Diagnóstico y control de la leishmaniasis en Centroamérica by Alejandro Valencia-Tobón

ISBN 978-958-714-389-8

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNOSTICO Y CONTROL DE LA LEISHMANIASIS EN CENTRO AMERICA Editores: Iván Darío Vélez Bernal Sara María Robledo Restrepo

Autores: 1,2

Iván Darío Vélez Bernal

1,2

Sara María Robledo Restrepo 1,2

Carolina Torres Gutiérrez

1,3

Lina María Carrillo Bonilla 1

Liliana López Carvajal

1,2

Carlos Enrique Muskus López 1,2

Marcel Marín Villa 4 Mónica Zuleta 1 Eugenia Maria Cardona Rivilla 1 María Angélica Contreras Gutiérrez 1 Richard Hoyos López 1 Karina Mondragón Shem 1 Luz Adriana Acosta Cardona 1 Horacio Cadena Peña 1 Rafael José Vivero Gómez 1 Alejandro Valencia Tobón 1 Raúl Leonardo Rocha Orjuela 1 Andrés Vélez Mira Diseño y Diagramación: Juan Fernando Cuartas Rivas FILIACIONES 1. PROGRAMA DE ESTUDIO Y CONTROL DE ENFERMEDADES TROPICALES PECET 2. FACULTAD DE MEDICINA 3. FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS 4. FACULTAD DE CIENCIAS SOCIALES Y HUMANAS UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA MEDELLIN, COLOMBIA 2010

CONTENIDO

Páginas PRESENTACIÓN

1 GENERALIDADES 1.1 Microbiología 1.2 Patogénesis 1.3 Respuesta inmune 1.4 Manifestaciones clínicas 1.4.1 Leishmaniasis cutánea 1.4.2 Leishmaniasis mucosa 1.4.3 Leishmaniasis cutánea difusa 1.4.4 leishmaniasis visceral 1.5 Los Reservorios

7 7 11 14 18 19 20 22 24 25

2 DIAGNÓSTICO 2.1 Métodos Directos 2.1.1 El extendido o frotis 2.1.2 El cultivo 2.1.3 La biopsia 2.1.4 La Reacción en cadena de la ADN polimerasa o PCR 2.2 Métodos Indirectos 2.2.1 La Inmunofluorescencia Indirecta 2.2.2. El ELISA 2.2.3 La prueba de Montenegro o Leishmanina 2.2.4 Inmunocromatografía

27 29 29 33 34 35 37 37 38 40

3 TRATAMIENTO

3.1 Antimoniales pentavalentes (Sb5) 3.2 Miltefosina 3.3 Anfotericina B 3.4 Sulfato de paromomicina 3.5 Isotianato de Pentamidina 3.6 Termoterapia 3.7 Crioterapia

41 43 43 44 44 44 45

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4 ENTOMOLOGIA 47 4.1 Generalidades sobre los flebotomíneos 47 4.2 Sistemática de los flebotomíneos 47 4.2.1 Clasificación y Generalidades de la Familia Psychodidae 47 4.2.2 Subfamilia Phlebotominae 47 4.2.3 Géneros en la Subfamilia Phlebotominae 48 4.2.4 Nombres populares de Lutzomyia en Latinoamérica 48 4.3 Biología de flebotomíneos: Ciclo de vida 48 4.3.1 Fases Inmaduras 49 4.3.2 Fase adulta 50 4.4. Taxonomía de flebotomíneos 51 4.4.1 Young & Duncan (1994) 51 4.4.2 Galati (2003) 51 4.5 Morfología de flebotomíneos 51 4.5.1 Cabeza 52 4.5.2 Tórax 53 4.5.3 Abdomen 53 4.6 Aspectos de la ecología y fisiología de los flebotomíneos 54 4.6.1 Alimentación 54 4.6.1.1 Alimentación con azúcares 54 4.6.1.2 Búsqueda, alimentación y digestión de sangre 55 4.6.2 Reproducción 56 4.6.3 Relación Vector-Parásito 57 4.7. Incriminación de especies vectores 59 4.8 Establecimiento y mantenimiento de colonias de flebotomineos en condiciones de laboratorio 62 4.9 Métodos de conservación, aclaración y montaje de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) 64 4.9.1 Aclaramiento de flebotomíneos 65 4.9.2 Montaje de flebotomíneos 66 4.10. Estudios entomologicos en campo 67 4.10.1 Estudio entomológico transversal 68 4.10.2 Estudio entomológico longitudinal 68 4.11. Métodos de muestreo de flebotomíneos 69 4.12. Recolección y conservación del material entomológico 70 4.13. Inclusión de material en una colección entomológica 71

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5 ESTUDIOS ECOEPIDEMIOLOGICOS DE FOCO 5.1 Caracterización epidemiológica del foco 5.1.1 Búsqueda activa de casos 5.1.2 Identificación del grupo de población que está en mayor riesgo de infectarse mediante la aplicación de la Prueba de Montenegro 5.1.3 Búsqueda de reservorios domésticos 5.1.4 Estudio entomológico 5.2 Caracterización antropológica 5.3 Caracterización ecológica

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80 80 80 80 81

6 LEISHMANISIS EN CENTRO AMERICA 6.1 Introducción 6.2 Formas clínicas y especies de Leishmania 6.2.1 Leishmaniosis cutánea 6.2.2 Leishmaniasis cutánea difusa 6.2.3 Leishmaniasis cutánea atípica 6.2.4 Leishmaniasis Mucosa 6.2.5 Leishmaniasis Visceral 6.3 Distribución Geografíca y Frecuencia de Leishmaniasis 6.4 Vectores 6.5 Reservorios 6.6 Control

81 81 82 82 85 87 87

7 PREVENCION Y CONTROL

8. LEISHMANIASIS CANINA 8.1 Leihmaniasis visceral canina 8.2 leshmaniasis cutanea canina 8.3 Prevencion y control

92 92 93 94

9. SISTEMAS DE INFORMACION GEOGRAFICA

AGRADECIMIENTOS

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BIBLIOGRAFIA ANEXOS Anexo 1 Atención a pacientes Anexo 2. Consentimiento informado Anexo 3 Prueba cutanea de Montenegro Anexo 4 Toma, manipulación y conservación de muestras Anexo 5 Directo para Leishmania Anexo 6 Detección de Leishmania Anexo 7 Detección de anticuerpos contra toma de muestra por aspirado del borde de la lesión Anexo 8 Historia Clinica Anexo 9 Diligenciamiento y administracion de la Historia clínica Anexo 10 Coloración de placas con GIEMSA Anexo 11 Formato reporte de resultados Anexo 12 Preparación solucion de PBS Anexo 13 Preparación del medio NNN modificado Anexo 14 Preparación del Medio NNN normal Anexo 15 Preparaciín de la Fase líquida Anexo 16 Prueba de esterilidad a medios y soluciones Anexo 17 Cultivo en masa de promastigotes de Leishmania Anexo 18 Prueba de Infectividad Anexo 19 Deteccion de ADN de Leishmania por PCR e identificación De especies de Leishmania por PCR-RFLP

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120 133 136 141 156 161 165 173 178 179 180 184 188 192 195 196 200 201

PRESENTACIÓN

En el Marco del proyecto “Fortalecimiento de los programas de control y sistemas de vigilancia en América Latina” auspiciado por el Programa para el Control de la Leishmaniasis del Departamento de Enfermedades Tropicales Huérfanas de la Organización Mundial de la Salud (HTM/NTD/IDM/OMS) y por la Organización Panamericana de la Salud (OPS), se realizó en el mes de junio de 2008 en la sede del Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales-PECET de la Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia el “ENCUENTRO REGIONAL DE COORDINADORES DE LOS PROGRAMAS NACIONALES DE CONTROL DE LEISHMANIASIS EN LA REGION DE LAS AMERICAS”. Una de las principales conclusiones que arrojó dicha reunión fue la necesidad de fortalecer los programas nacionales de control de la leishmaniasis, la creación o actualización de las normas nacionales de prevención, vigilancia epidemiológica y control de la enfermedad, la transferencia tecnológica para la georeferenciación de casos, para los estudios de focos y para el diagnostico molecular de la enfermedad. El “Manual de Procedimientos para el diagnostico y control de la leishmaniasis en Centro América” resume los principales aspectos relacionados con los aspectos clínicos, epidemiológicos, de prevención y control de la leishmaniasis, con especial énfasis para la región centroaméricana. El programa de fortalecimiento de los programas de control de la leishmaniasis que la OMS está realizando en todas las regiones endémicas del mundo se ha podido llevar a cabo gracias al generoso apoyo de la Agencia Española de Cooperación Internacional AECI Esperamos que este Manual sea de gran ayuda para todas las personas interesadas en el tema y poder contribuir en el éxito en la lucha contra una de las enfermedades que afectan a las poblaciones más pobres en el mundo.

CAPITULO 1

GENERALIDADES DE LA LEISHMANIASIS Iván Darío Vélez B., Sara Maria Robledo R.1, Carlos Enrique Muskus, Liliana López 1.1. Microbiología La leishmaniasis es una enfermedad infecciosa causada por protozoos del género Leishmania, familia Trypanosomatidae. El género Leishmania comprende alrededor de 25 especies que se agrupan en los subgéneros Leishmania y Viannia de acuerdo a la ubicación del parásito en el intestino del vector, a la distribución geográfica y al tipo de presentaciones clínicas que produce la infección por una especie de parásitos en particular (Figura 1.1). Las Leishmanias son parásitos digenéticos, es decir, durante su ciclo de vida se encuentran de dos formas o estadios (Figura 1.2): una forma conocida como promastigote (Figura 1.2a) que mide entre 20-30 ìm, es extracelular, alargado y posee un flagelo que le permite movilidad en el intestino de los insectos vectores que los transmiten. La otra forma es conocida como amastigote (Figura 1.2b), mide entre 2-5 ìm es redondeado, carece de flagelo, es intracelular y se multiplica en células del sistema de células mononucleares fagociticas, principalmente macrófagos. Ambas formas del parásito se dividen por fisión binaria, y además posee una única mitocondria modificada conocida como kinetoplasto. La forma de promastigote es transmitido a algunos mamíferos, entre ellos los humanos, por la picadura de un insecto vector del género Lutzomyia en el Nuevo Mundo (América) y Phlebotomus en el Viejo Mundo (Europa, Asia y África) (Figura 1.3). En el hospedero mamífero, el promastigote infecta a, o es fagocitado por, los macrófagos de la piel. Al interior del macrófago se forma una vacuola parasitófora la cual se fusiona con lisosomas generando lo que se conoce como fagolisosoma. Dentro del fagolisosoma el promastigote se transforma en amastigote y se multiplica hasta lisar el macrófago. Los amastigotes libres infectan o invaden otros macrófagos que han sido reclutados al sitio de la infección (Figura 1.4). Cuando un insecto vector pica nuevamente a un humano o reservorio, el vector ingiere células infectadas con amastigotes. En el intestino del vector las células se lisan liberando los amastigotes, que rápidamente se transforman nuevamente en promastigotes.

Contribución por igual

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Figura 1.1. Clasificación taxonómica de especies de Leishmania. Se han propuesto varios tipos de clasificación para el género Leishmania. La mas utilizada actualmente es la clasificación propuesta por Lainson y Shaw que dividió el género Leishmania en dos sub-géneros: Leishmania sensu stricto, presentes tanto en Europa, Asia, Africa y América y Viannia, limitadas a América. Dentro de estos dos sub-géneros se individualizaron complejos de varias especies.

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Figura 1.2. Estadios biológicos de Leishmania spp. Representaciones esquemáticas y fotográficas de los estadios de promastigote metacíclico (a) y amastigote (b). Nótese en ellos las estructuras características de núcleo (n), kinetoplasto (k) y flagelo (f).

Figura 1.3. Vectores de Leishmaniasis. Representaciones esquematicas de un macho (a) y una hembra (b) of Lutzomyia spp.

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Figura 1.4. Ciclo de vida de Leishmania spp. 1. El vector al picar toma la sangre del hospedero e inyecta promastigotes en la piel. 2. Los promastigotes son fagocitados por los macrófagos y los polimorfonucleares neutrófilos que llegan al sitio de la picadura. 3. Los macrófagos fagocitan los neutrófilos parasitados. 4. Los promastigotes se transforman en amastigotes al interior del macrófago y se multiplican como amastigotes. 5. La multiplicación de los amastigotes produce la lisis de los macrófagos. 6. Los amastigotes libres invaden o son fagocitados por otros macrófagos y por las células dendríticas presentes en la piel. 7. El vector al picar ingiere macrófagos infectados con amastigotes. 8. En el intestino del vector los amastigotes se transforman en promastigotes procíclicos. 9. Los promastigotes se multiplican por fisión binaria. 10. Los promastigotes procíclicos se desarrollan a promastigotes metacíclicos (infectivos) listos para ser inyectados con una nueva picadura.

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Los parásitos de Leishmania en la escala evolutiva parecen ser organismos intermedios entre procariotes y eucariotes, pues presentan características de ambos. A pesar de que Leishmania posee un núcleo compartamentalizado por una membrana, la transcripción es policistrónica y los transcriptos no poseen intrones de manera similar a las bacterias. Otra de las características particulares de estos parásitos es la presencia de una sola mitocondria modificada, conocida como kinetoplasto. Esta organela contiene dos tipos de ADN circular denominados minicírculos y maxicírculos. Los minicírculos pueden tener de 500 a 10.000 pares de bases, concatenados entre sí y un kinetoplastido pueden albergar entre 5000 y 10.000 copias. Los maxicírculos tienen entre 20.00040.000 pares de bases y puede haber entre 25 y 50 copias en el kinetoplasto. En los maxicírculos se encuentran los genes que codifican por enzimas necesarias para la producción de energía, los cuales sintetizan transcriptos no funcionales, pero se vuelven funcionales por un proceso conocido como edición del RNA, proceso en el cual intervienen los RNA guías (RNAg), sintetizados en los minicírculos. Lo que hacen estos RNAg es dirigir la inserción o delección de uracilos en sitios específicos de los RNAs mensajeros que codifican estas enzimas mitocondriales, asistido por un complejo proteico denominado editosoma. 1.2. Patogénesis Los parásitos del género Leishmania son protozoos intracelulares obligados; por tanto, para iniciar y mantener la infección en un hospedero mamífero, los parásitos transmitidos por el insecto vector deben infectar los macrófagos quienes servirán como células hospederas, ya que es dentro de ellas donde los parásitos lograrán sobrevivir y multiplicarse. El establecimiento de la infección y el desarrollo de enfermedad clínica evidente o la resolución de la infección, dependerá, además de la dosis y ruta de inoculación, de la capacidad del macrófago para activarse. Por ser Leishmania un parásito intracelular obligado y que es transmitido por un insecto vector, el desarrollo de enfermedad depende de factores propios del parásito, pero también de factores inherentes al hospedero y al vector. La entrada del parásito en la célula hospedera, al igual que el establecimiento de la infección y el desarrollo de la enfermedad, son procesos dinámicos que involucran una serie de interacciones ligando-receptor entre moléculas del parásito y de la célula hospedera y la respuesta inmune específica que se desarrolla, en ocasiones capaz de resolver la infección y en otras, por el contrario, capaz de favorecer el desarrollo de la enfermedad. Al parecer, la infección es un proceso facilitado por componentes de la saliva del vector que permitiría la entrada y supervivencia intracelular del parásito, al inhibir la acción de citoquinas activadoras del macrófago lo cual en última instancia favorece la infección persistente, las recurrencias y las metástasis.

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Como se mencionó anteriormente, la infección inicia cuando el insecto flebotomineo hembra infectado pica a un hospedero mamífero para alimentarse de sangre. Al picar, el flebotomineo infectado regurgita junto con la saliva e inocula entre 10 y 200 promastigotes en la dermis (Figura 5); inmediatamente después, los promastigotes en su intento por escapar a la acción de la lisis por el complemento activado interactúan con los neutrófilos y macrófagos presentes en la dermis. Los neutrófilos fagocitan los promastigotes y a su vez, los promastigotes entran en los macrófagos a través de un proceso que se conoce como fagocitosis facilitada, en el cual los promastigotes penetran activamente el macrófago formando un fagosoma que, al fusionarse con los lisosomas, da origen al fagolisosoma. Es al interior del fagolisosoma donde los promastigotes se transforman en amastigotes y son capaces de sobrevivir y multiplicarse profusamente, llevando a la lisis del macrófago infectado. Los amastigotes liberados penetran macrófagos adyacentes o se diseminan por vía linfática y sanguínea para ingresar a macrófagos localizados en sitios distantes como ganglios linfáticos, hígado, bazo y médula ósea. La presencia del parásito en el tejido ocasiona una reacción inflamatoria de tipo granulomotosa crónica, con reclutamiento de un gran número de células no específicas de antígeno, con predominio de los fagocitos mononucleares (neutrófilos y macrófagos), y a la activación de dichas células por las citoquinas liberadas por linfocitos Th1, que han sido activados a su vez por las células presentadoras de antígeno. Con la activación de los macrófagos se incrementa la liberación de factores inflamatorios como el interferon-gamma (IFN-g ) y se favorece la extravasación de células y fluidos desde los vasos sanguíneos hacia el sitio de infección y su acumulación en el tejido, ocasionando edema e induración local (Figura 1.5). En el sitio de la picadura aparece inicialmente un eritema que luego pasa a pápula. La lesión continúa creciendo y se desarrolla un nódulo. El nódulo es producido por la masa dermal que contiene macrófagos vacuolados con abundantes Leishmania y un infiltrado linfocitario. Los nódulos crecen en tamaño y como consecuencia de la necrosis en el centro de la reacción granulomatosa que se induce por la respuesta inmune, los nódulos se úlceran. Inicialmente se observan úlceras costrosas, redondeadas, de bordes levantados y son indoloras. A nivel sistémico, luego de la multiplicación del parásito en la piel, que puede causar o no una lesión pequeña transitoria, los parásitos y los macrófagos infectados alcanzan órganos y tejidos hematopoyéticos (hígado, bazo y medula ósea). Allí los parásitos se multiplican, infectan macrófagos locales, alterando la funcionalidad de dichos órganos y tejidos y causando la LV. Por último, luego de eliminado el parásito, ya sea porque la respuesta inmune fue efectiva o por

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acción del tratamiento especifico contra Leishmania se inicia la resolución de la lesión (cicatrización) con la producción de colágeno y metaloproteasas de la matriz extracelular por parte de las células hospederas para permitir con ello la remodelación del tejido y continua con la migración y proliferación de queratinocitos y luego de fibroblastos hacia el tejido afectado. Los fibroblastos se transforman en miofibroblastos que favorecen la contracción de las heridas. Luego ocurre un proceso de angiogénesis masiva que lleva a la formación de nuevos vasos sanguíneos y del tejido conectivo resultante conocido como tejido de granulación que culmina con la transición de este tejido a cicatrices maduras.

Figura 1.5. Respuesta inmune a la infección por Leishmania spp. La lesión producida por la Lutzomyia spp al picar al mamífero induce una respuesta inflamatoria con el fin de reparar el tejido lesionado, favoreciendo la activación de la cascada del Complemento y la migración de células inmunológicas como polimorfonucleares neutrófilos (PMNN) y macrófagos (M ). Los promastigotes inyectados por el vector en el sitio de la picadura son eliminados por el Complemento (C5-C9), mientras que otros son opsonizados por el C3, favoreciéndose su entrada en los

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M tisulares. Otros parásitos pueden infectar PMNN para que posteriormente sean fagocitados por los M . Al interior del M los promastigotes se transforman en amastigotes y se multiplican profusamente, favoreciendo la lisis de los M infectados. Los amastigotes libres son internalizados por otros M o por células dendríticas (CD) adyacentes. Dependiendo de la carga parasitaria y del estado inmunológico del hospedero, los M? pueden ser capaces de eliminar los amastigotes y resolver la infección o por el contrario ser incapaces de activar sus mecanismos microbicidas, favoreciendo el desarrollo de la lesión en el tejido infectado. Las CD que han internalizado amastigotes en el tejido y los M infectados migran a los ganglios linfáticos donde presentan los antígenos (Ag) a los linfocitos T ya sean ayudadores (LTh0) o citotóxicos (LTc). Dependiendo del tipo de Ag, de la celula que este presentando los Ags y del influjo de citoquinas que están presentes en el momento de la activación de los LT, se induce la diferenciación de los LTh0 en cualquiera de las diferentes subpoblaciones de LTh, tanto Th1 como Th2, Th17 o T reguladoras (Treg). Los LTh1 y LTreg activados producen IFN-? que activa la respuesta microbicida del M lo que favorece la eliminación de los parasitos y por ende la resolución de la lesión (curación). A su vez, los LTh2 activados producen citoquinas que activan los Linfocitos B (LB) para que se transformen en células plasmáticas productoras de anticuerpos (Acs). La presencia de Acs se asocia con exacerbación de la lesión ya que favorece el ingreso de los promastigotes y los amastigotes a otros M Por su parte, los LTh17, aunque aun no es claro su papel, al parecer favorecen el reclutamiento de PMNN al sitio de la lesión, permitiendo que perdure el estimulo inflamatorio. 1.3 Respuesta inmune La adaptación del parásito al hospedero es, al parecer, el resultado de una presión selectiva que el sistema inmune ejerce sobre la evolución y biología del parásito. Tanto los promastigotes inoculados por el vector como los amastigotes intracelulares deben resistir a los mecanismos de defensa del hospedero tales como la lisis, mediada por el Complemento, por especies reactivas del oxigeno (ROS) o por hidrolasas lisosomales; y también a los mecanismos microbicidas mediados por el IFNg Algunos aspectos de la biología del parásito, como por ejemplo, infectividad y virulencia, son el resultado de una modulación del sistema inmune que hace que los parásitos sean capaces de utilizar algunos componentes de la respuesta inmune del hospedero para propiciar su sobrevivencia y perpetuación dentro del hospedero mamífero. Algunos de los mecanismos de evasión que utiliza Leishmania son: interacción de los promastigotes con la célula hospedera a través de moléculas o receptores que no inducen mecanismos microbicidas en el macrófago, retardando la formación del fagolisosoma y capturando ROS a través del lipofosfoglicano expresado en la membrana del promastigote y finalmente transformándose en amastigotes para resistir así el pH acido del fagolisosoma y la acción de las enzimas lisosomales.

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El espectro de infección y enfermedad que se observa en los focos naturales de transmisión de Leishmania es muy amplio. Es así como en la población expuesta a la picadura del vector es común observar individuos que se no se infectan e individuos que se infectan y no desarrollan la enfermedad y otros que si desarrollan la enfermedad. Los individuos que no se infectan son negativos a la prueba de Montenegro (una intradermorreacción con antígenos específicos de Leishmania spp), mientras que los que se infectan presentan una prueba de Montenegro positiva. En el grupo de individuos infectados, algunos no desarrollan lesiones y permanecen asintomáticos (infección subclínica) mientras que otros desarrollan enfermedad que en algunos puede resolver fácilmente, con pocas manifestaciones clínicas mientras que otros desarrollan graves lesiones crónicas. Este espectro de fenotipos clínicos en el humano se debe a la interacción de una serie de factores que determinan finalmente la susceptibilidad o resistencia a la infección o enfermedad por Leishmania. Entre dichos factores se encuentran: a) factores ecoepidemiológicos que incluyen condiciones de clima que favorecen la presencia en un lugar geográfico particular de los elementos de la transmisión: vectores y reservorios infectados y el contacto entre el hombre y el vector infectado; b) factores genéticos entre los que se incluye la posible participación de genes de citoquinas y de sus receptores cuya expresión estaría relacionada con susceptibilidad o resistencia a la infección por Leishmania, como son los genes de IL-4 y del receptor para IFN-? ? que al parecer están asociados con susceptibilidad y resistencia a LV; y c) factores inmunológicos del hospedero que hacen referencia a la capacidad o no del hospedero para desarrollar una respuesta inmune efectiva. La mayoría de los promastigotes inyectados por el vector son eliminados por el Complemento sérico activado durante la respuesta inflamatoria y por los ROS y enzimas lisosomales producidas por el macrófago durante la respuesta microbicida, lo que se traduce en una infección limitada con fácil resolución. Esto explicaría el por qué muchos de los individuos expuestos a la transmisión y que evidencian infección con una prueba de Montenegro positiva no desarrollan enfermedad. Es decir, en algunos individuos, la mayoría de promastigotes que inocula el vector son destruidos antes de ingresar a la célula hospedera y los que logran entrar al macrófago, transformarse en amastigotes y multiplicarse dentro de la célula hospedera son eliminados por la acción de la respuesta inmune desencadenada. Sin embargo, el sistema inmune queda sensibilizado y ante una nueva exposición a antígenos del parasito, el sistema inmune reconoce estos antígenos y reacciona dando una respuesta positiva. La resolución de la infección y el desarrollo de una respuesta curativa o cicatrizante depende de la

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inducción y activación de una respuesta inmune mediada por células T, tanto Linfocitos T ayudadores tipo 1 (LTh1) como linfocitos T citotóxicos (LTc), productores de Interferon gamma (IFN-? ), una citoquina que es capaz de activar los macrófagos infectados a través de la producción de ROS, permitiendo con ello la resolución de la infección o en su defecto, la involución de la lesión y un posterior cicatrización. En términos generales, la respuesta inmune que se genera ante la infección por Leishmania se puede resumir de la siguiente manera (Figura 5): con el trauma producido por la picadura del flebótomo vector se activa en el hospedero el proceso inflamatorio con el objetivo de reparar el tejido lesionado. La respuesta inflamatoria trae como consecuencia la migración de células proinflamatorias, principalmente neutrófilos y macrófagos pero también células asesinas naturales (NK) y mastocitos, desde la circulación hacia el sitio donde se encuentra el parásito. El influjo de estas células puede ocurrir mientras perdure el antígeno. En los tejidos, los neutrófilos y macrófagos fagocitan los promastigotes inoculados por el vector con el fin de destruirlos. Simultáneamente, los macrófagos fagocitan también los neutrófilos que han fagocitado leishmanias. Al parecer la entrada del parásito en los neutrófilos es una forma que utilizan los promastigotes para evadir la lisis por el Complemento que ellos activan por la vía alterna y para llegar al interior de los macrófagos que son sus células hospederas, donde pueden transformarse en amastigotes, multiplicarse y sobrevivir dentro del hospedero. Por su parte, los promastigotes pueden inducir directamente la secreción de IFN-? ? por las células NK. El Complemento activado favorece la destrucción de muchos de los promastigotes que están aun extracelulares disminuyendo así el número de parásitos disponibles para iniciar la infección (Figura 1.5). Desafortunadamente, la multiplicación de los amastigotes dentro del macrófago es un proceso muy activo, por lo que los macrófagos infectados son fácilmente lisados liberando abundantes amastigotes que son capaces de infectar células adyacentes, como macrófagos y células dendríticas, entre otras. Los amastigotes liberados durante la lisis de los macrófagos infectados encuentran a las células de Langerhans y otras células dendríticas que están transitando por la dermis y son ingeridos por ellas para luego transportar los antígenos a los nódulos linfoides regionales drenantes de la lesión (Figura 1.5). En el nódulo linfoide las células dendríticas presentan los antígenos del parásito a los LTh y LTc.

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Luego de la interacción del LTh0 y LTc con los antígenos presentes en la membrana de la célula presentadora de Ag, los LT proliferan y se diferencian a LTh1 productores de IFN-? . Otras citoquinas producidas por las mismas células infectadas, por los LT activados o por las células presentadoras de ? ? favorecen la activación de Ag, como son la interleuquina 12 (IL-12), IL-1, IL-23, IL-27 y el TNF-? la respuesta inmune mediada por los LTh1 y los LTc que tienen como fin activar los macrófagos infectados a través del IFN-? ? ? Adicionalmente, la secreción temprana de IL-12 induce la producción de IFN-? ? por las células NK. El IFN-? ? producido activa los mecanismos microbicidas dependientes de ROS en el macrófago infectado, potenciando así la eficiencia del macrófago en la destrucción y eliminación de los amastigotes que posee en su interior. Por otro lado, los LTh1 y LTc activados son capaces de inhibir la producción de citoquinas como IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 y del factor de crecimiento de tumores ? ? (TGF-? ) por parte de los LTh2, una respuesta que aunque puede prevenir la destrucción del tejido, promueve la infección de los macrófagos a través de la interacción entre las inmunoglobulinas (anticuerpos) producidos por las células plasmáticas que han sido activadas por las citoquinas del perfil Th2 y los receptores para dichas inmunoglobulinas que expresan los macrófagos. Las citoquinas del perfil Th2 también bloquean la activación de los macrófagos, permitiendo la multiplicación intracelular del parásito, lo que a su vez, favorece la exacerbación de la enfermedad. Los estudios realizados en humanos para tratar de correlacionar los patrones de citoquinas producidas por LTh y LTc y la leishmaniasis, han mostrado un perfil de citoquinas mezclado diferente al perfil que se encuentra en el modelo murino. Aunque el IFN? ? está asociado al control de la infección o respuesta cicatrizante, y el patrón de citoquinas Th2 predomina en la leishmaniasis cutánea difusa y en la leishmaniasis visceral, al parecer, la respuesta inmune mediada por LTh es más compleja que la simple polarización en Th1 y Th2 ya que en dicha respuesta participan, además las células T reguladoras (LTreg) que secretan IL-10 y TGF-? 1, las células NK que producen IFN-? . Adicionalmente, es importante tener en cuenta que a la fecha se han identificado otras subpoblaciones de LTh como son los LTh9 y LTh17, cuya participación en el resultado de la infección por Leishmania aún está por esclarecer. Los resultados obtenidos en los estudios en humanos sugieren que más que la sola presencia o ausencia de una o más citoquinas, lo que permite distinguir una respuesta inmune efectiva o no es la relación y el balance entre las citoquinas producidas durante la infección y enfermedad.

Manual Diagnóstico y Control de la Leishmaniasis en Centroamérica 1.4. Manifestaciones clínicas: La leishmaniasis se caracteriza por su gran polimorfismo clínico, por ello para muchos autores no se trata de una enfermedad sino de un grupo de enfermedades. Las diferentes manifestaciones clínicas dependen de la especie de Leishmania infectante y de la respuesta inmune desencadenada por el hospedero, y pueden variar desde formas benignas y autolimitadas de leishmaniasis cutánea (LC) hasta las formas más severas como la leishmaniasis mucosa (LM), la leishmaniasis cutánea difusa (LCD) y la leishmaniasis visceral (LV) (Figura 1.6). Figura 1.6. Formas clínicas de leishmaniasis. Fotografias de lesiones características de las principales formas clínicas: leishmaniasis cutánea (LC), leishmaniasis cutánea difusa o diseminada (LCD), leishmaniasis mucosa (LM) y leishmaniasis visceral (LV). (a-c) lesiones porducidas por especies de Leishmania del subgnero Viannia (a) lesion ulcerada de LC acompañada de lindafenitis regional; (b) úlcera franca con forma redondeada, bordes levantados, fondo limpio de color rosado y aspecto granuloso; (c) lesión ulcerada acompañada de infección bacteriana secundaria y signos de inflamación con enrojecimiento y edema; estas lesiones se acompañan de pus y dolor. (d) lesión cutánea producida por L. infantum; (e) lesión cutánea producida por L. tropica; (f) lesión producida por L. major; (g-j) presencia de múltiples lesiones generalmente nodulares en diferentes regiones del cuerpo; (k) destruccción total del septum nasal como consecuencia de una LM. (l y m) pacientes con lesiones mucosas por L. aethiopica; (n) paciente con gran hepato y esplenomegalia, característica de la LV; (o) paciente con PKDL conmultiples lesiones

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Cuando el flebotomineo vector pica a la persona deja en el sitio donde ocurrió la picadura una macula de aproximadamente medio centímetro de diámetro, usualmente rodeada de un halo más claro, que perdura uno o 2 días. Esta macula se presenta como efecto de la picadura independientemente de que el insecto este o no infectado con el parasito. Cuando el vector está infectado y con una gran cantidad de promastigotes en la válvula esofagiana que le dificultan su alimentación con sangre, pica varias veces, en diferentes lugares de la piel, en cada picadura “siembra” promastigotes, y posteriormente van a aparecer simultáneamente varias lesiones en el mismo paciente. Los promastigotes inoculados por el vector invaden los macrófagos de la dermis y se reproducen silenciosamente en ellos, durante un periodo que varía entre 2 semanas y 2 meses; es el llamado periodo de incubación. El aumento del tamaño del granuloma dérmico va a mostrar los primeros signos de la LC, que consiste en un pequeño nódulo, redondeado, indoloro, que aumenta progresivamente de tamaño. En ocasiones el nódulo se convierte en una placa, con descamación epidérmica, pero más frecuentemente el daño en el granuloma que ocasiona el sistema inmune lleva en la mayoría de los casos a la formación de una úlcera característica. En América las leishmaniasis del subgénero Viannia (L. braziliensis, L. panamensis y L. guyanensis) tiene la capacidad invadir las mucosas naso-orofaríngeas y producir el cuadro de leishmaniasis mucosa. Otras especies, como L. amazonensis y en ocasiones L. panamensis se diseminan profusamente en la piel del hospedero y ocasionan la leishmaniasis cutánea diseminada. Por su parte la L. infantum (Syn L. chagasi) va a invadir las células sistema mononuclear fagocítico y producir la LV. 1.4.1 Leishmaniasis Cutánea Americana La LCA se distribuye desde el sur de los Estados Unidos hasta el norte de la Argentina. Sólo Canadá, Chile, Uruguay y la mayoría de las islas caribeñas se encuentran libres de transmisión. La enfermedad, como se explicó previamente, inicia en el lugar de la picadura luego de un período de incubación que dura entre dos semanas y dos meses, con la aparición de un nódulo pequeño, indoloro, de base indurada y que aumenta progresivamente de tamaño, puede presentarse como una lesión única o múltiples lesiones cutáneas (Figura 1.7). El nódulo es producido por una masa dermal que contiene macrófagos vacuolados con abundantes parásitos y un infiltrado linfocitario. El nódulo puede aumentar de tamaño y adquirir la forma de placa o como consecuencia de la necrosis en el centro de la reacción granulomatosa, inducida por la respuesta inmune, convertirse en úlcera.

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Inicialmente la úlcera está cubierta por una costra. Característicamente la costra está bien adherida al fondo de la úlcera y al tratar de retirarla sangra con facilidad; al desprenderse la costra se observa la lesión conocida como “úlcera franca”, de fondo limpio, color rosado, redondeada, de bordes regulares y levantados, indolora y de base indurada (Figura 1.7). En ocasiones las úlceras se infectan secundariamente con bacterias dando lugar a la “úlcera piógena”, que es purulenta y dolorosa; otras veces con hongos como el Sporotrix schenkii. Cuando el vector pica en el pabellón auricular puede producir mutilaciones del mismo. Este tipo de lesión se conoce como la "úlcera de los chicleros" y es muy frecuente en la península de Yucatán, México, producida por L. mexicana. Al parecer en esta región geográfica el vector (Lu. olmeca) tiene cierta preferencia por picar las orejas de las personas. Desde los primeros síntomas de la leishmaniasis cutánea los parásitos invaden los cordones y los ganglios linfáticos, produciendo linfadenopatias regionales. En su evolución natural y dependiendo del agente etiológico la úlcera puede curar espontáneamente, al cabo de algunos meses o volverse crónica. Cuando cura la úlcera deja una cicatriz característica que ha sido descrita como en “bulbo de cebolla” (Figura 1.7).

Figura 1.7. Leishmaniasis cutánea. Fotografias de lesiones características de leishmaniasis cutánea.

