Carnilac Industrial octubre-noviembre 2016 by Alfa Editores Técnicos

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Octubre - Noviembre 2016 | Volumen 6, No. 5 www.alfa-editores.com.mx | buzon@alfa-editores.com.mx

TECNOLOGÍA

EFECTO ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DEL RESIDUO DE CAFÉ EN CARNE CRUDA Y COCIDA

PERSPECTIVAS SOBRE EL POTENCIAL PROBIÓTICO DE BAL EN ALIMENTOS Y BEBIDAS FERMENTADAS TRADICIONALES

TECNOLOGÍA

IMPACTO POTENCIAL DE LA RESISTENCIA A LOS DESINFECTANTES DE AMONIO CUATERNARIO SOBRE LA PERSISTENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES

PROCESO DE FERMENTACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA RENINA PARA LA COAGULACIÓN DE LA LECHE

CARNILAC INDUSTRIAL | Octubre - Noviembre 2016

4 [ CONTENIDO ]

EDITOR FUNDADOR

Ing. Alejandro Garduño Torres DIRECTORA GENERAL

Secciones

Lic. Elsa Ramírez Zamorano Cruz

Editorial

Equipos de Proceso y para Empaque

Abamex Ingeniería, S.A. de C.V.

Novedades Calendario de Eventos Índice de Anunciantes

9 63 64

CONSEJO EDITORIAL Y ÁRBITROS

M. C. Abraham Villegas de Gante Dra. Adriana Llorente Bousquets Dra. Consuelo Silvia O. Lobato Calleros Dr. Francisco Cabrera Chávez Dra. Herlinda Soto Valdez Dr. Humberto Hernández Sánchez Dr. José Pablo Pérez-Gavilán Escalante Dra. Judith Jiménez Guzmán M. C. Ma. del Carmen Beltrán Orozco Dra. Ma. del Carmen Durán de Bazúa Dra. Ma. del Pilar Cañizares Macías Dr. Marco Antonio Covarrubias Cervantes Dr. Mariano García Garibay Ing. Miguel Ángel Zavala Arellano M. C. Rodolfo Fonseca Larios M. en C. Rolando García Gómez Dra. Ruth Pedroza Islas Dr. Salvador Vega y León Dr. Santiago Filardo Kerstupp Dra. Silvia Estrada Flores Dr. Valente B. Álvarez DIRECCIÓN TÉCNICA

Q.F.B. Rosa Isela de la Paz G.

ORGANISMOS PARTICIPANTES

CON EL RESPALDO DE

PRENSA

Lic. Víctor M. Sánchez Pimentel DISEÑO

ORGANISMO ASESOR

Lic. María Teresa Bañales Yerena Lic. Lucio Eduardo Romero Munguía VENTAS

Cristina Garduño Torres Karla Hernández Pérez ventas@alfa-editores.com.mx

Objetivo y Contenido La función principal de CARNILAC INDUSTRIAL es dar difusión a los servicios de apoyo que las empresas proveedoras (de materias primas, maquinaria, laboratorios de control de calidad, etc.) ofrecen a las Industrias Cárnica y Láctea, y a la vez servir de medio para que los técnicos, especialistas e investigadores de las áreas relacionadas con ambos sectores, expongan sus conocimientos y experiencias. El contenido de la revista es actualizado debido a la aportación del conocimiento de muchas personas especializadas en las áreas. Adicionalmente se incluye información tecnológica de aplicación básica y práctica, con la finalidad de que ayude a resolver los problemas que enfrentan los industriales procesadores del ramo. CARNILAC INDUSTRIAL es una publicación bimestral editada por Alfa Editores Técnicos, S.A. de C.V., domicilio: Unidad Modelo No. 34, Col. Unidad Modelo, Deleg. Iztapalapa, C.P. 09089, México, D.F., Tel. 55 82 33 42, www.alfa-editores.com.mx, buzon@alfa-editores.com.mx. Editor Responsable: Elsa Ramírez-Zamorano Cruz. Reserva de Derechos al Uso Exclusivo en trámite, ISSN 1870-0853, Certificado de Licitud de Título No. 12844 y Licitud de Contenido 104117 expedidos por la Comisión Calificadora de Publicaciones y Revistas Ilustradas de la Secretaría de Gobernación. Permiso SEPOMEX en trámite. Impreso por MasterCopy, S.A. de C.V., ubicados en Plásticos No. 84-2 Bis, Col. Alce Blanco, Naucalpan, Edo. De México, Tel. 5524 2383. Este número se terminó de imprimir el 17 de Octubre de 2016. El contenido de los artículos sin firma es responsabilidad de la editorial. La veracidad y legitimidad de los mensajes contenidos en los anuncios publicados en esta revista son responsabilidad de la empresa anunciante. Se aceptan colaboraciones. No se devuelven originales. Se acepta intercambio de publicaciones similarles. Queda estrictamente prohibida la reproducción total o parcial de los contenidos e imágenes de la publicación sin previa autorización de Alfa Editores Técnicos, S.A. de C.V.

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6 [ EDITORIAL ]

CARNILAC INDUSTRIAL, LA EVOLUCIÓN DE “INDUSTRIA CÁRNICA” E “INDUSTRIA LÁCTEA” La historia del desarrollo de la humanidad no sería la misma sin el aprovechamiento de los distintos alimentos que nos provee el reino animal. Desde la leche de vaca hasta la proteína cárnica en sus distintas variedades, los animales han impulsado la evolución de las sociedades a partir de que se descubrió la caza. En línea con esta idea, Alfa Editores Técnicos presenta a partir de este número la fusión de sus revistas “Industria Cárnica” e “Industria Láctea” en una misma solución comunicativa: CARNILAC INDUSTRIAL. CARNILAC INDUSTRIAL es el medio ideal para exponer las novedades, noticias e innovaciones tecnológicas de las industrias de la carne y los lácteos; así como los productos y servicios que los proveedores de ambos sectores ponen al alcance de los procesadores. Artículos técnicos de utilidad, reseñas de eventos, lanzamientos, tendencias de consumo y otras herramientas informativas valiosas para las industrias de las carnes y los lácteos, es lo que usted encontrará en CARNILAC INDUSTRIAL. En 2004, CARNILAC INDUSTRIAL existió como la evolución de nuestra entonces revista “Lácteos y Cárnicos Mexicanos”, que siguiendo las directrices de ambos mercados en crecimiento se dividió en las revistas “Industria Cárnica” e “Industria Láctea” entre 2011 y 2012. En línea con las mismas tendencias, y sobre todo atendiendo las necesidades e inquietudes de los industriales del sector cárnico y el sector lácteo, este 2016 retomamos CARNILAC INDUSTRIAL, con un formato innovador en su presentación im-

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presa, mientras que la versión digital se podrá consultar gratuitamente al tiempo que los sitios web de “Industria Cárnica” e “Industria Láctea” permanecen vigentes para la difusión de noticias específicas de cada segmento. En esta primera edición de CARNILAC INDUSTRIAL, exponemos un valioso artículo sobre el efecto antioxidante de los extractos del residuo de café en carne cruda y cocida, un análisis de las perspectivas sobre el potencial probiótico de bacterias ácido lácticas (BAL) en alimentos y bebidas fermentadas tradicionales, un trabajo en torno al impacto potencial de la resistencia a los desinfectantes de amonio cuaternario sobre la persistencia de Listeria monocytogenes, y el detalle de un proceso de fermentación y caracterización de la enzima renina para la coagulación de la leche. Además, complementamos este número con notas breves de los negocios cárnico y lácteo, y un práctico calendario de eventos tanto nacionales como internacionales. Bienvenid@s a CARNILAC INDUSTRIAL de octubre y noviembre del 2016. El equipo de Alfa Editores Técnicos, que por más de 37 años ha sido la casa editorial líder para las industrias de alimentos y bebidas en México, agradece su lectura y le invita a conocer nuestros nuevos micro-sitios y proyectos de comunicación para las industrias de alimentos, bebidas y envases: www.alfa-editores.com.mx. Lic. Elsa Ramírez-Zamorano Cruz Directora General

La USDA corrobora calidad de rastros mexicanos Durante una gira de trabajo por el Agroparque Integradora SuKarne Lucero, ubicado en Tlahualilo (Durango), donde se encuentra la planta de engorda más grande de América Latina, directivos de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) y el subsecretario adjunto para la Seguridad Alimentaria del Departamento de Agricultura de Estados Unidos de América (USDA, por sus siglas en inglés), Alfred Almanza, visitaron la planta Tipo Inspección Federal (TIF) 645, dedicada a la producción de cárnicos y que cumple con los más altos estándares de calidad a través de su Sistema Integrado de Producción de Carne (SIPC), que garantiza inocuidad, seguridad y sabor. Durante el recorrido se tuvo la oportunidad de conocer cómo opera la planta y las garantías de sanidad e inocuidad que ofrece a los consumidores. Asimismo, se constataron los servicios de inspección que realizan los médicos autorizados por el SENASICA y los procesos de engorda, sacrificio y procesamiento de cárnicos de bovino. Alfred Almanza destacó los avances de los servicios de inspección sanitaria de la carne en México, los cuales cumplen con las normas y criterios internacionales más estrictos. Reconoció que el Agroparque Integradora SuKarne Lucero es la mejor infraestructura que exporta carne a los Estados Unidos, por encima de empresas de otros países incluidas las asiáticas, y visitó también el rastro TIF 158 ubicado en Atitalaquia, Hidalgo, el cual cuenta con una posición relevante en el segmento de carnes frías y quesos que se comercializan en diferentes países de América y Europa.

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NOVEDADES

Jalisco innova con nueva raza de bovino: Simmangus En el marco de la presentación del II Congreso Simmental Simbrah de las Américas, que se realizará del 10 al 15 de octubre como parte de la Expo Ganadera Jalisco 2016 (6 de octubre al 2 de noviembre), la Secretaría de Desarrollo Rural (Seder) de ese estado informó que los ganaderos locales son líderes en la producción genética bovina a nivel nacional y que captarán la atención del mundo con la presentación por primera vez de la raza Simmangus (resultado de la cruza de Simmental y Angus), lo que representa una muestra de los avances genéticos del país y de la entidad.

La formación de esta nueva variedad bovina representó trabajar en cuatro generaciones de ejemplares, hasta que se estabilizaron las características genéticas utilizadas.

Agregó que Jalisco destaca por su crianza de todas las razas bovinas de consumo alimentario: Angus, Charolais, Charbray, Simmental, Brangus y Simmangus; esta última es única en su tipo a nivel mundial y su inventario se concentra en Jalisco y Sonora, para su composición el Simmental aporta la calidad materna, con facilidad para la ordeña, y la raza Angus otorga calidad a la carne, al tiempo que las crías son más pesadas. México es el único país que tiene registrada esta raza como tal.

Cabe señalar que Jalisco es el segundo estado con más inventario de ganado bovino, sólo superado por Veracruz, mientras que en valor de producción la entidad tapatía es líder con 13,732´324,000 pesos de acuerdo con cifras del 2015. La producción estatal carne bovina en dicho año fue de 203,644 toneladas, lo que representó el sacrificio de 796,000 cabezas; los principales municipios productores de carne son Lagos de Moreno, Tepatitlán de Moreno y Ameca.

Destacan importancia de la producción láctea y cárnica de la Ciudad de México Con 3,400 millones de litros al año, la producción de leche de vaca es la principal actividad pecuaria en la Ciudad de México, lo que representa 50.4% del valor total de la entidad en ese ramo, señaló la Secretaría de Desarrollo Rural y Equidad para las Comunidades (Sederec). En un comunicado, la dependencia destacó la importancia que tiene para la zona rural de la ciudad y la alimentación de los capitalinos, la generación de leche, carne, miel y huevo, por lo cual se apoya a los productores del campo local. Detalló que después de la leche de vaca, la carne de cerdo es el producto pecuario de mayor venta, ya que representa 28.6% del valor total y al año alcanza las 1,719 toneladas, lo que económicamente representa 69 millones de pesos. Mientras que la carne de bovino ocupa el tercer puesto con 11% del total y 544 toneladas anuales. La dependencia refirió que aunque durante todo el año hay producción de esos alimentos, la carne de porcino tiene un alza en los meses de julio y diciembre, la de bovino en mayo y la de leche en noviembre. Asimismo, señaló que la delegación líder en producción pecuaria es Xochimilco, con 37.9%; seguida de Tlalpan, con 33.8%; mientras que Milpa Alta tiene 12%, Tláhuac 11% y Magdalena Contreras 2.5%.

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{11} El consumo de yogurt ayuda a combatir el sobrepeso y la obesidad Consumir un yogurt descremado al día acompañado con fruta disminuye el riesgo de tener sobrepeso y obesidad, aseguró Carmen Sayon-Orea, investigadora de la Universidad de Navarra (España).

NOVEDADES

En el marco del segundo Simposio de Yogurt en México “Iniciativa para una dieta correcta: efectos del yogurt en la salud”, la especialista comentó que la prevalencia del síndrome metabólico aumentó como consecuencia del sedentarismo, por lo que existen mayores casos de obesidad. Por lo anterior, indicó que el yogurt es un tipo de leche fermentada cuya composición nutrimental es muy parecida a la leche que le dio origen, por lo que ofrece diferentes beneficios a la salud, que en gran medida se deben a las bacterias producidas durante el proceso de fermentación.

dos a tres mil personas con estos padecimientos, de edades que oscilaban entre los 18 y 35 años, fueron sometidos al consumo habitual de yogurt. Los resultados mostraron un menor riesgo de presentar componentes que conforman el síndrome metabólico; además, los participantes tenían menor ganancia de peso y se redujo la circunferencia de su cintura durante el seguimiento de los estudios.

Además, este alimento contiene probióticos que ayudan a mantener en buenas condiciones la pared intestinal, resaltó Sayon-Orea en una entrevista con la Agencia Informativa del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt). En relación con el síndrome metabólico, obesidad y sobrepeso, la especialista refirió que estudios realizaOctubre - Noviembre 2016 | CARNILAC INDUSTRIAL

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EFECTO ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DEL RESIDUO DE CAFÉ EN CARNE CRUDA Y COCIDA TECNOLOGÍA

[ Ji-Hee Kim 1, Dong Uk Ahn 1, Jong Bang Eun 2 y Sun Hee Moon 1 ]

Palabras clave : Extracto de residuo de café (ECR); antioxidante; sistema de carne.

RESUMEN El residuo del café molido obtenido después del proceso de extracción (café usado) todavía contiene varios componentes funcionales con alta capacidad antioxidante y beneficios a la salud, pero no se han hecho intentos para usarlos como una fuente para producir ingredientes alimentarios con valor agregado. Este estudio evalúa la actividad antioxidante de los extractos de etanol o agua caliente de los residuos de café después de su extracción. Un experimento de extracción se llevó a cabo usando métodos convencionales sólido-líquido, incluyendo etanol y agua como el medio de extracción a diferentes temperaturas y proporciones líquido/sólido. La actividad antioxidante de los extractos fue evaluada para el compuesto fenólico total (TPC), 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), y sustancias reactivas al ácido

Abreviaturas

Las siguientes abreviaturas se usaron en este texto: HEE Extracción con Etanol y Calor CEE Extracción con Etanol a temperatura ambiente WE Extracción con Agua Caliente

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2-tiobarbitúrico (TBARS) usando una emulsión de aceite y sistemas de carne cruda/ cocida. La actividad de captación del radical DPPH de los extractos de etanol con calor (HEE) y sin calor (CEE) fue mayor en los extractos con agua caliente (WE). El valor más alto de DPPH de HEE y CEE a 1000 ppm fue de 91.22% y 90.21%, respectivamente. La emulsión de aceite y los sistemas de carne cruda/cocida, tanto los extractos de agua como de etanol, tuvieron efectos antioxidantes similares a los del control positivo (BHA), pero los extractos de HEE y CEE mostraron actividades antioxidantes más fuertes que el extracto de WE. Estos resultados indicaron que los extractos de etanol del residuo de café tienen una fuerte actividad antioxidante y el potencial para ser usados como un antioxidante natural en la carne.

