Cuaderno de biología molecular

Cuaderno de prácticas de biología molecular y citogenética

Yaiza Ortiz Esteban 2º de Laboratorio Clínico y Biomédico Biología molecular y citogenética 2º evaluación

Índice Introducción .............................................................................................................................................................4 Mapa conceptual ......................................................................................................................................................5 Micropipetas.............................................................................................................................................................6 Manual de uso ......................................................................................................................................................6 Recomendaciones generales al pipetear..............................................................................................................7 Calibración de las micropipetas............................................................................................................................9 Conclusiones de la calibración............................................................................................................................10 Mantenimiento de las micropipetas ..................................................................................................................11 Inspección .......................................................................................................................................................11 Limpieza y descontaminación.........................................................................................................................11 Mantenimiento ...............................................................................................................................................11 Prácticas de laboratorio..........................................................................................................................................13 Práctica 1: extracción de ADN de sangre............................................................................................................13 Introducción al estudio de ADN......................................................................................................................13 Fundamento ...................................................................................................................................................13 Material ..........................................................................................................................................................13 Reactivos.........................................................................................................................................................13 Preparación de reactivos ................................................................................................................................13 Procedimiento ................................................................................................................................................19 Resultado e interpretación .............................................................................................................................20 Preguntas ........................................................................................................................................................21 Práctica 2: reacción en cadena de la polimerasa ...............................................................................................22 Introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .....................................................................22 Material ..........................................................................................................................................................24 Reactivos.........................................................................................................................................................24 Aparataje ........................................................................................................................................................24 Protocolo de la PCR ........................................................................................................................................24 Preguntas ........................................................................................................................................................26 Práctica 3: electroforesis en agarosa..................................................................................................................27 Fundamento ...................................................................................................................................................27 Material ..........................................................................................................................................................27 2

Preparación de reactivos ................................................................................................................................28 Preparación de las muestras ..........................................................................................................................30 Protocolo de la electroforesis.........................................................................................................................30 Visualización de resultados ............................................................................................................................32 Resultados e interpretación ...........................................................................................................................32 Preguntas ........................................................................................................................................................33 Reflexión final .........................................................................................................................................................34 Bibliografía ..............................................................................................................................................................34

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Introducción En este trimestre se nos ha propuesto realizar un portafolios en el que recojamos todas las tareas realizadas.

Hemos realizado tres tareas principales: 1. Un mapa conceptual de las principales técnicas de biología molecular 2. Un trabajo de las micropipetas donde se recoja la información teórica y práctica de la calibración.

3. Tres prácticas en el laboratorio y su memoria correspondiente.

Para ello primero realizamos un cronograma donde repartimos las actividades a hacer en diferentes días

Figura: cronograma

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Mapa conceptual Una de las tareas de este trimestre ha sido la realización de un mapa conceptual de las principales técnicas de biología molecular: PCR, secuenciación, clonación, hibridación. De cada técnica se nos pidió incluir el fundamento, las principales técnicas y por último las aplicaciones generales de estas cuatro técnicas.

Link del mapa conceptual de las técnicas de biología molecular: http://prezi.com/sai0a5bldrbv/?utm_campaign=share&utm_medium=copy Este mapa conceptual lo expusimos a la profesora y a nuestros compañeros. En el siguiente link se accede al vídeo de dicha exposición. https://www.youtube.com/watch?v=2CvK3bbjODg&feature=youtu.be

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Micropipetas Las micropipetas son instrumentos muy necesarios en un laboratorio de biología molecular. Se utilizan para transferir volúmenes pequeños de líquidos que normalmente varían entre 0,5 y 1000 µL. Es imprescindible que las micropipetas sean muy precisas ya que al trabajar con volúmenes tan pequeños cualquier imprecisión puede conllevar cambios importantes en las reacciones llevadas a cabo. Para asegurar esta precisión es necesario realizar la calibración de las micropipetas de forma periódica. El proceso de calibración ayuda a determinar si el equipo hace las lecturas correctas, para que pueda rectificarse a tiempo, y que se pueda mantener la eficiencia de los procesos de análisis del laboratorio.

Manual de uso El procedimiento para la utilización de una micropipeta comprende los siguientes pasos: 1. En caso de ser una micropipeta de volumen variable, ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado.

2. Colocar una punta de plástico (adecuada a la micropipeta utilizada) en la punta de la pipeta haciendo una leve presión para lograr un buen ajuste.

Figura: puntas de micropipeta de diferentes volúmenes 3. Oprimir el botón pulsador con el dedo pulgar hasta el primer tope y, sin soltarlo, introducir verticalmente la pipeta en el recipiente hasta que la punta se sumerja en el líquido.

