N uevos métodos diagnósticos en T DR VI BM I Congr eso AL AT , L ima D r . D avid M oor e L ondon School of H ygiene and T r opical M edicine, RU U niver sidad Per uana Cayetano H er edia, Per ú
04 de Octubr e del 2010
Pruebas de susceptibilidad • • • • •
Porque la dilema Resumen de las opciones Información útil Como usarlas – en que pacientes, en que momento Aspectos de la implementación – costo, capacidad, infraestructura, sostenibilidad, aseguramiento de calidad, pruebas adicionales
Pruebas de susceptibilidad Genotipicas
F enotipicas
Cepa o muestra
Cepa o muestra
Horas
D铆as a semanas
cara
Manual econ贸mica, automatizada cara
PSfenotipicas indirectas • A partir de una cepa – aislamiento primario – capacidad del laboratorio – manipulación de cultivos
• Método de proporciones • MGIT – Validadas (siempre con CC) – Pruebas de referencia
• LJ/ agar - costo bajo • MGIT - costo alto •
flexible – Todo 1ra linea – Todo 2da linea – Todo 1ra y 2da linea
• Métodos colorimetricos – Rápido – brinden MICs
1
TEMA (MABA, reazurin)
4
5
6
7
8
9
10
11
I NH
B
32
16
8
4
2
1
0.5
0.25
0.125
C
RI F
C
16
8
4
2
1
0.5
0.25
0.125
0.063
C
SM
D
32
16
8
4
2
1
0.5
0.25
0.125
C
64 8
32
16
8
4
2
1
0.5
C
0.125 5
0.063
0.031
C
0.25
0.125
0.063
C
B
• bioseguridad • 1 placa por muestra
3
A
EM
• Costo bajo • CMI vs. S/ R • PSde 1ra y 2da linea
2
E
12
CAP
F
8
4
2
1
0.5
CI P
G
16
8
4
2
1
H
0.2
0.5
12
PS dir ectas Pruebas r a pi da s por no depender en un aislamiento primiario Detecci贸n de MTB y a la vez PS Genotipicas o fenotipicas 7
Tuberculosis resistente: mutaciĂłn rpoB = 95%de resistencia a rifampicina ≈ MDR Detection of rifampicin resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis Lancet 1993; 341: 647-50 INNO-LiPA Rif TB Nature 1998; 393: 537-544
Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 2093-8
MTBDRplus (Hain) • Se usa sedimento de muestra de esputo decontaminado – Extracción – Amplificación – Hybridización
• 27 bandas por strip – 6 controles – rpoB • 8 tipo salvaje (susceptible) • 4 mutantes resistentes
– katG • 1 tipo salvaje (susceptible) • 2 mutantes resistentes
– inhA • 2 tipo salvaje (susceptible) • 4 mutantes resistentes
Barnard et. al. Am JRespir Crit Care Med 2008; 177: 787-792
Boehme et al, 2010
M TB
• • • •
Cepheid Xpert MTB/ RIF 105 minutos 16 pruebas/ dia/ maquina no se necesita cabina de bioseguridad
Consider aciones de las pr uebas molecular es
95% de resistencia a RIF se atribuye a mutaciones en rpoB 95% de resistencia a RIF es como parte de MDR 95% de 95% = 90.25%
Preparacion de insumos y muestras
Realizar la reacción y amplificación
Analisis del producto
Infraestructura por un flujo de trabajo adecuada Se identifica resistencia....ahora que? ...PS de 2da linea fenotipica – se necesita cepa o muestra adicional 11
Tuberculosis resistente: PSfenotipicas directas - “ pruebas rapidas” • Concurrente con cultivo – Menos demora – Menos capacidad de laboratorio – No se manipulan cultivos
• Método Griess – Medio solido (LJ)
• No se necesita aislamiento primario, entonces – bajo costo – menor carga de trabajo
• MODS – Medio liquido (7H9)
Griess Se agrega el “ agente Griess� al cultivo maduro (dia 28) de LJ con NaNO3
Solis et. al. Int JTuberc Lung Dis 2005; 9: 760-764
NaOHNALC
PBS
Vortex y dejelo 15 minutes
Centrifuga 15 min 3000g
Llene tubo hasta 15ml
7H9 PANTA OADC
Decontaminaci贸n de la muestra 900渭l/pozo
MODS isoniacida
Cultivo y prueba de susceptibilidad directa
rifampicina sin droga sin droga 1
2
3
Control 4 negativo
5
MODS
www.
peru.org
Pruebas de susceptibilidad utiles Isoniacida S Rifampicina S Isoniacida Rifampicina Etambutol Estreptomicina (Pirazinamida)
Isoniacida R Rifampicina S Isoniacida S Rifampicina R Isoniacida R Rifampicina R
Panel de drogas de 2da linea mรกs etambutol estreptomicina pirazinamida
A quien no se harĂa una prueba rĂĄpida?
Casos nuevos
Casos de retratamiento
H
R
MDR
H
R
MDR
1999
9.0%
4.0%
3.0%
16.2%
14.6%
12.3%
2006
11.6%
5.8%
5.3%
30.3%
26.4%
23.6%
17
Implementacíon • Costo
• Sostenibilidad
– Infraestructura – personal
• Aseguramiento de calidad
• Pruebas adicionales – ZES, 2da linea – Se necesita cepa
Resumen • PS fenotipica indirecta – convencional – estandar de referencia • PS fenotipica directa – rapida – no comercial – bajo costo
• PS genotipica directa – muy rapida – comercial – costoso
Resumen
Gr acias por su atención davidajmoor e@msn.com
• L uego de evaluaciones exhaustivas el OM S ahor a r ecomiende: – Cultivo y PSen medio liquido e.g. MGIT y MODS – Line probe assays e.g. MTBDRplus, InnoLIPA – PS directa por nitrate reductase e.g. Griess – PS indirecta colorimetrica e.g. TEMA, MABA • R endimiento de sensibilidad/especifidad no var ia mucho • Pr uebas molecular es: – son mas rápidas – sin embargo son mas costosas – Y no generan cepa para pruebas adicionales en caso que se identifica resistencia • No hay una pr ueba que puede ser vir par a todo • Pr ogr amas tienen que decidir como or ganizar su r ed de labor ator ios par a apr ovechar las diver sas ventajas de cada tipo de pr ueba • una combinación de pruebas puede maximizar el impacto