[ 1 Departamento de Ciencia Animal, Universidad del Estado de Iowa, Ames, IA 50010, USA. 2

Departamento de Ciencia y Tecnología Alimentaria, Universidad Nacional de Chonnam, Gwangju 500-757, Corea. ]

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TECNOLOGÍA Octubre - Noviembre 2016 | CARNILAC INDUSTRIAL

14 [ TECNOLOGÍA ] INTRODUCCIÓN La oxidación lipídica es reconocida como una causa principal del deterioro de la calidad de los productos cárnicos debido a que produce compuestos volátiles que pueden inducir un mal sabor y cambiar el color de la carne [1]. Los antioxidantes sintéticos como el hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), terc-butilhidroquinona (TBHQ) y el galato de propilo (PG) son comúnmente usados en productos cárnicos para prevenir cambios oxidativos [2]. Sin embargo, se ha reportado que los antioxidantes sintéticos tienen efectos carcinogénicos [2], y por ello los consumidores están preocupados por los alimentos que los contienen. Actualmente, el consumo de alimentos funcionales o antioxidantes de fuentes naturales se ha vuelto una tendencia, y se han hecho varios intentos para desarrollar antioxidantes de fuentes naturales. Los antioxidantes naturales de origen vegetal son seguros y pueden reemplazar a los sintéticos. Hierbas, gayuba, girasol y muchos otros

extractos herbales han sido ampliamente usados en alimentos para mejorar su sabor y calidad, y extender su vida de anaquel [3-7]. El café es muy conocido como una fuente rica de antioxidantes que puede reducir el estrés oxidativo en humanos. Recientemente, el consumo de café alrededor del mundo ha aumentado significativamente debido a sus efectos positivos a la salud. Miles de toneladas de residuos después de la preparación del café de grano en restaurantes, cafeterías, y a nivel consumidor son producidos anualmente en E.U., pero todos ellos son desechados. Sin embargo, cantidades significativas de antioxidantes pueden permanecer en estos residuos. Por lo tanto, si son recuperados apropiadamente, podrían ser una gran oportunidad para usarse como antioxidantes naturales [8]. En un estudio reciente, los extractos de los residuos del café preparado exhibieron actividades anti-inflamatorias, anti-tumorales y anti-alergénicas debido a la presencia de compuestos fenólicos como el ácido clorogénico, la cafeína, el ácido cafeico, trigonelina y el ácido protocatéquico [6, 9-11]. El ácido clorogénico es uno de los compuestos fenólicos más abundante en el extracto del residuo de café (ECR), y se ha reportado que tiene muchas funciones benéficas, incluyendo hepatoprotectoras, hipoglicémicas, antibacterianas, antivirales, anti-inflamatorias y anti-carcinogénicas en humanos. Se han aplicado varias técnicas de extracción para recuperar los compuestos antioxidantes de fuentes naturales y orgánicas. Los solventes como el metanol, etanol, acetona, acetato de etilo, y sus combinaciones, han sido usados para extraer los fenólicos o residuos del café, a menudo con diferentes proporciones de agua [11-18]. Entre estos métodos de extracción, los tratamientos con agua caliente y etanol fueron seguros y las técnicas de extracción más comúnmente usadas. En otros estudios, el residuo del café tostado fue extraído con

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metanol, etanol, y n-hexano, respectivamente, en una incubadora con agitación a 25 °C [6]. Los resultados indicaron que los extractos acuosos de los residuos del café tostado mostraron las mejores propiedades antioxidantes como el ácido clorogénico, cafeína y trigonelina, etc., que pueden ser principalmente atribuidas a los compuestos polifenólicos y no-polifenólicos en el extracto [6]. Xu et al. [9] mencionan que la extracción de agua subcrítica (SWE) es una tecnología efectiva para la recuperación de componentes bioactivos del café molido. Reportaron que la cantidad de fenólicos totales extraídos bajo condiciones de extracción óptima fue de 88.34 mg de equivalente de ácido gálico (GAE)/g SWE, y la actividad antioxidante fue 38.28 mmol de equivalentes de Trolox (TEs)/100g SWE. Zuorro et al. [12] reportaron que la extracción de café con etanol acuoso bajo condiciones suaves de temperatura también producía altas cantidades de compuestos fenólicos (21.56 mg GAE/g café). La combinación de microondas y etanol ayudó en la eficiencia de la extracción de los compuestos fenólicos (399 mg GAE/g de extracto, materia seca) del café, y del extracto (20 µg/mL) exhibieron una alta actividad antioxidante in vitro [20]. Mussatto et al. [13] usaron varias condiciones, incluyendo la concentración de metanol, proporción solvente/sólido, y tiempo de extracción para extraer los compuestos antioxidantes de los posos de café. Encontraron la máxima canti-

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dad de compuestos fenólicos (18 mg GAE/g) en el extracto del poso de café cuando se usó metanol al 50% en una proporción de 23 mL/g por poso de café molido. Zhang et al. [21] demostraron que la extracción asistida por microondas con etanol al 50% a 60 °C, mostró mayores valores de ácido clorogénico que otros métodos de extracción, y el rendimiento de este ácido rápidamente llegó a 6.14% dentro de los 5 min. Así, los extractos ricos en fenoles pueden ser obtenidos del café molido usando un proceso de extracción simple y ambientalmente amigable. Muchos otros métodos y condiciones para una extracción eficiente de compuestos antioxidantes del café pueden estar disponibles, los métodos de extracción deben ser seguros, baratos y eficientes. El objetivo de este estudio fue (1) investigar los potenciales antioxidantes del extracto de los residuos de café, y (2) evaluar el efecto antioxidante del extracto de los residuos de café en una emulsión de aceite y sistemas de carne cruda/cocida.

MATERIALES Y MÉTODOS Extracción de los residuos del café Los residuos después de la extracción del café molido se obtuvieron de una cafetería local y

[ TECNOLOGÍA ] 17

sodio al 10%. Después de 5 min de tiempo de reacción, 200 mL del reactivo Folin-Ciocalteu al 50% se adicionó a la mezcla. Después de 30 min, se midió la absorbancia a 750 nm. Las pruebas se realizaron por triplicado y se presentaron como mg de equivalente de ácido gálico por peso de la muestra de extracción (mg GAE/ g ECR).

Actividad de captación de radical DPPH se usaron como materia prima para extraer los compuestos antioxidantes. La extracción de los residuos de café se realizó usando etanol o agua. Para la extracción con etanol, el residuo de café (70 g) fue mezclado con 700 mL de etanol y se calentó (80 °C) o mantuvo a temperatura ambiente por 1 h, y después fue filtrado por medio de un papel filtro Whatman No. 1. El residuo fue re-extraído usando las mismas condiciones y los filtrados se combinaron. Para la extracción con agua caliente (WE), el residuo de café (70 g) fue extraído con 700 mL de agua destilada en baño maría a 80 °C y bajo las mismas condiciones.

La capacidad de captación del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) fue determinada como lo describieron Goffman et al. [23]. Una solución stock etanólica (0.4 mL) de cada muestra a diferente concentración fue añadida a 1.6 mL de solución DPPH (80 mg DPPH/L

El extracto acuoso fue directamente congelado, pero el extracto de etanol fue congelado después de remover el etanol en el extracto usando un evaporador giratorio (BUCH Rotavapor R-200, Postfach, Schwiez) bajo un sistema de vacío. Tanto los extractos acuosos como de etanol fueron liofilizados en un liofilizador (Labconco Corp., Kansas City, MO, USA) y almacenado hasta su uso.

Determinación de los compuestos fenólicos totales en el extracto El contenido fenólico total en ECR se determinó usando el reactivo Folin-Ciocalteu como lo describió Singleton et al. [22] con algunas modificaciones. Una solución etanólica stock de 200 µL (1 mg/mL) fue mezclada con 4 mL de una solución de bicarbonato de

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en 100% de etanol). Después de 30 min a temperatura ambiente, la absorbancia fue medida a 515 nm. La actividad de captación del radical fue calculada como se muestra a continuación: % de Actividad de Captación de Radical DPPH =

(1 – absorbancia de la muestra) absorbancia del blanco

x 100

Actividad antioxidante de ECR La oxidación lipídica fue medida usando los métodos de las sustancias reactivas al ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS). El efecto antioxidante de ECR en emulsión de aceite se determinó usando un método modificado de Ahn et al. [24]. Una emulsión aceite en agua que contenía 1 g de aceite de maíz (HyVee Inc., Amex, IA, USA) y 100 µL de Tween 20 en 100 mL de buffer de Tris-maleato (pH 6.8) fue preparada homogeneizándola usando un Brinkaman Polytron (Tipo PT 10/35; Brinkman Instrument Inc., Westbury, NY, USA) durante 4 min en un baño de hielo a alta velocidad. Las muestras para el ensayo de oxidación lipídica se prepararon mezclando 8 mL de emulsión de aceite, 0.5 mL de ácido ascórbico al 0.2% y 0.5 mL de 200 ppm de Fe+3 (FeCl3), y 1 mL de muestras ECR (500 o 1000 ppm) en un tubo de ensayo de 50 mL. Después del mezclado, la muestra fue incubada a 37 °C por 72 h. Un mL de la mezcla fue retirado para determinar el valor de las sustancias reactivas al ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS) a diferentes tiempos de incubación. Un mililitro de la emulsión de aceite fue mezclado con 2 mL de una solución de ácido tiobarbitúrico/ácido tricloroacético (20 mM TBA/ 15% TCA, w/v) en un tubo de ensayo desechable (13 x 100 mm), y se añadieron a 50 µL de butilhidroxianisol al 10% en etanol al 90%. Después del mezclado, la preparación fue incubada en un baño maría a 90 °C durante 15 min para desarrollar el color rosa. Después, las muestras fueron enfriadas durante 10 min en agua fría, mezcladas y centrifugadas a 3000/g durante 15 min

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a 5 °C. Se tomó 1 mL del sobrenadante para medir la absorbancia de TBARS a 532 nm contra un blanco preparado con 1 mL de etanol y 2 mL de solución TBA/TCA. Las cantidades de TBARS se expresaron como mg de malondialdehído (MDA) por L de emulsión. El efecto antioxidante de ECR en la carne cruda se determinó siguiendo el método de Ahn et al. [25]. Cinco gramos de carne cruda molida se añadieron con 15 mL de agua destilada, 50 µL de BHA y 1 mL de extractos de ECR (1000 ppm) y se homogeneizaron usando un Brinkaman Polytron durante 10-15 s a alta velocidad. El homogenizado fue incubado en baño maría a 37 °C durante 12 h. Un mililitro del homogenizado de carne cruda fue tomado a 0, 1, 3, 6, y 12 h de incubación y se determinaron las TBARS. Para el efecto antioxidante del ECR en la carne cocida, a los muslos se les retiró la piel o la grasa visible y se picaron dos veces usando una placa de 3 mm, se les añadió ECR, y después se mezclaron por 1 min en un tazón mezclador. Las hamburguesas de pollo molido (aproximadamente 50 g) se prepararon, empacaron al alto vacío individualmente en bolsas permeables al oxígeno (nylon permeable al oxígeno/bolsas de polietileno; Koch, Kansas City, MO, USA) y después se cocieron en baño maría a 90 °C (Isotemp®, Fisher Scientific Inc., Pittsburg, PA, USA) hasta que la temperatura interna de las hamburguesas llegó a 75 °C. Después de drenar el jugo de la carne, las hamburguesas cocidas se re-empacaron en bolsas permeables al oxígeno y se almacenaron en cuarto frío a 4 °C. La oxidación lipídica de las hamburguesas de pollo cocidas se determinó a 0, 1, 3, y 5 días de almacenamiento usando el método TBARS como se describió anteriormente. Las cantidades de TBARS se expresaron como miligramos de malondialdehído (MDA) por kilogramo de homogenizado de carne o carne.

[ TECNOLOGÍA ] 19 Análisis estadístico Todos los resultados se presentaron como medias ± desviación estándar (SD) y el error estándar de las medias (SEM). El análisis estadístico se realizó usando un SPSS para Windows (versión 20, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Todos los experimentos se replicaron tres veces (n=3). Los valores de las medias se compararon usando el análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido por la prueba de rangos múltiples de Duncan.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Valores del compuesto fenólico total de ECR Los compuestos fenólicos, uno de los grupos de mayor presencia de fitoquímicos, son de considerable importancia fisiológica y morfológica en plantas y tienen fuertes propiedades antioxidantes. Para evaluar el potencial de la capacidad antioxidante de los extractos del residuo de café, fue razonable determinar el contenido de fenólicos totales en etanol (HEE o CEE) y en los extractos en agua caliente (WE). Los valores de los componentes fenólicos totales de la muestra ECR fueron 41.97, 35.51, y 28.10 mg/mL para HEE, CEE y WE, respectivamente. Cuando el residuo de café se extrajo usando etanol con calor (HEE), la cantidad de compuestos fenólicos fue mayor que en los otros dos métodos (extracción con etanol a temperatura ambiente y extracción con agua caliente) (Tabla 1). Las cantidades de compuestos fenólicos encontrados en el ECR fueron tan altas como las de los demás en comparación [12, 13, 26]; algunas diferencias en los compuestos fenólicos podrían ser atribuidos al proceso de extracción del café, el tostado y la variedad de productos de café utilizados. Mussatto et al. [13] reportaron que el uso de metanol como solvente orgánico

dió mejores resultados de extracción que con el uso de sólo agua destilada. Esto puede deberse a la baja solubilidad de los compuestos fenólicos en agua polar que en el solvente orgánico [13]. Otros investigadores también reportaron que el etanol y metanol tienen mejor capacidad de extracción para los compuestos fenólicos de la yerba mate negra, extracto de la cáscara de cítricos y mashua que el agua destilada [13, 27-29]. La alta capacidad de extracción del etanol está relacionada con la estructura química de los compuestos fenólicos que contienen grupos hidroxilo, benzoico y cetonas en su estructura [30, 31]. Este resultado indicó que el residuo del café destilado todavía contiene una cantidad significativa de compuestos fenólicos y que puede ser usado como fuente de antioxidantes fenólicos.

Actividad de captación de radical DPPH Algunos métodos son más efectivos y específicos que otros en evaluar la actividad antioxidante de las muestras. Así, es fuertemente aconsejable usar más de un método para determinar el potencial antioxidante de una muestra apropiadamente e interpretar mejor los resultados [32]. Este estudio usó DPPH y los métodos TBARS para determinar la actividad antioxidante de ECR en los sistemas modelo al igual que en carne. El extracto acuoso (WE) mostró una alta actividad de captación del radical DPPH a una alta concentración (1000 ppm). En menores con-

Muestra

Conc. (ppm)

HEE

TPC (mg GAE actividad/g ECR) 41.97a ± 2.49

CEE

Tabla 1. Valores de los compuestos fenólicos totales de las muestras de extracto del residuo de café (ECR).

1000

35.51b ± 2.93 28.10c ± 0.76

Medias con diferentes letras en una columna son significativamente diferentes entre los métodos de extracción (p < 0.05); HEE: extracción con etanol y calor; CEE: extracción con etanol a temperatura ambiente; WE: extracción con agua caliente.

a-c 1

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Conc. (ppm)

Muestra

SEM2

250

500

1000

HEE1

38.16ax ± 1.33

72.15ay ± 1.37

90.39az ± 0.14

7.66

CEE

37.10ax ± 1.28

69.39ay ± 0.67

89.05az ± 0.74

7.58

12.03 ± 2.76

28.86 ± 1.52

55.42 ± 0.75

6.34

SEM

4.28

7.00

5.74

Medias con diferentes letras minúsculas en una columna son significativamente diferentes entre los métodos de extracción (p < 0.05); x-z Medias con diferentes letras mayúsculas en una fila son significativamente diferentes entre las concentraciones de las muestras (p < 0.05); 1HEE: extracción con etanol y calor; CEE: extracción con etanol a temperatura ambiente; WE: extracción con agua caliente; 2 SEM: error estándar de la media. a,b

Tabla 2. Actividad de captación de radical DPPH del ECR con diferentes concentraciones.

