Estudio e Identificación de Vectores de Leishmaniasis by Alejandro Valencia-Tobón

MANUAL PARA EL ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE VECTORES DE LEISHMANIASIS

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD Jorge Alvar Oficial Médico, Jefe Programa de Leishmaniasis

ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD Steven Ault Asesor Regional Parasitología

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA PROGRAMA DE ESTUDIO Y CONTROL DE ENFERMEDADES TRIPOCALES - PECET Iván Darío Vélez Bernal Director

Carolina Torres Gutiérrez Coordinadora Línea Entomología Médica

Ana Cristina Patiño Taborda Comunicadora Social

PROGRAMA DE ESTUDIO Y CONTROL DE ENFERMEDADES TROPICALES -PECET-

Comité editorial Iván Darío Vélez, Director PECET; Carolina Torres Gutiérrez, Coordinadora Línea Entomología Médica; Horacio Cadena Peña, Investigador Asociado

Dirección y revisión técnica Iván Darío Vélez Carolina Torres Gutiérrez Horacio Cadena Peña

Investigación temática Carolina Torres Gutiérrez, Sandra Inés Uribe Soto, Horacio Cadena Peña, Rafael José Vivero Gómez Raúl Leonardo Rocha, Andrés López Rubio, Richard Onalbi Hoyos López, María Angélica Contreras Gutiérrez, Karina Mondragon Shem, Luz Adriana Acosta Cardona, Alejandro Valencia Tobón, Juan Sebastián Cardona

Fotografías PECET, Rafael José Vivero Gómez, María Angélica Contreras Gutiérrez, Eduar Elías Bejarano Martínez, Alejandro Valencia Tobón, Pablo Herrera, Carlos Almanza.

Diseño, diagramación y concepto Grafico Jovany Barajas Galindo, María Angélica Contreras Gutiérrez

PRESENTACIÓN Este documento guía para el Curso Latinoamericano de Estudio e Identificación de Vectores de Leishmaniasis es un complemento de todo el contenido teóricopráctico incluido en la programación del evento, para la capacitación de profesionales en el área de la salud. El propósito de este manuscrito es guiar al participante en los contenidos de mayor relevancia para el estudio de los flebotomíneos, así como de proporcionar las referencias bibliográficas más importantes. La Leishmaniasis es una enfermedad re-emergente en el mundo, que hace parte del grupo de enfermedades desatendidas. En los últimos veinticinco años, la incidencia de esta enfermedad se ha incrementado significativamente a nivel mundial, con la aparición de nuevas áreas endémicas. Por esta razón, la Organización Mundial de la Salud, actualmente la considera como enfermedad re-emergente y segunda causa de muerte entre las infecciones parasitarias (Hirst & Stapley, 2000; WHO, 2004; OPS, 2007). Para el diseño e implementación de las medidas de prevención y control de la leishmaniasis es necesario conocer las especies vectores, así como su bionomía, dado que el riesgo epidemiológico de infección está determinado por el comportamiento de los vectores. Además, influyen las épocas del año y horas del día o la noche, en que ocurre mayor contacto entre el hombre y vector infectado; así como los lugares respecto al domicilio donde los grupos de población están en mayor riesgo. La identificación y estudio de la bionomía de las especies transmisoras es una prioridad al interior de todo programa de prevención y control. Por tanto deberá fortalecerse la capacidad técnica de los profesionales del área de la entomología médica en los diferentes países endémicos, para que suministren la información de base que permita a las autoridades de salud diseñar las medidas de prevención y elaborar los mapas de riesgo de infección de su respectivo país. v

CONTENIDO

TAXONOMÍA, BIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE FLEBOTOMÍNEOS .................................. 1 Generalidades ............................................................................................................... 1 Sistemática de los flebotomíneos................................................................................... 1 Familia Psychodidae................................................................................................... 1 Subfamilia Phlebotominae ......................................................................................... 2 Géneros en la Subfamilia Phlebotominae ................................................................... 2 Nombres populares de Lutzomyia en Latinoamérica .................................................. 3 Biología de flebotomíneos ............................................................................................. 3 Ciclo de vida de los flebotomíneos ............................................................................. 3 Taxonomía de flebotomíneos ........................................................................................ 6 Morfología de flebotomíneos ........................................................................................ 7

ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR FLEBOTOMÍNEOS .......................................... 13 Leishmaniasis............................................................................................................... 13 Leishmaniasis cutánea (LC)....................................................................................... 14 Leishmaniosis cutánea difusa (LCD) .......................................................................... 15 Leishmaniasis mucosa .............................................................................................. 16 Leishmaniasis visceral .............................................................................................. 16 Leishmaniasis visceral y VIH ..................................................................................... 17 Tratamiento de la Leishmaniasis .............................................................................. 18 Otros patógenos transmitidos por los flebotomíneos ................................................... 18

ASPECTOS DE LA ECOLOGÍA Y FISIOLOGÍA DE LOS FLEBOTOMÍNEOS ........................ 22 Alimentación ............................................................................................................... 22 Alimentación con azúcares....................................................................................... 22 Búsqueda, alimentación y digestión de sangre ......................................................... 23 Reproducción .............................................................................................................. 25 Relación Vector-Parásito.............................................................................................. 26 vi

4. CARACTERÍSTICAS ECOLÓGICAS DE FOCOS DE TRANSMISIÓN ...................................... 32 Ciclos de transmisión de la Leishmaniasis..................................................................... 33 Ciclo selvático .......................................................................................................... 33 Ciclo rural ................................................................................................................ 33 Ciclo urbano............................................................................................................. 34 5.

INCRIMINACIÓN DE ESPECIES VECTORES.................................................................. 36 Disecación de flebotomíneos y cultivo de parásitos ..................................................... 40 Anticuerpos monoclonales........................................................................................... 41 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ................................................................. 42

6. ESTABLECIMIENTO Y MANTENIMIENTO DE COLONIAS DE FLEBOTOMINEOS EN CONDICIONES DE LABORATORIO ..................................................................................... 46 Procedimiento ............................................................................................................. 48 7. MÉTODOS DE CONSERVACIÓN, ACLARACIÓN Y MONTAJE DE FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA: PSYCHODIDAE) ................................................................................................ 51 Aclaración de flebotomíneos ....................................................................................... 52 Montaje de flebotomíneos .......................................................................................... 53 8. SECUENCIAS DE ADN COMO HERRAMIENTA EN ESTUDIOS DE ENTOMOLOGÍA MÉDICA PARA LA DETERMINACIÓN TAXONÓMICA DE FLEBOTOMÍNEOS ....................................... 58 Colección, transporte y preparación de especímenes o tejidos a utilizar en estudios moleculares ................................................................................................................. 59 Extracción de ADN ....................................................................................................... 60 Protocolo de Extracción de DNA por Grind buffer .................................................... 61 Amplificación de ADN mediante Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction - PCR) ............................................................................................................ 63 Oligonucleótidos o primers usados en la PCR ........................................................... 64 Protocolo de Amplificación ...................................................................................... 65 Verificación de presencia de ADN mediante electroforesis........................................... 67 Electroforesis ........................................................................................................... 68 Protocolo de Verificación de presencia de ADN mediante electroforesis .................. 69 Obtención de secuencias ............................................................................................. 70 Edición y Análisis de secuencias ................................................................................... 70 vii

COLECCIONES ENTOMOLÓGICAS ............................................................................. 75 ¿Qué son y por qué existen las colecciones biológicas? ................................................ 75 Responsables de las colecciones Biológicas .................................................................. 76 Las Colecciones Biológicas y su Administración ............................................................ 76 Índice de Salud de las Colecciones: Niveles .................................................................. 76 Importancia de la colección de Lutzomyia (Diptera: Psychodidae) ................................ 77 Inclusión de material en una colección Entomológica .................................................. 78

10.

VIGILANCIA Y CONTROL DE FLEBOTOMÍNEOS....................................................... 81

Estudio de foco de la leishmaniasis .............................................................................. 82 Objetivos de la investigación en los focos de leishmaniasis ...................................... 82 Fases del trabajo de campo.......................................................................................... 82 Elaboración y aplicación de la encuesta epidemiológica ............................................... 83 Estudios entomológicos ............................................................................................... 83 Estudio entomológico transversal ............................................................................ 84 Estudio entomológico longitudinal ........................................................................... 84 Métodos de muestreo de flebotomíneos ..................................................................... 85 Recolección y conservación del material entomológico ................................................ 85 Estudio de posibles reservorios .................................................................................... 86 Zonas de transmisión de leishmaniasis visceral ........................................................ 86 Zonas de transmisión de leishmaniasis cutánea ....................................................... 87 Actividades posteriores al estudio del foco .................................................................. 87 Vigilancia entomológica ........................................................................................... 88 Vigilancia de Reservorios.......................................................................................... 88 Definición de mecanismos operativos ...................................................................... 88 Evaluación del impacto ............................................................................................ 88 11.

CONCEPCIONES Y APROXIMACIONES AL TRABAJO CON LA COMUNIDAD.............. 90

viii

TAXONOMÍA, BIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE FLEBOTOMÍNEOS

María Angélica Contreras Gutiérrez Richard Onalbi Hoyos López Generalidades Los flebotomíneos son pequeños dípteros hematófagos de la familia Psychodidae de importancia en salud pública por su papel como vectores de Leishmania. Además son transmisores de Bartonella bacilliformis agente causal de la Bartonelosis, del Virus de la Estomatitis Vesicular, de algunos Phlebovirus, Arbovirus y tripanosomas de reptiles y anfibios (Tesh, 1988; Anderson et al., 1997; Montoya-Lerma y Ferro, 1999).

Sistemática de los flebotomíneos Familia Psychodidae Es una de las más primitivas del orden Díptera, incluye 6 subfamilias, de las cuales 5 están Phylum: Artrópoda distribuidas en el Nuevo Mundo: Trichomyiinae, Clase: Insecta Sycoracinae, Brunchomyiinae, Psychodinae y Orden: Díptera Phlebotominae pero solamente las dos últimas son Suborden: Nematócera de importancia médico-veterinaria. La subfamilia Familia: Psychodidae Horaiellinae, está restringida al Viejo Mundo. Se Subfamilia: Phlebotominae caracterizan por la venación del ala y la presencia de Género: Lutzomyia densos pelos en las alas y tórax (Triplehorn y Jonson, 2005; Young y Duncan, 1994) (Figura 2). Reino: Animal

Subfamilia Phlebotominae Phlebotominae (del griego phlebos, vena y tomos, cortar), se diferencian de otras subfamilias dentro de Psychodidae, por la presencia de piezas bucales más largas que la cabeza, mandíbulas bien desarrolladas, palpos divididos en segmentos, antenas casi cilíndricas y vena radial del ala distribuida en 5 ramas (Barreto, 1955; Triplehorn and Jonson, 2005). Algunos atributos generales http://www.ddd-bramowski.pl/materialy/robaki/2i.jpg que a menudo pueden ser utilizados para distinguirlas de otros dípteros, es su tamaño Figura 2. Hembra de Psychoda sp. (1,5 - 2,5 mm de longitud), patas largas y su característica de salto de vuelo (Barreto, 1955; Fairchild, 1955; Theodor, 1965). Géneros en la Subfamilia Phlebotominae Los miembros de la subfamilia Phlebotominae, predominan en las regiones tropicales y subtropicales. El grupo está compuesto por 6 géneros, Sergentomyia, Phlebotomus y Chinius en el Viejo Mundo y Brumptomyia, Warileya y lutzomyia en las Américas. Su distribución altitudinal comprende desde el nivel del mar hasta los 2.900 m (http://cipa.snv.jussieu.fr/). Los individuos del género Sergentomyia se consideran vectores del género Sauroleishmania. Los dípteros del género Phlebotomus pueden ser distinguidos de los de Sergentomyia por el cibarium (Lewis, 1982, Davidson, 1990). El género Brumptomyia está distribuido desde el sur de México hasta el norte de Argentina, encontrándose regularmente asociada con armadillos, pero ninguna de sus especies han sido reportadas como antropofílicas, por lo que no se consideran de importancia médica (Young y Duncan, 1994). Los individuos del género Warileya aun cuando exhiben un comportamiento zoofílico y antropofílico, no han sido implicados en la transmisión de patógenos al hombre, su distribución comprende Costa Rica, Panamá, Colombia, Guyana Francesa, Bolivia, Ecuador y Perú (Young y Duncan, 1994). El género Lutzomyia alberga a más de 700 especies, existen registros de 14 fósiles de Lutzomyia preservados en ámbar en depósitos centroamericanos durante el Oligoceno tardío y Mioceno temprano, calculándose su edad mínima en 26 millones de años (Williams, 1993; Galati, 1995; Peçanha et al., 2002; Andrade y Peçanha, 2003). Este género se caracteriza dentro de la subfamilia Phlebotominae 2

por la presencia de una sutura interocular completa, número de filas de dientes en el cibarium y por la ausencia de la seta episternal (Young y Duncan, 1994). Nombres populares de Lutzomyia en Latinoamérica Los flebotomíneos se reconocen en diferentes regiones de Latinoamérica con diversos nombres como: “capotillo”, “titira”, “plumilla”, “angelillo”, “puma”, “rapache”, “jenjen”, “mantablanca”, “capablanca”, “lalapo”, “titira”, “wanwa”, “pumamanchachi", “carachupausa", “tarayita”, “angoleta”. En Centroamérica, se conocen popularmente como papalotillas (del nahuatl papalotl, que significa mariposa), “aliblanco”, “manta”, “palomilla”, “chiroso”, “pringador”, “chitras”, “toritos”, “carachais”.

Biología de flebotomíneos Ciclo de vida de los flebotomíneos La biología de cada especie de flebotomíneo, es única y compleja. Por tal motivo se deben considerar aspectos particulares de reproducción, alimentación, dispersión y comportamiento que influyen directamente en la epidemiología de la leishmaniasis y el control del vector. Son insectos con metamorfosis completa (holometábolos), que pasan por diferentes estados de vida: huevo, larva, pupa y adulto, que varían en duración según las especies. Es precisamente el estadío adulto el mejor conocido, dada la dificultad de encontrar los sitios naturales de cría de las diferentes especies (Ver fichas fotográficas en anexo). • Fases Inmaduras Los huevos de los flebotomíneos son ovalados, algo curvos, de color claro a oscuro. Miden entre 300 y 500 μ, presentan protuberancias propias de la especie o complejo de especies, y forman patrones típicos (irregulares, polígonos, eclipses, crestas, fosas, montañas). La hembra deposita entre 40 - 70 huevos sobre sustratos húmedos y la eclosión tarda de 8 a 15 días dependiendo de condiciones ambientales. Algunos autores plantean que los huevos de algunas especies pueden mantenerse viables en condiciones adversas, como sequía y frío (Barreto, 1941; Young y Duncan, 1994; Elnaiem y Ward, 1991). La etapa larval se completa en tan sólo 18 días, pero normalmente dura más tiempo dependiendo de la temperatura. Las larvas se alimentan de materia orgánica y su desarrollo incluye cuatro etapas: 3

larva de primero, segundo, tercero y cuarto instar, que se diferencian entre sí por el tamaño. Se caracterizan por ser pequeñas, alargadas, presentan una cápsula cefálica esclerotizada bien desarrollada que se diferencia del resto del cuerpo (Pessôa y Barreto, 1948; Cáceres, 1989; Young y Duncan, 1994). La larva de cuarto instar deja de alimentarse, y se transforma en pupa, quedando inmóvil y en posición erecta. La pupa es de tamaño pequeño (aproximadamente 2 mm), algo alargada, vermiforme, casi descubierta de cerdas y su color varía de blanco a pardo oscuro. Las pupas son más resistentes a las variaciones climáticas. No obstante, en ciertas especies de regiones frías, el desarrollo de la larva de cuarto estadio puede prolongarse considerablemente, a veces hasta un año. Su desarrollo culmina en 10 -12 días (en condiciones favorables), después de ese tiempo el adulto emerge completamente formado. El promedio de vida de la forma adulta es de 25 – 30 días (Perfil 'ev, 1968; Artemiev et al., 1972; Young et al., 1981; Killick-Kendrick, 1987; Young y Duncan, 1994, Alexander, 2000; Feliciangeli, 2004). En el Viejo Mundo, las fases inmaduras han sido encontradas en el interior de las viviendas humanas, corrales de animales domésticos, madrigueras de roedores y de montículos de termitas en África oriental (Dedet et al., 1982; Mutinga y Kamau, 1986; Feliciangeli, 2004). En el Nuevo Mundo, se han descrito potenciales microhábitats para las larvas tales como: sitios de pastoreo, hojarasca, huecos de árboles y madrigueras entre otros. Son muy pocos los ejemplares inmaduros recuperados y, por tanto, poco puede afirmarse acerca de los hábitats larvarios (Forattini, 1954; Rutledge y Ellenwood, 1975; Arias y Freitas, 1982; Casanova, 2001). • Fase Adulta Los adultos típicamente son de menos de 5 mm de longitud, patas largas, alas ampliamente lanceoladas (sin venas cruzadas más allá de la base) y tórax giboso. Su cuerpo está revestido de cerdas largas y finas, que le confieren un aspecto hirsuto y su color varía entre grisáceos pasando por amarillentos hasta marrón. La cabeza es pequeña, presenta ojos compuestos (ocelos ausentes) y antenas largas con 16 segmentos similares en machos y hembras. El abdomen posee diez segmentos, los tres últimos modificados para constituir la genitalia. En el macho hay una fuerte armadura genital capaz de sujetar a la hembra durante el apareamiento, a diferencia de la hembra, donde los últimos segmentos 4

abdominales constituyen dos lóbulos laterales y dos cercos (Young y Duncan, 1994; Galati, 2003). En lo que se refiere a la fenología, los flebotomíneos se encuentran distribuidos por amplias zonas del mundo, realizando su ciclo vital completo durante todo el año en áreas tropicales, y de mayo a octubre, en la región paleártica. Para sobrevivir a los rigores del invierno, se ha documentado que las especies entran en diapausa en el cuarto estadío larvario. Los hábitats varían desde selva húmeda a regiones muy áridas. En cuanto a su desplazamiento, por su característica de vuelo corto y silencioso, se conocen como voladores débiles que no pueden viajar largas distancias. Para muchas especies esto es válido: la distancia de dispersión más larga registrada de un flebotomíneo es de 280 m, mientras en las zonas boscosas del Nuevo Mundo no tienen un rango amplio, oscila entre 50 m a 200 m (Chaniotis et al., 1982; Cáceres, 1993). Sin embargo, algunas especies pueden alcanzar una distancia de 2 km (Killick-Kendrick et al., 1984). Las especies del género Lutzomyia presentan fototropismo positivo, tienen actividad crepuscular y nocturna (Desde las 16:00 hasta las 07:00 horas del día siguiente), aunque también están activas durante el día (Disney, 1966; Alexander, 2000; Casanova, 2001). En áreas tropicales los flebotomíneos exhiben características temporales y patrones biotópicos definidos, aumentando sus poblaciones, por ejemplo, inmediatamente después de la época de lluvia, aunque lo opuesto se ha observado para algunas especies de Asia (Trouillet, 1981; Martínez y Gallego, 1987). En África, el aumento de los flebotomíneos, la taxonomía del grupo basada en caracteres morfológicos es controversial (Theodor, 1965; Lewis et al., 1977; Artemeiev, 1991; Williams, 1993; poblacional de flebotomíneos coincide con el crecimiento de la población de roedores de los que se alimentan, adicionalmente, suele presentarse una dinámica estacional bifásica, con un pico de densidad hacia la primera quincena de julio y otro más marcado en septiembre (Basimike y Muyinga, 1990).