4. Liberar lentamente la presión ejercida sobre el botón para absorber el líquido.

5. Retirar, siempre verticalmente, la pipeta del líquido deslizando la punta contra la pared del recipiente.

6. Para verter el líquido, apoyar la punta contra la pared del recipiente donde se quiere depositar.

7. Para liberar el líquido de la punta presionar el botón pulsador hasta el segundo tope.

8. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente.

9. Descartar la punta utilizando el eyector de la micropipeta.

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Figura: procedimiento de pipeteo con una micropipeta En este vídeo se muestra la correcta utilización de una micropipeta: https://youtu.be/NpdPfKTc2gM Recomendaciones generales al pipetear 

Ángulo de inmersión vertical. Se ha de procurar mantener el ángulo de inmersión de la pipeta lo más cercano a la vertical posible. De otra forma, la columna vertical de líquido será más pequeña y se aspirará demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el líquido, la punta se ha de mantener en un ligero ángulo frente a la pared del vaso para asegurar un correcto vaciado.

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Figura: ángulo correcto e incorrecto en el pipeteo 

Profundidad de inmersión de la punta. Es especialmente importante en el uso de volúmenes pequeños. Si la punta se sumerge demasiado se aspirará más líquido debido al aumento de presión.

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Por el contrario, si la punta no se sumerge lo suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y volumen inadecuado.

Figura: profundidad de inmersión óptima de las micropipetas 

Uniformidad al pipetear. Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y técnica adecuada al mover el émbolo. Una aspiración demasiado rápida e incontrolada puede llevar a la formación de aerosoles, salpicaduras y posible contaminación del eje y del pistón, pudiéndose producir incluso pérdida de volumen de la muestra.



Técnica de dispensación. Para la mayoría de aplicaciones se recomienda dispensar con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente. Así se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra en el interior de la punta después de acabar la dispensación. Hay que retirar la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba por la pared lateral para liberar cualquier gotícula restante en el orificio de la punta. Otra técnica consiste en dosificar directamente en la superficie del líquido. Es crucial usar una punta de pared fina para que no quede ninguna gotícula en el interior de la punta. Si se dispensa directamente dentro del líquido habrá que sacar la pipeta manteniéndola en el segundo tope para evitar una toma de muestra después de la dispensación.

Figura: técnicas de dispensación 8



Trabajar sin cambios bruscos de temperatura. Hay que procurar pipetear a una temperatura constante. La temperatura óptima sería de 21,5°C ± 1°C. Debemos evitar repentinos o grandes cambios de temperatura ya que el aire del interior de la pipeta no se puede adaptar rápidamente y esto puede afectar al volumen. Es por este motivo que cuando pipeteamos durante un largo rato nuestra mano puede calentar el aire del interior de la pipeta, expandiéndose y pudiendo reducir la precisión hasta en un 1%. Es por esta razón que se recomienda no sostener continuamente la pipeta en las manos y entre ciclos dejarla en su soporte o en la mesa.

Calibración de las micropipetas Por calibración de pipetas se entiende la comparación entre el volumen real y el volumen teórico, siendo el volumen teórico el marcado por la propia micropipeta (ej: 0,10 mL) y el volumen real el aspirado por la pipeta (ej: 0,09 mL).

Para calibrar una pipeta necesitaremos agua destilada o desionizada y una balanza adecuada.

Para llevar a cabo la calibración deben cumplirse las siguientes condiciones: 1. Condiciones ambientales: sala sin corrientes y temperatura comprendida entre 20°C y 25°C sin variar más de 0,5°C durante el ensayo. Humedad relativa mayor al 50%. Presión atmosférica de 1 atm.

2. Utilizar una balanza adecuada.

Para realizar la calibración de las micropipetas se ha diseñado una plantilla de excell con varias páginas, una para cada micropipeta.

En las tablas podemos encontrar los miligramos (mg) correspondientes a los volúmenes de las micropipetas indicados en microlitros (µl). Como sabemos que la densidad del agua es 1 g/ml, realizando la equivalencia sacamos que 1 µl corresponde 1 mg.

En caso de tratarse de micropipetas de volumen variable, la calibración se obtiene pesando el rango de medida de cada micropipeta (en µl) con tres medidas diferentes, siendo esas medidas la menor, la intermedia y la mayor. Por ejemplo, si una micropipeta tiene una capacidad de entre 100 y 1000 µl, las mediciones que tendríamos que realizar serian: 100 µl, que corresponde a la menor medida; 500 µl que sería la medida intermedia; y, por último, 1000 µl que se trataría de la medida mayor.

Cada una de ellas se realiza 10 veces, es decir, en total para cada micropipeta habría que hacer 30 pesadas.

Todo ello con el fin de averiguar la inexactitud e imprecisión de cada micropipeta.