Tabla 3. Efecto antioxidante del extracto el residuo de café sobre los valores de las sustancias reactivas al ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS) (mg de malondialdehído (MDA)/L de emulsión de aceite) del sistema modelo de emulsión de aceite.

Muestra

Con. (ppm)

Control1 BHA HEE CEE WE SEM

centraciones, sin embargo, la actividad antioxidante no fue significativamente diferente (p < 0.05). El ECR preparado con etanol tuvo una mayor actividad de captación del radical DPPH que con agua. La actividad de captación del radical DPPH de HEE y CEE no fueron significativamente diferentes (p < 0.05) a niveles de 250 a 1000 ppm (Tabla 2). El valor DPPH de HEE y CEE oscilaron de 38.16 a 90.39% y 37.10 a 89.05% a una concentración de 250 a 1000 ppm. Sin embargo, WE de ECR mostró relativamente una baja actividad de captación del radical de 12.03, 28.86 y 55.42% a un nivel de 250, 500 y 1000 ppm, respectivamente (Tabla 2).

yores actividades de captación del radical DPPH que WE, con el extracto de etanol con calor mostró el más alto nivel de actividad de captación de radicales libres. Estos resultados implicaron que el etanol y particularmente el etanol caliente extrajo cantidades mayores de compuestos con alta actividad antioxidante. También, los resultados de Krings et al. [33] mostraron que los extractos etanólicos de algunos tostados son una fuente económica de antioxidante natural en los subproductos. Illy et al. [34] reportaron que los extractos de café fueron más activos que los extractos de cocoa o té negro en retrasar la oxidación de lipoproteínas de baja densidad.

Estos resultados indicaron que todos los ECR tienen una considerable capacidad de captación del radical DPPH. El HEE y CEE exhibieron ma-

Actividad antioxidante de ECR en el sistema de emulsión de aceite La Tabla 3 ilustra la actividad antioxidante de

Tiempo de incubación (h) 0

SEM2

0.066av

0.094aw

0.182ax

0.292ay

0.309ay

0.365az

0.027

0.031

0.034

0.038

0.047

0.056

0.081

0.005

cwv

500

0.025

0.040

0.051

0.052

0.056

0.082

0.004

1000

0.027bv

0.039cw

0.048cy

0.049cy

0.078cz

0.003

500

0.026

0.040

0.031

0.048

0.061

0.089

0.005

1000

0.027bv

0.042cw

0.050cx

0.061cy

0.086cz

0.004

500

0.034

0.075

0.145

0.222

0.284

0.326

0.025

1000

0.033bv

0.096aw

0.112bw

0.214bx

0.277by

0.331bz

0.026

0.003

0.005

0.012

0.020

0.024

0.026

abw

Medias con diferentes letras en una columna son significantemente diferentes entre los métodos de extracción y concentración (p < 0.05); u-z: Medias con diferentes letras en una fila son significativamente diferentes entre los tiempos de incubación (p < 0.05); 1Control: sin muestra de extracción; BHA: Solución BHA con 50 ppm; HEE: extracción con etanol y calor; CEE: extracción con etanol a temperatura ambiente; WE: extracto con agua caliente; 2SEM: error estándar de la media. a-c

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[ TECNOLOGÍA ] 21

ECR sobre los valores TBARS del sistema de emulsión de aceite durante 72 h a 37 °C. La estabilidad de la emulsión de aceite es una de las partes más importantes de este experimento. Las mezclas de tensoactivos, por ejemplo tween-20, pueden ser más efectivas en la emulsificación y estabilización de la emulsión de aceite. Durante el tiempo de incubación, no hay cambios visibles o físicos en las muestras de emulsión de aceite. A 0 h, se encontró que los valores TBARS fueron los mismos para todos los tratamientos y aumentó significativamente con el aumento del tiempo de incubación. Los valores TBARS del control (muestra sin extracto) aumentó rápidamente de 0.066 a 0.365 mg MDA/L de la emulsión de aceite. Sin embargo, todos los ECR exhibieron valores significativamente menores de TBARS que el control. Los valores TBARS del extracto WE aumentaron de 0.033 a 0.331 mg MDA/L (1000 ppm) durante las 72 h de tiempo de incubación, pero fue todavía significativamente menor que el control (p < 0.05). El HEE y CEE mostraron actividad antioxidante similar a BHA (50 ppm). Concentraciones mayores de los extractos de HEE y CEE, sin embargo, no mejoraron la actividad antioxidante significativamente entre 500 y 1000 ppm. Después de una incubación de 72 h, HEE y CEE de 500 a 1000 ppm mostraron 75.6% - 78.6% valores menores de TBARS que el control. HEE y CEE a 500 ppm fue tan efectivo como 500 ppm de BHA, indicando que pueden ser buenos antioxidantes para emulsión de aceite. Estos resultados demostraron que HEE y CEE tienen una potente actividad antioxidante en emulsión de aceite.

preparación del café. Por otra parte, los extractos acuosos exhibieron mayores actividades antioxidantes que los extractos de solventes en estudios previos [6, 13]. Las diferencias entre la materia prima, incluyendo las condiciones de tostado, composición del grano, condiciones de cultivo, y métodos de preparación pudieron tener un efecto sobre la cantidad de fenólicos remanentes en los residuos de café [6, 15].

Actividad antioxidante de ECR en los sistemas cárnicos Método TBARS de homogeneizados de carne cruda

La Tabla 4 muestra la actividad antioxidante de ECR en homogeneizados de carne cruda.

Franco et al. [35] reportaron que el etanol fue mejor que cualquier otro solvente en extraer los compuestos antioxidantes de materiales vegetales. Nuestros resultados también mostraron que el agua tuvo un menor poder de extracción que el etanol debido a que la mayoría de los compuestos antioxidantes solubles en agua ya fueron extraídos durante el proceso de

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22 [ TECNOLOGÍA ]

Muestra

Con. (ppm)

Control1

Tiempo de incubación (horas)

SEM2

0.190ax

0.363ay

0.454az

0.436az

0.469az

0.027

BHA

0.150b

0.191e

0.193e

0.191d

0.192e

0.006

HEE

500

0.202

0.267

0.261

0.267

cdy

0.227

0.007

100

ayx

0.202

0.228

0.237

dzy

0.219

dex

0.196

0.004

500

0.202ay

0.313bz

0.304cz

0.351bz

0.298bz

0.014

1000

0.202

0.272

0.256

0.258

dey

0.215

0.008

500

0.202ax

0.309by

0.377bz

0.363bz

0.284by

0.017

1000

0.202

0.273

0.291

0.286

0.249

0.009

0.008

0.010

0.016

0.01

0.018

CEE WE SEM

dz dz

Medias con diferentes letras en una columna son significantemente diferentes entre los métodos de extracción y concentración (p < 0.05); x-z: Medias con diferentes letras en una fila son significativamente diferentes entre los tiempos de incubación (p < 0.05); 1Control: sin muestra de extracción; BHA: Solución BHA de 50 ppm; HEE: extracción con etanol y calor; CEE: extracción con etanol a temperatura ambiente; WE: extracción con agua caliente; 2SEM: error estándar de la media. a-e

Tabla 4. Valores TBARS (mg MDA/kg de homogenados de carne cruda) de homogenados de carne con diferentes muestras de ECR durante almacenamiento a 37 °C.

Los valores TBARS del control (sin extractos) aumentaron significativamente (p < 0.05) durante las primeras 3 h de incubación y después permaneció igual. El homogenizado de carne con BHA no mostró ningún cambio en TBARS durante la incubación. Los TBARS de HEE y CEE aumentaron significativamente durante 1 h de incubación y después permanecieron igual o disminuyeron después de 12 h de incubación. El TBARS de WE disminuyó durante las 3 h de incubación y posteriormente disminuyó después de 12 h. Los valores TBARS de BHA fueron los más bajos entre los tratamientos, indicando que 50 ppm de BHA tuvieron antioxidantes más fuertes que 500 y 1000 ppm de los tratamientos HEE, CEE o WE. Sin embargo, todos los otros tratamientos también mostraron efectos antioxidantes significativos (p < 0.05) durante la incubación. Para todos los ECR (HEE, CEE y WE) de 1000 ppm mostraron efectos antioxidantes más fuertes que 500 ppm. Wong et al. [36] demostraron que la adición de vitamina E a 25-100 µg/g o extracto herbal a 30 µg/g en homogenizado de carne de res cocida mostró una inhibición dependiente de la concentración de la peroxidación lipídica. Estos resultados sugirieron que el ECR puede ser efectivo en retrasar la oxidación lipídica en carne cruda.

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Entre los extractos de etanol y de agua, los primeros mostraron fuertes efectos antioxidantes a la misma concentración debido a que los solventes orgánicos son más eficientes en extraer los compuestos orgánicos del residuo de café. Entre los extractos de temperatura alta (calor) o temperatura ambiente, el extracto de temperatura alta mostró un efecto antioxidante más fuerte que el extracto a temperatura ambiente. Muchos documentos han indicado que el residuo de café todavía contiene cantidades significativas de compuestos fenólicos [6, 8, 11-13]. La carne con valores de TBARS >2.0 puede producir un sabor desagradable que los consumidores comunes pueden reconocer [3]. Los valores TBARS del homogenizado de carne con ECR son <1.0 mg/kg, lo cual está dentro del nivel aceptable.

Sistema modelo de carne cocida usando el método de TBARS El efecto antioxidante de ECR y del BHA en la carne cocida (hamburguesas de carne molida de res) se muestra en la Tabla 5. Al día 0, el valor TBARS del control fue significativamente mayor que en el de los otros tratamientos. El TBARS de la carne cocida rápidamente aumentó durante el almacenamiento, especialmente en el con-

[ TECNOLOGÍA ] 23

trol. La carne cocida añadida con 140 ppm de BHA casi detuvo la oxidación lipídica durante el periodo de 5 días de almacenamiento. Los tratamientos de ECR mostraron efectos antioxidante variados dependiendo de los métodos de extracción usados: el extracto HEE mostró el efecto más fuerte y el extracto WE mostró el efecto antioxidante más débil entre los ECRs. Todos los tratamientos del ECR mantuvieron niveles bajos de valores TBARS después de 1 día de almacenamiento, pero los valores TBARS aumentaron significativamente después de 3 días de almacenamiento. El efecto antioxidante de 140 ppm de BHA fue significativamente mayor que cualquiera de los valores ECR. Es difícil explicar por qué ECR no exhibió tal actividad antioxidante como la mostrada en la emulsión de aceite o en los sistemas homogenizados de carne cruda. Sin embargo, parece que el poder oxidativo de la carne cocida es mucho más fuerte que la capacidad antioxidante del ECR, y la oxidación no pudo ser detenida únicamente con ECR. Mc Carthy et al. [37] y Ahn et al. [38] reportaron que los extractos de fuentes naturales mostraron efectos antioxidantes fuertes en sistemas modelo de aceite vegetal, grasa o proteína [39]. Los ingredientes alimentarios como las catequinas del té (0.25%), romero (0.10%) y salvia (0.05%) fueron efectivas en reducir la oxidación lipídica en hamburguesas fabricadas de carne de puerco previamente congelada [37]. Lee et al. [40] mostraron que la hoja de mostaza posee una actividad antioxidante en alimentos debido a su alto contenido de compuestos fenólicos. También, los extractos de clavo y semilla de uva tuvieron fuertes efectos antioxidantes en los valores TBARS en filetes de carpa plateada [41]. El resultado de ECR en los sistemas de carne cocida fue apenas diferente de otros sistemas (emulsión de aceite u homogenizado de carne cruda). Sin embargo, el ECR no tiene un potencial antioxidante lo suficientemente fuerte para prevenir la oxidación lipídica de la carne cruda, este todavía mostró

Muestra

Con. (ppm)

Control1

Tiempo de almacenamiento (días)

SEM2

0.105ax

0.393ay

0.807az

0.790az

0.063

BHA

140

0.022cy

0.026dy

0.040dz

0.039dz

0.001

HEE

1000

0.025

0.076

0.197

0.263

0.020

CEE

1000

0.031

0.121

0.380

0.396

0.034

1000

0.029bw

0.128bx

0.396by

0.494bz

0.023

0.005

0.023

0.048

SEM

cw bx

Medias con diferentes letras en una columna son significantemente diferentes entre los métodos de extracción (p < 0.05); w-z: Medias con diferentes letras en una fila son significativamente diferentes entre los tiempos de incubación (p < 0.05); 1Control: sin muestra de extracción; BHA: Solución BHA con 140 ppm; HEE: extracción con etanol y calor; CEE: extracción con etanol a temperatura ambiente; WE: extracción con agua caliente; 2SEM: error estándar de la media. a-d

una actividad antioxidante mayor que el control. Estos resultados indicaron que la actividad de estos antioxidantes retrasó la oxidación lipídica en las hamburguesas de carne cruda durante el almacenamiento.

Tabla 5. Valores TBARS (mg MDA/kg de hamburguesas de carne cocida) de hamburguesas de pollo cocidas con diferentes muestras de ECR durante el almacenamiento a 4 °C.

CONCLUSIONES Este estudio indicó que los extractos de etanol y agua del residuo de café mostraron actividad antioxidante significativa y capacidad de captación del radical DPPH. Entre los tres métodos diferentes de extracción, HEE fue el mejor método para extraer los compuestos antioxidantes de los residuos de café. HEE fue efectivo en prevenir la oxidación lipídica en emulsión de aceite y en sistemas de carne cruda, pero no fue lo suficientemente fuerte para prevenir los cambios oxidativos en carne cocida empacada en bolsas permeables al oxígeno por más de 3 días. Esto sugirió que los residuos del café después de su extracción tienen el potencial para ser usados como una fuente de antioxidantes naturales. Fuente: Antioxidants 2016

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TECNOLOGÍA

PERSPECTIVAS SOBRE EL POTENCIAL PROBIÓTICO DE BAL EN ALIMENTOS Y BEBIDAS FERMENTADAS TRADICIONALES

Palabras clave : Antimicrobianos; probióticos; bacteria ácido-láctica; alimentos fermentados.

[ Mduduzi Paul Mokoena *, Taurai Mutanda y Ademola O. Olaniran ]

RESUMEN Diversos alimentos y bebidas fermentados tradicionales africanos, producidos usando diferentes tipos de fermentación, han sido usados desde la antigüedad debido a sus numerosos valores nutricionales. Los aislados de bacteria ácido-láctica (BAL) de estos productos han emergido como una fuente importante de antimicrobianos y terapéuticos, y son aceptados como probióticos. Los probióticos se definen como suplementos alimentarios microbianos vivos que afectan benéficamente al huésped mejorando el balance microbiano intestinal. Actualmente, los probióticos

populares se derivan de productos lácteos fermentados. Sin embargo, con el crecimiento del número de consumidores con intolerancia a la lactosa que son afectados por el colesterol dietario de los productos lácteos, hay un creciente interés global en los probióticos de otras fuentes alimentarias. El objetivo de esta revisión es proporcionar una visión general de los desarrollos recientes en las aplicaciones de probióticos BAL a nivel global, y específicamente enfatizar la idoneidad de los alimentos y bebidas fermentados africanos como una fuente viable de nuevos probióticos.