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Las características histológicas de la LC son similares en las lesiones producidas por las diferentes especies de Leishmania. La descripción típica es de una formación granulomatosa crónica que consiste en un infiltrado inflamatorio con predominio de histiocitos infectados, presencia de células polimorfonucleares, linfocitos, células plasmocitoides, células plasmáticas. Las lesiones de corta evolución se caracterizan por presentar agregados de histiocitos infectados con abundantes linfocitos y células plasmáticas. El epitelio que recubre la lesión presenta hiperplasia marcada (acantosis) e hiperqueratosis, seguidas de necrosis y úlceración. Las lesiones con costra presentan masas de células epidermales muertas en la superficie y acantosis y papilomatosis en los extremos con abundantes histiocitos infectados y células mononucleares. Las lesiones crónicas se caracterizan por la presencia de infiltrados difusos de histiocitos que pueden estar organizados en forma de granulomas pobres con abundante infiltrado de linfocitos y plasmocitos. La úlceración generalmente se extiende desde la epidermis hacia el tejido subcutáneo. Algunas veces se observan granulomas maduros y células gigantes. Cuando la úlcera comienza a cicatrizar disminuye el número de histiocitos infectados y aumentan los linfocitos. 1.4.2 Leishmaniasis mucosa La LM se presenta cuando Leishmanias del subgénero Viannia se disemina por vía linfática y sanguínea desde una lesión cutánea e invade las mucosas de la región naso-oro-faríngea (Figura 1.8). Esta forma clínica de la enfermedad, llamada “espundia” en Brasil, debe diferenciarse de la lesión mucosa que ocurre por contigüidad de una lesión cutánea en nariz, labios o mejillas y que la puede causar cualquier especie de Leishmania. La invasión del parásito a la mucosa se observa inicialmente como una hiperemia con congestión nasal, que evoluciona a la formación de nódulos semejantes a granos de arroz que confluyen, posteriormente aparece una úlcera y luego se perfora el tabique. El daño continúa con invasión y destrucción de tejidos contiguos, como el paladar blando y duro, labios, faringe, laringe y tráquea. La evolución de las lesiones en mucosas es muy crónica, y pueden persistir durante años; tienen pobre respuesta al tratamiento con antimoniales pentavalentes por lo que las recaídas son frecuentes. Las lesiones mucosas se caracterizan por un infiltrado de abundantes linfocitos y plasmocitos pero pocos histiocitos y parásitos. Se hace evidente la destrucción de estructuras cartilaginosas.

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Figura 1.8. Leishmaniasis mucosa y mucocutanea. Fotografias de lesiones características de leishmaniasis mucosa (a,b,d,e,f) y leishmaniasis mucocutanea (c).

1.4.3 Leishmaniasis cutánea difusa La LCD ha sido reportada en Brasil, Venezuela, México, República Dominicana y Colombia, aunque esta forma de la enfermedad no es muy frecuente en el mundo. La LCD está asociada generalmente con estados de inmunosupresión, ya sea por efecto directo del parásito o por una condición inmunológica que impide que el hospedero responda en forma adecuada ante la infección. En algunos pacientes la infección con Leishmania, principalmente L.amazonensis induce una inhibición de la respuesta de inmunidad celular específica contra el parásito, lo que facilita su reproducción y diseminación. La LCD se caracteriza por la presencia de abundantes lesiones en todo el cuerpo sobre todo cara y extremidades (Figura 1.9). Las lesiones son de tipo nodular principalmente, aunque algunas veces pueden ser placas con descamación epidérmica; las lesiones son indoloras, contienen gran número de amastigotes dentro de macrófagos vacuolados, con poco o ningún infiltrado linfocitario. La epidermis que recubre los nódulos no se úlcera y aparece con prolongaciones extendidas. En algunos pacientes se encuentran grandes nódulos infiltrados que asemejan a la lepra lepromatosa; estos pacientes tienen una fuerte inhibición de la inmunidad celular específica contra

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Leishmania; en otros la inhibición es menor y aunque hay diseminación de los parásitos e intradermorreacción de Montenegro negativa, algunas lesiones son de tipo placa. La respuesta al tratamiento con antimoniales es pobre, presentándose frecuentes recaídas.

Figura 1.9. Leishmaniasis cutánea difusa. Fotografias de lesiones características de leishmaniasis cutánea difusa.

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1.4.4 Leishmaniasis visceral El 90% de todos los casos de LV ocurre en la India, Bangladesh, Etiopía, Sudan y Brasil. La LV en América se presenta en focos muy circunscritos que se extienden desde el sur de los Estados Unidos hasta el norte de Argentina. En Brasil se presenta más del 90% de los casos de LV americanos. El agente causal es L. Infantum llamado anteriormente L. chagasi pues se consideraba que era una especie diferente; el vector principal es Lu. longipalpis, con excepción de la costa Caribe colombiana donde el vector mas asociado es Lu. evansi. Luego de la multiplicación del parásito en la piel, que puede causar o no una lesión pequeña transitoria, los parásitos y los macrófagos infectados alcanzan órganos y tejidos hematopoyéticos (hígado, bazo, medula ósea, ganglios linfáticos etc.) (Figura 1.10). Allí los parásitos se multiplican, infectan macrófagos locales y causan los síntomas y signos de la LV. El periodo de incubación usualmente es entre 2 semanas y 2 meses. La LV afecta principalmente a niños menores de cinco años, está asociada con condiciones de malnutrición y puede evolucionar hacia la muerte si no se instaura un tratamiento adecuado en forma oportuna.

Figura 1.10. Leishmaniasis visceral. Fotografias de la apariencia física de pacientes con leishmaniasis visceral. Notese la hepato-esplenomegalia.

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Los cambios histológicos principales que se observan en el bazo son la dilatación de los sinusoides venosos, con abundantes macrófagos infectados con amastigotes en la pulpa blanca y en la pulpa roja, al igual que en la trabécula. También es común observar un infiltrado por células plasmáticas. La pulpa blanca está muy reducida y es frecuente la presencia de fibrosis y necrosis en las áreas de células T. En el hígado las células de Kupffer están infiltradas con abundantes amastigotes. La arquitectura normal del hígado se ve afectada por la presencia de abundantes macrófagos infectados en los sinusoides hepáticos. Las células del parénquima son casi siempre normales, aunque algunas veces presentan acúmulos grasos. Los vasos portales presentan abundantes macrófagos parasitados y se observa proliferación del conducto biliar y fibrosis ligera. La medula ósea presenta hiperplasia mieloide, células grasas disminuidas y una menor cantidad de macrófagos infectados en comparación con el hígado y el bazo. Los individuos que presentan una anemia muy marcada presentan signos de hematopoyesis extramedular. En casos avanzados hay leucopenia severa. En personas infectadas con el VIH, la infección con L. infantum se presenta como enfermedad oportunista y al disminuir los CD4 el parásito se disemina por todo el organismo y se aísla fácilmente de sangre, piel sana, aspirado bronquial etc., el hombre se convierte en reservorio del parasito, y la LV empeora el pronóstico del Sida. Estos pacientes coinfectados responden mal al tratamiento de la leishmaniasis. Los primeros síntomas consisten en malestar general, cefalea y fiebre a intervalos irregulares, con crecimiento progresivo del bazo y del hígado y ocasionalmente dolor abdominal agudo. La enfermedad se caracteriza por fiebre crónica, hepatoesplenomegalia y pancitopenia, microadenopatías, pérdida de peso y palidez de las membranas mucosas. Por la leucopenia y la desnutrición de base que acompaña generalmente a estos pacientes son muy susceptible a otras infecciones (neumonía bacteriana o viral, tuberculosis y disentería) lo que puede agravar la enfermedad y causar la muerte. 1.5 Los reservorios Los reservorios son animales vertebrados que mantienen el parásito, permitiendo que los vectores se infecten de ellos y persista el ciclo de transmisión. Generalmente hay un huésped reservorio principal para cada especie de Leishmania en un determinado foco, pero otros mamíferos de la misma zona pueden resultar infectados, convirtiéndose en huéspedes secundarios o accidentales. Los mamíferos

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domésticos o selváticos (marsupiales, carnívoros, roedores, endentados, insectívoros y primates) infectados por Leishmania pueden mostrar o no signos evidentes de infección. Existen reservorios domésticos, silvestres y para algunas especies del parásito el hombre es el reservorio principal, como es el caso de la LV causada por L. donovani y la LC causada por L. tropica. En el Nuevo Mundo las leishmaniasis son zoonosis pero hay evidencias de transmisión antroponótica, en brotes epidémicos ocurridos en la región andina. Existen muchos reservorios silvestres. En América los reservorios identificados incluyen los marsupiales (Didelphis spp), el oso perezoso (Choloepus spp y Bradypus spp), el oso hormiguero menor (Tamandua tetradactyla), el zorro (Cerdocyon thous) y los roedores (Rattus spp, Proechimys spp, Oryzomys spp etc.). Por su parte, el reservorio doméstico más importante de L. infantum es el perro., Diferentes especies de roedores como Meriones shawii, Arvicanthis niloticus, Rhombomys opimus, Tatera indica y Psammomys obesus entre otros son reservorios de LC del Viejo Mundo.

CAPITULO 2

DIAGNÓSTICO Sara M. Robledo, Carlos Muskus, Iván D. Vélez Es de gran importancia el diagnóstico temprano de la leishmaniasis ya que nos permite instaurar el tratamiento específico lo antes posible y con este, controlar la evolución de la enfermedad, aliviar los signos y síntomas y mejorar la calidad de vida de los pacientes quienes están expuestos a un gran estigma social por las “marcas” (cicatrices) y las secuelas físicas que deja la leishmaniasis y que son difíciles de olvidar para quien ha sufrido o sufre la enfermedad. Los hallazgos clínicos y epidemiológicos no son patognómicos de la enfermedad, por lo que es necesario el diagnóstico de laboratorio para verificar la sospecha clínica de leishmaniasis. Las herramientas diagnósticas varían dependiendo de la forma clínica de la enfermedad. El diagnóstico de la leishmaniasis debe ser parasitológico, es decir, debe estar basado en la visualización del parásito, ya sea a partir de extendidos (frotis) o cultivos del material obtenido de la lesión (para los casos de LC y LM) o del material obtenido a partir de aspirado o biopsias de medula ósea, hígado o bazo (en el caso de una LV). Sin embargo, en algunos casos de LM o LV no siempre es posible visualizar o aislar el parásito y por ello el diagnóstico puede ser clínico y estar ayudado por la presencia de anticuerpos específicos contra Leishmania spp. En la figura 11 se muestra el diagrama de flujo que se debe seguir ante la sospecha de una caso de LC (Figura 2.1a), LM (Figura 2.1b) y LV (Figura 2.1c).

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c Figura 2.1. Algoritmo diagn贸stico de Leishmaniasis. Diagrama de flujo con la estrategia a seguir ante un caso sospechosos de LC (a), LM (b) o LV (c).

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En términos generales los métodos diagnósticos se clasifican en métodos directos y métodos indirectos. 2.1 Métodos directos Los métodos directos son los que permiten la visualización del parásito en la muestra obtenida del paciente e incluyen: 1) La visualización de amastigotes en frotis o biopsias de material obtenido a partir de piel (en casos de LC), mucosas de la región oro-naso-faríngea (en caso de una LM) o de médula ósea, hígado o bazo (en caso de una LV). Cuando se trata de un caso de LV, la muestra de elección es medula ósea, ya que el aspirado o biopsia de hígado o bazo conlleva riesgos de hemorragia que pueden comprometer la vida del paciente, y por lo tanto debe ser realizado por personal altamente entrenado. 2) la visualización de promastigotes en cultivos del material obtenido en aspirados de lesiones en piel, mucosas, medula ósea, hígado o bazo y 3) la detección del material genético (ADN o ARN) o de proteínas del parásito por medio de técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la electroforesis de proteínas, respectivamente. La sensibilidad de estos métodos varía en función del tejido de donde proviene la muestra al igual que de la técnica utilizada para la toma y procesamiento de la muestra y también depende del tiempo de evolución de la lesión y del uso de tratamientos previos por los pacientes. Es así como, la sensibilidad del frotis o extendido de material obtenido del borde activo de la lesión es de 90.4% en comparación del frotis o extendido del material obtenido de la base de la ulcera que es del 78.3%. Así mismo, la sensibilidad de la detección por PCR es del 80.8% cuando el material es obtenido de la base de la úlcera vs 57.7% cuando el material es obtenido del borde. Por otro lado, la sensibilidad para el aspirado de medula ósea es del 55-97%, de 60% para el aspirado de ganglio linfático y del 97% para la biopsia o aspirado de bazo. 2.1.1 El frotis o extendido Es un procedimiento muy fácil, económico y rápido de realizar; con una buena técnica de toma y lectura de la muestra la sensibilidad puede alcanzar hasta el 90% o más. El examen consiste en obtener tejido del borde activo de la lesión o también del centro de la úlcera si es una LC o una LM. Si se trata de un caso de LV, la muestra se toma de medula ósea, hígado o bazo mediante aspirado, según se describe más adelante.

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Para los casos de lesiones en piel, es importante seleccionar una lesión que tenga el menor tiempo de evolución y que no presente una infección sobreagregada. Usando guantes quirúrgicos, se debe limpiar la lesión con jabón quirúrgico y retirar la costra y el material necrótico o purulento. Se selecciona el sitio donde se va a tomar la muestra y se hace hemostasia local, en pinza, mediante presión con los dedos índice y pulgar; con una hoja de bisturí se hace una pequeña incisión en el borde de la lesión o un raspado de tejido del centro de la misma tratando de obtener tejido (Figura 2.2). Si la lesión es ulcerada puede raspar tejido del fondo de la úlcera luego que ha retirado la costra, en caso de que esté presente. Si se trata de una lesión en mucosa, se debe procurar obtener un raspado de la lesión o un fragmento del tejido de la misma.

Figura 2.2 Procedimientos para la toma de muestras de lesiones para frotis o extendidos. Las fotografías muestran el proceso a seguir para tomar la muestra y lectura para el frotis. Material necesario para el examen. (a), usando guantes quirurgicos, se limpia la lesión haciendo uso de una gasa esteril. (b) con la ayuda de los dedos de hace hemostasia local y con una hoja de bisturí se hace una pequeña incisión en el borde de la lesión. (c) visualización de los amastigotes.

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En los casos de una LV, la muestra se debe tomar por medio de un aspirado de medula ósea (habitualmente cresta iliaca postero-superior o esternón) preferiblemente, pero también se puede tomar de bazo o hígado. Si se trata de un aspirado de medula ósea, se limpia el área de la punción con una solución antiséptica y se aplica anestesia local. Después se inserta una aguja delgada que se acopla a una jeringa para crear succión y se extrae una pequeña muestra; después de retirar la aguja se hace presión para evitar posible sangrado y se coloca un apósito. Por su parte, el aspirado de bazo debe ser un procedimiento rápido y preciso, es decir, la aguja debe permanecer más o menos 1 segundo dentro del bazo y el eje de entrada y salida de la aguja debe ser el mismo para evitar el desgarre de la capsula esplénica. Para ello, se toma una jeringa de 5 cc con una aguja 21G x 11/4.

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Se palpa el bazo y se delimita su margen en el abdomen del paciente usando un bolígrafo (Figura 2.4). Por razones de seguridad el bazo debe palparse al menos 3 cm por debajo del reborde costal durante la espiración; se limpia el área de la punción con una solución antiséptica y se deja secar la piel. Se penetra la piel con la aguja insertada en la jeringa justo en el medio de los bordes del bazo, 2 a 4 cm por debajo del reborde costal. Se dirige la aguja cranealmente en un ángulo de 45°C a la pared abdominal y se realiza la aspiración tirando del émbolo de la jeringa para aplicar vacio y con un movimiento rápido hacia dentro y hacia fuera empujar la aguja en el bazo a la profundidad de la aguja y retirarla rápidamente. El paciente se debe mantener en bajo observación, registrando el pulso y la presión cada media hora durante 4 horas y luego cada hora durante 6 horas, y debe permanecer en cama por 12 horas.

Figura 2.4 Procedimientos para la toma de muestras de bazo por aspirado. Las fotografías muestran el proceso a seguir para la toma y lectura de la muestra. Luego de palpar el bazo y delimitarlo muy bien se introduce la aguja en la zona seleccionada como describe en el capitulo 2. Con la ayuda de la jeringa se hace aspirado (a), con el cual se hacen extendidos en placa (b) para visualizar al microscopio los amastigotes (c), luego de la tinción con colorante de Giemsa; o se cultiva en medio NNN (d) para visualizar los promastigotes en la muestra fresca al microscopio invertido (e) o en placa coloreada con Giemsa (f).

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Luego de haber obtenido el material por raspado o aspirado, se extiende el material sobre una lámina portaobjetos limpia, en forma suave, tratando de no destruir los amastigotes (Figura 12); la muestra se deja secar a temperatura ambiente, se fija con metanol (hasta evaporación) y se tiñe con el colorante de Wright, Field o Giemsa, disuelto en solución salina amortiguada con fosfatos (PBS). Se observa la placa al microscopio en objetivo de 100X, con aceite de inmersión, en busca de los amastigotes, verificando que presenten las estructuras características como núcleo y kinetoplasto. 2.1.2 El cultivo: La técnica consiste en aspirar material de la lesión en piel o mucosa con ayuda de una aguja fina (26G) y una jeringa de insulina que contiene PBS con antibióticos. Previa limpieza del borde de la lesión con solución salina al 0.9% o alcohol al 70% (Figura 2.5) se introduce la aguja en el borde activo de la lesión. Mediante movimientos rotatorios durante aproximadamente dos minutos se trata de macerar un poco de tejido y obtenerlo al aspirar con el embolo de la jeringa. Luego de obtener la muetra, se retira la jeringa. Para el caso de aspirado de medula osea o bazo se procede de la forma como se describió previamente. Figura 2.5 Procedimientos para la toma de muestras de aspirado de lesión. Las fotografías muestran el proceso a seguir para tomar la muestra de aspirado de lesión. Para el aspirado de material para cultivo se introduce la aguja en el borde activo de la lesión y se aspira con el embolo de la jeringa (a); la muestra se deposita en el medio de cultivo NNN (b y c) y se incuba a 26C (d). Se revisa cada semana al microscopio invertido (e) en busca de l promastigotes (f) o se hace un extendido para colorear con Giemsa y v i s u a l i z a r l o s promastigotes con el uso del microscopio (g).

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Bajo condiciones asépticas se deposita la muestra en el medio de cultivo bifásico conocido como NNN y se incuba a 26C. Se revisa cada semana al microscopio invertido en busca del promastigotes (Figura 2.5). Los cultivos se incuban hasta por un mes haciendo pases a nuevos medios de cultivo cada 8 días. El crecimiento del parásito en los medios de cultivo apropiados brinda buenos resultados en el diagnóstico, con una sensibilidad cercana al 70%. 2.1.3 La biopsia: La biopsia convencional para estudio histopatológico, coloreada con hematoxilina-eosina o inmunoperoxidasa, permite hacer el diagnóstico de leishmaniasis cuando se observan amastigotes. En general es una prueba poco sensible probablemente por la distorsión que sufren los parásitos durante el proceso de fijación y tinción; sin embargo, es una técnica de gran ayuda para el diagnóstico diferencial de las lesiones cutáneas diferentes a leishmaniasis. Para la toma de la biopsia se utiliza un punch o sacabocado esteril de 4 mm de diámetro. Previa limpieza de la lesión con jabón quirúrgico o alcohol al 70% se inyecta un ml de xilocaina al 2% por vía subcutánea en el sitio donde se va a tomar la muestra. Se introduce el sacabocado en la piel haciendo movimientos rotatorios para poder cortar la dermis. Se levanta el tejido con la ayuda de una pinza, se corta la base de la biopsia con un bisturí y se deposita en un frasco con formol al 10%. Para la biopsia de órganos o tejidos diferentes a piel, tales como hígado, bazo, riñón, y otros, se toma una pequeña porción del tejido para luego examinarla al microscopio. La biopsia de bazo se realiza por punción (percutánea) y se extrae tejido utilizando una jeringa y siguiendo el procedimiento descrito previamente para la obtención del aspirado de bazo. La biopsia de médula ósea se realiza también por punción. La muestra se toma generalmente del hueso de la cadera. Se limpia la piel y se inyecta anestesia local para insensibilizar la piel. Luego, se introduce la aguja de biopsia en el hueso. El centro de la aguja se retira y ésta se introduce más profundamente dentro del hueso. Esto crea una pequeña muestra, o núcleo, de médula ósea dentro de la aguja. Posteriormente, se retira la aguja junto con la muestra de médula ósea, se aplica presión en el sitio de la biopsia para detener el sangrado y se coloca un vendaje. La biopsia de hígado, aunque no es muy usual, se debe realizar en un hospital y por personal médico.

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Antes del examen, se recomienda administrar un sedante al paciente. La biopsia se lleva a cabo a través de la pared abdominal, con el paciente acostado boca arriba, con la mano derecha bajo la cabeza y debe permanecer lo más quieto posible. El médico examina el hígado y selecciona el punto correcto de inserción de la aguja para la biopsia. Luego, se limpia la piel y se inyecta un anestésico local utilizando una pequeña aguja para insensibilizar el área. Se hace una incisión pequeña y se inserta la aguja de biopsia. El paciente debe contener la respiración mientras se toma la biopsia, con el fin de reducir la posibilidad de perforar el pulmón o de desgarrar el hígado. La aguja se introduce y se retira rápidamente y se aplica presión para detener el sangrado. Se coloca un vendaje sobre el sitio de inserción. Se recomienda utilizar ultrasonido para guiar la aguja. Una vez obtenida la biopsia de cualquier órgano o tejido, se fija en formol y se incluye en parafina para luego hacer cortes muy delgados del tejido (4 ? m) que se adhieren en láminas portaobjetos. El tejido se desparafina en en xilol y se hidrata en soluciones decrecientes de alcohol (100 30%). Para el estudio histopatológico los cortes se colorean con Hematoxilina de Harris-Eosina o con inmunoperoxidasa, se dejan secar a temperatura ambiente y se revisan al microscopio en busca de los amastigotes y el tipo de reacción inflamatoria. El material obtenido para biopsia también se puede utilizar para cultivo. En este caso, la biopsia se introduce en un frasco con PBS con antibióticos. Luego de 2-4 horas se descarta el PBS, se macera el tejido y el triturado se deposita en los medios de cultivo NNN y se revisa semanalmente en busca de promastigotes. En la coloración con inmunoperoxidasa los amastigotes se observan más fácilmente al microscopio de luz por el contraste de la coloración, ya que los amastigotes toman un color marrón. El método de peroxidasa tiene mayor sensibilidad que la biopsia coloreada con Hematoxilina-Eosina, pero menor que el examen directo y el cultivo. 2.1.4 Reacción en cadena de la ADN polimerasa o PCR Permite la detección del material genético (ADN) de los parásitos en material de lesiones de pacientes, de animales posibles reservorios, así como en los flebotomíneos vectores. El material de partida para la PCR puede ser un raspado de la lesión, un pequeño fragmento de la biopsia preservado en alcohol puro hasta su procesamiento, el aspirado de la lesión o también sangre total. Es una técnica útil en términos de especificidad y sensibilidad. La especificidad puede llegar a ser del 100% si se usan los iniciadores (“primers”) apropiados, es decir, altamente específicos para el material genético

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de Leishmania. Los costos del método cada día son más reducidos. La técnica consiste en amplificar el ADN del parásito mediante el uso de diferentes secuencias de oligonucleotidos que funcionan como iniciadores para la extension de las nuevas cadenas de ADN que se amplifican. Para ello se debe extraer el ADN de la muestra obtenida del paciente por cualquier método de extracción disponible, ya sea fenol-cloroformo y etanol o cualquier otro método. El ADN extraído se incorpora en una mezcla que contiene las secuencias especificas de oligonucleótidos que actúan como iniciadores, los desoxinuclósidos trifosfatos, cloruro de magnesio y la enzima Taq ADN polimerasa. La mezcla de reacción se somete a determinados ciclos de desnaturalización, amplificación y extensión en un termociclador. Las condiciones de amplificación dependen del gen que se quiere amplificar. Luego de la amplificación, el producto de la amplificación (ADN amplificado) se visualiza en un gel de agarosa al 1% con la ayuda de un colorante que tiñe los acidos nucleicos que puede ser Bromuro de etidio (Figura 2.6a) o Syber safe green, un colorante más seguro que el Bromuro de Etidio ya que no es mutagénico.

Figura 2.6. Patrón electroforético de especies de Leishmania según amplificación del gene cpb (a). Luego de la amplificación, el ADN amplificado se visualiza en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio como bandas blancas. Nótese la presencia de bandas correspondientes a el marcador de peso molecular (línea 1), L. panamensis (línea 2), L. braziliensis (línea 3), L. guyanensis (línea 4), ausencia de bandas en control negativo (líneas 5, 8 y 11), L. major (línea 6), L. infantum (línea 7), L. mexicana (línea 9) y L. amazonensis (línea 10). Sitios reconocidos por las enzimas de restricción utilizadas según especie de Leishmania (b). Patrón de bandas electroforéticas en gel de agarosa al 1% que permite diferenciar entre especies de Leishmania (c).

Existen variaciones como la PCR en tiempo real, que emplea un fluorocromo para visualizar la reaccion. Esta variación hace a la PCR más sensible. Actualmente se están desarrollando otros métodos basados en PCR que consisten en la amplificación isotérmica del ADN y la detección puede

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hacerse visualmente adicionando el fluorocromo Sybr-green, el cual se torna verde en presencia de productos amplificados y permanece naranja en su ausencia. Con la PCR se puede distinguir además la especie del parásito, utilizando una técnica conocida como PCR-RFLP que consiste en el análisis de la longitud de los fragmentos de restricción del producto amplificado cuando se somete a digestión con diferentes enzimas de restricción (Figura 2.6b). 2.2 Métodos indirectos: Los métodos indirectos se basan en la detección de anticuerpos espcíficos contra Leishmania, principalmente de tipo IgG, mediante pruebas serológicas y también en la evaluación de la respuesta celular mediante una prueba cutánea de hipersensibilidad retardada conocida como Prueba de Montenegro o Leishmanina. Los métodos serológicos más comúnmente usados incluyen la inmunofluorescencia indirecta (IFI) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA); en estas técnicas se utiliza como fuente de antígeno parásitos enteros o lisados. Las técnicas serológicas se usan para ayudar en el diagnóstico de LV y de LM donde los títulos de anticuerpos son generalmente altos. En los casos de LC, debido principalmente a los bajos títulos de anticuerpos circulantes, las técnicas serológicas son poco sensibles, encontrándose lesiones activas y ausencia de anticuerpos. Otro gran inconveniente de estas técnicas, especialmente en Centro y Sur América, es la reactividad cruzada que presentan los antígenos de Leishmania con Trypanosoma cruzi, parásito de la misma familia de la Leishmania y que sobrepone muy frecuentemente sus áreas endémicas con las areas endémicas de Leishmania. 2.2.1 Inmunofluorescencia Indirecta (IFI): Permite la detección de anticuerpos específicos para Leishmania sp. El procedimiento es el siguiente (Figura 2.7): En cada pozo de una placa para inmunofluorescencia se depositan 20 ? l de antígeno de Leishmania (3x106 promastigotes/ml) y se dejan secar a temperatura ambiente. Se adiciona luego el suero del paciente (y las correspondientes diluciones) para que ocurra la reacción antígenoanticuerpo. Luego se adiciona el conjugado que consiste en un anticuerpo anti-Inmunoglobulina humana (G o M, respectivamente, según se estén detectando anticuerpos tipo IgG o IgM en el suero) conjugado o marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Luego de un periodo de incubación, la placa se lee con microscopio de fluorescencia. La muestra se considera positiva para anticuerpos

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anti-Leishmania cuando se observan los parásitos con fluorescencia de color verde intenso y negativa cuando los parásitos fijados se tornan de color rojo. El título de anticuerpos corresponde a la dilución del suero en la cual los parásitos se observan con fluorescencia verde. Los anticuerpos están presentes muy temprano luego de la infección y son indetectables entre 6 y nueve meses después de la curación. Títulos por encima de 1:20 son significativos y por encima de 1:32 son diagnóstico.

Figura 2.7 Detección de anticuerpos contra Leishmania spp por la técnica de inmunofluorescencia Indirecta (IFI). La figura muestra una representación esquematica del procedimiento (a) y fotografías alusivas a los procesos de lavado (b), y dispensado de las muestras (c) en las placas para fluorescencia. Observese la fluorescencia de los parasitos en una muestra positiva para anticuerpos (d) y (e).

2.2.2 ELISA: Al igual que la IFI, esta técnica permite detectar anticuerpos específicos contra Leishmania en el suero o plasma de los pacientes. En este caso, los pozos de un plato de 96 pozos se sensibilizan con los parásitos (Figura 2.8). Luego se adicionan los sueros de los pacientes, seguido de la adición del conjugado (anti-IgG o IgM humana) marcada con una enzima que puede ser peroxidasa o fosfatasa alkalina. Finalmente, se adiciona el sustrato específico para la enzima. La

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reacción entre el sustrato y la enzima da como resultado la formación de un producto cuya concentración es proporcional a la intensidad de un color que se mide por densidad óptica en un espectrofotómetro a 492 nm. Se considera positiva toda densidad óptica igual o superior a la densidad óptica media de los sueros controles negativos más dos desviaciones estándar.

Figura 2.8 Detección de anticuerpos contra Leishmania spp. por la técnica de ELISA). La figura muestra una representación esquematica del procedimiento (a) y la reactividad de las muestras de suero procesadas (b). La presencia de color indica presencia de anticuerpos y la intensidad del color (densidades ópticas) es proporcional a los títulos de anticuerpos.

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2.2.3 La prueba de Montenegro ó Leishmanina Mide la respuesta de inmunidad celular retardada y se utiliza comunmente en estudios epidemiológicos para el diagnóstico de infección con Leishmania. Aunque es una prueba muy sensible y específica no permite diferenciar entre infección actual o pasada. Para la aplicación de la prueba, se limpia la piel del antebrazo con alcohol al 70% (Figura 2.9). Luego se inyecta por vía intradérmica 0.1 ml de antígeno Montenegro (2x106 promastigotes de Leishmania/ml de una mezcla de cloruro de sodio, bicarbonato de sodio y fenol). La lectura de la prueba se realiza a las 48 o 72 horas determinando el área de induración. Se considera una prueba positiva cuando el diámetro de la induración es mayor o igual a cinco milímetros.

Figura 2.9 Aplicación y lectura de la prueba de Montenegro. Para la prueba de Montenegro se inyecta 0.1 ml de antígeno de Montenegro en la cara anterior del antebrazo (a) y se lee a las 48 horas con la técnica del bolígrafo (b), demarcando el diámetro de induracion.

Manual Diagnóstico y Control de la Leishmaniasis en Centroamérica FE DE ERRATAS 2.2.4 Inmunocromatografía La técnica inmunocromatográfica permite la detección de anticuerpos contra antígenos específicos que están embebidos en una columna o matriz. Actualmente existe una prueba rápida de inmunocromatografía en tirilla, para la detección de anticuerpos contra el antígeno rK39, que es un antígeno que forma parte de la proteína relacionada con kinesina, una proteína altamente conservada en especies de Leishmania del complejo L. donovani. La prueba se conoce como “rK39 dipstick test” es una prueba inmunocromatográfica para la detección cualitativa de anticuerpos contra especies de Leishmania del complejo donovani. La prueba consiste en una membrana precubierta con antígeno recombinante K39 en la región de la tirilla marcada como “test line” y con anticuerpos anti-Proteína A en la región de la tirilla marcada como “control line”. Durante la reacción, la muestra de suero reacciona con el conjugado marcado (Proteína A- Coloidal Conjugada), que esta presente en la región de la tirilla marcada como “test line”. Luego la mezcla migra hacia arriba por capilaridad para reaccionar con el antígeno rK39 adherido a la membrana y genera la aparición de una línea roja. La presencia de la línea roja indica un resultado positivo mientras que la ausencia de una línea roja indica un resultado negativo. Independientemente de la presencia de anticuerpos contra el antígeno rK39, como la mezcla del

suero y el conjugado continua migrando a través de la membrana cuando se encuentra con el anti-proteína A presente en la región marcada como “control line” aparece en esta región una línea roja. En la región “control line” siempre debe aparecer la línea roja y su presencia sirve para verificar que la prueba si funciono adecuadamente. La prueba inmunocromatográfica rK39 es fácil de realizar, muy rápida (10-20 minutos), económica (aproximadamente 1 dólar por prueba) y da resultados altamente reproducibles. Actualmente constituye una herramienta importante para el diagnostico presuntivo de LV en regiones alejadas.

Figura 2.10. Prueba de inmunocromatografia rápida en tirilla para la detección de anticuerpos contra la proteína rK39. Fotografía de dos tirillas con diferentes resultados (a). Nótese la presencia de una sola banda en la región control, lo que sugiere un resultado negativo (tirilla superior) y presencia de dos bandas, una azul (muestra) y una roja (control), indicativa de un resultado positivo (tirilla inferior). Representación esquemática de los resultados e interpretaciones de una prueba rápida (b).

CAPITULO 3

TRATAMIENTO Iván Darío Vélez, Sara María Robledo, Liliana López El tratamiento de la leishmaniasis en cualquiera de sus formas clínicas recae en la administración de medicamentos con actividad específica contra el parásito y el manejo de cualquier infección concomitante. En el caso de la LV, adicionalmente se deben tratar los problemas de anemia, hipovolemia y malnutrición que pueden estar presentes. El tratamiento para la leishmaniasis se debe instaurar sólo cuando existe el diagnóstico parasitológico. Sin embargo, en casos especiales como en la LM y LV el tratamiento se puede iniciar cuando hay serología positiva con aspectos clínicos y epidemiológicos compatibles con la enfermedad. La elección del tratamiento está determinada por la eficacia del medicamento, la toxicidad, el costo y la disponibilidad del medicamento y por las características clínicas de la enfermedad en el paciente a tratar. Hasta hace pocos años los esquemas de tratamiento para la leishmaniasis se basaban en la aplicación de los antimoniales pentavalentes, pero actualmente se dispone de nuevos medicamentos locales y sistémicos y de una mayor comprensión no sólo de la eficacia y toxicidad de estos antimoniales pentavalentes sino también de la enfermedad, lo que permite adecuar el tratamiento a las condiciones clínicas particulares del enfermo. Los medicamentos con que se dispone actualmente para la leishmaniasis son: 3.1 Antimoniales pentavalentes (Sb5) Se empezaron a utilizar desde 1947 y gracias a las altas tasas de curación y menores toxicidades comparadas con el antimonio trivalente se seleccionaron como los medicamentos de primera elección para el tratamiento de las distintas formas clínicas de la enfermedad. Desde entonces los Sb5 han mostrado una respuesta terapéutica adecuada en la mayoría de los casos. Sin embargo, en los últimos años, se ha venido documentando en varios países y para las diferentes formas clínicas de la enfermedad una disminución en la eficacia, aparición de resistencia y una mayor detección de efectos adversos, aun fatales, lo que ha aumentado la necesidad de disponer de nuevos esquemas y de alternativas terapéuticas.

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Los antimoniales pentavalentes que se encuentran en el mercado son el estibogluconato de sodio (Pentostam® o genérico) y el antimoniato de meglumina (Glucantime®). Los antimoniales se administran por vía parenteral (IM o IV) y se distribuyen a altas concentraciones en plasma, hígado y bazo; la vida media es de 8 horas en adultos y 5 horas en niños, con una tasa rápida de absorción. La excreción se realiza a través de la orina y se completa entre 24 y 76 horas después de administrados. La respuesta al tratamiento con antimoniales varía considerablemente dependiendo de la especie y cepa del parásito, del estado inmunológico del paciente y de la forma clínica de la enfermedad. Los efectos adversos más comunes y principales responsables de la interrupción del tratamiento, son los relacionados con el sistema musculo esquelético, como mialgias y artralgias, las cuales pueden ser severas, principalmente en pacientes mayores, pero que generalmente responden a antiinflamatorios no esteroides; también es frecuente el dolor de cabeza, anorexia, nauseas y fiebre. La alanino aminotransferasa, la alcalino aminotransferasa, la aspartato aminotransferasa y la lipasa séricas pueden aumentarse, además frecuentemente se presenta hiperamilasemia con aparición o no de pancreatitis aguda, lo que puede ser la causa de la aparición de náuseas y dolor abdominal; ocasionalmente han sido reportados disminución de la hemoglobina y leucocitos o aumento de concentraciones séricas de nitrógeno uréico y creatinina. En el electrocardiograma (ECG) se pueden ver efectos dosis-dependiente, como cambios reversibles del ECG como un incremento en la amplitud de la onda P, inversión de la onda T (o disminución en su altura), elevación del segmento ST, o prolongación del intervalo QT. El antimoniato de meglumina no debe ser administrado en embarazo. No se han realizado estudios en humanos, ni en animales por lo que está contraindicado su uso durante la lactancia materna. Se debe tener especial cuidado con su administración en pacientes con enfermedades cardíacas, en especial en los defectos de la conducción, ya que puede causar arritmias. Así mismo, puede producir una disminución de la función hepática, pancreatitis o disfunción tubular renal. Se ha informado la muerte de pacientes asociada al uso de este medicamento. La resistencia a los antimoniales es un problema creciente principalmente con las especies de Leishmania que son antroponóticas, y está asociada al uso de tratamientos incompletos.

