BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA Rector, Dr. José Alfonso Esparza Ortiz Secretario General, Mtra. Guadalupe Grajales y Porras Vicerrector de Investigación y Estudios de Posgrado, Dr. Ygnacio Martínez Laguna ALIANZAS Y TENDENCIAS BUAP. Año 6, Nº 21, Enero-Marzo de 2021, es una publicación trimestral editada por la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, con domicilio en 4 sur 104, Col. Centro, C.P. 72000, Puebla Pue., Tel. +52 222 2295500 Ext. 2234 Director Fundador: Dr. Martín Pérez Santos (Dirección de Innovación y Transferencia del Conocimiento, BUAP). Director y Editor en jefe: Dr. Jesús Muñoz Rojas (Instituto de Ciencias, BUAP). Editores asociados: Dra. Verónica Quintero-Hernández (Cátedra CONACYT-Instituto de Ciencias, BUAP). Dra. Yolanda Elizabeth Morales-García (Facultad de Ciencias Biológicas, Licenciatura en Biotecnología, BUAP). Comité Editorial/Editorial Board D. C. Patricia Bernal Guzmán (Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, Andalucía, España). D. C. Abdelali Daddaoua (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II. Facultad de Farmacia. Universidad de Granada, Granada, España). D. C. Miguel Matilla Vázquez (Department of Environmental Protection, Estación Experimental del Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Granada, España). D. C. Antonino Báez Rogelio (Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México). D. C. Miguel Ángel Villalobos López (Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada, Instituto Politécnico Nacional, Tepetitla de Lardizabal, Tlaxcala, México). D. C. Hortencia Silva Jiménez (Área de Oceanografía Química, Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California, Ensenada, Baja California, México). D. C. Alma Rosa Netzahuatl Muñoz (PTC del programa académico de Ingeniería en Biotecnología, Universidad Politécnica de Tlaxcala, Colonia San Pedro Xalcaltzinco, Tepeyanco, Tlaxcala, México). D. C. Arturo Elías Domínguez ("Facultad de Ciencias Básicas, Ingeniería y Tecnología", Ingeniería Química, Universidad Autónoma de Tlaxcala, Calzada Apizaquito s/n. Apizaco, Tlaxcala, México).
D. C. José María Sigarreta Almira (Facultad de Matemáticas de la Universidad Autónoma de Guerrero, Acapulco, México). M. C. Carla de la Cerna-Hernández (Dirección de Innovación y Transferencia de Conocimiento, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México). D. C. Mayra Z. Treviño Garza (Departamento de Alimentos, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, San Nicolás de los Garza, Nuevo León, México). D. C. Jesús Manuel Muñoz Pacheco (Facultad de Ciencias de la Electrónica, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México). D. C. Siara Silvestri (Postgraduate Program in Environmental Engineering, Environmental Engineering Department, Federal University of Santa Maria–UFSM, 1000, Roraima Avenue, Santa Maria, RS, 97105-900, Brazil). D. C. Cindy Bandala ((1) Instituto Nacional de Rehabilitación LGII. (2) Sección de Posgrado e Investigación, Escuela Superior de Medicina, Instituto Politécnico Nacional). Reserva de Derechos al uso exclusivo 04-2016-061316422200203, ISSN: 2594-0627, ambos otorgados por el Instituto Nacional de Derecho de Autor de la Secretaría de Cultura. Responsable de la última actualización de este número la Dirección de Innovación y Transferencia de Conocimiento de la BUAP, Dr. Martín Pérez Santos, domicilio en Prolongación de la 24 Sur y Av. San Claudio, Ciudad Universitaria, Col. San Manuel, Puebla, Pue., México, C.P. 72570, fecha de la última modificación, 31 de marzo de 2021. Email: jesus.munozrojas@viep.com.mx Las opiniones expresadas por los autores no necesariamente reflejan la postura del editor de la publicación.
Revista indizada en: Latindex International Scientific Indexing Academic Resource Index CiteFactor Scientific Journal Impact Factor Portada Lic. Arte Digital Ximena Gordillo Ibarra Lic. Arte Digital Jesús Mauricio Muñoz Morales
CONTENIDO AyTBUAP 6(21)
i.
La próxima pandemia: Bacterias multiresistentes a antibióticos. Verónica Quintero-Hernández
1
Microorganismos de interés para la agricultura del futuro: agentes de biocontrol y fijadores de nitrógeno. Patricia Bernal*
12
Identificación molecular de especies de Mycobacterium aisladas de pacientes con diagnóstico clínico de tuberculosis. Carlos García-Cortés, Perla M. Martinez-Cruz, Edith A. Bernabé Pérez, Jesús Muñoz-Rojas, Lucía Martínez-Martínez*
28
Métodos de identificación molecular para Gluconacetobacter diazotrophicus. Cristian Molinares-Pacheco, Julieta Mariana Muñoz-Morales2, Adriana Carbajal-Armenta, Ana Laura Hernández-Tenorio, Alejandro Cueto-Becerra, Jesús Muñoz-Rojas*.