[ * Disciplina de Microbiología, Escuela de Ciencias de la Vida, Colegio de Agricultura, Ingeniería y Ciencia, Universidad de KwaZulu-Natal (Campues Westville), Durban, Sudáfrica. ]

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La fermentación tradicional es una forma de procesamiento de alimento alcanzada usando microorganismos, especialmente bacterias ácido-lácticas (BAL) y levaduras. Aunque es una tecnología de conservación de alimentos antigua, todavía es parte de la norma cultural normalmente practicada a nivel local y del hogar entre las comunidades indígenas en África y la mayor parte de los países en desarrollo (1-3). A diferencia de su contraparte sin fermentar, los alimentos fermentados son preferidos por los consumidores debido a sus características de gusto, textura y color (4). Los alimentos y bebidas fermentados tradicionales en países en desarrollo constituyen uno de los componentes principales de la dieta, con algunos de ellos siendo usados como comidas ligeras o refrigerios. Los aislados de BAL de varios alimentos fermentados producen ácidos orgánicos y una alta diversidad de agentes antimicrobianos, que son responsables para el mantenimiento de la calidad y palatabilidad de los alimentos fermentados. A nivel local, las BAL son usadas en las comunidades africanas para producir una variedad de alimentos fermentados que incluyen papillas a base de cereales, bebidas, frutas y vegetales (incluyendo raíces y tubérculos), leches y carnes (4, 5). De los varios tipos de fermentaciones usados para obtener alimentos y bebidas, las fermentaciones alcohólicas ácido-lácticas son las más populares. Otros tipos son la fermentación alcalina y la fermentación amino-ácida (5). El rol de las BAL en el mejoramiento de la vida de anaquel y la calidad nutricional de los alimentos y bebidas fermentadas, controlar la diarrea, al igual que las propiedades antimicrobianas han sido establecidas (6-9). Sin embargo, a pesar del aumento en el interés en probióticos BAL, hay escasez

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de documentos con respecto a los nuevos y emergentes usos de BAL como probióticos, especialmente en el continente africano. Adicionalmente, una regulación estricta por cuerpos internacionales ha generado productos probióticos limitados pasando la etapa de pruebas clínicas. Las comunidades rurales son conocidas por ser consumidoras de alimentos fermentados cargados de microflora probiótica, de las cuales se derivan los beneficios a la salud. Este documento revisa diferentes alimentos y bebidas fermentados tradicionales típicos en África que son fuentes potenciales de nuevos probióticos, y explora el progreso global en el aislamiento de candidatos probióticos BAL. Las aplicaciones de BAL como agentes antidiabéticos, agentes reductores de colesterol, agentes moduladores de sistema inmunológico, y como vehículos de liberación de fármacos al igual que sus nuevas aplicaciones en el bienestar mental y emocional de humanos se discutieron a detalle.

FERMENTACIÓN DE ALIMENTOS Y BEBIDAS POR BAL Los alimentos fermentados han sido parte de la dieta humana desde los albores de la civilización humana, y han sido usados como un medio de mejora de la vida de anaquel, seguridad, digestibilidad y valor nutricional por más de 6,000 años (10-16). La fermentación ácido-láctica de los alimentos es un proceso por el cual los microorganismos y sus enzimas son usados para convertir los azúcares fermentables en el sustrato del alimento en ácido láctico principalmente y otros productos limitados. La fermentación es ampliamente usada para la conservación de alimentos en hogares y en las industrias alimentarias para desarrollar una variedad de productos alimentarios (13). Esta tecnología de

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preservación de alimentos es barata; por ello, es de importancia económica en países en desarrollo (4). Los microorganismos responsables para la fermentación pueden ser la microflora autóctona presente en los sustratos, o pueden ser añadidos como cultivos iniciadores después de la cocción o preparación del alimento o bebida. La fermentación de los alimentos tradicionales es llevada a cabo principalmente por BAL, que ha ganado el estatus de “generalmente considerado como seguro” (GRAS). La fermentación mejora las propiedades organolépticas de los alimentos y su aceptabilidad general. Los productos alimentarios fermentados populares en África incluyen leches fermentadas, papillas agrias, y bebidas alcohólicas y no alcohólicas (17). Los cereales son globalmente un alimento básico y pueden ser procesados por medio de la fermentación para adquirir modificaciones deseables de gusto, sabor, acidez y digestibilidad alimentaria (4). Existe una vasta diversidad de alimentos y bebidas fermentadas tradicionales africanas distribuidas por todo el continente. Adicionalmente a los varios productos vegetales fermentados, las carnes y pescados fermentados forman parte de la dieta africana y también de la dieta de otras partes del mundo (18-21), aunque estas todavía no son comunes. Sin embargo, las carnes fermentadas pueden ser proveedoras adecuadas de bacterias probióticas si son apropiadamente aplicadas. Los productos cárnicos fermentados son definidos como carne que es inoculada con un cultivo iniciador microbiano durante el procesamiento bajo condiciones controladas para dar características deseables. La fermentación de la carne también puede ser alcanzada permitiéndole que se fermente espontáneamente por microflora natural de la flora de la carne. Una revisión reciente (22)

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discute la aplicación de tecnologías nuevas y cultivos microbianos en el desarrollo de carnes fermentadas funcionales. Zakpaa et al. (19) establecieron que la composición de la microflora de la carne fermentada ghanesa consiste de especies BAL, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., y Micrococcus spp. De estas, Streptococcus spp. y Staphylococcus spp son caracterizadas como patogénicas, y las especies BAL y Streptococcus spp., como probióticos. Estos resultados sugieren que el uso de un cultivo iniciador probiótico robusto puede ser útil en el mejoramiento de la calidad de carnes fermentadas, ya que puede inhibir el crecimiento potencial del organismo patogénico. La fermentación es uno de los métodos más importantes en la preserva-

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ción de pescado en muchas partes del mundo y particularmente en las regiones costeras de los países africanos (21). Los procesos de fermentación aplicados son generalmente autóctonos y adaptables a la cultura de la gente. Sin embargo, la falta de estandarización de los métodos de proceso y los niveles de higiene comprometen la seguridad y calidad de los productos pesqueros fermentados en África. Así, más investigadores necesitan estar dedicados para encontrar soluciones a estos temas. Los alimentos fermentados son producidos usando técnicas de manufactura, materias primas y microorganismos diferentes, dependiendo de las materias primas dis-

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ponibles y las prácticas locales. Sin embargo, los cuatro procesos de fermentación principales son la fermentación alcohólica, ácido-láctica, ácido-acética y alcalina. Mientras que la mayoría de estas fermentaciones son llevadas a cabo por una bacteria, en la fermentación alcohólica las levaduras son los organismos predominantes usados para la producción de bebidas que contienen etanol, como los vinos y las cervezas, donde las BAL juega un rol limitado (4). Las BAL son críticas en la producción de la mayoría de los alimentos y bebidas fermentados, pero hay una escasez de conocimiento sobre los beneficios específicos a la salud que los alimentos le confieren a los consumidores y las características de la cepas de bacterias usadas para su producción. Además, los documentos de microbios probióticos de diferentes alimentos fermentados de África que han encontrado aplicaciones en las industrias alimentaria y farmacéutica son escasos.

DIVERSIDAD DE ALIMENTOS Y BEBIDAS FERMENTADAS TRADICIONALES AFRICANAS Y LOS MICROBIOS ASOCIADOS Ogi, iru y gari son alimentos fermentados nigerianos que han sido comercializados; el resto todavía está siendo producido a nivel local. Ogi es un producto fermentado de maíz o sorgo o de granos de mijo. Iru es un producto fermentado del garrofin africano y Gari es un producto de yuca fermentada, producido pelando las raíces frescas, pasándolas por una rejilla para hacerlas puré y poniéndolas en sacos de fermentación (23). Los organismos principales usados para la fermentación en estos productos son BAL y levaduras. Borde y Shamita son importantes bebidas fermentadas tradicionales etíopes, produci-

das por una fermentación durante la noche de ciertos cereales predominantemente por BAL (24). BAL asociado con la fermentación de Borde y Shamita tiene propiedades antimicrobianas contra varios patógenos transmitidos por alimentos; los productos inhibitorios son extracelulares y difusibles. Togwa es una bebida fermentada de Tanzania que puede ser preparada con yuca, maíz, sorgo, y mijo o sus combinaciones. Las levaduras y BAL son los microorganismos predominantes encontrados en togwa (25). Amasi o leche agria, umqombothi o cerveza de sorgo, y amahewu, una masa de maíz fermentada no alcohólica, son alimentos y bebidas sudafricanos. Amasi es producida usando una BAL específica como el Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus spp. Amahewu es producido con cultivo iniciador BAL, mientras que umqombothi es producido del maíz y sorgo vía fermentación de levadura salvaje, y las BAL de los adjuntos de sorgo malteados que desempeñan un rol limitado (7). Las bebidas fermentadas como aquellas obtenidas de frutas de marula usando levadura y BAL son populares en partes de las provincias de Limpopo y Mpumalanga en Sudáfrica. La papilla agria es maíz o sorgo, que es fermentado usando principalmente BAL para mejorar y desarrollar palatabilidad, sabor y nutrición (26). Chibuku es una cerveza de sorgo tradicional zimbabuo producida comercialmente por fermentación de levadura de sorgo (9), mientras que mabisi, munkoyo, y chibwantu son alimentos y bebidas tradicionales zimbabuos producidas mediante fermentaciones de levadura y ácido láctica (27). La producción de estos alimentos fermentados tradicionales depende de la disponibilidad desde la infraestructura hasta el almacenamiento y transporte del producto. El

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aislamiento y filtración de los microorganismos de fuentes naturales han sido los medios más efectivos para obtener cepas genéticamente estables y robustas para los productos alimentarios importantes industrialmente (28, 29). Sin embargo, la diversidad microbiana de los diferentes alimentos fermentados de las diferentes localidades en África todavía necesita ser caracterizada usando más herramientas confiables como la secuenciación de próxima generación y otras técnicas moleculares. Esto permitirá la selección de más microorganismos probióticos robustos con características deseables para ser usados como cultivos iniciadores y asegurará la seguridad de los alimentos y bebidas y productos farmacéuticos.

ROL E IMPORTANCIA DE BAL EN LOS ALIMENTOS FERMENTADOS TRADICIONALES Tabla 1. Una revisión de algunas de las aplicaciones de las cepas de BAL elegidas.

Rol general de BAL La fermentación puede ser la forma más sim-

ple y económica de mejorar el valor nutricional, propiedades sensoriales y cualidades funcionales del cereal disponibles a nivel de comunidad local (15, 30). La fermentación ácido-láctica de los cereales ha sido usada como una estrategia para disminuir el contenido de anti-nutrientes, como fitatos y taninos, y para mejorar la biodisponibilidad de los micronutrientes (31). Muchas bacterias asociadas con alimentos fermentados producen moléculas bioactivas antimicrobianas, como el peróxido de hidrógeno, ácidos orgánicos, y bacteriocinas, que los hacen bioconservadores efectivos (12, 32) y producen nutracéuticos que crean alimentos funcionales con una biodisponibilidad aumentada de nutrientes (33, 34). La Tabla 1 presenta una revisión de algunas de las varias aplicaciones de aislados de BAL.

BAL como probióticos Las BAL comprenden un componente significativo de la flora intestinal humana y tiene varios roles benéficos en el tracto gastroin-

Cepa(s) BAL

Aplicaciones

Referencias publicadas

Lactobacillus rhamnosus

Reducción de riesgo de caries dental

(63, 123)

L. casei

Mitigación de diabetes tipo II y obesidad

(67, 124)

Bifidobacterium longum SPM 1207; Lactobacillus spp.

Disminución de colesterol y lipoproteínas de baja densidad

(77, 80, 83)

Lactobacillus spp.

Inhibición de Listeria monocytogenes & Clostridium spp.

(20, 90)

Lactobacillus reuteri; L. plantarum

Agentes anti-fúngicos

(3, 20, 92)

L. casei, L. plantarum

Vehículo de liberación de fármacos

(93, 97, 98, 101)

L. acidophilus, L. salivarius, L. rhmnosus, L. brevis, L. casei

Modulación de sistema inmunológico y salud mental

(39, 42, 53, 115)

Lactobacillus spp.

Reducción de micotoxinas en productos de maíz fermentados

(7)

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testinal. Así, un mejor entendimiento de las poblaciones de microflora intestinal contribuirá al desarrollo de nuevas estrategias para la prevención y/o tratamiento de varias enfermedades (35). Los probióticos son suplementos alimentarios de microbios vivos que afectan benéficamente al huésped mejorando el balance de microflora intestinal (36-38). Las BALs probióticas pertenecen al género Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, y Leuconostoc (39, 40). Los probióticos son consumidos en forma de yogurt, leches fermentadas, y otros alimentos fermentados (37, 41). Estos productos que contienen microorganis-

mos vivos han sido tradicionalmente usados para restaurar la salud intestinal (42). Así, la bacteria conocida como probiótica debido a su impacto positivo en la salud humana y el bienestar han sido añadidos han varios alimentos por las últimas décadas (42, 43). La bacteria probiótica del género Lactobacillus está inherentemente presente en los alimentos fermentados y muchas enfermedades causadas por patógenos que invaden el tracto gastrointestinal pueden ser prevenidas manteniendo la flora intestinal apropiada consumiendo probióticos o alimentos fermentados. Los probióticos tienen un gran potencial para mejorar la nutrición, calmar

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trastornos intestinales, mejorar el sistema inmunológico, optimizar la ecología intestinal, y promover la salud en general debido a su capacidad de competir con patógenos por los sitios de adhesión, antagonizar patógenos o modular la respuesta inmunológica del huésped (33, 43, 44). Las especies Bifidobacterium son estrictamente anaeróbicas, habitan en el intestino grueso, y más de 30 especies han sido identificadas. Estos microbios son añadidos en fórmulas lácteas para bebés y productos lácteos como el yogurt y su crecimiento en el intestino grueso es estimulado por prebióticos de la dieta. Ayudan en el metabolismo de la lactosa, la generación de iones lactantes del ácido láctico y síntesis de vitaminas (40,45). Generalmente, la bacteria probiótica no coloniza el tracto intestinal humano permanentemente, pero algunas cepas son capaces de colonizar transitoriamente y modular la microbiota autóctona (42). Las BALs son organismos altamente benéficos para los humanos y su uso debe ser promovido para la buena salud. Las cepas microbianas probióticas candidatas deben satisfacer el criterio de seguridad, producción o manufactura, administración y aplicación, y sobrevivencia y colonización en el huésped (46). Los experimentos in vitro son usados para investigar si la cepa microbiana elegida cumple estos criterios y permite la filtración de microorganismos para su potencial como cepa probiótica (46). Los probióticos potenciales son sujetos posteriormente a experimentos in vivo para validar su eficacia. Con respecto a esto, se ha demostrado experimentalmente que alimentando polluelos con cultivo probiótico basado en BAL después de que fueran enfrentados con Salmonella enteritidis o Salmonella typhimurim redujeron significativamente su recuperación de Salmonella (47). Similarmente, se

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ha demostrado que el pez alimentado con dietas suplementadas con probióticos presentaron mayores índices de crecimiento y rendimiento de alimentación que aquellos alimentados con la dieta control (48). Los aislados de probióticos BAL de muestras de alimentos fermentados exhiben excelentes actividades antimicrobianas contra las bacterias y hongos patogénicos (3). La bacteria con tan notables propiedades probióticas puede ser usada como una fuente potencial de probióticos para uso en preparaciones farmacéuticas, y como alimentos funcionales para mejora de la salud pública. Los países en desarrollo en Asia y África tienen una diversidad rica en alimentos y bebidas fermentados que pueden ser explotados para aislarse de tales probióticos nuevos.

