essa mensuração fica mais difícil de ser realizada. No entanto, em qualquer uma dessas situações experimentais, o poço, ou a placa, deve estar preenchido por meio de cultura para que a mensuração seja fidedigna. De qualquer forma, a irradiação feita na base do poço minimiza a absorção ou reflexão da luz laser pelo meio de cultura. De fato, Brondon et al.17 relataram que a atenuação da potência total de saída do laser é da ordem de menos de 5% quando a irradiação é feita pela base do poço (Figura 4.2).
LOCALIZAÇÃO DAS CULTURAS DENTRO DAS PLACAS A SEREM IRRADIADAS As células podem ser irradiadas quando em suspensão, em geral dentro de tubos de ensaio, e posteriormente serem semeadas em placas de cultivo celular. Além disso, células podem ser irradiadas quando já aderidas ao fundo de placas de cultivo. Nesse caso há que se observar o tipo de placa que será empregada no experimento. Se as células forem plaqueadas em placas multipoços (6, 24, 48 ou 96 poços), deve-se ter o cuidado de se colocar uma distância entre os poços que serão irradiados, e os grupos-controle devem ser plaqueados em placas diversas daquelas que serão irradiadas. Até hoje não existe um estudo específico que tenha demonstrado que a irradiação de poços contendo células próximos entre si e próximos de poços controles não irradiados tivesse efeito sobre as células dos demais poços. Existem alguns indícios de que a luz laser, ao entrar em contato com a placa, pode sofrer espalhamento, portanto podendo influenciar as culturas dos poços vizinhos. Portanto se devem colocar as células em poços distantes uns dos outros para evitar qualquer tipo de influência durante as irradiações que pudessem resultar em algum tipo de viés no experimento (Figura 4.3). Para evitar o espalhamento da luz laser pode-se também lançar mão de líquidos coloridos nos poços vizinhos aos que serão irradiados para proteger aqueles que não deveriam ser irradiados.
IRRADIAÇÃO DE TODAS AS CÉLULAS NOS POÇOS OU PLACAS Há que se ter certeza de que todas as células dos poços foram irradiadas. Para tanto, o uso de placas de 96 poços e equipamentos de laser com feixes de diâmetro similar ao do fundo dos poços facilita a irradiação em um só ponto de todo o poço. No entanto, se
A
B
C
Figura 4.2 Ilustração da irradiação pela base dos poços. A: placa de 96 poços coberta por máscara negra e o posicionamento da ponta do equipamento de laser; B: vista da ponta do laser; C: visão da ponta do laser (seta) através do poço preenchido de meio de cultura. (Fonte: arquivo pessoal.)
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Figura 4.3 Ilustração de uma placa de 96 poços com os poços contendo células e meio de cultura entremeados por poços sem células contendo apenas solução salina tamponada com fosfato (PBS). (Fonte: arquivo pessoal.)
maior quantidade de células deve ser irradiada e placas ou poços de maior diâmetro forem necessárias, pode-se utilizar uma grade transparente contendo quadrados ou círculos que servirão de guia para as irradiações em múltiplos pontos, garantindo a irradiação de todas as células aderidas à placa ou ao poço (Figura 4.4).
CÉLULAS MAIS UTILIZADAS NOS TRABALHOS Segundo revisão de Peplow et al.16, os tipos celulares de animais ou de humanos que foram irradiados nos trabalhos publicados de 2002 a 2009 estavam limitados àqueles envolvidos na reparação de feridas e tecidos ou linhagens celulares de tecidos moles. Entre elas destacamos aquelas de interesse odontológico que foram: células-tronco, endoteliócitos, células de músculo liso, queratinócitos, monócitos, mas principalmente fibroblastos, quer sejam normais, estressados, diabéticos, quer de monocamadas confluentes e submetidas à ferida, ou seja, que perderam sua continuidade graças ao uso de um instrumento de raspagem, agulha ou ponta de pipeta.
Figura 4.4 Ilustração mostrando placa de 100 mm de diâmetro com a grade quadriculada na sua base para direcionar a irradiação de todas as células. (Fonte: arquivo pessoal.)