45
Extractos acuosos de plantas como inhibidores de la germinación de urediniosporas de Hemileia vastatrix; la roya anaranjada del café. José Antonio García-Pérez*, Enrique Gutiérrez, Vianey del Rocío Torres Pelayo
Alarcón-
AyTBUAP 6(21):i-vii Quintero-Hernández., 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.21
La próxima pandemia: Bacterias multirresistentes a antibióticos Verónica Quintero-Hernández* ID. 1
CONACYT, Grupo “Ecology and Survival of Microorganisms”, Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP), Puebla, México. *Email autor corresponsal: vquinterohe@conacyt.mx
RESUMEN Actualmente la humanidad se encuentra viviendo una pandemia inesperada provocada por el virus SARS-CoV-2 que causa la enfermedad denominada COVID-19. Afortunadamente se han desarrollado vacunas contra el SARS-CoV-2 en un tiempo récord, gracias al enorme esfuerzo de grandes laboratorios científicos y empresas farmacéuticas en todo el mundo. Sin embargo, aún se ve lejos su término y nos deja como lección que debemos vivir de ahora en adelante con la cultura de la prevención. Una vez que se supere esta pandemia, la humanidad no puede regresar a vivir en el confort del pasado e ignorar otro de los graves problemas que tenemos actualmente y que empeorará en los siguientes años: el aumento de bacterias multirresistentes a los antibióticos con los que se cuenta actualmente. La Organización Mundial de la Salud (OMS) publicó en 2017 una lista de bacterias que requieren urgentemente nuevos antibióticos, debido a que éstas son resistentes a varios de los antibióticos convencionales disponibles actualmente. Los péptidos cortos tipo ISCT derivados de venenos de alacrán tienen un gran potencial como nuevos antibióticos ya que presentan actividad de amplio espectro, su mecanismo de acción tiene muy poca probabilidad de ser bloqueado por las bacterias ya que no actúan sobre un receptor específico sino sobre las membranas bacterianas, su estructura es una hélice alfa y su pequeño tamaño menor a 20 aminoácidos facilita su síntesis química sin requerir una modificación extra. Palabras clave: Bacterias multirresistentes, Antibióticos, Péptidos cortos tipo ISCT.
i Editorial
AyTBUAP 6(21):i-vii Quintero-Hernández., 2021
ABSTRACT Currently humanity is experiencing an unexpected pandemic caused by the SARS-CoV-2 virus that causes the disease called COVID-19. Fortunately, vaccines against SARS-CoV-2 have been developed in record time due to the enormous effort of large scientific laboratories and pharmaceutical companies around the world. However, the end of this pandemic is still a long way off and this event leaves us a lesson that we must live with a culture of prevention. When this pandemic is overcome, humanity cannot return to live in the comfort of the past and ignore another of the serious problems that we currently have and that will worsen in the following years: the increase of multi-resistant bacteria to antibiotics currently available. The World Health Organization (WHO) published in 2017 a list of bacteria that urgently require new antibiotics because they are resistant to several of the conventional antibiotics currently available. The short ISCT-type peptides derived from scorpion venoms have great potential as new antibiotics since they present a broad-spectrum activity, their mechanism of action has very little probability of being blocked by bacteria since this kind of antimicrobials do not act on a specific receptor of the membrane of bacteria. Bacterial membrane structure is an alpha helix and its small size, less than 20 amino acids, facilitates its chemical synthesis without the need for an extra modification. Keywords: Multi-drug resistant bacteria, Antibiotics, ISCT-like short peptides. EDITORIAL
Enterobacteriaceae (Klebsiella pneumoniae,
El 27 de febrero de 2017, la Organización
Escherichia coli, Enterobacter spp., Serratia
Mundial de la Salud (OMS) publicó una lista de
spp.,
las bacterias para las cuales se requieren
Morganella spp.).
urgentemente nuevos antibióticos [1] y además
Proteus
spp.,
Providencia
spp.,
Este tipo de bacterias multirresistentes se
las clasificó en tres categorías de acuerdo al
encuentran frecuentemente en hospitales, asilos
grado de urgencia como se muestra en la figura
y afectan en mayor medida a pacientes
1.
inmunosuprimidos, provocando infecciones del
El grupo de prioridad crítica incluye a:
torrente sanguíneo y neumonías. Todas son
Acinetobacter
resistentes a carbapenémicos (antibióticos de
baumannii,
Pseudomonas
aeruginosa y algunas bacterias de la familia
amplio ii
Editorial
espectro)
y
las
de
la
familia
AyTBUAP 6(21):i-vii Quintero-Hernández., 2021
Enterobacteriaceae además son resistentes a cefalosporinas de 3ra generación.
Figura 1. Grupos de bacterias de prioridad crítica, alta y media para las cuales se requieren nuevos antibióticos. CA= resistente a carbapenémicos (antibióticos de amplio espectro), CE= resistente a cefalosporinas de 3ra generación, VA= resistente a vancomicina, ME= resistente a meticilina, CLA= resistente a claritromicina, FLU= resistente a fluoroquinolona, PE= resistente a penicilina, AMP= resistente a ampicilina.