En el siguiente vídeo se muestra el procedimiento de calibración de las micropipetas que realizamos nosotros. https://www.youtube.com/watch?v=EHY65L_IRGw Se adjunta un documento excell con 11 hojas que corresponden a la calibración de las 11 micropipetas de volumen variable que hemos calibrado. https://drive.google.com/file/d/0B5b9bGT1jH0XNWRSa2d0V3pjVFU/view?usp=sharing

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Conclusiones de la calibración Al realizar la calibración de 11 micropipetas de diferentes volúmenes casi todas son imprecisas e inexactas, es decir casi todas tenían unos valores de inexactitud e imprecisión.

Al realizar la verificación de las micropipetas con un volumen variable de 0.5 a 10 µl nos encontramos con un problema. Al tratarse de un volumen tan pequeño, la balanza no detecta tan poco peso, por lo que entre las pesadas muchas veces no había diferencia y salía el mismo valor que el anterior.

En la siguiente tabla, se resume la conformidad de las micropipetas en base a su conformidad y su precisión, calculadas previamente en el documento excell. Para ello, hemos establecido un margen de error del 20%, de modo que, si había más de un 20% de imprecisión y de inexactitud, las hemos considerado imprecisas e inexactas respectivamente. Finalmente, si una micropipeta es imprecisa o inexacta, está no será conforme.

Micropipeta

Precisión

Exactitud

Conformidad

1LV_100-1000

No

No

No

2LV_10-100

No

Sí

No

3LV_100-1000

No

Sí

No

4LV_100-1000

No

Sí

No

5LV_0,5-10

No

No

No

6RV_0,5-10

No

Sí

No

7RV_100-1000

Sí

No

No

8RV_10-100

No

No

No

9RV_10-100

No

No

No

10RV_0,5-10

No

Sí

No

11DMV_10-100

No

Sí

No

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Mantenimiento de las micropipetas Inspección Frecuencia: diaria Las micropipetas requieren inspecciones frecuentes para detectar desgastes o daños y/o verificar que las mismas se encuentran en buenas condiciones de funcionamiento.

La inspección debe cubrir los siguientes aspectos: 1. Verificar la integridad y ajuste de los mecanismos. Los mismos deben poder moverse de forma suave. El pistón debe desplazarse suavemente.

2. Confirmar que el portapuntas no presente marcas del desgaste, dado que es esencial para la exactitud de las medidas.

3. Colocar una punta y llenarla con agua destilada. La pipeta no debe presentar ningún tipo de fuga.

Limpieza y descontaminación 1. Verificar cada día que la pipeta se encuentre limpia, en sus superficies interiores y exteriores. Si se detecta suciedad, la misma debe limpiarse utilizando un solvente adecuado o una solución jabonosa.

Revisar las recomendaciones del fabricante relativas a la compatibilidad que tienen los materiales con que está fabricada la pipeta para seleccionar aquellos reactivos que no produzcan efectos dañinos a la integridad de los componentes.

2. Esterilizar la pipeta siguiendo las indicaciones de los fabricantes. Algunas pipetas se pueden esterilizar en un autoclave, utilizando un ciclo de 121 °C y un tiempo estimado de 20 minutos; algunas requieren ser desensambladas para que el vapor esté en contacto con sus componentes internos.

El desensamble consiste en liberar o desenroscar el cuerpo central de la pipeta, siguiendo los procedimientos indicados por los fabricantes. Para desensamblar o ensamblar algunas pipetas, se requiere utilizar un conjunto de herramientas –llaves– que normalmente proporcionan los fabricantes, junto con la pipeta en el momento de la venta. La pipeta solo debe ensamblarse de nuevo, cuando el ciclo de esterilización haya terminado y la temperatura se haya estabilizado con la del ambiente. En ese momento se verifica que los componentes se encuentren secos y se procede al ensamble. Algunos fabricantes recomiendan esterilizar la pipeta, utilizando una solución de isopropanol al 60 % y, a continuación, lavar los componentes con agua destilada, secar y ensamblar.

3. Si una pipeta ha sido utilizada con sustancias peligrosas para la salud, es responsabilidad del usuario asegurar que está completamente descontaminada antes de que la misma sea utilizada en otros procedimientos o sea retirada del laboratorio.

Mantenimiento Frecuencia: semestral Una pipeta que se utiliza diariamente debe ser sometida a los siguientes procedimientos para garantizar su correcto funcionamiento: 1. Desensamblar la pipeta. Seguir el procedimiento que describe el fabricante en el manual de uso y mantenimiento de la pipeta (el procedimiento varía dependiendo de la marca, tipo y modelo).

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2. Limpiar los anillos en O, el émbolo y las paredes interiores del cilindro antes de lubricar. Si los componentes interiores fueron contaminados accidentalmente, todas las superficies deberán ser limpiadas con un detergente y luego con agua destilada. Si los anillos en O requieren ser cambiados, deberán ser sustituidos por repuestos de las mismas características de los originales. Debe tenerse en cuenta que este tipo de sellos varía dependiendo de la marca, tipo y modelo.