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3.2 Miltefosina Es la primera droga de uso oral para el tratamiento de la leishmaniasis, principalmente de la LV en la India. Se usa a una dosis de 1.5 – 2.5 mg por kg de peso día (25 mg/d <25 kg; 50 mg/d 25-50 kg; 100 mg/d >50-70 kg, 150 mg/d >70 kg) durante 28 días. Produce efectos adversos gastrointestinales como náuseas, acompañadas algunas veces de vómito, diarrea y pérdida de apetito, lo que disminuye la adherencia al tratamiento. El ser teratogénico y tener una vida media prolongada en el organismo, restringe su uso en mujeres fértiles en quienes debe garantizarse una adecuada contracepción durante el tratamiento y hasta 3 meses después de terminado el mismo. 3.3 Anfotericina B Actualmente existen cuatro formulaciones diferentes: Anfotericina B deoxicolato (Fungizone®) que actúa alterando la permeabilidad de la membrana celular. Se administra por vía intravenosa en dextrosa al 5% en 4 horas a una dosis de 1.0 mg/kg/ día o interdiario, para un total de 15 a 20 dosis en 30 a 40 días, para una dosis total de 25 mg/k. Es un medicamento muy efectivo, con tasas de curación hasta del 98% pero de uso limitado por lo lento de la administración (infusiones intravenosas), el tratamiento intrahospitalario y efectos adversos serios como nefropatías, hipocalemia refractaria, miocarditis y muerte. Además se pueden presentar efectos secundarios tales como anorexia, nauseas, vómito, tromboflebitis local, fiebre. Antes de aplicar la primera dosis y a fin de evaluar la tolerancia al medicamento se puede hacer un test con 1 mg del medicamento aplicado en infusión IV y si no hay efectos adversos se aplica la dosis correspondiente 4 horas más tarde. a. Anfotericina B liposomal (L-AMB) (Ambisome®) es una formulación lipídica de anfotericina B y fosfatidilcolina deshidrogenada de soya, distearoilfosfatidilglicerol y colesterol y que se utiliza por vía intravenosa a una dosis de 5-10 mg por Kg de peso/día por 15 días para el tratamiento de la LV, con una eficacia superior al 98%. Las pequeñas vesículas de lípidos que contienen el medicamento, son fagocitadas por los macrófagos, fusionándose a la membrana del fagosoma para liberar el medicamento directamente sobre el parásito, b. Dispersión coloidal de Anfotericina B (ABCD) (Amphocil® y Amphotec®) (una formulación lipídica de anfotericina B y sulfato de colesterol.

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c. Complejo lipídico Anfotericina B (ABLC) (Abelcet®) que es una formulación lipídica de Anfotericina B y dimiristoil fosfatidilcolina y dimiristoil fosfatidilglicerol. Todas las 3 formulaciones presentan eficacia similar contra la leishmaniasis. 3.4 Sulfato de paromomicina (aminosidine) Antibiótico aminoglicósido que inhibe la síntesis de proteínas y altera la permeabilidad de la membrana del parasito. Se emplea a una dosis de 15 mg/kg/día durante 21 días, por vía intramuscular y tiene una eficacia similar a la de la anfotericina B para el tratamiento de la LV en la India. Los efectos adversos más frecuentes son el dolor en el sitio de la aplicación, daño renal y oto-toxicidad reversible. 3.5 Isotianato de Pentamidina Es un derivado aromático de la diamidina que interactúa con el ADN del kinetoplasto e inhibe la topoisomerasa II e interfiere con la glicolisis. Se administra a una dosis de 2-4 mg/kg interdiario durante 7 días por vía intramuscular. Presenta tasas de curación hasta del 98%. Los efectos adversos serios asociados al tratamiento incluyen diabetes mellitus insulinodependiente. Se utilice para el tratamiento de los casos que no responden a cualquiera de los medicamentos de elección y en aquellos casos en los cuales los antimoniales están contraindicados como por ejemplo, en pacientes con fallas renales y cardiacas. 3.6 Termoterapia Entre las opciones de tratamiento local está la termoterapia que es una técnica cuyo fundamento se centra en la aplicación de calor local sobre las lesiones de los pacientes con diagnóstico de LC, Sumado a esto, diferentes estudios han revelado que en comunidades campesinas de países suramericanos es muy frecuente la aplicación local de cáusticos de las lesiones, logrando en muchos de los casos la resolución de la enfermedad. En la actualidad se cuenta con un equipo diseñado para este fin conocido como Thermomed®, que es un operador que cuenta con dispositivos especiales (electrodos) que alcanzan y mantienen una temperatura de 50ºC. Los electrodos se colocan en la lesión durante 30 segundos, el equipo a través de la tecnología de alta frecuencia, genera ondas de calor que se extienden hasta las capas más profundas de la piel, logrando así la destrucción de los amastigotes.

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3.7 Crioterapia Terapia con nitrógeno liquido, aplicado sobre las lesiones 2 veces por semana durante 4 a 6 semanas. La crioterapia se encuentra frecuentemente disponible en los servicios de dermatología. ESQUEMAS DE TRATAMIENTO Los expertos de la Organización Mundial de la Salud recomiendan adecuar el esquema de tratamiento de acuerdo a las presentaciones clínicas que tenga la enfermedad en el paciente a tratar, esto es, ya no se recomienda un sólo esquema de tratamiento para todos los pacientes sino que el clínico debe evaluar su paciente y de acuerdo a como se están presentando las lesiones y según los medicamentos disponibles darle un tratamiento particular. De acuerdo a ello, en pacientes que acuden a la consulta y sus lesiones ya están en proceso de resolución por los tratamientos empíricos empleados el clínico podría considerar no administrar ningún tratamiento y evaluar la evolución clínica de esas lesiones. Otra opción, para lesiones de tamaño pequeño que no estén localizadas cerca de mucosas, es el uso de tratamiento local. Para ello existen varias opciones, a saber: ? Antimoniales pentavalentes intralesionales. ? Termoterapia o Crioterapia. ? Paromomicina tópica. Si por el tamaño de la(s) lesión(es) o por el número o localización de las mismas el clínico considera que se debe dar tratamiento sistémicos y dispone de los medicamentos puede seleccionar entre los antimoniales pentavalentes, la miltefosina, la pentamidina o la Anfotericina B. TRATAMIENTO SEGÚN ESPECIE DE LEISHMANIA Y FORMA CLÍNICA Leishmaniasis visceral Para la LV los esquemas recomendados de tratamiento son por orden de preferencia son: ? Anfotericina B Liposomal: 3–5 mg/kg por día de 3-6 infusiones, para una dosis total de 18–21 mg/kg (B). ? Antimoniales pentavalentes: 20 mg Sb5+/kg por día intramuscularmente o intravenoso por 28 días (B). ? Anfotericina B deoxycolato: a la dosis de 0.75-1 mg/Kg/d o cada 2 días por vía IV durante 2030 dosis, para una dosis total de 2-3 g.

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Los mejores indicadores de cura en la LV son la desaparición de los síntomas y signos clínicos y la ausencia de recaídas en los seis meses posteriores al tratamiento. Leishmaniasis cutánea Para la LC Americana, de acuerdo al criterio del médico tratante se puede considerar no aplicar tratamiento antileishmania como fue indicado anteriormente o un tratamiento local con los siguientes esquemas: ? Antimoniales intralesionales: a la dosis de 1–5 ml por sesión cada 3–7 días (para un total de 1–5 sesiones). ? Termoterapia o crioterapia: 1–3 sesiones con 4-7 días de intervalo. Tratamiento sistémico, el cual puede adaptarse a la especie de parásito en caso de que ésta se conozca. LC producida por L mexicana ? Para LC producida por L. mexicana los esquemas recomendados son: ? Ketoconazol: dosis adultos, 600 mg vía oral diariamente por 28 días. ? Miltefosina: 2.5 mg/kg por 28 días. LC producida por L. braziliensis: ? Antimoniales pentavalentes: 20 mg Sb5+/kg por día intramuscularmente o intravenosamente por 20 días. ? Anfotericina B deoxycolato: 0.7 mg/kg por día, por infusión, por 25–30 dosis. ? Anfotericina B liposomal: 2–3 mg/kg por día, por infusión, hasta 20–40 mg/kg dosis total. LC producida por L. guyanensis y L. panamensis: ? Pentamidina isetionato: inyecciones intramusculares o infusiones breves de 4 mg sal/kg día de por medio por 3 dosis. ? Antimoniales pentavalentes: 20 mg Sb5+/kg por día intramuscularmente o intravenosamente por 20 días. ? Miltefosina: 2.5 mg/kg por día oralmente por 28 días. LC producida por L. amazonensis, L. peruviana y L. venezuelensis: ? Antimoniales pentavalentes: 20 mg Sb5+/kg por día intramuscularmente o intravenosamente por 20 días.

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En caso de recaída el tratamiento recomendado es así: ? Anfotericina B deoxycolato, como anteriormente explicado. ? Antimoniales pentavalentes: como anteriormente, más imiquimod día de por medio por 20 días. ? Anfotericina B Liposomal: 3 mg/kg por día, por infusión, hasta 20–40 mg/kg dosis total puede ser considerada. Esquemas de tratamientos recomendados para leishmaniasis mucocutanea (MCL), no clasificado por preferencia ? Antimoniales pentavalentes: 20 mg/kg por día IM o IV por 30 días. ? Antimoniales pentavalentes: como anteriormente descrito más pentoxifilina oral a 400 mg/8 h por 30 días. ? Anfotericina B deoxycolato: 0.7–1 mg/kg por infusión día de por medio hasta 25–45 dosis. ? Anfotericina B liposomal: 2–3 mg/kg por infusión hasta una dosis total de 40–60 mg/kg. ? En Bolivia la Miltefosina a la dosis 2.5–3.3 mg/kg por día oralmente por 28 días ha mostrado muy buen resultado.

CAPITULO 4

ENTOMOLOGIA Maria Angélica Contreras, Richard Hoyos, Karina Mondragón Shem, Horacio Cadena, Rafael Vivero, Luz Adriana Acosta, Alejandro Valencia, Raúl Leonardo Rocha, Carolina Torres G.

4.1 Generalidades sobre los flebotomíneos Los flebotomíneos son pequeños dípteros hematófagos de la familia Psychodidae de importancia en salud pública por su papel como vectores de parásitos del género Leishmania. Algunas especies tambien son transmisores de otros agentes patógenos como: Bartonella bacilliformis, agente causal de la Bartonelosis, virus de la Estomatitis Vesicular, de algunos Phlebovirus, Arbovirus y tripanosomas de reptiles y anfibios (Tesh, 1988; Montoya-Lerma y Ferro, 1998). 4.2 Sistemática de los flebotomíneos 4.2.1 Clasificación y Generalidades de la Familia Psychodidae Es una de las familias más primitivas del orden Díptera, incluye 6 subfamilias, de las cuales 5 están distribuidas en el Nuevo Mundo: Trichomyiinae, Sycoracinae, Brunchomyiinae, Psychodinae y Phlebotominae pero solamente las dos últimas son de importancia médico-veterinaria. La subfamilia Horaiellinae, está restringida al Viejo Reino: Animal Mundo. En general, los insectos flebotomíneos se caracterizan por la Phylum: Artrópoda Clase: Insecta venación del ala y la presencia de densos pelos en las y tórax (Triplehorn Orden: Díptera y Jonson, 2005; Young y Duncan, 1994). Suborden: Nematócera Familia: Psychodidae

4.2.2 Subfamilia Phlebotominae La subfamilia Phlebotominae Recibe este nombre y a que proviene de los vocablos griegos: phlebos, Género: Lutzomyia que significa vena y tomos, cortar. Los insectos incluidos en este grupo se diferencian de otras subfamilias dentro de Psychodidae, por la presencia de piezas bucales más largas que la cabeza, mandíbulas bien desarrolladas, palpos divididos en segmentos, antenas casi cilíndricas y vena radial del ala distribuida en 5 ramas (Barreto, 1955; Triplehorn and Jonson. 2005). Algunos atributos generales que a menudo pueden ser utilizados para distinguirlas de otros dípteros, son su tamaño (1,5 - 2,5 mm de longitud), patas largas y su característico de salto vuelo de salto (Barreto, 1955; Fairchild, 1955; Theodor, 1965). Subfamilia: Phlebotominae

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4.2.3 Géneros en la Subfamilia Phlebotominae Los miembros de la subfamilia Phlebotominae, predominan en las regiones tropicales y subtropicales. El grupo está compuesto por 6 géneros, Sergentomyia, Phlebotomus y Chinius en el Viejo Mundo y Brumptomyia, Warileya y Lutzomyia en las Américas. Su distribución altitudinal comprende desde el nivel del mar hasta los 2.900 m. (http://cipa.snv.jussieu.fr/). El género Lutzomyia alberga a más de 700 especies, existen registros de 14 fósiles de Lutzomyia preservados en ámbar en depósitos centroamericanos durante el Oligoceno tardío y Mioceno temprano, calculándose su edad mínima en 26 millones de años (Williams, 1993; Galati, 1995; Peçanha. et al., 2002; Andrade and Peçanha. 2003). Este género incluido en la subfamilia Phlebotominae, se caracteriza por la presencia de una sutura interocular completa, número de filas de dientes en el cibarium y por la ausencia de la seta episternal (Young y Duncan, 1994). 4.2.4 Nombres populares de Lutzomyia en Latinoamérica Los flebotomíneos se reconocen en diferentes regiones de Latinoamérica con diversos nombres comunes, en Centroamérica, se conocen popularmente como papalotillas (del nahuatl papalotl, que significa mariposa), “aliblanco”, “manta”, “palomilla”, “chiroso”, “pringador”, “chitras”, “toritos”, “carachais”. 4.3 Biología de flebotomíneos: Ciclo de vida La biología de cada una de las diferentes especies de flebotomíneos, es única y compleja, especialmente cuando se trata de factores relacionados con el tiempo y lugares de desarrollo de los estadios inmaduros de las diferentes especies. Los aspectos sobre reproducción, alimentación, dispersión y comportamiento que influyen directamente en la epidemiología de la leishmaniasis, deben estudiarse por especie porque pueden variar grandemente.

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En general, se puede decir que los flebotomíneos son insectos con metamorfosis completa (holometábolos), es decir, que sufren diferentes estados de desarrollo: huevo, larva, pupa y adulto, que varían en duración según las especies. Es precisamente el estadío adulto el mejor conocido, porque el muestreo de estos insectos en ambientes silvestres cuenta actualmente con muchas herramientas exitosas; contrariamente, la información existente sobre los estadios inmaduros es muy escasa. 4.3.1 Fases Inmaduras Los huevos de los flebotomíneos son ovalados, algo curvos, de color claro a oscuro. Miden entre 300 y 500 ì, presentan protuberancias propias de la especie o complejo de especies, y forman patrones típicos (irregulares, polígonos, eclipses, crestas, fosas, montañas). La hembra deposita entre 40 - 70 huevos sobre sustratos húmedos y la eclosión tarda de 8 a 15 días, dependiendo de condiciones ambientales. Algunos autores plantean que los huevos de algunas especies pueden mantenerse viables en condiciones adversas, como sequía y frío (Barreto, 1941; Young y Duncan, 1994; Elnaiem y Ward, 1991). La etapa larval se completa en aproximadamente 18 días, pero puede tardar más tiempo, dependiendo de la temperatura del ambiente. Las larvas se alimentan de materia orgánica y su desarrollo incluye cuatro etapas: larva de primero, segundo, tercero y cuarto estadio, que se diferencian entre sí por el tamaño; a medida que cambian de estadio aumentan su tamaño corporal. Las larvas se caracterizan por ser pequeñas, alargadas, presentan una cápsula cefálica esclerotizada bien desarrollada que se diferencia del resto del cuerpo (Pessôa y Barreto, 1948; Cáceres, 1989; Young y Duncan, 1994). La larva de cuarto estadio deja de alimentarse y se transforma en pupa, quedando inmóvil y en posición erecta. La pupa es de tamaño pequeño (aproximadamente 2 mm), algo alargada, vermiforme, casi descubierta de cerdas y su color varía de blanco a pardo oscuro. Las pupas son más resistentes a las variaciones climáticas. No obstante, en ciertas especies de regiones frías, el desarrollo de la larva de cuarto estadio puede prolongarse considerablemente, a veces hasta un año. Su desarrollo culmina en 10 -12 días (en condiciones favorables), después de ese tiempo, el adulto emerge completamente formado. El promedio de vida de un insecto adulto es de 25 - 30 días (Perfil 'ev, 1968; Artemiev et al., 1972; Young et al., 1981; Killick-Kendrick, 1987; Young y Duncan, 1994, Alexander, 2000; Feliciangeli, 2004). En el Nuevo Mundo, se han descrito potenciales microhábitats para las larvas tales como: sitios de pastoreo, hojarasca, huecos de árboles y madrigueras entre otros. Son muy pocos los ejemplares

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inmaduros recuperados y, por tanto, poco puede afirmarse acerca de los hábitats larvarios (Forattini, 1954; Rutledge y Ellenwood, 1975; Arias y Freitas, 1982; Casanova, 2001). 4.3.2 Fase Adulta Los adultos típicamente son de menos de 5 mm de longitud, patas largas, alas ampliamente lanceoladas (sin venas cruzadas más allá de la base) y tórax giboso. Su cuerpo está revestido de cerdas largas y finas, que le confieren un aspecto hirsuto y su color varía entre grisáceos pasando por amarillentos hasta marrón. La cabeza es pequeña, presenta ojos compuestos (ocelos ausentes) y antenas largas con 16 segmentos similares en machos y hembras. El abdomen posee diez segmentos, los tres últimos corresponden con segmentos modificados en la genitalia. En el macho hay una fuerte armadura genital capaz de sujetar a la hembra durante el apareamiento, a diferencia de la hembra, donde los últimos segmentos abdominales constituyen dos lóbulos laterales y dos cercos (Young y Duncan, 1994; Galati, 2003). Los flebotomíneos se encuentran distribuidos por amplias zonas del mundo, realizando su ciclo vital completo durante todo el año en áreas tropicales, y de mayo a octubre, en la región paleártica. Los hábitats varían desde selva húmeda a regiones muy áridas (Alvar, 2001). En cuanto a su desplazamiento, por su característica de vuelo corto y silencioso, se conocen como voladores débiles, que no pueden viajar largas distancias. Para muchas especies esto es válido: la distancia de dispersión más larga registrada de un flebotomíneo es de 280 m, mientras en las zonas boscosas del Nuevo Mundo no tienen un rango amplio, oscila entre 50 m a 200 m (Chaniotis et al., 1982; Cáceres, 1993). Sin embargo, algunas especies pueden alcanzar una distancia de 2 km (KillickKendrick et al., 1984). Las especies del género Lutzomyia presentan fototropismo positivo, tienen actividad crepuscular y nocturna (desde las 16:00 hasta las 07:00 horas del día siguiente), aunque también están activas durante el día (Disney, 1966; Alexander, 2000; Casanova, 2001). En áreas tropicales los flebotomíneos exhiben características temporales y patrones definidos según sea la época del año (lluvias vs. sequia), por ejemplo, algunas especies sufren aumento poblacional inmediatamente después de la época de lluvias, aunque lo opuesto se ha observado para algunas especies de Asia (Trouillet, 1981; Martínez y Gallego, 1987). La abundancia de acuerdo a la época del año es una característica de las especies muy local, que debe ser estudiada en las diferentes regiones geográficas.

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4.4 Taxonomía de flebotomíneos Actualmente, existen dos sistemas de clasificación para el género Lutzomyia, propuestos por investigadores diferentes: 4.4.1 Young & Duncan (1994) Divide al género Lutzomyia en 15 subgéneros y 11 grupos de especies (al interior de algunos grupos y subgéneros se pueden encontrar series). Los subgéneros y grupos de especies se encuentran constituidos principalmente por la similitud estructural de un pequeño grupo de caracteres (genitalia masculina, morfología de las espermatecas, cibario, palpos y flagelómeros), para constituir categorías intragenéricas (Theodor, 1965; Lewis, 1977), sin embargo, el significado evolutivo de este grupo de caracteres para establecer las relaciones sistemáticas del grupo no fue delimitado. Por ejemplo, en el grupo Verrucarum se han propuesto divisiones hasta el nivel de “series” por la similitud morfológica de caracteres asociados a la genitalia del macho (espinas subterminales y tufo de setas) (Theodor, 1965; Young, 1979; Feliciangeli, 1988; Cazorla, 1995). 4.4.2 Galati (2003) Propone una clave dicotómica independiente a la de Young & Duncan (1994) para identificar flebotomíneos de acuerdo a las agrupaciones inferidas en su anterior propuesta sistemática (Galati, 1995), y destacando nuevos caracteres para la separación e identificación de especies (Beati, 2004). Subdivide al género Lutzomyia en tres subtribus: Sergentomyiina (donde se ubican especies pertenecientes al grupo oswaldoi sensu Young & Duncan), Lutzomyiina (Lutzomyia) y Psychodopygina (en nomenclatura Young & Duncan un subgénero dentro de Lutzomyia), esta última subtribu tiene varios subgéneros que han sido elevados a rango genérico (Psathyromyia, Viannamyia, Nyssomyia, Trichophoromyia, Psychodopygus), al analizar morfológicamente 88 caracteres cuantitativos y cualitativos de la subfamilia Phlebotominae con especial énfasis en los grupos americanos. Los cladogramas inferidos por Galati (1995), proporcionan la primera hipótesis de relaciones evolutivas al interior del género Lutzomyia. 4.5 Morfología de flebotomíneos A nivel morfológico, los caracteres asociados a larvas y huevos han jugado poco papel en la sistemática y taxonomía de flebotomíneos, sin embargo, los estados adultos han sido muy bien descritos en su estructura externa como en su anatomía interna (Jobling, 1987; Munstermann, 2005; Galati, 2003). La base de la identificación taxonómica se basa en caracteres del estado adulto,

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asociados a la cabeza (palpómeros, flagelómeros, ascoides y cibario), tórax (longitud de venas alares, posición de venas alares, longitud y espinas de fémur, quetotaxia y setas en pleuritos) y abdomen (genitalia masculina y femenina) (Theodor, 1965; Young y Duncan, 1994; Galati, 2003). A continuación, se da una descripción general de cada parte corporal y las estructuras de importancia en la identificación taxonómica de flebotomíneos: 4.5.1 Cabeza Presenta ojos compuestos generalmente, con una distancia inter-ocular característica en algunas especies, además están separados por una sutura interocular que puede ser incompleta (Lutzomyia) o completa (Warileya). El palpo se encuentra dividido por cinco segmentos, estando parcialmente fusionados el primero y segundo; la longitud y relación métrica entre palpos está relacionada con la separación de grupos y subgéneros (formulas palpales pueden ayudar a identificar especies) (Figura 4.1a). La probóscide está compuesta por labro-epifaringe, hipofaringe y labio, en la parte distal de esta última, aparecen las labelas y suturas longitudinales mediales que originan la división labial que en algunos grupos de especies pueden o no unirse. En el cibario, se pueden observar dientes horizontales y verticales cuyo número, disposición y forma son característicos y diagnósticos de cada especie; otros caracteres importantes en el cibario son la presencia de manchas pigmentadas y un arco cibarial que puede estar completo, incompleto o ausente (Figura 4.1b). Las antenas presentan: escapo, pedicelo y 14 flagelómeros, revistiendo especial interés los ascoides del flagelómero II, en cuanto a longitud y disposición (Figura 4.1c). Figura 4.1 Cabeza en vista dorsal con estructuras de importancia taxonómica (a), Cibario (b); Ascoides en flagelómero II (c).

Tomado de: Munstermann, 2005.

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4.5.2 Tórax Está conformado por pronoto, mesonoto y metanoto, al igual que en otras familias del orden Diptera, estos segmentos pueden dividirse en pleuritos por el paso de una sutura longitudinal en episterno, epimero y mesotórax. Es de especial interés la venación alar en cuanto a la disposición de las venas radiales y la longitud de segmentos o la totalidad de las venas (Figura 4.2). Tomado de: Young y Duncan, 1994.

Figura 4.2. Nervación del ala característica de la subfamilia Phlebotominae; se presentan en letras griegas algunas relaciones longitudinales de interés taxonómico. 4.5.3 Abdomen Se encuentra constituido por diez segmentos, los tres últimos modificados para constituir la genitalia. En la genitalia femenina, podemos encontrar un par de espermatecas, que se encuentran constituidas por capsulas tubulares o en forma de saco que se conectan por medio de ductos individuales a un ducto común y adyacente se encuentra una estructura Tomado de: Munstermann, 2005. fuertemente esclerotizada conocida como furca genital. La morfología y longitud de las espermatecas son de importancia taxonómica a nivel de especie y algunas características permiten las agrupaciones en subgéneros y grupos (las espermatecas estriadas y en forma de saco, por ejemplo, son las principales características de las hembras del grupo Verrucarum). La longitud, segmentación y relación de los ductos individuales con respecto al ducto común son de relevancia en la separación taxonómica (Figura 4.3). Figura 4.3. Espermatecas con estructuras de importancia en la identificación taxonómica.

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La genitalia masculina está compuesta externamente por: gonocoxito (que varía en cuanto a forma y presencia de tufos de setas); gonostilo que soporta un número variable de espinas accesorias, terminales o subterminales; parámeros, que pueden tener un patrón de inserción de setas, presentar tubérculos o espinas; otras estructuras que proporcionan caracteres taxonómicos son los lóbulos laterales y los cercos que varían en cuanto a longitud y forma (Figura 4.4a). La genitalia masculina en su anatomía interna, presenta una bomba eyaculadora y unos filamentos genitales de forma y tamaño variable (Figura 4.4b).

Figura 4.4. Estructuras externas características asociadas a la genitalia masculina (a); bomba eyaculadora y aparato genital interno masculino (b).

b Tomado de: Munstermann, 2005.

4.6 Aspectos de la ecología y fisiología de los flebotomíneos Cada vector posee adaptaciones fisiológicas que son necesarias para adquirir y transmitir parásitos, al igual que comportamientos especializados que permiten localizar tanto sus fuentes de alimento, como miembros de la misma especie durante los periodos de reproducción. Este capítulo describe las características fisiológicas generales de los flebotomíneos como la alimentación y la búsqueda de hospedero, además de la interacción vector-parásito. 4.6.1 Alimentación 4.6.1.1 Alimentación con azúcares Como muchos dípteros hematófagos, los flebotomíneos adultos requieren de una fuente de carbohidratos para sus actividades. Es un nutriente consumido por machos y hembras, aunque estas últimas requieren adicionalmente de la sangre de vertebrados para desarrollar sus huevos (Tang y Ward, 1998). Por lo general los flebotomíneos eclosionan con muy pocas reservas de energía para el vuelo y supervivencia, y la alimentación con azúcares debe ocurrir durante los primeros días. Sin una

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alimentación de carbohidratos, los machos sobreviven 2-3 días y las hembras 3-5 días (Zhou et al., 2005), y este es un tiempo insuficiente para producir descendencia exitosa. En la naturaleza, ambos sexos obtienen energía de los azúcares encontrados en la savia de plantas y frutas maduras (Chaniotis, 1974), y en algunos casos se ha documentado que pueden obtener los carbohidratos de las sustancias azucaradas que producen los áfidos [Aphis sp.] (Killick-Kendrick y Killick-Kendrick, 1987; Wallbanks et al., 1990). 4.6.1.2 Búsqueda, alimentación y digestión de sangre El proceso de alimentación de sangre se realiza bajo la influencia de atrayentes y repelentes que le permiten al insecto localizar la fuente sanguínea de la cual se alimentará, y que estimulan el inicio y continuación de la alimentación (Travi y Montoya, 1994). Entre los atrayentes se encuentran ciertos olores característicos de algunos animales, el CO2 y el calor (Hamilton y Ramsoondar, 1994). También se ha reportado atracción de los estos insectos hacia colores oscuros (Galati et al., 2001). Los flebotomíneos pueden alimentarse de un amplio rango de hospederos vertebrados, incluyendo aves, reptiles y mamíferos (Travi y Montoya, 1994). El aparato bucal de estos insectos está compuesto por la mandíbula, la maxila y el labro, que son estructuras delgadas, terminando en una punta y envueltas por el labio. Al momento de picar, el insecto ubica la punta del labio en la superficie de la piel del hospedero, corta y expone capilares superficiales y luego ingiere sangre a través de un canal alimenticio central (Black y Kondratieff, 2005). Este tipo de alimentación donde se crea una acumulación de sangre en la superficie de la piel se conoce como telmofagia. La saliva de los insectos hematófagos posee productos farmacológicamente activos que alteran los sistemas hemostáticos, inflamatorios e inmunes del hospedero (Valenzuela, 2005), con el objetivo de hacer más efectivo el proceso de alimentación al interrumpir los procesos de homeostasis en la sangre y reparación de tejidos. Para los insectos del género Lutzomyia, se encuentran reportados 5 componentes salivales (Tabla 4.1).

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Tabla 4.1. Componentes salivales de los flebotomíneos del género Lutzomyia:

La digestión de la sangre se realiza por medio de enzimas que son producidas en el intestino medio y depende de tres factores principales: pH, capacidad de tampón y potencial redox. Posterior a la alimentación, la matriz peritrófica es degradada y desechada con los restos no digeridos del alimento (Secundino et al., 2005). La sangre de los vertebrados es un alimento nutricionalmente único. Las proteínas constituyen el 20% del peso líquido de la sangre, y a partir de los aminoácidos de estas proteínas, el insecto puede sintetizar las reservas de lípidos y carbohidratos involucradas en la producción de los huevos (Pennington y Wells, 2005). 4.6.2 Reproducción Los machos de los flebotomíneos generalmente eclosionan un día antes que las hembras, ya que en este momento su genitalia se encuentra inadecuadamente posicionada para la cópula, y por lo tanto deben esperar un tiempo, en el cual dichas estructuras rotan 180°. La rotación comienza luego de la eclosión y es controlada por la maduración de los músculos adyacentes, permitiendo que la genitalia del macho pueda acoplarse apropiadamente con la de la hembra al momento del apareamiento (Klowden y Zwiebel, 2005). Las hembras eclosionan aproximadamente 24h después, y comienzan a buscar un hospedero del cual alimentarse y machos para inseminarlas.

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El apareamiento tiene lugar en grupos conocidos como leks. En los leks, los machos se agregan y defienden territorios en sitios que las hembras normalmente visitan, con el fin de aumentar su probabilidad de aparearse (Jones y Quinnell, 2002). Las agregaciones se forman generalmente al atardecer, cerca de los hospederos donde las hembras se alimentan (Quinnell y Dye, 1994). Entre los semioquímicos más importantes se encuentran las kairomonas liberadas por el hospedero, las cuales funcionan a favor del flebotomíneo guiándolos hasta su fuente de alimento, y las feromonas producidas por los machos (Kelly y Dye, 1997). Algunos experimentos han demostrado que las feromonas de cortejo juegan un papel importante en el éxito reproductivo del macho, ya sea como un precursor determinando la aceptación del macho por parte de la hembra, o directamente incrementando la posibilidad de que el macho pueda copular (Jones y Hamilton, 1997). Tanto los machos como las hembras producen sonidos durante el proceso de apareamiento, sin embargo, durante la cópula únicamente el macho produce vibraciones con las alas (de Souza et al., 2002). El esperma es almacenado en la espermateca de la hembra, donde permanece hasta la fertilización de los huevos justo antes de la oviposición (Travi y Montoya, 1994). Una sola inseminación es suficiente para que la hembra pueda fertilizar sus huevos durante toda su vida. 4.6.3 Relación Vector-Parásito El ciclo de vida de Leishmania involucra una alternancia entre un hospedero mamífero y un organismo invertebrado, un flebotomíneo. En el mamífero, la biología del parásito es relativamente sencilla y es inoculado en la piel a través de la picadura de un flebotomíneo infectado. La forma infectiva del parásito Leishmania corresponde con promastigotes metacíclicos que son fagocitados por los macrófagos y se transforman en amastigotes intracelulares, permaneciendo en esta forma dentro del hospedero mamífero (Killick-Kendrick, 1990). En contraste, la biología del desarrollo del parásito en el flebotomíneo, es más compleja y menos conocida. El flebotomíneo ingiere formas del parásito denominadas amastigotes al alimentarse de la sangre de un vertebrado infectado, y estos se dividen al interior del intestino del vector. Rápidamente, los amastigotes se transforman en promastigotes los cuales continúan dividiéndose (Ashford, 2000). Se pueden observar diferencias en el patrón de desarrollo para aquellas especies que son infectivas para los mamíferos. Algunas especies normalmente incluyen una fase de desarrollo en el intestino posterior del flebotomíneo (desarrollo peripilórico) y se encuentran clasificadas en un subgénero separado, Leishmania (Viannia). Evolutivamente, se considera que el desarrollo peripilórico es un

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carácter ancestral, y estas son especies exclusivamente del Nuevo Mundo (Bates y Rogers 2004). Los miembros del subgénero Leishmania se desarrollan exclusivamente en el intestino medio de sus vectores (desarrollo suprapilórico), e incluye parásitos tanto del Nuevo y Viejo Mundo (Gossage et al., 2003; Bates y Rogers 2004). Aproximadamente, tres días después de la alimentación, el insecto expulsa los restos de la ingesta sanguínea, y los parásitos no adheridos son evacuados. Sobreviven aquellos parásitos que pueden anclarse por medio del flagelo a las microvellosidades del intestino medio (especies suprapilóricas), o posterior (especies peripilóricas) del insecto infectado. Como es relatado por Bates y Rogers (2004), se estima que los parásitos atraviesan 5 estadios importantes durante su desarrollo en el interior del flebotomíneo vector: Amastigotes, Promastigotes procíclicos, Promastigotes nectomonados, Promastigotes leptomonados y Promastigotes metacíclicos. Gracias a sus componentes (Tabla 1), la saliva del flebotomíneo puede influenciar la infectividad del parásito en el hospedero. En 1988, Titus y Ribeiro demostraron que la saliva de los flebotomíneos exacerba los efectos de la fase inicial de las infecciones con Leishmania en términos de la carga parasitaria y el tamaño de la lesión cutánea. A partir de experimentos realizados con los diferentes componentes de la saliva como el maxadilan (Milleron et al., 2004) y la hialuronidasa (Volvofa et al., 2008), han descubierto que las propiedades inmunomoduladoras de estos impiden que las defensas del hospedero actúen adecuadamente para protegerse de los parásitos facilitando su dispersión. En la naturaleza, la prevalencia de infección de los flebotomíneos puede ser muy baja incluso en áreas endémicas, por lo cual el éxito de transmisión del parásito depende de estrategias adicionales que pueda implementar para asegurar dicha transmisión. El gel secretado por promastigotes (GSP) es un potente factor de virulencia, que junto con la saliva del flebotomíneo, potencia significativamente las infecciones cutáneas cuando son transmitidas en conjunto a la piel del mamífero hospedero. Para hacer más eficiente la transmisión del patógeno, el parásito Leishmania también puede modificar considerablemente el ambiente del intestino del insecto dañando la válvula estomodeal, y físicamente bloqueando el intestino con GSP. La combinación de estos dos eventos resulta en el bloqueo del intestino medio con un tapón de promastigotes de Leishmania y su gel, lo cual distiende y permanentemente mantiene abierta la válvula ya erosionada. El resultado de este bloqueo es la interferencia de la alimentación al limitar el volumen de sangre que puede obtener el insecto, causando que perfore la piel una mayor cantidad de veces y pasar más tiempo alimentándose.