El grupo de prioridad Alta esta constituido por:
fluoroquinolona),
Enterococcus
(resistente a fluoroquinolona y a cefalosporinas
vancomicina), (resistente
a
Helicobacter
faecium
(resistente
Staphylococcus meticilina pylori
y
a
gonorrhoeae
de 3ra generación).
aureus
Finalmente el grupo de prioridad Media
vancomicina),
(resistente
Neisseria
integrado por: Estreptococcus pneumoniae (no
a
claritromicina), Campylobacter (resistente a
suceptible
fluoroquinolona), Salmonella spp. (resistente a
influenzae (resistente a ampicilina), Shigella
iii Editorial
a
penicilina),
Haemophilus
AyTBUAP 6(21):i-vii Quintero-Hernández., 2021
spp. (resistente a fluoroquinolona).
bacterias resistentes a antibióticos.
Mycobacterium tuberculosis es otra de las
Los mecanismos de resistencia bacteriana a los
bacterias multiresistentes a antibióticos, la cual
antibióticos incluyen: la inactivación de los
no se incluyó en la lista publicada por la OMS
antibióticos por hidrólisis, alteración del sitio
en 2017, porque ya se había alertado de ella
blanco de acción del antibiótico, evitando que
previamente.
este pueda accesar al sitio blanco haciendo que
La OMS estima que, en 2018, se detectó a nivel
las
mundial alrededor de 500 000 nuevos casos de
antibiótico y la expulsión del antibiótico desde
tuberculosis resistente a la rifampicina (TBRR),
interior de la célula a través de transportadores
y de estos nuevos casos la gran mayoría se debe
de salida unidos a la membrana. Estos
a Mycobacterium tuberculosis multirresistente
mecanismos
(TBMR), la cual es resistente a los dos
principalmente como resultado de mutaciones
antituberculosos más potentes. La aparición de
de genes endógenos y / o transferencia lateral
la resistencia a los nuevos medicamentos de
de genes de resistencia de otros patógenos [3].
último recurso (isoniazida y rifampicina) contra
Algunos investigadores predicen que para el
la tuberculosis farmacorresistente supone una
año
amenaza importante [2]. En el presente número
multirresistentes [4], una idea aterradora,
de nuestra revista Alianzas y Tendencias se
aunque otros investigadores opinan que en el
incluye un artículo relacionado: Identificación
año 2035 no todas las bacterias serán
molecular de especies de Mycobacterium
multirresistentes [5] y otros opinan que no están
aisladas de pacientes con diagnóstico clínico de
seguros [6]. Lo que es un hecho es que se
tuberculosis.
requieren nuevas estrategias para contender con
El surgimiento de bacterias resistentes son
este grave problema que nos acecha. Entre las
resultado de varios factores: el uso incorrecto
estrategias que se proponen se encuentran las
de antibióticos para tratar enfermedades que no
vacunas para prevenir infecciones, los péptidos
son causadas por bacterias, interrumpir el
antimicrobianos o la terapia con fagos,
tratamiento y no cumplir con la dosis y tiempo
diseñadas para matar bacterias utilizando sitios
indicado,
el
blanco que no serán susceptibles a la evolución
almacenamiento incorrecto de los antibióticos
genética, y el uso de anticuerpos o probióticos
que provocan disminución en su acción, son
[7].
algunas de las causas de la selección de
De las estrategias mencionadas, los péptidos
la
automedicación,
iv Editorial
células
2035
sean
de
todas
irreconocibles
para
resistencia
las
bacterias
el
ocurren
serán
AyTBUAP 6(21):i-vii Quintero-Hernández., 2021
antimicrobianos, tienen un enorme potencial y
interacciones electrostáticas, formando poros
al respecto se publicó en esta revista un artículo
los cuales colapsan la integridad celular y como
referente
antimicrobianos
no actúan sobre un receptor o blanco especial la
provenientes de venenos de alacrán [8]. Dentro
posibilidad de que se genere o seleccione una
de estos, existen varios tipos de péptidos
bacteria resistente es muy baja.
clasificados principalmente por su tamaño en
No obstante que hay varias alternativas para
péptidos cortos (menores a 30 aminoácidos),
contender con la multirresistencia de las
medianos
bacterias, se deben seguir explorando otras
a
y
péptidos
largos
(alrededor
de
75
aminoácidos). Los péptidos cortos tienen una
alternativas
y
estructura de alfa-helice (Figura 2), por su
antibacteriano. Se deben financiar de manera
tamaño pueden ser fácilmente sintetizados
prioritaria
químicamente, su costo de producción es
continuar con la evaluación de las alternativas
relativamente bajo y lo más importante es que
mencionadas y se debe ser más riguroso en la
son péptidos de amplio espectro, activos contra
prescripción y empleo de antibióticos, tanto en
bacterias Gram-positivas y Gram-negativas y se
humanos como en ganado que consumimos
han evaluado contra bacterias multirresistentes
para evitar una futura pandemia por bacterias
provenientes de aislados clínicos, mostrando
multirresistentes a antibióticos.