Taxonomía de flebotomíneos Pese a la importancia médica Young & Duncan, 1994; Galati, 1995); en parte porque históricamente, se ha considerado solo un pequeño grupo de carácteres morfológicos (cibario, espermatecas y genitalia masculina principalmente) (Theodor, 1965), para agrupar algunas especies y separar otras en subgéneros y grupos, sin inferir si estas similitudes morfológicas representan relaciones evolutivas de grupos monofiléticos. Además, la separación de la subfamilia Phlebotominae de acuerdo a su distribución geográfica y a la necesidad de tener un arreglo estable, ha impedido una sistemática de las relaciones interespecíficas de los géneros y las relaciones intragenéricas, considerando que estas relaciones no están sustentadas con base a una verdadera distinción morfológica (Ashford, 1991); sin embargo, hasta ahora el significado filogenético de tales caracteres no ha sido considerado en magnitud, porque además, se le ha restado importancia a otras estructuras morfológicas de los flebotomíneos (Bejarano, 2003). Actualmente, existen dos sistemas de clasificación para el género Lutzomyia: • Young & Duncan (1994) Divide al género Lutzomyia en 15 subgéneros y 11 grupos de especies (al interior de algunos grupos y subgéneros se pueden encontrar series). Los subgéneros y grupos de especies se encuentran constituidos principalmente por la similitud estructural de un pequeño grupo de caracteres (genitalia masculina, morfología de las espermatecas, cibario, palpos y flagelómeros), para constituir categorías intragenéricas (Theodor, 1965; Lewis et al., 1977), sin embargo, el significado evolutivo de este grupo de caracteres para establecer las relaciones sistemáticas del grupo no fue delimitado. Por ejemplo, en el grupo verrucarum se han propuesto divisiones hasta series por la similitud morfológica de caracteres asociados a la genitalia del macho (espinas subterminales y tufo de setas) (Theodor, 1965; Young, 1979; Feliciangeli et al., 1992; Cazorla, 1995). • Galati (2003) Propone una nueva clave dicotómica para identificar flebotomíneos de acuerdo a las agrupaciones inferidas en su anterior propuesta sistemática (Galati, 1995), y destacando nuevos caracteres para la separación e identificación de especies (Beati et al., 2004). Subdivide al género Lutzomyia en tres subtribus: Sergentomyiina (donde se ubican especies pertenecientes al grupo oswaldoi sensu Young & Duncan), Lutzomyiina (Lutzomyia) y Psychodopygina (en nomenclatura 6

Young & Duncan un subgénero dentro de Lutzomyia), esta última subtribu tiene varios subgéneros que han sido elevados a rango de géneros (Psathyromyia, Viannamyia, Nyssomyia, Trichophoromyia, Psychodopygus), al analizar morfológicamente 88 carácteres cuantitativos y cualitativos de la subfamilia Phlebotominae con especial énfasis en los grupos americanos. Los cladogramas inferidos por Galati (Galati, 1995), proporcionan la primera hipótesis de relaciones evolutivas al interior del género Lutzomyia.

Morfología de flebotomíneos A nivel morfológico, los carácteres asociados a larvas y huevos han jugado poco papel en la sistemática y taxonomía de flebotomíneos, sin embargo, los estados adultos han sido muy bien descritos en su estructura externa como en su anatomía interna (Jobling, 1987; Munstermann, 2005; Galati, 2003). La base de la identificación taxonómica se basa en caracteres del estado adulto, asociados a la cabeza (palpómeros, flagelómeros, ascoides y cibario), tórax (longitud de venas alares, posición de venas alares, longitud y espinas de fémur, quetotaxia y setas en pleuritos) y abdomen (genitalia masculina y femenina) (Theodor, 1965; Young y Duncan, 1994; Galati, 2003). A continuación se da una descripción general de cada parte corporal y las estructuras de importancia en la identificación taxonómica de flebotomíneos: • Cabeza Presenta ojos compuestos generalmente, con una distancia inter-ocular característica en algunas especies, además están separados por una sutura interocular que puede ser incompleta (Lutzomyia) o completa (Warileya). El palpo se encuentra dividido por cinco segmentos, estando parcialmente fusionados el primero y segundo; la longitud y relación métrica entre palpos está relacionada

con la separación de grupos y subgéneros (formulas pálpales pueden ayudar a identificar especies) (Figura 3a). Las antenas presentan: escapo, pedicelo y 14 flagelómeros, revistiendo especial interés los ascoides del flagelomero II en cuanto a longitud y disposición (Figura 3c). La probóscide está compuesta por labroepifaringe, hipofaringe y labio, en la parte distal de esta última, aparecen las labelas y suturas longitudinales mediales que originan la división labial que en algunos grupos de Tomado de: Munstermann, 2005. especies pueden o no unirse. En el cibario, se Figura 3. a. Cabeza Vista dorsal con pueden observar dientes horizontales y estructuras de importancia en la verticales cuyo número, disposición y forma identificación taxonómica. b. Cibario son característicos y diagnósticos de cada Disposición c. Ascoides en flagelómero especie; otros caracteres importantes en el II. cibario son la presencia de manchas pigmentadas y un arco cibarial que puede estar completo, incompleto o ausente (Figura 3 b).

Tomado de: Young y Duncan, 1994.

Figura 4. Nervación del ala característica de la subfamilia Phlebotominae; se presentan en letras griegas algunas relaciones longitudinales de interés taxonómico.

Tórax Está conformado por pronoto, mesonoto y metanoto, al igual que en otras familias del orden Diptera, estos segmentos pueden dividirse en pleuritos por el paso de una sutura longitudinal en episterno, epimero y mesotórax. De especial interés resulta la venación alar en cuanto a la disposición de las venas radiales y la longitud de segmentos o la totalidad de las venas (Figura 4).

• Abdomen Se encuentra constituido por diez segmentos, los tres últimos modificados para constituir la genitalia. En la genitalia femenina, podemos encontrar un par de 8

espermatecas, que se encuentran constituidas por capsulas tubulares o en forma de saco que se conectan por medio de ductos individuales a un ducto común y adyacente se encuentra una estructura fuertemente esclerotizada conocida como furca genital.

Tomado de: Munstermann, 2005

Figura 5. Espermatecas con estructuras de importancia en la identificación taxonómica.

La morfología y longitud de las espermatecas son de importancia taxonómica a nivel de especie y algunas características permiten la agrupaciones en subgéneros y grupos (espermatecas estriadas y en forma de saco por ejemplo son las principales características de las hembras del grupo verrucarum). La longitud, segmentación y relación de los ductos individuales con respecto al ducto común son de relevancia en la separación taxonómica (Figura 5).

La genitalia masculina está compuesta externamente por: gonocoxito (que varía en cuanto a forma y presencia de tufos de setas); gonostilo que soporta un número variable de espinas accesorias, terminales o subterminales; parámeros, que pueden tener un patrón de inserción de setas, presentar tubérculos o espinas; otras estructuras que proporcionan caracteres taxonómicos son los lóbulos laterales y los cercos que varían en cuanto a longitud y forma (Figura 6a). La genitalia masculina en su anatomía interna, presenta una bomba eyaculadora y unos filamentos genitales de forma y tamaño variable (Figura 6b).

Tomado de Munstermann, 2005.

Figura 6. a. Estructuras externas características asociadas a la genitalia masculina, b. Bomba eyaculadora, aparato genital interno masculino.

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2. ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR FLEBOTOMÍNEOS

Luz Adriana Acosta Cardona Leishmaniasis Es una enfermedad causada por algunas especies de protozoarios pertenecientes a la Familia Trypanosomatidae, del género Leishmania (Ross, 1903), las cuales afectan la piel, mucosas y vísceras. El parásito es transmitido a los humanos o animales a través de la picadura de insectos de los géneros Phlebotomus y Lutzomyia en el Viejo y Nuevo Mundo respectivamente. Según la Organización Mundial de la Salud la incidencia anual de casos se estima entre 1 y 1,5 millones para leishmaniasis cutánea y 500.000 en la visceral (WHO, 1996). Sin embargo, estas cifras se consideran que están subestimadas ya que no es posible determinar el número real de individuos afectados, debido a múltiples factores, culturales, sociales y económicos que conducen al subregistro (Desjeux, 2004). Es endémica en 88 países de Asia, África, Europa y América, con una prevalencia de 12 millones de casos y se calcula que unas 350 millones de personas están en riesgo. En América la enfermedad ha sido descrita como una zoonosis en 24 países, extendiéndose desde el sur de los Estados Unidos (Texas) hasta el norte de Argentina. Sólo Uruguay y Chile parecen estar libres de la enfermedad (Grimaldi et al., 1989). Teniendo en cuenta el desarrollo del parásito en el vector, el género Leishmania se divide en dos subgéneros: Viannia (V.) restringido al nuevo mundo, son aquellas especies conocidas como peripilóricas, que se desarrollan en la región 13

posterior del tubo digestivo del insecto. El subgénero Leishmania (Le.) para las especies suprapilóricas que se desarrollan en la parte media y anterior del tubo digestivo de los vectores (Lainson y Shaw, 1987). Según la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1990) existe una leishmaniasis zoonótica en la cual los reservorios son animales salvajes y domésticos y otra antroponótica, en la que el humano es fuente de infección. Este último está involucrado como reservorio directamente en la forma visceral y cutánea causada por Le. (Le.) donovani y Le.(Le.) trópica, en el Viejo Mundo. Un reservorio, es un sistema ecológico en el cual el patógeno puede mantenerse por mucho tiempo. Estos sistemas comprenden varias especies de vectores y animales que viven bajo las mismas condiciones epidemiológicas, ambientales, de proximidad espacial y densidad poblacional, permitiendo que el patógeno sea transmitido entre ellos (Ashford, 1996). Los principales reservorios de Leishmania pertenecen a diferentes grupos de mamíferos como cánidos, roedores, edentados y primates. (Ashford, 2000). En América, se han incriminado varios reservorios mamíferos que sirven como hospederos de Leishmania, estos son entre otros: Choloepus hoffmani, Metachirus nudicaudatus, Proechimys semispinosus, Didelphis marsupialis, Rattus rattus, Akadon sp. y Choendu sp. (Lainson et al., 1995, Llanos-Cuentas et al., 1999 ; Travi et al., 2002 ; Sinval et al., 2003). En el caso de la Leishmaniasis visceral el reservorio doméstico más importante es el perro (Canis familiaris). En el hombre, la infección presenta diferentes manifestaciones clínicas que difieren en la severidad y en su impacto en la salud, dado que la forma clínica de la enfermedad depende del tejido u órgano infectado y también de la especie del parasito involucrada, y la respuesta inmune del hospedero (Miranda et al., 2005; Vélez et al., 2005). El curso de la infección con las diversas especies de Leishmania es variable. Las formas clínicas de la enfermedad se conocen como leishmaniosis cutánea (LC), leishmaniosis mucosa (LM) y leishmaniosis visceral (LV) o kala-azar. A su vez, la LC se puede presentar en forma localizada o difusa (Vélez et al., 2005). Leishmaniasis cutánea (LC) Es la forma más común de la enfermedad, se caracteriza por lesiones que se forman en el sitio de la picadura, y gradualmente se van transformando en úlceras indoloras que al sanar dejan una cicatriz característica. En promedio, el periodo de incubación varía entre 3 semanas y 2 meses. La úlcera es, por lo general, 14

redondeada, indolora, con bordes bien definidos levantados y cortados en forma de sacabocado e indurada que recuerda la imagen de un cráter. En los primeros meses de evolución, tiende a crecer hasta su tamaño máximo que está en función de la respuesta inmune del huésped y de la especie de Leishmania infectante (INS, 2006). En ocasiones estas se infectan con bacterias, y se produce pus por lo que la lesión se vuelve Figura 7. Leishmaniasis cutánea. Fotografía: PECET dolorosa, o en algunos casos la infección sobreagregada se presenta por hongos como Sporotrix schenkii. Dependiendo de la especie de Leishmania y del estado inmunológico del paciente la ulcera puede curar espontáneamente en meses o años y dejar una cicatriz característica llamada “bulbo de cebolla” (De Almeida et al., 2003; Desjeux, 2004). La LC es causada por especies de Leishmania de los subgéneros Viannia y Leishmania. En las Américas se distribuye desde el sur de los Estados Unidos hasta el norte de Argentina, Canadá, Chile, Uruguay y la mayoría de las islas caribeñas se encuentran libres de transmisión (Arias et al., 1996; Vélez et al., 2005). Leishmaniosis cutánea difusa (LCD) Se caracteriza por la gran cantidad de lesiones nodulares e indoloras por todo el cuerpo, principalmente en la cara y extremidades, debido a la inhibición de la respuesta inmune mediada por linfocitos T específica contra el parásito, lo que facilita su multiplicación y diseminación. Generalmente no cura espontáneamente y es resistente al tratamiento, esta manifestación clínica presenta una incidencia baja, pero se encuentran casos en Brasil, Venezuela, México, Colombia y República Dominicana. Es causada por Figura 8. Leishmaniasis cutánea difusa. especies del complejo Le. mexicana, Fotografía: PECET especialmente Le. (Le.) amazonensis, 15

aunque se han reportado casos aislados debido a otras especies, como Le. (V.) panamensis (Vélez et al., 2005). Leishmaniasis mucosa La forma mucosa o mucocutánea puede presentarse después de meses o inclusive años de haber cicatrizado la forma cutánea o manifestarse aún en presencia de lesiones cutáneas activas. Es muy común que la lesión se manifieste a nivel del septum cartilaginoso del tabique nasal, pero también en otras partes de las vías aéreas superiores. En algunos casos la lesión en las mucosas se presenta sin antecedentes de lesiones cutáneas, lo que sugiere que con la picadura se produjo una infección primaria asintomática que luego se diseminó a las mucosas por invasión vía linfática o sanguínea (Osorio et al., 1998). La evolución de estas lesiones es crónica y pueden persistir durante años (Vélez et al., 2005). Es producida por parásitos del subgénero Viannia, principalmente Le. (V.) Figura 9. Leishmaniasis mucosa. braziliensis y Le. (V.) panamensis. Fotografía: PECET

Leishmaniasis visceral Es la forma más grave de la enfermedad. Los síntomas principales son hepato y/o esplenomegalia, fiebre crónica, anemia, pérdida de peso y palidez de las membranas mucosas. Estos síntomas pueden desarrollarse gradualmente o de forma abrupta. Los órganos más afectados son el bazo, hígado y medula ósea. Afecta principalmente a niños menores de cinco años y está asociada con la desnutrición y puede conllevar a la muerte si no se realiza un tratamiento adecuado. La LV presenta una distribución amplia en América, desde México hasta el norte de Argentina, y la mayor Figura 9. Leishmaniasis visceral. incidencia se presenta en el nordeste de Fotografía: PECET Brasil. El agente etiológico es Leishmania

infantum (=Le. chagasi). Sin embargo, en el viejo mundo además de presentarse Le. infantum, también se encuentra Le. donovani que afecta principalmente a personas adultas; se encuentra en la región oriental de África, India y China. El parásito compromete los órganos hematopoyéticos donde produce cambios similares a los descritos para la LV causada por Le. infantum, excepto por una hiperpigmentación cutánea que se encuentra en estos pacientes por lo que la enfermedad recibe el nombre de Kala-azar o fiebre negra (Vélez et al., 2005). Se considera de gran importancia por presentar un gran impacto en la salud pública al ser responsable de más de 50,000 muertes cada año en el mundo (WHO/TDR, 2004). Además, hasta hace algunos años se consideraba como una enfermedad que ocurría principalmente en áreas rurales, sin embargo este panorama ha exhibido cambios durante los últimos años, pues se han venido presentando casos en áreas urbanas en grandes ciudades del nordeste de Brasil y otros países de Latinoamérica (Soares y Turco, 2003; Lainson y Rangel, 2005; OPS/OMS, 2005). Probablemente este aumento en la distribución de la enfermedad pueda deberse a cambios que están asociados a problemas socioeconómicos que aumentan la migración desde las áreas rurales endémicas a las urbanas, y a cambios en el medio ambiente debido a condiciones ecoepidemiológicas y climáticas propicias por el calentamiento global que favorecen la multiplicación del agente etiológico y del vector (OPS/OMS, 2005). Leishmaniasis visceral y VIH En ciertas zonas endémicas de leishmaniasis, tales como la India, el Este de África o la Cuenca Mediterránea, se ha producido en las últimas décadas la coinfección leishmania - HIV, que parece estar aumentando debido a dos factores: por un lado, la pandemia de SIDA se está extendiendo hacia áreas rurales y suburbanas en muchos países en vías de desarrollo y, por otro, la leishmaniasis está alcanzando el ámbito urbano en dichas zonas. De esta manera, se espera que en un futuro los casos de coinfección por VIH y Leishmania a nivel mundial aumenten (Nuno Marques et al., 2007). Como enfermedad oportunista en pacientes inmunodeprimidos su historia natural se ve alterada, retrasándose su diagnóstico, empeorando la efectividad del tratamiento médico y aumentando las recidivas. A principios de los años 90 hubo un aumento alarmante de los casos de coinfección VIH-Leishmania que cedió a finales de la misma década por la introducción de los nuevos medicamentos antirretrovirales (Pasquau et al., 2005).

Tratamiento de la Leishmaniasis Hay diferentes factores que influyen en la evolución de la enfermedad y condicionan la terapia a seguir y su eficacia. Entre estos se encuentra la especie del parásito, el grado de susceptibilidad al tratamiento, la inmunidad de los pacientes y su estado nutricional, entre otros (Alvar, 2001). El tratamiento de las diferentes formas clínicas de la leishmaniasis se realiza con los mismos compuestos: Antimoniales pentavalentes, Pentamidina y Anfotericina B, pero difieren en la posología y ruta de administración. En la Tabla 1 se muestra la dosificación para cada medicamento (Vélez et al., 2005).

Otros patógenos transmitidos por los flebotomíneos Algunas especies de flebotomíneos son vectores de agentes infecciosos causantes de Bartonellosis y varias enfermedades arbovirales. Adicionalmente, su picadura puede producir reacciones alérgicas en la piel de las personas, conocida para muchos autores como “harara” (Theodor, 1935). La bartonellosis (enfermedad de Carrión, Fiebre Oroya, Verruga peruana) es causada por la bacteria Bartonella baciliformis (Schultz, 1968). Esta actualmente restringida a los Andes Peruanos y algunas áreas especificas de Ecuador. L. verrucarum ha sido implicada como vector. Poco se sabe sobre el ciclo de vida de B. bacilliformis fuera del huésped humano. La fiebre de flebótomo, es una fiebre aguda inespecífica, que se caracteriza por fuertes dolores de cabeza, fiebre, mialgia, postración y, es causado por una serie de distintos virus pertenecientes a la familia Bunyaviridae, género Phlebovirus (Tesh, 1988). Es más común en el Medio Oriente y Asia Central; donde Phlebotomus papatasi es el principal vector. Muchos de los flebovirus son transmitidos transovaricamente (verticalmente) en sus hospederos e invernan en larvas en diapausa (Tesh, 1988; Tesh et al., 1992). Algunos flebotomíneos también han sido implicados como vectores de varios virus de la estomatitis vesicular en el serogrupo (familia Rhabdoviridae; género Vesiculovirus). Algunos de los virus en este grupo causan enfermedades en animales domésticos, así como en los humanos (Comer y Tesh,1991).

Tabla 1. Principales drogas utilizadas en el tratamiento de la leishmaniasis Tratamiento

Medicamento

Dosis

Observaciones

Antimonio pentavalente v (Sb )

Antimoniato de meglumina ® (Glucantime ) Estibogluconato de sodio (Pentostam®)

20mg de antimonio v pentavalente (Sb )/Kg de peso al día durante 20 para la LC y durante 28 días para la LM y LV.

Medicamento de primera elección

Anfotericina B

Anfotericina B libre Formulaciones lipidícas como el ® AmBisome

Comienza con una dosis de ataque de 5 a 10 mg que aumenta progresivamente en 5 a 10 mg/día hasta alcanzar una dosis de 0,5 a 1 mg/Kg.

Medicamento de segunda elección en caso de toxicidad y resistencia a antimoniales

Pentamidina

Análogo derivado aromático de la diamidina

Dosis intramuscular: 4 mg/kg interdiario por 4 a 6 dosis presentando eficacia similar a los antimoniales pentavalentes para el tratamiento de la LC.

Medicamento de segunda elección

Miltefosina

Análogo de la fosfocolina con actividad antiproliferativa

Administración oral: 100 a 150 mg por día durante 28 días.

Medicamento de segunda elección

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3. ASPECTOS DE LA ECOLOGÍA Y FISIOLOGÍA DE LOS FLEBOTOMÍNEOS

Karina Mondragón Shem

Cada vector posee adaptaciones fisiológicas que son necesarias para adquirir y transmitir parásitos, al igual que comportamientos especializados que permiten localizar tanto sus fuentes de alimento, como miembros de la misma especie durante los periodos de reproducción. Este capítulo describe las características fisiológicas generales de los flebotomíneos como la alimentación y la búsqueda de hospedero, además de la interacción vector-parásito.