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4.7 Incriminación de especies vectores Debido a la importancia de los flebotomíneos por su papel de vectores de agentes patógenos, se hace necesario establecer el papel que juega una especie determinada o población de dicha especie, en la transmisión de un agente infeccioso, causante de alguna enfermedad. El estudio del papel que cumple una especie en un foco de transmisión es lo que se conoce como incriminación vectorial (Eldridge y Edman, 2003). Se han utilizado otros términos para referirse a las relaciones entre el patógeno que produce la enfermedad y el artrópodo, como es el caso de la palabra asociación, que significa el vinculo existente entre la presencia de leishmaniasis en una localidad, por la ocurrencia de alguna de las especies del parásito Leishmania y los flebotomíneos capturados en el mismo sitio. De igual forma, en estudios sobre epidemiología de leishmaniasis se han empleado los términos: vector confirmado y vector naturalmente infectado. En el primer caso se realiza el aislamiento del agente patógeno a partir de la especie de flebotomíneo, pero adicionalmente se confirma con el cultivo de aislados de humanos y animales examinados finalmente por electroforesis de isoenzimas (Corredor et al., 1989). Por el contrario, un vector infectado naturalmente corresponde al hallazgo de flagelados en el intestino de una especie de flebotomíneos capturada en un estudio de campo, en una localidad determinada (Corredor et al., 1990). En America existen más de 350 especies de flebotomíneos diferentes, pero solo 17 han sido encontradas infectadas naturalmente y/o confirmadas como vectores de leishmaniasis (Laboratoire D'informatique Et De Systématique, 1997) (Tabla 4.2).

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Tabla 4.2. Flebotomíneos infectadas naturalmente y/o confirmadas como transmisoras de especies de Leishmania en América (Laboratoire D'informatique Et De Systématique 1997. http://cipa.snv.jussieu.fr/ ).

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En general, los estudios entomológicos sobre flebotomíneos pueden ser producto de evaluaciones puntuales, así como parte fundamental de los estudios de foco de transmisión; esto último brindaría información más sólida para direccionar acciones de prevención y control de la leishmaniasis en áreas geográficas determinadas. No solo es importante definir los términos, sino también la importancia biológica que tienen las diferentes especies de flebotomíneos como vectores y por ende su papel en la transmisión del parásito. Los criterios más aceptados para incriminar una especie de flebotomíneo, como vector comprobado de Leishmania, han sido planteados por Killick-Kendrick (1990) y se resumen en los cuatro puntos siguientes: - La especie debe tener comportamiento antropofílico, - Estar presente en la localidad donde se transmite la enfermedad y durante la estación conocida

como de mayor ocurrencia de la misma, - El parásito aislado de los insectos flebotomíneos, en una zona endémica, debe ser la misma especie que se identifique en las lesiones o muestras de pacientes de la misma región, - El insecto debe ser susceptible a infección (que se infecte con facilidad) con el parásito ya aislado de pacientes, y en estudios de laboratorio, el insecto debe ser capaz de transmitir este parásito a un mamífero susceptible. Otros factores como la preferencia alimenticia sobre un reservorio, longevidad, estacionalidad, la frecuencia de picadura y su presencia y abundancia en un foco determinado de transmisión, también contribuyen a la incriminación de una especie de flebotomíneo como vector de leishmaniasis (Killick-Kendrick, 1990). La abundancia aparente de una especie no es por si misma suficiente para incriminarla como vector. Mientras que algunas poblaciones de vectores son más pequeñas, otras parecen tener un período muy corto como para mantener la circulación de una especie de Leishmania (Killick-Kendrick, 1990). En la práctica, existen distintas dificultades que hacen de la incriminación una tarea compleja. La leishmaniasis es causada por un amplio rango de parásitos, y este hecho sumado a la complejidad en la taxonomía tanto de parásitos como de vectores, hacen aún más difícil la definición sobre el papel que cumple en la transmisión una u otra especie de insecto en una localidad determinada (KillickKendrick, 1990).

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Normalmente los procedimientos para la identificación de parásitos en insectos de campo van desde la disección de los flebótomos hasta técnicas más sensibles de biología molecular, como la PCR. La tipificación bioquímica de los parásitos y la taxonomía, sin duda han contribuido a clarificar el papel de algunas especies vectores (Killick-Kendrick, 1990). A continuación se registran las fuentes bibliográficas más importantes en donde se documentan procedimientos para la incriminación de flebotomíneos: Ver Tabla 4.2. 4.8 Establecimiento y mantenimiento de colonias de flebotomineos en condiciones de laboratorio Las condiciones de laboratorio para la colonización de los flebotomíneos dependen principalmente de las condiciones ambientales como temperatura, humedad relativa y de la duración del ciclo de vida. Una de las ventajas de la colonización de una especie determinada, es la obtención de ejemplares en iguales condiciones fisiológicas para el desarrollo de estudios sobre comportamiento, capacidad y competencia vectorial, xenodiagnóstico y pruebas de susceptibilidad a insecticidas entre otros. A continuación se describe brevemente una propuesta de procedimiento para la colonización de Lutzomyia longipalpis, que corresponde con la especie que se ha colonizado de forma exitosa en varias ocasiones, por diferentes instituciones (incluyendo el PECET): - Por las características zoofílicas de Lu. longipalpis la captura de los parentales deberá realizarse

sobre cebo animal (ganado, gallineros o corrales para cría de cerdos). Registrar las condiciones de temperatura y humedad relativa durante la captura. - Se recomienda realizar la captura de las hembras alimentadas, las cuales reposan generalmente sobre las paredes del corral o en su cercanía. - El número de flebótomos condensados entre machos y hembras por jaula no debe ser superior a 120 ejemplares. - Una vez en el laboratorio, los flebótomos deberán ser alimentados dependiendo de la disponibilidad con hámster, ratón o cobayo. Eventualmente la alimentación puede ser realizada también en campo. - La mayoría de las veces es necesario alimentar de 2 a 3 veces cada 24 horas hasta lograr un buen porcentaje de insectos alimentados. - Finalizada la alimentación coloque un algodón ligeramente humedecido con una solución de agua y azúcar sobresaturada para alimentar a los flebotomíneos.

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- A partir de la última alimentación deberá esperarse 2 días para permitir la formación y maduración de los huevos. - Con ayuda del aspirador bucal tome 5 ejemplares hembras cada vez y deposítelos suavemente en los recipientes para ovipostura hasta completar 50 ? ? . - Posteriormente coloque un algodón con una solución de azúcar sobresaturada encima de la malla de tela que cubre cada recipiente (cambiar diariamente). - Colocar la siguiente información en la parte externa del pote: Fecha, Especie colonizada, Alimentado sobre (hámster, ratón) No. de huevos, Fecha de eclosión de los huevos, Fecha empupación, Fecha de eclosión de adultos. - Colocar los potes de ovipostura con las hembras en cajas plásticas transparentes con tapa. - Para mantener la humedad en la caja, ponga una hoja doble de papel toalla ligeramente humedecida en el fondo de la caja transparente. - Ubique la bandeja en el estante a temperatura ambiente. Generalmente el rango de la temperatura y humedad relativa es 27 30 0C y 60 -80 % respectivamente. - Después de 5 -7 días ha muerto la totalidad de las hembras en ovipostura. Proceda a retirar la malla de tela, retirar los cadáveres y a contabilizar el número de huevos en el recipiente. - Revisar diariamente los potes de ovipostura bajo el estereoscopio para observar la eclosión de los huevos. - Se deberá tener especial cuidado de retirar los ácaros que vienen adheridos a los insectos de campo, los cuales depositan sus huevos sobre los cadáveres de los flebótomos. - Los ácaros deberán ser sacrificados en alcohol al 70% y la revisión de los potes se deberá hacer diariamente una vez se detecte la presencia de ácaros durante la ovipostura. - Una vez se haya registrado la presencia de las larvas, adicione una cantidad muy pequeña de alimento para flebótomos todos los días durante los primeros 15 días. 0 - Luego pase la bandeja con los potes de ovipostura a la incubadora a una temperatura de 27 a 30C y adicione alimento cada 3 días. Nota: mantener la humedad en el interior de la bandeja, impregnando ligeramente el papel toalla con agua. - Una vez se haya registrado la aparición de las pupas suspenda la alimentación de las larvas. - Coloque nuevamente la malla de tela a cada recipiente. - Después de 6 8 días las pupas eclosionan dando lugar a la aparición de los primeros adultos - Capture los adultos de cada recipiente y proceda a (sexar) a través del aspirador bucal y deposite en una jaula entomológica. - Contabilizar el número de machos y hembras que eclosionan por cada pote y anotar en su respectivo formato de colonización de flebotomíneos.

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- En cada jaula entomológica se deberán tener 120 hembras y 40 machos aproximadamente. - Introducir la jaula entomológica en una bolsa plástica negra, colocar algodón con una solución de

azúcar sobresaturada y una hoja de papel toalla ligeramente humedecida (cambiar diariamente) - Esperar 3 días a que los insectos hayan madurado sus estructuras bucales y proceder a introducir

hámster previamente anestesiado e iniciar nuevamente el proceso de colonización de la especie. Nota: Lecturas recomendadas para el mantenimiento de colonias de flebotomíneos: KillickKendrick y Killick-Kendrick, 1991; Lawyer et al., 1991; Modi et al., 1983; Cabrera et al., 1999; Young et al., 1981. 4.9 Métodos de conservación, aclaración y montaje de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) Es de gran importancia mantener una colección de referencia de las especies registradas en las zonas donde existe transmisión de leishmaniasis. De acuerdo con Young y Duncan 1994, la importancia de la cabeza (cibario), la genitalia interna de las hembras (espermatecas) y externa de los machos, se consideran estructuras básicas para la identificación de los flebotomíneos. Adicionalmente, en algunas especies las patas muestran características distintas como la pigmentación y la presencia de espinas, así como el contraste entre el mesonoto y otras partes del tórax también pueden ser útiles (Young y Duncan, 1994). Aunque muchas en ocasiones es necesario hacer identificaciones rápidas, a partir de la observación de las espermatecas de las hembras o la genitalia externa de los machos en fresco, utilizando solución salina o lactofenol, es preferible preservar los individuos enteros, para que sean conservados en láminas con montajes permanentes. Algunos procedimientos de la determinación taxonómica, como el uso de marcadores moleculares, implican la utilización de alguna parte representativa del cuerpo del insecto (ej.: tórax), dejando al espécimen incompleto para el respectivo montaje e inclusión a la colección entomológica. Idealmente, se debe contar con varios especímenes de un mismo origen geográfico que permita incluir en una colección entomológica un número mínimo (5 a 10 individuos) de ejemplares completos, en tanto que otro lote de insectos, de un mismo origen geográfico, podría ser utilizado en procesos moleculares o de otro tipo.

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Formas de conservación de flebotomíneos silvestres: - En alcohol de concentración 70% y absoluto (96-98%); tiene la desventaja que endurece los músculos del insecto e impide la visualización de estructuras internas aunque luego se puede pasar a lactofenol. - En lactofenol hasta su aclaramiento y montaje. - En seco entre capas de papel suave, con alcanfor o cristales de paradicloro benceno para prevenir que sean atacados por Psocópteros. - En nitrógeno liquido, técnica utilizada generalmente para disección en fresco y estudios moleculares (Maroli et al., 1997; Bruce et al., 1994). - En isopropanol puro para posterior procesamiento por herramientas moleculares. Para estudios sobre potencial vectorial en flebotomíneos es necesario aislar el parásito Leishmania u otros microorganismos de interés. Los individuos deben ser capturados vivos y conservados en nitrógeno líquido o a muy bajas temperaturas (Maroli et al., 1997; Ferro y Morales, 1998). 4.9.1 Aclaramiento de flebotomíneos El propósito de aclarar los insectos es conseguir una mejor visualización de los caracteres de importancia taxonómica, como setas, tubérculos, u otras estructuras accesorias. Existen varias sustancias de gran utilidad para clarificar y colorear los flebotomíneos. Una de las soluciones más empleadas y rápidas es el lactofenol, que consiste en una mezcla de volumen 1:1 de ácido láctico y fenol, en la cual pueden dejarse los insectos por 24 horas. El aclaramiento con lactofenol tiene la ventaja de no requerir otra solución para examinar los especimenes bajo el microscopio, y es posible examinarlos por un mayor periodo de tiempo (Young y Duncan, 1994; Maroli et al., 1997). En ocasiones, debido a la abundancia de pelos en el insecto y dificultad para aclaración de la cutícula, es necesario calentar la solución sobre un plato de porcelana solo hasta el punto de ebullición, sin embargo, es recomendable ser prudente con el tiempo de manipulación del lactofenol, pues es una sustancia tóxica y corrosiva que se volatiliza muy fácilmente y puede causar afecciones oculares y del sistema nasofaríngeo (Young y Duncan, 1994; Young y Perkins, 1984). Existen otras sustancias que muchas veces son combinadas o trabajadas individualmente, que incluyen el NaOH (hidróxido de sodio), KOH (hidróxido de potasio), la fucsina ácida en fenol, o simplemente detergente al 5% (Bruce et al., 1994; Maroli et al., 1997; Galati, 2003). El tiempo es

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fundamental sobre todo cuando se utiliza NaOH y KOH: los especímenes deben dejarse por un tiempo limitado porque dichas sustancias pueden digerir los tejidos de los insectos muy rápidamente. La técnica descrita inicialmente por Fairchild & Hertig (1948) consiste en mantener los ejemplares en KOH caliente al 10-20%, durante pocos minutos o en frío durante varias horas. Luego son resuspendidos con agua destilada y coloreados con una solución de fucsina ácida. 4.9.2 Montaje de flebotomíneos Para el montaje permanente de los insectos, se puede utilizar bálsamo de Canadá, que no contiene agua, al contrario de los medios solubles en agua como el Berlese o Hoyers (Quate y Steffan, 1966; Lewis, 1973). Este proceso de montaje garantizará la conservación de los ejemplares por un largo período de tiempo, durante el cual deben almacenarse adecuadamente. Generalmente se emplea la metodología sugerida por Fairchild y Hertig (1948), utilizando Bálsamo de Canadá, con algunas modificaciones: - Los individuos se aclaran en lactofenol (individualmente o en grupo), y son transportados a una

placa porta objetos donde son sumergidos en una gota de fenol líquido 90-95%. - Retirar el fenol y dejar secando por un minuto aproximadamente, antes de pasar a la gota del medio de montaje en otra placa porta objeto. - Para montar los flebotomíneos con bálsamo de Canadá, se deposita una gota de bálsamo de Canadá preparado previamente (mezcla 2:5 vol:vol de fenol y bálsamo de Canadá), sobre la placa portaobjetos donde es ubicado el individuo entero, si es macho; en el caso de las hembras, éstas se deben fragmentar previamente. - Para la fragmentación de las hembras se realiza un corte para separar la cabeza del tórax (cuidando de no causar daños al espécimen), empleando estiletes muy finos. Este procedimiento se realiza en alcohol (70%) o en solución salina y es un paso previo al montaje permanente con Bálsamo de Canadá. - El montaje de las hembras implica la ubicación de la cabeza y el resto del cuerpo (tórax y abdomen) en una misma gota de medio de montaje (ya descrito Bálsamo de Canadá diluído con fenol). - Las placas con los montajes permanentes (individuos adultos machos y hembras ubicados en medio de montaje sobre láminas de vidrio) pueden dejarse secando a temperatura ambiente, en posición horizontal, por un período de 24 horas. - Posterior a este último paso, se deberá añadir una gota del medio de montaje sobre el insecto

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montado e inmediatamente colocar una lámina cubre-objetos sobre dicho montaje que contiene el insecto. La lámina cubre-objetos se coloca suavemente para evitar la formación de burbujas en el medio de montaje, y se presiona para esparcir el medio de tal forma que lo cubra completamente.. - Las láminas son ubicadas al interior de una incubadora, a 37ºC aproximadamente, para dejar secar el medio de montaje y acelerar el proceso de endurecimiento y fijación del individuo. Nota: Cuando se sigue el protocolo de montaje con Bálsamo de Canadá diluido con fenol, deben tomarse medidas de protección personal rigurosas, debido a que el fenol es una sustancia muy tóxica que libera vapores orgánicos que irritan mucosas oculares y respiratorias. Por esta razón, las personas que manipulen estos reactivos deben cumplir con todas las medidas de protección personal necesarias (máscara de respiración contra gases orgánicos, gafas para protección, guantes de látex, trabajo al interior de cámaras de extracción o de ambientes bien aireados, etc). Existe variedad de métodos, utilizando diferentes reactivos, para buscar otras alternativas, consultar los trabajos de Lerger et al. (1983); Bruce et al. (1994) y Maroli et al. (1997). Es recomendable anotar toda la información pertinente en el rotulo que acompaña el portaobjetos: país de origen, estado/departamento/provincia, fecha, nombre del colector y la información detallada sobre el sitio y método de captura (Cebo humano, trampa CDC, etc.). Todos estos datos facilitan el análisis descriptivo de la composición, registro y distribución de los flebotomíneos, además de ubicar al investigador aparece registrado en el portaobjetos (Young y Duncan, 1994; Maroli et al., 1997; Galati, 2003; Ferro et al., 1998). Se debe recordar que toda la inversión de recursos y esfuerzo en trabajos de campo que permitan colectar material biológico será apreciable siempre y cuando éste material biológico sea debidamente procesado y tenga información completa como respaldo. Una vez se tenga suficiente material biológico debidamente procesado, se podrán formar colecciones entomológicas que representen la riqueza y diversidad de un grupo de insectos en zonas geográficas determinadas. 4.10. Estudios entomologicos en campo El estudio entomológico debe ocuparse de la recolección de material biológico en el mayor número de viviendas posibles donde se presenten casos activos, sospechosos o personas con cicatrices. Debe cumplir con el objetivo de identificar las especies de flebotomíneos existentes en el área, su relación

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con el domicilio, las preferencias alimenticias y procurar el aislamiento de parásitos de Leishmania de los vectores. Existen dos tipos de estudio entomológicos: transversales y longitudinales ambos permiten tomar medidas sobre la vigilancia y control de los flebotomíneos. Debido a la dificultad de ubicar los sitios de cría de los flebotomíneos, la captura de las formas adultas se realizará en tres sitios asociados a la vivienda. - Intradomicilio: Se debe seleccionar el mayor número de casas donde hayan registrado casos activos,

sospechosos o pacientes con cicatrices, de acuerdo a la disponibilidad de equipo. - Peridomicilio: se considera aquella zona alrededor de la vivienda donde se desarrollan actividades cotidianas (zonas de cultivo). - Extradomicilio: se considera aquellos bosques secundarios o semi-intervenidos alejados de la vivienda, donde no se desarrolla ninguna actividad agrícola. 4.10.1 Estudio entomológico transversal Se realiza durante un corto periodo de tiempo (semanas o meses). Estos muestreos recopilan información básica inicial sobre la entomofauna de la localidad como: - La composición y densidad en un tiempo determinado de las especies presentes. - Comportamiento de los flebotomíneos: (características antropofílicas, zoofílicas, endofagia, etc.) - Picos de actividad (se recomienda realizar muestreo nictameral para determinar las horas de mayor

actividad). 4.10.2 Estudio entomológico longitudinal Se realiza durante un tiempo prolongado de un año o más, generalmente incluyendo las épocas de verano e invierno. La información obtenida permitirá: - Determinar la composición y densidad relativa de las especies en los diferentes hábitats asociados

con la localidad de estudio. - Establecer asociaciones entre las variables climáticas (temperatura, precipitación, humedad relativa) y la densidad de las diferentes especies de flebótomos. - Conocer la densidad relativa de las especies en determinados meses del año y tomar acciones para su

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control evitando la presentación de nuevos casos. - Realizar estudios sobre la bionomía de las especies de interés como su distribución (altitudinal y vertical), hábitat, comportamiento, longevidad, capacidad vectorial, estado fisiológico, etc. Los estudios entomológicos deberán ser frecuentes para reunir suficiente información sobre las especies de Lutzomyia presentes en un área geográfica previamente identificada como zona de riesgo de transmisión de leishmaniasis. Idealmente, se debe registrar la abundancia y comportamiento de las especies de importancia médica durante las diferentes épocas del año, asociando esta información con la variación climática local. Estudios frecuentes sobre las áreas de transmisión pueden consolidar un sistema de vigilancia entomológica que permita suministrar información relevante para prevenir y controlar la enfermedad a partir del conocimiento de los vectores de la misma. 4.11. Métodos de muestreo de flebotomíneos Para la captura de flebotomíneos se han diseñado una serie de trampas entre las cuales mencionaremos las más recomendadas para los estudios de foco. Adicionalmente se recomendaran otros tipos de trampa que serán utilizadas dependiendo de los objetivos del estudio. - Trampas CDC de luz blanca: Se instala entre las 6:00 pm y 6:00 am en el interior de las viviendas,

peridomicilio y extradomicilio. Se deben recoger a las 6am para apagar la batería y recuperar la mayor parte del material antes de que sufra deterioro. - Trampa Shannon: Se instala entre las 18:00 y 22:00 horas en el peridomicilio o extradomicilio. - La captura manual se realiza con un “aspirador bucal”, es decir un instrumento elaborado manualmente por medio del cual se utiliza una manguera conectada a un tubo acrílico transparente. El colector aspira por la manguera, y la succión ejercida obliga al insecto ingresar al tubo transparente, el cual está separado por un filtro (malla muy fina) que evita que el insecto llegue a la boca del colector. Una vez el insecto esté dentro del tubo, el colector lo transfiere inmediatamente a un recipiente plástico, soplando suavemente para obligar el insecto a salir del tubo. El frasco colector debe estar debidamente marcado en relación al tipo de hábitat, hora, lugar respecto al domicilio, etc. - Captura sobre cebo humano: esta técnica permite determinar el comportamiento antropofílico de las especies de flebotomíneos que se acercan a picar al humano. Con estas capturas se obtiene información sobre la tasa de picadura o aterrizaje (No. de flebótomos/hora/hombre). Se puede realizar en el intra, peri y extradomicilio. Cuando son realizadas sobre animales domésticos (vacas,

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cerdos y equinos) se puede inferir el comportamiento zoofílico de los flebotomíneos. - Captura en reposo: consiste en la recolección de flebotomíneos en lugares de descanso de insectos como paredes de la vivienda, corrales de animales, rocas, cuevas de animales, tronco de árboles o raíces tablares de grandes árboles, etc. Se debe realizar en el intra, peri y extradomicilio - Trampas pegantes o adhesivas: se consideran complementarias a las capturas en reposo y requieren de menor esfuerzo. Se pueden dejar durante 5 o más días en el interior de la vivienda. En el peri y extradomicilio deberán ser revisadas más frecuentemente durante el periodo de lluvias. Adicionalmente, este método permite evaluar grandes trayectos de varios kilómetros, a partir del cual se registrará la composición y densidad relativa de los flebotomíneos (Alexander 2000). 4.12. Recolección y conservación del material entomológico La recolección del material entomológico capturado en las trampas de luz, sobre cebo animal, en reposo y humano deberán sacrificarse introduciendo algodón embebido con Acetato de etilo* u otro reactivo en los recipientes de captura. Posteriormente, los ejemplares se deben depositar en un plato de fondo blanco y proceder a separar con pinzas entomológicas los flebotomíneos de la fauna acompañante (otros insectos). Finalmente, depositar aproximadamente 10 -15 flebotomíneos por vial Eppendorf ® (o frascos de plástico/vidrio con tapa rosca) con alcohol al 70% o en seco de acuerdo a los objetivos del estudio. Los frascos que contienen los flebotomíneos deben ser marcados con el origen de captura, fecha, método de colecta, responsable, etc, con todo el detalle para conservar esta información de la mejor forma posible. Se debe tener precaución al manipular el Acetato de etilo porque es una sustancia muy tóxica. Para las capturas sobre las trampas pegantes, se recomienda colectar cuidadosamente los ejemplares usando una aguja entomológica (con la aguja se retiran los insectos de los papeles impregnados con aceite). Todo el material recolectado deberá ser rotulado con la fecha, sitio de captura, y método de trampeo, esta información debe ir en el interior de los viales escrita con lápiz. Idealmente, deberán existir formularios de campo en donde los colectores puedan registrar toda la información del material biológico que aporte datos para el análisis de la situación por cada localidad.

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4.13. Inclusión de material en una colección Entomológica Una colección entomológica contiene un registro organizado de diferentes especies de insectos, provenientes de lugares y períodos determinados. La acumulación de toda la información relacionada con los insectos conservados en dicha colección, es fundamental para llevar a cabo labores de docencia e investigación. En el caso de la colección de Lutzomyia (Diptera: Psychodidae), cada espécimen luego de ser colectado, montado (Figura 4.5) e identificado, se encuentra fijado a una placa de vidrio, la cual debe estar debidamente marcada. Posterior a la identificación, se elabora un rótulo adhesivo que se pegará a la lámina de vidrio (Figura 4.5a), éste contiene la información básica del espécimen: número único y consecutivo, género y especie, sexo, hábitat, método, lugar y fecha de captura, colector y determinador. Luego del desarrollo del rótulo se procede a la sistematización de la información relacionada con origen y tipo de captura. El proceso de sistematización, se desarrolla en una hoja de cálculo de un programa que permita almacenar gran cantidad de carácteres; el objetivo es tener la información más precisa y completa de cada espécimen: especie, sexo, fecha de colección, hora de colección, país, departamento, municipio, localidad específica, método de captura, hábitat en el que fue colectado, nombre de colector y determinador, coordenadas geográficas del lugar de captura, posibles comentarios hechos por el colector concernientes al espécimen, y existencia de marcador molecular, secuencias génicas, u otra información asociada al individuo. Esta base de datos también posee el número y un lugar único y consecutivo de cada placa. Adicionalmente, es importante conservar las libretas de campo y demás anotaciones de los investigadores que desarrollaron el trabajo de campo y la identificación del material. Figura 4.5. Ejemplo de rótulo adherido a la placa, donde se deposita la p r i n c i p a l información del espécimen; la sigla PPCO corresponde a PECET Psychodidae Colombia (a). Lutzomyia aragaoi fijada en placa de vidrio (b). Fotografía: Pablo Herrera.

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Para el desarrollo de la colección entomológica, es fundamental tener un espacio adecuado para su almacenamiento; por esto, posterior al marcado y sistematización, cada placa se deposita en un espacio único dentro de una gaveta de madera, en posición horizontal (Figura 4.6), cada gaveta debe estar debidamente rotulada, indicando los códigos de los especímenes que contiene. El espacio donde se encuentren las placas debe estar aislado, en un ambiente con temperatura de 18ºC y humedad relativa de 70%, preferiblemente sin fluctuaciones bruscas de estas condiciones; adicionalmente, no debe estar expuesta a radiación, luz directa y no debe estar en contacto con gases. Los estantes deben ser revisados con periodicidad para evitar plagas que puedan deteriorar el material. Todo el material hará parte de futuras investigaciones, dando lugar a publicaciones, monografías o revisiones, por lo que estará en constante revisión y actividad, lo cual garantiza que la colección sea parte de una colectividad académica y que refleje el profundo trabajo dirigido a estructurar un conocimiento de la dinámica de uno de los componentes principales de la enfermedad: el vector.

Figura 4.6. Gavetas para el almacenamiento de las placas de vidrio donde se encuentran fijados los individuos. Fotografía: Alejandro Valencia

CAPITULO 5

ESTUDIOS ECOEPIDEMIOLOGICOS DE FOCO Lina Maria Carrillo, Sara Maria Robledo, Ivan Dario Velez La leishmaniasis es endémica en cerca de 100 países, distribuidos en las regiones tropicales y subtropicales del planeta. Las cifras que definen la carga de la enfermedad y los datos de la Organización Mundial de la Salud estiman en 350 millones las personas en riesgo de adquirir la infección, 1.5 a 2 millones de casos nuevos y 70.000 muertes cada año. La morbilidad y mortalidad debida a la enfermedad causa alrededor de 2.4 millones de años de vida perdidos ajustados por discapacidad. Sin embargo, debido al gran subregistro en prácticamente todos los países la carga de enfermedad esta subestimada. Más del 90% de los casos de LC ocurren en Afganistán, Algeria, Brasil, Pakistán, Colombia, Arabia Saudí Perú y Siria. En los últimos 10 años, el número de casos tanto de LC como de LV ha venido en aumento, por lo que es considerada por la OMS como una enfermedad re-emergente. La leishmaniasis no se distribuye homogéneamente en la naturaleza sino que se circunscribe a zonas geográficas específicas llamados focos naturales de transmisión, que son aquellos lugares donde están presentes los elementos claves de la transmisión: vectores y reservorios infectados. A su vez, la presencia de estos elementos y especialmente de los vectores está condicionada a factores de tipo ecológico como el clima, la humedad, la temperatura, la vegetación, entre otros, que permiten no solo la presencia del vector sino además su densidad relativa, su distribución espacial y con ellos la distribución los focos de transmisión y en buena medida el grupo de población humana que van a infectar. La eco-epidemiologia, como disciplina científica, estudia los elementos de la transmisión, los factores ecológicos asociados y los comportamientos humanos que afectan la transmisión, reconoce como elemento clave para el riesgo de infección al flebotomineo vector y de acuerdo a este define los límites del foco o macrofoco como las zonas geográficas donde el vector está presente, y de acuerdo a la bionomía o comportamiento del vector las épocas o estaciones de mayor riesgo de transmisión las épocas del año donde el vector tiene una mayor tasa de infección natural con Leishmania, que usualmente es 1 o 2 semanas posteriores al pico de mayor densidad de vectores, la población de riesgo como el grupo de población que está en mayor contacto con el vector infectado, la hora de

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mayor riesgo como la hora, usualmente de la noche, en que hay mayor actividad de picadura de los vectores y al microfoco o lugar de mayor riesgo, el lugar respecto al domicilio donde se da el contacto hombre-vector infectado: intra, peri o extra domicilio. La aplicación del método eco-epidemiológico permite identificar tres ciclos principales de transmisión a saber: selvático, doméstico-rural y doméstico-urbano. En el ciclo selvático, la transmisión ocurre cuando el hombre penetra el bosque o selva, es picado por los insectos vectores y se infecta. En este tipo de transmisión el hombre es un huésped accidental que no interviene en el ciclo de transmisión. Las personas que ingresan a las selvas por diversas actividades: mineros, cazadores, taladores de arboles, constructores de obras de infraestructura, comunidades indígenas y fuerzas militares, son los grupos de población más afectadas. El ciclo doméstico-rural se presenta en América y en otros países del mundo donde se ha observado un aumento del número de casos de leishmaniasis luego que se suspendieron los programas de rociamiento de las viviendas con DDT para el control de la malaria. Los vectores llegan al peri-domicilio, entran a las viviendas rurales y transmiten la infección a todo el núcleo familiar, sin diferencia por sexos y con una mayor tasa de infección en niños. El ciclo doméstico-urbano es cada vez más frecuente y en varios países americanos como Brasil, Venezuela y Colombia se señala presencia de los vectores en ciudades y la transmisión urbana tanto de LC como de LV. Se puede constatar que los focos de transmisión son dinámicos y van cambiando en el tiempo como resultado de cambios ambientales, deforestación etc. con presencia o alternancia de vectores en zonas donde antes no estaban y aparición de brotes epidémicos. El hombre juega un papel modulador en el riesgo, favoreciendo o dificultando la transmisión. En algunas regiones andinas la deforestación y establecimiento de zonas de pastoreo han confinado a los insectos vectores de LC al interior del bosque, de otra parte, la deforestación crea el ambiente favorable para el establecimiento del vector de LV, Lu longipalpis como se ha observado en Brasil y en Colombia. Los focos endémicos selváticos y domésticos-rurales se caracterizan por ser zonas generalmente alejadas de las ciudades, condiciones de pobreza, con grandes inequidades sociales y donde se encuentra poca presencia de las entidades de salud del estado. Por lo visible de las lesiones, pues se localizan en las zonas descubiertas de la piel, la cronicidad y lo deformante que pueden llegar a ser LC y LM, las poblaciones han elaborado sus propios sistemas médicos de tratamiento empírico para la enfermedad. Se entiende por, sistemas médicos el complejo de ideas o creencias acerca de las

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causas y curas de la enfermedad las técnicas utilizadas para contrarrestarla y las cualidades de los remedios. Tener en cuenta estos sistemas médicos es fundamental para el diseño y realización de los programas asistenciales y de control de las enfermedades. Estudios cualitativos sobre sistemas médicos realizados en comunidades indígenas de Colombia han permitido diferenciar dos tipos de enfermedades: El primer tipo comprende las llamadas enfermedades del "monte" o del "indio". El segundo tipo comprende las enfermedades occidentales o del "blanco", que curan los médicos occidentales o medicina facultativa. En el grupo de enfermedades del "monte" o "del indio" se distinguen, enfermedades producidas por seres sobrenaturales, enfermedades por maleficio y enfermedades producidas por causas naturales, debidas al contacto brusco entre el calor y el frío. En las diversas comunidades indígenas estudiadas la LC y la LV hacen parte de este grupo de enfermedades. Para algunas poblaciones campesinas colombianas, la causa está en la picadura del "pito" nombre con el que se designa tanto la leishmaniasis cutánea como a algunos insectos hemípteros, similares a los vectores de la Enfermedad de Chagas. El tratamiento de la leishmaniasis en las comunidades indígenas y campesinas se hace principalmente con cáusticos y macerados de plantas. El tratamiento con cáusticos consiste en la aplicación local de diversas sustancias como nitrato de plata, ácido sulfúrico, agua caliente, panela caliente y principalmente la cauterización de la lesión con una cuchara o con la punta de un machete que han sido previamente colocados al fuego y que es aplicado sin anestesia sobre la úlcera, dejando una cicatriz lisa. En Centroamérica hay pocas documentación acerca de las concepciones, actitudes y practicas sobre la leishmanisis sin embargo estudios en Guatemala y Costa Rica mostraron resultados similares a los encontrados en Colombia, especialmente con lo relacionado a la forma en que se tratan la enfermedad. En las encuestas se evidencia que una gran parte de la población considera que la transmisión de la enfermedad, llamada “chiclera” o “llaga llorona” en Guatemala o “papalomoyo” en Costa Rica, se da por contacto directo con los pacientes, otros lo pueden relacionar con la picadura de un insecto pero ninguno con la picadura de un flebotomíneo. Cuando se hacen estudios de focos y búsqueda activa de casos al interior de las zonas de transmisión se encuentra que en los ciclos domésticos-rurales la enfermedad afecta tanto a hombres como a mujeres, y en mayor proporción a los niños que a los adultos, mientras que en los registros de consulta médica en los Centros de Salud, Hospitales y Centros de Referencia la enfermedad se diagnostica

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más en hombres en edad laboral activa; esto se explica porque en las regiones rurales las mujeres y los niños permanecen en sus viviendas mientras que los hombres que son los responsables de las labores agrícolas, se desplazan a la cabecera municipal para la venta de sus productos y para la compra de alimentos y cuando se sienten enfermos aprovechan para consultar al hospital local. Ante la dificultad económica y el sobrecosto que representa llevar a las mujeres y los niños hasta la cabecera municipal, sumado a la poca credibilidad que en muchas regiones se tiene del hospital como lugar más idóneo para recibir un diagnóstico y el tratamiento para la leishmaniasis, las mujeres y los niños reciben más frecuentemente tratamientos empíricos ya sea con cáusticos o con plantas. Esto demuestra una inequidad de género en el tratamiento de la LC Para desarrollar los estudios de foco que permitan el conocimiento del ciclo de la enfermedad, los limites de las zonas de transmisión, el segmento de población en mayor riesgo de infección, las épocas del año, horas y lugares con respecto al domicilio de mayor riesgo se debe seguir una metodología con objetivos claros que permitan la: Caracterización epidemiológica, ecológica y antropológica de la zona de estudio para poder correlacionarla. Para ello se deben seguir las siguientes actividades: 5.1 Caracterización epidemiológica 5.1.1 Búsqueda activa de casos La busqueda activa se puede hacer por concentración o por visita casa a casa. El propósito es captar el mayor número posible de casos, establecer la real prevalencia de la enfermedad. Permite diagnosticar casos en fases iniciales de evolución clínica, y determinar casos antiguos. A las personas que presenten lesiones compatibles con la enfermedad se les llena el formato de la Historia Clínica y se le toma las muestras diagnosticas y para la identificación de especie de leishmania, siguiendo el protocolo descrito en el capitulo 2. A las personas con diagnostico comprobado se les instaura el tratamiento. Es importante además registrar toda la información como: - Número de personas examinadas y su distribución por grupos de edad y sexo. - Número de casos confirmados de leishmaniasis cutánea, mucosa, visceral, y su distribución por grupos de edad y sexo. - Número de casos confirmados que recibieron tratamiento y tipo de tratamiento administrado, dosis diaria y duración.