este
fármacos
tipo
de
con
potencial
investigaciones,
actividad bactericida [9]. Este tipo de péptidos actúan sobre la membrana bacteriana, mediante
Figura 2. Estructura del péptido IsCT del veneno del alacrán Opisthacanthus madagascariensis. Estructura 1T51 tomada de la base de datos Protein Data Bank (PDB, https://www.rcsb.org/structure/1T51).
v Editorial
AyTBUAP 6(21):i-vii Quintero-Hernández., 2021
En el presente número de Alianzas y
indizaciones de AyTBUAP (AyT BUAP -
Tendencias BUAP nos complace en presentar a
Indización / Indexing) y a considerarnos como
4 manuscritos que esperamos sean de gran
una buena alternativa para su siguiente
interés para todos nuestros lectores, dos de ellos
publicación.
relacionados con bacterias benéficas para la agricultura: el primero por la Dra. P. Bernal que
REFERENCIAS
aborda el tema “Microorganismos de interés
[1].
para la agricultura del futuro: agentes de
https://www.who.int/medicines/publications/gl
biocontrol y fijadores de nitrógeno” [10] y el
obal-priority-list-antibiotic-resistant-
segundo por Molinales-Pacheco y cols., que
bacteria/en/
abordan el tema “Métodos de identificación molecular
para
[2].
Gluconacetobacter
https://www.who.int/tb/publications/global_re
diazotrophicus” [11]. Como se mencionó anteriormente
un
artículo
original
port/es/
sobre
“Identificación molecular de especies de
[3]. Penesyan A, Gillings M, Paulsen IT (2015)
Mycobacterium aisladas de pacientes con
Antibiotic discovery: combatting bacterial
diagnóstico clínico de tuberculosis” también
resistance in cells and in biofilm communities.
fue abordado en este número [12] y finalmente
Molecules 20:5286–5298.
un manuscrito original sobre “Extractos
[4]. Dimopoulos, G., Kollef, M.H. & Cohen, J.
acuosos de plantas como inhibidores de la
In 2035, will all bacteria be multiresistant? Yes.
germinación de urediniosporas de Hemileia
Intensive Care Med 42, 2014–2016 (2016).
vastatrix; la roya anaranjada del café” [13] fue
https://doi.org/10.1007/s00134-016-4310-y
publicado en el presente número (AyTBUAP
[5]. Barbier F, Lipman J, Bonten MJM. In 2035,
6(21)). Los 4 manuscritos pasaron nuestros
will all bacteria be multidrug-resistant? No.
estándares de calidad y fueron evaluados por
Intensive Care Med. 2016 Dec;42(12):2017-
tres revisores previo a la aceptación de la
2020. doi: 10.1007/s00134-016-4348-x. Epub
versión final. La calidad de la revista ha ido en
2016 Apr 18. PMID: 27091442.
incremento y esto se ha reflejado en la [6]. Czaplewski L, Bax R, Clokie M et al (2016)
evaluación positiva de las indizadoras que han
Alternatives to antibiotics—a pipeline portfolio
otorgado un factor de impacto a nuestra revista.
review. Lancet Infect Dis 16:239–251.
Los invitamos a dar un paseo por las
[7]. Laupland KB, Ruppé E, Harbarth S. In vi Editorial
AyTBUAP 6(21):i-vii Quintero-Hernández., 2021
2035, will all bacteria be multidrug resistant?
Martínez L. Identificación molecular de
We are not sure. Intensive Care Med. 2016
especies
Dec;42(12):2021-2023. doi: 10.1007/s00134-
pacientes
016-4343-2. Epub 2016 Apr 18. PMID:
tuberculosis. Alianzas y Tendencias BUAP
27091440.
[Internet]. 2021;6(21):12–27. Available from:
[8]. Quintero-Hernández, V., Cesa Luna C.,
https://drive.google.com/file/d/1MA5xgMKM
MuñozRojas J. Péptidos antimicrobianos de
PSEKW8OIDquBYfgirF3eX5Ns/view
alacrán Alianzas y Tendencias. 2017, Vol. 2,
[12]. Molinares-Pacheco C, Muñoz-Morales
No. 6.
JM, Carbajal-Armenta A, Hernández-Tenorio
[9]. Catherine Cesa-Luna, Jesús Muñoz-Rojas,
AL,
Gloria Saab-Rincon, Antonino Baez, Yolanda
Métodos de identificación molecular para
Elizabeth Morales-García, Víctor Rivelino
Gluconacetobacter diazotrophicus. Alianzas y
Juárez-González,
Tendencias BUAP [Internet]. 2021;6(21):28–
Hernández.
Verónica
Structural
Quintero-
characterization
44.
of
de
Mycobacterium
con
aisladas
de
clínico
de
diagnóstico
Cueto-Becerra
A,
Muñoz-Rojas
Available
J.
from:
scorpion peptides and their bactericidal activity
https://drive.google.com/file/d/1uuGL5Dfm5B
against clinical isolates of multidrug-resistant
HzaXWiWmfs-O5tr6hxoAej/view
bacteria. PLOS ONE, Published: November 11,
[13]. García-Pérez J-A, Alarcón-Gutiérrez E,
2019.