Alimentación Alimentación con azúcares Como muchos dípteros hematófagos, los flebotomíneos adultos requieren de una fuente de carbohidratos para sus actividades. Es un nutriente consumido por machos y hembras, aunque estas últimas requieren adicionalmente de la sangre de vertebrados para desarrollar sus huevos (Tang y Ward, 1998). Por lo general los flebotomíneos eclosionan con muy pocas reservas de energía para el vuelo y supervivencia, y la alimentación con azúcares debe ocurrir durante los primeros días. Sin una alimentación de carbohidratos, los machos sobreviven 2-3 días y las hembras 3-5 días (Zhou et al., 2004), y este es un tiempo insuficiente para producir descendencia exitosa. En la naturaleza, ambos sexos obtienen energía de los 22

azúcares encontrados en la savia de plantas y frutas maduras (Chianotis, 1974), y en algunos casos se ha reportado que pueden obtener los carbohidratos de las sustancias azucaradas que producen los áfidos [Aphis sp.] (Killick-Kendrick y KillickKendrick, 1987; Wallbanks et al., 1990). Una vez el flebotomíneo se alimenta de solución azucarada, la cual contribuye al desarrollo de los parásitos en el intestino y facilita su transmisión ésta es transportada al divertículo, el cual funciona como un órgano de almacenamiento y esterilización de los carbohidratos ingeridos (Young et al., 1980; Schlein y Warburg, 1986). El divertículo es normalmente considerado un órgano inerte recubierto con una cutícula, y por lo general no se producen enzimas digestivas para los azúcares consumidos. Sin embargo, se ha demostrado una ingestión de saliva en los flebotomíneos al tiempo que toman el azúcar, lo cual sugiere que la digestión puede iniciar desde este momento (Cavalcante et al., 2006). Adicionalmente, la presencia de amilasa en el divertículo de Lu. longipalpis puede deberse a la ingestión de saliva (Ribeiro et al, 2000a). Búsqueda, alimentación y digestión de sangre El proceso de alimentación de sangre se realiza bajo la influencia de atrayentes y repelentes que determinan el hospedero del cual se alimentará el insecto, que estimulan el inicio y continuación de la alimentación (Travi y Montoya, 1994). Entre los atrayentes se encuentran ciertos olores característicos de algunos animales, el CO2 y el calor (Hamilton y Ramsoondar, 1994). También se ha reportado atracción de los estos insectos hacia colores oscuros (Galati et al., 2001). Los flebotomíneos pueden alimentarse de un amplio rango de hospederos vertebrados, incluyendo aves, reptiles y mamíferos (Travi y Montoya, 1994). El aparato bucal de estos insectos está compuesto por la mandíbula, la maxila y el labro, que son estructuras delgadas, terminando en una punta y envueltas por el labio. Al momento de picar, el flebotomíneo ubica la punta del labio en la superficie de la piel del hospedero, corta y expone capilares superficiales y luego ingiere sangre a través de un canal alimenticio central (Black y Kondratieff, 2005). Este tipo de alimentación donde se crea una acumulación de sangre en la superficie de la piel se conoce como telmofagia. La saliva de los insectos hematófagos posee productos farmacológicamente activos que alteran los sistemas hemostáticos, inflamatorios e inmunes del hospedero (Valenzuela, 2005), con el objetivo de hacer más efectivo el proceso de alimentación al interrumpir los procesos de homeostasis en la sangre y reparación 23

de tejidos. Para los insectos del género Lutzomyia, se encuentran reportados 5 componentes salivales (Tabla 2). Tabla 2. Componentes salivales de los flebotomíneos del género Lutzomyia

Componente

Función

Referencia

5'-nucleotidasa

Convierte el AMP en adenosina, la cual posee fuertes propiedades antiplaquetarias y vasodilatadoras.

Ribeiro et al., 2000b.

Adenosin deaminasa

Anestésico que puede disminuir o atenuar el dolor en el hospedero causado por la picadura del flebotomíneo.

Charlab et al., 2000.

Apirasa

Vasodilatador que impide agregación plaquetaria facilitando la ingestión de la sangre.

Charlab et al., 1999.

Hialuronidasa

Contribuye a la difusión de agentes antihemostásicos en los alrededores de la picadura.

Ribeiro et al., 2000c; Volfova et al., 2008.

Maxadilan

Generalmente equivale a 1-2% de la proteína total en la saliva. Actúa como un vasodilatador y posee propiedades inmunomoduladoras.

Charlab et al., 1999 ; Milleron et al., 2004.

Una vez el alimento es ingerido, llega al intestino medio donde es rodeado por una estructura a modo de “bolsa”, la matriz peritrófica (MP). Esta estructura está presente en la mayoría de los insectos, y se clasifica en dos tipos: MP1 y MP2. La MP2 ocurre principalmente en el estadio larval de algunos insectos, mientras que la MP1 se presenta en adultos, y es una estructura quitinosa que envuelve la ingesta de sangre a lo largo del intestino, separándolo del epitelio intestinal (Devenport y Jacobs-Lorena, 2005). El papel de la MP incluye proteger el lumen intestinal del daño mecánico causado por las partículas de alimento (Berner et al., 1983), el aislamiento de los procesos digestivos actuando como una barrera para las enzimas (Miller y Lehane, 1993; Secundino et al., 2005) y la protección contra posibles patógenos ingeridos (Devenport y Jacobs-Lorena, 2005). La digestión de la sangre se realiza por medio de enzimas que son producidas en el intestino medio y depende de tres factores principales: pH, capacidad de tampón y 24

potencial redox. Posterior a la alimentación, la matriz peritrófica es degradada y desechada con los restos no digeridos del alimento (Secundino et al., 2005). La sangre de los vertebrados es un alimento nutricionalmente único. Las proteínas constituyen el 20% del peso líquido de la sangre, y a partir de los aminoácidos de estas proteínas, el insecto puede sintetizar las reservas de lípidos y carbohidratos involucradas en la producción de los huevos (Pennington y Wells, 2005).

Reproducción Los machos de los generalmente eclosionan un día antes que las hembras, ya que en este momento su genitalia se encuentra inadecuadamente posicionada para la cópula, y por lo tanto deben esperar un tiempo, en el cual dichas estructuras rotan 180°. La rotación comienza luego de la eclosión y es controlada por la maduración de los músculos adyacentes, permitiendo que la genitalia del macho pueda acoplarse apropiadamente con la de la hembra al momento del apareamiento (Klowden y Zwiebel, 2005). Las hembras eclosionan aproximadamente 24h después, y comienzan a buscar un hospedero del cual alimentarse y machos para inseminarlas. El apareamiento tiene lugar en grupos conocidos como leks. En los leks, los machos se agregan y defienden territorios en sitios que las hembras normalmente visitan, con el fin de aumentar su probabilidad de aparearse (Jones y Quinnell, 2002). Las agregaciones se forman generalmente al atardecer, cerca de los hospederos donde las hembras se alimentan (Quinnell y Dye, 1994). Entre los semioquímicos más importantes se encuentran las kairomonas liberadas por el hospedero, las cuales funcionan a favor del flebotomíneo guiándolos hasta su fuente de alimento, y las feromonas producidas por los machos (Kelly y Dye, 1997). Algunos experimentos han demostrado que las feromonas de cortejo juegan un papel importante en el éxito reproductivo del macho, ya sea como un precursor determinando la aceptación del macho por parte de la hembra, o directamente incrementando la posibilidad de que el macho pueda copular (Jones y Hamilton, 1997). Tanto los machos como las hembras producen sonidos durante el proceso de apareamiento, sin embargo, durante la cópula únicamente el macho produce vibraciones con las alas (de Souza et al., 2002). Una vez ambos sexos entran en contacto inician una compleja secuencia de comportamientos que lleva a la inseminación. Entre los diferentes comportamientos físicos involucrados en la 25

cópula, el macho sujeta a la hembra e introduce su aedago en ella para depositar esperma y secreciones en la bursa copulatrix (Klowden y Zwiebel, 2005). El esperma es almacenado en la espermateca de la hembra, donde permanece hasta la fertilización de los huevos justo antes de la oviposición (Travi y Montoya, 1994). Una sola inseminación es suficiente para que la hembra pueda fertilizar sus huevos durante toda su vida.

Relación Vector-Parásito El ciclo de vida de Leishmania involucra una alternancia entre un hospedero mamífero y un organismo invertebrado, un flebotomíneo. En el mamífero, la biología del parásito es relativamente sencilla y es inoculado en la piel a través la picadura de un flebotomíneo infectado. La forma infectiva o promastigotes metacíclicos son fagocitados por los macrófagos y se transforman en amastigotes intracelulares, permaneciendo en esta forma dentro del hospedero mamífero (Killick-Kendrick, 1990). En contraste, la biología del desarrollo del parásito en el flebotomíneo, es más compleja y menos conocida. El flebotomíneo ingiere amastigotes al alimentarse de la sangre de un vertebrado infectado, y estos se dividen al interior del intestino del vector. Rápidamente se transforman en promastigotes los cuales continúan dividiéndose (Ashford, 2000). Se pueden observar diferencias en el patrón de desarrollo para aquellas especies que son infectivas para los mamíferos. Algunas especies normalmente incluyen una fase de desarrollo en el intestino posterior del flebotomíneo (desarrollo peripilórico) y se encuentran clasificados en un subgénero separado, Leishmania (Viannia). Evolutivamente, se considera que el desarrollo peripilórico es un carácter ancestral, y estas son especies exclusivamente del Nuevo Mundo (Bates y Rogers, 2004). Los miembros del subgénero Leishmania se desarrollan exclusivamente en el intestino medio de sus vectores (desarrollo suprapilórico), e incluye parásitos tanto del Nuevo Mundo y Viejo Mundo (Gossage et al., 2003; Bates y Rogers, 2004). Aproximadamente tres días luego de la alimentación, el insecto expulsa los restos de la ingesta sanguínea, y los parásitos no adheridos son evacuados. Sobreviven aquellos parásitos que pueden anclarse por medio del flagelo a las microvellosidades del intestino medio (especies suprapilóricas), o posterior 26

(especies peripilóricas). Como es reportado por Bates y Rogers (2004), se estima que los parásitos atraviesan 5 estadios importantes durante su desarrollo en el interior del flebotomíneo vector: • Amastigotes: representan la forma infectiva para el vector. La infección ocurre a través de la ingesta de macrófagos infectados. Son pequeños, intracelulares y carecen de un flagelo desarrollado. Una vez los macrófagos se deshacen horas después de la alimentación, los amastigotes comienzan a transformarse en promastigotes procíclicos. • Promastigotes procíclicos: es el primer gran evento de la metaciclogénesis (Bates y Rogers, 2004). Esta forma es descrita como corta, elipsoide con un flagelo corto y muy poca movilidad, con frecuencia encontrados en grupos, formando rosetas en el alimento sanguíneo. • Promastigotes nectomonados: presentan una forma elongada presentan una alta movilidad y se acumulan en la parte anterior de la membrana peritrófica, dispuestos a migrar hacia la parte anterior del intestino. Para poder establecerse adecuadamente, los parásitos deben salir de la membrana peritrófica y adherirse al epitelio intestinal. Son una forma no replicativa del parásito (Bates y Rogers, 2004). • Promastigotes leptomonados: aproximadamente de 3 a 7 días después de la ingesta sanguínea ocurre la transformación de promastigotes nectomonados a leptomonados, y estos son acumulados en el intestino medio. La principal función de los promastigotes leptomonados es producir una sustancia gelatinosa, el gel secretorio de los promastigotes (GSP), el cual juega un importante papel en la transmisión del parasito a un hospedero vertebrado. La gran mayoría de los promastigotes leptomonados se encuentran embebidos en el GSP, aparentemente de manera fija, pero con una alta movilidad. • Promastigotes metacíclicos: es la diferenciación final de los promastigotes a la forma que es infectiva para los hospederos vertebrados. Se pueden observar luego del quinto día de la alimentación sanguínea, y son altamente móviles. Es posible observarlos en el lumen de la parte anterior del intestino medio o el intestino anterior, en posiciones que faciliten su transmisión durante la próxima alimentación sanguínea del vector. 27

Gracias a sus componentes (Tabla 1), la saliva del flebotomíneo puede influenciar la infectividad del parásito en el hospedero. En 1988, Titus y Ribeiro demostraron que la saliva de los flebotomíneos exacerba los efectos de la fase inicial de las infecciones con Leishmania en términos de la carga parasitaria y el tamaño de la lesión cutánea. A partir de experimentos realizados con los diferentes componentes de la saliva como el maxadilan (Milleron et al., 2004) y la hialuronidasa (Volvofa et al., 2008), han descubierto que las propiedades inmunomoduladoras de estos impiden que las defensas del hospedero actúen adecuadamente para protegerse de los parásitos facilitando su dispersión. En la naturaleza, la prevalencia de infección de los flebotomíneos puede ser muy baja incluso en áreas de endemicidad y alta transmisión, por lo cual el éxito de transmisión del parásito depende de estrategias adicionales que pueda implementar para asegurar dicha transmisión. El gel secretado por promastigotes (GSP) es un potente factor de virulencia, que junto con la saliva del flebotomíneo, potencia significativamente las infecciones cutáneas cuando son transmitidas en conjunto a la piel del mamífero hospedero. Para hacer más eficiente la transmisión del patógeno, el parásito Leishmania también puede modificar considerablemente el ambiente del intestino del insecto dañando la válvula estomodeal, y físicamente bloqueando el intestino con GSP. La combinación de estos dos eventos resulta en el bloqueo del intestino medio con un tapón de promastigotes de Leishmania y su gel, lo cual distiende y permanentemente mantiene abierta la válvula ya erosionada. El resultado de este bloqueo es la interferencia de la alimentación al limitar el volumen de sangre que puede obtener el insecto, causando que perfore la piel una mayor cantidad de veces y pasar más tiempo alimentándose.

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4. CARACTERÍSTICAS ECOLÓGICAS DE FOCOS DE TRANSMISIÓN

Carolina Torres Gutiérrez Horacio Cadena Peña

La gran diversidad ecológica y biológica que caracteriza a los países del Nuevo Mundo, conduce a una multiplicidad de complejas situaciones epidemiológicas. Es así como la presencia de un gran número de especies vectores, la variedad de reservorios putativos y la diversidad de hábitats convergen para producir las condiciones óptimas para una eficiente transmisión de Leishmania. Aunque se reconoce que la ocurrencia de casos de leishmaniasis está determinada por la presencia del vector, es ampliamente aceptado que es una enfermedad esencialmente de transmisión focal y su dinámica es diferente entre los lugares de ocurrencia, debido a variables relacionadas con los parásitos, vectores, ecosistemas y la actividad humana. Esta nueva dinámica de la enfermedad está asociada a factores sociales como: • La creación no planificada de asentamientos o comunidades próximas a zonas selváticas o boscosas. • El desplazamiento forzado de personas provenientes de zonas endémicas a la periferia de las ciudades acompañado de animales domésticos o silvestres infectados. • Las características de la vivienda de estas poblaciones marginadas que permiten la entrada de flebotomíneos antropofílicos.

• El comportamiento y hábitos de los humanos que inciden en el contacto con flebotomíneos. • Edad, características nutricionales, inmunes y de ocupación de la población local. Se entiende por foco de transmisión el espacio geográfico donde incide de forma continua, una enfermedad. Para el caso en particular, un foco de transmisión de leishmaniasis es el área geográfica donde simultáneamente co-habitan parásitos (Leishmania spp.), los vectores (Lutzomyia spp.), los reservorios (mamíferos) y los humanos. Generalmente, las áreas geográficas donde ocurren los casos, reúnen algunas características ecológicas que facilitan el ciclo de la enfermedad, tales como: tipo de vegetación, clima local, fauna silvestre, actividades agrícolas de la región, animales domésticos en el peridomicilio (Davies et al., 2000).

Ciclos de transmisión de la Leishmaniasis Ciclo selvático Entre los ciclos de transmisión de la leishmaniasis, el ciclo selvático es el mejor comprendido, donde la transmisión de la enfermedad ocurre a lo largo de todo el año (Vélez et al., 1997) y su incidencia está determinada por el contacto del humano con los focos naturales, asociado a actividades como la extracción de madera, la minería, construcción de viviendas, carreteras, etc. El riesgo de adquirir la infección al ingresar en este hábitat estará determinado por: 1) la abundancia e infectividad del vector 2) el comportamiento antropofílico de los vectores 3) hábito alimenticio durante el día de los vectores 4) la abundancia de los hospederos infectados. En Colombia, se han incriminado como reservorios selváticos de Leishmania sp. a: Choloepus hoffmani (Loyola et al., 1988), Bradypus griseus (Corredor et al., 1990), algunos canidos del género Procyon. (mapache o zorra manglera) y roedores del género Proechimys. La transmisión en el ciclo selvático ocurre a lo largo de todo el año (Vélez et al., 1997). Ciclo rural Se presenta en comunidades o poblaciones con actividades agrícolas cercanas a zonas selváticas intervenidas o bosques deforestados. Estos cambios en el ambiente han generado procesos de adaptación de los flebotomíneos al ambiente peridomiciliar, es decir, en este ciclo los vectores ingresan a viviendas rurales 33

buscando al hombre como fuente sanguínea (Vélez et al., 1991; Moreira et al., 2003). La reproducción de los vectores puede ocurrir en lugares cercanos a las viviendas, también alimentándose de animales domésticos y roedores sinantrópicos. Estos cambios en la bionomía de los flebotomíneos han facilitado su interacción con miembros del núcleo familiar, produciendo nuevos casos de leishmaniasis en mujeres y niños (Ampuero et al., 2005). Algunos reservorios en Colombia, de importancia en este ciclo de transmisión podrían ser los responsables del mantenimiento y diseminación del parásito en el ambiente peridoméstico: Melanomys caliginosus (ratón silvestre), Microryzomys minutus (ratón enano), Ratus rattus, Sylvilagus braziliensis, Didelphis marsupiales, Micoureus demerarae (Alexander et al., 1998), Canis familiaris (Reithinger y Davies, 1999) y el hombre (Montoya-Lerma et al., 1998). Ciclo urbano Uno de los principales factores de riesgo para la leishmaniasis es el fenómeno mundial de urbanización, muy relacionado con un drástico aumento en la migración. Este fenómeno contribuye en gran medida a la persistencia de la carga de la enfermedad, especialmente en los focos antroponóticos del viejo mundo donde las especies de flebotomíneos, se encuentran en una densidad elevada en áreas peridomiciliarias e intradomiciliarias (Desjeux, 2002). En los focos zoonóticos, en el Nuevo Mundo, el nivel de transmisión intradomiciliaria se ha relacionado estrechamente con la poca distancia de las viviendas suburbanas a los relictos de bosques secundarios, en los que convergen flebotomíneos y animales selváticos (Didelphis marsupialis) adaptados al ambiente peridomiciliar e infectados con Leishmania (Santamaría et al., 2006). En algunos países Suramericanos como Brasil, Colombia y Venezuela se han registrado casos de leishmaniasis en varias zonas urbanas lo cual supone la evidencia de un ciclo de transmisión doméstica urbana (Vélez et al., 2001; Bejarano et al., 2002).