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- Número de personas con antecedentes de infección con Leishmania y su distribución por grupos de edad y sexo. La identificación de la especie de Leishmania es importante para adecuar el tratamiento y evaluar los riesgos epidemiológicos, incluida la incriminación de la especie vectora. 5.1.2 Identificación del grupo de población que está en mayor riesgo de infectarse mediante la prueba de Montenegro Se debe aplicar la prueba de cutánea intradérmica o prueba de Montenegro o leishmanina a una proporción representativa de los miembros de la comunidad incluyendo a personas de todos los grupos de edad y de ambos sexos, que acepten de manera voluntaria y firmen previamente un consentimiento informado. La prueba consiste en la aplicación intradérmica del antígeno de Montenegro, la cual será leída 48 a 72 horas después como se explica en detalle en el capitulo 2. Es positiva si hay una induración mayor o igual a 5 mm e indicara que el paciente esta o estuvo en contacto con el parasito, sin que necesariamente haya padecido la enfermedad. Esta información permitirá determinar cuáles son las poblaciones que han estado en contacto con el vector infectado, lo que se correlacionará con la georeferenciación de los casos. 5.1.3 Búsqueda de reservorios domésticos En las zonas endémicas a LV los perros son el principal animal domestico a estudiar, pues son el principal reservorio de L. Infatum. Las manifestaciones clínicas principales son: decaimiento, pérdida de peso, pelo hirsuto, crecimiento de las uñas u onicogrifosis, hepato y esplegnomegalia, linfadenopatias especialmente de los ganglios poplíteos, cataratas, enflaquecimiento de los músculos de la trompa, lo que le da el aspecto de animal viejo, posteriormente hay formación de escamas en todo el cuero que son más abundantes alrededor de los ojos, lo que se conoce como el signo de los anteojos. Se debe tener presente que los perros infectados tiene la capacidad de infectar a los flebotomíneos desde antes de que se presenten las manifestaciones clínicas de la enfermedad, por lo que la encuesta canina debe incluir a los perros asintomáticos, especialmente a los que se encuentren en la misma vivienda o alrededor de las viviendas en donde se han confirmado casos humanos.

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Los perros positivos deben ser sacrificados, como lo recomienda la OMS, pues la respuesta al tratamiento es pobre y no esterilizante es decir que este puede seguir infectado al vector, lo que significa mantener el riesgo de transmisión a los humanos y el riesgo de seleccionar cepas resistentes al medicamento. La información que se bebe consignar es la siguiente - Número de perros en la comunidad, de acuerdo al censo (si lo hay) y el promedio de perros por vivienda. - Número de perros atendidos, sospechosos, infectados y su georeferenciación. - Número de perros sacrificados. 5.1.4 Estudio entomológico Debe llevarse a cabo de manera sistemática y juiciosa pues es la presencia del vector la que focaliza la enfermedad y determina el riesgo epidemiológico de infección. El detalle de la metodología se encuentra descrito en el capítulo de Entomología, sección Estudios de campo. El procesamiento y análisis de las muestras y datos entomológicos deben dar cuenta de las especies vectoras responsable de la enfermedad y su comportamiento con respecto al domicilio, la época del año y las horas de la noche de mayor actividad de picadura. 5.2 Caracterización antropológica Los estudios de la disciplina antropológica son fundamentales para ponderar los resultados cuantitativos en la disciplina epidemiológica y favorecer la aplicación de las medidas de prevención y control de manera eficaz. Existen dos metodologías generales para obtener esta información, una es la cuantitativa que permite la recolección de datos a través de encuestas, censos, o entrevistas cerradas. La otra es la metodología cualitativa, que utiliza la etnografía de campo en donde la recolección de la información se lleva a acabo en todos los espacios posibles en los cuales se pueda interactuar con las personas de la región para hablar del tema, como en reuniones colectivas, visita casa a casa, entrevistas en profundidad con informantes claves como son los curanderos, lideres y ancianos de la región, todas estas conversaciones y entrevistas deben permitir entender las diferentes relaciones sociales relacionadas con la leishmaniasis que se dan al interior de la comunidad, y la manera en que el pensamiento colectivo influye en la cosmovisión sobre la enfermedad y las diversas maneras de conocerla y tratarla. Es decir su Conocimiento, Actitud y Practica (CAP) frente a la enfermedad.

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Otros factores sociales a describir son la disponibilidad de atención médica en localidades afectadas y acceso a la misma; las características y ubicación espacial de las viviendas que facilitan el contacto con las especies vectores cuando el contacto es en el intra o peridomicilio, los comportamiento y/o tipos de actividad de las poblaciones humanas durante los períodos de mayor riesgo, que favorecen el contacto con los vectores infectados, los conocimientos sobre la enfermedad: como la llaman, creencias sobre la forma en que se adquiere,nombre local para los insectos vectores, practicas populares para prevenir y tratar la leishmaniasis y las actividades de los pobladores que favorecen el mantenimiento de los focos de transmisión. 5.3 Caracterización ecológica La presencia y densidad relativa de las especies vectores que son las que focalizan la transmisión de la enfermedad están determinadas por factores ecológicos como flora, suelos, altitud y especialmente clima. La distribución espacial del foco se puede correlacionar con un marcador ecológico, como puede ser la presencia o asociación de plantas, altitud o un índice climático, que permite no solo cartografiar las zonas de riesgo sino reconocerlas en los trabajos de campo. Es por esto que la descripción ecológica en el foco de transmisión es importante y se debe tener información como: régimen de lluvias en el año, fluctuaciones en la humedad relativa, tipos de zona de vida, tipo de vegetación y cultivos, uso del suelo. Con este conocimiento holístico de la transmisión, la ecoepidemiología permite elaborar los mapas de riesgo y diseñar medidas racionales, económicas y efectivas de prevención y de control.

CAPITULO 6

LEISHMANIASIS EN CENTROAMERICA Lina María Carrillo, Iván Darío Vélez

6.1 Introducción El diseño e implementación de medidas efectivas para la prevención y el control de una enfermedad como la leishmaniasis requiere del conocimiento de los riesgos epidemiológicos de infección, esto es el establecimiento de los limites del foco natural de infección, o sea del lugar donde están presentes los vectores y reservorios infectados, de los grupos de población que están en mayor riesgo de infectarse, de las épocas del año y horas de mayor riesgo de infección y de los lugares, respecto al domicilio donde se da el mayor contacto de la población con los vectores infectados. La leishmaniasis es una enfermedad de distribución en zonas tropicales y subtropicales del planeta, y en América se encuentra en focos desde el sur de Estados Unidos hasta el norte de Argentina, con la mayor diversidad de especies de parásitos, de vectores y reservorios de todos los continentes y con un gran polimorfismo. Solo en Centroamérica se han identificado 8 especies de Leishmania y cientos de especies de Lutzomyia. En la región centroamericana se han realizado importantes estudios que han permitido tener una mayor comprensión sobre esta enfermedad y hay evidencia que la incidencia va en aumento en algunos países, sin embargo aun se tienen muchos vacios sobre elementos de la transmisión y factores de riesgo lo que ha dificultado su control. En el presente capítulo se hace un resumen de la situación epidemiológica de la leishmaniasis en la región centroamericana, con especial atención en las especies de Leishmania, los vectores, las formas clínicas de la enfermedad, los reservorios y los programas de prevención y control existentes en la región de centro América. Esta información se condensa en la Tabla 6.1. 6.2 Formas Clínicas La leishmaniasis se presenta en toda la región centroamericana y en algunos países de la zona Caribe como Republica Dominicana, con diferentes formas de manifestaciones clínicas entre las que se encuentra la Leishmaniasis cutánea, cutánea difusa, cutánea atípica, mucosa, y visceral. 6.2.1 Leishmaniasis Cutánea (LC) Es la forma clínica más común en centroamericana es la leishmaniasis cutánea y se presenta desde la provincia de Veracruz y la península de Yucatán en México hasta la región del Darién, en Panamá.

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Las especies que la producen son: - L. braziliensis: es la especie de mayor distribución geográfica en Centroamérica. Ha sido reportado en todos los países con excepción de El Salvador y Republica Dominicana. - L. panamensis: se ha informado en cinco países: Panamá, Guatemala, Costa Rica, Nicaragua y Honduras. Y es la especie más prevalente en Nicaragua, Costa Rica y Panamá. - L. mexicana: sta especie fue descrita por primera vez en 1942 por Biagi en México y posteriormente reportada en Belice, Guatemala, Costa Rica y Honduras. En la península de Yucatan causa lesiones llamadas “ulcera del chiclero” que producen mutilaciones en el pabellón auricular. Hay otras cuatro especies más que se han reportado en Centroamérica, estas especies son: L. garnhami en Costa Rica y L. colombiensis, L. amazonensis y L. naiffi en Panamá. Esta última fue recientemente amplificada por PCR en Lutzomyia trapidoi and Lu. gomezi. Todas estas especies son poco frecuentes y adolecen de estudios que permita conocer su epidemiologia y reconocer su impacto. 6.2.2 Leishmaniasis Cutánea Difusa (LCD) Es una forma clínica poco frecuente, producida generalmente por parásitos del complejo mexicana, que inducen en el paciente una inhibición de la respuesta inmune mediada por linfocitos T específica contra el parásito lo que facilita su multiplicación y diseminación, resultando en gran cantidad de lesiones nodulares e indoloras en todo el cuerpo, sobre todo en cara y extremidades. La LCD se ha reportado en Costa Rica, Guatemala, México y Republica Dominicana. En todo el agente causal ha sido L. mexicana. 6.2.3 Leishmaniasis Cutánea Atípica (LCA) En los últimos tiempos, se ha descrito en Centroamérica una forma de leishmaniasis cutánea denominada Leishmaniasis Cutánea Atípica (LCA), que se manifiesta con lesiones circunscritas y no ulceradas, crónicas, producidas por L. infatum, que puede evolucionar a la forma visceral en personas inmunodeprimidas. La LCA ha sido informada en: Nicaragua en donde se reporto por primera vez esta forma clínica en 1997 y para el periodo 2003-2007 se informaron en total 1096 casos. También se ha informado en Honduras, Costa Rica y El Salvador este último país con 87 casos en los últimos cinco años. 6.2.4 Leishmaniasis Mucosa (LM) La LM se presenta cuando Leishmanias del subgénero Viannia se disemina por vía linfática y sanguínea desde una lesión cutánea e invade las mucosas de la región naso-oro-faríngea, debe

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diferenciarse de la lesión mucosa que ocurre por contigüidad de una lesión cutánea en nariz, labios o mejillas y que la puede causar cualquier otra especie de Leishmania. Es ocasionada en México, Guatemala, Honduras, Nicaragua, Costa Rica y Panamá por L. braziliensis y L. panamensis, así mismo se han informado casos por L. mexicana en Costa Rica y México. En Belice se publico en 2004 un único caso de LM en un turista británico pero se desconoce de casos de personas nativas de la Región. 6.2.5 Leishmaniasis Visceral (LV) Es producida por L. infantum (syn. L chagasi) afecta principalmente a niños menores de 5 años. En México en el año 2000, se informo de un caso de LV causado por L. mexicana en un paciente coinfectado con toxoplasmosis proveniente del estado de Tabasco. La LV se presenta en casi todo el istmo Centroaméricano con excepción de Panamá y Belice. Aunque Costa Rica no se considera como un país endémico para LV en 1999 se informo un caso en un bebe de 15 meses de edad de la región de Guanascate, que mejoro después de terapia con antimonio por seis semanas. Los primeros casos de LV en la región fueron descritos en Guatemala en 1959, luego en Honduras en 1974 y desde esa época un poco más de 300 casos han sido notificados en niños menores de cinco años. Mientras que el primer caso autóctono en México se informó en 1984, y cuatro años después en 1988 se reporta en Nicaragua en una niña de tres años proveniente de la Isla Zapatera, en el Lago de Nicaragua. 6.3 Distribución Geografía y Frecuencia de Leishmaniasis La leishmaniasis sigue siendo en Centroamérica un problema de mayor impacto en las áreas rurales, y ha venido tomando mayor importancia en la medida que en los últimos años ha aumentado el número de casos y el reporte de los mismos. Nicaragua es el país que informa el mayor número de casos con alrededor de 3000 por año, seguido por Panamá y Honduras con cerca de 1500 casos al año. Costa Rica, Guatemala y México reportan alrededor de mil, y El Salvador menos de cien casos por año. Para Belice y, Republica Dominicana no hay datos recientes. 6.3.1 México En México la LC es endémica en Campeche, Chiapas, Coahuila, Jalisco, Michoacán, Nayarit, Nuevo León, Oaxaca, Tamaulipas, Quintana Roo, Tabasco, Veracruz, Yucatán y recientemente Sinaloa. Entre 1990 y 2007 se reportaron en total 16.858 casos, y en los últimos cinco años el promedio por año fue de 870 con un pico de 1129 casos en el años 2003. Solo 17 casos se reportaron de LV entre 1985 a 1994 en Guerrero, Morelos y Chiapas en donde se reportaron los primeros casos para el país.

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6.3.2 Guatemala Entre el año 2000 y 2007 se reportaron para Guatemala en total 5709 casos de los cuales el 94.6% (5399/5709) fueron LC, conocido en el país como “Chiclera” o “Llaga llorona”. Los tres Departamentos en donde se presentaron el mayor número de casos fueron Alta Verapaz (2039/5709), Petén (2893/5709) y Huehuetenango (550/5709). Del 2002 al 2008 se notificaron 101 casos de LV en seis departamentos: Chiquimula, Quichè, Alta Verapaz, Huehuetenango, Izabal y Peten con una población en riesgo que suma los 4.359.734 millones de personas. 6.3.3 Belice No hay datos sobre la prevalencia o la incidencia de la enfermedad en este país. Existen reportes de casos especialmente en turistas o personal militar extranjero; de hecho el primer registro de esta enfermedad se hizo en 1984 en donde se aisló L. braziliensis en personal militar británico. Dos especies se han identificado, L. mexicana y L. braziliensis, aunque algunos autores consideran que no es L. braziliensis sensu stricto si no una variante muy semejante. 6.3.4 El Salvador Los departamentos con mayor número de casos son San Vicente, Cabañas, San Miguel, La Unión y San Salvador. En total se han reportado 91 casos entre el 2003 y el 2007, 90% originados en áreas rurales, la mayoría tipificados como LCA y cuatro como LV. La única especie reportada en El Salvador es L. infantum, sin embargo se reportan casos de LC desde 1950 con baja incidencia y con epidemiologia desconocida, así como casos de LM, cuatro del 2007 al 2008, lo que genera dudas acerca de la posible circulación de L. braziliensis en este país. 6.3.5 Honduras En promedio 1500 casos son reportados anualmente. Los principales departamentos afectados con LC son Olancho, Yoro, El Paraíso, Santa Bárbara, Cortés, Atlántida, Colón y Gracias a Dios. Los principales focos de LV se encuentran en el sur y en la región suroccidente de1 país, en los departamentos de Choluteca, Valle y Francisco Morazan. Hay áreas endémicas de menor extensión en los departamentos de El Paraiso, Intibuca, La Paz y Lempira. 6.3.6 Nicaragua La mayoría de los casos se presenta hacia el norte del país, en el departamento de Jinotega, aunque se reportan casos en casi todo los departamentos. Entre el 2003 y el 2007 se notificaron 16.123 casos, de

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estos el 91.6% (14-784/16.123) fue LC, 6.8% (1096/16.123) LCA, 1.4% (230/16.123) LM, y solo se reportaron 13 casos de LV. 6.3.7 Costa Rica La leishmaniasis ocasiona en Costa Rica un delicado problema de salud pública, ya que el número de casos promedio ha aumentado significativamente. Por ejemplo en el periodo comprendido entre 1996 a 2000 el número de casos oscilo entre 481 a 998 casos por año, es decir entre 14-26 casos por cada 100.000 personas. Mientras que para el periodo de 2004-2007 el número de casos por año fue de 1061 a casos 1870, es decir más del doble de lo reportado para la década de los noventa. Y en promedio la tasa casos por cada 100.000 habitantes fue de 35.7, en estos últimos cinco años, diez casos más que la tasa promedio para los años 90s. Uno de los brotes epidémicos de LC más importantes se dio en Guanacaste, entre 1986 y 1987, cuando unas 200 personas, especialmente refugiados nicaragüenses, fueron afectadas. La mayor prevalencia de la enfermedad se da en zonas boscosas sin embargo, los casos se distribuyen por todo el país, siendo las provincias de Alajuela, Cartago, Heredia, Limón, Puntarenas, y San José (la zona de Puriscal), las más afectadas. Otras como Guanacaste presentan casos solamente en La Cruz. Por otro lado la población con mayor prevalencia en estudios realizados del 2005 al 2007 son los niños menores de 5 años en donde las tasas alcanzan a ser de 122,4 por cien mil habitantes. 6.3.8 Panamá La mayoría de los casos en Panamá se originan en las región de Bocas del Toro, Panamá, Coclé, Oeste Panamá y Colón. Entre el 200-2007 se reportaron 22.277 casos pero el sistema de información no permite desglosar la proporción de LC y LM. No existe reporte de LV. Panamá es el país que junto a Costa Rica tienen el mayor número de especies de leishmania, cinco en total. 6.3.9 Republica Dominicana El primer caso se reporto en 1975 pero a pesar de los intentos que se hicieron por identificar la especie, no fue posible pues los resultados de las pruebas fueron contradictorios por ejemplo las lesiones que produce en el hámster son parecidas a L. panamensis que a L. mexicana, sin embargo se desarrolla en la región suprapilórica del intestino de la Lutzomyia como lo hace L. mexicana, además la forma del amastigote es más grande que otras especies de Leishmania y no es fácilmente cultivable en el laboratorio. No hay datos ni estudios recientes que permitan concluir cual es la

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especie circulante en este país o cual es su situación epidemiológica, 6.4 Vectores En algunas regiones de Centroamérica como en Costa Rica a la Lutzomyia, vector de la leishmaniasis, se le llama popularmente “Papalomoyo” que deriva de la palabra azteca Papallot, que significa mariposa y Moyotl, que significa mosquito, en otras partes se le llama la mosca del cusuco (armadillo) o chaquiste como en Guatemala. En forma general no hay en el conocimiento popular una asociación entre el vector y la enfermedad. Existen al menos catorce especies vectoras o posibles vectoras en la región centroamericana estas son: 6.4.1 Lutzomyia ovallesi (Ortiz) pertenece al grupo verrucarum es una especie antropofílica, que frecuenta el peridomicilio y ha sido señalada como transmisor de L. mexicana en Guatemala, así como en la región centro occidental de Venezuela. Se han encontrado infectada naturalmente con L. braziliensis en Belice, Honduras y México 6.4.2 Lutzomyia (Nyssomyia) olmeca olmeca (Vargas & Nájera), es un vector comprobado de L. mexicana en México, Belice, Costa Rica y Guatemala y es el principal vector en la región del Yucatán en México. 6.4.3 Lutzomyia (Nyssomyia) ylephiletor (Fairchild & Hertig), El descubrimiento de la infección natural de esta especie con L. mexicana en Guatemala (Porter et al. 1987) representó el primer aislamiento de este parásito a partir de un phlebotomineo. Esta especie es uno de los vectores sospechosos de L. panamensis en Panamá (Christenson y Herrer 1973) y Costa Rica (Zeledón 1985) en donde es una de las especies más abundantes. De la misma forma es vectora de L. panamensis en Honduras, Nicaragua y Guatemala en donde además se encontró infectado con L. braziliensis (Umakant Sharma & Sarman Singh. 2008). 6.4.4 Lutzomyia (Nyssomyia) trapidoi (Fairchild & Hertig) se considera vector de L. panamensis en Panamá (Barreto P. 1974) Costa Rica, Guatemala, Honduras y Nicaragua (Jaramillo-Antillon O, et al. 2009; Umakant Sharma & Sarman Singh. 2008). Es endofilica y endofagicas . Estas características indicaron para dichos estudios que Lu. trapidoi podía ser el vector primario de la enfermedad y participar en su transmisión a nivel domiciliario (Santamaría E., et al. 2006). 6.4.5 Lutzomyia olmeca bicolor pertenece al subgénero Nyssomyia Barretto, el cual se encuentra filogenéticamente cercano de Psychodopygus (Beati et al. 2004), mostrando también un comportamiento antropofílico. Entre los antecedentes vectoriales de L. olmeca bicolor se halla su probable participación en la transmisión de L. mexicana en Costa Rica. (Young DG, Arias JR. 1992).

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6.4.6 Lutzomyia youngi (Murillo y Zeledón, 1985), pertenece al subgénero Psychodopygus. Es considerado como vector de L. braziliensis en Costa Rica en donde también ha sido relacionada con la transmisión de L. garnhami. Hasta hace poco era confundida con Lu. townsendi (Ortiz, 1959). 6.4.7 Lutzomyia longipalpis (Diptera: Lutzomyia) es el principal vector de Leishmania (L.) infantum, agente etiológico de la leishmaniasis visceral y de la Leishmanasis Cutánea Atípica (Ward 1985, Shaw & Lainson 1987, Momen et al. 1987, Grimaldi et al. 1989, Tesh 1995) Se encuentra en toda Centroamerica con excepción de Belice y Panamá. 6.4.8 Lutzomyia evansi (Núñez-Tovar, 1924). es el principal vector de la enfermedad en delimitados focos de Colombia y Venezuela, en algunos de los cuales también se ha registrado la ocurrencia de Lu. longipalpis (Feliciangeli et al. 1999). Morfológicamente, las hembras de Lu. evansi se caracterizan por tener espermatecas en forma de saco con estrías irregulares y ductos individuales largos y delgados. Se encuentra en Costa Rica, México y Nicaragua. 6.4.9 Lutzomyia (Psychodopygus) panamensis (Shannon): especie reconocida como transmisora de L. panamensis (Lainson y Shaw, 1972), y de L. braziliensis (Vianna, 1911) en Guatemala, Honduras, Nicaragua y Panamá en estos dos países es el único vector reconocido para L. braziliensis (Rodríguez N, et al. 1999; Rowton E, et al. 1991) 6.4.10 Lutzomyia (Psathyromyia) shannoni (Dyar). Se han encontrado infectados naturalmente con flagelados no identificados en varios países como Panamá (Johnson et al. 1963) y Costa Rica (Zeledón y Alfaro 1973). En Guatemala (Rowton et al. 1991) y México esta incriminado como transmisor de L. mexicana 6.4.11 Lutzomyia (Lutzomyia) cruciata (Coquillett). Se puede distinguir fácilmente de Lu. gomezi en Centroamérica por la coloración del pronoto y paratergito, siendo muy pigmentada en Lu. cruciata. Una alta proporción de esta especie es autógena (Young & Perkins 1984, Porter et al. 1987). Son antropofílicas y se ha demostrado transmisión experimental de L. mexicana en Belice. También se ha relacionado con la transmisión de esta especie en México, Honduras y Guatemala (Cruz-Ruiz et al. 1994; Umakant Sharma & Sarman Singh. 2008). Además Se ha incriminado en la transmisión de L. panamensis en Nicaragua y L. braziliensis en México (Williams P.1966). 6.4.12 Lutzomyia (Lutzomyia) gomezi (Nitzulescu) Se considera vector de L. panamensis y L. naiffi en Panamá (Barreto P. 1974), único país centroamericano que la reporta. 6.4.13 Lutzomyia (Helcocyrtomyia) sanguinaria (Fairchild & Hertig) ha sido incriminada como vectora de leishmaniasis cutánea por L. panamensis solo en Panamá (Christensen y Herrer 1973). 6.4.14 Lutzomyia christophei (Fairchild &. Trapido). Incriminada como posible y única especie

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vectora en Republica Dominicana, debido a su distribución, los hábitos y las relaciones de la enfermedad. Por otra parte, se ha demostrado experimentalmente que las hembras pueden transmitir la cepa endémica de Leishmania (cepa Isabel) en hámsters. 6.5 Reservorios Los reservorios son animales vertebrados que albergan el parásito, permitiendo que los vectores se infecten de ellos y persista el ciclo. Existe una amplia variedad de animales salvajes y domésticos que están implicados como reservorios de Leishmania en Centroamérica. Dentro de los animales reservorios más comunes en esta subregión de América están especies de Canidae, Didelphidae, Muridae y Xenartros. Uno de los primeros estudios para incriminar reservorios en la región, fue el desarrollado en Belice en los años 60`s, en donde se incriminaron como reservorios L. mexicana a Ototylomys phyllotis, a Nyctomys sumichrasti, y a Heteromys desmarestianus, esta ultima especie fue incriminada también como reservorio de L. panamensis en Costa Rica. En la actualidad varias especies del género Heteromys han sido incriminadas como reservorios de Le mexicana en la región del Yucatán, en México, así como especies de los géneros Ototylomys, Nyctomys, Sigmodon, Peromyscus siendo Peromyscus yucatanicusy Ototylomys phyllotis los reservorios primarios L. mexicana en esta región. Otros estudios también de la época demostraron en Costa Rica y en Panamá que Choloepus hoffmani, el oso perezoso de dos dedos, es el reservorio de L. panamensis y L. colombiensis en Panamá. Por otro lado el oso perezoso de tres dedos (Bradypus griseus) también se incrimino como reservorio de L. panamensis. El reservorio principal de L. infantum especie causante de LV, es el perro (Canis familiares). 6.6 Control En algunos países de la región centroamericana no hay notificación obligatoria como en Belice y Republica Dominicana. En otros países como Honduras solo es obligatorio el reporte de los casos de Leishmaniasis Visceral o Mucosa. Costa Rica, Panamá, México, Nicaragua fueron pioneros y hace mas o menos treinta años reglamentaron este tipo de notificación mientras Guatemala, El Salvador y Honduras lo han hecho hace menos de una década. Ningún país hace búsqueda activa de casos, la mayoría de los casos se conocen por vigilancia pasiva, en donde el paciente consulta en hospitales o centro de salud, se hace el diagnostico, se suministra el tratamiento cuando está disponible y desde allí se reporta al sistema nacional de salud. Esto hace que en todos los países halla un alto subregistro de la enfermedad, pues la mayoría de las personas afectadas pertenecen a poblaciones rurales pobres que tienen dificultad de desplazamiento y escaso o nulo acceso a los servicios de salud. No existen

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programas de estudio y control de vectores, algunos países hacen control vectorial en focos donde hay casos, como Guatemala, Honduras y Nicaragua. Ningún país cuenta con un programa de estudio y control de reservorios. Todo esto significa que en la mayoría de países los programas de control se limitan a la detección y tratamiento de los casos. Existen programas especiales como el de Guatemala en donde se creó en 1986 la Comisión Nacional para el Estudio de la Leishmaniasis y desde ese momento muchos estudios epidemiológicos y clínicos han permitido tener un mejor conocimiento de la enfermedad en este país. O como el caso de Honduras en donde en el Plan Nacional para la Salud 2021 le dio prioridad a la prevención y control de enfermedades transmitida por vectores como la leishmaniasis y entre los planes a alcanzar para el 2010 es: Reducir los casos de LV en un 50% y la fatalidad a un 0%, entre otras.

Manual Diagnóstico y Control de la Leishmaniasis en Centroamérica Tabla 6.1. Resumen por país de las principales especies de Leishmania, Lutzomyias y reservorios así como de las formas clínicas de la leishmaniasis en Centroamérica

L.b: L. braziliensis, L.p: L. panamensis; L.i: L. infantum; L.m: L. mexicana; L.g: L. garnhami, L.c: L. colombiensis; L.n; L. naiffi; L.a: L. Amazonensis *Promedio de los últimos cinco años. **Especies incriminadas sin confirmar.

CAPITULO 7

PREVENCION Y CONTROL Iván Darío Vélez, Sara Maria Robledo La prevención y el control de la leishmaniasis en cualquiera de sus formas clínicas son programas muy complejos, debido a la gran cantidad de especies del parásito, de vectores y de reservorios y a los diferentes ciclos epidemiológicos de transmisión. Para poder prevenir la enfermedad en una comunidad es preciso determinar previamente los riesgos de infección: grupo de población de mayor riesgo, lugar respecto al domicilio donde se dá el contacto hombre-vector infectado, época del año y hora de la noche de mayor actividad de picadura de los vectores. De esta forma se adecuan las medidas de prevención (esta información será ampliada en el capítulo referente a estudios de foco). Cuando la transmisión es selvática las medidas de prevención están orientadas a prevenir que las personas sean picadas por los vectores. En estos casos el uso de repelentes de insectos a base de DEET (N, N-dietil-m-toluamida) ha mostrado ser eficaz cuando se aplica cada 6 a 8 horas. El repelente se debe aplicar cuando se vaya a estar al aire libre y se esté en peligro de recibir picaduras de los insectos vectores. Al interior de la selva debe aplicarse de día y de noche. La frecuencia de aplicación depende del tipo de repelente que se esté usando, por lo tanto es importante seguir las recomendaciones del producto. Debe aplicarse el repelente con mayor frecuencia cuando hay sudoración y después del baño. En poblaciones especiales como trabajadores de obras de infraestructura y en militares, además del repelente de insectos se recomienda la impregnación de los uniformes con permetrina y en la noche el uso de toldillos o mosquiteros impregnados con insecticidas piretroides. En los ciclos domésticos urbanos o rurales se recomienda la aspersión de insecticidas y el uso de cortinas y toldillos o mosquiteros impregnados con piretroides. Los flebotomíneos son susceptibles a la mayoría de los insecticidas que se utilizan en salud pública y para el control de la leishmaniasis hay que aplicarlos antes de la época de mayor densidad de vectores. Los toldillos deben estar fabricados en nylon o en poliéster ya que la acción residual del insecticida es mayor en estos materiales que en los de algodón. Los orificios deben ser muy pequeños (cerca de 160 orificios por centímetro cuadrado) para así evitar que la Lutzomyia atraviese el toldillo, dado el tamaño tan pequeño de estos insectos. Hay que tener en cuenta que si el toldillo no está impregnado de insecticida la Lutzomyia puede atravesarlo, aun si los orificios son pequeños.

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Para la LV americana se recomienda el sacrificio de todos los perros infectados además de las medidas de lucha antivectorial de los ciclos domésticos, especialmente para los niños. No se recomienda el tratamiento de los perros enfermos puesto que no hay ningún medicamento que sea efectivo y luego de una mejora clínica del animal aparecen las recaídas y se favorece la generación de cepas de Leishmania resistentes a los medicamentos usados. El uso de collares impregnados con deltametrina (Scalibor®) protege los perros contra la picadura de los flebótomos. Cuando se presenta un brote epidémico se deben hacer medidas de control directamente en el foco de infección, que incluye la educación primaria en salud, la búsqueda activa de casos, diagnóstico y tratamiento y la implementación de medidas de lucha antivectorial. La prevención de la enfermedad con una vacuna profiláctica, al igual que para muchas otras enfermedades infecciosas, sería una estrategia mucho más efectiva desde el punto de vista costo beneficio. Infortunadamente y a pesar de los grandes esfuerzos en encontrar una vacuna aún no se dispone de ninguna vacuna que muestre ser efectiva.

CAPITULO 8

LEISHMANIASIS CANINA Iván Darío Vélez B, Sara María Robledo R.

Los perros son susceptibles a la LC y LV y a la vez son reservorios importantes de L. infantum, el agente causal de LV en humanos. La sintomatología y signos clínicos mostrada por los perros con LC permiten diferenciar la LC canina de la LV canina como dos entidades clínicamente diferentes. 8.1 Leishmaniasis visceral canina La LV canina es una infección crónica que lleva a la muerte del animal. Es endémica en muchos países de América Latina, la cuenca del Mediterráneo y el occidente del África, donde constituye un problema serio de salud pública y veterinaria. Como consecuencia al cambio climático y el aumento en las migraciones la enfermedad se ha ido propagando a otras regiones del mundo como por ejemplo, Estados Unidos. La enfermedad en el perro tiene peor pronóstico que en los humanos, toda vez que no se dispone de un tratamiento efectivo. y cursa con apariencia clínica muy variable. El período de incubación puede ser de meses o años. Los perros que viven en zonas endémicas de LV, sobre todo los perros cazadores y de guardia que pasan la noche al aire libre, están mas expuestos a ser picados por los vectores infectados. La mayor exposición aumenta el riesgo de infección y la infección ocasiona la seropositivad de los animales. El diagnostico temprano y el sacrificio de los animales infectados, permite un control más eficaz de la transmisión a otros perros y a los humanos. Los signos y síntomas de la LV canina se inician con la pérdida del olfato, letargia y enflaquecimiento de los músculos de la trompa, lo que le da el aspecto de animal viejo; posteriormente hay una descamación furfurácea , sobre todo alrededor de los ojos, lo que se conoce como el “signo de los anteojos”. Según la enfermedad va avanzando, el perro manifiesta crecimiento de las uñas (onicogrifosis), decaimiento, pérdida de peso, fiebre, visceromegalias, dermatitis exfoliativa, crecimiento de ganglios poplíteos y cataratas. Son habituales las heridas en la piel, especialmente en la cabeza y las patas en las áreas donde el perro está en contacto con el suelo al tumbarse o sentarse. Cuando el cuadro se vuelve crónico, se presentan complicaciones como e insuficiencia renal en lo que lleva a la muerte del animal. Para el diagnostico se utilizan las mismas técnicas usadas en humanos y que nos permitan detectar los anticuerpos o el parásito (Ver capitulo 2). Entre las técnicas más utilizadas está el aspirado de

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medula ósea o de ganglio linfático poplíteo. Para el diagnostico serológico se cuenta con una prueba inmunocromatográfica rápidas o dipstick que utiliza el antígeno recombinante rK39 . Para ello una gota de sangre se coloca en el dipstick, se adiciona una gota de buffer y un minuto mas tarde se lee de la siguiente manera: aparición de una banda significa que el dispstick esta bueno, aparición de 2 bandas significa que el perro tiene anticuerpos contra Leishmania; rK39 tiene una sensibilidad del 96%-100 en perros sintomáticos y del 76.6%-96% en perros asintomáticos, con una especificidad del 100% en perros positivos por parasitología. Es una prueba muy fácil de realizar, económica y de lectura rápida por lo que es muy útil para estudios de campo. Otras técnicas serológicas son IFI y ELISA. Para el diagnostico parasitológico se puede hacer aspirado de ganglio poplíteo o de medula ósea. El material aspirado se puede utilizar para realizar frotis o extendidos en placa, cultivo o PCR.

No se dispone de tratamientos efectivos para la LV canina y toda vez que las recaídas son la regla y que se disponen de pocos medicamentos para tratar la LV humana, no se recomienda el tratamiento de perros infectados por la posibilidad de generar cepas de Leishmania resistentes que luego van a infectar a las poblaciones humanas. Por ello la recomendación es de sacrificar los perros positivos. Se debe tener en cuenta que los perros infectados son reservorios, esto es, infectan a los flebotomineos vectores desde antes que la enfermedad sea aparente, de ahí la necesidad de mantener una permanente vigilancia epidemiológica, con evaluación de presencia de anticuerpos en las zonas endémicas y proceder con el sacrificio de los perros infectados.

8.2 Leishmaniasis cutánea canina Especies de Leishmania como L. braziliensis y L panameniss entre otras, pueden infectar a los perros y producirles los síntomas y signos de LC similar a la LC en humanos. Los signos y síntomas de la LC canina incluyen lesiones de la piel muy similares a las lesiones típicas descritas para LC en humanos , es decir, lesiones que comienzan con la formación de una pápula que incrementa su tamaño y finalmente se ulcera. Las lesiones también pueden ser tipo placa o ulceras francas o costrosas con induración en la base de la misma y de tamaños variados, hemorragias nasales, inflamación de los ganglios linfáticos, pérdida de peso e inflamación de las articulaciones. Las lesiones generalmente se

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presentan en el hocico, las orejas y los genitales. Para el diagnostico se recomienda el raspado y aspirado de la lesión para visualizar el parasito ya sea por examen directo, cultivo o PCR. La aerología también permite identificar los animales positivos mediante la detección de anticuerpos específicos por las técnicas de IFI y ELISA.