Torres Pelayo V del R. Extractos acuosos de
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0222438
plantas como inhibidores de la germinación de
[10]. Bernal P. Microorganismos de interés para
urediniosporas de Hemileia vastatrix; la roya
la agricultura del futuro: agentes de biocontrol
anaranjada del café. Alianzas y Tendencias
y fijadores de nitrógeno. Alianzas y Tendencias
BUAP [Internet]. 2021;6(21):45–60. Available
BUAP [Internet]. 2021;6(21):1–11. Available
from:
from:
https://drive.google.com/file/d/1EwNETNjHT
https://drive.google.com/file/d/1As-
sojNvFk85gIAxsJlZkTu4eK/view
aH8E-rkaJzcbyTRFqEJ2M-Kzco1ZJ/view [11]. García-Cortés C, Martínez-Cruz PM, Bernabé-Pérez EA, Muñoz-Rojas J, Martínez-
vii Editorial
AyTBUAP 6(21):1-11 Bernal, 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.21.01
Microorganismos de interés para la agricultura del futuro: agentes de biocontrol y fijadores de nitrógeno Patricia Bernal* ID. Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Av. Reina Mercedes 6, C.P. 41012, Sevilla, España. Teléfono: +34-954557116; Fax: +34-954557830. *Email autor corresponsal: pbernal@us.es Recibido: 31 de diciembre 2020. Aceptado: 13 febrero 2021 RESUMEN La agricultura extensiva, necesaria para cubrir las necesidades nutricionales de los miles de millones de habitantes del planeta, ha requerido de diversos métodos para asegurar la producción a la vez que para evitar pérdidas millonarias. Entre estos métodos, el uso de compuestos químicos como los pesticidas y los fertilizantes nitrogenados ha permitido el abastecimiento de frutas, hortalizas, legumbres y cereales tanto para los animales de granja como para los seres humanos durante las últimas décadas. Por un lado, los pesticidas químicos han sido fundamentales para evitar las grandes pérdidas derivadas de las inevitables plagas que atacan a los cultivos, mientras que los fertilizantes nitrogenados han permitido aumentar enormemente la producción de los mismos, al proveer a los cultivos de su principal limitante para el crecimiento, el nitrógeno en su forma asimilable. Aunque es indudable que estas dos herramientas han sido claves para mantener la agricultura extensiva, ambas tienen graves efectos secundarios para el medio ambiente como la contaminación del subsuelo o la pérdida del microbioma natural tanto del suelo como de la planta. Por esta razón, en los últimos años, se vienen priorizando diferentes iniciativas destinadas a promover una agricultura más sostenible con el medio ambiente, donde la producción no sea el único factor a tener en cuenta y se cuide igualmente la salud de nuestro planeta. En este contexto, el control biológico de las enfermedades producidas por patógenos de plantas (fitopatógenos) y la fijación biológica de nitrógeno (rizobios) se consideran alternativas excelentes a los pesticidas químicos y los fertilizantes nitrogenados para proteger nuestros cultivos y aumentar su producción, respectivamente. En este artículo, se describen casos de interés tanto de control biológico a través del uso del sistema de 1 Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):1-11 Bernal, 2021
secreción de tipo VI en Pseudomonas putida como de fijación biológica de nitrógeno (sistema de secreción tipo III en rizobios) y se discutirán las posibles direcciones que pueden tomar las nuevas investigaciones en este campo desde el punto de vista de la biotecnología agraria. Palabras clave: biocontrol, fijadores de nitrógeno, sistema de secreción tipo VI (T6SS), sistema de secreción tipo III (T3SS), Pseudomonas putida, rizobios.
ABSTRACT Extensive agriculture necessary to meet the nutritional needs of billions of inhabitants of the planet has required various methods to ensure production as well as to avoid millionaire damages. Among these methods, the use of chemical compounds such as pesticides and nitrogen fertilizers has allowed the supply of fruits, vegetables, legumes and cereals for both farm animals and human beings during the last decades. On one hand, chemical pesticides have been fundamental to avoid the great losses derived from crop pests. On the other hand, nitrogen fertilizers have allowed to greatly increase agriculture production by providing crops with their main limitation for growth, assimilable nitrogen. Although it is clear that these approaches have been key to maintaining extensive agriculture, both have serious secondary effects on the environment including contamination of the soil and the impairment of natural microbiome. For this reason, in recent years, different initiatives have been prioritized to promote sustainable agriculture to preserve our planet. In this context, the biological control of diseases caused by plant pathogens (phytopathogens) and the biological nitrogen fixation are considered excellent alternatives to chemical pesticides and nitrogen fertilizers to protect our crops and increase their production, respectively. In this article, both, the biological control carried out by Pseudomonas putida using the type VI secretion system and the biological nitrogen fixation performed by rhizobia employing the type III secretion system, are described from the point of view of the agricultural biotechnology. Keywords: biocontrol, nitrogen fixing bacteria, type VI secretion system (T6SS), type III secretion system (T3SS), Pseudomonas putida, rhizobia.