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5. INCRIMINACIÓN DE ESPECIES VECTORES

Raúl Leonardo Rocha Orjuela

La primera evidencia real de una enfermedad que afectaba al hombre y que su vez tenía desarrollo obligatorio en un insecto, ocurrió hace más de cien años, momento en el cual se consideró justificable el inicio de la entomología médica. Con el inicio de esta rama del conocimiento se hizo necesaria la creación de términos propios para esta disciplina. Aparece entonces el término vector que hace referencia a aquel organismo que transmite el patógeno de un hospedero a otro. Para todas las enfermedades incluidas en la Entomología Médica, los vectores son artrópodos (Eldridge y Edman, 2003). Debido a la importancia de los flebotomíneos en su papel de vectores de agentes patógenos, se hace necesario establecer el papel que juega una especie determinada o población en la transmisión de un agente infeccioso de una enfermedad particular, lo que se conoce como incriminación (Eldridge y Edman, 2003). Se han utilizado otros términos para referirse a las relaciones entre el patógeno que produce la enfermedad y el artrópodo transmisor, como es el caso de la palabra asociación, que señala el vínculo existente entre la presencia de especies de Leishmania, en una localidad dada y los flebotomíneos capturados en el mismo sitio; es el caso de la asociación encontrada entre Lutzomyia colombiana con un foco de leishmaniasis, en Samaniego (Colombia), debido a la ocurrencia de especies del complejo Leishmania mexicana (Montoya-Lerma et al., 1999). De igual forma, en estudios sobre epidemiología de leishmaniasis se han empleado los 36

términos: vector confirmado y vector naturalmente infectado. En el primer caso, se logra el aislamiento del agente patógeno a partir de flebotomíneos de una especie capturada, pero adicionalmente, se confirma con el cultivo de aislados de humanos y animales examinados; finalmente la infección con el patógeno es confirmada mediante ciertas herramientas bioquímicas y/o moleculares (Corredor et al., 1989). Por el contrario, un vector infectado naturalmente, corresponde al hallazgo de flagelados en el intestino de individuos de una especie capturados en campo (Corredor et al., 1990). En América, existen más de 350 especies de flebotomíneos diferentes, pero solo 17 han sido encontradas infectadas naturalmente y/o confirmadas como vectores de leishmaniasis (Laboratoire D'informatique et De Systématique, 1997) (Tabla 3). En Colombia, la mayor parte de las especies se encuentran en la región de la Orinoquía y Amazonía; en estas regiones se reúne el 64 % del total de las especies registradas para el país (Vásquez-Trujillo et al., 2008). Particularmente, en el departamento del Meta se llevó a cabo la primera notificación de especies de flebotomíneos para Colombia (Antunes, 1937). A pesar del gran número de especies de flebotomíneos registradas y de los hábitos antropofílicos de la mitad de sus integrantes (Young y Arias, 1991; Alexander et al., 1992; Young y Duncan, 1994; Ferro y Morales, 1998), únicamente seis especies han sido incriminadas como vectores en nuestro país (Tabla 4). Adicionalmente, se han reportado seis especies con antecedentes que señalan su capacidad vectorial: Lu. davisi, Lu. hirsuta hirsuta, Lu. yuilli, Lu. antunesi, Lu. gomezi y Lu. panamensis (Antunes, 1937; Montoya-Lerma y Ferro, 1998; Bejarano, 2006; Vásquez et al., 2007). A pesar de estos hallazgos, los estudios sobre incriminación en cada foco son escasos (Ferro y Morales, 1998; Barreto et al., 2000), lo que dificulta las acciones de prevención y control. Es de suma importancia por tanto, profundizar en el estudio de los flebotomíneos, que además de poseer gran complejidad taxonómica, también difieren en el papel que cumplen diferentes especies en la transmisión de Leishmania spp. Es relevante definir los términos con que se hace referencia a la capacidad vectorial de las especies, además de determinar su papel en la transmisión del parásito. Los criterios más aceptados para incriminar una especie de flebotomíneo, como vector comprobado de Leishmania, han sido propuestos por Killick - Kendrick (1990) y se resumen en los cuatro puntos siguientes: • La especie debe tener comportamiento antropofílico 37

• Estar presente en la localidad donde se transmite la enfermedad y durante la estación apropiada • Que el parásito aislado del vector en una zona endémica sea la misma especie que se encuentra circulando en las personas afectadas • Debe infectarse con facilidad en estudios de laboratorio y ser capaz de transmitir el parásito a un mamífero susceptible. Otros factores como la preferencia alimenticia sobre un reservorio, longevidad, estacionalidad, la frecuencia de picadura y su presencia en un foco determinado, también son importantes para su incriminación (Killick-Kendrick, 1990). Sin embargo, la abundancia aparente de una especie no es por si misma suficiente para incriminarla como vector. Mientras que algunas poblaciones de vectores son más pequeñas, otras parecen tener un período muy corto para mantener la circulación de una especie de Leishmania. Las posibles explicaciones para estas contradicciones incluyen deficiencias en el muestreo o diferencias en la longevidad de las especies, así como se relacionan con la frecuencia de picadura (KillickKendrick, 1990). En la práctica existen varios factores que hacen de la incriminación de especies vectores una tarea compleja. La leishmaniasis es causada por un amplio rango de parásitos, este hecho sumado a la complejidad en la taxonomía hacen aún más difícil la decisión sobre la responsabilidad de la transmisión de una u otra especie en una localidad determinada (Killick-Kendrick, 1990). Además, se presentan problemas técnicos asociados al trabajo en campo como la obtención de personal auxiliar que colabore con distintas tareas en los sitios de captura, difícil acceso al foco, dificultad para identificar los parásitos y la falta de personal capacitado para la identificación de flebotomíneos (Travi y Montoya-Lerma, 1994). En muchas ocasiones, es necesario disecar muchos flebotomíneos para encontrar una muestra infectada. Esta labor no ofrece una idea de la verdadera tasa de infección ya que es probable que los flebotomíneos no hayan ingerido sangre (especie nulípara). Existe entonces la necesidad de una forma simple y rápida, que permita el reconocimiento de hembras que hayan ingerido sangre y así expresar las tasas de infección de flebotomíneos que hayan tenido al menos una alimentación sanguínea (Killick-Kendrick, 1990).

Tabla 3. Flebotomíneos infectadas naturalmente y/o confirmadas como transmisoras de especies de Leishmania en América (Laboratoire D'informatique et De Systématique 1997. http://cipa.snv.jussieu.fr/ ). Especie Lu. wellcomei Lu. yucumensis Lu.llanosmartinsi Lu. Spinicrassa Lu. ylephiletor Lu. panamensis Lu. ovallesi Lu. whitmani

Leishmania spp.

Procedencia

Referencia

Laison et al., 1973; Le Pont y Desjeux, 1986; Bermudez et al., 1987; Ryan et al., 1987; Young et al., 1987; Grimaldi et al., 1989; Corredor et al., 1990; Grimaldi et al., 1991; Rowton et al; 1991.

Le. braziliensis

Bolivia, Brasil, Colombia, Venezuela, Guatemala

Le. guyanensis

Le Pont y Pajot, 1980; Arias et al., 1985; Pajot et al., 1986; Ready et al., Brasil, Colombia, 1986; Ryan et al., 1987; Young y Guyana Morales, 1987; Grimaldi et al., 1989; Francesa Corredor et al., 1990; Grimaldi et al., 1991.

Lu. trapidoi Lu. gomezi Lu. ylephiletor Lu. panamensis

Le. panamensis

Christensen et al., 1983; Murillo y Colombia, Costa Zeledón, 1985; Young et al., 1987; Rica Panamá Grimaldi et al., 1989; Corredor et al., 1990.

Lu.squamiventris squamiventris Lu. intermedia

Le. naiffi. Le braziliensis

Brasil

Lu. hartmanni

Le. colombiensis Colombia

Lu.olmeca olmeca Lu. ylephiletor

Le. mexicana

Belize, México

Lu. flaviscutellata

Le. amazonensis

Tikasingh, 1975; Arias et al., 1985; Brasil, Trinidad y Dedet et al., 1985; Ryan et al., 1987; Tobago, Guyana Grimaldi et al., 1989.

Lu. longipalpis

Le. chagasi

Bolivia, Brasil, Argentina Colombia, Venezuela

Deane, 1956; Lainson et al., 1985; Le Pont y Desjeux, 1985; Corredor et al., 1989; Grimaldi et al., 1989; Corredor et al., 1990; Travi et al., 1990.

Lu. evansi

Le. chagasi

Colombia, Venezuela

Travi et al., 1990; Feliciangeli et al., 1999

Lu. umbratilis Lu. anduzei Lu. whitmani

Naiff et al., 1991. Rangel et al., 1984. Kreutzer et al., 1991. Williams, 1970; Grimaldi et al., 1989.

Normalmente, los procedimientos para la identificación de parásitos en insectos de campo van desde la disecación de los flebotomíneos hasta técnicas más sensibles como la detección del ADN del parásito, utilizando flebotomíneos capturados en campo. La tipificación bioquímica de los parásitos y la taxonomía sin duda han contribuido a clarificar el papel de algunos vectores (Killick-Kendrick, 1990). Tabla 4. Especies de Lutzomyia implicadas en la transmisión de Leishmaniasis en Colombia.

Vector

Parásito

Referencia

Lu. longipalpis

Le. infantum (= Le. chagasi)

(Corredor et al., 1989; Corredor et al., 1990)

Lu. evansi

Le. Infantum (= Le. chagasi)

(Travi et al., 1990)

Lu. spinicrassa

Le. braziliensis

(Young et al., 1987; Corredor et al., 1990)

Lu. trapidoi

Le. panamensis

(Young et al., 1987; Corredor et al., 1990)

Lu. umbratilis

Le. guyanensis

(Young et al., 1987; Corredor et al., 1990)

Lu. hartmanni

Le. colombiensis

(Kreutzer et al., 1991)

A continuación, se detallan los métodos empleados para la incriminación de flebotomíneos.

Disecación de flebotomíneos y cultivo de parásitos Los flebotomíneos capturados en campo deben ser transportados vivos, debidamente marcados y empacados, utilizando cajas de icopor para mantener las condiciones de temperatura y humedad similares a las encontradas en los sitios de captura (Travi y Montoya Lerma, 1994). En el laboratorio, se deben sacrificar los especímenes con ayuda de éter, cloroformo o en frío, antes de la disecación. Es necesario emplear materiales e instrumentos estériles para evitar la 40

contaminación, estos materiales incluyen: láminas portaobjetos, cubreobjetos, solución fisiológica, jeringas, pinzas entomológicas y agujas de disección. Seguidamente, haciendo uso de un estereoscopio y con el insecto sobre la lámina portaobjetos se separa la cabeza del insecto; luego se hace un corte en los últimos tres segmentos del abdomen y simultáneamente, se presiona hacia el lado opuesto a los segmentos, muy suavemente. Este procedimiento permite la obtención del intestino el cual se transfiere a una gota de solución fisiológica y se cubre con un portaobjetos. Se examina bajo el microscopio compuesto, buscando la presencia de parásitos en la parte anterior del intestino. En caso de obtener un resultado positivo, se puede transferir los parásitos a diferentes medios de cultivo (Medio de Evans, Medio Bifásico Agar sangre: Medio NNN y Medio USMARU, medio agar sangre DIFCO, Medio Schneider Drosophila, GIBCO). Al transferir los parásitos obtenidos de la disecación, puede ocurrir contaminación del medio de cultivo, por esta razón, se recomienda inocular animales mantenidos en laboratorio (Hámsters), para llegar posteriormente a la identificación de la especie mediante pruebas bioquímicas o moleculares, una vez dicho animal haya manifestado lesiones (Corredor et al., 1989).

Anticuerpos monoclonales Este método se ha utilizado en el Nuevo Mundo (Shaw et al., 1987). Los flagelados obtenidos por el método de disecación se fijan en láminas con ayuda de acetona. Una vez ocurra esto, se pueden almacenar a -70°C. Las láminas se incuban con anticuerpos monoclonales a temperatura ambiente empleando un conjugado antiIgG de ratón marcado con fluoresceína, si los anticuerpos monoclonales fueron preparados en ratones. Luego de esto, las láminas se lavan con PBS y se examinan bajo el microscopio de fluorescencia. Si los monoclonales se fijaron a los parásitos, entonces se podrá observar el colorante en las superficies. La desventaja de este método consiste en el volumen de información preliminar sobre los parásitos que puedan encontrarse en el foco y sus propiedades de fijación a un rango de monoclonales, muchos de ellos no se fijan a todos los estadios del parásito encontrados en el vector (Travi y Montoya Lerma, 1994). Aun siendo una metodología utilizada en la incrimación de especies vectores, actualmente ha perdido vigencia no solo por considerarse antigua, sino por las bajas tasas de infección y el gran número de anticuerpos que se deben emplear.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Este método utiliza la replicación del ADN para amplificar el material genético presente en la muestra, de tal forma que se pueden detectar cantidades muy pequeñas. Ofrece la ventaja de producir un gran número de copias de ADN y se ha utilizado en estudios entomológicos con diferentes fines (Cabrera et al., 2002). El método se basa en homogenizar los flebotomíneos almacenados y extraer el ADN. Para la extracción, el método del fenol cloroformo se describe con más frecuencia (Barrios et al., 1994; Mukherjee et al., 1997; Rodriguez et al., 1997). Sin embargo, existen otros métodos como la cromatografía de intercambio iónico (Pirmez et al., 1999) y extracción con Chelex 100 (Schriefer et al., 1991). Esta última técnica ha sido trabajada al 5% del ADN de Leishmania (Sandoval et al., 1999). También se utiliza para este fin soluciones de lisis o mediante kits comerciales (DNAeasy Kit, QUIAGEN® o kit de purificación de DNA Geonómico, FERMENTAS). Posteriormente, se realiza la detección de Leishmania spp. mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para la amplificación se han utilizado iniciadores como aquellos que son específicos para la región conservada de los minicírculos del ADN, OL1: GGG GAG GGG CGT TCT GCG AA (Romero et al., 2001) y OL2: CCG CCC CTA TTT TAC ACC AAC CCC (Miranda et al., 1997; Pirmez et al., 1999), que generan una banda de aproximadamente 120 pares de bases, que corresponde a Leishmania (Cabrera et al., 2002). Los métodos descritos para realizar la incriminación vectorial tienen ventajas y desventajas que se deben considerar al seleccionarlos como procedimientos regulares (Tabla 5).

Tabla 5. Características de los métodos usados en la incriminación de especies de flebotomíneos Método

Disección y cultivo

Especificidad

Alta

Sensibilidad

Media

Tamaño Tiempo población empleado

Moderado

Largo

Costo

Moderado

Ventaja

Desventaja

Especifico

Contaminación Entrenamiento

Anticuerpos Alta Monoclonales

Alta

Bajo

Corto

Alto

Especifico

Información previa del parasito y fijación de algunos estadios

PCR

Muy alta

Muy poca

Corto

Alto

Especifico sensibilidad alta

Costos de la técnica

Muy alta

Referencias citadas Alexander B, Ferro C, Young D, Morales A y Tesh R. 1992. Ecology of phlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae) in a focus of Leishmania (Viannia) braziliensis in northeastern Colombia. Mem Inst Oswaldo Cruz 87(3): 387-95. Antunes P. 1937. Informe sobre una investigación realizada en Colombia. Rev Fac Med Bogotá Colombia 6: 3-29. Arias J, Miles M, Naiff R, Povoa M, De Freitas R, Biancardi C y Castellon, E. 1985. Flagellate infections of Brazilian sand flies (Diptera: Psychodidae): isolation in vitro and biochemical identification of Endotrypanum and Leishmania. Am. J. Trop. Med. Hyg. 34(6): 1098-108. Barreto M, Burbano M y Barreto P. 2000. Lutzomyia sand flies (Diptera: Psychodidae) from middle and lower Putumayo Department, Colombia, with new records to the country. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 95(5): 633-9. Barrios M, Rodriguez N, Feliciangeli D, Ulrich M, Telles S, Pinardi M y Convit J. 1994. Coexistence of two species of Leishmania in the digestive tract of the vector Lutzomyia ovallesi. Am. J. Trop. Med. Hyg. 51(5): 669-75. Bejarano E. 2006. Lista actualizada de los Psicódidos (Diptera: Psychodidae) de Colombia. Folia Entomol Mexicana 45: 47-56. Bermudez H, Urjel R, Rivero A, Claure J y Montalvan B. 1987. Leishmaniasis en los llanos de Bolivia: V.-infeccion por flagelados en phlebotomus del bosque humedo de Yapacani / Leishmanisis in the lowlands of Bolivia: V.-infection for flagellum in phlebotomus of the lumid forest of Yapacani. Boletín científico del CENETROP 13: 35-7. Cabrera O, Munsterman L, Cardenas R, Gutierrez R y Ferro C. 2002. Definition of appropriate temperature and storage conditions in the detection of Leishmania DNA with PCR in phlebotomine flies]. Biomedica 22(3): 296-302. Christensen H, Fairchild G, Herrer A, Johnson C, Young DG y De Vasquez, A. 1983. The ecology of cutaneous leishmaniasis in the Republic of Panama. J. Med. Entomol 20(5): 463-84. Corredor A, Gallego J,Tesh RB, Morales A, De Carrasquilla C, Young D, Kreutzer R, Boshell J, Palau M , Caceres E y et al. 1989. Epidemiology of visceral leishmaniasis in Colombia. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40(5): 480-6. Corredor A, Kreutzer R, Tesh RB, Boshell J, Palau M, Caceres E, Duque S, Pelaez D,Rodriguez, Nichols S y et al. 1990. Distribution and etiology of leishmaniasis in Colombia. Am. J. Trop. Med. Hyg. 42(3): 206-14. Deane L. 1956. Leishmaniose visceral no Brasil. Estudos sôbre reservatórios e transmissores realizados no Estado de Ceará. São Paulo, Faculdade Medicina Universidade de São Paulo. Dedet J, Pajot F, Desjeux P, Goyot P, Chippaux J y Geoffroy B. 1985. Natural hosts of Leishmania mexicana amazonensis Lainson and Shaw, 1972 (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) in French Guiana. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 79(3): 302-5. Eldridge B y Edman J. (2003). Medical Entomology California, Kluwer Academy Press.

Feliciangeli MD, Rodríguez N, De Guglielmo Z, Rodríguez A. 1999. The re-emergence of American visceral leishmaniasis in an old focus in Venezuela. II. Vectors and parasites. Parasite 6: 113-120. Ferro C y Morales A. 1998. Flebótomos de Colombia: Estudios realizados por el laboratorio de Entomología 1965-1997. Instituto Nacional de Salud 1917-1997 Una historia, un compromiso. Toro G, H. C., Raad J, : 219-33. Grimaldi G, Jr. Tesh R y Mcmahon-Pratt D. 1989. A review of the geographic distribution and epidemiology of leishmaniasis in the New World. Am. J. Trop. Med. Hyg. 41(6): 687-725. Grimaldi, G., Jr. Momen H, Naiff R, Mcmahon-Pratt, D y Barrett T. 1991. Characterization and classification of leishmanial parasites from humans, wild mammals, and sand flies in the Amazon region of Brazil. Am. J. Trop. Med. Hyg 44(6): 645-61. Kreutzer R, Corredor A, Grimaldi G, Jr. Grogl M, Rowton E, Young DG, Morales A, Mcmahon-Pratt D, Guzman H y Tesh RB (1991). Characterization of Leishmania colombiensis sp. n (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), a new parasite infecting humans, animals, and phlebotomine sand flies in Colombia and Panama. Am. J. Trop. Med. Hyg 44(6): 662-75. Killick-Kendrick R. 1990. Phlebotomine vectors of the leishmaniases: a review. Med. Vet. Entomol. 4: 1-24. Laboratoire D'informatique Et De Systématique, U. P. E. M. C. 1997. Computer-aided Identification of Phlebotomine sandlies of America, CIPA. <http://cipa.snv.jussieu.fr/> Lainson R, Shaw J, Ryan L, Ribeiro R y Silveira F. 1985. Leishmaniasis in Brazil. XXI. Visceral leishmaniasis in the Amazon Region and further observations on the role of Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva, 1912) as the vector. Trans. R Soc. Trop. Med. Hyg. 79(2): 223-6. Laison R, Shaw J, Ward R y Fraiha H. 1973. Leishmaniasis in Brazil. IX. Considerations on the Leishmania braziliensis complex. Importance of sandflies of the genus Psychodopygus (Mangabeira) in the transmission of L. braziliensis braziliensis in north Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 67(2): 184-96. Le Pont F y Desjeux P. 1985. Leishmaniasis in Bolivia. I. Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva, 1912) as the vector of visceral leishmaniasis in Los Yungas. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 79(2): 227-31. Le Pont F y Desjeux P. 1986. Leishmaniasis in Bolivia. II. The involvement of Psychodopygus yucumensis and Psychodopygus llanosmartinsi in the selvatic transmission cycle of Leishmania braziliensis braziliensis in a lowland subandean region. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 81(3): 311-8. Le Pont F y Pajot F. 1980. La leishmaniose en Guyane française. 1. Etude de l'écologie et du taux d'infection naturelle du vecteur Lutzomyia (Nyssomyia) umbratilis Ward et Fraiha, 1977 en saison sèche. Considérations épidémiologiques. Cahiers ORSTOM, série Entomologie Médicale et Parasitologie 18(4): 359-382. Miranda J, Reis E, Goncalves M, Reis M, Fernades O y Barral-Netto M, et al. 1997. Combination of pinpointed phlebotomine capture and PCR for Leishmania improves detection of naturally infected Lutzomyia. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 92: 504. Montoya-Lerma J y Ferro C. 1998. Flebótomos (Diptera: Psychodidae) de Colombia. Insectos de Colombia, Academia Colombiana de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Volumen II.: 211-245.