3. Lubricar el émbolo y el pistón con grasa siliconada especial para pipetas. La grasa mencionada ha sido especialmente desarrollada para ser utilizada en las pipetas. Utilizar siempre la recomendada por el fabricante. Retirar cualquier exceso de lubricante con un papel absorbente.

4. Ensamblar siguiendo un proceso inverso al utilizado para desensamblar.

En el siguiente vídeo se muestra un ejemplo de cómo realizar la limpieza y el mantenimiento de las micropipetas: https://www.youtube.com/watch?v=vqmry_tZ-oQ

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Prácticas de laboratorio Práctica 1: extracción de ADN de sangre Introducción al estudio de ADN El ácido desoxirribonucleico (ADN) está en todas las células con núcleo de nuestro organismo. Es una molécula formada por dos cadenas de nucleótidos (G, C, T, A) que contienen la información necesaria para el funcionamiento de las células y la formación de los distintos tejidos Fundamento Existen métodos muy diferentes para aislar ADN a partir de células humanas. Algunos son muy sencillos y normalmente se usan para recuperar ADN de restos biológicos mínimos, como manchas de sangre o muestras de criminalística. Otros son más elaborados y permiten la obtención de cantidades grandes de ácido nucleico, con un alto grado de pureza, a partir de tejidos abundantes de células, cultivos celulares, etc.

Todos los protocolos de extracción de ADN incorporan los mismos pasos básicos: 1. Lisis celular y posterior lisis nuclear.

2. Separación del ADN del contenido celular: protección frente a nucleasas.

3. Purificación del ADN. Material ● ● ● ●

2 microtubos 1 Tubo de fondo cónico 15 ml 1 Varilla para capturar la madeja de ADN 2 Pipetas pasteur de 3 ml

Reactivos ● ● ● ● ● ● ● ●

Muestra de sangre Tampón de lisis (Tris-HCl 10mM, MgCl2 5mM, Sacarosa 0.32 M, Triton-X100 1%) NaCl 0.9% SDS 20% Proteinasa K 20mg/ml NaCl saturada (6M) Etanol absoluto Etanol 70%

Preparación de reactivos Para realizar la extracción de ADN hay que preparar 5 reactivos: 1. Tampón de lisis 2. NaCl 0.9% 3. NaCl saturado 13

4. SDS 5. Etanol %70 a. Tampón de Lisis, preparación de 500 ml Reactivos tampón de lisis ● ● ● ● ●

0.605g de Tris-HCl 10 mM 0.51g de MgCl2 5 mM 54.77g de sacarosa 0.32 M 5 ml de Triton-X100 1% Agua para uso de biología molecular

Figura: Tris-HCl, MgCl2, sacarosa y triton-X100

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Figura: agua para uso de biología molecular Material tampón de lisis ● ●

Matraz erlenmeyer Pipeta de 5ml

Aparataje tampón de lisis ● ●

Balanza pH-metro.

Procedimiento para la realización del tampón de lisis: 1.

2.

3.

4.

5.

Pesar o medir cada uno de los reactivos indicados y echarlos en un matraz erlenmeyer.

Añadir agua para uso de biología molecular hasta 400 ml.

Disolver agitando el matraz erlenmeyer.

Ajustar el pH a 7.5 con HCl Añadir agua para uso de biología molecular hasta 500 ml.

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Figura: tampón de lisis b. NaCl 0,9%, preparación de 100 ml Reactivos para la preparación del NaCl 0.9% ● ●

0.9g de NaCl Hasta 100 ml de agua para biología molecular

Material para la preparación del NaCl 0.9% ● ●

Matraz erlenmyer Vidrio de reloj 16

Aparataje para la preparación del NaCl 0.9% ●

Balanza.

Procedimiento para la preparación del NaCl 0.9% 1. Pesar 0.9 g de NaCl. 2. Añadir agua para uso de biología molecular hasta 100 ml.

3. Disolver la disolución agitando el matraz erlenmeyer. c. NaCl saturado, preparación de 10 ml Reactivos para la preparación del NaCl saturado ● ●

3.5 g de NaCl Hasta 100 ml de agua para biología molecular

Material para la preparación del NaCl 0.9% ● ●

Tubo de ensayo.

Vidrio de reloj

Aparataje para la preparación del NaCl saturado ●

Balanza.

Procedimiento para la preparación del NaCl saturado 1. Pesar 3.5g de NaCl. 2. Añadir agua para uso de biología molecular hasta 10ml.

3. Disolver la disolución agitando el tubo.

Figura: NaCl saturado 17

d. SDS, preparación de 10 ml.