2 Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):1-11 Bernal, 2021
INTRODUCCIÓN Agentes de biocontrol como alternativa a los pesticidas químicos
aniquilar al patógeno sin dañar la planta (cultivo de interés). En esta nueva era y para avanzar en este campo de investigación, es
El uso de microorganismos ambientales para
crucial comprender de manera íntegra los
erradicar patógenos de plantas es una vieja
mecanismos moleculares de control biológico
estrategia que se vio interrumpida tras la
realizados por agentes de biocontrol conocidos
introducción de los pesticidas químicos. El uso
y perfectamente establecidos. En este artículo
de estos pesticidas causa muchos efectos
vamos a centrarnos en Pseudomonas putida, un
negativos, incluyendo la erosión del suelo, la
modelo de agente de biocontrol acreditado [1].
contaminación del agua subterránea y la P. putida es una bacteria que, durante años, ha
pérdida de un microbioma saludable tanto del
sido estudiada extensamente por sus múltiples
suelo como de la planta. Por ello, la agricultura
implicaciones biotecnológicas; es una especie
sostenible se ha convertido en una prioridad en
segura y la gran mayoría de sus cepas no
las principales economías del mundo. La
producen enfermedades en humanos, animales,
agricultura sostenible debe ser capaz de
ni plantas. Como dato curioso, la estirpe
satisfacer las necesidades de una población en
KT2440, el microorganismo modelo de los
rápido crecimiento (se estima que la población
estudios que se exponen a continuación, fue la
mundial será de 9,5 mil millones de personas en
primera bacteria en ser patentada (EEUU,
el año 2050) al mismo tiempo que se respeta el
1980). P. putida es una bacteria saprófita del
planeta y sus recursos. De acuerdo con estos
suelo con la capacidad de colonizar la raíz de
principios, el control biológico o biocontrol se
diferentes plantas de cultivo entre ellas el maíz
está convirtiendo, una vez más, en una
[2]. La colonización llevada a cabo por esta
alternativa extremadamente interesante para
bacteria proporciona ventajas de crecimiento a
proteger nuestros cultivos de una manera
la planta [3] y, al mismo tiempo, protección
eficiente y sostenible, al tiempo que se evita el
contra una gran variedad de fitopatógenos; ya
uso de pesticidas químicos. El biocontrol
sean otras bacterias, hongos o incluso gusanos
consiste en controlar enfermedades producidas
[4,5,6], por lo que, como comentábamos
por diferentes microorgasnimos en plantas
anteriormente, es considerada un agente de
conocidos como patógenos de plantas o
control biológico.
fitopatógenos mediante el uso de un arma biológica, es decir, otro microorganismo con la
Se conocen diferentes mecanismos usados por
capacidad de inhibir el crecimiento o incluso
bacterias para biocontrolar enfermedades en 3
Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):1-11 Bernal, 2021
plantas incluyendo la síntesis de bacteriocinas,
vez eyectada perfora las membranas celulares
antibióticos o la producción de sideróforos [1].
[9] (Fig. 1A). Una vez que se ensambla el
Pero aquí vamos a centrarnos en un nuevo
sistema, existen señales mayoritariamente
mecanismo
desconocidas
de
biocontrol
descubierto
que
producen
un
cambio
recientemente en P. putida KT2440, el sistema
conformacional a nivel de placa base y esto se
de secreción de tipo VI (T6SS, por sus siglas en
traduce en la contracción de la vaina que
inglés Type VI Secretion System) que confiere
expulsa el tubo interno (Hcp) y su punta (VgrG
a esta estirpe casi la totalidad de su capacidad
y PAAR), ambos cargados con toxinas
biocontroladora [7] (Fig. 1A). El T6SS es una
(efectores) hacia el exterior celular para ser
nanomáquina bacteriana utilizada para inyectar
secretados en el interior de la célula diana
efectores
célula
(Fig.1A). Con frecuencia, las dianas del T6SS
productora hasta el interior de las células diana,
son otras células procariotas y, por ello, se
donde pueden tener efectos letales sobre las
considera una potente arma antimicrobiana [9],
mismas. Es por ello que esta herramienta
aunque también se conocen efectores de tipo VI
molecular juega un papel extremadamente
con dianas eucariotas como células animales
importante en la competición entre bacterias y
[10] y hongos [11].