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METODOLOGIAS DE BIOLOGIA CELULAR UTILIZADAS PARA ANÁLISE DO EFEITO DA TLBP SOBRE CÉLULAS EM CULTURA O cultivo celular tem sido utilizado para a análise dos efeitos da TLBP sobre células isoladas do sistema in vivo, que é muito mais complexo. Os estudos in vivo demandam grande quantidade de amostras, uma vez que a variabilidade de resposta de indivíduos diferentes, sejam animais ou humanos, é muito grande. Assim, o uso de linhagens celulares que respondem de forma semelhante à necessidade de réplicas nos experimentos diminui significativamente, o que permite que vários parâmetros sejam testados num mesmo estudo. Além disso, a utilização de células obtidas a partir de cultivo primário dos tecidos de interesse do estudo aproxima bastante o sistema in vitro daquele in vivo. De qualquer forma, há que se ter em mente que não se podem interpretar os resultados in vitro como sendo totalmente válidos para o sistema in vivo, mesmo que as células sejam de cultivo primário e tragam em si muitas das induções presentes no tecido de origem. Mas os resultados in vitro servem como pontos de partida para estudos in vivo e, mais ainda, com células isoladas o estudo de processos celulares específicos ficam muito facilitados. Dessa forma, os pesquisadores têm utilizado células em cultura para examinar a resposta à TLBP nos processos de proliferação celular, morte celular, secreção de produtos celulares, tanto de forma funcional como morfológica. As técnicas de biologia celular utilizadas para a análise desses processos têm sido as seguintes: mensuração de número de células e de viabilidade celular, observação de dano ao DNA e da integridade de membrana, além da análise de síntese e secreção de proteínas, morfologia celular e morfologia no nível ultraestrutural.
ESTUDOS DOS EFEITOS DA TLBP NA PROLIFERAÇÃO CELULAR A proliferação celular pode ser acessada mediante a mensuração de número de células e de viabilidade celular. Em geral, nos estudos os autores cultivam as células em frascos de cultivo celular até obterem número de células suficientes para a realização dos experimentos. Nesse momento é definido o número de grupos experimentais, sempre lembrando da importância de se ter grupos-controles, ou ao menos um grupo-controle negativo, como já havíamos discutido anteriormente neste capítulo. As células então são removidas dos frascos de cultura utilizando a ação de uma enzima. Para as células mais usadas nesses estudos, que são as células de tecidos conjuntivos de mamíferos, como fibroblastos, osteoblastos ou outras que crescem aderidas às placas, a tripsina tem sido a enzima mais utilizada. Após a neutralização da tripsina com o uso de soro fetal bovino que contém antiquimotripsina, as células, agora em suspensão, serão contadas, em geral utilizando-se a técnica do hemocitômetro ou da câmara de Neubauer. Esse método é o mesmo utilizado para quantificar células sanguíneas. Pelo uso de uma equação matemática é possível calcular quantas células estão nos frascos para iniciar o experimento1. Utilizando diluições é possível obter quantidades específicas de células que serão semeadas nos poços ou placas de cultivo celular. O mesmo número de células é semeado em cada poço, tanto dos grupos-controle como dos irradiados. Neste plaqueamento, como já se discutiu anteriormente neste capítulo, os poços plaqueados devem ter uma distância entre si, ou devem estar corados com cor escura, ou, ainda, poços vizinhos daqueles que serão irradiados deverão conter líquidos escuros. Isso deve ser feito no sentido de proteger as células dos poços de diferentes grupos experimentais dos efeitos do espalhamento do laser durante a irradiação dos poços vizinhos. Após as irradiações, que podem ser únicas ou múltiplas, com intervalos que devem ser determinados pelo pesquisador antes do experimento, células de poços de todos os grupos experimentais devem ser quantificadas em diferentes períodos para que se possam construir as curvas de crescimento e, portanto, analisar os efeitos da TLBP sobre a proliferação celular. A mensuração do número de células viáveis nos poços pode ser feita de forma direta, pela utilização da técnica da exclusão de células coradas pelo azul de tripan e contadas em câmara de Neubauer, ou indireta, pela análise da atividade mitocondrial das células presentes nos poços, entre outras técnicas de contagem1. A técnica da análise de