Reactivos para la preparación de SDS ● ●

2 g de SDS Hasta 8 ml de agua para biología molecular

Material para la preparación de SDS ● ●

Matraz erlenmeyer Vidrio de reloj

Aparataje para la preparación de SDS ●

Balanza.

Procedimiento para la preparación de SDS 1.

2.

3.

4.

Pesar 8 g de NaCl. Añadir agua para uso de biología molecular hasta 8 ml.

Disolver la disolución en el agitador magnético con aplicación de calor suave.

Una vez disuelto, echar hasta 10 ml.

e. Etanol 70%, preparación de 15ml.

Reactivos para la preparación de etanol 70% ● ●

10,5 ml Etanol absoluto.

5ml de agua para biología molecular

Material para la preparación de etanol 70% ●

Probeta

Procedimiento para la preparación de etanol 70% 1. Medir 10,5 ml de etanol absoluto.

2. Añadir agua para uso de biología molecular hasta 15 ml.

3. Mezclar la disolución.

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Figura: etanol 70% Procedimiento 1.

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3.

4.

5.

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7.

8.

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10.

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13.

14.

15.

Echar 2 ml de sangre en un tubo cĂłnico graduado.

AĂąadir 10 ml de tampĂłn de lisis y mezclar por inversiĂłn.

Dejar en la nevera durante 30 minutos.

Echar 6 ml en un tubo adaptado a la centrĂ­fuga.

Centrifugar 15 minutos a 2500 rpm.

Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.

AĂąadir al precipitado 4 ml del NaCl 0.9% y disolver el precipitado Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm.

Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.

AĂąadir al precipitado 500 đ?œ‡L de tampĂłn de lisis, 25 đ?œ‡L de SDS 20% y 2,5 đ?œ‡L de Proteinasa K. Agitar con el vĂłrtex si es necesario.

Incubar a temperatura ambiente toda la noche AĂąadir 160 đ?œ‡L de NaCl saturado. Agitar con el vĂłrtex si es necesario.

AĂąadir dos volĂşmenes de etanol absoluto frĂ­o. Mezclar por inversiĂłn muy lentamente observando la formaciĂłn del ovillo de ADN precipitado Capturar la madeja de ADN con una varilla *Un volumen es una medida relativa, de manera que el volumen de lĂ­quido contenido en el tubo constituye un volumen, siendo dos volĂşmenes el doble de lo que haya en el tubo (Ej.: si en el tubo hay 1 ml de lĂ­quido, aĂąadir dos volĂşmenes implicarĂ­a aĂąadir 2 ml, para sumar un total de 3 ml) Lavar la madeja en un microtubo con 1 ml de etanol.

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16. Dejar secar el ADN en la varilla durante 30 minutos apoyando la varilla sobre una gradilla. Pasar la varilla a un microtubo vacĂ­o 17. Resuspender el ADN en 300 đ?œ‡L de agua destilada estĂŠril (agua para biologĂ­a molecular). Con este procedimiento se obtiene una concentraciĂłn de ADN promedio de 100-200 ng/đ?œ‡L

Figura: resultado correspondiente al paso 8 antes de eliminar el sobrenadante (paso 9) Resultado e interpretaciĂłn Tras realizar el paso 13 no se nos formĂł la madeja de ADN. Creemos que las posibles causas de que no obtuviĂŠramos el resultado esperado son: 1. ContaminaciĂłn por DNAasas, ya que nuestro laboratorio no podemos disponer de una tĂŠcnica asĂŠptica.

2. Poco ADN por a. La división de la muestra en dos tubos→ disminuye la concentración de ADN b. Lisis parcial c. Incorrecta sedimentación d. Mås número de lavados → pÊrdida de precipitado

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Preguntas 1. Enumera y ordena en funciĂłn de la cantidad de cĂŠlulas presentes, los distintos tipos de muestras humanas a partir de las cuales se puede hacer una extracciĂłn de ADN. 1. Semen 2. Sangre 3. Tejidos 4. Pelo 5. Saliva 6. Orina 2. ÂżQuĂŠ cantidad de ADN comparten una cĂŠlula epitelial, un hepatocito y una neurona?

La misma, todas las cĂŠlulas del cuerpo contienen la misma cantidad del ADN, excepto el glĂłbulo rojo que no contiene ADN. 3. ÂżA partir de quĂŠ cĂŠlulas sanguĂ­neas se puede aislar ADN? Leucocitos.

4. ÂżEn quĂŠ parte de la cĂŠlula estĂĄ el ADN? El ADN de la cĂŠlula se encuentra en el nĂşcleo.

5. En funciĂłn de la muestra biolĂłgica de partida empleada, aproximadamente Âża partir de cuĂĄntos nĂşcleos celulares hemos extraĂ­do ADN en esta prĂĄctica?