La LC canina responde bien al tratamiento con antimoniales por lo que se recomienda la administración del tratamiento para el manejo de la enfermedad y no el sacrificio de los mismos como ocurre para los casos de LV canina. 8.3 Prevención y control Una de las medidas más efectivas para prevenir la leishmaniasis canina es evitando el contacto entre los perros y los flebotomineos vectores de Leishmania ya sea con el uso de collares impregnados con insecticidas o el uso de insecticidas tópicos, los cuales repelen y matan los flebotomineos en su intento por alimentarse de los perros. Los collares de plástico impregnados con 4% deltametrina y el excipiente trifenil fosfato, comercializado con el nombre de Scalibor® ha mostrado protección del 94% hasta por 34 semanas de uso. Entre los insecticidas de uso tópico están los siguientes: - Una solución tópica de permetrina (EXspot®) aplicada en el dorso del perro, la cual se distribuye e impregna por el estrato córneo de la superficie del animal. - Una solución tópica pulverizable (Duowin®) que contiene una combinación de permetrina y piriproxifeno que se utiliza a una dosis de 5 ml/kg. - La combinación de imidacloprid al 10% y permetrina al 50% (Advantix®), en una formulación en pipeta, es muy eficaz en la prevención de la leishmaniasis canina en condiciones naturales de las áreas endémicas por su actividad repelente contra los flebótomos en un 95%. Otra medida preventiva es el uso de vacunas. A la fecha se conocen resultados de dos vacunas contra la leishmaniasis canina con resultados prometedores según ensayos de fase III.

CAPITULO 9

SISTEMAS DE INFORMACION GEOGRAFICA Mónica Zuleta La creciente demanda de la sociedad moderna por desarrollar una eficiente gestión de los Sistemas de información, que permitan una rápida captura, organización, procesamiento y análisis de información, ha conducido a implementar el desarrollo de programas y métodos de procesamiento y análisis computarizados, los cuales son hoy en día están siendo integrados en diversas actividades de la sociedad moderna. Este es el caso de la información espacial que es capturada mediante el empleo de herramientas como los Sistemas de Información Geográficas (SIG), los cuales permiten analizar la información espacial y no espacial relacionada, con el fin de contribuir en procesos de planificación y búsqueda de soluciones a problemas espaciales. El desarrollo de los SIG comienza desde finales del siglo XX, pero su origen se encuentra ligado a la evolución de los Sistemas de Información (SI), que nacen a partir de la necesidad de facilitar la organización y gestión de la información. Como Sistema los SI están compuestos por un conjunto de componentes, que se conectan entre sí y que tienen funciones específicas, las cuales buscan recolectar, almacenar, procesar y distribuir información, con el fin de que ésta sirva de soporte y apoyo en la toma de decisiones, coordinación y control, análisis y visualización en una organización (Laudon, 2006). Algunas funciones de los componentes básicos de los Sistemas de Información (SI) son permitir la entrada de datos, permitir el accionar de mecanismos de control y de transformación, así como facilitar la salida de la información (Fernández, 2006). Un componente fundamental en un SI son los datos, es decir, la información digital almacenada, la cual dependiendo de su naturaleza, determina el tipo de Sistema de Información generado; tal es el caso de los SIG o también conocidos en inglés como Geographic Information System (GIS), esta herramienta fue diseñada para almacenar, procesar y analizar información espacial o geográfica; por ejemplo, datos descriptivos de lugares, información de infraestructura, datos demográficos, mapas, imágenes satelitales, fotografías, planos técnicos, datos geográficos estadísticos, en otros. Según Bartelme (1995), la historia de los SIG comienza a mediados de los años 50, tiempo que el autor denominada como el tiempo de los “pioneros”(Bartelme, 1995), pero es realmente desde mediados de los años 70, debido a la creciente necesidad de administrar grandes volúmenes de datos provenientes de los censos, que la US Bureau of Census en conjunto con el US Geological Survey y el British Ordnance Survey deciden establecer una administración computarizada de la información

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censal en forma, de lo que actualmente conocemos, como Geodatos, siguiendo posteriormente con un acelerado desarrollo de los SI. Desde los últimos 20 años se ha presentado una creciente demanda en el empleo y difusión de tecnologías SIG, posiblemente gracias a los avances en el desarrollo de Hardware y aplicaciones informáticas y a una disminución de costos de estas tecnologías en el mercado, lo que hace accequible que un mayor número de personas y empresas puedan comprarla. Además, ha aumentado en el mercado la oferte de herramientas en el campo de los SIG. Es común que se asocie el empleo de los SIG con la tecnología de generar mapas, porque evidentemente los SIG se han permeado de herramientas de la cartografía digital brindando funcionalidades para diseñar y generar cartografía temática; pero a diferencia de los programas de dibujo automatizado, las potencialidades de los SIG son superiores debido a que estos sistemas integran herramientas para la administración y análisis de grandes volúmenes de datos. Otra particularidad importante en los SIG es la naturaleza geográfica de los datos que almacena. Estos datos geográficos poseen varios atributos que los caracterizan, como son el que poseen una posición, una descripción ligada a su entorno geográfico, unas relaciones espaciales con el entorno en el que se encuentran y además, esta información geográfica varía según la temporalidad (Comas, 1992). La localización espacial (georreferenciación) de la información geográfica en un SIG, ya sea en forma explícita (en coordenadas geográfica o planas) o implícita (por direcciones, en función a su vecindad, etc.), es la que posibilita integrar y analizar topológicamente los datos geográficos en el sistema. Bill and Fritsch (1994) definen un SIG como …” un sistema computarizado que se compone de un Hardware, Software y Datos, con el cual es posible capturar, almacenar, organizar, modelar y analizar datos georreferenciados, que pueden ser presentados tanto en forma alfanumérica como gráfica”. Otra definición más precisa, es la que lo define como un sistema computarizado, que consta también de métodos, para la solución y representación de problemas espaciales, ya que se trata de sistemas,1 herramientas y métodos computarizados que “[...] están en capacidad de capturar, administrar, modificar e interpretar datos geográficos relacionados a una superficie. Estos datos existen en forma de datos espaciales y de informaciones descriptivas. [...] Se habla de un Sistema de Información geográfica o de un SIG cuando esos datos espaciales, se encuentran almacenados en un sistema de información” (Buhman/Bachhuber/Schaller, 1996). En todas las definiciones, se desprenden los componentes básicos de un SIG, que son: hardware, software, datos y usuario. Para muchos autores

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los datos representan la parte más importante de los SIG, sin embargo no sería posible almacenar, procesar y analizar los datos sin contar con un Hardware y Software, y sin un Usuario, quien es finalmente la persona que establece los criterios metodológicos de entrada, organización, procesamiento y análisis de la información almacenada en un SIG. El desarrollo de la tecnología computarizada, Hardware, ofrece cada vez mejores herramientas que posibilitan alcanzar una mayor velocidad y capacidad de almacenamiento de información, las cuales eran anteriormente una de las grandes limitaciones en el trabajo con los SIG. Igualmente, con respecto al componente Software, hoy en día en el mercado ha aumentado la oferta de múltiples y variados programas SIG. En el mercado es posible encontrar potentes herramientas de SIG como ArcGIS-ESRI, Geomedia de Intergraph, IDRISI, Falconview, entre otros, que pueden ser adquiridas a precios razonables por los usuarios. Además, es posible encontrar herramientas con aplicaciones específicas, algunas con código abierto con bajos costo o con acceso libre, como son los programas: Grass GIS, ILWIS, Mapwindow SIG, entre otros. Un ejemplo importante de herramienta SIG, aplicada a la salud, de libre acceso es la aplicación SIGEpi, software creado por el programa de análisis de Situación en Salud de la División de Salud y Desarrollo humano de la Organización Panamericana de la Salud (OPS), el cual integra algunas funcionalidades básicas de un SIG, como son: la visualización de datos, diseño de mapas, generación de gráficos, juntar datos espaciales y tablas, análisis básicos estadísticos epidemiológicos, entre otros. Estas funcionalidades permiten crear mapas de distribución, densidad de casos y asociados a otros indicadores eco-epidemiológicos, mapas de riesgo por enfermedad, delimitación y cálculo de áreas críticas, así como realizar análisis demográficos y de mortalidad, análisis de la cobertura y atención en salud grupos sociales, control y vigilancia de enfermedades tropicales, análisis estadísticos de datos, entre otros. (Castillo-Salgado, 1996). La utilización de un SIG tiene como objetivo la representación virtual o modelación de una realidad geográfica, involucrando diversa información espacial y temporal con el fin de analizar un proceso geográfico determinado (Figura 1). Con el fin de cumplir con ese objetivo, es necesario capturar esa realidad en forma de datos, los cuales usando las herramientas del SIG, nos permitan representar 1 2

Traducción al español realizada por el autor Traducción al español realizada por el autor

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virtualmente esa realidad lo más exacta posible. Es así como los datos en un SIG son recolectados como entidades geográficas, las cuales cuentan con un mismo elemento geométrico. Estas entidades son agrupadas en una capa en clases o categorías y representan las capas temáticas o Layers que pueden ser desplegadas en el SIG.

Figura 9.1. Deslizamiento en un sector del Suroeste antioqueño. El proceso de movimiento ocurrido en el 2006 se reconstruye usando el programa ArcGIS 9,2 mediante la combinación de datos provenientes de cuatro capas (Layers): Cartografía, Hidrología, Geomorfología e infraestructura. Imagen tomada de Zuleta, 2008.

Estas representaciones “abstractas” del mundo real, pueden ser capturadas usando diferentes tipos de formato de datos: vectorial aplicando formas geométricas, en forma de imágenes o raster, representado como una trama de puntos, o en forma de tablas, las cuales pueden contener información descriptiva o de atributo no espacial de objetos.

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Las ventajas o desventajas en el uso de los diferentes formatos de datos varían según el objetivo del estudio, pero se observa una tendencia a usar más datos vectoriales debido a que este tipo de formato permite ejecutar más procesos de análisis, como sobre-posición de mapas, unión, relación de datos, algebra de mapas, buffer, entre otros. Además los datos guardados en la estructura vectorial, ocupan menos espacio. Sin embargo, el trabajo con los datos tipo raster, como son por ejemplo los Ortofotomapas, imágenes satelitales, imágenes Lidar, entre otros, permite obtener una mayor precisión y resolución de la información. Además de que combinan datos provenientes de sensores remotos y de la fotogrametría, disciplinas que son actualmente una importante fuente de datos espaciales para los SIG. Los datos en un SIG, pueden ser almacenados en una Base de Datos, que por lo general es integrada a un programa SIG para ser usada en los procesos de análisis. Sin embargo, a medida que programas de Sistemas de Gestión de Bases de datos (SGBD), en inglés database management system (DBM), han ido desarrollando una mejor interfaz con las diversas aplicaciones de análisis SIG, se ha logrado generar una mayor independencia entre los diversos Sistemas de Bases de datos y los programas SIG. Es así como, grandes volúmenes de datos estructurados en aplicaciones de SGBD, como Oracle, PostgresSQL, MySQL, MAccess, MSQL Server, Open Access, entre otros, se encuentran hoy en día disponibles y accesibles de manera fácil y oportuna en el mercado. Adicionalmente los datos organizados en SGBD pueden ser procesados con herramientas de análisis de un SIG de manera rápida, en tanto se encuentran georreferenciados y/o geocodificados y sus formatos sean compatibles con la herramienta SIG.

Los SIG brindan herramientas que permiten procesar y analizar los datos contenidos en un proyecto SIG, algunas de estas funciones básicas son por ejemplo: funciones de captura (fuentes de datos), funciones de organización y almacenamiento de datos, funciones de gestión y manipulación de los datos (selección bajo criterios definidos, búsqueda, relación, unión intersección, sobreposición) funciones de transformación geometría y análisis (transformaciones geométricas y de coordenadas, proyecciones, buffer, análisis de superficie de terreno, métodos estadísticos, entre otras) y funciones de presentación y salida de datos (impresión de mapas, tablas, figuras, visualización en pantalla, entre otras). Además, dentro de sus herramientas de trabajo, los SIG permiten la aplicación de métodos de análisis estadístico y espacial, así como la implementación de metodologías interdisciplinares.

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Es importante recalcar, que el uso de los SIG, no desplaza la formación geográfica ni el quehacer del investigador, todo lo contrario, los SIG deben ser vistos como una herramienta que facilita la ejecución de determinados procesos de análisis. Dependiendo de la aplicación SIG que se emplee, es posible, sin necesidad de contar con un profundo conocimiento en programación realizar tareas de automatización de procesos. Un ejemplo es la herramienta Model Builder, que encontramos en el programa ArcGIS (ESRI). El Model Builder permite que el usuario genere su propio modelo de trabajo en el proceso de análisis de datos, que se ve como un diagrama de flujo de procedimientos, lo que realiza combinando herramientas de procesamiento y análisis de datos. El modelo de flujo de procedimientos construido se ejecuta automáticamente y puede ser guardado en la caja de herramientas del usuario para futuras tareas.

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Figura 9.2. Descripción del proceso básico de trabajo con una aplicación SIG

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AGRADECIMIENTOS

A la agencia Española de Cooperación Internacional (AECI) por la financiación del programa de control de Leishmaniasis de la OMS. A la Organización Mundial de la Salud (OMS), especialmente al Dr. Jorge Alvar director del programa de Leishmaniasis por su permanente apoyo y liderazgo para el control de la Leishmaniasis en América y el mundo. A la Organización Panamerica de la Salud (OPS) por su apoyo, motivación y gestión local que permitieron realizar el presente programa de fortalecimiento para el control de la Leishmaniasis. A la Universidad de Antioquia y a todo el personal del PECET.

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CAPITULO 8 Alvar JE. 2001. Las Leishmaniasis: de la Biología al Control. 2ª ed. Salamanca: Laboratorios Intervet. 200p. Ciaramella P, Oliva G, DeLuna R et al. A retrospective clinical study of canine leishmaniasis in 150 dogs naturally infected by Leishmania infantum. The Veterinary Record 1997; 141: 53943. Dantas-Torres F. Leishmune vaccine: The newest tool for prevention and control of canine visceral leishmaniosis and its potential as a transmission-blocking vaccine. Veeterinary Parasitology 2006; 141:18. Enserink M. Has leishmaniasis become endemic in the US? Science. 2000;290:1881-3. Killick-Kendrick R, Killick-Kendrick M, Focheux MC, Dereure J, Puech MP, Cadiergues MC. Protection of dogs from bites of phlebotomine sand? ies by deltamethrin collars for control of canine leishmaniasis. Med. Vet. Entomol. 1997;11:105-11. Lemesre JL, Holzmuller P, Gonçalves RB, Bourdoiseau G, Hugnet C, Cavaleyra M, Papierok G. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: Double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine 2007; 25(21):422334 Moreira MA, Luvizotto MC, Garcia JF et al. Comparison of parasitological, immunological and molecular methods for the diagnosis of leishmaniasis in dogs with different clinical signs. Veterinary Parasitology 2007; 145: 24552. Otranto D, Paradies P, Sasanelli M, Spinelli R, Brandonisio R. 2004. Rapid inmunochromatographic test for serodiagnosis of canine leishmaniasis. J Clin Microbiol 42(6):2769-2770. Otranto D, Paradies P, Sasanelli M, Leone N, Caprariis D, Chirico J, Spinelli R, Capelli G, Bradonisio O. 2005. Recombinant K39 dipstick immunochromatographic test: a new tool for the serodiagnosis of canine leishmaniasis. J Vet Diagn Invest 17:32-37.

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Otranto D, Paradies P, Paolo R, Latrofa M. 2007. Efficacy of a combination of 10% imidacloprid / 50% permethrin for the prevention of leishmaniasis in kenneled dogs in an endemic area. Science Direct Ve. Parasitology 144:270-278. Petersen CA. Leishmaniasis, an emerging disease found in companion animals in the nited States. Top Companion Anim Med. 2009;24(4):182-8. Quinnell RJ, Courtenay O, Shaw MA et al. Tissue cytokine responses in canine visceral leishmaniasis. The Journal of Infectious Diseases 2001; 183: 14214. Saridomichelakis MN. Advances in the pathogenesis of canine leishmaniosis: epidemiologic and diagnostic implications. Vet Dermatol. 2009;20(5-6):471-89. Taverne J. US sandflies and leishmaniasis on the web. Parasitol Today 2000;16:371-2.

CAPITULO 9 Albert, D.; Gesler, W.& Levergood B. Spatial analyst, GIS and remote Sensing applications in the Health Sciences. Sleeping Bear Press, Michigan, 2000. Bartelme, N. Geoinformatik: Modelle, Strukturen, funktionen.Springer Verlag, Berlin, 1995. Bill & Fritsch. Grundlage der Geo-Informationssysteme. 2th Edition. Band 1. Hardware, Software und Daten. Wichmann, Karlsruhe. 1994. Buhman/Bachhuber/Schaller. ArcView: Gis Arbeitsbuch. Wichmann, Heidelberg, 1996. Cromley, E. & McLafferty, S. GIS and Public Health. The Gilford Press. New York. 2002. Fernández, A. Vicenç. Desarrollo de los Sistemas de Información: una metodología basada en el modelado. Edicions de la Universitat Politécnica de Catalunya UPC, SL, Barcelona, 2006. Laudon, K. &Laudon, J. Management Information Systems. Edition. Pearson Prentice Hall, 2006. Salgado-Castillo, C. Uso de Sistemas de Información Geográfica en Epidemiología (SIG Epi). Boletín Epidemiológico-OPS. Vól. 17. No. 1. OPS, 1996. Zuleta, M. Naturrisikoanalyse unter Anwendung von GIS in der kolumbiani-schen Raumordnungsplanung POT am Beispiel der Gemeinde Jerico (Antioquia). Dart Europe ETheses-Portal. Düsseldorf. 2007.

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ANEXO 1

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1. DEFINICIÓN 1.1 OBJETIVO Garantizar que la atención a los usuarios del consultorio del (nombre del laboratorio) __________________________________________________________________________ se haga de manera oportuna y de acuerdo con los criterios de eficiencia, eficacia y efectividad. 1.2 ALCANCE El procedimiento abarca desde el momento en que el paciente consulta por primera vez hasta los controles post-tratamiento. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica 3. RESPONSABILIDAD Médico, Bacteriólogo o Microbiólogo y Bioanalista 4. GLOSARIO Y SIGLAS Antecedentes epidemiológicos: Haber vivido o visitado una zona endémica para leishmaniosis.

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Ac: Anticuerpos. Cicatrización: Proceso de curación de una herida o lesión que da por resultado la formación de una cicatriz. Código UA (o las siglas de la institución): un nuevo caso de leishmaniosis confirmado parasitológicamente captado por el (nombre del laboratorio)_______________________________ ______________________________________________________________________________ Código W: un caso sospechoso de leishmaniosis captado por el (nombre del laboratorio)_____________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ Efectividad: Medida del impacto de la gestión, tanto en el logro de los resultados planificados, como en el manejo de los recursos utilizados y disponibles. Eficacia: Grado en que se realizan las actividades planificadas y se alcanzan los objetivos. Eficiencia: Relación entre el resultado alcanzado y los recursos utilizados Evento Adverso: Hallazgo no deseable asociado al contacto o la exposición al medicamento. h.: Horas. IDx de leishmaniosis: Impresión diagnóstica

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Induración: Endurecimiento de los tejidos de un órgano. PIE: Prueba inmunológica de embarazo. Prueba de Montenegro: Prueba inmunológica, la cual informa el contacto con el parásito de Leishmania spp en cualquier época de la vida. De valor epidemiológico. Ulceración: Proceso de necrosis con formación de una úlcera. Ulcera. 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES Este procedimiento es realizado a todos los pacientes que llegan al área asistencial con una lesión que genere la sospecha de leishmaniosis. Todas las pruebas realizadas y los tratamientos suministrados se basan en los lineamientos de la Organización Mundial de la Salud. 5.2 DESCRIPCIÓN 5.2.1 Principio del método No aplica 5.2.2 Rango de trabajo No aplica

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5.2.3 Condiciones generales 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Equipos Cámara fotográfica Equipo de órganos de los sentidos Fonendoscopio Pesa Tensiómetro Materiales Baja lenguas Espéculo nasal Linterna Medicamentos Antimoniato de Meglumina Miltefosina Elementos de protección Bata de laboratorio Guantes

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5.2.5 Puntos de Control Todo paciente a quien se le realice procedimientos en la consulta o a quien se le inicie tratamiento para leishmaniosis debe dar su consentimiento firmado de manera escrita. Esto se logra con el diligenciamiento del Formato de Consentimiento informado (Anexo 2); el cual deberá ser firmado con documento de identidad, y en presencia de un testigo. Para efectos legales el Médico, el Bacteriólogo o el Microbiólogo que atienda la consulta podrá servir como garante y deberá firmar también con documento de identidad. 5.2.6 Desarrollo del método 5.2.6.1 Recepción del paciente El usuario lleva a la consulta del (nombre del laboratorio)_______________________________ ______________________________________________________________________________ una IDx de leishmaniosis, bien sea para confirmación del diagnóstico o para iniciar tratamiento. El usuario solicita la cita al personal del laboratorio, la cual es asignada según disponibilidad y se registra en la Agenda Asignación de Citas a Pacientes. El día de la cita el usuario es recibido en la recepción del área asistencial por parte de personal de la IPS Universitaria, quien toma unos datos iniciales al paciente (nombre, fecha de nacimiento, documento de identidad, dirección y teléfono) y los ingresa a la base de datos general de la IPS. Posteriormente informa al profesional del laboratorio (Médico, Bacteriólogo o Microbiólogo) para que realice la atención.

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5.2.6.2 Consulta inicial Una vez el médico está en capacidad de atender al paciente, lo hace pasar al consultorio, le explica al usuario los procedimientos contemplados en el Formato de consentimiento informado (Anexo 2) y una vez se verifique su total comprensión, se le solicita al paciente que lo firme. Cuando el paciente no llega para consulta, sino que solo requiere la toma de la muestra, es atendido directamente por un bacteriólogo Microbiólogo. El consentimiento informado es archivado en la carpeta marcada para tal fin, en orden cronológico de atención de pacientes y allí deberá permanecer a menos que sea solicitado por la autoridad competente, o en el caso de ser confirmado el caso sospechoso de leishmaniosis se debe anexar a la historia clínica del paciente y será tratado como parte integral de la misma. 5.2.6.3 Toma de datos El profesional del laboratorio que atiende al usuario registra los siguientes datos en el Cuaderno de Atención de Pacientes: ? Código W ? Fecha ? Nombre completo ? Fecha de nacimiento, edad, ocupación, teléfono y dirección ? Afiliación al sistema de salud. ? Nombre, Cédula y teléfono del acompañante (obligatorio si es menor de edad) ? Antecedentes: Si ha sufrido leishmaniosis anteriormente, fecha aproximada de aparición de

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la lesión y regiones geográficas visitadas al menos en los últimos tres meses antes su aparición. ? Características y número de lesiones: nódulos, placas o ulceras de bordes indurados, si es o no dolorosa al tacto, si está sobre infectada, entre otras. Presencia o no de adenopatías y de compromiso mucoso. ? Tratamiento previo recibido. 5.2.6.4 Pruebas diagnósticas A los pacientes que no tienen antecedentes de leishmaniosis se les realiza la Prueba de Montenegro (Ver POE Prueba cutánea de Montenegro Anexo 3) para orientar o descartar la impresión diagnostica. Este procedimiento es efectuado por el mismo médico o por el bacteriólogo o microbiologo y bioanalista encargado, y se cita al paciente para la lectura de la prueba en 48h a 72 horas. En la visita de las 48h a 72 horas, se procede a la lectura de la Prueba (Ver POE Prueba Cutánea de Montenegro Anexo 3). Si la prueba es negativa, a juicio del médico especialista, se le toman al paciente muestras para exámenes de diagnóstico parasitológico de Leishmania, o se remite el paciente al servicio respectivo según la sospecha diagnóstica, o al médico que inicialmente hizo la ínter consulta y se deja registro de la entrega del resultado negativo al paciente en la carpeta Resultados Negativos.

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Si la prueba es positiva se toman muestras para examen Directo (Ver POE Directo para Leishmania spp (Anexo 4) y cultivo para Leishmania spp (Ver POE Toma de muestra por aspirado del borde de la lesión (Anexo 5), se procesan las muestras para obtener los resultados y se solicita al paciente averiguar el resultado del Examen Directo en 24h. El resultado puede ser entregado (según autorización del paciente en la hoja de consentimiento informado) telefónicamente, por fax, e-mail o por escrito por el Bacteriólogo o Microbiólogo del consultorio. Si la Prueba de Montenegro es positiva y el Examen Directo negativo se cita al paciente para la toma de nuevas muestras; de obtenerse tres muestras negativas, se informa este resultado al paciente y se sigue el mismo procedimiento que cuando es negativa la prueba cutánea. Si tenemos una Prueba de Montenegro positiva y observamos compromiso mucoso, se toma muestra de sangre para obtención de suero a fin de realizar Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) para Ac de Leishmania spp (ver POE Inmunofluorescencia indirecta para detectar anticuerpos anti-Leishmania spp Anexo 6). Sí la Prueba de Montenegro y el Examen Directo o el cultivo son POSITIVOS se procede de la siguiente manera: ? Se le asigna un código UA ? Se llena la historia clínica. (ver Instructivo Diligenciamiento y administración de la Historia Clínica Anexos 7 y 8). ? Se ordena al paciente pruebas de función hepática (TGO y TGP), renal (creatinina), pancreática (amilasa) y electrocardiograma (este último para pacientes mayores de 50 años). Estos resultados debe tenerlos previo al inicio del tratamiento. En mujeres en edad fértil y con vida sexual activa se les solicitara además una PIE. Al usuario se le informa que debe solicitar una nueva cita una vez tenga el resultado de estos exámenes.

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5.2.6.5 Revisión de exámenes e inicio de tratamiento En el consultorio del (nombre del laboratorio)__________________________________________ ______________________________________________________________________________ solo se hace tratamiento a pacientes con diagnóstico de leishmaniosis cutánea o leishmaniosis mucosa no complicada. En caso de sospecha de leishmaniosis visceral se remite al paciente a un segundo nivel de atención donde será manejado con el apoyo del (nombre del laboratorio) ______________________________________________________________________________ El médico revisa el resultado de los exámenes de laboratorio y define la seguridad del uso del tratamiento en cada paciente en particular. El paciente con pruebas de función hepática y/o renal alteradas será evaluado por el medico especialista para decidir el manejo terapéutico. Esquemas de tratamiento: ? Tratamiento con Antimoniato de Meglumina: Para los pacientes en quienes el médico considere que es seguro usar tratamiento sistémico, se inicia tratamiento con Antimoniato de Meglumina en dosis de 20 mg/Kg/día por 20 días para leishmaniosis cutánea y 28 días para leishmaniosis mucosa. Se entregan al paciente (previa revisión de la fecha de vencimiento) las ampollas correspondientes a 8, 9 o 10 días de tratamiento y se le asigna la cita correspondiente dependiendo de la facilidad del paciente en regresar al control. Esto se registra en la historia clínica del paciente. En la visita de los 8 a 10 días, el paciente devuelve las ampollas vacías del medicamento aplicado, el Médico realiza una evaluación clínica de seguimiento y eventos adversos del medicamento y entrega medicamento para finalizar tratamiento, se asigna cita para seguimiento para el día 20 o 28 (control fin de tratamiento) según el caso. Esto se registra en la historia clínica del paciente.

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? Tratamiento con miltefosina: Si el tratamiento de elección es miltefosina, se administran 2.5 mg/kg/día durante 28 días, se entrega (previa revisión de la fecha de vencimiento) al paciente las dosis correspondientes a 14 días de tratamiento y se le asigna la cita correspondiente al dia 14. En esta cita el Médico realiza una evaluación clínica de seguimiento y eventos adversos del medicamento y entrega medicamento para finalizar tratamiento, se asigna cita para seguimiento para el día 28 (control fin de tratamiento). Esto se registra en la historia clínica del paciente. 5.2.6.6 Controles pos tratamiento Una vez el paciente termina tratamiento y hay mejoría clínica de las lesiones se hace control por el médico a los 45, 90, y 180 días, evaluando respuesta al tratamiento según induración, ulceración, cicatrización, aparición de lesiones mucosas. En el último control de no encontrar hallazgos anormales y el paciente cicatriza, se termina la evaluación, se dan recomendaciones y signos de alarma y se da de alta al paciente del servicio. Sí al mes y medio no hay cicatrización o hay un aumento del tamaño de la lesión, se procede de la siguiente manera: Se toma muestra de raspado de la lesión para examen directo (Ver POE Directo para Leishmania spp Anexo 4) y aspirado para cultivo (Ver POE Toma de muestra por aspirado del borde de la lesión Anexo 5). Si los resultados son positivos se inicia de nuevo el tratamiento (igual esquema) y se procede de la misma manera. Si luego de dos esquemas de tratamiento con Antimoniato de Meglumina no hay curación se buscan diferentes alternativas terapéuticas, de forma individual para cada paciente, entre ellas: Pentamidina (4 mg/kg/interdia/4 días), termoterapia, crioterapia, otros.

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Si los resultados son negativos se toma nuevamente la muestra El paciente con pruebas de función hepática y/o renal alteradas será evaluado por el médico especialista para decidir el manejo terapéutico 5.2.6.6.1 Posibles Eventos adversos para el Usuario Para el tratamiento con Miltefosina: ? Malestar gastrointestinal pasajero ? Vómito ? Diarrea y aumento de enzimas hepáticas y creatinina en suero. Estos efectos suelen ser de leves a moderados y pasajeros o reversibles al final del tratamiento. Para el tratamiento con Antimoniato de Meglunina ? Fiebre ? Mialgias ? Artralgias ? Cefalea ? Otros: Miocarditis, Hepatitis, Nefritis 5.2.6.6.2 Manejo de Eventos adversos El efecto negativo o positivo de alguno de los tratamientos se registra en la historia clínica del paciente.

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En caso de presentarse eventos adversos serios con la administración de algún tipo de medicamento el paciente se remite a una institución hospitalaria con copia de la historia clínica. 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? Protocolo Vigilancia Epidemiológica de Leishmaniasis. DSSA. ? Angulo VM y col. Leishmaniosis, Chagas y Malaria. Guías de práctica clínica basadas en la evidencia. Publicación ISS-Ascofame. 1998. ? Arango P y col. Guía integral de manejo de las enfermedades transmitidas por vectores. Ministerio de Salud, 1996. ? COLOMBIA, MEDELLÍN. PECET, UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA, EJÉRCITO NACIONAL DIRECCIÓN DE SANIDAD. Enfermedades Tropicales, Guía de manejo de ETV y accidente ofídico. Primera edición. Medellín. 2005. p 17-53. ? COLOMBIA, MINISTERIO DE SALUD. DIRECCIÓN GENERAL DE PROMOCIÓN Y PREVENCIÓN. Guía de Atención de la Leishmaniosis, 2005. ? Garcés ED, Vélez ID. Programa Control de la leishmaniosis Manual de Normas TécnicoAdministrativas, 1993. Servicio Seccional de Salud de Cundinamarca 27 p ? Nichols RS y col. Leishmaniasis. Plan Nacional de Control. Manual de normas técnicoadministrativas. Ministerio de Salud. 1994 ? Vélez I, Agudelo S. Manual de procedimientos para el diagnóstico de leishmaniosis cutánea americana. Ed Universidad de Antioquia. 1996. 7. LISTA DE REGISTROS Agenda de asignación de citas.Cuaderno de Atención de Pacientes. Formato Historia Clínica.

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Formato Consentimiento Informado. Formato de reporte de resultado. 8. ANEXOS No aplica.

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ANEXO 2

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CONSENTIMIENTO INFORMANDO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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Página

POR FAVOR LEA ESTE ESCRITO Y REALICE TODAS LAS PREGUNTAS QUE SE LE OCURRAN ANTES DE FIRMARLO. Yo (nombre) ___________________________________________ de _______ años de edad, doy mi autorización al (nombre institución)_______________________________________________ ______________________________________________________________________________ para la realización de las actividades y procedimientos enumerados a continuación con el fin de aclarar el diagnóstico probable de leishmaniosis y administrar, en caso que sea positivo, el tratamiento para esta enfermedad. 1. Toma, procesamiento y lectura de las pruebas de laboratorio que los profesionales de la salud

consideren necesarias para esclarecer el diagnóstico y que pueden incluir: toma de muestras de lesiones para la realización de directos, cultivos o biopsia, muestra de sangre para la realización de pruebas inmunológicas y pruebas intradérmicas. 2. Apertura de la Historia Clínica: los registros obtenidos serán manejados respetando su

confidencialidad y de acuerdo a las normas de Buenas Prácticas clínicas. Administración de Tratamiento: El (nombre laboratorio)_________________________________ ______________________________________________________________________________ suministrará, si cuenta con el, el medicamento específico para el tratamiento de la leishmaniosis y explicará su dosificación y las indicaciones sobre conducta a seguir en caso de presentarse reacciones adversas al mismo. Los medicamentos 1. empleados para su tratamiento los distribuye gratuitamente el Ministerio de la Protección Social de Colombia.

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CONSENTIMIENTO INFORMANDO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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2. Controles clínicos antes, durante y después de terminado el tratamiento, al menos durante los 180 días posteriores a su finalización. 3. Realización de investigación y docencia con el caso. Si los resultados de este estudio son publicados, usted no será identificado por el nombre.

Así mismo como paciente me comprometo a realizar las siguientes actividades bajo la indicación dada en el consultorio: 1. Asistir a los controles durante el tratamiento y posteriores, de acuerdo a las citas que me sean dadas. 2. Realizar los exámenes de laboratorio que el (nombre laboratorio) _______________________ ____________________________ no realice y que el Medico considere necesarios para la administración y/o seguimiento del tratamiento. 3. Aplicarme el medicamento y seguir las indicaciones dadas por el personal del consultorio, en las dosis indicadas y durante el tiempo indicado. 4. Informar personalmente o telefónicamente de forma pronta y oportuna cualquier cambio en mi condición clínica durante el tratamiento. 5. Devolver las ampollas vacías del medicamento que me sea entregado para tratarme. 6. Doy permiso para que el (nombre laboratorio) _______________________________________

_____________________________Realice otras pruebas de laboratorio que estime convenientes con las muestras que me tomaron. 1. Autorizo para que la entrega del resultado de mis pruebas se haga telefónicamente, vía fax o email, en caso de ser necesario.

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CONSENTIMIENTO INFORMANDO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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En constancia de aceptación del presente informe de consentimiento (en caso que el paciente sea un menor de edad firma el acudiente) acepto entiendo y apruebo el anterior documento, soy conciente de la enfermedad y se me ha explicado de los efectos secundarios que puede tener el tratamiento. Por lo cual firmo de manera libre y sin presiones a los _____ del mes _____________ de 20_____ SU FIRMA (O HUELLA DIGITAL) INDICA QUE USTED ACEPTA VOLUNTARIAMENTE ESTOS PROCEDIMIENTOS HABIENDO LEIDO (O ESCUCHADO) LA INFORMACION ANTERIOR. Nombre del Paciente o acudiente: ___________________________________________________ CC.: _________________________________ Firma: ________________________________ Nombre del encargado laboratorio: _________________________ CC.: ____________________ Firma: ________________________________

Teléfono y Dirección del laboratorio:

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ANEXO 3

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PRUEBA CUTÁNEA DE MONTENEGRO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO Establecer si el paciente que consulta al consultorio del (nombre laboratorio) __________________________________________________________________________ estuvo en contacto con el parásito de Leishmania en cualquier época de la vida. 1.2 ALCANCE El protocolo abarca desde la aplicación del Ag hasta el reporte de resultado. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica 3. RESPONSABILIDAD Bacteriólogo, Microbiólogo y Bioanalista ó Médico 4. GLOSARIO Y SIGLAS Ag: Antígeno.

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PRUEBA CUTÁNEA DE MONTENEGRO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código: P-DX-0006

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Células T Activadas: Linfocito T que ha reconocido el Ag y que inicia un proceso de proliferación y adquisición de sus capacidades efectoras. 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES Es una reacción de hipersensibilidad retardada y se realiza en todo paciente con sospecha clínica como primer paso para el diagnóstico de leishmaniasis. La prueba de Montenegro es una prueba no diagnóstica, pero muy útil como ayuda para el diagnóstico de leishmaniosis y en la elaboración de encuestas Epidemiológicas. La prueba mide la respuesta de inmunidad celular que se presenta en un paciente al aplicar el Ag de Leishmania. La vía de administración es intradérmica y su lectura ocurre entre las 48 y 72 horas. 5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método La Prueba de Montenegro evalúa la respuesta mediada por células T activadas al reconocer Ags de Leishmania. 5.2.2 Rango de trabajo Se considera positiva la prueba que arroje un resultado mayor de 5 mm a las 48 - 72 horas. Lugar de trabajo: Consultorio y áreas de trabajo de campo.