atividade mitocondrial pode ser feita pelo teste colorimétrico de análise da redução do sal de tetrazólio ou do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-difeniltetrazólio (MTT). Esse ensaio se baseia na metabolização do MTT, que é solúvel em meio aquoso e reduzido na mitocôndria da célula, resultando num cristal de cor azul violácea, insolúvel em meio aquoso. Esses cristais são então solubilizados e a cor presente no poço é mensurada em espectrofotômetro com filtro de comprimento de onda próximo a 570 nm1. Quanto maior a intensidade de cor, maior será a viabilidade celular que poderá ser comparada com aquela do grupo-controle negativo, bem como com as dos demais grupos irradiados, o que determinará qual dos parâmetros testados resultou em maior resposta positiva de proliferação celular. Outros métodos de contagem também têm sido utilizados, como o do vermelho neutro, entre outros. No entanto, nos trabalhos do nosso grupo, o uso do teste do MTT tem sido aplicado com sucesso há muito tempo, já que para quantidades pequenas de células, como o que ocorre nos poços de placas de 96 poços, este teste é o mais confiável. De fato, no início dos nossos estudos utilizávamos a técnica da exclusão de células coradas pelo azul de tripan, mas nesses estudos foram utilizadas placas de 35 mm ou de 60 mm de diâmetro, o que acabava tornando o estudo muito trabalhoso e economicamente desfavorável6-8. Utilizando a contagem de células com a técnica da exclusão de células coradas pelo azul de tripan, nosso grupo mostrou as primeiras evidências de que com baixa concentração de soro fetal bovino era possível observar efeitos da TLBP sobre fibroblastos oriundos de cultivo primário de gengiva. Nesse estudo mostramos que o laser vermelho foi capaz de induzir um crescimento significativamente maior nas células irradiadas quando em comparação com aquelas crescidas em déficit nutricional e não irradiadas3. Mais tarde foram estudados os efeitos de diferentes comprimentos de onda (670 nm, 780 nm, 692 nm e 786 nm), diferentes potências e mesma densidade de energia (2 J/cm2). Nesse estudo ficou claro que a TLBP tem efeitos na proliferação de fibroblastos em cultura e que
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a intensidade desses efeitos é dependente dos diferentes parâmetros utilizados, além de ter sido sugerido que o tempo de irradiação exerce influência importante no efeito da irradiação4. Para melhor entender os efeitos do tempo de irradiação na proliferação de células estressadas por déficit nutricional, Azevedo et al.8 estudaram a proliferação de fibroblastos de gengiva humana (linhagem LMF) submetidos à TLBP com comprimento de onda e densidade de energia fixos (660 nm e 2 J/cm2), variando a potência e, consequentemente, a densidade de potência e o tempo de irradiação8. Os autores demonstraram que os grupos submetidos a menores potência e densidade de potência (10 mW e 142,85 mW/ cm2) responderam mais intensamente, apresentando maior crescimento que as células-controle não irradiadas e aquelas irradiadas com maiores parâmetros (29 mW e 428,57 mW/cm2). Os resultados foram interpretados em função do tempo de irradiação, que, para uma mesma densidade de energia, era maior quando a potência diminuía. Esses resultados demonstraram a importância de outros parâmetros além da densidade de energia, que até então parecia ser mais relevante que os demais. Outro trabalho que demonstrou a importância dos diferentes parâmetros da TLBP foi publicado por Meneguzzo et al.11. Utilizando a TLBP (685 nm, 40 mW, spot size 0,019 cm2) e energias de 0,12 J, 0,24 J ou 0,36 J de forma única ou fracionada em duas ou três irradiações com intervalos de 6 h, os autores demonstraram que a irradiação, quando feita de forma fracionada, resulta em maiores efeitos na proliferação de fibroblastos de polpas dentárias humanas (linhagem FP5). A proliferação de outros tipos celulares estressados, além dos fibroblastos, também foi melhorada após irradiação. Células mais diferenciadas, como epiteliócitos, quando em déficit nutricional, também responderam positivamente à TLBP de forma dependente dos protocolos de irradiação utilizados. Eduardo et al.9 estudaram o efeito de diferentes números de irradiações (1, 2 ou 3) e de diferentes comprimentos de onda, de potência e de densidade de energia (660 nm ou 780 nm, em 40 mW e 70 mW, respectivamente, e 3 J/cm2 ou 5 J/cm2) sobre a proliferação dessas