6. ESTABLECIMIENTO Y MANTENIMIENTO DE COLONIAS DE FLEBOTOMINEOS EN CONDICIONES DE LABORATORIO

Horacio Cadena Peña Juan Sebastián Cardona Las condiciones de laboratorio para la colonización de los flebotomíneos dependen principalmente de las condiciones ambientales como temperatura, humedad relativa y de la duración del ciclo de vida. Una de las ventajas de la colonización de una especie determinada, es la obtención de ejemplares en iguales condiciones fisiológicas para el desarrollo de estudios sobre comportamiento, capacidad y competencia vectorial, xenodiagnóstico y pruebas de susceptibilidad a insecticidas entre otros. A continuación se describe brevemente el procedimiento para la colonización de Lutzomyia longipalpis (procedimiento utilizado regularmente en el insectario del PECET): • Por las características zoofílicas de Lu. longipalpis la captura de los parentales deberá realizarse sobre cebo animal (ganado, gallineros o corrales para cría de cerdos). Registrar las condiciones de temperatura y humedad relativa durante la captura. • Se recomienda realizar la captura de las hembras alimentadas, las cuales reposan generalmente sobre las paredes de corrales o en su cercanía. • El número de flebotomíneos condensados entre machos y hembras por jaula no debe ser superior a 120 ejemplares.

• Una vez en el laboratorio, los flebotomíneos deberán ser alimentados dependiendo de la disponibilidad con hámster, ratón o cobayo. Eventualmente la alimentación puede ser realizada también en campo. • La mayoría de las veces es necesario alimentar de 2 a 3 veces cada 24 horas hasta lograr un buen porcentaje de insectos alimentados. • Finalizada la alimentación coloque un algodón ligeramente humedecido con una solución de agua y azúcar sobresaturada para alimentar a los flebotomíneos. • A partir de la última alimentación deberá esperarse 2 días para permitir la formación y maduración de los huevos. • Con ayuda del aspirador bucal tome 5 ejemplares hembras cada vez y deposítelos suavemente en los potes para ovipostura hasta completar 50 ♀♀. Los potes para ovipostura son recipientes plásticos con un fondo de yeso (yeso dental), lo cual permite mantener la humedad en cada recipiente. • Posteriormente coloque un algodón con una solución de azúcar sobresaturada encima del tul de cada pote (cambiar diariamente) • Colocar la siguiente información en la parte externa del pote: Fecha, especie colonizada, Tipo de alimentación (hámster, ratón) No. de huevos, Fecha de eclosión de los huevos, Fecha empupación, Fecha de eclosión de adultos. • Colocar los potes de ovipostura con las hembras en cajas plásticas transparentes con tapa. • Para mantener la humedad en la caja, ponga una hoja doble de papel toalla en el fondo de la caja transparente ligeramente humedecida • Ubique la bandeja en el estante a temperatura ambiente. Generalmente el rango de la temperatura y humedad relativa es 27 – 30 0C y 60 -80 % respectivamente. • Después de 5 -7 días ha muerto la totalidad de las hembras en ovipostura, proceda a quitar el tul , retirar los cadáveres y a contabilizar el número de huevos en el pote, • Revisar diariamente los potes de ovipostura bajo el estereoscopio para observar la eclosión de los huevos. • Se deberá tener especial cuidado de retirar los ácaros que vienen adheridos a los insectos de campo, los cuales depositan sus huevos sobre los cadáveres de los flebotomíneos. • Los ácaros deberán ser sacrificados en alcohol al 70% y la revisión de los potes se deberá hacer diariamente, una vez se detecte la presencia de ácaros durante la ovipostura. • Una vez se haya registrado la presencia de las larvas, adicione una cantidad muy pequeña de alimento preparado todos los días, durante los primeros 15 días. 47

• Luego pase la bandeja con los potes de ovipostura a la incubadora a una temperatura de 27 a 30C0 y adicione alimento cada 3 días. Nota: 1) mantener la humedad en el interior de la bandeja, humedeciendo ligeramente el papel toalla. 2) Ver recomendaciones para preparación del alimento. • Una vez se haya registrado la aparición de las pupas suspenda la alimentación de las larvas. • Coloque nuevamente el tul a cada pote. • Después de 6 – 8 días las pupas eclosionan dando lugar a la aparición de los primeros adultos • Capture los adultos de cada pote e identifíquelos (sexar) a través del aspirador bucal y deposite en una jaula entomológica. • Contabilizar el número de machos y hembras que eclosionan por cada pote y anotar en su respectivo formato de colonización de flebotomíneos • En cada jaula entomológica se deberán tener 120 hembras y 40 machos aproximadamente. • Introducir la jaula entomológica en una bolsa plástica negra, colocar algodón con una solución de azúcar sobresaturada y una hoja de papel toalla ligeramente humedecida (cambiar diariamente) • Esperar 3 días a que los insectos hayan madurado sus estructuras bucales y proceder a introducir hámster previamente anestesiado e iniciar nuevamente el proceso de colonización de la especie. Preparación de alimento para inmaduros: Materiales • Heces de vaca • Sangre de cerdo • Hígado en polvo (Becton-Dickinson Cat. 0133-17, 500 g) • Agua Potes plásticas NALGENE de 500 mL (16oz) • Bolsas plásticas negras desechables (90 cm x 65 cm) • Bandejas plásticas herméticas oscuras (10cm alto x 50 cm largo x 30 cm ancho) • Pulpa de fruta (fruto de palma, usualmente se utiliza la especie Bactris gasipaes) Procedimiento • Depositar proporciones iguales de heces de vaca y sangre de cerdo en una bandeja plástica 48

• Agregar 200 ml de agua hasta formar una masa semisólida y amasar durante 10 minutos • Adicione 50 gramos hígado en polvo y mezcle nuevamente. • Seguidamente agregue 20 unidades de fruta previamente triturados en la licuadora • Colocar capas delgadas de la mezcla en las bandejas plástica y cerrar herméticamente. Esto permite una descomposición y recuperación más rápida del alimento. • Revisar cada 2 semanas las bandejas y mezclar para destruir la capa de hongos • Repetir el paso anterior hasta que no se formen más hongos y la mezcla este ligeramente húmeda • Envasar en potes plásticos y autoclavar durante 15 minutos. Recomendaciones El alimento deberá ser preparado cada 30 días para tener disponibilidad todo el tiempo.

Lecturas recomendadas Killick-Kendrick, M., and Killick-Kendrick, R. 1991. The initial establishment of sand fly colonies. Parassitologia 33(suppl): 315-320. Lawyer, P. G., Rowton, E. D., Perkins, P. V., and Johnson, R. N. 1991. Recent advances in laboratory mass rearing of phlebotomine sand flies. Parassitologia 33(supp1): 361-364. Modi, G., and Tesh, R. B. 1983. A simple technique for mass rearing Lutzomyia Iongipalpis and Phlebotomus papatasi (Diptera: Psychodidae) in the laboratory. J. Med. Entornol. 20: 568-569. Cabrera, O. L., Neira, M., Bello, F., and Ferro, C. 1999. Ciclo de vida y colonización de Lutzomyia ovallesi (Díptera: Psychodidae), vector de Leishmania spp. en América Latina. Biomédica 19:223229. Young, D. G., P. V. Perkins, and R. G. Endris. 1981. A larval diet for rearing phlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae). J. Med. Entomol. 18: 446

7. MÉTODOS DE CONSERVACIÓN, ACLARACIÓN Y MONTAJE DE FLEBOTOMÍNEOS (DIPTERA: PSYCHODIDAE)

Rafael José Vivero Goméz

Aun cuando existen nuevas metodologías de biología molecular para la identificación de flebotomíneos, el estudio de los caracteres morfológicos de estos insectos continúa siendo fundamental para la identificación de los mismos, siendo también de gran importancia el establecimiento de una colección de referencia de las especies registradas en las zonas donde existe transmisión de leishmaniasis. Varias técnicas de montaje emplean el uso de sustancias químicas para aclarar las partes quitinizadas de los flebotomíneos, que permiten tanto la observación de estructuras internas de importancia, como la conservación permanente de los insectos para la identificación taxonómica. De acuerdo con Young y Duncan (1994), algunas estructuras como la cabeza (cibario), la genitalia interna de hembras (espermatecas) y genitalia externa de los machos, se consideran de gran importancia para la identificación de los flebotomíneos. Adicionalmente, en algunas especies las patas muestran características distintas como pigmentación y presencia de espinas, así como, el contraste entre el mesotonum y otras partes del tórax también pueden ser útiles (Young y Duncan, 1994).

Aunque muchas veces se puede hacer identificaciones rápidas por el examen de las espermatecas de las hembras o la genitalia externa de los machos, en fresco, con solución salina o lactofenol, es preferible preservar los individuos enteros, para que queden conservados en láminas de montajes permanentes. Algunos procedimientos de la determinación taxonómica, como el uso de marcadores moleculares, implican la utilización de una parte representativa del cuerpo del insecto, dejando al espécimen incompleto para ser introducido en la colección formal. Los flebotomíneos pueden ser sacrificados con diferentes reactivos como éter, cloroformo, acetato de etilo, bajas temperaturas o luz solar y pueden ser conservados de varias formas. Según sean los objetivos del estudio, la conservación de estos insectos puede ser: • En alcohol 70%, tiene la desventaja que endurece los músculos del insecto e impide la visualización de estructuras internas aunque pueden después conservarse en lactofenol. • En lactofenol o Berlese, hasta su aclaración y montaje. • En seco, entre capas de papel suave (celulosa) con alcanfor o cristales de paradicloro-benceno, para prevenir que sean atacados por Psocópteros. • En nitrógeno líquido, técnica utilizada generalmente para disección en fresco y estudios moleculares (Maroli et al., 1997; Bruce et al., 1994). Para estudios sobre el potencial vectorial de flebotomíneos, es necesario aislar el parásito Leishmania y/o otros microorganismo. Los individuos deben ser capturados vivos y conservados en nitrógeno líquido o a muy bajas temperaturas (Maroli et al., 1997; Ferro et al, 1998).

Aclaración de flebotomíneos Existen varias sustancias de gran utilidad para clarificar y colorear los flebotomíneos. Una de las soluciones más empleadas y rápidas es el lactofenol, que consiste en una mezcla de volumen 1:1 de ácido láctico y fenol. Normalmente, los insectos se pueden dejar 24 horas. El uso del lactofenol para aclarar los insectos tiene la ventaja de no requerir otra solución para examinar los especimenes bajo el

microscopio, y es posible examinarlos por un mayor periodo de tiempo (Young y Duncan, 1994; Maroli et al., 1997). En ocasiones, debido a la abundancia de pelos en el insecto y dificultad para lograr aclarar la cutícula, es necesario calentar la solución sobre un plato de porcelana, solo hasta el punto de ebullición, sin embargo, es recomendable ser prudente con el tiempo de manipulación del lactofenol, pues es una sustancia tóxica y corrosiva, que se volatiliza muy fácilmente y puede causar afecciones a nivel del humor vítreo como de todo el sistema nasofaríngeo (Young y Duncan, 1994; Young y Perkins, 1984). Existen otras sustancias que muchas veces son combinadas o trabajadas individualmente que incluyen el NaOH, KOH, la fucsina ácida en fenol, la solución Marc André o simplemente detergente al 5% (Bruce et al., 1994; Maroli et al., 1997; Galati, 2003). El tiempo es fundamental sobre todo cuando se utiliza NaOH y KOH, debido a que estas sustancias digieren rápidamente los tejidos de los insectos. La técnica descrita inicialmente por Fairchild & Hertig (1948), consiste en mantener los ejemplares en KOH caliente al 10-20%, durante pocos minutos o en frío durante varias horas. Luego son resuspendidos con agua destilada y coloreados con una solución de fucsina ácida.

Montaje de flebotomíneos Para el montaje permanente de los insectos, se puede utilizar bálsamo de Canadá, que no contiene agua, al contrario de los medios solubles en agua como el Berlese o Hoyers (Quate y Steffan, 1966; Lewis, 1973). La metodología empleada con el medio de montaje bálsamo de Canadá (Fairchild y Hertig, 1948, Modificada por Pérez, 2008) consiste en: • Los individuos una vez aclarados en lactofenol, son transportados a una placa porta objetos donde son sumergidos en una gota de fenol líquido 90-95%, este procedimiento se realiza con el fin de retirar el exceso de acido láctico al interior

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del flebotomíneo y evitar la incompatibilidad con el bálsamo de Canadá y aclaración continuo una vez este montado. Retirar el fenol y dejar secando por un minuto aproximadamente, antes de pasar a la gota del medio de montaje en otra placa cubreobjeto. Una gota de bálsamo de Canadá preparado previamente (mezcla 2:5 de fenol y bálsamo de Canadá) es colocada en la placa cubreobjeto donde es ubicado el individuo con finos estiletes, conservando las buenas reglas de montaje, que corresponden a montar el insecto entero. Tanto el medio de montaje, como el espécimen en proceso, se dejan a temperatura ambiente durante tres minutos, con el objetivo de fijar bien el espécimen al medio de montaje. Una placa cubreobjetos se deja caer suavemente sobre el insecto y sobre el medio de montaje, evitando la formación de burbujas en el medio de montaje, y presionando para esparcir el medio de tal forma que ocupe toda el área del cubreobjetos. Las láminas son secadas en una incubadora a aproximadamente 37ºC, para acelerar el proceso de endurecimiento y fijación del individuo. Para mantener las preparaciones por largo tiempo, el cubreobjetos puede ser sellado con esmalte transparente después de haber eliminado con una aguja el exceso de bálsamo.

En las ocasiones en que un ejemplar deba ser removido del medio de montaje, por errores durante la ubicación de las estructuras u otros casos, éste puede ser fácilmente desmontado remojándolo en fenol líquido, por una semana o más, para luego remontarlos. Existe variedad de métodos de montaje cuya base es la goma-chloral, compuesto constituido por goma arábiga, hidrato de cloral y glicerina (Liquido de Hoyer). Estas sustancias normalmente son mezcladas con ácido acético glacial para acelerar el proceso de purificación (Bruce et al., 1994; Maroli et al., 1997). Los ejemplares son inicialmente sometidos a un proceso de aclaración, utilizando varias sustancias previamente calentadas, por corto tiempo, o a temperatura ambiente, durante dos horas. Las sustancias utilizadas para aclarar las estructuras son: KOH, lactofenol, clorolactofenol, y solución de Marc André, entre otros. A diferencia del montaje con bálsamo de Canadá, el medio de montaje con goma arábiga permite preservar mejor la coloración natural del insecto, además, estas preparaciones tienen la ventaja de ablandarse fácilmente en H2O (Maroli et al., 1997). 54

Otros métodos de montaje incluyen al líquido de Faure, cuyo procedimiento parte de una aclaración durante varios días en clorolactofenol hasta alcanzar una coloración oscura. Una vez los insectos son aclarados, se coloca una gota del medio Faure sobre el portaobjeto y el flebotomíneo se ubica en la posición ideal, para se cubierto después por una lamina portaobjetos, que es sellada con esmalte transparente una vez el medio de montaje esté endurecido. Adicionalmente, otros medios clasificados como permanentes, incluyen al alcohol polivinílico cuya técnica es muy útil por su rapidez, pero las características y la morfología de los flebotomíneos pueden cambiar fácilmente cuando la solución se seca (Lerger et al., 1983; Maroli et al., 1997). En muchas ocasiones, es necesario agilizar la determinación taxonómica por abundancia del material biológico, de tal forma que las estructuras internas y externas utilizadas puedan ser apreciadas de manera provisional, en placas cóncavas o en montajes no permanentes, con el mismo medio de aclaración. El líquido de Marc André, el clorolactofenol y el lactofenol, son los más utilizados para clarificar y continuar con este procedimiento en la mayoría de los casos, donde el ejemplar es montado con el mismo liquido, debido a su bajo índice de refracción, que permite una visión optima, proporcionando turgencia a los ejemplares y manteniendo las proporciones de los órganos. Como forma de almacenamiento, los flebotomíneos pueden conservarse en tubos de vidrio con alcohol etílico 70% o isopropanol, y mantener una colección de referencia en líquido, donde el recambio del medio soluble debe ser constante por su fácil volatilización. El mayor número de datos del sitio de captura, la determinación taxonómica y el número de individuos por tubo deben ser registrados. Es recomendable anotar toda la información pertinente en el rótulo que acompaña el portaobjetos: país de origen, estado/departamento/provincia, fecha, nombre del colector y la información detallada sobre el sitio y método de captura (Cebo humano, trampa CDC, etc.). Todos estos datos facilitan el análisis descriptivo de la composición, registro y distribución de los flebotomíneos, además de ubicar al investigador que tiene el portaobjetos en uso (Young y Duncan, 1994; Maroli et al., 1997; Galati, 2003; Ferro et al., 1998). Los flebotomíneos en montajes permanentes, constituyen un material de trabajo de suma importancia para los grupos de investigación que estudian las especies 55

vectores de leishmaniasis. En muchas ocasiones, es necesario corroborar la determinación taxonómica o confirmar el registro de una nueva especie para su descripción, haciendo indispensable el intercambio de material entre diferentes instituciones que sostengan convenios de cooperación. A continuación se mencionan algunas especies de flebotomíneos presentes en la colección entomológica del PECET, preservadas en montajes permanentes en placas y en viales con alcohol: Lu. ayrozai Lu. aclydifera, Lu. amazonensis , Lu. antunesi, Lu. atroclavata, Lu. barretoi barretoi, Lu. dubitans Lu. bifoliata, Lu. betinni, Lu. claustrei, Lu. evansi, Lu. gomezi, Lu. camposi, Lu. cayennensis cayennensis, Lu. chagasi, Lu. columbiana, Lu. dysponeta, Lu. davisi, Lu. farcata, Lu. flaviscutellata, Lu. hartmanni, Lu. hirsuta, Lu. isoverpertilionnis, Lu. lichy, Lu. longiflocosa, Lu. longipalpis, Lu. micropyga, Lu. nunez tovari, Lu. ovallesi, Lu. olmeca bicolor, Lu. panamensis, Lu. triramula, Lu. trinidadensis, Lu. trapidoi, Lu. rangeliana, Lu. yuilli, Lu. youngi.

Referencias citadas Bruce A. 1994. Montaje y preservación de los flebótomos. Manual de Entomología Medica para investigadores de América latina. CIDEIM. Fundación Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas. Sección practica. pp. 70. Fairchild GB & Hertig M. 1948. An improved method for mounting small insects. Science, 108:2021. Ferro C, Morales A. 1998. Flebótomos de Colombia: Estudios realizados por el laboratorio de entomología 1966-1997. En: Toro G, Hernández CA, Raad J, editores. Instituto Nacional de Salud 1917-1997: una historia, un compromiso. Bogotá: Instituto Nacional de Salud. p.219-33. Galati EAB. 2003. Morfologia, terminologia de adultos e identificação dos táxons da América En: Rangel EF, Lainson R (eds) Flebotomíneos do Brasil, Fiocruz, Rio de Janeiro, p53-175. Leger M, Pesson B, Madulo-Leblona G & Abonnenc E. 1983. Sur la differentiation des femelles du sous-genre. Larroussius Nitzulescu, 1932. (Diptera Phlebotomidae) de la region mediterraneenne. Ann. Parasitol. Hum. Comp. 58(6 Suppl): 611-623. Lewis DJ. 1973. Phlebotomidae and Ppichodidae. Sp. 159-179. In Smith, K.G.V (ed.), Insects and others arthropods of medical importance, 561pp. London. Maroli M, Feliciangeli MD, Arias J. 1997. Métodos de Captura, Conservación y Montaje de los Flebótomos (Diptera: Psychodidae), OPS/OMS/HCP/HCT/95/97, Washington D.C., 72 pp. Pérez A. 2008. Montaje de flebotomíneos. Protocolo utilizado en el laboratorio de Biomédicas de la Universidad de Sucre. (En preparación) Quate LW, Steffan WA. 1966. An alternative method of mounting Phlebotomus and other small Diptera. J. Med. Entomol., 1(3 Suppl): 213-268. Young DG, Duncan M. 1994. Guide to the identification and geographic distribution of Lutzomyia sand flies in Mexico, the West Indies, Central and South America (Diptera: Psychodidae). Mem Amer Ent Inst; 54:1-881. Young DG, Perkins P. 1984. Phlebotomine sand flies of North America (Diptera: Psychodidae). Mosq. News, 44: 263-306.