El rol de BAL en la modulación de sistema inmune y salud mental La mayoría de los alimentos probióticos contienen BAL que pertenece al género

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Lactobacillus pero no es exclusivo (39). Algunas cepas de probióticos son capaces de estimular y regular varios aspectos de la naturaleza y adquieren respuesta inmunológica, aunque las diferencias en la capacidad de las cepas Bifidobacterium y Lactobacillus para influir en el funcionamiento del sistema inmunológico se han reportado (33). Las interacciones de estos probióticos y sus capacidades metabólicas únicas son críticas para su capacidad de colonizar el tracto gastrointestinal y modulación del sistema inmunológico. Más de 100 especies de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus rhamnous, Lactobacillus brevis, y Lactobacillus casei han sido caracterizados e identificados. Están implicados en la mejora de la inmunidad innata y adquirida al igual que como causa de inhibición de los mediadores pro-inflamatorios (49). Los microorganismos probióticos protectores previenen que los patógenos se adhieran al intestino compitiendo por los sustratos y lugares de adhe-

sión, la producción simultánea de moléculas antibacteriales, y la producción simultánea de anticuerpos específicos y moco. Así, una colonización inicial del intestino con bacterias probióticas es crítico para el desarrollo de la barrera protectora del intestino. Varios estudios han indicado que las BAL juegan un rol positivo en la modulación del sistema inmunológico del huésped y monitoreo de las actividades antimicrobianas contra los patógenos transmitidos por alimentos y en prevenir y tratar la diarrea (11, 28, 33, 34, 50, 51). El conocimiento actual del rol de la bacteria probiótica en los sistemas humano y animal es preliminarmente parcial debido a la complejidad del ecosistema gastrointestinal y el aumento de la variedad de cepas consideradas como probióticas (52). Sin embargo, estos mecanismos pueden ser multifactoriales y cada cepa probiótica puede tener funciones específicas afectando al huésped. La bacteria probiótica específica es conocida por modular las respuestas inmunológicas sistémicas y locales, aunque los mecanismos de modulación inmunológica todavía no están completamente dilucidados. Sin embargo, hay un conocimiento de que los componentes bacterianos son reconocidos por el sistema inmunológico por medio de sus interacciones con receptores específicos, resultando en la modulación de las respuestas inmunológicas (42). Otro estudio (53) sugiere que hay una conexión entre los microbios que habitan el intestino humano y muchos aspectos de la fisiología, incluyendo la salud cerebral. Los autores puntualizan que la fermentación altera los compuestos dietarios en los alimentos y mantienen que los químicos enriquecidos con la fermentación (lactoferrina, péptidos bioactivos) y los nuevos fitoquímicos recién formados como flavonoides únicos pueden actuar hasta la microflora

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intestinal humana. Por lo tanto sugieren que el consumo de alimentos fermentados tiene un potencial que afecta positivamente la salud humana y el bienestar mental estimulando las acciones de la microflora intestinal, vía producción de químicos bioactivos y neuropéptidos que se manifiestan por medio del aumento en el comportamiento antioxidante y antiinflamatorio, y la reducción de la permeabilidad intestinal. Otros estudios establecen que la agmatina y otras poliaminas asociadas con carnes, pescados y ciertas bebidas fermentadas, tienen beneficios relacionados con la salud cerebral (54, 55). Todos estos estudios enfatizan los

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grandes pasos que ya se han hecho en el rol de los alimentos y bebidas probióticas en la fisiología humana.

BAL COMO FUENTE DE AGENTES ANTIMICROBIANOS Bacteriocinas de BAL Las bacteriocinas son un grupo heterogéneo de potentes péptidos antimicrobianos principalmente activos contra organismos estrechamente relacionados, en su mayoría bacterias gram-positivo (84). Se sintetizan ribosomalmente durante la fase principal

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de crecimiento (85). Las bacteriocinas son pequeñas moléculas catiónicas de aproximadamente 30-60 aminoácidos, formando hélices anfifílicas y estable a 100 °C por 10 min. Así, varían en espectro de actividad, modo de acción, peso molecular (MW), origen genético y propiedades bioquímicas (86). Se clasifican en tres grupos: lantibióticos, no lantibióticos de baja MW, y lantibióticos de mayor MW (87). Las cepas de BAL que producen bacteriocinas se protegen de sus propias toxinas por la expresión de una proteína de inmunidad específica que es codificada en el operón bacteriocina (88). En alimentos fermentados, las BALs monitorean varias actividades antimicrobianas, incluyendo la producción de bacteriocinas. Consecuentemente, varias bacteriocinas con potencial para aplicaciones industriales han sido purificadas y caracterizadas. Los cultivos productores de bacteriocinas han sido aplicados para inhibir Listeria monocytogenes y Clostridium en varias carnes fermentadas, productos empacados al alto vacío, y en alimentos de base vegetal (20, 84). Las bacteriocinas pueden ser vitales cuando la cadena fría es interrumpida durante la transportación de alimentos sensibles al calor. Los químicos artificiales son actualmente ampliamente usados para limitar a los organismos de deterioro de alimentos, pero su potencial en el riesgo de la salud ha llevado a los investigadores a considerar seriamente el posible uso de bacteriocinas o su efecto sinérgico con químicos, compuestos fenólicos, y proteínas antimicrobianas (86, 89). La propagación de la resistencia antibiótica y la demanda por productos alimentarios con menos conservadores químicos necesita la búsqueda de nuevas alternativas para evitar el abuso de antibióticos terapéuticos (87). Las BALs aisladas de vegetales fermentados caseros producen sustancias antibacteriales contra

patógenos bacterianos comunes gram-positivo y gram negativo, transmitidos por alimentos. Este amplio espectro de inhibición sugiere que las cepas de BAL tienen potencial para ser utilizadas como conservadores naturales en varios productos alimentarios. Las bacteriocinas son principalmente bactericidas, siendo algunas bacteriostáticas haciéndolas útiles en los sectores alimentario y farmacéutico. Su sitio de acción está en la membrana citoplásmica de la bacteria y en las vesículas activas de la membrana para interrumpir la fuerza motriz de los protones (84, 86). Sin embargo, su desventaja podría yacer en el hecho de que inhiben principalmente organismos que están estrechamente relacionados, lo que implica que pueden inhibir otros cultivos iniciadores deseables, y puede que no estén activos contra los patógenos gram-negativo y organismos que deterioran los alimentos. Se ha encontrado que las bacteriocinas son efectivas contra bacterias toxigénicas y patogénicas. La adición de agentes quelantes ha sido efectiva en fijar bacterias gram-negativo susceptibles a las bacteriocinas (86). Un estudio reciente ha establecido que el uso de Lactobacillus spp. heterofermentativo en la producción de productos tipo queso tipo holandés reduce las poblaciones de microorganismos tecnológicamente dañinos que afectan negativamente la calidad, seguridad, y vida de anaquel del producto final (90).

Agentes anti-fúngicos y otros agentes antimicrobianos de BAL A medida que aumenta el número de especies microbianas resistente a los antibióticos, los hongos y levaduras no son la excepción, y tanto los patógenos fúngicos humanos como el moho del deterioro en alimentos y en piensos se vuelven resistentes. Curiosamente, las levaduras y hongos se están volviendo resistentes también a conservadores como el sorbato y benzoato al igual

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que a los detergentes químicos (91). Las BAL producen varios compuestos antimicrobianos como el ácido láctico, ácido propiónico, y diacetil, generando reducciones de pH que inhiben muchos microorganismos, incluyendo los hongos (91). Adicionalmente a otras funciones, el Lactobacillus reuteri produce reuterina, que tiene una actividad de amplio espectro contra protozoos, hongos y tanto bacterias gram-positivo como gram-negativo y reuterociclina, la cual es un antibiótico de amplio espectro, cargado negativamente, hidrofóbico que está restringido sólo para trabajar contra bacterias gram-positivo (92). Los ácidos orgánicos, bacteriocinas y péptidos anti-fúngicos producidos por microorganismos también son aislados del pasto ensilado. L. plantarum aislado del pasto ensilado, exhiben actividad anti-fúngica produciendo ácidos orgánicos, otros metabolitos de masa molecular y dipéptidos cíclicos (20).

BAL como vehículo de liberación de fármacos Debido a sus propiedades como estatus GRAS, perfil adyuvante, adhesión a la mucosa y baja inmunogenicidad intrínseca, las BALs se han adjudicado tener un potencial como acarreador para inmunización oral, donde la función adyuvante de las diferentes especies de Lactobacillus fue explorada. En uno de tales estudios (93), L. casei y L. plantarum mostraron consistentemente fuerte capacidad adyuvante en diferentes sistemas de modelos experimentales. Estos resultados demostraron así, que la generación de vectores vivos basados en Lactobacillus como vacunas en lugar de vacunas derivadas de patógenos vivos, es factible (93). Esto representa un dato preliminarmente inmunológico de cepas de BAL recombinantes expresando antígenos de patógenos.

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Los vectores de vacunas de bacterias vivas pueden ser aplicados para la liberación de antígenos (94). Sin embargo, el aumento en la estabilidad y costos de producción bajos debe ser buscado en adición a las múltiples ventajas asociadas con el uso de bacterias como vectores de vacunas para poder cosechar los máximos beneficios. Hay un interés creciente con respecto al uso de péptidos de BAL en los productos para cuidado personal y médicos, pero todavía se carece de datos clínicos para sostener su eficacia. La administración dirigida de fármacos hacia el colon usando probióticos, solos o en combinación con prebióticos, asegura un tratamiento directo en el sitio de la enfermedad llevando a una menor dosificación y menores efectos laterales sistémicos (95). Al igual que el hábitat de los probióticos, el colon está mejor ubicado como portal para la entrada de fármacos dentro del sistema circulatorio (96). Aunque se ha sugerido que los polímeros mucoadhesivos como las lectinas y fibrina

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pueden ser usados para mejorar la liberación del fármaco por medio de diferentes rutas como la gastrointestinal, nasal, ocular, bucal, vaginal y rectal, las BALs son los candidatos más ideales para la liberación de fármacos, especialmente en las rutas gastrointestinales y nasales (97). Adicionalmente, las BALs tienen potencial como un enfoque alternativo para el tratamiento del asma humano (98). La vacuna nasal usando vectores de bacterias vivas, donde los patógenos respiratorios atenuados son aplicados, es más efectiva que los microbios no colonizados como BAL. Sin embargo, en contraste con las vacunas administradas sistémicamente, las bacterias vivas recombinadas generalmente inducen fuertes respuestas inmunológicas a las mucosas en el tracto respiratorio y en lugares de la mucosa distal. Aunque muchas aplicaciones de BAL como sede de la fábrica y vehículo de liberación necesitan de mayor investigación (99, 100), el ya establecido perfil de seguridad y eficiencia de este sis-

tema significa un futuro prometedor de la bacteria GRAS como vectores de expresión que pueden revolucionar el campo de la expresión proteica recombinada. Las dos ventajas principales de usar probióticos como un enfoque alternativo para el manejo del cuidado de la salud son su mecanismo de acción inherente diverso y ser organismos vivos. Los retos actuales con este sistema son la identificación de cepas probióticas, caracterización, monitoreo y conocimiento de su mecanismo de acción para una enfermedad en particular. Varios enfoques incluyendo microencapsulación y uso de material compatible han sido estudiados con el fin de evitar estos desafíos (101).

Factores principales que impactan en el uso de BAL como probióticos Los probióticos son bacterias vivas y no patogénicas que tienen efectos benéficos en la salud de su huésped (33, 102). El interés principal en BAL es impulsado por el hecho de

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que en el consumo, estos microorganismos son benéficos para el huésped impulsando la buena microflora del tracto gastrointestinal (GIT), y ya que los probióticos están normalmente asociados con BAL, hace sentido usar alimentos fermentados tradicionales como fuente principal de probióticos (102, 103). Las bacterias probióticas comúnmente se comercializan como alimentos fermentados y productos lácteos que son portadores populares de probióticos (33, 104). Los alimentos fermentados son muy apropiados para promover la imagen positiva de salud de las bacterias probióticas debido a que los cereales fermentados y los productos lácteos ya tienen una imagen positiva de salud; los consumidores están familiarizados con el hecho de que los alimentos fermentados contienen microorganismos; y los probióticos usados como cultivos iniciadores combinan las imágenes positivas de fermentación y de cultivos probióticos (104). Los productos alimentarios probióticos se venden convencionalmente en forma de leche fermentada debido a que la leche ha sido aceptada como un producto nutritivo y saludable, y como una fuente importante de calcio, proteínas, fósforo y rivoflavinas (39). Sin embargo, con un aumento de una conciencia más saludable de los consumidores en los países en desarrollo, hay una demanda para los productos alimentarios fermentados probióticos no lácteos debido a que algunos consumidores son afectados negativamente por la lactosa y el contenido de colesterol asociado con los productos lácteos fermentados (39, 105-107). El contenido de grasa, la viabilidad sustentable y el número de bacterias probióticas son algunos de los factores que actualmente afectan el uso de BAL como probióticos. Varios factores que son considerados en el criterio para la selección del probiótico BAL candidato es brevemente descrito a continuación.

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Bilis y baja tolerancia al pH Las BAL con alta tolerancia a pH bajo y sales de bilis demostraron la capacidad de sobrevivir en el estómago e intestino y competir exitosamente con otras bacterias en este ambiente y colonizar el GIT del huésped. Este potencial probiótico de seis cepas de BAL fue evaluado con respecto a la tolerancia a la acidez y a las sales biliares. Las seis cepas fueron resistentes a un pH de 3.0 y pH de 4.0 después de 24 h de incubación mostrando índices de viabilidad de 109 CFUml-1 y 1012 CFUml-1, respectivamente. Además, las seis cepas también demostraron una alta resistencia a la concentración de sales biliares de 0.3% (w/v), dando una viabilidad celular de 105-108 CFUml-1 después de 24 h de tratamiento (38). Las BALs con alta producción de exopolisacáridos como las cepas de Streptococcus thermophilus exhiben una mayor tolerancia a las sales biliares que Lactobacillus delbrueckii, cepa subespecie bulgaricus (108).

Poblaciones de cultivos iniciadores Los probióticos son microorganismos vivos que proporcionan beneficios a los humanos cuando son consumidos en cantidades adecuadas. Para tener efecto de estos beneficios, los alimentos fermentados deben contener microorganismos probióticos en poblaciones arriba de 106 CFUml-1 o g durante su vida de anaquel. En consecuencia, el consumo de más de 100 g por día de un bio-yogurt comercial típico que contiene más de 106 CFUml-1 es necesario para satisfacer el número adecuado de células viables (109). Se alcanza una alta población de probióticos en los productos lácteos fermentados comerciales añadiéndolos durante o después del proceso de fermentación separadamente del cultivo iniciador. Para los alimentos fermentados tradicionales, esto implica que deben ser producidos asegurando las poblaciones de probióticos de no

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menos de 106 CFUmL-1, de otra forma puede que no proporcionen el beneficio máximo al consumismo (110).

Actividad antimicrobiana y seguridad Una cepa típica probiótica debe exhibir efectos antimicrobianos produciendo algunos de los varios compuestos como ácidos orgánicos, ácidos grasos, peróxido de hidrógeno, y diacetil (112). Los probióticos deben mejorar la seguridad del huésped inactivando los patógenos pero no deben demostrar ninguna actividad patogénica o tóxica en el mismo. Adicionalmente, los probióticos candidatos no deben tener genes de resistencia antibiótica transferible y prevenir la producción de aminas biogénicas de las proteínas dietarias (3, 113).

OBSERVACIONES FINALES El valor de los alimentos fermentados no debe ser exagerado, ya que siempre han jugado un rol vital en la dieta y nutrición. Los beneficios asociados con alimentos fermentados, como el aumento en la vida de anaquel, palatabilidad y valor nutricional, sugieren la importancia de estos alimentos. Los efectos probióticos de varios alimentos fermentados y sus cultivos microbianos asociados parecen prometedores y garantizan una mayor investigación. Los productos de fermentación de las BAL probióticas de alimentos tradicionales pueden ser una fuente alternativa disponible de agentes antimicrobianos, incorporándose en la lucha contra los microorganismos emergentes resistentes a los antibióticos. La fermentación de los alimentos es un método de conservación al presentar un obstáculo contra bacterias patogénicas, y puede mitigar la diarrea en comunidades con calidad inferior de agua potable. Los alimentos tradicionales, producidos apropiadamente, son seguros y

aceptables y califican como una fuente de probióticos con nuevas aplicaciones. Mientras los mecanismos de acción de los probióticos BAL y sus productos, incluyendo las bacteriocinas, garanticen una mayor experimentación (in vitro e in vivo), y pruebas clínicas controladas para explotar el valor máximo son importantes, los desarrollos actuales sugieren que el consumo de alimentos y bebidas fermentadas deben ser promovidos en todas las comunidades, especialmente en países en desarrollo donde los productos lácteos probióticos pueden llegar a un alto precio. La bacteria probiótica tiene un potencial en la solución de enfermedades del estilo de vida actuales y nuevas. Recientemente y en forma sorpresiva se encontró que BALs provenientes de alimentos fermentados juegan un rol positivo en la salud mental. La mayor parte de los cultivos microbianos probióticos en la literatura y actualmente disponibles en el mercado son de fuera de África, a pesar de que este continente tiene una rica diversidad de tales alimentos fermentados que necesita ser explotada como una fuente de probióticos. Así, la búsqueda por nuevas bacterias probióticas de alimentos y bebidas fermentadas africanas y de otras partes del mundo, debe ser intensificada. Por último, la metagenómica puede desempeñar un papel crucial en este proceso proporcionando conocimientos sobre los genes, la estructura y la función de los productos procedentes de microorganismos probióticos. Tomado de Food & Nutrition Research Para consulta de la bibliografía, visite la versión virtual en www.alfa-editores.com.mx

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TECNOLOGÍA

IMPACTO POTENCIAL DE LA RESISTENCIA A LOS DESINFECTANTES DE AMONIO CUATERNARIO SOBRE LA PERSISTENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES

Palabras clave : Listeria monocytogenes; procesamiento de alimentos; persistencia bacteriana; desinfectantes de amonio cuaternario; resistencia.

