Arribas (2)trat

Mes enllà del genoma.

Aplicacions en el diagnòstic i el tractament del càncer

Joaquín Arribas Laboratori de Recerca Oncologica Institut de Recerca de l’Hospital Universitari Vall d’Hebron

Cáncer • Si continúa la tendencia actual, aproximadamente una de cada cinco personas morirá de cáncer en países desarrollados.

• La enfermedades cardiovasculares en países desarrollados y las infecciosas en países sin desarrollar causan más muertes que el cáncer.

• ¿Por que se está realizando un esfuerzo tan formidable para conocer las bases moleculares del cáncer?

Fig. 1 Alteraciones de la fisiología de las células tumorales (Hanahan, D., and Weinberg, R. A. (2000). The Hallmarks of Cancer. Cell 100, 57–70)

El genóma y el diagnóstico y tratamiento del cancer Abordaje tradicional: • Análisis de mutaciones en un numero limitado de genes • Análisis de la expresión de un número muy limitado de genes en muestras de pacientes o modelos animales.

– Northern blot (niveles de mRNA) – Western blot (niveles de proteína) – Immunhistoquímica (proteína en muestras intactas de tejido

• Creación de modelos animales sencillos

Fig. 1 Alteraciones de la fisiología de las células tumorales (Hanahan, D., and Weinberg, R. A. (2000). The Hallmarks of Cancer. Cell 100, 57–70)

El genóma y el diagnóstico y tratamiento del cancer La nuevas técnolgias en el diagnóstico y tratamiento del cáncer

• Automatizacion de la secuenciacion: Secuencia completa del genoma.

• Microdisección laser.

• Determinacion del transcriptoma: SAGE, Microarrays.

• Determinacion del proteoma: Proteomica.

El genóma y el diagnóstico y tratamiento del cancer La nuevas técnolgias en el diagnóstico y tratamiento del cáncer

• Automatizacion de la secuenciacion: Secuencia completa del genoma.

• Microdisección laser.

• Determinacion del transcriptoma: SAGE, Microarrays.

• Determinacion del proteoma: Proteomica.

El genóma y el diagnóstico y tratamiento del cancer La nuevas técnolgias en el diagnóstico y tratamiento del cáncer

• Automatizacion de la secuenciacion: Secuencia completa del genoma.

• Microdisección laser.

• Determinacion del transcriptoma: SAGE, Microarrays.

• Determinacion del proteoma: Proteomica.

Microdisecciรณn laser

Microdisecciรณn laser

Microdisecciรณn laser

El genóma y el diagnóstico y tratamiento del cancer La nuevas técnolgias en el diagnóstico y tratamiento del cáncer

• Automatizacion de la secuenciacion: Secuencia completa del genoma.

• Microdisección laser.

• Determinacion del transcriptoma: SAGE, Microarrays.

• Determinacion del proteoma: Proteomica.

El genóma y el diagnóstico y tratamiento del cancer La nuevas técnolgias en el diagnóstico y tratamiento del cáncer

• Automatizacion de la secuenciacion: Secuencia completa del genoma.

• Microdisección laser.

• Determinacion del transcriptoma: SAGE, Microarrays.

• Determinacion del proteoma: Proteomica.

Basic steps in the SAGE protocol Select cells for profiling

Isolate mRNA using magnetic beads and synthesize cDNA.

Cut transcript with anchoring enzyme (NlaIII).

Release 14 bp tags from the 3' end, adjacent to the last restriction site with tagging enzyme BsmF1.

Pair and ligate tags to form ditags, and concatenate ditags into plasmids for automtic sequencing.

Extract and count tags to calculate expression level of each transcript.

El genóma y el diagnóstico y tratamiento del cancer La nuevas técnolgias en el diagnóstico y tratamiento del cáncer

• Automatizacion de la secuenciacion: Secuencia completa del genoma.

• Microdisección laser.

• Determinacion del transcriptoma: SAGE, Microarrays.

• Determinacion del proteoma: Proteomica.

Metástasis • Es la principal causa de muerte en pacientes con cáncer • Bases moleculares: – Hipótesis tradicional.

• Muy poca células (10-7) en un tumor tienen capacidad metastática • La capacidad metastática se adquiere mediante mutaciones somáticas.

– Analisis mediante microarrays

A molecular signature of metastasis in primary solid tumors Ramaswany, S., Ross, K. N. and Golub, T. R. Nature Genetics 33, 49-54 (2003)

Translation apparatus

Separase Inhibitor

Non-epithelial Origin

Fig. 1 Alteraciones de la fisiología de las células tumorales (Hanahan, D., and Weinberg, R. A. (2000). The Hallmarks of Cancer. Cell 100, 57–70)

A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., CordĂłn-Cardo, C., Guise, T. A. and MassaguĂŠ, J. Cancer Cell 3, 537-549 (2003)

Therapeutic Strategies: The EGFR signaling network Matar, P., Arribas, J, Baselga, J

Cetuximab

R

R

TK

TK

EGFR Gefitinib Grb2 Sos

PI3-k

PTEN Ras

Akt

Raf

mTOR FKHR

GSK-3

Bad MEK1/2

p27

MAPK

Cyclin D1,E

Cell cycle progression

survival

proliferation

A431 Xenografts

Tumor Volume (mm3) 3000 2500 2000

Treatment

1500 1000 500 0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Days CONTROL Gefitinib (200mg/Kg/day) Cetuximab (1.5mg/mouse/twice per week )

Gefitinib (50mg/Kg/day) + Cetuximab (1mg/mouse/twice per week )

UNSUPERVISED TWO-DIMENSIONAL CLUSTER ANALYSIS Gefitinib + Cetuximab Gefitinib or Cetuximab

9,726 clones (6,386 genes)

6,584 clones with good spot quality Merge replicates

5.126 clones

Normalized expression (Log2 scale)

724 genes Differentially expressed

Angiogenesis (0.7%) Basic cellular function (10.1%) Cell adhesion (1.1%) Cell cycle (5.4%) Cell death (2.6%) Cell growth/prolif (5.1%) Cytosk (4.1%) EMT related (2.4%) Immune response (1.8%) Metabolism (3.9%) Miscellaneous (37.6%) Oncogene (2.1%) Secreted proteins (0.7%) Proteolisis (3%) Signal transduction (6.8%) Transcription related (7.6%) Transport (3.6%) Tumor progression (1%) Tumor supressor (0.4%)

El genóma y el diagnóstico y tratamiento del cancer La nuevas técnolgias en el diagnóstico y tratamiento del cáncer

• Automatizacion de la secuenciacion: Secuencia completa del genoma.

• Microdisección laser.

• Determinacion del transcriptoma: SAGE, Microarrays.

• Determinacion del proteoma: Proteomica.

2D-Electrophoresis

Matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) Time of fligth (TOF)