8. SECUENCIAS DE ADN COMO HERRAMIENTA EN ESTUDIOS DE ENTOMOLOGÍA MÉDICA PARA LA DETERMINACIÓN TAXONÓMICA DE FLEBOTOMÍNEOS

Sandra Inés Uribe Soto Andrés López Rubio

En la actualidad los marcadores moleculares y en particular las secuencias de ADN, son ampliamente utilizados en estudios de entomología médica. Los principales avances involucran aspectos de taxonomía molecular y filogenia y precisión en aspectos como diversidad genética y flujo de genes. Adicionalmente, mediante el uso de marcadores moleculares es posible identificar haplotipos y líneas genéticas y predecir la migración y la historia de colonización de las especies, aspectos de gran importancia en entomología médica. Con base en datos moleculares también es posible diferenciar especies simpátricas, alopátricas y parapátricas y obtener estimativos relevantes para entender la dinámica y la estructura de las poblaciones naturales o estudiar aspectos como la resistencia a insecticidas y la relación parásito vector. A continuación se suministra información básica sobre la obtención y utilización de secuencias de ADN en sistemática molecular de insectos de importancia médica. Es 58

de aclarar que aunque existen diversas técnicas para el estudio y análisis molecular de insectos, se enfatiza en el uso de secuencias nucleotídicas, ya que actualmente su uso como caracteres moleculares se implementa en proyectos taxonómicos de gran importancia como el MBI (Mosquito Barcode Initiative) y LBI (Lutzomyia Barcode Initiative). Se hace particular referencia a los protocolos y trabajo de tipo experimental, con base en las consultas frecuentes al laboratorio de Entomología médica del PECET de la Universidad de Antioquia y al grupo de investigación en Sistemática Molecular de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, quienes trabajan de forma conjunta en el uso de secuencias de ADN aplicado al estudio de insectos vectores de enfermedades.

Colección, transporte y preparación de especímenes o tejidos a utilizar en estudios moleculares Antes de colectar los especímenes para el trabajo molecular es muy importante tener conocimiento sobre las reglamentaciones locales y nacionales respecto a la colecta, transporte de material biológico y acceso a recursos genéticos (aunque el propósito del estudio sea de taxonomía o filogenia y no de transformación o manipulación genética de los insectos). Es primordial conservar limpios los instrumentos de colecta, recipientes para el depósito de los tejidos del insecto (viales) y procurar un ambiente de transporte frío. Sin embargo, la crío-preservación de los tejidos no es absolutamente necesaria, ya que es posible obtener ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir de especímenes conservados en seco, en etanol al 100%, en isopropanol al 100% o incluso de especímenes de museo. Según el objetivo del estudio (taxonomía, estimativos de diversidad genética, estructuración, flujo de genes, filogenia etc.,) es recomendable la realización de un estudio piloto que permita tener una aproximación a la variabilidad genética del grupo de interés en relación con la procedencia geográfica y con las preguntas específicas del estudio. Esto permite determinar con mayor precisión y consideraciones estadísticas el tamaño adecuado de la muestra (Hillis et al., 1996, Bejarano, 2001; Bejarano, 2002, Bejarano, 2002a; Uribe et al., 2001; Vivero et al., 2007; Vivero et al., 2009).

En general, para estudios de filogenias moleculares los requerimientos en número de especímenes son menores que para taxonomía molecular o genética de poblaciones, pero los números dependen grandemente de la disponibilidad de material, la estrategia de muestreo y la pregunta o problema de estudio. Para el trabajo molecular con insectos no se recomienda utilizar los especimenes completos, lo cual implica prácticamente destruirlos, y optar preferiblemente por utilizar partes con la menor importancia taxonómica morfológica, o pequeños tejidos extraídos cuidadosamente. Esto permite tener siempre una colección de referencia y realizar la identificación taxonómica con base en caracteres morfológicos y lógicamente, contar con la verificación por especialistas. La colecta y uso de especímenes, debe registrarse en una base de datos con la mayor cantidad de información complementaria incluyendo colector, tipo de trampa usada, disposición de la trampa (intra, peri o extradomicilio), localidad, fecha de colecta, descripción ecológica de la localidad de colecta, sexo del individuo, tipo de marcador molecular a usar, tejido usado para extraer el ADN, forma de preservación, etc. A partir de los ejemplares obtenidos en campo o conservados en el laboratorio, se inicia una serie de pasos consecutivos para obtener su ADN y analizarlo. El primer paso es la extracción, el segundo la amplificación de los segmentos específicos de ADN mediante la técnica de PCR y posteriormente la purificación del mismo para la obtención de secuencias y el análisis de las mismas. Adicionalmente, para trabajos en taxonomía molecular se requiere de buenas prácticas de bioseguridad y condiciones de asepsia. Los mesones de trabajo deben limpiarse previamente y el material a utilizar debe ser estéril, al igual, requiere de alta concentración y orden, ya que un descuido al dispensar los reactivos o las muestras podrían resultar en confusión en el análisis e interpretación de los datos.

Extracción de ADN La extracción de ADN tiene como objetivo recuperar el ADN de un organismo, en este caso un insecto. El proceso incluye de forma general el rompimiento mecánico de los tejidos, el tratamiento enzimático de los mismos y una centrifugación 60

experimental. Estos procedimientos generan el rompimiento de la membrana celular, la solubilidad de las proteínas y la precipitación y recuperación del ADN. Debido a que la célula contiene gran cantidad de proteínas, se usan detergentes que las hidrolizan y solubilizan separándolas de los ácidos nucléicos en fases visibles e insolubles y que posibilitan su separación por métodos mecánicos. Para separar el ADN total de los compuestos diferentes a las proteínas, se usa alcoholes y enzimas. La extracción del ADN puede realizarse mediante buffer o soluciones de lisis preparadas en el laboratorio, pero los métodos de extracción con mayor rendimiento se encuentran disponibles en forma comercial, manufacturados por compañías con representación en el país y con precios relativamente accesibles. Una vez obtenido el ADN, es importante relacionar el estado del tejido y su conservación al momento de la extracción, con la cantidad obtenida. La extracción de ADN con buffer de lisis (Collins et al., 1987) proporciona excelentes rendimientos cuando se usan fracciones de tórax y patas (una o dos), incluso en especímenes de museo con hasta 2 años de antigüedad (Bedoya et al., 2005). Protocolo de Extracción de DNA por Grind buffer • Utilice dos juegos de viales por ejemplar, márquelos (marcador indeleble) con el código único y dispóngalos de manera consecutiva en una gradilla. • Coloque la muestra (insecto o sección del cuerpo) en un vial estéril de 1,5 mL y adicione 100 μL de solución de lisis (Collins et al., 1987). Si la muestra estaba conservada en líquido, deposítela sobre servilletas de papel estéril para absorber el exceso antes de llevarla al vial. Debe estar seguro cuando vaya a empezar el proceso ya que congelar y descongelar el insecto, o la parte a usar, también puede tener efecto en el rendimiento de la extracción. • Macere completamente la muestra en la solución de lisis y observe muy bien las paredes del vial para evitar pérdida de material que puede quedarse adherido a las mismas. • Cuando son muestras muy pequeñas y esclerotizadas, la maceración no es fácil, recuerde que la muestra debe estar completamente macerada y la solución de lisis debe observarse turbia. Utilice un macerador por muestra y descártelo en el recipiente dispuesto; al terminar el proceso lave y esterilice para reutilizar. • Cuando la muestra esté completamente macerada, coloque el vial en baño María a 65 o C durante 30 minutos. • Transcurridos los 30minutos remueva el vial y dispense 14 μL de acetato de potasio 8 M, mezcle la muestra y coloque el vial en hielo en hielo (escarcha) durante 30 minutos. 61

• Transcurridos los 30 minutos, centrifugue la muestra a 14.000 rpm durante 10 minutos. Transcurridos los 10 minutos transfiera el sobrenadante a un nuevo vial (previamente marcado) y descarte el precipitado en el recipiente dispuesto para ello. • Adicione al nuevo vial 100 μL de etanol al 100% (refrigerado a 4o C) y almacene a -20 oC durante 24 horas. Transcurrido este tiempo centrifugue a 14.000 rpm durante 20 minutos. • Descarte el sobrenadante volteando el vial sobre un recipiente de descarte y cuidando que no haya desprendimiento del “pellet” en el fondo del tubo, lávelo depositando 200 μL de etanol al 70% y girando suavemente el vial entre sus dedos, descarte el sobrenadante. • Repita el lavado con 200 μL de etanol al 100% y descarte nuevamente el sobrenadante. • Para secar la muestras llévelas al secador de vacío (temperatura ambiente) o voltee los viales sobre una servilleta de papel. Es importante que la muestra quede completamente seca, ya que los residuos de alcohol pueden inhibir el proceso siguiente (amplificación de ADN). • Cuando la muestra este seca, resuspenda en 50 μL-100 μL l de agua bidestilada estéril o buffer TE. • La cantidad usada para resuspender depende del tejido y tamaño del insecto (menor cantidad para partes o insectos de menor tamaño), por último, guarde los viales de extracción debidamente rotulados a -80 oC si va almacenar durante largo tiempo, o a 4º C si va a realizar los PCR rápidamente. • Como regla general, debe evitarse ciclos de congelamiento y descongelamiento frecuentes que afectan notablemente la calidad del ADN. • Si está usando un producto comercial de extracción de ADN siga las recomendaciones de la casa comercial para la extracción. Notas: • En el caso de insectos algunos investigadores agregan además del buffer de lisis proteinasa K. • En algunas ocasiones es pertinente realizar tratamiento a las muestras con RNAsa después de la extracción. • Para verificar el éxito en la extracción del ADN y la calidad del mismo puede realizarse un gel de agarosa o utilizar cualquier método disponible en el laboratorio para detectar y cuantificar el ADN. 62

Para la extracción de ADN se recomienda trabajar con partes del insecto como las patas y porciones de tórax, las cuales deben ser removidas cuidadosamente según el tipo de insecto y el tiempo y tipo de preservación del mismo, o usar métodos no invasivos que permitan extraer el ADN y preservar los especímenes completos para la colección de referencia y verificación con base en morfología. El desprendimiento de la sección del cuerpo a usar como fuente de ADN, debe realizarse con una lanceta estéril, utilizando en lo posible una por cada ejemplar y descartándola o esterilizándola cuidadosamente según el caso. Para la obtención de ADN con calidad para secuenciar, es suficiente contar con cantidades menores a 1 mg. de tejido, lo cual es relevante en el caso de insectos de tamaño muy pequeño como Lutzomyia spp.

Amplificación de ADN mediante Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction - PCR) Esta técnica permite la amplificación directa de los segmentos de ADN de interés con gran especificidad y puede realizarse a partir de fragmentos muy pequeños de tejido en los cuales se encuentren cantidades de ADN infinitesimalmente pequeñas. La facilidad, rapidez, versatilidad y sensibilidad de la PCR, la hacen particularmente útil para estudios genético-moleculares que incluyen gran número de individuos de cualquier organismo. La técnica se basa en la replicación del ADN que ocurre de forma natural en los organismos eucarióticos por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5’-3’ usando un molde de cadena sencilla pero a partir de una región de cadena doble. Para sintetizar el fragmento de interés en forma de cadena doble, se usan los llamados cebadores (“primers”) que consisten en una pareja de oligonucleotidos que son sintetizados de forma que sean complementarios a cada uno de los extremos 3’ del fragmento de ADN que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la reacción en cadena de la polimerasa se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: La primera etapa consiste en la desnaturalización del ADN de doble cadena en cadenas sencillas mediante el aumento de temperatura. En el segundo paso los 63

cebadores se unen a las zonas 3’ complementarias que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. Esto se realiza gracias a la disminución de la temperatura (50 65 oC). En la tercera etapa (elongación) se procede a la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5’-3’ mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Oligonucleótidos o primers usados en la PCR Los oligonucleótidos, primers o cebadores, corresponden a secuencias de ADN complementarias a la secuencia particular del genoma del insecto que se desea amplificar y del cual se obtiene gran número de copias mediante la PCR. En el caso de insectos de importancia médica el uso de primers para regiones conservadas del genoma ha permitido amplificar y utilizar diversos marcadores con éxito. Entre los más usados están los ITS (espaciadores internos transcritos) de procedencia nuclear, y empleados por excelencia para separar especies. El gen del “ojo blanco” en Drosophila spp. y el gen “period” son otros genes nucleares usados también en taxonomía y filogenia. Existen además numerosos cebadores para amplificar genes involucrados en resistencia, a insecticidas, inmunidad a parásitos o patógenos, etc. (Simonds et al., 1998; Hoy, 2003). Los genes mitocondriales característicos por su herencia fundamentalmente materna también han sido ampliamente usados en los últimos 10 años para estudios entomológicos. Por características como la forma de herencia y las tasas altas de evolución, estos genes son ampliamente usados en estudios de complejos de especies o especies crípticas con separaciones recientes y en filogeografía y subdivisión de poblaciones (Avise 2004). Entre los genes mitocondriales más usados en entomología médica se encuentran, el Citocromo B, NAD deshidrogenasa subunidades 1 y 5 (ND4, ND5), y las unidades pequeñas y grande ribosomales. Actualmente, se ha incrementado el uso de un fragmento del gen Citocromo Oxidasa subunidad I (COI), propuesto a nivel mundial como código genético de barras de eucariota y que ha sido adoptado por las iniciativas MBI (Mosquito Barcode Initiative) y LBI (Lutzomyia Barcode Initiative) (Hebert et al., 2005). La selección de el o los genes a usar está relacionada con el objeto del estudio y las tasas de evolución del gen, de forma que se obtenga información adecuada para 64

resolver la pregunta. Para la amplificación de los genes de interés o fragmentos de los mismos, puede usarse primers conservados previamente diseñados por otros investigadores, o diseñarlos con ayuda de programas de computación. Para ello se realizan alineamientos de las secuencias del grupo de interés o grupos cercanos disponibles en bases de datos como Gen bank (Simond et al., 1994). El diseño de los cebadores generalmente se realiza cuando se trata de regiones muy variables o poco estudiadas con anterioridad en el grupo de interés o cuando hay gran desconocimiento del genoma en el grupo de estudio. Una vez definidas las secuencias de los cebadores estos se solicitan al distribuidor especializado y previo uso se centrifugan brevemente, y se diluyen en agua desionizada estéril a la concentración deseada. En general se prepara una solución concentrada a 100 mM., para lo cual se agrega 10 veces el número de nanomoles de ADN indicadas en el inserto. A partir de esta solución se prepara una segunda concentración 1:10. Finalmente se prepara una solución de trabajo a 200 pm, la cual se almacena en pequeños volúmenes de trabajo de 100μL. Estas soluciones deben guardarse debidamente rotuladas con nombre, concentración y fecha de preparación. La solución concentrada se almacena a - 80o C y la solución de trabajo a - 20oC. Se debe evitar al máximo los ciclos de congelación y descongelación que podrán afectar la calidad de los cebadores. Protocolo de Amplificación • Adecúe el lugar desinfectando con alcohol al 70%. • Llene adecuadamente la hoja de registro para PCR, indicando la fecha, el tipo y número de muestra, la cantidad que utilizará para la reacción, el número total de muestras y los cebadores utilizados. • Las reacciones de PCR pueden realizarse del total deseado, una cantidad adecuada cuando el objeto es secuenciar es 50 μL por muestra, incluyendo el ADN molde, los cebadores, el buffer 10X con MgCl2, agua estéril y la taq polimerasa. • Marque con marcador indeleble los viales de PCR previamente esterilizados y dispóngalos en una gradilla sobre hielo (escarcha). • Descongele el ADN proveniente de los especímenes de su interés y transfiera con la ayuda de una pipeta los μL de ADN molde en cada una de los viales de PCR (la cantidad de ADN generalmente está entre 0,5-2 μL dependiendo de la calidad del ADN extraído) y consérvelos en el hielo mientras procede a preparar la mezcla de los demás reactivos de la PCR. (use siempre un control positivo y agua como control negativo).

• En un vial de 1,5 ml prepare una mezcla que contiene los reactivos en cantidades calculadas para el total de las muestras más una. La mezcla debe contener el agua, el buffer 10 X con MgCl2, los deoxinucleótidos y los cebadores. Por último adicione la Taq-polimerasa. El buffer 10x y el MgCl2 deben ser homogenizados antes de agregarlos a la mezcla agitándolos durante unos minutos en el vortex. El buffer 10X generalmente incluye concentraciones de MgCl2 de 25mM. Para el caso de insectos acuáticos y en particular de insectos esta concentración es crítica y debe ser mayor (hasta 50 mM). • Adicione los µl correspondientes de la mezcla a cada uno de los tubos de reacción de PCR donde previamente depositó el ADN de cada muestra. • Coloque cada vial en el termociclador tan pronto como sea posible e inicie el proceso según el perfil térmico que se esté utilizando. Transporte sus muestras siempre en hielo. • Verifique que el programa a usar es realmente el suyo y no se retire del termociclador hasta que haya pasado por lo menos un ciclo. Recuerde que el perfil térmico a utilizar debe ser el previamente estandarizado para el ADN, cebadores y tipo de muestras y reactivos que se están trabajando. • Al término, retire sus muestras y almacénelas a 4 oC, mientras tanto prepare el gel de verificación para observar el resultado. Posteriormente almacene a -20°C hasta la purificación y secuenciación. En el proceso de preparación de la muestra, la reacción, la manipulación y análisis (electroforesis) post-PCR se recomienda realizarse en áreas físicas separadas y si es factible, en cuartos separados, estas áreas deben ser desinfectadas antes y después de cada uso con etanol al 70% o Hipoclorito de sodio al 10% (porcentajes más altos o más bajos no descontaminan adecuadamente). El peligro de contaminación en la reacción de PCR puede provenir de dos fuentes, contaminación cruzada entre muestras y fragmentos de ADN dispersados por aerosol. Para evitar la contaminación se debe utilizar material desechable nuevo y estéril (puntas de micropipeta con filtro, tubos eppendorf, etc.) minimizando la contaminación de los suministros y las muestras, si esto no es posible, los artículos a ser reutilizados deben ser desinfectados con una solución de etanol al 70% y las puntas deben ser autoclavadas (25 libras de presión 25 minutos) y se deben secar completamente, ya que el etanol puede inhibir la reacción de PCR.

Para evitar que las partículas contaminantes se dispersen por aerosoles es recomendable usar puntas de pipeta con barrera para aerosol y centrifugar los tubos antes de abrirlos. Esto último es especialmente importante después de la PCR ya que los amplificados o bandas que en realidad son fragmentos concentrados y específicos de ADN, pueden contaminar todo, desde los mesones hasta las pipetas. Estos fragmentos pueden también afectar los análisis futuros de PCR, incrementando las posibilidades de falsos positivos. Se debe utilizar guantes sin talco (de nitrilo) y deben ser cambiados regularmente, se debe destinar pipetas para el uso exclusivo de la PCR, también se recomienda un juego separado para la preparación de la muestra, la reacción PCR y el análisis. En cuanto a los reactivos o soluciones preparadas en grandes cantidades (”stocks”) y que pueden ser fácilmente contaminados como los cebadores y el agua estéril grado PCR, deben ser divididos en volúmenes pequeños (alícuotas). Además todos los reactivos necesarios para la PCR deben estar conservados en frío. La taq polimerasa solo se retira del congelador (-20 oC) al momento de uso.

Verificación de presencia de ADN mediante electroforesis Con la finalidad de ver la calidad del ADN de una extracción o un PCR, se realiza una electroforesis en gel de agarosa. En el caso de la extracción de ADN, si la muestra presenta más de una banda o mezcla de bandas de diferentes tamaños, es probable que esté degradada y de preferencia debería descartarse, también cuando se evidencia gran cantidad de RNA se trata las muestras con Rnasa. En el caso de la PCR se verifica que el tamaño de la banda corresponda al del gen o al fragmento que se desea amplificar, esto se realiza mediante comparación con un marcador de peso molecular (llamado comúnmente escalera) que se coloca en el extremo del gel. También se verifica que no haya amplificación de productos inespecíficos evidenciados como bandas adicionales, caso en el cual se toma directamente el producto deseado con el gel (cortándolo) y se recupera el ADN del gel.