[ Joaquín V. Martínez-Suárez 1*, Sagrario Ortiz 1 y Victoria López-Alonso 2 ]

La persistencia de ciertas cepas de Listeria monocytogenes, incluso después de que el entorno del procesamiento de alimentos ha sido limpiado y desinfectado, sugiere que esto puede estar relacionado a un fenómeno que reduce la concentración de los desinfectantes a niveles subinhibitorios. Esto incluye (i) la existencia de nichos ambientales o reservorios que son difíciles para que los desinfectantes lleguen, (ii) microorganismos que forman biopelículas y crean microambientes en las que concen-

traciones adecuadas de desinfectantes no pueden ser alcanzadas, y (iii) la adquisición de mecanismos de resistencia en L. monocytogenes, incluyendo aquellos que llevan a una reducción en la concentración intracelular de los desinfectantes. Los únicos datos disponibles con respecto a la resistencia de L. monocytogenes hacia los desinfectantes aplicados a los entornos de producción de alimentos se refieren a la resistencia genotípica a los compuestos de amonio cuaternario (QACs). Aunque hay varias bombas

[ 1 Departamento de Tecnología de Alimentos, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria, Madrid, España, 2

Unidad de Biología Computacional, Unidad Funcional de Investigación de Enfermedades Crónicas, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España ]

Abreviaturas

BAC, cloruro de benzalconio; MIC, concentración mínima inhibitoria; QACs, compuestos de amonio cuaternario.

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TECNOLOGÍA

de salida bien caracterizadas que confieren resistencia a los QACs, hay una fuerza de bajo nivel que no genera resistencia de los QACs a las concentraciones aplicadas en la industria alimentaria. Sin embargo, la dilución en el ambiente y la biodegradación generan gradientes de concentración en QAC. Como un resultado, los microorganismos son frecuentemente expuestos a concentraciones subinhibitorias de QACs. Por lo tanto, la resistencia de bajo nivel a los QACs en L. monocytogenes puede con-

tribuir a su adaptación y persistencia en su ambiente. De hecho, en ciertos casos, se ha establecido previamente la relación entre la resistencia de bajo nivel y la persistencia al ambiente de L. monocytogenes en diferentes cadenas de producción alimentaria Las cepas resistentes podrían tener ventajas de supervivencia en esos ambientes en relación con las cepas sensibles, tales como la capacidad de formar biopelículas en la presencia de concentraciones aumentadas de biocidas.

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INTRODUCCIÓN La Listeria monocytogenes es un patógeno transmitido por alimentos gram-negativo que puede causar listeriosis, una enfermedad relativamente poco común con una tasa de fatalidad de 20-30% (Silk et al., 2012; CDC, 2014; de Noordhout et al., 2014; EFSA y ECDC, 2014). La mayoría de los casos de listeriosis humana son causados por alimentos procesados contaminados (McLauchlin et al., 2004; Lianou y Sofos, 2007). Aunque la fuente original de contaminación puede ser la materia prima alimentaria usada en las plantas de procesamiento, las cepas de L. monocytogenes presentes en los productos alimentarios finales son normalmente diferentes de las cepas en la materia prima (Tompkin, 2002; Thévenot et al., 2006). Adicionalmente, cuando los brotes de listeriosis se han investigado, la contaminación normalmente es trazada al ambiente y al equipo de procesamiento (Orsi et al., 2008; Nakari et al., 2014). Esto sugiere que la con-

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taminación ocurre principalmente durante el procesamiento de alimentos y se debe principalmente al ambiente de la planta de fabricación (Malley et al., 2015; Garner y Kathariou, 2016).

PERSISTENCIA AMBIENTAL La caracterización molecular de los aislados de L. monocytogenes del ambiente de procesamiento de alimentos regularmente muestra la presencia de un número reducido de subtipos moleculares y la persistencia a largo plazo de cepas específicas que pueden contaminar los alimentos y causar listeriosis transmitida por alimentos (Ortiz et al., 2010; Ferreira et al., 2011; Morganti et al., 2015). La detección de aislados altamente similares de diferentes áreas dentro de establecimientos sencillos y su persistencia ambiental, es un tema de preocupación para el manejo higiénico de los establecimientos alimentarios (Cramer, 2006; Ferreria et al., 2014).

[ TECNOLOGÍA ] 47

Carpentier y Cerf (2011) evaluaron que la persistencia de L. monocytogenes es principalmente un proceso aleatorio dado que “no hay cepas con propiedades únicas que lleven a la persistencia pero hay sitios de refugio en las premisas y equipo de la industria alimentaria donde L. monocytogenes puede persistir”. Las cepas persistentes de L. monocytogenes han sido ocasionalmente aisladas en los entornos de procesamiento de alimentos después de la limpieza y desinfección (Lundén et al., 2003b; Soumet et al., 2005; Thévenot et al., 2006; Bëziņš et al., 2010; Ortiz et al., 2016). Como se demostró por los descubrimientos de los estudios revisados aquí, la persistencia de ciertas cepas de L. monocytogenes después de la limpieza y desinfección no es un proceso aleatorio en su totalidad, sino más bien un evento relacionado con las diferentes situaciones que resultan en concentraciones subinhibitorias de los desinfectantes a diferentes escalas. Esto incluye: (i) condiciones ambientales locales que pueden llevar a la formación de nichos o reservorios que son difíciles de alcanzar por parte de los desinfectantes; (ii) microorganismos que forman biopelículas y crean microambientes en los que no pueden alcanzarse concentraciones adecuadas de desinfectantes; y (iii) la adquisición de mecanismos de resistencia en L. monocytogenes, incluyendo aquellas que llevan a una reducción en la concentración intracelular de los desinfectantes.

sobrevivir y multiplicarse rápidamente (Cramer, 2006; Carpentier y Cerf, 2011). La falla en la limpieza y desinfección efectiva en el ambiente de la planta de procesamiento puede contribuir a la formación de biopelícula en ciertos nichos, llevando a la persistencia bacteriana (Gandhi y Chikindas, 2007; Renier et al., 2011). Las células embebidas en la matriz de la biopelícula mostraron una resistencia aumentada en los tratamientos con biocidas (Bridier et al., 2011). Sin embargo, la resistencia a los desinfectantes en células inmóviles (biopelículas) y en células planctónicas (flotación libre) es claramente un fenómeno diferente (Fatemi y Frank, 1999; Norwood y Gilmour, 2000; Stopforth et al., 2002; Kastbjerg y Gram, 2009). La resistencia de las biopelículas a los desinfectantes se considera como una forma de “resistencia fenotípica” ya que la resistencia bacteriana es principalmente inducida por una adaptación fisiológica al modo de vida

Hay numerosos factores en las plantas de procesamiento de alimentos, tales como limpieza insuficiente antes de la desinfección, desinfección de superficies húmedas, y falla de dosis que puede llevar a concentraciones subinhibidoras de desinfectantes, y de esta forma, reducir su eficiencia. Esta reducción puede ser específicamente significativa en ciertos nichos o reservorios en los que el agua o la materia orgánica puede

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de la biopelícula y se puede perder o reducir marcadamente cuando las células de la biopelícula revierten el estado planctónico (Pan et al., 2006; Bridier et al., 2011). En contraste, en el caso de las células planctónicas, una cepa bacteriana es definida como un ser resistente a un biocida si no es inhibida por una concentración específica que normalmente inhibe la mayoría de las otras cepas (Bridier et al., 2011); esto es, la resistencia celular planctónica depende de los atributos celulares intrínsecos como la variabilidad intra-especies (es decir, cepa) en el MIC de un desinfectante dado (Kastbjerg y Gram, 2012).

RESISTENCIA A DESINFECTANTES Los únicos datos disponibles con respecto a la resistencia de L. monocytogenes a los desinfectantes aplicados a los ambientes de producción de alimentos se refieren a la resistencia genotípica de los QACs (Hegstad et al., 2010; Gerba, 2015). BAC es típicamente usado en estudios de evaluación in vitro

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de la actividad de QACs. Se han encontrado MICs de BAC aumentados en cepas de L. monocytogenes de diferentes cadenas de producción de alimentos en diferentes países (Tabla 1). La resistencia de BAC en L. monocytogenes es una resistencia de bajo nivel. Esto significa que las cepas resistentes sólo tienen un aumento de dos a ocho veces en el MIC comparado con el resto de las cepas (Tabla 1). Esta resistencia no lleva a una resistencia QAC en concentraciones que son normalmente usadas en la industria alimentaria (normalmente 200 – 1000 mg/L) (SCENIHR, 2009; Ferreira et al., 2014; Tezel y Pavlostathis, 2015). Por lo tanto, los QACs son considerados como un medio efectivo de eliminación de cepas resistentes de L. monocytogenes (Kastbjerg y Gram, 2009, 2012).

Algunos de estos estudios se han conducido con un gran número de cepas, y reportan una frecuencia variable de cepas resistentes debido a la diversidad del criterio de selección para las cepas estudiadas. Por ejemplo, el estudio de Ortiz et al. (2016) reporta una frecuencia muy alta de aislados resistentes

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porque sólo las muestras de superficies desinfectadas se incluyeron (Tabla 1). En algunos casos, la selección de los aislados de L. monocytogenes resistentes a QACs han sido asociados con el uso repetido de esta clase

No. de aislados ensayados

de desinfectantes (Heir et al., 2004; Ortiz et al., 2014a, 2016). En los entornos del procesamiento de alimentos, L. monocytogenes se expone a diferentes

MIC (mg/L) de BAC No. de aislados resistentes (%) Aislados resistentes Aislados susceptibles

Tabla 1. Reportes de resistencia a BAC en células de plancton de Listeria monocytogenes.

Susceptibilidad del medio de prueba

Origen principal de cepas

Referencia

132

12 (9%)

16.0

2.0-8.0

Agar de Mueller Hinton (MHA) con sangre

Aves (Francia)

Lemaitre et al., 1998

200

20 (10%)

4.0-7.0

≤2.0

Caldo de soya tríptico (TSB)

Pescado (Noruega)

Asse et al., 2000

7 (7%)

≥8.0

≤4.0

MHA

Alimentos y otros (Francia)

Mereghetti et al., 2000

5 (26%)

≥5.0

≤1.25

TSB

Carne, aves (EU y Canadá)

Romanova et al., 2002

112

17 (15%)

4.0-8.0

2.0-3.0

TSB

Carne (Noruega)

Heir et al., 2004

254

108 (42%)

> 7.5

≤7.5

MHA

Pescado (Francia)

Soumet et al., 2005

114

9 (8%)

16.0-32.0

4.0

MHA con sangre

123

57 (46%)

> 10.0

≤10.0

MHA con sangre

Aves (pavo) (EU)

Mulapudi et al., 2008

138

19 (14%)

> 10.0

≤10.0

MHA con sangre

Diferentes alimentos (EU)

Ratani et al., 2012

15(16%)

28.0

14.0

MHA con sangre

Alimentos y otros (Austria)

Müller et al., 2013

3 (10%)

≥10.0

≤2.5

MHA

Puerco (España)

Ortiz et al., 2014a

19 (27%)

≥16.0

<16.0

MHA con sangre

Alimentos al menudeo (China)

Xu et al., 2014

13 (22%)

≥12.0

≤10.0

Caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI)

Alimentos al menudeo (China)

Jiang et al., 2015

142

25 (18%)

≥10.0

<10.0

MHA con sangre

Diferentes alimentos (Suiza)

Ebner et al., 2015

3 (15%)

≥10.0

<10.0

MHA con sangre

Diferentes alimentos (China)

Zhang et al., 2015

14a

11 (79%)

≥10.0

≤2.5

MHA

Puerco (España)

Ortiz et al., 2016

Alimentos al menudeo Aarestrup, et al., 2007 (Dinamarca)

Todas de superficies desinfectadas.

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desinfectantes y sanitizantes, y algunas veces a concentraciones subinhibitorias. Esto es particularmente verdad para los desinfectantes que no son totalmente biodegradables que pueden persistir en aguas residuales por largos periodos. Por ejemplo, los QACs son biodegradables sólo bajo condiciones aeróbicas, resultando en fluctuaciones continuas de gradientes de concentración (Tezel y Pavlostathis, 2015). Como resultado, los microorganismos son frecuentemente expuestos a concentraciones subinhibitorias de QACs. La exposición repetida a concentraciones subinhibitorias de QACs y la persistencia ambiental prolongada de ciertas cepas puede facilitar el desarrollo de la resistencia con el tiempo (Ortiz et al., 2014a). Concentraciones subinhibitorias de antimicrobianos pueden causar cambios genéticos en la bacteria por medio de diferentes vías, incluyendo un incremento en los radicales

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libres dentro de la célula o el estrés oxidativo (Liu et al., 2016). Esto puede desencadenar la respuesta de ayuda (SOS) que puede promover ya sea la expresión de los genes involucrados en la transferencia genética horizontal o la mutagénesis por medio de la inducción de las polimerasas de ADN propensas al error (Shapiro, 2015). Las cepas de L. monocytogenes con resistencia genotípica a QACs pueden tener mutaciones que llevan a una reducción en la permeabilidad celular (Mereghetti et al., 2000; To et al., 2002). Por ejemplo, las cepas resistentes pueden tener modificaciones en los ácidos grasos y fosfolípidos de la membrana (Fox et al., 2011), que pueden llevar a una superficie celular más aniónica e hidrofóbica. Esto lo hace difícil para que los QACs pasen a través de la membrana y entren a la célula (To et al., 2002).

[ TECNOLOGÍA ] 51

monocytogenes a BAC (Elhanafi et al., 2010). Además, los plásmidos con genes que confieren resistencia a BAC pueden ser transferidos entre diferentes especies patogénicas y no patogénicas de Listeria en la presencia de QACs. Este proceso también lleva a la co-selección de resistencia contra metales pesados (Katharios-Lanwermeyer et al., 2012). En varios estudios de filtración de cepas resistentes, se han encontrado el gen qacH y el determinante bcrABC (Müller et al., 2013). En un estudio, por ejemplo, la resistencia a BAC ha sido asociada con el gen qacH en la mayoría de las cepas evaluadas (80%), y una minoría de las cepas (12%) ha sido asociada con el determinante bcrABC (Ebner et al., 2015). Sin embargo, en otros estudios, sólo el gen qacH ha sido detectado (Ortiz et al., 2014b, 2016), mientras que en otros se ha reportado una predominancia clara del determinante bcrABC (Dutta et al., 2013).