2 ml de sangre = 2000 đ?œ‡L → 9000-22000 leucocitos → 9000-22000 nĂşcleos 4500-11000 leucocitos/đ?œ‡L 6. ÂżPor quĂŠ precipita el ADN en el paso 13?

El ADN es una molĂŠcula polar en cambio el etanol es apolar, por lo que el ADN es insoluble en el etanol y precipita.

7. ÂżSe podrĂ­a lavar el ADN en el paso 15 con etanol al 40%?

Si, aunque se corre el riesgo de que se disuelva parte del ADN, porque no es etanol puro.

8. ÂżCuĂĄl es la finalidad de lavar el ADN con etanol al 70%?

Eliminar/quitar los restos (biomolĂŠculas). Si se lava con otro producto el ADN se va a disolver, por eso es muy importante lavar con etanol.

9. ÂżPor quĂŠ es importante que el etanol se evapore bien en el paso 15?

Porque los restos de etanol pueden interferir en el resultado, es decir en los posteriores procesos en los que se utilice el ADN.

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Práctica 2: reacción en cadena de la polimerasa Introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vitro del ADN: el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica consiste de ciclos repetitivos de: - desnaturalización del ADN por someterlo a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN monocatenario.

- unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN diana; - extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador en presencia de iones Mg2+ Los oligonucleótidos (cebadores o primers) consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son diferente entre sí y complementaria de los sitios del reconocimiento que flanquean el segmento del ADN diana que debe amplificarse. Las fases de desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador constituyen a un “ciclo” del método amplificación por PCR.

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Figura: proceso de la PCR En esta práctica se va a amplificar un segmento del gen que participa en el diagnóstico de la Homocistinuria, con el fin de analizar la presencia de una variante concreta mediante un análisis postamplificación (P4_RFLP, Ref.11511). El gen de la metil-tetra-hidro-folato-reductasa (MTHFR) se encuentra localizado en el cromosoma 1 (1p36.3). Se conocen al menos 40 mutaciones que alteran la función de la enzima o incluso la inactivan y no permiten que la proteína convierta la homocisteína en metionina. Esto produce un acúmulo de homocisteína en plasma, provocando enfermedades vasculares, como tromboembolismo venoso que puede derivar en embolia pulmonar; y un mayor riesgo a desarrollar defectos del tubo neural, espina bífida o fisura labiopalatina en un feto en desarrollo.

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Figura: localizaciĂłn cromosĂłmica del gen MTHFR Material â—? â—? â—?

Microtubo de 0,2 ml Gradilla Guantes

Reactivos â—? â—? â—? â—?

Muestras de ADN Enzima Taq polimerasa TampĂłn de actividad 5x Cebadores o Primers: Forward y Reverse

Aparataje â—?

Termiciclador

Protocolo de la PCR 1. Preparar la Mezcla Mix, para un volumen total de 300đ?œ‡L. Mezclar siempre por pipeteo, no emplear el vĂłrtex.

Taq polimerasa

6đ?œ‡L

TampĂłn 5x (con dNTPs y MgCl2)

75đ?œ‡L

Primer F

7,5đ?œ‡L

Primers R

7,5đ?œ‡L

Agua destilada estĂŠril

204 đ?œ‡L

Volumen total

300đ?œ‡L

2. Una vez preparado la Mezcla Mix y en un tubo eppendorf mezclar 20đ?œ‡L del la Mezcla Mix y 5đ?œ‡L de la muestra del ADN. En nuestro caso hicimos una muestra en blanco (sin ADN) y otra con ADN control.

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3. Efectuar la PCR en el termociclador con el siguiente programa:

Figura: fases de la PCR, con sus correspondientes temperatura y tiempo

Figura: configuraciรณn del termociclador 25

4. Comprobar el resultado de la reacción mediante una electroforesis en agarosa y explicar los patrones de bandas obtenidos.

Preguntas 1. ¿Qué particularidad tiene la ADN polimerasa para que pueda emplearse en este procedimiento?

Es termoestable, lo que hace que pueda resistir los cambios de temperatura que se producen durante el proceso de la PCR 2. ¿Cuál es el factor limitante del proceso? ● Cantidad de cebadores o primers ● Actividad de la Taq polimerasa 3. ¿Qué sucede en cada etapa de un ciclo de temperaturas: desnaturalización, anillamiento, elongación? ● Desnaturalización: convertir el ADN bicatenario en ADN monocatenario ● Anillamiento: unión de los cebadores a la cadena de ADN. ● Elongación: el ADN polimerasa se une a los cebadores, para extenderse la cadena del ADN. 4. ¿Cómo podemos asegurar que estamos amplificando el gen que necesitamos analizar?

Mediante una electroforesis en gel de agarosa.