Electroforesis Esta técnica se basa en la capacidad de las macro moléculas para migrar cuando están en un campo eléctrico por las fuerzas de atracción que experimentan hacia el polo con carga opuesta. El ADN posee una carga negativa dada por el grupo fosfato, por lo cual, su migración en un gel de electroforesis será al polo positivo. La velocidad de migración es inversamente proporcional al tamaño, ya que a mayor tamaño de la molécula, habrá una mayor resistencia al avanzar a través de los poros del gel. La agarosa es un polímero de carbohidratos que se extrae de algas marinas. El polvo de agarosa se disuelve en una solución amortiguadora generalmente TAE (Tris-ácido acético-EDTA) o TBE (Tris- ácido bórico-EDTA) con pH 8,2 y se funde a 56 0 C antes de ser depositada en un molde (cámara de electroforesis) que servirá como soporte de las muestras de ADN a ser separadas. El porcentaje de agarosa en el gel varia (0,7%, 1,5%, 2,0%). Si el fragmento de ADN es menor a 1 Kb se usa un gel al 0,7%, en caso de ser mayor, se usa de 1,0 a 2,0%. Con la ayuda de micropipetas con puntas estériles, las muestras (entre 4 y 8 µl) se colocan en pozos previamente formados en el extremo del gel por un peine colocado de forma previa a la gelificación de la agarosa. Para dar peso y marcar las muestras de forma que pueda seguirse visualmente su migración en el gel, estas se mezclan con un colorante de carga (”loading dye”) a razón de 1μL por μL de muestra. La visualización del ADN en gel de agarosa se realiza mediante compuestos como el bromuro de etidio que pueden intercalarse con el ADN y son visibles con luz U.V y que se incorporan al gel donde se depositan las muestras en pequeñas cantidades (4μLts por gel en una cámara con capacidad de 75 mL de TBE 5X. para hasta 24 muestras). En la actualidad la tendencia es a usar productos diferentes al bromuro y menos contaminantes y riesgosos y de menor costo (ver por ejemplo gel red según proveedor).

Protocolo de Verificación de presencia de ADN mediante electroforesis • Mida 70 ml de buffer TBE 1 X en una probeta. • Pese la cantidad de gramos de agarosa, dependiendo de la actividad a realizar: verificación de extracción (0,58 g), PCR (0,8g) o purificación (0,8g). • Adicione la agarosa y el buffer TBE 1X en un erlenmeyer, homogenice y lleve al horno microondas por un minuto. • Deje enfriar el gel aproximadamente a 50 oC. • Agregue 0,7 μL de bromuro, homogenice y sirva en la cámara de electroforesis, disponga el peine para realizar los pozos en el extremo superior de la cámara. • Cuando el gel este sólido retire el peine, retire los demás dispositivos y agregue buffer TBE hasta que cubrirlo por completo. • Disponga sobre una gradilla los viales previamente marcados con el número correspondiente a la muestra y consérvelos en frío. • Añada 2 μL de colorante de carga en cada vial. • Sirva 8 μL de ADN en el vial correspondiente y homogenice, use una punta para cada muestra. • Sirva la muestra en cada uno de los carriles del gel con la precaución de no perder la muestra, para lo cual debe tener en cuenta no acercar la punta a la base de la cámara. En el último carril siembre el control de peso o escalera. • Conecte la cámara a la fuente de poder a 80 voltios durante 1 hora. Para verificar que ha quedado correctamente instalada la cámara con el gel observe formación de burbujas en los extremos de la cámara, una vez encienda la fuente de poder. • No olvide depositar en el primer carril 2 μL de marcador de peso molecular, (lo cual permitirá comparar los tamaños estándar de ADN con el tamaño del gen o fragmento amplificado y la referencia del que se desea amplificar). • La fotografía del gel permitirá visualizar si su procedimiento ha sido exitoso. Nota: • La pipeta utilizada para los geles debe ser siempre la misma. • En algunos laboratorios se recupera el ADN del gel (cortando el pedazo con el ADN de interés). Esto requiere una calidad diferente de agarosa y un procedimiento adicional para recuperarlo. • Usar gafas protectoras o careta cuando observe geles con la luz ultravioleta.

Se recomienda para la realización de la electroforesis calcular el volumen del gel lo más preciso, agregar bromuro de etidio luego que la mezcla de agarosa y buffer TBE este homogenizada (luego de pasar por microondas) y solo hasta asegúrese que esté lo suficientemente fría y no produzca vapores. Al verter la mezcla, verifique el recipiente o cámara de electroforesis donde se va a depositar el gel este bien sellado, para evitar derrames. (Ver protocolos de electroforesis). Adicionalmente, las puntas, servilletas y guantes utilizados en la preparación de geles se deben descartar en los respectivos recipientes (muestras contaminadas con bromuro), no mezclándolo con los geles, ya que esto dificulta el proceso de descontaminación.

Obtención de secuencias Una vez obtenidos los productos de PCR de los genes o fragmentos de interés se procede a obtener las secuencias. En la actualidad la relación costo-beneficio en la obtención de secuencias por empresas comerciales dedicadas a ello, amerita el envío de los productos (http://dna.macrogen.com/eng/). Las secuencias se realizan en doble sentido de la cadena y con base en ellas se inicia el análisis.

Edición y Análisis de secuencias Existen diferentes herramientas computacionales para el análisis de genética de poblaciones y reconstrucción de filogenias utilizando secuencias de ADN. Estas herramientas permiten usar las secuencias de ADN para obtener información sobre la evolución de un gen, un grupo de organismos o poblaciones de una especie. Con base en esta información se puede estimar, la composición nucleotídica, las distancias genéticas, los tiempos de divergencia entre grupos, los procesos de selección, el flujo de genes, el número de individuos migrantes entre poblaciones, así como hipótesis de especiación (Avise 2004, Hoy 2003, Hillis et al. 1996) En la actualidad, existe gran disponibilidad de programas para los sistemas operativos Windows®, MacOSX, y LINUX, bajo los cuales puede realizarse el análisis 70

de secuencias de ADN, algunos de ellos pueden obtenerse gratuitamente en la Internet (Tabla 6), otros requieren la compra de licencia para poder ejecutarse. Hay disponibilidad de versiones de algunos programas que trabajan en estos tres sistemas operativos, mientras que otros son exclusivos para uno de los sistemas. Algunos de los programas utilizados para realizar el proceso de anรกlisis de secuencias son: DNASP, CLUSTALX, MEGA, BIOEDIT y PAUP*. A continuaciรณn se relacionan de forma general los programas de acuerdo a su orden en el proceso y uso en el anรกlisis de secuencias (Figura 9).

Figura 9. Diagrama mostrando programas de uso frecuente de acuerdo a su orden en el proceso y aplicaci贸n en el an谩lisis de secuencias.

Tabla 6. Lista de programas de uso frecuente en taxonomía molecular PROGRAMA

USO

SITIO WEB

PHYLIP

Filogenético

Evolution.genetics.Washington,edu/phylip.h tml

CLUSTAL W

Alineamientos pareados y múltiples

www.ebi.ac.uk/clustalw/

DAMBE

Variabilidad molecular

http://dambe.bio.uottawa.ca/dambe.asp

MEGA

Variabilidad molecular y estimación de árboles

http://www.megasoftware.net/

http://paup.csit.fsu.edu/

DNASP

Variabilidad molecular, genética de poblaciones, pruebas estadísticas de neutralidad

http://www.ub.es/dnasp/

ARLEQUIN

Genética de poblaciones

http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3/

MODELTEST

Selección de modelo de evolución molecular para http://darwin.uvigo.es/software/modeltest. análisis de máxima html verosimilitud

TCS

Parsimonia de redes.

http://darwin.uvigo.es/software/tcs.html

EMBOSS

Análisis edición de secuencias (aminoácidos y proteínas) predicción de estructura de proteínas, análisis cladísticos, etc.

http://emboss.sourceforge.net/

MRBAYES

Inferencia bayesiana

http://mrbayes.csit.fsu.edu/

TNT

Análisis cladísticos bajo criterio de parsimonia.

http://www.zmuc.dk/public/phylogeny/tnt/ Read_me!.htm

PAUPUP

Emulación de interfaz gráfica para PAUP* en Windows

http://www.agromontpellier.fr/sppe/Recherche/JFM/PaupUp /main.htm

Otros programas

Filogenético y Genética de poblaciones

http://evolution.genetics.washington.edu/p hylip/software.html

PAUP*

GRATUITO

Referencias citadas Avise John. 2004. Molecular Markers, Natural History, and Evolution. Sinauer Associates; 2 edition 684 p. Bedoya A, Gomez L, Uribe S. 2005. Extracción de ADN a partir del margen costal del ala anterior, pata y masa antenal de mariposas. Brasil En:: I Encontro sobre Lepidoptera Neotropicais. Bejarano EE. 2001. Nuevas herramientas para la clasificación taxonómica de los insectos vectores de leishmaniosis: utilidad de los genes mitocondriales. Colombia, Biomédica ISSN: 0120-4157, vol:21 fasc: 2 págs: 182 – 191 Bejarano EE. 2002. Genetic flow between rural and urban populations of Lutzomyia (verrucarum) evansi (Nuñez-Tovar, 1924) in Colombia, based on analysis of mitochondrial nucleotide sequences. Brasil, Evento: IV International Symposium on Phlebotomine Sandflies. Ponencia. Bejarano EE. 2002a Phylogenetic relationships among natural populations of Lutzomyia (verrucarum) evansi (Nuñez-Tovar, 1924).Brasil, Evento: IV International Symposium on Phlebotomine Sandflies. Ponencia. Collins FH, Mendez MA, Rasmussen MO et al. 1987 (DNA extraction from a single mosquito) A ribosomal RNA gene probe differentiates member species of the Anopheles gambiae complex. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene USA, 37: 37-41. Hebert P, Ratnasingham S, deWaard JR. 2005. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. (Suppl). 270:2003b. S96– S99. Hillis D, Moritz C y Mable B. 1996. Molecular Systematics 2nd ed. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts. Cap 2. Hoy Marjorie. 2003. Insect Molecular Genetics, 2nd Edition. Academic Press Kumar P, Rajavel A, Natarajan R and JambulingamP. 2007. DNA Barcodes Can Distinguish Species of Indian Mosquitoes (Diptera: Culicidae) Journal of Medical Entomology 44(1):1-7. Simon C, Frati F, Beckenback A, Crepsi B, Liu H and Flook P.1994. Evolution, weighting and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Ann. Entomol. Soc. Am. 87: 651–701. Uribe SI, Porter C, Lemanhh T, Velez ID, Rowton E. 2001. Speciation and population structure in the morphospecies Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva) as derived from the mitochondrial ND4 Gen. Molecular Phylogenetics And Evolution ISSN: 1055-7903, 2001 vol:18 fasc: 1 págs: 84 - 93 Vivero R, Contreras-Gutiérrez MA, Bejarano EE. 2007. Analysis of the primary and secondary structure of de mitocondrial serine transfer RNA in seven species of Lutzomyia. Biomédica 27: 429438 Vivero R, Contreras-Gutiérrez MA, Bejarano EE. 2009. Changes in the carboxyl-terminal domain of cytochrome b as a taxonomic character in Lutzomyia (Diptera: Psychodidae). Revista Colombiana de Entomología SOCOLEN (Sometido)

9. COLECCIONES ENTOMOLÓGICAS

Alejandro Valencia Tobón ¿Qué son y por qué existen las colecciones biológicas? Las colecciones biológicas son agrupaciones sistemáticas de individuos que, ubicadas en un lugar y un espacio determinado, son usadas para labores investigativas o de docencia. Hacen parte de los Museos de Ciencia que, junto con los Museos de arte e Historia, conforman los tres tipos de museos existentes, siendo todos ellos bancos de información y patrimonio de las sociedades ya que brindan conocimiento tanto a generaciones presentes como venideras. Por esta razón deben ser establecidos y protegidos de manera apropiada, procurando su conservación y permanencia en el tiempo. Es así como se reconocen cuatro actividades dentro de cualquier museo: generar información, perpetuar la información, organizarla y difundirla (Simmons y Muñoz-Saba, 2005). El biólogo E.O Wilson llama biofilia a "la necesidad de afiliarse a otras formas de vida" (1984), una de cuyas manifestaciones es la tendencia a formar grupos. Quizá es también esta tendencia humana la que nos hace coleccionar objetos, plantas o animales, que representen la naturaleza y nuestro conocimiento de ella. Una colección biológica está destinada a ser un centro de documentación que debe ser conservada mediante un mantenimiento preventivo, lo cual debe ser asegurado 75

por un Curador y un Gerente de Colección que estén a cargo del registro, cuidado, mantenimiento y uso de la misma. Con una colección mantenida de esta manera se podrá garantizar su empleo para fines investigativos, en estudios en sistemática, taxonómicos, ecología, biogeografía, biología comparada, estimación de la diversidad biológica, conservación, entre otros.

Responsables de las colecciones Biológicas Los responsables de las colecciones biológicas son los Gerentes de Colección y los Curadores (Simmons y Muñoz-Saba, 2005): • Gerente de colección: Administra la colección. Organiza, cataloga, etiqueta y almacena las colecciones. • Curador: Científico o investigador con responsabilidades primariamente para hacer investigación. Usa la colección.

Las Colecciones Biológicas y su Administración Se han formulado estrategias tendientes a mejorar el nivel de las colecciones y en esta medida es el USNM (National Museum of Natural History) el lugar en donde se plantean criterios básicos expuestos por McGinley (1993) dirigidos a optimizar los recursos, establecer prioridades e intentar categorizar las colecciones y sus contenidos (Simmons y Muñoz-Saba, 2005). De esta manera se postula el Índice de Salud de las Colecciones (ISC) como una medida del estado de la misma. Este índice fue propuesto por McGinley y modificado por Williams y por Simmons y MuñozSaba (Williams et al., 1996; Simmons y Muñoz-Saba, 2005).

Índice de Salud de las Colecciones: Niveles • Nivel 0: Ausencia de material. • Nivel 1: Materiales de conservación, dado que el material esta deteriorado, no identificado. • Nivel 2-4: Prioridades en organización física. • Nivel 5-6: Referentes a accesibilidad a los ejemplares, procesos de sistematización. • Nivel 7-9: Niveles tendientes a la obtención de la información depositada en 76

libretas de campo, información adicional que acompañe a cada espécimen. • Nivel 10: Material científico depositado, fines exclusivos para investigación. Para establecer el nivel de la colección se puede tener como unidad de medida la gaveta, una placa, una caja o un vial. Posterior al establecimiento de Índice de Salud de las Colecciones, Simmons y Muñoz-Saba (2005) proponen unas prioridades que van a caracterizar las actividades a seguir con la colección: • Prioridad 1: Conservación, protección y conservación del material (Suma de los niveles 0 al 1) • Prioridad 2: Organización Física (Suma de los niveles 2 al 4) • Prioridad 3: Accesibilidad; material accesible a los investigadores (Suma de los niveles 5 al 6) • Prioridad 4: Inventario de especies (Suma de los niveles 7 al 9)

Importancia de la colección de Lutzomyia (Diptera: Psychodidae) Las especies del género Lutzomyia han sido estudiadas a partir de carácteres morfológicos particulares como son la sutura interocular, la forma de la espermateca (hembras), el número de dientes horizontales y verticales del cibario y la forma de la genitalia masculina, entre otros. Sin embargo, en muchos casos, estos carácteres pueden ser poco precisos al observar un solo individuo, por lo que se hace necesario comparar los resultados obtenidos con otros especimenes colectados durante muestreos similares; para esto, se requiere de una colección entomológica y de una base de datos que registre, de manera ordenada, cada uno de los especímenes ya identificados, obtenidos a partir de diversos estudios y conservados en el laboratorio. Lo anterior implica que, para el estudio de la leishmaniosis, es crucial evaluar la biología y ecología de los insectos responsables de su transmisión. Es por ello que cada laboratorio debe establecer una colección entomológica numerosa y representativa de los insectos asociados a la leishmaniosis. Este material es necesario para comprender la dinámica de transmisión de la enfermedad, ya que la 77

información consignada se relaciona con sitios de picadura, horarios de actividad de los vectores, ubicación de ellos respecto a los hogares (intra, peri o extradomicilio), hábitats característicos para su colecta, lugares de reposo posterior a la ingesta sanguínea (endofilia, exofilia), sitios de picadura o alimentación (endofagia, exofagia), sitios potenciales de transmisión de la enfermedad, personas en riesgo, y actividades mayormente asociadas a la transmisión de la leishmaniosis, como cultivos, cría de animales (gallinas, conejos), ganadería y labores varias que implican alteraciones antrópicas del ecosistema. Toda esta información será útil, sea para realizar confirmaciones taxonómicas, para desarrollar trabajos en sistemática, ecología o geografía; o aún para comparar la información disponible sobre los vectores con la información de zonas de captura y aislamientos de las especies de Leishmania, agente etiológico de la enfermedad.

Inclusión de material en una colección Entomológica Una colección entomológica contiene un registro organizado de una especie de insecto en un lugar y período determinado, información fundamental para llevar a cabo labores de docencia, investigación y extensión. En el caso de la colección de Lutzomyia (Diptera: Psychodidae), cada espécimen luego de ser colectado, montado e identificado, se encuentra fijado a una placa de vidrio, la cual debe estar debidamente marcada. Posterior a la identificación, se elabora un rótulo adhesivo que se pegará a la lámina de vidrio (Figura 10), éste contiene la información básica del espécimen: número único y consecutivo, género y especie, sexo, hábitat, método, lugar de origen y fecha de captura, colector y determinador. Luego de la elaboración del rótulo, se procede a la sistematización. El proceso se desarrolla en una hoja de cálculo de un programa que permita almacenar gran cantidad de carácteres; el objetivo es tener la información más precisa y completa de cada espécimen: especie, sexo, fecha de colección, hora de colección, país, departamento, municipio, localidad específica, método de captura, hábitat en el que fue colectado, nombre de colector y determinador, coordenadas geográficas del lugar de captura, posibles comentarios hechos por el colector concernientes al espécimen, y existencia de marcador molecular, secuencias génicas, u otra información asociada al individuo.

Esta base de datos también posee el número y un lugar único y consecutivo de cada placa. Adicionalmente, es importante conservar las libretas de campo y demás a b anotaciones de los Figura 10. a. Rótulo adherido a la placa, donde se deposita investigadores que la principal información del espécimen; la sigla PPCO corresponde a PECET Psychodidae Colombia. b. Lutzomyia desarrollaron el trabajo de campo y la identificación del aragaoi fijada en placa de vidrio. Fotografía: Pablo Herrera. material. Para el establecimiento de la colección entomológica, es fundamental tener un espacio adecuado para su almacenamiento; por esto, posterior al trabajo de asignación de rótulos y sistematización, cada placa se deposita en un espacio único dentro de una gaveta de madera, en posición horizontal (Figura 11), cada gaveta debe estar debidamente rotulada, indicando los códigos de los especímenes ahí contenidos. El espacio donde se encuentren las placas debe estar aislado, en un ambiente con temperatura de 18ºC y humedad relativa de 70%, preferiblemente sin fluctuaciones bruscas de temperatura o humedad; y preferiblemente, no debe estar expuesta a radiación, ni luz directa y no debe estar en contacto con gases. Los a b Figura 11. a y b. Gavetas para el almacenamiento de las estantes deben ser revisados placas de vidrio donde se encuentran fijados los con periodicidad para evitar individuos. Fotografía: Alejandro Valencia plagas que puedan deteriorar el material. Todo el material hará parte de futuras investigaciones, dando lugar a publicaciones, monografías o revisiones, por lo que estará en constante revisión y actualización, lo cual garantiza que la colección sea parte de una colectividad académica y que refleje el profundo trabajo dirigido a estructurar un conocimiento de la dinámica de uno de los componentes principales de la enfermedad: el vector. 79

Referencias citadas McGinley RJ. 1993. Where's the management in collection management? Planning for improved care, great use, and growth of collections. International Symposium and First World Congress on the Preservation and Conservation of Natural History Collections. Madrid: 3 : 309 – 338. Simmons J, Muños-Saba Y. 2005. Cuidado y Manejo de Colecciones Biológicas. Universidad Nacional de Colombia - Conservación Internacional, Bogotá. Williams SL, Monk RR, Arroyo-Cabrales J. 1996. Applying McGinley's model for collection assessment to collections of recent vertebrates. Collection Forum, 12: 21-35, 1. Wilson EO. 1984. Biophilia. Cambridge: Harvard University Press. New York.