células (linhagem Vero)9. O método utilizado para mensurar o crescimento celular foi a análise da redução do MTT. Os autores demonstraram que o crescimento é aumentado de forma proporcional ao número de irradiações. Demonstraram, além disso, que, especificamente nas condições deste estudo, o comprimento de onda de 780 nm induziu um maior crescimento. Outro achado interessante desse estudo foi o fato de que nenhum dos grupos estressados por déficit nutricional, irradiados ou não irradiados, foi capaz de apresentar crescimento similar àquele do grupo em que as células cresceram nas condições ideais de nutrição. Isso demonstrou que células mais diferenciadas provavelmente necessitam de protocolos mais elaborados para responderem à TPLB da mesma forma que respondem os fibroblastos, que são células menos diferenciadas. A TLBP tem sido aplicada como terapia auxiliar em diversos processos biológicos, em especial na cicatrização de feridas e em processos inflamatórios de várias naturezas. No entanto, nos dias atuais vislumbramos uma aplicação tão ou mais importante para essa terapia. Na verdade, por sabidamente ser capaz de restaurar o potencial metabólico completo de células estressadas ou em condições patológicas, a TLBP poderia ser uma terapia auxiliar de importância na engenharia tecidual. De fato, quando células-tronco saem de um sistema in vitro e são implantadas num sistema in vivo, há que sofrer alguma forma de estresse. Portanto, se a TLBP pudesse ter ação sobre essas células, devolvendo suas capacidades metabólicas ideais, certamente esse processo de implante celular seria melhorado. Pensando nessa possibilidade, Eduardo et al., em um estudo piloto, analisaram o efeito da TLBP sobre células-tronco oriundas de polpas dentárias humanas12. Utilizando um laser emitindo na faixa do vermelho visível e duas potências diferentes (20 mW e 40 mW, por 6 ou 3 segundos, respectivamente), demonstraram que as células-tronco irradiadas com ambas as potências apresentaram crescimento significativamente maior que as células-tronco controle, que também foram estressadas nutricionalmente, porém não irradiadas. Células-tronco irradiadas com a menor potência e o maior tempo de irradiação apresentaram maior proliferação celular quando em comparação com as do grupo irradiado com a maior potência. Isso demonstrou que não só as células-tronco respondem positivamente à TLBP, mas também que esta resposta foi similar àquela dos fibroblastos que crescem mais com o aumento do tempo de irradiação8.
EFEITO DA TLBP NA PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS Outro aspecto de importância que foi estudado pelo nosso grupo de pesquisa, e que também é de interesse de outros pesquisadores da área da TLBP, foi a análise de produção de proteínas. Para esse tipo de análise existem várias técnicas, entre elas a imunoprecipitação, o Western-blot, o teste ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), entre outros. Esses testes se baseiam em reações antígenoanticorpo na busca da proteína específica de interesse, e têm sido mais utilizados nos estudos de análise dos efeitos da TLBP sobre células em cultura porque podem quantificar as proteínas secretadas pelas células e, portanto, há como se comparar a secreção de células irradiadas com as células controle não irradiadas, ou mesmo as células irradiadas com diferentes protocolos de irradiação. Nos estudos utilizando fibroblastos, a proteína de interesse é o colágeno, enquanto de outras células, como, por exemplo, o osteoblasto, poderia ser a osteonectina, entre outras. No decorrer dos nossos estudos sobre os efeitos biológicos da TLBP passamos a nos interessar não somente pela proliferação celular, mas também pela secreção de proteínas. Nesse aspecto, Pereira et al.5 em 2002, publicaram um estudo que demonstrou que parâmetros efetivos para aumentar a proliferação de fibroblastos de pele de ratos recémnascidos (linhagem NIH-3T3) não exerciam efeitos na produção de pró-colágeno. Os autores utilizaram a técnica da imunoprecipitação com a utilização de anticorpos anticolágeno tipo 1, que era aplicado sobre o extrato das células irradiadas com laser emitindo, no infravermelho próximo (904 nm), potência de 120 mW e densidade de energia de 3 J/cm2. Nesses parâmetros as células cresceram de forma significativamente maior que as do controle negativo, crescidas em déficit nutricional e não irradiadas. Porém não causou alteração na produção de colágeno. Existem controvérsias sobre os efeitos da TLBP sobre o metabolismo do colágeno5. Outros estudos in vivo18-19 e in vitro20-21 sugeriram que essa terapia aumenta a síntese do colágeno. Por outro lado, outros autores relataram resultados similares aos nossos, em que não houve aumento quando havia aumento na proliferação como resultado da TLBP22. De