En otros casos, la resistencia a los QACs en L. monocytogenes puede deberse a la adquisición de bombas específicas de descarga de QAC por medio de elementos recombinantes y elementos genéticos móviles. Se han identificado diferentes marcadores genéticos que confieren a L. monocytogenes una resistencia de bajo nivel a los QACs, incluyendo el determinante de resistencia bcrABC (Elhanafi et al., 2010) y el gen qacH de transposón Tn6188 (Müller et al., 2013), al igual que varios determinantes qac originalmente identificados en estafilococos (Xu et al., 2014). Todos estos componentes genéticos codificados del sistema de descarga en el pequeño grupo familiar de proteínas resistentes multi-fármaco (SMR) (Blair et al., 2015). Adicionalmente, los plásmidos también están asociados con la resistencia de L.

Por otra parte, en algunos estudios, los determinantes mencionados anteriormente no son detectados en ciertas cepas resistentes (Ortiz et al., 2014b, 2016; Ebner et al., 2015). En estos casos, la resistencia puede deberse a la sobreexpresión de las bombas de descarga endógenas debido a las mutaciones en los elementos reguladores. Esto puede ocurrir debido a la exposición a los QACs o al estrés inducido por estos compuestos (Tezel y Pavlostathis, 2015). Estas bombas están normalmente codificadas cromosómicamente y afectan un amplio espectro de compuestos antimicrobianos (Buffet-Bataillon et al., 2012; Ortiz et al., 2016). En ciertas cepas de L. monocytogenes que son resistentes a BAC, la resistencia a QAC ha sido asociada con la sobreexpresión de las bombas de descarga en el grupo MFS (importante facilitador superfamilia) (Blair et al., 2015), como MdrL (Listeria resistente

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a multi-fármacos) y Lde (Listeria de descarga de fármaco) (Romanova et al., 2006; Rakic-Martinez et al., 2011). Recientemente, la sobreexpresión de una nueva bomba de descarga de L. monocytogenes (codificada por emrE) ha sido implicada en la resistencia a QACs (Kovacevic et al., 2015).

El problema de definir y detectar resistencia Por varias razones, los datos sobre la resistencia bacteriana a las biocidas es normalmente difícil de interpretar y comparar (Buffet-Bataillon et al., 2012). Una razón potencial para la dificultad en interpretar los datos sobre la resistencia bacteriana a las biocidas es la ausencia de criterios claros para definir un microorganismo como resistente a los desinfectantes. Un concepto ecológico de resistencia a biocidas ha sido propuesto basado en la susceptibilidad “natural” de una especie dada (Morrissey et al., 2014). De acuerdo con este criterio, un aislado es definido como resistente cuando no es inhibido por una concentración que podría inhibir la mayoría de las cepas de esas especies en particular. El aislado resistente es normalmente fenotípicamente diferente del tipo salvaje porque este ha adquirido un mecanismo de resistencia a través de mutación o transferencia genética horizontal (EFSA, 2008; SCENIHR, 2009; Buffen-Bataillon et al., 2012; Morrissey et al., 2014). Esto ocurre comúnmente a las cepas de L. monocytogenes que son resistentes a BAC (Mereghetti et al., 2000; Elhanafi et al., 2010; Müller et al., 2013). Otra razón para la dificultad en la comparación de resultados en la resistencia bacteriana es la falta de pruebas estandarizadas para examinar la susceptibilidad in vitro a los desinfectantes (Buffet-Bataillon et al., 2012). La susceptibilidad a los desinfectantes es a menudo determinada por medio

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de técnicas MIC (normalmente empleando métodos de dilución de agar o dilución en caldo) (Tabla 1). Sin embargo, en algunos casos, los MICs obtenidos por medio de diferentes métodos pueden producir diferentes resultados, siendo la razón de por qué es necesaria una estandarización. La influencia del medio de cultivo es especialmente importante a considerar cuando se detecta resistencia de bajo nivel (Tabla 1). Por lo tanto, recomendamos el uso de protocolos clínicos estandarizados que están diseñados para evaluar la actividad inhibitoria de los antibióticos (EUCAST, 2000; CLSI, 2009). Consecuentemente, se pueden medir los cambios en el MIC del desinfectante de varias cepas “evaluadas” y las cepas resistentes pueden ser detectadas (Ortiz et al., 2014a). En contraste, las pruebas estandarizadas actuales para la evaluación y comparación de desinfectantes comerciales miden la actividad bactericida de los productos usando una cepa específica de “referencia” (Consejo Europeo para la Estandarización, 2010; Buffet-Bataillon et al., 2012); las diferentes pruebas usan células planctónicas (prueba de suspensión) o células unidas a acero inoxidable (prueba de carrera). A pesar de los bajos valores MIC, las cepas de L. monocytogenes con resistencia de bajo nivel a QACs tiene bombas de descarga que pueden reducir la concentración intracelular de los biocidas a niveles subinhibitorios, “de tal forma que la bacteria pueda sobrevivir más tiempo de lo predicho de las MIC para ese organismo” (Piddock, 2006). Para Staphylococcus aureus resistente a quinolona, por ejemplo, los MICs permitidos por mutaciones en la codificación del gen, la topoisomerasa objetivo es muy baja para permitir que sobreviva, y se ha propuesto que la descarga aumente las concentraciones intracelulares de los fármacos (Piddock, 2006). Adicionalmente, los microorganis-

[ TECNOLOGÍA ] 53

mos en el ambiente pueden ser expuestos a concentraciones enormemente variables de QACs. Por ejemplo, en las aguas residuales domésticas la concentración promedio de QACs es de aproximadamente 0.5 mg/L, y en los afluentes de la planta de tratamiento de aguas residuales la concentración disminuye a 0.05 mg/L (Tezel y Pavlostathis, 2015). Como resultado, la resistencia de bajo nivel a los QACs puede contribuir a la persistencia de L. monocytogenes en el ambiente.

¿Está la persistencia ligada a la resistencia? En numerosos estudios se ha investigado la hipótesis de que la persistencia de ciertos subtipos de L. monocytogenes está ligada a la resistencia a los desinfectantes (revisado por Ferreira et al., 2014). Sin embargo, sólo en algunos casos se ha demostrado una asociación entre la resistencia de bajo nivel a los QACs y la persistencia del patógeno en diferentes entornos de procesamiento de alimentos (Aase et al., 2000; Lundén et al., 2003a; Fox et al., 2011; Ortiz et al., 2014a, 2016).

La susceptibilidad de 200 cepas de L. monocytogenes a BAC ha sido investigado en una planta de producción pesquera en Noruega. En este estudio, 10% de las cepas eran cepas resistentes, y todas estas fueron previamente identificadas como cepas persistentes (Aase et al., 2000; Tabla 1). La relación entre la persistencia y la resistencia a dos QACs también ha sido analizada en cuatro cepas de aves de corral originarias de Finlandia. En una de las cepas persistentes, los valores MIC fueron mayores (2.5 – 5.0 mg/L) que las MICs del resto de las cepas (0.63 – 1.25 mg/L) (Lundén et al., 2003a). Adicionalmente, los MICs de un diferente QAC, cloruro de bencetonio, han sido analizados en 11 cepas de L. monocytogenes de la industria quesera en Irlanda. Dos de las cepas persistentes tienen valores MIC de 1.5-4.0 mg/L, comparado con un MIC de 0.5 mg/L para el resto de las cepas (Fox et al., 2011). En una planta de procesamiento de puerco ibérico en España, 29 diferentes subtipos de L. monocytogenes han sido identificados durante 3 años, y la resistencia a BAC ha sido asociada

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con la presencia de tres subtipos de serotipo molecular 1/2a (Ortiz et al., 2014a). Subsecuentemente, en una planta similar, cinco subtipos moleculares diferentes han sido detectados en las muestras ambientales de superficies limpias y desinfectadas (Ortiz et al., 2016). En estos ocho subtipos persistentes, una resistencia de bajo nivel a QACs ha sido confirmada. En ambos de estos estudios, los valores MIC de BAC son 10-20 mg/L en las cepas resistentes y 1.25-2.5 mg/L en las cepas sensibles (Tabla 1). Para mejorar el control de L. monocytogenes en entornos de procesamiento de alimentos, se necesita investigación adicional para evaluar los atributos específicos a cepas resistentes y persistentes de este patógeno.

Ventajas de las cepas resistentes para persistir en el ambiente Las cepas de L. monocytogenes que han adquirido mecanismos de resistencia a QACs pueden tener ventajas específicas sobre las cepas sensibles con respecto a persistir en los ambientes de procesamiento de alimentos. Por ejemplo, la influencia de los QACs residuales puede variar en cepas sensibles y cepas resistentes, como una concentración óptima (inhibitoria) para el primero y puede ser subóptima (subinhibitoria) para el segundo. Esto ha sido confirmado por Ortiz et al., (2014b) en cepas de L. monocytogenes resistentes a BAC. Cuando se ha estudiado la formación de biopelícula en presencia de BAC, sólo tres concentraciones de BAC (1.25, 2.5 y 5 mg/ L) han sido identificadas por mostrar diferentes efectos sobre la formación de biopelícula por el grupo de cepas de L. monocytogenes incluidas en el estudio. Se observó que ciertas cepas resistentes son capaces de formar biopelículas a 5 mg/L, una concentración de BAC que es inhibitoria para la mayoría de las cepas (Ortiz et al., 2014b). Sin embargo, la formación de bio-

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película en presencia de concentraciones aumentadas de BAC puede diferir entre cepas resistentes con MICs similares pero diferentes determinantes genéticos de resistencia de BAC. Por ejemplo, la producción de biopelícula en la presencia de BAC difiere entre las cepas de L. monocytogenes persistentes que pertenecen a la secuencia tipo ST121 que tiene transposón Tn6188 con el gen qacH, y prfA mutados que pertenecen a la secuencia tipo ST31 que también son persistentes y resistentes (Ortiz et al., 2016). La Figura 1 muestra el porcentaje de biopelícula formada en la presencia de BAC en relación con la biopelícula formada sin BAC por las dos cepas resistentes representativas ST31 y ST121. Así, la cepa ST121 es capaz de formar biopelículas en la presencia de concentraciones mayores de BAC (5 mg/L) que el MIC de la cepa sensible (1.25-2.5 mg/L) (Ortiz et al., 2016; Figura 1). Estos resultados pueden ayudar a explicar la persistencia de las cepas resistentes ST121 (Ortiz et al., 2014b, 2016; Schmitz-Esser et al., 2015). Adicionalmente, estudios han mostrado que las cepas de L. monocytogenes que son resistentes a QAC’s pueden formar biopelículas más rápido que las cepas sensibles, las cuales aumentan la probabilidad de su supervivencia (Nakamura et al., 2013). La expresión de ciertos genes asociados con la respuesta de estrés o su regulación también puede llevar a una mayor formación de biopelículas por cepas resistentes (van der Veen y Abee, 2010). Por lo tanto, la exposición de L. monocytogenes a concentraciones subinhibitorias de QACs y la consiguiente selección de microorganismos resistentes puede aumentar la capacidad de esta bacteria para formar biopelículas y sobrevivir a futuros tratamientos con altas concentraciones de los mismos compuestos (Tezel y Pavlostathis, 2015).

[ TECNOLOGÍA ] 55

120

** 0 mg L-1

100

1.25 mg L-1

2.5 mg L-1

Biofilm (%)

5 mg L-1 60 * * 40

0 ST31

CONCLUSIONES En años recientes, la evaluación de la relación entre la resistencia a los desinfectantes y la persistencia, ha permitido a los investigadores identificar los subtipos de L. monocytogenes persistentes que son resistentes a los desinfectantes. La resistencia de bajo nivel a los QACs que han sido detectados en estos subtipos no es una adaptación fenotípica, sino más bien una resistencia genotípica estable que es relativamente frecuente en ciertos entornos y tiene implicaciones importantes. Por ejemplo, la formación de biopelículas por cepas resistentes en la presencia de concentraciones de biocidas que son inhibitorias para las cepas sensibles pueden indudablemente tener un efecto sobre su supervivencia ambiental. Por lo tanto, es necesario un mejor entendimiento de las características ecológicas y genéticas de la resistencia de las cepas a los QACs, al igual que la estandarización y consenso de las técnicas usadas para detectar las cepas resistentes.

Figura 1. Efecto de BAC en la formación de biopelícula por cepas de Listeria monocytogenes representativas de la secuencia tipo (ST) y ST121. Los resultados están representados como los porcentajes promedio de tres mediciones de biopelícula formada con la adición de concentraciones de BAC de 1.25 mg/L, 2.5 mg/L, 5 mg/L, comparados con el control sin la adición de BAC (0 mg/ L,100%). Los porcentajes reducidos (*) o aumentados (**) de biopelícula difieren significativamente de los controles sin BAC (p < 0.05, prueba t de Student), adaptada de Ortiz (2015).

ST121

Fuente: Frontiers in Microbiology, 2016 Para consulta de la bibliografía, visite la versión virtual en www.alfa-editores.com.mx

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TECNOLOGÍA

{56}

PROCESO DE FERMENTACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA RENINA PARA LA COAGULACIÓN DE LA LECHE [ N. Valarmathi 1*, P. Periyakaruppiah 2 y M. Kannan 3 ]

RESUMEN

Palabras clave : Microbios; renina; actividad coagulante de la leche; actividad proteolítica; SDS-PAGE; análisis FTIR; (B. subtilis) mutado con UV.

Los microorganismos seleccionados se investigaron para la producción de la enzima coagulante de la leche (MCE). Las bacterias elegidas (Bacillus subtilis, Apergillus niger y Aspergillus flavus) fueron caracterizadas para pruebas bioquímicas e identificación. Se investigaron la producción de enzimas y su actividad de coagulación en la leche y la actividad proteolítica de la renina. Se determinaron los contenidos de proteína de la enzima por análisis SDS-PAGE y FTIR. Los resultados de la actividad de coagulación de la leche aumentaron, Aspergillus niger y Aspergillus flavus más que Bacillus subtilis. Bacillus subtilis fue mutado usando luz ultravioleta. Se comparó la producción del producto por B. subtilis tipo salvaje y B. subtilis (mutado con UV).

[ 1 Departamento de Biotecnología, Colegio Kamaraj de Ingeniería y Tecnología, Virudhunagar – 626 001, India; Departamento de Botánica, Colegio Yadava (Autónoma), Madurai – 625 014, India; Departamento de Microbiología, Colegio VHNSN (Autónomo), Virudhunagar – 626 001, India ] 2

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{57} INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento y filtración del hongo Un gramo de muestra de tierra se diluyó en serie hasta una dilución de 10-7. La muestra fue sembrada en un medio de agar dextrosa papa (PDA). El medio fue suplementado con 1% de leche descremada estéril en el momento del sembrado. Las placas se incubaron por tres días a temperatura ambiente.

Aislamiento y filtración de la bacteria Un mL de muestra de leche se diluyó serialmente hasta una dilución de 10-7. La muestra

Identificación para las enzimas coagulantes de leche El hongo aislado fue transferido al medio de Gastrock et al., (1938) en el que la cerveza fue reemplazada por 0.5 g de extracto de levadura por 100 mL de medio, y se incubó por 3 días a 30 °C. Los hongos se cultivaron a 30 °C por 5 días. El crecimiento se extrajo con 50 mL de solución salina, y de esta forma, se determinó la actividad de coagulación de la leche. En la identificación bacteriana, 100 mL de leche fresca (pH alrededor de 6.5) se añadieron en matraces Erlenmeyer de 500 mL, que fueron posteriormente esterilizados por autoclave a 15 psi por 20 min. Los matraces fueron enfriados aproximadamente a 30 °C, y se inocularon con una suspensión salina de aislados bacterianos madurados por 24 h. Los organismos fueron incubados por 72 h bajo condiciones de sumersión y de superficie. En el cultivo sumergido, los matraces inoculados se mantuvieron a 30 °C en un agitador rotatorio (cerca de 200 rpm). En el cultivo de superficie, los matraces a 30 °C no fueron perturbados durante el periodo de crecimiento. La mayoría de los organismos fueron formadores peliculares en los cultivos de superficie, y de esta forma, se asumió que la mayoría de las células fueron retenidas en la superficie del medio.