10.

VIGILANCIA Y CONTROL DE FLEBOTOMÍNEOS

Horacio Cadena Peña La vigilancia y control de los flebotomíneos hacen parte de los estudios ecoepidemiológicos, dirigidos a la caracterización de la enfermedad desde el punto de vista clínico, entomológico, ecológico y social. La selección de las intervenciones en cualquier área particular debe basarse en primer lugar en las características ecológicas y epidemiológicas, las cuales van a determinar la eficacia de las intervenciones potenciales. Generalmente, ante la aparición de un brote epidémico la primera medida de control de la enfermedad es el diagnóstico y tratamiento de las personas afectadas, seguido del rociamiento con piretroides a nivel intradomiciliar y el uso de toldillos (Alexander y Maroli, 2003). La vigilancia y control de flebotomíneos deberá tener cuatro grandes propósitos: • Contribuir a la disminución del número de casos entre los habitantes de una zona endémica. • Ampliar las coberturas de educación a todos los habitantes sobre los riesgos de adquirir la enfermedad. • Incrementar la participación de la comunidad en los programas de control de las enfermedades transmitidas por vectores. • Evaluar las medidas de control implementadas.

Estudio de foco de la leishmaniasis Los estudios de foco de la leishmaniasis, son actividades dirigidas por personal del área clínica (médico, bacteriólogo y epidemiólogo), entomológica (entomólogo) y de las aéreas sociales (ej: antropólogo, sociólogo), con el fin de caracterizar ecoepidemiológicamente un brote epidémico de la enfermedad. En leishmaniasis, un foco es definido como la presencia de casos autóctonos en una comunidad en un tiempo determinado, donde se ha confirmado la transmisión del parásito. Generalmente, estos focos son producto de factores ecológicos y sociales que se han conjugado en un espacio o lugar determinado. Objetivos de la investigación en los focos de leishmaniasis • Diagnóstico y tratamiento oportuno de los casos. • Delimitar geográfica y ecológicamente el área de transmisión. • Elaborar una encuesta epidemiológica. • Determinar la prevalencia de la enfermedad. • Identificar las especies de Leishmania y de flebotomíneos. • Determinar el porcentaje de flebotomíneos infectados. • Identificar potenciales reservorios domésticos y silvestres. • Identificar los factores de riesgo asociados a la transmisión. • Definir y ejecutar las intervenciones de prevención y control.

Fases del trabajo de campo • Conformación del equipo multidisciplinario y preparación de las acciones a desarrollar. • Reunión con las autoridades de salud del área afectada y del municipio • Coordinación de actividades con la comunidad adelantando contacto con líderes y voluntarios. • Delimitación y caracterización de la zona geográfica: elaborar croquis de la vereda o caserío, ubicar viviendas, obtener datos meteorológicos. • Identificar la fauna y flora predominante en la región.

Elaboración y aplicación de la encuesta epidemiológica La encuesta debe considerar las siguientes variables: • Persona: edad, género, procedencia, ocupación. • Exposición a factores de riesgo: tiempo de residencia en la región, hábitos domésticos. • Conocimientos sobre la enfermedad (modo de transmisión, formas de diagnóstico, tratamiento, medidas de prevención y control). • Actividades desarrolladas por los adultos: trabajar en zonas boscosas, mineras, otras zonas endémicas. • Características de la vivienda: cercanía de la vivienda a zonas boscosas o cercanas a cultivos (café, cacao, plátano, etc.). • Condiciones de la vivienda: disposición de excretas y basuras. • Presencia de animales domésticos (No. de perros, caballos, vacas, gallinas etc.). • Medidas de protección de la vivienda (uso de mallas o anjeos adecuados, desmonte de áreas cercanas). • Protección de las personas (uso de toldillos, repelentes, uso de fumigantes caseros). • Datos clínicos: presencia de lesiones y tipo de lesiones, tipo de tratamiento recibido.

Estudios entomológicos El estudio entomológico debe realizar los muestreos en el mayor número de viviendas posibles donde se presenten casos activos, sospechosos o personas con cicatrices. Debe cumplir con el objetivo de identificar las especies de flebotomíneos existentes en el área, su relación con el domicilio, las preferencias alimenticias y procurar el aislamiento de parásitos de Leishmania de los vectores. Existen dos tipos de estudio entomológicos; transversales y longitudinales, los dos permiten tomar medidas sobre la vigilancia y control de los flebotomíneos. Debido a la dificultad de ubicar los sitios de cría de los flebotomíneos, la captura de las formas adultas se realizará en tres sitios asociados a la vivienda.

• Intradomicilio: Se debe seleccionar el mayor número de casas donde hayan registrado casos activos, sospechosos o pacientes con cicatrices, de acuerdo a la disponibilidad de equipo. • Peridomicilio: se considera aquella zona alrededor de la vivienda donde se desarrollan actividades cotidianas (zonas de cultivo) • Extradomicilio: se considera aquellos bosques secundarios o semi-intervenidos alejados de la vivienda, donde no se desarrolla ninguna actividad agrícola.

Estudio entomológico transversal Se realiza durante un corto periodo de tiempo (semanas o meses). Estos muestreos recopilan información básica inicial sobre la entomofauna de la localidad como: • La composición y densidad en un tiempo determinado de las especies presentes. • Comportamiento de los flebotomíneos: características antropofílicas, zoofílicas, endofagía, etc. • Picos de actividad (se recomienda realizar muestreo nictameral para determinar las horas de mayor actividad). Estudio entomológico longitudinal Se realiza durante un tiempo prolongado de un año o más, generalmente los muestreos incluyen las épocas de verano e invierno. La información obtenida permitirá: • Determinar la composición y densidad relativa de las especies en los diferentes hábitats asociados con la localidad de estudio. • Establecer asociaciones entre las variables climáticas (temperatura – precipitación – humedad relativa) y la densidad de las diferentes especies de flebotomíneos. • Conocer la densidad relativa de las especies en determinados meses del año y tomar acciones para su control evitando la presentación de nuevos casos. • Realizar estudios sobre la bionomía de las especies de interés como su distribución (altitudinal y vertical), hábitat, comportamiento, longevidad, capacidad vectorial, estado fisiológico, etc. 84

Métodos de muestreo de flebotomíneos Para la captura de flebotomíneos se han diseñado una serie de trampas entre las cuales mencionaremos las más recomendadas para los estudios de foco. Adicionalmente se recomendaran otros tipos de trampa que serán utilizadas dependiendo de los objetivos del estudio. • Trampa CDC de luz blanca: Se instala entre las 6:00 pm y 6:00 am en el interior de las viviendas, peridomicilio y extradomicilio. • Trampa Shannon: Se instala entre las 18:00 y 22:00 horas en el peridomicilio o extradomicilio. • Captura sobre cebo humano: esta técnica permite determinar el comportamiento antropofílico de las especies de flebotomíneos que se acercan a picar al humano. Con estas capturas se obtiene información sobre la tasa de picadura (No. de flebotomíneos/hora/hombre). Se puede realizar en el intra, peri y extradomicilio. Cuando son realizadas sobre animales domésticos (vacas, cerdos y equinos) se puede inferir el comportamiento zoofílico de los flebotomíneos. • Captura en reposo: consiste en la recolección de flebotomíneos en lugares de descanso de insectos como paredes de la vivienda, corrales de animales, rocas, cuevas de animales, tronco de árboles o raíces tablares de grandes árboles, etc. Se debe realizar en el intra, peri y extradomicilio • Trampas pegantes o adhesivas: se consideran complementarias a las capturas en reposo y requieren de menor esfuerzo. Se pueden dejar durante 5 o más días en el interior de la vivienda. En el peri y extradomicilio deberán ser revisadas más frecuentemente durante el periodo de lluvias. Adicionalmente, este método permite evaluar grandes trayectos de varios kilómetros registrándose la composición y densidad relativa de los flebotomíneos (Alexander, 2000).

Recolección y conservación del material entomológico La recolección del material entomológico capturado en las trampas de luz, sobre cebo animal, en reposo y humano deberán sacrificarse introduciendo algodón embebido con acetato de etilo u otro reactivo en los recipientes de captura. 85

Seguidamente depositar los ejemplares sacrificados en un plato de fondo blanco y proceder a separar el material con pinzas entomológicas, separando los flebotomíneos de la fauna acompañante. Finalmente, depositar aproximadamente 5-10 flebotomíneos por vial Eppendorf ® con alcohol al 70%, isopropanol o conservar en seco, de acuerdo a los objetivos del estudio. Para las capturas sobre las trampas con cebo animal y pegantes, se recomienda colectar cuidadosamente los ejemplares usando una aguja entomológica. Todo el material recolectado deberá ser rotulado con la fecha, sitio de captura, y método de trampeo, esta información debe ir en el interior de los viales escrita con lápiz. El material capturado en campo, sin la debida información, pierde validez.

Estudio de posibles reservorios Un reservorio, es un sistema ecológico en el cual el patógeno puede mantenerse por mucho tiempo. Estos sistemas comprenden varias especies de vectores y animales que viven bajo las mismas condiciones epidemiológicas, ambientales, de proximidad espacial y densidad poblacional, favoreciendo la transmisión del patógeno entre ellos (Ashford, 1996). Previo al inicio de la captura de pequeños mamíferos se deberá tramitar los permisos ante la autoridad competente. Zonas de transmisión de leishmaniasis visceral En estas localidades el principal reservorio sospechoso es el perro para lo cual deberán tomarse las siguientes muestras. • Una muestra de sangre a todos los perros con el fin de determinar los títulos de anticuerpos séricos (IFI) contra el parásito. • Exámenes parasitológicos a partir de un extendido de aspirado de ganglio poplíteo o de ulceras activas. • El resultado positivo en las anteriores pruebas, implica un sacrificio del perro concertado previamente con el propietario del animal. • Otras especies como marsupiales (ej; Didelphis marsupialis) han sido implicadas como reservorios de L. visceral y su captura debe realizarse con trampas tipo tomahawk descritas más adelante (Travi et al., 1994).

Zonas de transmisión de leishmaniasis cutánea En estas localidades los estudios están dirigidos al muestreo de los animales domésticos y silvestres. • En los animales domésticos (perros y equinos) deberá buscarse lesiones cutáneas activas o sospechosas y proceder a tomar una biopsia o aspirado para identificar el parásito. • En animales silvestres se deberán realizar capturas de pequeños mamíferos como marsupiales y roedores principalmente, con trampas sherman y tomahawk en el intra, peri y extradomicilio. • Los animales silvestres capturados deben ser sacrificados y se tomaran biopsias de piel, ganglio (cuello o poplíteo), hígado y bazo. • Las muestras pueden ser almacenadas en solución salina + penicilina streptomicina al 10 % para ser aisladas en medios de cultivo (ej; Triple NNN, agar sangre o Senejkie). • Alternativamente una parte de las muestras se deben almacenar en viales eppendorf de 1.8 ml con alcohol absoluto para la identificación por métodos moleculares (Brandão et al., 2003). Tipos de trampas para muestreos de pequeños mamíferos: Trampas sherman y tomahawk (http://www.forestry-suppliers.com/)

Actividades posteriores al estudio del foco Se deberá elaborar un informe final el cual debe incluir entre otros: Las características geográficas, económicas, sociales y otros factores de riesgo para adquirir la enfermedad. Anexar información indicando las potenciales especies de flebotomíneos implicados en la transmisión del parásito. Adicionalmente, incluir un listado de los posibles reservorios capturados en la zona de estudio. Fase de seguimiento del estudio de foco: En esta fase se debe vigilar el tratamiento de los casos. Fortalecer las actividades de vigilancia epidemiológica con participación activa de la comunidad para la búsqueda activa de nuevos casos. 87

Evaluar las intervenciones realizadas y hacer los ajustes necesarios con coordinación de las seccionales de salud y del gobierno municipal. Vigilancia entomológica Debe hacerse siempre un muestreo de los flebotomíneos en los estudios de foco según la metodología propuesta y donde debe participar el funcionario operativo encargado de la prevención y control de las enfermedades transmisibles por vectores en el nivel local. Es recomendable mantener dicha vigilancia de forma continua, con el fin de conocer la diversidad de especies presentes en las diferentes zonas de importancia epidemiológica, así como su bionomía y estacionalidad. Vigilancia de Reservorios Sólo se justifica para los casos de leishmaniasis visceral y es una función del promotor de saneamiento ante la confirmación del caso, para lo cual se debe sangrar los perros sospechosos para realizar pruebas serológicas de IFI a partir del aspirado poplíteo. Definición de mecanismos operativos Designación de un coordinador de la vigilancia de la salud pública en cada dirección local de salud y de vigilancia epidemiológica en cada institución prestadora de servicios de salud. Constitución y funcionamiento de los comités de vigilancia de la salud pública municipal y de vigilancia epidemiológica. Asesoría, asistencia técnica, evaluación y control desde la dirección seccional al proceso de vigilancia de la salud pública realizada por las direcciones locales y de vigilancia epidemiológica. Evaluación del impacto • Incidencia general y específica por edad y sexo, por departamento y municipio. • Mapa de riesgo por municipio según presencia de casos y focos. • Proporción de mortalidad por leishmaniasis en población general y por grupos de edad. • Distribución de los casos según forma clínica de la enfermedad. • Porcentaje de casos hospitalizados. 88

Referencias citadas Alexander, B. 2000. Sampling methods for phlebotomine sandflies. Medical and Veterinary Entomology. 14: 109-122. Alexander B, Maroli MN. 2003. Control of phlebotomine sandflies: a review. Medical and veterinary entomology. 2003;17(1):1-18. Ashford, R. W. 1996. Leishmaniasis reservoirs and their significance in control. Clin. Dermatol 14: 523-32. Brandao-Filho SP, Brito ME, Carvalho FG, Ishikawa EA, Cupolillo E, Floeter-Winter L. y Shaw JJ. 2003. Wild and synanthropic hosts of Leishmania (Viannia) braziliensis in the endemic cutaneous leishmaniasis locality of Amaraji, Pernambuco State, Brazil.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 97: 291-6. Travi BL, Jaramillo C, Montoya J, Segura I, Zea A, GonĂ§alves A, Velez ID 1994. Didelphis marsupialis, an important reservoir of Trypanosoma Schizotrypanum) cruzi and Leishmania (Leishmania) chagasi in Colombia. Am. J. Trop. Med. Hyg. 50: 557 â&#x20AC;&#x201C; 561.

11.

CONCEPCIONES Y

APROXIMACIONES AL TRABAJO CON LA COMUNIDAD

Alejandro Valencia Tobón Para el estudio de la leishmaniasis es necesario evaluar los diferentes factores involucrados en la transmisión de la enfermedad: el vector, el parásito, los reservorios y el hombre, de una manera integral y en un contexto determinado, ya que las comunidades que padecen la enfermedad presentan condiciones particulares de vivienda, ocupación, recursos económicos, concepciones religiosas, medicina tradicional, entre otras, que pueden variar las dinámicas de transmisión de la enfermedad. El analizar todas estas variables cualitativas, permitirá evaluar el microfoco de la enfermedad, con lo cual se puede establecer cómo la misma enfermedad será juzgada e intervenida de manera diferente dependiendo de la localidad específica donde se esté presentado. En el proceso de selección de la población con la cual se desea trabajar, es importante realizar un contacto previo, y de ser posible contar con el acompañamiento de una persona de la zona, preferiblemente un líder comunitario, fácilmente identificado, y que sea un apoyo en el trabajo. La información ofrecida por el grupo de investigación, en cada una de las charlas, 90

debe incluir datos sobre riesgos de transmisión, ciclos de la enfermedad, característicos del vector y del parásito, tipos de medicamento, centros de salud donde se diagnostica la enfermedad y medidos de protección. Este trabajo, es retroalimentado por la misma comunidad en la medida que ellos deben exponer cuáles son sus conocimientos de la enfermedad, y jamás debe concebirse como una imposición de conocimientos por parte del grupo investigador (Artemiev et al., 1972; Killick-Kendrick, 1987; Doha et al., 1990; Sivagnaname y Amaldra, 1997; Imagen Corporativa ISAGEN y PECET 1998; Alexander et al., 2002, Informe PECET ISAGÉN, 2007). La socialización puede ser desarrollada por medio de conferencias con material didáctico: videos, carteleras, fotografías, material entomológico y otros elementos que permitan recrear y exponer las características de la enfermedad y su ciclo de transmisión. Para evaluar el grado de conocimiento de la comunidad se pueden desarrollar encuestas, sin embargo, es la comunicación libre y espontánea, producto de una simple conversación la que dará cuenta del grado de conocimiento y de la percepción que se tiene por parte de la comunidad con la que se trabaja (Vélez et al., 1987; Restrepo et al., 1991; Vélez, 1997; Imagen Corporativa ISAGEN y PECET 1998; Vélez et al., 2005) De esta manera, la investigación se realiza con los testimonios de la población, personas que libremente expresan sus conocimientos, a partir quizá de experiencias propias con la enfermedad, bien sea por ser “curanderos”, o por haber padecido la misma. Posterior a esto, a través de la relación establecida con la comunidad, se podrá interpretar la información obtenida. De ahí que el objetivo del componente social del trabajo sea responder por los significados que han construido los habitantes de una zona determinada en torno a la leishmaniasis. Para posibilitar el intercambio puro con la comunidad, es importante indagar por las transformaciones experimentadas por cada paciente y su familia, al haber sido enfrentados a la enfermedad y al tratamiento médico administrado o al tratamiento propio de cada localidad. Esto debe ir de la mando del análisis del entorno social y de sus vínculos familiares. Finalmente, es importante anotar que la población puede ser convocada por medio de contactos previos a la visita, valiéndose del personal de salud local, de funcionarios de la alcaldía, líderes de la comunidad y de diversos medios de comunicación como emisoras o periódicos locales. 91

Referencias citadas Artemiev MM, Flerova OA, Belyaev AE. 1972. Quantitative evaluation of the productivity of breeding places of sandflies in the wild and in villages. Meditsinskaya Parazitologiya I Parazitarnye Bolezni, 41, 31–35. Doha S, Kamal H, Shehata M, Helmy N, Kader MA, El Said S, El Sawaf BM. 1990. The breeding habitats of Phlebotomus sand flies (Diptera: Psychodidae) in El Agamy, Alexandria, Egypt. Journal of the Egyptian Society of Parasitology, 20, 747–752. Killick-Kendrick R. 1987. Breeding places of Phlebotomus ariasi in the Cévennes focus of leishmaniasis in the South of France. Parassitologia, 29, 181–191. Imagen Corporativa ISAGEN y PECET. 1998. De mosquitos y zancudos no nos dejemos picar. Picadura de pito o leishmanasis, paludismo y dengue. Proyecto Hidroelectrico Miel I. Cartilla para la comunidad. 1998. Informe 21 PECET ISAGÉN. 2007. Leishmaniosis y Proyecto Hidroeléctrico Miel II. Restrepo AM; Jaramillo L; Ocampo O de J; Vélez ID. 1991. Características clínicas y epidemiologicas de la leishmaniosis cutanea. Estudio de pacientes atendidos en Medellín (1986-1988). IATREIA. 4 (2): 49 – 55 Sivagnaname N, Amaldraj DD. 1997. Breeding habitats of vector sandflies and their control in India. Journal of Communicable Diseases, 29, 153–159. Velez ID; Ospina S; Henao G; LePape P; Correa M; Wolff M; Jaramillo J. 1987. Epidemiología de la leishmaniasis cutanea en San Roque, Antioquia. Boletín Epidemiologico de Antioquia. 12 (4): 354 – 359. Velez ID. 1997. Tratamiento de las leishmaniosis. En: Primer seminario distrital de enfermedades transmitidas por vectores. Secretaría Distrital de Salud, Dirección de Salud Pública. 24 p. Vélez I.D., Rodriguez E, Duarte R, López L, Castaño M, Colorado D, Carrillo L, Sierra D, Robledo S, Jiménez J, Quintana J, Fonseca I, Rincón C. 2005. Enfermedades Tropicales. Guía de manejo de ETV y accidente ofídico. Programa de Promoción y Prevención de enfermedades Tropicales y Accidente Ofídico en las Fuerzas Militares Colombianas.