así, las estirpes bacterianas que expresan de
P. putida contiene tres T6SS llamados K1-, K2-
forma activa este sistema de secreción
y K3-T6SS; cada uno de ellos contiene el
presentan grandes ventajas con respecto al resto
número mínimo de componentes necesarios
de
para
directamente
organismos
desde
presentes
en
la
ambientes
formar
una
maquinaria
funcional
polimicrobianos complejos [8]. La estructura
(componentes
del T6SS se asemeja a un bacteriófago invertido
denominados accesorios implicados en la
que se ancla a la membrana a través de un
regulación del sistema o que confieren alguna
complejo de membrana (TssJ, TssM y TssL) al
variedad en la conformación del mismo y al
que se une una placa base (TssE, TssF, TssG y
menos 12 pares de efectores (toxinas) /
TssK) desde donde polimeriza un tubo (Hcp)
proteínas inmunitarias (pares EI, del inglés
rodeado por una cubierta contráctil o vaina
Effector / Immunity pair). Entre estos efectores,
(TssB y TssC) y terminada por un complejo
denominados Tke (del inglés, T6SS KT2440
formado por la proteína TssA. Por el otro
effector), se encuentran nucleasas y colicinas
extremo, y a nivel de placa base, el sistema
formadoras de poros principalmente y una gran
termina en una punta (VgrG y PAAR), que una
parte de ellos tienen función desconocida [7]. 4
Artículo de revisión
centrales),
componentes
AyTBUAP 6(21):1-11 Bernal, 2021
Figura 1. Representación esquemática de los procesos de biocontrol y fijación biológica de nitrógeno en la rizosfera de una planta. A) P. putida usa su sistema de secreción de tipo VI para inyectar toxinas antimicrobianas y eliminar a un fitopatógeno que de otra forma hubiera causado una enfermedad en la planta. Código de colores del T6SS: rojo (ClpV), morado (Hcp), amarillo (VgrG), negro (PAAR), verde claro (TssJ, TssL, TssM), azul claro (TssB y TssC), rosa claro (TssE, TssF, TssG y TssK), verde oscuro (toxinas) y estrella verde clara (proteínas inmunitarias). B) comunicación entre la planta (flavonoides) y el rizobio (factores de nodulación y T3SS) para promover la formación de nódulos donde la bacteria llevará a cabo la fijación biológica de nitrógeno gracias a la enzima nitrogenasa.
Dos genes vgrG (vgrG4 y vgrG5) y tres genes
proteínas inmunitarias en estos sistemas. Las
hcp (hcp4, hcp5 y hcp6) se encuentran fuera de
proteínas inmunitarias son necesarias para
los clústeres de tipo VI diseminados en el
evitar
cromosoma y están genéticamente ligados a
antimicrobianos sintetizados por la propia
pares EI (efectores-proteínas inmunitarias) [7].
célula T6SS+ y para protegerse del ataque
Es interesante destacar que los genes que
indiscriminado de células hermanas [9] (Fig.
codifican las putativas proteínas inmunitarias
1A). Se ha demostrado que el K1-T6SS de P.
de tipo VI se encuentran inmediatamente aguas
putida es un potente dispositivo antibacteriano
abajo de los genes que codifican las toxinas y
que secreta un efector tóxico con actividad
en la mayoría de las ocasiones estos genes
nucleasa (Tke2) [7]. Sorprendentemente, P.
solapan para asegurar la transcripción de
putida es capaz de matar a una amplia gama de
ambos, lo que demuestra la importancia de las
bacterias de una manera dependiente de este 5
Artículo de revisión
la
intoxicación
con
efectores
AyTBUAP 6(21):1-11 Bernal, 2021
sistema de secreción incluyendo fitopatógenos
tiene un gran impacto negativo en el medio
de
como
ambiente, siendo considerados uno de los
Pseudomonas
mayores contaminantes de nuestros acuíferos.
importancia
Agrobacterium syringae,
comercial tumefaciens,
Pseudomonas
tales
savastanoi
y
La aplicación de rizobios simbióticos a los
Xanthomonas campestris [7]. Además, estos
cultivos es una fuente alternativa de nitrógeno
estudios demuestran que la protección se
para las plantas sin rastro ambiental y barata
produce también en ensayos in planta y que
desde el punto de vista del agricultor, pero su
Nicotiana está protegida del ataque de
uso está restringido a las legumbres, las únicas
Xanthomonas en una forma dependiente de
plantas hospedadoras de rizobios fijadores de
T6SS [7]. Como ha quedado demostrado en
nitrógeno.
estas investigaciones, la eficacia de esta nueva
representativas se encuentran Bradyrhizobium
arma biológica para el control de plagas es
japonicum,
sumamente relevante para futuras aplicaciones
Rhizobium
biotecnológicas aplicadas a la agricultura, ya
Sinorhizobium fredii. La mayoría de las
que evitaría el uso de pesticidas químicos
especies de leguminosas pueden fijar nitrógeno
controlando los fitopatógenos con eficientes
atmosférico a través de rizobios simbióticos
agentes de biocontrol sin huella ecológica. Por
pero su eficiencia y rendimiento dependen del
tanto, este nuevo mecanismo de biocontrol debe
par simbiótico, es decir, existe un alto grado de
ser considerado para la selección de futuros
especificidad entre el microorganismo y la
agentes de control biológico con la capacidad
planta
de manipular la composición microbiana de la
diazotróficas (fijadoras de nitrógeno) solo
rizósfera y la filósfera.
pueden formar nódulos efectivos con unas
y
Entre
las
especies
Rhizobium etli,
la
leguminosarum,
Mesorhizobium
mayoría
más
de
las
loti
y
bacterias
pocas especies de leguminosas [12]. Fijación biológica de nitrógeno como alternativa a los fertilizantes nitrogenados
La simbiosis rizobio-leguminosa ha sido
La producción eficiente de cultivos de interés
y es la asociación entre un microorganismo y
agrícola depende en gran medida del uso de
una planta mejor comprendida hasta la fecha.