5. Enumera los motivos por lo que no se produciría amplificación por PCR. ¿Qué ocurre si hay una mutación en la secuencia complementaria de unión de los cebadores?

Si hay una mutación en la secuencia complementaria de unión de los cebadores, estos no se unirían a la hebra de ADN, con lo que no se produciría la amplificación del gen.

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PrĂĄctica 3: electroforesis en agarosa Fundamento Los ĂĄcidos nucleicos tienen carga negativa, por lo que cuando se someten a un campo elĂŠctrico migran hacia el polo positivo. Esta migraciĂłn (electroforesis) se suele llevar a cabo en el interior de un gel (agarosa o poliacrilamida), de manera que los fragmentos de menor tamaĂąo se desplazan con mayor facilidad por la trama del gel que los mĂĄs largos. Tras la electroforesis, aparecen varias bandas que corresponden a los fragmentos de distinto tamaĂąo.

Para visualizar el ADN, el gel se debe teĂąir con marcadores que tienen una gran afinidad por los ĂĄcidos nucleicos y ademĂĄs, bajo la luz ultravioleta, emiten fluorescencia cuando se hallan unidos a ADN o ARN; por este motivo, son utilizados para la detecciĂłn de dichas sustancias en la trama de gel.

Figura: representaciĂłn de una electroforesis Material â—? â—? â—? â—? â—? â—? â—?

Muestras de ADN para cargar en el gel.

Agarosa TampĂłn TBE 10x (TRis-HCl, ĂĄcido bĂłrico, EDTA ph=8). Se debe diluir hasta tener TBE 1x, del que se necesitan 50 ml para preparar el gel y 250 ml para sumergirlo en la cubeta.

Midori Green (agente intercalante) Marcador de peso molecular TampĂłn de carga (5 đ?œ‡L para cada muestra) Microtubos de 0,6 ml.

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Agarorosa

Marcador de peso molecular Tampón de carga

Preparación de reactivos Tampón de electroforesis REACTIVOS

CONCENTRACIÓN FINAL

CANTIDAD

TBE10x

1x

50 ml

Agua (para biología molecular o destilada)

Hasta 500 ml

Preparación de 500 ml: 1. Medir la cantidad correspondiente de TBE 1x, en función de la cantidad de tampón de electroforesis necesaria para preparar el gel y llenar la cubeta de electroforesis que se vaya a emplear.

2. Añadir agua hasta 500 ml.

3. Mezclar.

Almacenamiento ●

Almacenar a temperatura ambiente

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PreparaciĂłn del gel de agarosa REACTIVOS

GEL 2%*

Agarosa

1g

TBE 1x

50 ml

1. Preparar la bandeja con el peine.

2. Pesar la agarosa directamente en el vaso de precipitados. AĂąadir 50 ml de TBE 1x.

3. Hervir en el microondas hasta la disoluciĂłn total de la agarosa, agitando el vaso con la mano de vez en cuando.

4. Mantener en agitaciĂłn hasta alcanzar los 65ÂşC aproximadamente (temperatura orientativa) 5. AĂąadir 5 đ?œ‡L de Midori Green a la agarosa lĂ­quida. Mover para distribuir uniformemente.

6. Servir en la bandeja con el peine colocado.

7. Dejar polimerizar a temperatura ambiente, hasta que la agarosa deje de estar transparente.

8. Quitar el peine levantĂĄndolo verticalmente del gel y evitando moverlo hacia los lados para no romper los pocillos.

Figura: peine para realizar los pocillos en gel de agarosa

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Figura: gel de agarosa con los pocillos PreparaciĂłn del tampĂłn de electroforesis (TBE 1x): REACTIVOS

CANTIDAD

TBE 10x

25 ml

Agua (para biologĂ­a molecular o destilada)

Hasta 250 ml

PreparaciĂłn de las muestras â—?

â—?

En un pocillo del peine Marcador del peso molecular

4 đ?œ‡L

TampĂłn de carga

5đ?œ‡L

Agua destilada

5đ?œ‡L

En cada pocillo Muestra del ADN

10đ?œ‡L

TampĂłn de carga

5đ?œ‡L

Agua destilada

5đ?œ‡L

En cada pocillo colocamos varias muestras de ADN amplificado obtenido tras realizar la PCR. Por una parte, utilizamos el ADN de un compaĂąero de clase y por otra parte un ADN control.

Protocolo de la electroforesis 1. Preparar el tampĂłn de electroforesis.

2. Preparar la muestra de ADN. 3. Introducir el gel y el tampĂłn de electroforesis en la cubeta e insertar las muestras de ADN en los pocillos, anotando el orden de colocaciĂłn en el gel, con precauciĂłn de no daĂąar el pocillo.

4. Conectar la cubeta a la fuente y poner el voltaje constante (100-120 V) hasta que el frente de la electroforesis haya recorrido las tres cuartas partes del gel.