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PRUEBA CUTÁNEA DE MONTENEGRO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código: P-DX-0006

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5.2.3 Condiciones generales Deben tenerse presentes las precauciones universales para la manipulación de fluidos contaminados con material biológico y observar las normas para realizar un adecuado descarte de material contaminado. 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Equipos Nevera Reactivos y materiales Alcohol Antiséptico Antígeno de Montenegro Algodón Jeringa de 1 ml tipo tuberculina Lapicero o bolígrafo Metro Elementos de protección Bata de laboratorio Guantes 5.2.5 Puntos de control La prueba se lee entre 48 y 72 horas después de aplicado el Ag (preferiblemente a las 48 horas). Se considera positiva la reacción que mida 5 o más mm.

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PRUEBA CUTÁNEA DE MONTENEGRO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código: P-DX-0006

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5.2.6 Desarrollo del método El Bacteriólogo, Microbiólogo y Bioanalista ó Médico debe seguir los siguientes pasos: ? Limpiar con alcohol antiséptico la cara anterior del antebrazo izquierdo del paciente. ? Aplicar vía Intradérmica 0.1 ml de Ag de Montenegro. ? Leer la prueba entre 48 y 72 horas después de aplicado el Ag, utilizando la Técnica del

Bolígrafo que consiste en colocar perpendicularmente el bolígrafo sobre el plano de la piel, se deja deslizar suavemente el bolígrafo desde la periferia hacia el centro (lugar donde se aplicó la prueba), hasta donde se encuentra resistencia en los cuatro cuadrantes para delimitar el área de induración. ? Medir con el metro las distancias que separan los límites de la induración en mm y calcular el promedio de las dos distancias. ? Registrar el resultado de la prueba de Montenegro en la historia clínica (Anexo 8), aun cuando resultado sea negativo. 5.2.7 Cálculo y Reporte de resultados Para la emisión del resultado se promedian las distancias horizontal y vertical de la intradermorreacción y el tiempo de lectura, por ejemplo: Distancia 1: 7mm Distancia 2: 9 mm Promedio 7 + 9 / 2 = 8 mm Se reporta 8 mm/48 horas El resultado se reporta por el Bacteriólogo, Microbiólogo y Bioanalista o el Médico en el Formato reporte de resultados diagnósticos (Anexo 11).

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PRUEBA CUTÁNEA DE MONTENEGRO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código: P-DX-0006

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6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? Protocolo Vigilancia Epidemiológica de Leishmaniasis, DSSA. 2008. ? Vélez I, Agudelo S. Manual de procedimientos para el diagnóstico de leishmaniosis

cutánea americana. Ed. Universidad de Antioquia. 1996. ? Manual de Bioseguridad 7. LISTA DE REGISTROS Formato Historia Clínica (Anexo 8) Formato reporte de resultados diagnósticos (Anexo 11). 8. ANEXOS No aplica

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ANEXO 4

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TOMA, MANIPULACIÓN Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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1. DEFINICIÓN 1.1 OBJETIVO Establecer el procedimiento para una adecuada toma, recepción, manipulación y conservación de muestras para los ensayos realizados en el laboratorio ____________________________________ 1.2 ALCANCE Aplica a todas las muestras utilizadas para pruebas de diagnóstico o pertenecientes a sujetos participantes en investigación que lleguen al laboratorio__________________________________ 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica 3. RESPONSABILIDAD Bacteriólogo o Microbiólogo y bioanalista 4. GLOSARIO Y SIGLAS ºC: grados centígrados Tº: temperatura 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES Teniendo en cuenta la responsabilidad que tenemos en nuestro laboratorio de entregar resultados que

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DIRECTO PARA LEISHMANIA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

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sean precisos y confiables, es nuestra obligación considerar que el proceso analítico inicia con la preparación del paciente, continúa con la obtención y el manejo de la muestra en el laboratorio y finaliza con el reporte de un informe. 5.2 DESCRIPCIÓN 5.2.1 Directo para Leishmania 5.2.1.1 Condiciones del paciente No requiere condiciones especiales. 5.2.1.2 Identificación de la muestra La muestra será identificada usando lápiz vidriograf (la tinta de marcador se corre con la coloración) con el código W y la fecha. No se identificaran placas con el nombre del paciente. 5.2.1.3 Toma de muestra Ver POE Directo para Leishmania. 5.2.2.4 Recepción de muestra La información de la remisión se registra en el cuaderno de Atención a pacientes, indicando la fecha y hora de llegada al laboratorio. Se asigna el código W y se marca la placa con el código W y la fecha de toma de muestra. 5.2.1.5 Conservación de la muestra Las placas se almacenan en cajas de colección a Tº ambiente. 5.2.1.6 Transporte de muestra Las placas se transportan protegidas de la humedad y en recipiente de paredes duras que evite que se quiebren.

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DIRECTO PARA LEISHMANIA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

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Para el envío de placas para control ínter laboratorio se tienen en cuenta las indicaciones dadas en el Manual de control de calidad interno y externo. 5.2.1.7 Almacenamiento Las muestras se almacenan en cajas de colección por 2 años, protegidas de la humedad, en el área de microscopia del laboratorio de Ensayos Biológicos e Inmunología. 5.2.1.8 Descarte Las placas se descartan en el guardián de seguridad. 5.2.2 Cultivo para Leishmania 5.2.2.1 Condiciones del paciente No requiere condiciones especiales. 5.2.2.2 Identificación de la muestra La muestra será identificada con el código W y la fecha. No se identificaran tubos con el nombre del paciente. 5.2.2.3 Toma de muestra De acuerdo al POE Toma de muestra por aspirado del borde de la lesión y se siembra en tubos de cultivo con medio NNN normal. 5.2.2.4 Recepción de muestra La información de la remisión se registra en el cuaderno de Atención a pacientes, indicando la fecha y hora de llegada al laboratorio. Se asigna el código W y se marca el tubo con el código W y la fecha de toma de muestra. 5.2.2.5 Conservación de la muestra Los tubos con el medio NNN y con la Fase antes de la siembra se conservan a 4ºC. Una vez tomada la muestra se conservan a Tº ambiente.

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5.2.2.6 Transporte de muestra Los tubos se transportan a Tº ambiente en recipiente de paredes duras que evite que se quiebren. Deben llegar al laboratorio en el menor tiempo posible para evitar contaminación. 5.2.2.7 Almacenamiento Las cepas aisladas se almacenan en los tanques de nitrógeno ubicados en el cuarto de equipos grandes. Ver POE Criopreservación de Leishmania spp. 5.2.2.8 Descarte Los cultivos se disponen en el recipiente de descarte de material ubicado en el cuarto de cultivos, para ser llevado posteriormente por el encargado al cuarto de esterilización del 6º Piso. 5.2.3 Muestras de suero para pruebas inmunológicas 5.2.3.1 Condiciones del paciente No requiere condiciones especiales. 5.2.3.2 Identificación de la muestra La muestra será identificada con el código W y la fecha. No se identificaran tubos con el nombre del paciente. 5.2.3.3 Toma de muestra De acuerdo al POE Toma de muestra de sangre en tubos secos (tapa roja) 5.2.3.4 Recepción de muestra La información de la remisión se registra en el cuaderno de Atención a pacientes, indicando la fecha y hora de llegada al laboratorio. Se asigna el código W y se marca el tubo con el código W y la fecha de toma de muestra. Las muestras deben ir en empaques como icopor u otros en los cuales se asegure la cadena de frio de la muestra, mediante el uso de hielo seco, gel refrigerante, etc.

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5.2.3.5 Conservación de la muestra Los sueros deben separarse en el menor tiempo posible. Las muestras de suero para pruebas inmunológicas se conservan refrigeradas (4ºC-8ºC) hasta por 7 días. Si van a ser analizadas después de este tiempo deben conservarse -20ºC. Para el envío de sueros para control ínter laboratorio se tienen en cuenta las indicaciones dadas en el Manual de control de calidad interno y externo. 5.2.3.6 Transporte de muestra Los tubos se transportan refrigerados (2 a 8ºC). 5.2.3.7 Almacenamiento Los sueros se almacenan en el congelador de banco de sueros, ubicado en el cuarto de equipos grandes, a -20º y se registra en el formato Banco de sueros. 5.2.3.8 Descarte Los tubos se disponen en el recipiente de descarte de material ubicado en el laboratorio de Ensayos biológicos e inmunología, para ser llevado posteriormente por el encargado al cuarto de esterilización del 6º Piso. 5.2.4 Muestras de suero para Química Sanguínea 5.2.4.1 Condiciones del paciente Ayuno por lo menos de 6 horas. La ingesta de bebidas alcohólicas la noche previa a la toma de una muestra de sangre puede determinar cambios en las concentraciones de ciertos analitos como la GOT y GPT. 5.2.4.2 Identificación de la muestra La muestra de suero que va a ser remitida para pruebas de química sanguínea debe ir identificada con el nombre del paciente, fecha, pruebas a realizar y (nombre del laboratorio). Debe ir acompañada de la respectiva orden de remisión.

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5.2.4.3 Toma de muestra Ver POE Toma de muestra de sangre. 5.2.4.4 Remisión de muestra La información de la remisión se registra en el cuaderno de remisión de pruebas de laboratorio, indicando la hora de envío, la Tº de la nevera y firma de quien recibe la muestra. 5.2.4.5 Conservación de la muestra Los sueros deben separarse en el menor tiempo posible. No deben enviarse muestras hemolizadas. La mayoría de las pruebas que requieren suero son estables hasta por 8 horas a 22ºC. Si la realización de la prueba va a tardar más de las 8 horas, se deben refrigerar (2 a 8ºC). 5.2.4.6 Transporte de muestra Los sueros se transportan refrigerados (2 a 8ºC). 5.2.4.7 Almacenamiento Se recomienda guardar reserva de las muestras remitidas, en refrigeración (2 a 8ºC), hasta recibir el resultado de la prueba, para aquellos casos en que se necesite hacer alguna verificación ó que ocurra algún accidente con la muestra. 5.2.4.8 Descarte Los tubos se disponen en el recipiente de descarte de material ubicado en el laboratorio de Ensayos biológicos e inmunología, para ser llevado posteriormente por el encargado al cuarto de esterilización. 5.2.5 Muestras de tejido 5.2.5.1 Condiciones del paciente No requiere condiciones especiales.

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5.2.5.2 Identificación de la muestra La muestra será identificada con el código W y la fecha. No se identificaran tubos con el nombre del paciente. 5.2.5.3 Toma de muestra Ver POE Toma de muestras de tejido. 5.2.3.4 Recepción de muestra La información de la remisión se registra en el cuaderno de Atención a pacientes, indicando la fecha y hora de llegada al laboratorio. Se asigna el código W y se marca el tubo con el código W y la fecha de toma de muestra. 5.2.5.5 Conservación de la muestra Las muestras de tejido para PCR se conservan congeladas (-20ºC) hasta su procesamiento. Las muestras de tejido para Biopsia se conservan a Tº ambiente hasta su envío al laboratorio de referencia. 5.2.5.6 Remisión de muestra La información de la remisión se registra en el cuaderno de remisión de pruebas de laboratorio, indicando la hora de envío y firma de quien recibe la muestra. 5.2.5.7 Transporte de muestra Los tubos se transportan en recipiente de paredes duras que evite que se quiebren. 5.2.5.9 Descarte Los tubos se disponen en el recipiente de descarte de material ubicado en el laboratorio de Ensayos biológicos e inmunología, para ser llevado posteriormente por el encargado al cuarto de esterilización.

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5.2.6 Muestras no Conformes El evento de una Muestra no Conforme se registra por el bacteriólogo en el cuaderno de Atención de pacientes al momento de recibir la muestra.

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6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? POE Directo para Leishmania spp. ? Manual de control de calidad interno y externo. ? POE Toma de muestra por aspirado del borde de la lesión . ? POE Criopreservación de Leishmania spp . ? POE Toma de muestra de sangre. ? POE Toma de muestras de tejido.

7. LISTA DE REGISTROS Cuaderno de Atención a pacientes. Cuaderno Remisión de pruebas de laboratorio. Cuaderno de Criobanco. Formato Banco de sueros. 8. ANEXOS No aplica.

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ANEXO 5

LOGO INSTITUCIÓN

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LOGO DEPENDENCIA

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1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO Establecer las actividades necesarias para realizar el diagnóstico de Leishmaniasis cutánea o mucocutánea a través del examen directo. 1.2 ALCANCE Abarca desde la toma de muestra del directo para Leishmania hasta el reporte del resultado. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica. 3. RESPONSABILIDAD Bacteriólogo o Microbiólogo y Bioanalista. 4. GLOSARIO Y SIGLAS Amastigote: Forma intracelular del parásito Leishmania. Promastigote: Forma extracelular del parásito Leishmania. Amastigote: Forma intracelular del parásito Leishmania. T°A: Temperatura ambiente. 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES Una adecuada toma de muestra permite demostrar la presencia de amastigotes spp en el material obtenido de la lesión del paciente. La toma de muestra se le debe realizar a todo paciente con lesión y

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datos epidemiológicos compatibles con leishmaniasis para realizar el diagnóstico y en todos los casos de reactivación de lesiones en pacientes ya tratados para constatar si se trata de una recaída. 5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método La coloración con Giemsa permite, en muestras biológicas, la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Leishmania). Los parásitos presentes en las lesiones (amastigotes de Leishmania spp) pueden ser observados al microscopio en alto poder (100X) y su observación se convierte en diagnóstico de la enfermedad. La sensibilidad de la prueba está considerada alrededor de un 90%. 5.2.2 Rango de trabajo La observación de formas amastigotas de Leishmania son diagnóstico de Leishmaniasis. 5.2.3 Condiciones generales Debe tenerse presente las precauciones universales para la manipulación de fluidos contaminados con material biológico (Ver Manual de Bioseguridad PECET M-R-0001). La toma de muestra implica bajo riesgo para el personal que toma la muestra en cuanto a transmisión de la enfermedad, dado que se considera que el parásito se transmite a través de la inoculación directa del promastigote por parte del vector y en la muestra del paciente encontramos presentes las formas de amastigotes. No se requieren condiciones especiales de temperatura ni humedad específicas para realizar esta prueba. 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Reactivos Alcohol antiséptico. Colorante de Giemsa. Solución salina.

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Materiales Gasa estéril. Hoja de bisturí No. 4 Láminas portaobjetos nuevas y limpias. Lápiz vidriograf. Mango de bisturi. Recipiente para transporte de muestras. Equipos Microscópio binocular com objetivo de 100X. Computador. Elementos de protección Bata de laboratorio. Guantes. 5.2.5 Puntos de control No aplica. 5.2.6 Desarrollo del método El paciente no requiere preparación previa. La muestra se puede tomar tanto del borde activo como del fondo de la úlcera. En caso de que el paciente presente varias lesiones, se selecciona la de menor tiempo de evolución y que presente los bordes más indurados. Si la úlcera presenta costra y se desea tomar una muestra del fondo, se debe debridar antes de proceder al raspado. El Bacteriólogo o Microbiólogo recibe al usuario en el área asistencial de la SIU (ver POE Atención de Pacientes) y debe realizar las siguientes actividades: ? Rotular las placas utilizando lápiz vidriograf con el Código W asignado al paciente y fecha. ? Con las manos enguantadas hacer limpieza de los bordes de la lesión utilizando gasa y alcohol

antiséptico.

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? Realizar hemostasia del lugar escogido para la toma de la muestra, esto se logra haciendo

pinza con los dedos índice y pulgar. ? Realizar una pequeña incisión con la hoja de bisturí de aproximadamente 3 mm de larga por 3

mm de profundidad en la parte central del borde activo que es paralelo al borde de la úlcera. ? Limpiar la gota de sangre que pueda salir con la incisión con gasa seca y estéril. ? Raspar los bordes de la incisión para obtener tejido con la punta del bisturí. ? Extender el material obtenido sobre la lámina, esparciéndolo con la misma hoja del bisturí

suavemente para evitar destrucción de los amastigotes. Realiza 3 extendidos por placa. ? Dejar secar las láminas a T°A. ? Trasladar las muestras, en un recipiente cerrado, hasta el área técnica en el laboratorio de

Inmunología. ? Colorear las placas con Giemsa. Ver Instructivo Coloración de placas con Giemsa. ? Observa al microscopio de luz con un aumento de 100X, en busca de los amastigotes que

pueden encontrarse intra o extra celulares. ? Registrar el resultado de la prueba en el cuaderno de Atención a pacientes y en la Historia

Clínica. ? Una vez leídas las placas, estas son almacenadas en cajas de colección para posterior control interno y externo de lectura de placas. 5.2.7 Cálculos y Reporte de resultados Siguiendo los lineamientos, el reporte de resultados es realizado por el bacteriólogo o microbiólogo en el Formato de reporte de resultados de la siguiente forma: Resultado Diagnóstico Positivo: Se observan formas amastigotas de Leishmania spp en la muestra examinada. Resultado Diagnóstico Negativo: No se observan formas amastigotas de Leishmania spp en la muestra examinada. 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? Protocolo Vigilancia Epidemiológica para Leishmaniasis. DSSA ? Vélez I, Agudelo S. Manual de procedimientos para el diagnóstico de leishmaniasis cutánea

americana. Ed Universidad de Antioquia. 1996. ? Instructivo Coloración de placas con Giemsa. ? POE Atención a Pacientes.

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7. LISTA DE REGISTROS Cuaderno de Atención a pacientes. Formato Historia Clínica. Formato de reporte de resultados. 8. ANEXOS No aplica.

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ANEXO 6

LOGO INSTITUCIÓN

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA DETECTAR ACS CONTRA LEISHMANIA SPP DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

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1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO Detectar en muestras de suero o plasma de pacientes, anticuerpos contra Leishmania spp. 1.2 ALCANCE El protocolo abarca desde la obtención de la muestra hasta el reporte de los resultados obtenidos. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica. 3. RESPONSABILIDAD Bacteriólogo o Microbiólogo y Bioanalista. 4. GLOSARIO Y SIGLAS Acs: anticuerpos. Ag: Antígeno. Ag-Ac: Antígeno-Anticuerpo. IFI: Inmunofluorescencia indirecta. LC: Leishmaniosis Cutánea. LCL: Leishmaniosis Cutánea localizada. LM: Leishmaniosis Mucosa. LV: Leishmaniosis Viseral. LUV: Luz Ultravioleta. FITC: Isotiacianto de Flouresceina.

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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA DETECTAR ANTICUERPOS ANTI-LEISHMANIA spp DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

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5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES La IFI es una técnica inmunológica que nos permite visualizar de una manera indirecta la unión AgAc. Esta técnica utiliza un anticuerpo secundario marcado con una sustancia fluorescente, el cual reaccionará de una manera específica con los Acs presentes en el suero del paciente que previamente se han unido a los Ags de Leishmania spp. Cuando el fluorocromo se expone a LUV emite fluorescencia que se visualiza por microscopía. 5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método La IFI permite detectar anticuerpos tipo IgG contra parásitos de Leishmania spp. 5.2.2 Rango de trabajo Se considera positivo un resultado mayor o igual de 1:32. 5.2.3 Condiciones generales Deben tenerse presentes las precauciones universales para la manipulación de fluidos contaminados con material biológico y observar las normas para realizar un adecuado descarte de material contaminado (ver Manual de Bioseguridad). 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Equipos Centrifuga. Congelador. Microscopio de fluorescencia. Micropipetas P10, P20, P100, P200, P1000. Nevera. Pipetas multicanales de 5-50ul. Propipeteador.

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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA DETECTAR ANTICUERPOS ANTI-LEISHMANIA spp DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

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Reactivos y materiales Agua destilada. Antígeno de Leishmania panamensis (Concentración de 6x106 promastigotes/ml). Azul de Evans al 1%. Conjugado anti igG humana marcada con FITC (SIGMA F- 4512). Formol al 4%. Glicerina tamponada con PBS pH8. PBS pH 7.2. Suero control positivo y negativo. Suero paciente. Beakers y Probetas. Cámara de Neubauer. Cámara húmeda (recipiente con tapa que permita conservar la humedad, por ejemplo caja plastica o metalica con servilleta de papel mojada en el fondo). Frascos para almacenar soluciones. Frascos para coloraciones que tienen divisiones para sostener las placas (Glass Staining Dishes. Fisherbran catalogo No 08-816). Gradillas para tubos cónicos de 15 y 50ml y viales de 1.5ml. Laminillas cubre objetos 22 x 50 mm. Micro platos de 96 pozos desechables para preparar diluciones del suero. Puntas para micro pipetas Azules y Amarillas. Placas para inmunofluorescencia (placas opacas con pozo transparente CEL-LINE). Servilletas. Timer. Tubos cónicos de 15 y 50ml. Viales de 1.5ml. Elementos de protección Guantes. Bata de laboratorio. 5.2.5 Puntos de control La dilución a la cual se utiliza el conjugado, debe ser estandarizada para cada laboratorio y para cada lote de conjugado.

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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA DETECTAR ANTICUERPOS ANTI-LEISHMANIA spp DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

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El microscopio de fluorescencia debe ser encendido 15 minutos antes de la lectura y se deben seguir estrictamente las instrucciones para su uso. 5.2.6 Desarrollo del método 5.2.6.1 Obtención del antígeno (promastigotes de Leishmania) ? Colectar parásitos en fase estacionaria temprana de crecimiento de un cultivo de

promastigotes de Leishmania Viannia panamensis (5to día de crecimiento), en medio NNN modificado, con menos de 10 subpases. ? Lavar los parásitos colectados 3 veces por centrifugación, con PBS pH 7.2 estéril y frío a 3000 rpm por 10 min cada lavado. ? Contar los parásitos antes del último lavado, y posterior al mismo resuspender en formol al 4% en proporción 1:1 (vol/vol). En estas condiciones los parásitos son almacenados a 4°C hasta su uso (máximo 2 meses). ? Preparar a una concentración final de 6x106 p/ml en PBS pH 7.2, frío y estéril en el momento en que los parásitos van a ser utilizados como fuente de antígenos para sensibilizar las placas para la IFI. 5.2.6.2 Preparación placas IFI Lavar las Lavar las placas para las IFI con hipoclorito a 5000 ppm y una solución jabonosa durante 15 min, frotar suavemente cada uno de los pozuelos de la placa, lavar con abundante agua corriente y dejar 1 hora en agua destilada. Secar las placas y guardar hasta su utilización, antes de lo cual son limpiadas cuidadosamente con alcohol. 5.2.6.3 Fijación del Antígeno (promastigotes de Leishmania ) a la placa de IFI ? Seleccionar las placas a utilizar y marcarlas con lápiz ? Depositar en cada pozo entre 15 y 20 ul del Ag previamente preparado a una concentración

de 6x106 p/ml. ? Poner las placas sensibilizadas en un lugar seguro a temperatura ambiente durante toda la noche. El número de placas que se sensibilicen dependerá de la cantidad de sueros a analizar.

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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA DETECTAR ANTICUERPOS ANTI-LEISHMANIA spp DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

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5.2.6.4 Reacción serológica ? Con el suero obtenido del paciente (ver POE Toma de Muestras de Sangre P-DX-0007) y los

sueros control, preparar diluciones seriadas desde 1:8 hasta 1:128 (utilizando los platos para las diluciones), con PBS pH 7.2 estéril ? Depositar entre 15 y 20 ul de la dilución de los sueros, en los pozos de las placas ya sensibilizadas con el Ag. ? Incubar durante 45 min a 37°C en cámara húmeda ? Lavar las placas dos veces con PBS pH 7.2 durante 5 min y luego 1 vez con agua destilada por 2 min. Utilizar para los lavados los frascos especiales para coloraciones. ? Dejar secar las placas en posición vertical, a temperatura ambiente protegidas del polvo y la luz. ? Preparar el conjugado anti igG humana marcada con FITC a una dilución de 1:100 en PBS pH 7.2, más el colorante de contraste (azul de Evans) también a una concentración de 1: 100 en el mismo volumen. ? Agregar a los pozos donde se esta haciendo la reacción serológica 22 ul del conjugado previamente preparado. ? Incubar a 37°C durante 45 min en cámara húmeda y oscuridad. ? Lavar las placas dos veces con PBS pH 7.2 durante 5 min y luego 1 vez con agua destilada por 2 min. Utilizar para los lavados los frascos especiales para coloraciones. ? Dejar secar las placas en posición vertical, a temperatura ambiente protegidas del polvo y la luz. ? BAJO CONDICIONES DE OSCURIDAD, depositar en las placas un poco de glicerol tamponado y cubrir con las laminillas correspondientes, para posteriormente proceder a lectura en el microscopio de fluorescencia. ? Leer en un microscopio de fluorescencia con lente de 40x. Observar la fluorescencia de los promastigotes y registrar en el Cuaderno de Resultados IFI, la ultima dilución hasta la cual la fluorescencia persiste. La fluorescencia es positiva cuando los parásitos toman un color verde y es negativa cuando se observan de color rojo marrón. 5.2.7 Cálculos y reporte de resultados La fluorescencia es positiva cuando los parásitos toman un color verde intenso que corresponde a la fluorescencia emitida por el FITC. La fluorescencia es negativa cuando no se observa fluorescencia verde y los parásitos toman un color rojo marrón. Se registra la última dilución hasta la cual la fluorescencia persiste.

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INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA DETECTAR ANTICUERPOS ANTI-LEISHMANIA spp DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

El reporte de resultados es realizado por el bacteriólogo o microbiólogo en el Formato de reporte de resultados (F-DX-0005) de la siguiente forma: Negativo: cuando la reactividad con los sueros corresponde a una dilución menor que 1:32 Positivo: cuando la reactividad con los sueros corresponde a una dilución mayor o igual a 1:32. 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA No aplica. 7. LISTA DE REGISTROS Cuaderno de resultados IFI. Formato Reporte de Resultados. 8. ANEXOS No aplica.

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ANEXO 7

LOGO INSTITUCIÓN

TOMA DE MUESTRA PARA ASPIRADO DEL BORDE DE LA LESIÓN DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO Aislar parásitos de Leishmania spp, inoculando material aspirado de las lesiones en medios de cultivo específico. 1.2 ALCANCE El procedimiento describe los pasos de la toma de muestra para cultivo de Leishmania spp. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica. 3. RESPONSABILIDAD Bacteriólogo, Microbiólogo y Bioanalista ó Médico. 4. GLOSARIO Y SIGLAS Acs: Anticuerpos Aspirado: Obtención de tejido y líquido tisular de las lesiones por medio de una jeringa. Cultivo: Siembra de la muestra tomada en un medio monofásico o bifásico, en condiciones de temperatura controladas, con el fin de evaluar si se presenta o no crecimiento del parásito. ELISA: Inmunoensayo ligado a enzimas. IF: Inmunofluorescencia. IFI: Inmunofluorescencia indirecta.

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TOMA DE MUESTRA POR ASPIRADO DEL BORDE DE LA LESIÓN DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

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Página

5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES El parásito cultivado, puede ser aislado y sirve como fuente de antígeno para pruebas inmunológicas como la Prueba de Montenegro, linfoproliferación, identificación de la especie del parásito, detección de Acs por ELISA o IFI, aislamiento e identificación de moléculas del parásito, entre otras. 5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método Los parásitos presentes en las lesiones pueden ser recuperados cultivándolos bajo condiciones ambientales controladas. 5.2.2 Rango de trabajo La observación de formas promastigotas de Leishmania spp son diagnóstico de Leishmaniosis. 5.2.3 Condiciones generales 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Equipos Nevera. Reactivos y materiales Gasa estéril. Alcohol antiséptico. PBS o suero fisiológico. Fase líquida suplementada con Penicilina G sódica 1000 U/ml . Jeringas de 1 ml (tipo tuberculina). Elementos de protección Bata de laboratorio. Guantes

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TOMA DE MUESTRA POR ASPIRADO DEL BORDE DE LA LESIÓN DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

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Página

.5.2.5 Puntos de control 5.2.6 Desarrollo del método El paciente no requiere preparación previa. La muestra se toma del borde activo de la úlcera. En caso de que el paciente presente varias lesiones, se selecciona la de menor tiempo de evolución y que presente los bordes más indurados. El Bacteriólogo o Microbiólogo recibe al usuario en el área asistencial (ver POE Atención de Pacientes) y debe realizar las siguientes actividades: ? Con las manos enguantadas hacer limpieza de los bordes de la lesión utilizando gasa y alcohol

antiséptico. ? Tomar en la jeringa de tuberculina 0,5 ml de fase estéril suplementada con penicilina G sódica

(1000 U/ml). ? Introducir la punta de la aguja en el borde de la lesión (paralelo al borde de la úlcera) y hacer movimientos rotatorios durante dos minutos aproximadamente con el fin de macerar el tejido con el bisel de la aguja y obtener linfa. ? Aspirar varias veces sin retirar la aguja y sin sacar el embolo totalmente a fin de permitir que el material liberado por la maceración penetre en la jeringa. ? Retirar lentamente la aguja cuando observe que el material (de color rojizo amarillento) se ha mezclado con la fase en la jeringa. ? Descartar todo el material utilizado siguiendo los lineamientos del Programa de Gestion Integral de Residuos. ? Trasladar las muestras, en un recipiente cerrado, hasta el área técnica en el laboratorio de inmunología. 5.2.7 Cálculo y Reporte de resultados No aplica. 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? Angulo VM y col. Leishmaniosis, Chagas y Malaria. Guías de práctica clínica basadas en la

evidencia. Publicación ISS-Ascofame. 1998. ? Arango P y col. Guía integral de manejo de las enfermedades transmitidas por vectores. Ministerio de Salud, 1996.

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TOMA DE MUESTRA POR ASPIRADO DEL BORDE DE LA LESIÓN DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

? COLOMBIA, MEDELLÍN. PECET, UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA, EJÉRCITO

NACIONAL DIRECCIÓN DE SANIDAD. Enfermedades Tropicales, Guía de manejo de ETV y accidente ofídico. Primera edición. Medellín. 2005. p 17-53. ? COLOMBIA, MINISTERIO DE SALUD. DIRECCIÓN GENERAL DE PROMOCIÓN Y PREVENCIÓN. Guía de Atención de la Leishmaniosis, 2005. ? Garcés ED, Vélez ID. Programa Control de la leishmaniosis Manual de Normas Técnicoadministrativas, 1993. Servicio Seccional de Salud de Cundinamarca 27 p. ? Nichols RS y col. Leishmaniasis. Plan Nacional de Control. Manual de normas técnicoadministrativas. Ministerio de Salud. 1994. ? Vélez I, Agudelo S. Manual de procedimientos para el diagnóstico de leishmaniosis cutánea americana. Ed Universidad de Antioquia. 1996. ? Ministerio de Salud. Manual de Conductas Básicas en Bioseguridad, Manejo Integral. Ed. Programa Nacional de Prevención y Control de ETS/VIH/SIDA. 1997 ? POE Preparación Solución de PBS (P-DX-0011) ? POE Preparación de la Fase Líquida (P-DX-0013) ? Plan de Gestión integral de residuos PGIR (M-R-0001) 7. LISTA DE REGISTROS No aplica. 8. ANEXOS No aplica.

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ANEXO 8

HISTORIA CLÍNICA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

LOGO INSTITUCIÓN

CÓDIGO PACIENTE:_________

Código Página

FECHA DE APERTURA:_______________________ I. IDENTIFICACION DEL PACIENTE Nombre:_______________________________________________________________________ Identificación: ________________ Ocupación: __________________ Estado Civil: ___________ Fecha de Nacimiento:_______________________ Edad: _______ Sexo: _______ Raza:_________ Lugar de residencia: _____________________________Teléfono residencia:_________________ Celular:_____________________Remitido por:________________________________________ Aseguradora en salud:______________________________Tipo de Vinculación: ______________ Nombre del acompañante: ___________________________ CC: _____________ Tel: __________ II. ENFERMEDAD ACTUAL # de Lesiones:____________ Tiempo de evolución: _____________________________________ En que lugar contrajo la enfermedad: _________________________________________________ Tto recibidos:___________________________________________________________________ Dosis: ______________________________ Duración Tto: ________________________________ III. ANTECEDENTES DE LEISHMANIOSIS Lesiones similares a la actual: ________________ Hace cuanto tiempo: ______________________ Tto antileishmania: _________ Cual:___________________Dosis: ________________________ Duración Tto: _____________ Evolución estado final de la lesión:__________________________ IV. ANTECEDENTES PERSONALES PATOLOGICOS Cardíacos: ___________ Hepáticos:____________Otros: ________________________________ Quirurgicos: _____________________________Alergicos: ______________________________ Embarazo actual SI: _____ NO: _____ FUM: ___________________

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HISTORIA CLÍNICA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

LOGO INSTITUCIÓN

CÓDIGO PACIENTE:_________

Código Página

V. EXAMEN FISICO Peso: ____________ Frecuencia Cardíaca:_______________Presión Arterial: ________________ Auscultación Cardiopulmonar:_____________________________________________________ Palpación Abdominal:____________________________________________________________ Mucosas nasal y oral:_____________________________________________________________ Cicatrices compatibles: _____________ Localización:___________________________________

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HISTORIA CLÍNICA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

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CÓDIGO PACIENTE:_________

Tipo: P = Pápula N = Nódulo U = Ulcera Descripción: C = Costra V = Verrucosa P = Purulenta

Código Página

M = Mucosa

F = Franca

167

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HISTORIA CLÍNICA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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CÓDIGO PACIENTE:_________

Código Página

Impresión diagnóstica: __________________________________________________________

168

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HISTORIA CLÍNICA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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CÓDIGO PACIENTE:_________

Código Página

EVALUACIÓN DE LESIONES

169

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HISTORIA CLÍNICA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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CÓDIGO PACIENTE:_________

Código Página

TRATAMIENTO

Medicamento: ______________________ Dosis: _________________ Lote: ______________ Fecha de vencimiento: __________________________________________________________ Fecha de Inicio de Tratamiento: __________________________________________________ Fecha Final de tratamiento:______________________________________________________

EFECTOS INDESEABLES Efectos Adversos

170

Fecha

Intensidad

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HISTORIA CLÍNICA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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CÓDIGO PACIENTE:_________

Código Página

SEGUIMIENTO Nombre paciente: _______________________________________________________________

171

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HISTORIA CLÍNICA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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CÓDIGO PACIENTE:_________

Código Página

SEGUIMIENTO Nombre paciente: _______________________________________________________________

172

ANEXO 9

DILIGENCIAMIENTO Y ADMINISTRACIÓN DE LA HISTORIA CLÍNICA LOGO DEPENDENCIA

LOGO INSTITUCIÓN PROCESO TRATAMIENTO DE LEISHMANIASIS

Código:

Versión:

Página

1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO Garantizar el funcionamiento de las historias clínicas de manera oportuna y acorde con los criterios de conservación, confidencialidad y custodia para fines asistenciales, legales, investigativos y administrativos. 1.2 ALCANCE Se describe todo el procedimiento para diligenciar y administrar adecuadamente las Historias Clínicas. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica. 3. RESPONSABILIDAD Médico, bacteriólogo o Microbiólogo. 4. GLOSARIO Y SIGLAS Caso sospechoso: Caso compatible clínicamente pero sin confirmación parasitológica. Caso confirmado: Caso compatible clínicamente y confirmado parasitológicamente. Código UA: Hace referencia a un nuevo caso de leishmaniosis confirmado parasitológicamente. Código W: Hace referencia a un caso sospechoso de leishmaniosis por confirmar. Distal: Lejano al eje longitudinal del cuerpo. Historia Clínica: Documento privado, obligatorio y sometido a reserva, en el cual se registran cronológicamente las condiciones de salud del paciente, los actos médicos y los demás procedimientos ejecutados por el equipo de salud que interviene en su atención. PIE: Prueba inmunológica de embarazo.

173

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DILIGENCIAMIENTO Y ADMINISTRACIÓN DE LA HISTORIA CLÍNICA PROCESO TRATAMIENTO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

Proximal: Cercano al eje longitudinal del cuerpo. SIVIGILA: Sistema de Vigilancia Epidemiológica para Colômbia. 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES La Historia Clínica es un documento de vital importancia para la prestación de los servicios atención en salud y para el desarrollo científico.