TECNOLOGÍA

La coagulación de la leche es la etapa básica en la elaboración del queso. Las enzimas coagulantes de la leche son los agentes activos primarios en la fabricación de queso; una pequeña cantidad de renina es capaz de coagular una gran cantidad de leche. La unidad Soxhlet, que todavía es usada en la elaboración tradicional de queso, representa un método convencional para determinar la actividad de coagulación total de la leche de una preparación de renina. La fuerza de coagulación en las unidades Soxhlet se refiere al volumen de la leche bronca que puede ser coagulada por una unidad de volumen de la enzima en 40 min a 35 °C. En la actualidad, los coagulantes microbianos de origen fúngico, que han sido usados en la elaboración de quesos comerciales desde los 1960’s, son de gran importancia. Más de 100 fuentes fúngicas fueron reportadas por Foltmann (1959) que reflejan el alto interés científico en los coagulantes alternativos para la producción de queso. El salvado de trigo fue usado frecuentemente como ingrediente principal de crecimiento del medio (Boopathy, 1994).

fue sembrada en un medio de agar nutritivo que contenía leche descremada. Las diluciones apropiadas del material de prueba se sembraron e incubaron a 37 °C por 48 h.

Medio de crecimiento para la fermentación sumergida Para estudiar el efecto del pH, la fuente de carbono y la fuente de nitrógeno, se llevaron a cabo los experimentos en matraces Erlenmeyer (250 mL) que contenían 30 mL de medio de cultivo sintético esterilizado que fueron inoculados con los microorganismos elegidos. El medio de cultivo consistió de una

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58 [ TECNOLOGÍA ]

fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, y una solución mineral que se esterilizó separadamente. El medio de producción consistió en 1% (w/v) de fuente de carbono y 0.5% (v/w) de fuente de nitrógeno. La glucosa, fructosa y lactosa se evaluaron como fuente de carbono, mientras la triptona, caseína y leche en polvo descremada fueron evaluados como fuente de nitrógeno. El medio de fermentación contenía trazas de sólidos de maíz (20 g/L), NaCl (5 g/L), MgSO4.7H2O (5g/L), KH2PO4 (2g/L), CaCO3 (3g/L). Se incubó el agitador rotatorio por 7 días. Una metodología similar se usó para la bacteria y se incubó en el agitador rotatorio por 4 días.

Método de mejora de la cepa bacteriana Bacillus subtilis fue mutado usando luz ultravioleta. Se compara la producción del producto por B. subtilis tipo salvaje y B. subtilis (mutado con UV).

Mutagénesis por radiación UV 4 mL de suspensión celular (108 células/mL) de la cepa iniciadora contenida en un Petridis

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fue puesta bajo una lámpara ultravioleta (30W, Central electronic, USA) con una distancia de 30 cm e irradiado por diferentes intervalos de tiempo entre 20 y 180 s. La célula fue agitada durante la irradiación. Las células tratadas fueron diluidas en una solución salina fisiológica estéril y 1 mL de suspensión celular fue extendida en un medio de aislamiento de una sola colonia (su composición es igual a un medio sesgado), para calcular el índice de letalidad. Las placas fueron incubadas en la obscuridad a 37 °C por 2 días y los mutantes fueron aislados.

Ensayo para la actividad de coagulación de la leche La actividad de coagulación de la leche fue determinada de acuerdo al método de Arima et al. (1963) el cual está basado en la evaluación visual de la apariencia de los primeros matraces coagulados, expresado en términos de unidades Soxhlet (SU). La actividad de coagulación fue calculada usando la siguiente fórmula: SU =

2400 x 5 x D x 0.5 T

[ TECNOLOGÍA ] 59

Donde, T = tiempo de coagulación D = dilución del material de prueba

Evaluación de la actividad proteolítica

ción sumergida. Se estudió el efecto del pH, fuente de carbono y fuente de nitrógeno. Los experimentos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer (250 mL) que contenían 30 mL de medio de cultivo estéril e inoculado con microorganismos aislados (Figura 1).

Figura 1. Fermentación sumergida y actividad de coagulación de la leche.

La actividad de la proteasa fue determinada de acuerdo con Samal et al.,(1990). La absorbancia fue medida a 420 nm.

Purificación de la enzima coagulante de leche La enzima que tiene la actividad más alta de coagulación de la leche fue elegida para estudios de purificación posteriores usando el método modificado de Otani et al.,(1959). El sobrenadante fue tratado con sulfato de amonio (40% de saturación). La enzima precipitada se recolectó centrifugando a 3000 rpm por 20 minutos en una centrifugadora refrigerada y disuelta en una cantidad mínima de agua destilada.

Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) fue hecha usando el método de Laemmli (1970).

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) El FTIR principalmente se usó para determinar el rango de absorción proteica de las enzimas. Así, el Bacillus subtilis (mutado) y el Bacillus subtilis producido por enzimas se sujetaron a FTIR (espectro RXI Perkin Elmer).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las colonias fúngicas (Aspergillus flavus y Aspergillus niger) fueron aisladas de las muestras de suelo. Bacillus subtilis, Bacillus subtilis (mutado con UV), Aspergilus niger y Aspergillus flavus fueron cultivados bajo fermenta-

La actividad de coagulación de la leche es inversamente proporcional a la actividad proteolítica. La actividad de coagulación de la leche aumenta y también disminuye la actividad proteolítica. En este estudio B. subtilis mutado aumentó la actividad de coagulación de la leche y disminuyó la actividad proteolítica que con el B. subtilis, A. niger y A. flavus (Tabla 1). En este estudio se encontró que el pH fue el factor predominante que afecta la producción de la enzima coagulante de la leche. El valor del pH óptimo inicial para la actividad máxima de la enzima es 4.0. Ninguna actividad de coagulación de la leche fue detecta-

Tabla 1. Actividad de coagulación de la leche.

Microorganismo

Actividad de coagulación de la leche (SU/mL)

Actividad proteolítica 420 nm

Bacillus subtilis (mutado por UV)

1.225±0.050*

0.11±0.03*

Bacillus subtilis (control)

1.110±0.040*

0.42±0.04*

Aspergillus niger

0.905±0.005*

0.39±0.06*

Aspergillus flavus

1.060±0.003*

0.32±0.02*

* ± Valores de error estándar de las muestras (P=0.05) (n=5)

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97 kDa 84 kDa 78 kDa 45 kDa 36 kDa 28 kDa

19 kDa

M-Marcador L1 – Bacillus Sp. (control) L2 – Bacillus Sp. (mutado por UV)

ble a pH 3.0, bajo condiciones de cultivo similar. Para determinar la fuente más favorable de carbono para la producción de la enzima, se usaron ya sea glucosa o lactosa en forma individual como única fuente de carbono en la producción de renina en función del metabolismo de los microorganismos objeto de este estudio y se usó glucosa para la fermentación del B. subtilis (mutado). (Silveria et

Figura 2. Patrón SDS-PAGE de enzima purificada parcialmente de microorganismos.

Figura 3. Espectro FTIR de la enzima de coagulación de la leche de Bacillus sp y Bacillus sp (mutado con UV).

1.30 1.2

al., 2005). Similarmente la actividad máxima en el presente estudio se observó cuando la glucosa se usó como fuente exclusiva de carbono. La fuente de nitrógeno influye sobre la enzima de coagulación de la leche por B. subtilis (mutado). Entre las fuentes de nitrógeno evaluadas con caseína y leche en polvo descremada, la caseína influye en el aumento de los niveles de enzimas. Por otra parte, la actividad de coagulación de la leche fue la más baja cuando la leche en polvo descremada fue la única fuente de nitrógeno orgánica (Siliveria et al., 2005), mostrando que la caseína jugó un rol importante en la producción de renina bajo la fermentación sumergida. La electroforesis en gel de poliacrilamida se basó en los descubrimientos de la enzima producida por las muestras de B. subtilis y B. subtilis (mutado por UV). B. subtilis y B. subtilis (mutado) mostrando la máxima actividad de coagulación de leche. El extracto enzimático crudo y purificado se precipitó obteniendo una fracción de 40%. La espectroscopia FTIR trabaja irradiando por radiación infrarroja una muestra y viendo cuáles longitudes de onda de la radiación en la región infrarroja del espectro son

0.60

Banda de Amida I 1633.85

0.55

1.1

0.50

1.0

0.45

0.9

Banda de Amida I 1633.66

0.40

0.8 0.7

0.35

Banda de Amida II 1406.50

0.6

Banda de Amida II 1407.26

0.30

0.5

0.20

0.3 1.19 1800.0 1750

1459.18 1429.58

0.25

0.4

1700

1650

1600

1550

1500

1450

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1400

1350

1300

0.15 0.13 1800.0 1750

1700

1650

1600

1550

1500

1450

1400

1350

1300

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absorbidas por Bacillus control y por Bacillus mutados por UV. Las bandas características encontradas en el espectro infrarrojo de las proteínas y polipéptidos que incluyen Amida I y Amida II. La absorción asociada con las bandas de Amida I tiende a vibraciones de tensión del enlace C=O de la amida, absorción asociada con las bandas de Amida II llevan principalmente a las vibraciones de flexión del enlace N–H (Figura 3). (Byler y Susi, 1986; Surewicz y Mantsch, 1988).

CONCLUSIÓN La producción de la enzima de coagulación de la leche por A. niger, A. flavus, B. subtilis, y B. subtilis (mutado por UV) ha sido estudiada en fermentación sumergida y el perfil óptimo de cultivo fue reportado. Las cepas microbianas mencionadas podrían ser una fuente valiosa de una enzima que tiene alta actividad de coagulación a un índice de proteólisis terciaria y una resistencia disminuida a un tratamiento termal. Bacillus subtilis, Bacillus subtilis (mutado por UV). Aspergillus niger, Aspergillus flavus tienen la capacidad de producir una enzima de coagulación de la leche en fermentación sumergida en contraposición al cultivo en estado sólido.

REFERENCIAS

• Foltmann B 1959 On the enzymatic and the coagulation stages of the renneting process.In Proceedings of the 15th International Dairy Congress, vol. 2 (pp.655– 661). London • Gastrock E A; N Porges; N Wells and A J Moyer 1938 Gluconic acid production on pilot plant scale. Ind. Eng. Chem. 30:782789 • Laemmli U K 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. - Nature 227: 680-685 • Samal B B; Karan B and Stabinsky Y 1990 Stability of two novel serine proteinases in commercial laundry detergent formulations. Biotechnol. Bioeng. 35: 650-652 • Silveira G G D; Oliveira G M D; Ribeiro E J; Monti R and Contiero J 2005 Microbial rennet produced by Mucor miehei in solid-state and submerged fermentation. Brazilian Archives of Biology and Technology, 48(6), pp.931-937 • Surewicz W K and Mantsch H H 1988 New insight into protein secondary structure from resolution-enhanced infrared spectra. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 952, pp.115-130 Fuente: International Journal of Current Science Research

• Arima K; Yu J and Iwasaki S 1970 Milk clotting enzyme from Mucorpusillus In: Perlman GE, Lorandl(eds) methods in enzymology, Academic press, New York.19: 446-459 • Bhoopathy R Indian Food Ind 1994 13, 22–31. Dairy Sci. 76:2845-2855 • Byler D; Michael and Heino Susi 1986 Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra. Biopolymers 25, no. 3: 469-487

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CALENDARIO DE EVENTOS SICARNE 2016

necesidades de tecnología, ingredientes, sabores y soluciones profesionales en general.

Simposio Internacional Sobre Producción de Ganado de Carne 19 al 21 de Octubre Sede: Nave de Locomotoras “Tres Centurias”; Aguascalientes, Aguascalientes, México Organiza: Financiera Rural, SAGARPA, Fira, CNG, AMEG, Auber Teléfono: +52 (811) 777 7166 y +52 (331) 617 4073 E-mail: mf.sicarne@gmail.com Web: www.sicarne.org Es un evento que integra a todos los elementos que conforman la cadena productiva de la industria cárnica en México y Latinoamérica. Sicarne es un espacio donde productor, empresa y comerciante pueden relacionarse libremente, conociendo de primera mano sus necesidades y la mejor forma de satisfacerlas a través del negocio, la capacitación y el intercambio de ideas. Dentro de Sicarne podrá encontrar la más completa muestra industrial en donde exponen empresas reconocidas de maquinaria, empaque, equipo para rastros, laboratorios, ingredientes y refrigeración, entre otros rubros.

CERVEZA MÉXICO 2016 04 al 06 de Noviembre Sede: Pepsi Center (World Trade Center); Ciudad de México, México Organiza: Tradex Exposiciones Internacionales Teléfono: +52 (55) 5604 4900 ext. 154 E-mail: geo@tradex.com.mx Web: www.tradex.mx/cerveza El evento más completo sobre Cerveza en América Latina. Cerveza México es un espacio interactivo donde además de degustar y hablar de cerveza, se vive la experiencia más completa en México sobre el mundo de esta bebida. Contempla tres eventos: exposición, congreso y competencia; llevándose a cabo desde 2010, se ha convertido en el principal evento de la industria cervecera en la región con más de 150 productores, importadores, exportadores y proveedores de insumos.

YUMMEX MIDDLE EAST 2016 EXPO BOTANAS 2016 27 y 28 de Octubre Sede: Hotel Royal Pedregal, Ciudad de México Organiza: Rama 106 (Fabricantes de Botanas) de Canacintra México Teléfono: +52 (55) 5171 5297 y 98 E-mail: fsuastegui@amvission.com Web: www.facebook.com/ExpoBotanasMX Un foro pensado y diseñado para generar sinergias y relaciones productivas entre los fabricantes de botanas, nacionales e internacionales, medianos y pequeños, así como con sus principales proveedores. Dos días para presentar directamente a clientes y prospectos las innovaciones del ramo. Evento que reúne a cientos de expertos que buscan, además de contenidos técnicos y sobre tendencias mediante ponencias y conferencias magistrales, satisfacer sus

07 al 09 de Noviembre Sede: Dubai World Trade Centre; Dubái, Emiratos Árabes Unidos Organiza: Koelnmesse GmbH y Dubai World Trade Centre Co. LLC. Teléfono: +49 (221) 821 2801 E-mail: f.stroeter@koelnmesse.de Web: www.yummex-me.com Como la principal feria internacional para la región MENA (Middle East and North Africa; en español, Medio Oriente y Norte de África), “Sweets & Snacks Middle East” se convierte ahora en “yummex Middle East 2016”, un punto culminante de la industria para los fabricantes de confitería y aperitivos que buscan presentar sus productos e innovaciones a empresarios de esta parte del mundo. Para su décimo aniversario, este 2016 el evento escala al siguiente nivel con cambio de nombre, un nuevo aspecto y significativamente más oportunidades de negocio.

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ÍNDICE DE ANUNCIANTES

COMPAÑÍA

CONTACTO PÁGINA

ABAMEX INGENIERÍA, S.A. DE C.V. info@abamex.mx 9

CARNOTEX, S.A. DE C.V. www.tecnologiacarnica.com 17

CONDIMENTOS NATURALES TRES VILLAS, S.A. DE C.V. ventas@condimentosnaturales.com

DANFOSS www.danfoss.com/IR 2DA FORROS

DEWIED INTERNACIONAL DE MÉXICO, S. DE R.L. DE C.V. lourdes@dewiedint.com

DVA MEXICANA, S.A. DE C.V. ventas@dva.mx 7

FORBO SIEGLING, S.A. DE C.V. forboAlimentos@siegling.com.mx 15

FMC INGREDIENTES ALIMENTICIOS, S.A. DE C.V. www.fmchealthandnutrition.com

INDUSTRIAS ALIMENTICIAS FABPSA, S.A. DE C.V. www.fabpsa.com.mx

KENWORTH MEXICANA, S.A. DE C.V. www.kenworth.com.mx 1

METCO, S.A. DE C.V. www.metco.com.mx 27

PLM MÉXICO, S.A. DE C.V. www.plmlatina.com 62

SANCHELIMA INTERNATIONAL INC. www.sanchelimaint.com.mx 3

SARTORIUS DE MÉXICO, S.A. DE C.V. leadsmex@sartorius.com 29

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