Capítulo 4 – Laser de Baixa Potência sobre Culturas Celulares de Interesse Odontológico
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qualquer forma, os resultados de Pereira et al. foram de importância para demonstrar que o protocolo da TLBP deve ser determinado para cada aplicação clínica, uma vez que um protocolo que favorece a proliferação celular e, portanto, indicado para melhorar, por exemplo, o pós-operatório de cirurgias em que houve perda tecidual, pode não ser indicado para outras situações clínicas nas quais a indução de produção de proteína é esperada, como, por exemplo, na regeneração de tecidos5. Esse estudo também demonstrou um aspecto de extrema relevância no que diz respeito a protocolos da TLBP. Foi demonstrado que com uma pequena alteração na densidade de energia aplicada o efeito de melhoria da proliferação celular foi perdido. De fato, quando foram aplicados 3 J/cm2 ou 4 J/cm2, houve aumento significativo na proliferação celular. No entanto, quando foi aplicada a densidade de energia de 5 J/cm2, nas condições desse estudo, esse efeito não foi observado, já que o número de células viáveis desse grupo irradiado foi similar àquele das células do grupo controle negativo não irradiado5. Em outro de nossos estudos também foi observado que parâmetros capazes de incrementar a proliferação celular foram inábeis no sentido de alterar a produção de proteínas. Fujihara et al. demonstraram que a irradiação de osteoblastos de calvária de ratos recémnascidos em cultura (linhagem Osteo-123) com o laser emitindo no comprimento de onda de 780 nm, 10 mW e 3 J/cm2 foi capaz de aumentar o crescimento de osteoblastos estressados pela presença de dexametasona no meio de cultivo. No entanto esse mesmo protocolo de irradiação não modificou a síntese de osteonectina, analisada pela técnica do Western-blot. Utilizando outra técnica de biologia celular, o teste ELISA, nosso grupo estudou a produção de outros tipos de proteínas, como citocinas da inflamação13 e fatores de crescimento14. Protocolos de pesquisa utilizando cultivo celular podem e devem mimetizar o melhor possível as condições in vivo relacionadas com as questões da pesquisa. Assim, Sousa et al. se interessaram em estudar in vitro, os possíveis efeitos da TLBP no pós-operatório de tratamentos endodônticos de polpas mortificadas e obturados com diferentes tipos de cimentos13. Para mimetizar in vitro essa situação clínica, os autores trabalharam com macrófagos inflamatórios obtidos de líquido de ascite de camundongos. Essas células foram induzidas por produtos bacterianos (lipopolissacarídeo [LPS] e interferon delta [IFN-δ]) e, a seguir, entraram em contato com meios condicionados por cimentos endodônticos. Estes macrófagos, que agora se assemelhavam àqueles no ápice de um dente com polpa mortificada, isto é, que entraram em contato com produtos bacterianos e com substâncias liberadas por cimentos endodônticos, foram então irradiados ou não e a sua produção de citocinas (fator de necrose tumoral alfa [TNF-α] e metaloproteinase de matriz [MMP-1]) foi analisada pelo teste ELISA. As irradiações foram feitas com laser em 780 nm, e o que se verificou foi uma diminuição importante dos níveis de TNF-α em todos os grupos experimentais irradiados independentemente do tipo de cimento endodôntico utilizado. Isso poderia explicar resultados de diminuição de dor pós-operatória de cimentação endodôntica, quando o ápice do dente obturado é irradiado com laser no infravermelho24. Em outro estudo do efeito da TLBP sobre secreção de proteínas, Damante et al. demonstraram que irradiação de fibroblastos gengivais humanos (linhagem FGH) com laser vermelho é capaz de incrementar significativamente a produção de fator de crescimento de fibroblastos (bFGF)14. Esse resultado indica que uma das formas de a TLBP incrementar o crescimento de fibroblastos estressados pode ser pelo aumento da produção deste fator de crescimento que, de forma autócrina, agiria sobre as células nos poços irradiados, levando a maior proliferação destes grupos irradiados.