5. Desconectar la fuente.

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Figura: cubeta de electroforesis con el gel de agarosa con los pocillos cargados

Figura: cubeta de electroforesis con el gel de agarosa con los pocillos cargados

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Visualización de resultados 1. Una vez detenida la electroforesis, sacar el gel de la cubeta con cuidado para que no se rompa, y, sin bandeja, colocarlo sobre un transiluminador UV. 2. Analizar el resultado obtenido mediante la visualización de gel, con precaución de proteger cara y ojos de la luz UV, con las gafas especiales.

Resultados e interpretación Gracias a la electroforesis podemos comprobar si la PCR se ha realizado correctamente y se ha amplificado el gen correcto. En nuestro caso, no se pueden observar las bandas correspondientes, lo que nos indica que hubo algún fallo durante la PCR y no hubo amplificación. Creemos que las posibles causas de que no hubiera amplificación pueden ser: ● No programamos bien el termociclador. ● No pipeteamos correctamente durante el proceso. ● El termociclador no funciona correctamente.

Figura: resultado de la electroforesis

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Preguntas 1. Explicar brevemente en qué se basa la electroforesis de ácidos nucleicos.

La electroforesis de ácidos nucleicos es una técnica que permite separar moléculas de ADN en función de su tamaño y forma en un campo eléctrico.

2. ¿Qué función tiene el tampón de carga?

El tampón de carga aporta color y densidad a las muestras para que cuando sean introducidas en los pocillos precipiten y se aprecien bien a la hora del visualizar el resultado.

3. ¿Por qué aparecen bandas con distinta intensidad?

Aparecen diferentes bandas en función de los distintos tamaños que tengan los ácidos nucleicos.

La distinta intensidad se debe a la diferente cantidad de ADN unido al fluorocromo.

4. ¿Por qué no se hace la electroforesis en agua en vez de en tampón TBE? Porque el agua no posee iones ni sales para que corra la corriente eléctrica que arrastra el ADN del polo negativo hacia el positivo.

5. Interpretar los resultados obtenidos al analizar ADN Genómico y/o el producto de PCR y la restricción enzimática mediante electroforesis en agarosa.

Si hay una restricción enzimática, las enzimas implicadas en la PCR se inhiben, con lo que no tiene lugar la PCR y por lo tanto, no se visualizarían bandas en la electroforesis.

6. ¿Por qué la electroforesis en agarosa es sumergida?

Porque el gel de agarosa se sumerge en tampón de electroforesis para que corra la corriente eléctrica.

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Reflexión final Tras la realización de todas estas actividades durante la segunda evaluación las conclusiones que saco son las siguientes.

Gracias al mapa conceptual he aprendido a sintetizar la información y quedarme con los datos más importantes, para así resumir el contenido y hacerlo más fácil de comprender. Llevando a cabo este proceso de resumen, he asimilado mejor en qué consisten las cuatro prácticas de biología molecular que hemos trabajado.

También he descubierto la gran cantidad de utilidades que tienen estas técnicas en los distintos campos de la vida en general.

En el trabajo de micropipetas en un principio nos costó centrarnos y saber qué es lo que se nos pedía. Sin embargo, finalmente he conocido cómo se lleva a cabo la calibración y la verificación de las mismas. Además, el haberlo realizado nosotros mismos en el laboratorio ha facilitado el proceso de aprendizaje. También me he informado de cómo se lleva a cabo el mantenimiento y limpieza de estos aparatos. Además, he aprendido un poco cómo trabajar en un documento excell aunque es verdad que aún me resulta difícil y no lo controlo del todo todavía.

Por último, las tres prácticas de laboratorio me han ayudado a conocer cómo se llevan a cabo los distintos procesos necesarios para realizar la PCR y la posterior electroforesis de ácidos nucleicos. De este modo, hemos podido poner en práctica todo lo estudiado durante el primer trimestre a pesar de que la práctica no saliera bien finalmente. Además, el fracaso de la práctica me ha ayudado a darme cuenta de lo difícil que es realizar este tipo de prácticas, y que un pequeño fallo durante el proceso puede estropear toda la práctica.

Bibliografía Universidad de Alcalá de Henares, España. (s.f.). http://www.biologia.arizona.edu/human/problem_sets/DNA_forensics_2/06t.html.

GENYCA GENETICS. (s.f.). http://www.genyca.es/.

BIOTECNOLOGÍA-UNAM, I. D. (JUNIO de 2004). SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Obtenido de http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf F. Gómez-Aguado, M. L. (2015). Biología molecular y citogenética. Editorial Altamar SL. Organización Panamericana de la salud. (2005). MANUAL DE MANTENIMIENTO PARA EQUIPO DE LABORATORIO. Washington D. C.

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