Es primordial que el manejo de las Historias Clínicas asegure la confidencialidad de la información y de los resultados de los pacientes durante todo el tiempo que permanezcan en el archivos. 5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Diligenciamiento de la Historia Clínica ? La historia clínica se debe llenar basado en la información médica, de forma clara y completa,

sin tachones o enmendaduras, con esfero de tinta negra, no se debe usar corrector, siguiendo los estándares internacionales de Buenas Practicas clínicas (GCP) ver documento TDR/ ser diagnosticado un paciente con Leishmaniosis Cutánea o Muco cutánea no complicada se le asigna un código UA inmediatamente, el cual complementa el código W asignado al paciente cuando se consideraba caso sospechoso, y se le inicia la Historia Clínica por parte del médico encargado del consultorio. En primer lugar se deben confirmar los datos de identificación del paciente (nombre, identificación, fecha de nacimiento, edad, sexo, raza, ocupación, estado civil, lugar de residencia, teléfono, nombre del acompañante con cédula y teléfono) y registrarlos en el formato. Paso siguiente se debe anotar en la Historia Clínica el número de lesiones, el tiempo de evolución de las mismas, en que lugar contrajo la enfermedad, tratamientos recibidos, dosis y duración del tratamiento así mismo se anotan los antecedentes de lesiones similares a la actual, ? hace cuanto se presentaron, tratamiento recibido, dosis, duración del tratamiento y la evolución estado final de la lesión. ? Se debe preguntar por antecedentes cardiacos, hepáticos, alérgicos, y demás que el médico encargado considere de importancia antes de iniciar el tratamiento antileishmania. A toda mujer en edad fértil y con vida sexual activa, si existen dudas por parte de la paciente o del examinador, se debe solicitar dentro de los paraclinicos una prueba inmunológica de

174

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Versión:

Página

embarazo (PIE). ? Se procede entonces a realizar y registrar en el formato un examen físico, que debe incluir:

Peso, frecuencia cardiaca, presión arterial, auscultación cardiopulmonar, palpación abdominal, descripción de presencia o no de lesiones en mucosa oral o nasal y de cicatrices compatibles. Si el paciente es de sexo femenino se debe registrar en este apartado si esta o no en embarazo como también la fecha de su última menstruación. Si es hombre se debe rellenar el campo con la frase “No aplica”. ? Posteriormente se debe llenar el cuadro descriptivo de las lesiones compatibles con leishmaniasis, se deben numerar (de 1 a 7) de proximal a distal, y de la de mayor diámetro a la de menor, se debe aclarar el tipo de lesión (pápula, nódulo o ulcera), descripción (costra, purulenta, franca, verrugosa o mucosa), si hay adenopatías regionales su localización y el tiempo de evolución. Luego estas lesiones (con su numeración) deben ser dibujadas en el esquema incluido en el formato para este fin. ? Se debe llenar la casilla de impresión diagnóstica. ? Se llena luego el formato de evaluación de las lesiones en el cual se deben registrar las dimensiones de la ulceración, induración y la presencia de adenopatías (registrando la fecha en que se realizo la medición), respetando la numeración anteriormente dada de las lesiones, por lo menos una vez antes del tratamiento y otra después del mismo, y luego según el criterio medico. ? Luego se llena la hoja de tratamiento en la cual se hace control al tratamiento administrado al paciente, en ella se debe especificar el medicamento administrado, la dosis a la que se administra, lote del medicamento, fecha de inicio del tratamiento, fecha de finalización del tratamiento, ampollas/capsulas entregadas al paciente, ampollas devueltas por el paciente, se debe señalar los días de tratamiento recibido, si es necesario se puede aclarar en la parte inferior el numero de unidades utilizadas. ? En la misma hoja se debe llenar el cuadro de efectos indeseables, donde se registra el efecto adverso relatado o encontrado, en que consulta se encontró, en que fecha y con que intensidad se presentó. Al final del formato se encuentra la hoja de seguimiento, en la cual con fecha y hora de atención se debe realizar todas las notas de atención al paciente, se deben registrar los informes de laboratorio (con fecha de realización, valor de referencia y por quien fue leído además de anexar copia al final) y puede ser entregado al paciente una vez se ha registrado, las notas de inició del tratamiento y de seguimiento del mismo, los hallazgos al examen físico, la conducta tomada en la visita y la fecha del próximo encuentro si debe realizarse.

175

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DILIGENCIAMIENTO Y ADMINISTRACIÓN DE LA HISTORIA CLÍNICA PROCESO TRATAMIENTO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

5.2.2 Administración de la Historia Clínica 5.2.2.1 Solicitud de historias clínicas: El bacteriólogo o médico. ? Cuando el usuario solicita personalmente la historia: el bacteriólogo o médico indaga

para qué es solicitada y solicita llenar el formato Solicitud de Historias Clínicas con copia del documento de identidad. Estos documentos se anexan al respaldo de la historia clínica. El bacteriólogo o médico se desplaza con el usuario hasta la fotocopiadora y le saca la copia con cargo al usuario, el original es devuelto al archivo. ? Cuando el usuario solicita la historia a través de un tercero: el bacteriólogo o médico solicita la autorización escrita firmada por el usuario y con copia del documento de identidad, estos documentos se anexan al respaldo de la historia clínica, cuando cumple se procede como en el paso anterior. ? Cuando la historia clínica es solicitada para uso médico-legal: el bacteriólogo o médico pide al usuario llenar el formato solicitud de Historias Clínicas con copia del documento de identidad y la solicitud que viene de una autoridad competente. Se debe solicitar autorización al Director para hacer la entrega oficial del documento siguiendo las instrucciones anteriores. 5.2.2.2 Organización de las historias clínicas: El laboratorio tiene una Historia Clínica única institucional que se conservan en un archivo activo general propio por mínimo 5 años y mínimo 15 años en archivo central, contados a partir de la fecha de la última atención, (Ver Resolución 1995 de Julio 8 de 1999, por la cual se establecen normas para el manejo de la Historia Clínica. Ministerio de la Protección Social, Colombia). La persona encargada de la atención de los pacientes ordena en forma consecutiva los documentos de acuerdo a su código UA Institucional, verifica que todos los documentos sean del mismo usuario, anexa los documentos sueltos, cambia y rotula las carpetas de historias clínicas deterioradas por el uso y revisa su diligenciamiento. 5.2.2.3 Seguridad de Historias en medio físico: Las historias clínicas en físico reposan en un en un archivo con llave ubicado en el consultorio, al cual solo tienen acceso el Médico, Bacteriólogo o microbiólogo encargado del consultorio. 5.2.2.4 Seguridad de historias clínicas digitalizadas: Las historias clínicas son digitalizadas por el Médico, Bacteriólogo o Microbiólogo en el computador que se encuentra en el consultorio, este computador tiene clave de acceso que solo conocen estas dos personas.

176

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Versión:

Página

5.2.2.5 Envío de información: Los datos epidemiológicos de las Historias Clínicas de los pacientes tratados en el laboratorio, por tratarse de enfermedad de notificación obligatoria, son digitalizadas por el bacteriólogo o el medico encargado en los registros del SIVIGILA para fines epidemiológicos nacionales. 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Resolución 1995 de Julio 8 de 1999, por la cual se establecen normas para el manejo de la Historia Clínica. Ministerio de la Protección Social, Colombia. POE Atención de Pacientes. ICH GCP TDR/WHO. 7. LISTA DE REGISTROS Formato Historia Clínica. Formato Solicitud de Historias Clínicas. 8. ANEXOS No aplica.

177

ANEXO 10

LOGO INSTITUCIÓN

COLORACIÓN DE PLACAS CON GIEMSA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

Equipos Microscopio de luz con objetivo de 100x. Reactivos y materiales Solución madre de colorante de GIEMSA. PBS. Aceite de inmersión. Placas portaobjetos con la muestra a observar. Elementos de protección Bata de laboratorio. Guantes. Desarrollo del método ? Fijar las placas portaobjetos conteniendo los frotis de las muestras durante 2 minutos con

metanol. ? Dejar secar a T°A. ? Preparar el colorante según aparece indicado en la etiqueta de la solución madre de GIEMSA. Ej: Agregar 4 gotas de colorante por ml de PBS. Nota: 1 gota = 40 ul. ? Bañar la placa con la preparación anterior y dejar actuar el colorante durante 15 minutos. ? Lavar con abundante agua de chorro. ? Escurrir y dejar secar a T°A. Leer al microscopio de luz con aumento de 100X en busca de parásitos de Leishmania spp. Documentos de referencia POE Preparación de PBS. POE Preparación solución madre de colorante de GIEMSA.

178

ANEXO 11

LOGO INSTITUCIÓN

REPORTE DE RESULTADOS DE DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

179

ANEXO 12

LOGO INSTITUCIÓN

PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE PBS DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO Preparar una solución amortiguadora con pH 7.2 - 7.4 que sirva como diluente de muestras y reactivos para diferentes procedimientos empleados en el diagnóstico de leishmaniosis. 1.2 ALCANCE No aplica. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica. 3. RESPONSABILIDAD No aplica. 4. GLOSARIO Y SIGLAS KH2PO4: Fosfato monobásico de potasio. NaCl: Cloruro de sodio. Na2HPO4: Fosfato difásico de sodio anhidro. PBS: Solución salina tamponada con fosfatos. 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES El PBS es una solución empleada en las pruebas serológicas para diluir muestras de sueros, preparar diluciones de anticuerpos, para los procesos de lavados durante las técnicas de inmunofluorescencia

180

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PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE PBS DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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Código:

Versión:

Página

ELISA en general, para la preparación de la solución de trabajo de colorante de Giemsa y en la preparación de antígenos de Leishmania empleados en las técnicas que se utilizan para el diagnóstico. 5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método El PBS es una solución amortiguadora de pH que contiene un ácido débil y su base débil conjugada, cuyo pH sólo cambia ligeramente al añadir un ácido o álcali. El ácido débil se vuelve tampón cuando se añade un álcali y, por su parte, la base débil se vuelve tampón cuando se añade un ácido. El PBS es una sustancia que mantiene constante la concentración de hidrogeniones dentro del rango fisiológico que en el caso de los mamíferos es de 7.38. 5.2.2 Rango de trabajo No aplica. 5.2.3 Condiciones generales No aplica. 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Equipos Autoclave. Balanza. Medidor de pH. Nevera. Plancha magnética con agitación.

181

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PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE PBS DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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Código:

Versión:

Página

Reactivos y materiales Agua destilada. Envases con tapa rosca, autoclavables. Erlermeyer. Magnetos. NaCl. Na2HPO4. KH2PO4. Soluciones calibradoras para pH (4.0 y 10.0). Elementos de protección Bata de laboratorio. Guantes. 5.2.5 Puntos de control Ajustar pH a 7,2. 5.2.6 Desarrollo del método ? Pesar 4.75gr de Na2HPO4 y 5.0 gr de NaCl. ? Depositar el Na2HPO4 y el NaCl en una probeta de 1L . ? Ajustar con agua destilada hasta 1L y agitar hasta obtener una mezcla homogénea. (Esta será

la solución A). ? Pesar 4.53 gr de KH2PO4 y 5.0 gr de NaCl. ? Depositar el KH2PO4 y el NaCl en una probeta de 1L. ? Ajustar con agua destilada hasta 1L y agitar hasta obtener una mezcla homogénea. (Esta será

la solución B). ? Esterilizar las solución A y B. ? Prepara la solución de trabajo mezclando cuatro (4) partes de la solución A con una (1) parte

de la solución B.

182

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PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE PBS DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

? Rotular indicando el nombre de la solución, la fecha de preparación y el responsable. ? Almacenar a 4ºC. ? Registrar en el cuaderno de Preparación y seguimiento de lotes de medios y soluciones.

Nota: Si las soluciones se preparan a 10X de concentración de los solutos, estas deben ser almacenadas a temperatura ambiente, de lo contrario se precipitan. 5.2.7 Cálculos y preparación de soluciones No aplica 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? Vélez I, Agudelo S. Manual de procedimientos para el diagnóstico de leishmaniosis cutánea

americana. Ed Universidad de Antioquia. 1996. ? Current Protocols in Immunology.

7. LISTA DE REGISTROS Cuaderno de preparación y seguimiento de Lotes de Medios y soluciones. 8. ANEXOS No aplica.

183

ANEXO 13

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PREPARACIÓN DEL MEDIO NNN MODIFICADO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO

Preparar un medio de cultivo que permita el crecimiento in vitro en masa de Leishmania spp. 1.2 ALCANCE

La guía describe el procedimiento de la preparación del medio NNN modificado partiendo de los reactivos y materiales preparados. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica. 3. RESPONSABILIDAD Auxiliar de laboratorio. 4. GLOSARIO Y SIGLAS gr: Gramos. NaCl: Cloruro de sodio. ml: Mililitros. rpm: Revoluciones por minuto. T°A: Temperatura ambiente. 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES El Cultivo en masa permite la obtención de promastigotes de Leishmania spp en gran cantidad que

184

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PREPARACIÓN DEL MEDIO NNN MODIFICADO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

serán usados en la preparación de Ags de Leishmania spp, clasificación de la especie de Leishmania, infecciones in vitro, PCR entre otras pruebas. 5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método No aplica. 5.2.2 Rango de trabajo Cuarto de cultivos. 5.2.3 Condiciones generales Debe tenerse presente las precauciones universales para la manipulación de fluidos contaminados con material biológico (Ver Manual de Bioseguridad) 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Equipos Autoclave. Centrifuga. Nevera. Cabina de seguridad biologica. Reactivos y materiales Agar base sangre. Agua destilada. Botellas para servir el medio de cultivo. Envase con tapa rosca, autoclavable. Sangre de conejo. Elementos de protección Bata de laboratorio. Guantes.

185

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PREPARACIÓN DEL MEDIO NNN MODIFICADO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

5.2.5 Puntos de control No aplica. 5.2.6 Desarrollo del método Para preparar 1000 ml de volumen final del medio: ? Depositar en un envase con tapa rosca de 1000 ml, previamente estéril, 700 ml de agua

destilada y 40 gr de agar base sangre. ? Mezclar en agitación hasta que se observe disolución completa del agar. ? Autoclavar a 15lb de presión hasta alcanzar una temperatura de 121°C durante 15 minutos.

Además deben esterilizarse también las botellas necesarias para servir el medio de cultivo. ? Sacar del autoclave, ajustar la tapa rosca del envase y dejar fuera hasta hasta alcanzar una T° de 65°C aproximadamente. ? Sangrar el conejo. ? Por punción cardiaca según procedimientos estandarizados y aprobados por el Comité de Ética Animal de la Institución. ? Desfibrinar la sangre de conejo de la siguiente manera: mezclar en tubos de centrifuga, previamente estériles, una parte de agua (200 ml) y una parte de sangre (200 ml), tapar y llevar a la centrífuga a 25°C a 3000rpm durante 15 minutos. ? En cabina de seguridad biológica recuperar 300 ml del sobrenadante y depositar en el envase que contiene el agar base sangre, homogenizando suavemente por unos 15 segundos. ? Servir 8 ml del medio en cada botella previamente esterilizada. ? Llevar a refrigeración a 4°C cuidando de colocar las botellas en posición horizontal. ? Registrar en el cuaderno preparación medios y soluciones. ? Hacer prueba de esterilidad según instructivo para pruebas de esterilidad. 5.2.7 Cálculos y Reporte de resultados No aplica. 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? Beltrán S, Peláez D, Corredor A. Normas para cultivo in Vitro de parásitos de la familia

Trypanosomatidae. Manual de procedimientos. Instituto nacional de salud. 1993.

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PREPARACIÓN DEL MEDIO NNN MODIFICADO DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

? WHO. Control of the leishmaniasis. Reporto f a WHO expert comité. 1990. ? POE Punción cardíaca en Conejos.

7. LISTA DE REGISTROS Cuaderno Preparación medios y soluciones. 8. ANEXOS No aplica.

187

ANEXO 14

LOGO INSTITUCIÓN

PREPARACIÓN DEL MEDIO NNN NORMAL DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO

Preparar un medio de cultivo que permita el crecimiento in vitro de Leishmania spp. 1.2 ALCANCE

La guía describe el procedimiento para la preparación del medio NNN normal partiendo de todos los reactivos y materiales preparados. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica. 3. RESPONSABILIDAD Auxiliar de Laboratorio. 4. GLOSARIO Y SIGLAS gr: Gramo. NaCl: Cloruro de sodio. ml: Mililitro. T°A: Temperatura ambiente. 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES El medio NNN normal es un medio de agar agar suplementado con sangre de conejo que permite el crecimiento de parásitos de Leishmania spp.

188

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PREPARACIÓN DEL MEDIO NNN NORMAL DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método No aplica. 5.2.2 Rango de trabajo La observación de promastigotes de Leishmania spp en el medio NNN se convierte en una prueba diagnóstica de Leishmaniosis. La preparación del medio debe realizarse en el Cuarto de cultivos utilizando la cabina de seguridad biologica. 5.2.3 Condiciones generales Debe tenerse presente las precauciones universales para la manipulación de fluidos contaminados con material biológico (Ver Manual de Bioseguridad Institucional). 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y Equipos Autoclave. Nevera. Báscula. Cabina de Seguridad Biologica. Reactivos y materiales Agar-agar. Agua destilada. Envase con tapa rosca previamente estéril. NaCl. Sangre de conejo. Tubos estériles con tapa.

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PREPARACIÓN DEL MEDIO NNN NORMAL DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

Elementos de protección Bata de laboratorio. Guantes. 5.2.5 Puntos de control No aplica. 5.2.6 Desarrollo del método Para 1000 ml de volumen final de medio: ? Depositar en un envase con tapa rosca de 1000 ml, previamente estéril, 850ml de agua

destilada, 15 gr de Agar-agar y 6 gr de NaCl. ? Mezclar en agitación hasta que se observe disolución completa del agar y el NaCl. ? Autoclavar a 15lb de presión hasta alcanzar una temperatura de 121°C durante 15 minutos. Además deben esterilizarse también los tubos necesarios para servir el medio de cultivo. ? Sacar del autoclave, ajustar la tapa rosca del envase y dejar fuera hasta alcanzar una T° de 65°C aproximadamente. ? Adicionar 150 ml de sangre de conejo + 3ml de penicilina G sódica, teniendo cuidado de adicionarlo por las paredes para evitar la hemólisis de la sangre. ? Servir 2.5 ml del medio en cada tubo previamente esterilizado. ? Colocar los tubos en posición oblicua para formar bisel y llevar a refrigeración a 4°C hasta su uso. ? Registrar en el cuaderno de Preparación y Seguimiento de lotes de medios y soluciones. ? Hacer prueba de esterilidad según el instructivo. 5.2.7 Cálculos y Reporte de resultados No aplica. 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? Beltrán S, Peláez D, Corredor A. Normas para cultivo in Vitro de parásitos de la familia

Trypanosomatidae. Manual de procedimientos. Instituto Nacional de Salud. 1993.

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PREPARACIÓN DEL MEDIO NNN NORMAL DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

? WHO. Control of the leishmaniasis. Report f a WHO expert committee. 1990. ? Manual de Bioseguridad Institucional. ? POE Punción Cardíaca en Conejos.

7. LISTA DE REGISTROS Cuaderno de Preparación y Seguimiento de lotes de Medios y Soluciones.

191

ANEXO 15

LOGO INSTITUCIÓN

PREPARACIÓN DE FASE LIQUIDA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO Disponer de una solución rica en nutrientes para ser utilizada en combinación con el medio NNN que permita el crecimiento in Vitro de Leishmania spp. 1.2 ALCANCE

Describe la preparación de la fase líquida. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica. 3. RESPONSABILIDAD No aplica. 4. GLOSARIO Y SIGLAS NaCl: Cloruro de sodio. T°A: temperatura ambiente. 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES La fase líquida es una solución que se utiliza en técnicas de cultivo de promastigotes de Leishmania spp, preparación de antígenos de Leishmania spp y clasificación de especies de Leishmania, entre otras.

192

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PREPARACIÓN DE FASE LIQUIDA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método No aplica. 5.2.2 Rango de trabajo No aplica. 5.2.3 Condiciones generales No aplica. 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Equipos Autoclave. Magnetos. Nevera. Plancha magnética con agitación. Reactivos y materiales Agua destilada. Envase con tapa rosca, autoclavable. Glucosa. NaCl. Elementos de protección Bata de laboratorio. Guantes. 5.2.5 Puntos de control No aplica.

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PREPARACIÓN DE FASE LIQUIDA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

5.2.6 Desarrollo del método ? Para preparar 1000ml, en un erlermeyer se dispensan 8.5gr de NaCl, 10gr de glucosa y 1000

ml de agua destilada no estéril. ? Mezclar en agitación hasta que se observe disolución completa. ? Alicuotar en envases con tapa rosca en cantidades de 100 o 50 ml, según se requiera,

previamente marcados con nombre de la solución, fecha de preparación y responsable. ? Autoclavar a 15lb de presión hasta alcanzar una temperatura de 121°C durante 15 minutos. ? Sacar del autoclave, ajustar la tapa rosca del envase y dejar fuera hasta que alcance la T°A. ? Refrigerar a 4°C hasta su uso. ? Registrar en el cuaderno de Preparación y Seguimiento de lotes de medios y soluciones.

5.2.7 Cálculos y preparación de soluciones No aplica. 6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? Guía 412. Ministerio de Protección social. 2000. ? Beltrán S, Peláez D, Corredor A. Normas para cultivo in Vitro de parásitos de la familia

Trypanosomatidae. Manual de procedimientos. Instituto Nacional de Salud. 1993. ? Vélez I, Agudelo S. Manual de procedimientos para el diagnóstico de leishmaniosis cutánea

americana. Ed Universidad de Antioquia. 1996. ? WHO. Control of the leishmaniasis. Reporto f a WHO expert comité. 1990.

7. LISTA DE REGISTROS Cuaderno de preparación y seguimiento de Lotes de Medios y soluciones. 8. ANEXOS No aplica.

194

ANEXO 16

LOGO INSTITUCIÓN

PRUEBA DE ESTERILIDAD A MEDIOS Y SOLUCIONES DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

1. OBJETIVO Verificar la esterilidad de los medios de cultivo, las soluciones y el Antígeno de Montenegro que se emplean en el diagnóstico de leishmaniasis. 2. MATERIALES Y REACTIVOS Bata de laboratorio. Guantes. BHI caldo. Saboreau. Medios o soluciones a evaluar. Incubadora de 37ºC. 3. DESCRIPCIÓN ? Para los medios RPMI, Schneider y Antígeno de Montenegro, se inoculan dos tubos de medio

BHI caldo y dos de Saboreau con 1-2 gotas. Para los medios NNN y NNN modificado simplemente se agrega a dos tubos seleccionados al azar 1 o 2 gotas de fase liquida. ? Se incuban a 37°C al menos durante una semana, revisando diariamente en busca de crecimiento microbiano (no debe de haber crecimiento de bacterias ni hongos). ? Si no se presenta crecimiento microbiano se descarta como negativo y pueden ser utilizados los diferentes medios. ? Se registra en el Cuaderno de Preparación de Medios y Soluciones el resultado obtenido en las pruebas de esterilidad, indicando fecha y firma del responsable.

195

ANEXO 17

LOGO INSTITUCIÓN

CULTIVO EN MASA DE PROMASTIGOTES DE LEISHMANIA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

LOGO DEPENDENCIA

Código:

Versión:

Página

1. DEFINICION 1.1 OBJETIVO

Obtener cantidades abundantes de parásitos, requeridos para diferentes ensayos, mediante la inoculación de cepas de Leishmania en medios de cultivo específicos para su crecimiento. 1.2 ALCANCE

Describe el procedimiento de realizar el cultivo en masa. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica. 3. RESPONSABILIDAD No aplica. 4. GLOSARIO Y SIGLAS Acs: anticuerpos. Ag: antígeno. Cultivo en masa: siembra de la cepa de Leishmania en un medio monofásico o bifásico, en condiciones de temperatura controladas, con el fin de obtener crecimiento de los parásitos. ELISA: Inmunoensayo ligado a enzimas. IF: Inmunofluorescencia. IFI: Inmunofluorescencia indirecta. Roseta: Agregado de promastigotes de Leishmania spp. que se unen por el flagelo.

196

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CULTICO EN MASA DE LEISHMANIA SSP DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

Versión:

Página

5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES El parásito aislado y cultivado sirve como fuente de Ag para pruebas inmunológicas como la prueba de Montenegro, linfoproliferación, detección de Acs por ELISA o IFI, asilamiento e identificación de moléculas del parásito que constituyan factores de virulencia, entre otros. 5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método El parásito mantenido en un medio bifásico rico en nutrientes con agar base sangre y en condiciones ambientales controladas crece en su estado extracelular o promastigote. 5.2.2 Rango de trabajo Se debe trabajar en cabina de seguridad biologica. 5.2.3 Condiciones generales No aplica. 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Equipos Cabina de Seguridad Biologica. Micropipeta de 20-200 µl. Microscopio invertido. Reactivos y materiales Fase con antibiótico a 2000U/ ml. Parásitos en cultivo NNN. PBS. Botellas con medio de cultivo NNN modificado.

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Manual Diagnóstico y Control de la Leishmaniasis en Centroamérica

CULTICO EN MASA DE LEISHMANIA SSP DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

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Placas portaobjetos. Puntas estériles para micropipeta. Elementos de protección Bata de laboratorio. Guantes. 5.2.5 Puntos de control No aplica. 5.2.6 Desarrollo del método Este procedimiento se lleva a cabo por un Bacteriólogo o Microbiólogo y Bioanalista en el cuarto de cultivo: ? Pasar 120 µl de fase líquida del medio NNN normal que tiene la cepa de Leishmania

previamente aislada (según procedimiento Cultivo para Lehismania P-DX-0008) a una botella que contiene medio NNN modificado y agregar 5 ml de fase líquida con antibiótico (penicilina 1000 U/ml). ? Rotular las botellas con el código de la cepa (o el código W del paciente si aun no se ha identificado cepa) y la fecha. ? Incubar los tubos a 26°C. ? Observar los cultivos al quinto día tomando una gota de la fase líquida y depositándola sobre una lámina portaobjetos y mirar al microscopio de luz con el objetivo de 40x en busca de promastigotes de Leishmania spp. ? Verificar que el crecimiento de los parásitos sea abundante (gran cantidad de rosetas del parásito) y que no haya contaminación por bacterias u hongos. Si se cumplen estas condiciones el cultivo puede ser utilizado para los diferentes procedimientos en los que se requiera. 5.2.7 Cálculos y reporte de resultados No aplica.

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CULTICO EN MASA DE LEISHMANIA SSP DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS LABORATORIO Código:

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6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA ? Vélez I, Agudelo S. Manual de procedimientos para el diagnóstico de leishmaniosis cutánea

americana. Ed Universidad de Antioquia. 1996. ? POE preparación medio NNN modificado. ? POE preparación medio NNN normal. ? POE Cultivo para Leishmania spp. ? POE Preparación de la fase líquida.

7. LISTA DE REGISTROS No aplica. 8. ANEXOS No aplica.

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ANEXO 18

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CULTIVO EN MASA DE PROMASTIGOTES DE LEISHMANIA DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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1. OBJETIVO Verificar la seguridad del Antigeno de Montenegro preparado, previo a su utilización en pacientes. 2. MATERIALES Y REACTIVOS Bata de laboratorio. Guantes. 2 Tubos de medio NNN normal. Antigeno de Montenegro. Incubadora a 26-28ºC. 3. DESCRIPCIÓN ? Se inoculan dos tubos de medio NNN normal con 1-2 gotas de Antigeno de Montenegro. ? Se incuban a 26-28° C durante un mes, revisando diariamente en busca de parásitos vivos (no

debe de haber parásitos vivos) ? Si al mes de revisión no se observan parásitos vivos se descarta como negativo y puede ser

utilizado este antígeno para la Prueba de Montenegro (Ver POE Prueba Cutánea de Montenegro. ? En el Cuaderno preparación Medios y Soluciones se registra el resultado de las pruebas de esterilidad, indicando fecha y firma del responsable.

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ANEXO 19

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DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS POR PCR DEL GENE DE LA PROTEASA DE CISTEINA TIPO B (CPB)

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1. DEFINICIÓN 1.1 OBJETIVO

Definir los pasos que se deben seguir para la amplificación de secuencias nucleotidicas en muestras de pacientes con leishmaniasis. 1.2 ALCANCE

Este procedimiento se inicia a partir de ADN en solución y termina con el gel de verificación del producto amplificado. 2. NOTAS DE CAMBIO No aplica para esta versión. 3. RESPONSABILIDADES La administración e implementación del presente procedimiento es responsabilidad del Coordinador del laboratorio y del Investigador responsable del procedimiento. 4. GLOSARIO Y SIGLAS Termociclador: instrumento que permite realizar los ciclos de amplificación del ADN en forma automatizada por medio de un control de temperaturas. Vortex: implemento de laboratorio que permite agitar una muestra a una velocidad programada mediante giros de un eje. Marcador de peso molecular: fragmentos de diferentes pesos moleculares en solución que permiten predecir el tamaño de las muestras problema en una electroforesis. Electroforesis: método de separación de muestras mediante corriente eléctrica. Cámara de electroforesis: instrumento de acrílico que permite el desplazamiento de unas muestras con una carga específica a través de un gel por medio de cargas eléctricas.

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ADN: material genético que se encuentra en el parásito. PCR: reacción en cadena de la polimerasa. Procedimiento que permite la amplificación exponencial de pequeños fragmentos de ADN a partir de una muestra molde. Primers: también conocidos como iniciadores, son los responsables de flanquear la zona del fragmento de ADN a amplificar. Taq Polimerasa: enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), permite la polimerización de los amplificados de ADN durante la PCR. 5. CONTENIDO 5.1 GENERALIDADES La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis (1) cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad la presencia de Leishmania en las muestras de los pacientes. 5.2 DESCRIPCION 5.2.1 Principio del método Amplificar fragmentos de genes específicos de Leishmania, en este caso el gene de la proteasa de cisteína tipo B. 5.2.2 Rango de trabajo Todas las actividades de este procedimiento se deben realizar en el laboratorio de Biologia Molecular (zonas de pre-PCR y PCR).

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5.2.3 Condiciones generales ? El termociclador debe estar en optimas condiciones que garantice los cambios de

temperaturas requeridos. ? Se usa TBE 1X tanto para la preparación del gel de agarosa, como para correr la electroforesis ? La Taq polimerasa debe almacenarse a -20ºC y durante su suo debe mantenerse en mabiente frio (usar cubeta con hielo). ? Los geles de agarosa pueden contener bromuro de etidio para la visualización de los productos amplificados. Para el manejo de esta sustancia, deben tomarse medidas de bioseguridad como uso de guantes, tapabocas y gafas de seguridad por tratarse de un producto carcinogénico. ? El descarte de geles se hace en la caneca marcada para tal fin y el procedimiento de detoxificación y descarte debe realizarse según las normas del manual de bioseguridad. 5.2.4 Equipos, reactivos, materiales y elementos de protección Equipos ? Centrífuga. ? Termociclador. ? Vortex. ? Nevera de -20ºC y -80ºC. ? Cámara electroforesis. ? Equipo para tomar las fotografias: GelDoc. ? Software para editar las fotografías de los geles: ChemiDoc.

Elementos de laboratorio ? Viales de 0,2ml. ? Puntas de 10ul y 200ul. ? Taq polimerasa.

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? dNTPs. ? Primers COI. ? Taq Buffer 10X. ? MgCl2. ? Micropipetas de 2ul, 10ul, 20ul, 100ul, 200ul y 1000ul.

Material biológico ? DNA de mosquitos y Lutzomyia.

Elemento de protección ? Bata de laboratorio, guantes de nitrilo o latex, tapabocas.

5.2.5 Puntos de control La mezcla de reacción (master mix) debe hacerse en un espacio del laboratorio previamente definido para ello con el fin de evitar contaminaciones y amplificaciones inespecificas. 5.2.6 Desarrollo del método 5.2.6.1 PCR: 5.2.6.1.1 Se utilizarán 2ul del ADN extraido con una concentración minima de XXX. 5.2.6.1.2 Realizar un master mix teniendo en cuenta el volumen de reacción a usar y la cantidad de reactivos descritas a continuación:

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El volumen final de la reacción es de 25 ? l. La concentración de MgCl depende del tipo de Taq polimerasa a usar. 5.2.6.1.4 Condiciones de la PCR.

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5.2.6.2 PREPARACIÓN GEL DE AGAROSA al 1%TEÑIDO CON BROMURO DE ETIDIO

5.2.6.2.1Procedimiento: ? Pesar 1.0 g de agarosa en balanza analítica. ? Medir 80mL de buffer TBE1X. ? Añadir a un erlenmeyer la agarosa y la buffer cuidando de no dejar rastros en las paredes de

vidrio.

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? Calentar en microondas por 1 minuto 30 segundos y observar la dilución total de la agarosa. ? Dejar enfriar un poco (50-60ºC aproximadamente). ? Adicionar 2 ul de bromuro de etidio. ? Mezclar suavemente por rotación y sin formar burbujas. ? Añadir la mezcla a la cámara electroforética . ? Esperar la gelificación durante al menos 30 minutos. ? Preparar las muestras de ADN sobre papel parafilm con 3 ul de buffer de carga (azul) y 5ul

del ADN amplificado. ? Sobre el gel solidificado añadir 500 ml de buffer . ? Proceder a sembrar 7 ul de muestra en cada uno de los pozos. ? Conectar la cámara electroforética a la fuente de poder, cuidando el sentido positivo o

negativo de los polos. ? Correr las muestras a 80V por lo menos una hora o hasta que el buffer de carga llegue a la

parte inferior del gel sin que se salga. ? Apagar la fuente de poder, desconectar la cámara y abrirla. ? Retirar el gel y ubicarlo en el analizador de geles con cuidado para no dejarle burbujas ni romperlo. ? Proceder a tomar la fotografía, previsualizando con luz blanca, y luego con radiación UV ? Guardar la imagen con extensión .raw y .jpeg. ? Desechar el gel en la caneca asignada para geles contaminados con bromuro de etidio. 6. PROTOCOLO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE LEISHMANIA MEDIANTE RFLP DEL GEN DE LA PROTEASA DE CISTEIN B ? La técnica de PCR-RFLP es una técnica que se basa en el corte con endonucleasas de

restricción de los productos amplificados por PCR. Si dos amplicones (productos amplificados) presentan una variación de la secuencia nucleotídica, en los sitios de reconocimientos de las enzimas de restricción, generarán distintos patrones de fragmentos. la diferenciacion e identificacion de species de Leishmania con endonucleasas de restriccion depende de la especie y el procedimiento es el siguiente:

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? Para diferenciar L. panamensis de L. braziliensis, se toman 10 ìl del producto amplificado y s

emezclan con 0.5 ìl (3U/ìl)de la enzima Kpn I (Promega) para su digestión en 2 ìl de buffer J (10X), y 7.5 ìl H2O. la mezcla se incuba durante 6 h a 37ºC. se toman 10 ìl del producto de amplificación y se mezclan con 0.5 ìl (4 U/ìl), de la enzima Nsi I (New England Biolab) en 2.0 ìl de buffer NEBuffer 3 (10X) y 7.5 ìl H2O. La mezcla se incuba durante 16 h a 37ºC.

? Para diferenciar L. panamensis de L. guyanensis

? Para diferenciar L. mexicana de L. amazonensis, se toman 10 ìl del producto amplificado y

se mezclan con 0.5 ìl (4 U/ìl) de la enzima Nar I (New England Biolab), en 2.5 ìl del buffer NEBuffer 1 (10X) y12 ìl H2O. la mezcla se incuba por 6 h a 37ºC. ? Para diferenciar L. mexicana de L. infantum, se toman 10 ìl del product amplificado y se

mezclan con 0.5 ìl (3 U/ìl) de la enzima Kpn I (Promega), en 2.5 ìl del buffer J (10X) y 12 ìl H2O. la mezcla se incuba por 6 h a 37 ºC. ? Después de la digestión los productos digeridos se separan por electroforesis en un gel de

agarosa al 1-2%, que se prepara en la misma forma como se indico anteriormente. 6. Documento de referencia 1. Bartlett & Stirling (2003). A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Methods Mol Biol. 226:3-6 2. Montalvo AM, Fraga J, Montano I, Monzote L, Marin M, Der Auwera GV, Dujardin JC, Velez ID, Muskus C. Differentiation of Leishmania (Viannia) panamensis and Leishmania (V.) guyanensis using BccI for hsp70 PCR-RFLP. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2010. 104:364367

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7. Lista de registro Cuaderno de resultados. 8. Anexos No aplica.

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