EFEITOS DA TLBP NA MORFOLOGIA DAS ORGANELAS CELULARES Alguns autores realizaram estudos morfológicos ultraestruturais para a observação das organelas celulares após a irradiação das mesmas6,25. Os estudos enfocaram, em especial, a morfologia das mitocôndrias, uma vez que estas são uma das organelas-alvo mais discutidas da TLBP. Alterações na morfologia das mitocôndrias foram reportadas por Bakeeva et al., que observaram em microscopia eletrônica de transmissão o aparecimento de megamitocôndrias quando linfócitos foram irradiados com laser de He-Ne (56 J/m2, 5,6 W/m2)25. De acordo com estes autores, a formação destas megamitocôndrias era baseada na fusão de mitocôndrias menores e refletia o aumento dos níveis de trocas energéticas. Na nossa experiência, megamitocôndrias não foram observadas quando fibroblastos de mucosa bucal humana (linhagem FMM1) foram irradiados com laser de diodo (904 nm, 120 mW, 3 J/cm2)6. Neste estudo, no entanto, alterações na morfologia das mitocôndrias compatíveis com edema intramitocondrial foram observadas. Algumas células apresentaram morfologia em vários estágios de apoptose. Assim, os autores sugeriram que a TLBP pode não só induzir proliferação celular, mas também, em um número menor da população irradiada, esta terapia pode induzir apoptose celular, assunto que deverá ser mais bem investigado no futuro.
EFEITO PROTETOR DA TLBP SOBRE CÉLULAS PULPARES Mais recentemente, nosso grupo de pesquisa pôde observar in vitro, utilizando fibroblastos de polpas dentárias humanas (linhagem FP5), que a TLBP exerce efeito protetor sobre estas células contra a ação de substâncias citotóxicas liberadas por agentes clareadores dentais15. De fato, células que entraram em contato com meio condicionado com gel clareador dental contendo 35% de peróxido de hidrogênio e foram irradiadas com laser emitindo em 780 nm e na densidade de energia 10 J/cm2 apresentaram viabilidade celular similar àquela das células que não foram irradiadas e foram cultivadas nas condições ideais de nutrição. Os autores sugeriram que provavelmente o melhor pós-operatório observado em pacientes que recebem TLBP imediatamente após a realização dos procedimentos de clareamento dental poderia ser em função da manutenção da viabilidade das células pulpares, o que acarretaria menor grau de inflamação desse tecido.
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Laser de Baixa Potência – Princípios Básicos e Aplicações Clínicas na Odontologia
CONSIDERAÇÕES FINAIS A ação do laser sobre culturas celulares de interesse odontológico tem sido estudada por diversos grupos de pesquisadores no Brasil e no mundo com o objetivo de melhor entender os efeitos dessa terapia nos níveis celular e subcelular. De fato, utilizando-se as técnicas de cultivo celular, consegue-se isolar determinados processos biológicos, como proliferação, morte celular e síntese proteica, entre outros, que podem ser mais bem avaliados no sistema in vitro. Muito se descobriu utilizando a cultura celular, mas muito mais está por ser descoberto. Na atualidade, os pesquisadores estão voltados para os estudos dos efeitos da TLBP sobre células-tronco. Especificamente na odontologia, as células-alvo são as células-tronco adultas derivadas de polpas dentárias humanas no sentido de se estudar não só seu efeito na melhoria das condições dessas células, mas também buscar efeitos na diferenciação destas células em outros tipos celulares. Nesse sentido, nosso grupo de pesquisa já está com projetos em andamento na busca dos efeitos da TLBP também sobre células-tronco de polpas dentárias humanas. Nossos resultados preliminares têm demonstrado que a TLBP pode exercer efeitos na diferenciação dessas células, bem como na proliferação das mesmas26.
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