fertilizantes nitrogenados químicos, ya que el
Esta relación simbiótica de fijación de
nitrógeno asimilable es uno de los mayores
nitrógeno comienza cuando el nivel de
limitantes del crecimiento de las plantas. Sin
nitrógeno limita el crecimiento de la planta
embargo, el uso excesivo de estos fertilizantes
leguminosa por ser demasiado bajo. En esta
ampliamente estudiada durante varias décadas
6 Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):1-11 Bernal, 2021
situación,
se
desencadena
complejo
FN, las proteínas secretadas a través del sistema
intercambio de señales moleculares, que
de secreción de tipo III (T3SS, de sus siglas en
conduce a variaciones en la expresión de un
inglés Type III Secretion System) también
gran conjunto de genes en ambos beneficiarios
tienen un efecto importante en la eficiencia
de la simbiosis. Esta conversación molecular
simbiótica y el rango de hospedadores de
garantiza que solo los rizobios compatibles con
nodulación de los rizobios (Fig. 1B). El T3SS
la leguminosa en cuestión infecten con éxito las
está ampliamente distribuido en bacterias
raíces de las mismas y se alojen dentro de un
Gram-negativas y se utiliza para dirigir
nuevo tipo de órgano formado por la planta para
proteínas efectoras (T3E) directamente al
el microrganismo, el nódulo, donde los rizobios
interior de las células hospedadoras eucariotas
pueden replicarse y llevar a cabo la fijación de
donde pueden alterar la señalización de la
nitrógeno [13]. Los flavonoides secretados por
misma y/o suprimir las respuestas de defensa
las raíces de las leguminosas son las primeras
del hospedador (Fig. 1B). En los rizobios, el
señales de este diálogo simbiótico. Estas
T3SS está presente en solo unas pocas especies
moléculas interactúan directamente con NodD,
y los T3E se conocen colectivamente como
un regulador transcripcional bacteriano que
proteínas Nop (por sus siglas en inglés,
induce la expresión de unos genes específicos
Nodulation outer proteins) [15]. La síntesis y
involucrados en la nodulación y denominados
secreción de proteínas Nop están controladas
genes nod (Fig. 1B). Los genes nod codifican
por el regulador transcripcional TtsI, cuya
proteínas involucradas en la síntesis de
actividad depende de los flavonoides secretados
moléculas
denominadas
por las leguminosas y del factor transcripcional
factores de nodulación o Factores Nod (FN).
NodD (Fig. 1B) [16]. Además de NodD y TtsI,
Los FN son reconocidos por receptores de las
otros reguladores transcripcionales alternativos
leguminosas denominados Receptores de FN
participan en el delicado ajuste de la expresión
(RFN), los cuales activan una cascada de
génica que regula la simbiosis en rizobios,
señalización en la planta que induce la
incluyendo NolR y SyrM que controlan la
formación y progresión de los tubos de
expresión de los genes nod específicos
infección (IT, por sus siglas en inglés Infection
uniéndose a sus regiones promotoras y, por
Threads) y el desarrollo de nódulos para
tanto, juegan un papel importante en la
introducir y albergar rizobios compatibles,
modulación de la síntesis de factores Nod
respectivamente (Fig.1B) [14]. Junto con los
[17,18].
señal
específicas
un
7 Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):1-11 Bernal, 2021
La ausencia de estos reguladores alternativos
una idea plausible. Hasta ahora, la comunidad
altera
científica ha centrado sus esfuerzos en el
negativamente
pero
no
bloquea
totalmente el proceso simbiótico entre el
desarrollo
organismo
genéticamente
modelo
Sinorhizobium
fredii
de
cereales para
fijar
modificados directamente
HH103 y su planta hospedadora natural, la soja
nitrógeno o para fomentar el desarrollo de
[19–22]. Estos resultados indican que las vías
nódulos con rizobios simbióticos fijadores de
reguladoras simbióticas microbianas y los
nitrógeno [25]. Un enfoque novedoso sería el
elementos que determinan el rango de
uso de rizobios "promiscuos" que carezcan de
hospedador (FN y T3E) están perfectamente
los genes simbióticos específicos que optimizan
ajustadas y permiten una interacción óptima y
la especificidad con una leguminosa concreta.
específica con su hospedador. Cabe destacar
Estos rizobios “no-discriminatorios” serían
que la ausencia de estos reguladores, aunque
menos eficientes en la fijación de nitrógeno con
disminuye la eficiencia de la fijación de
su hospedador natural, pero estarían más
nitrógeno con su par simbiótico, permite
abiertos a la posibilidad de establecer una nueva
extender el rango de hospedadores del rizobio,
simbiosis con otros hospedadores, por ejemplo,
que en estas condiciones es capaz de inducir la
con cereales.
formación de IT y nódulos fijadores de
Estas
nitrógeno en raíces de plantas hasta ahora
microorganismos beneficiosos de alto interés
consideradas no compatibles (revisado en [23]).
en la biotecnología agrícola nos acercan a la
Estos
nuevas
agricultura del futuro que se enfrenta al gran
perspectivas para abordar el desafío de extender
reto de alimentar a un planeta superpoblado de
la capacidad de fijación de nitrógeno a otras
forma sostenible. Estas nuevas aproximaciones,
plantas no leguminosas, incluidas los cereales.
respetuosas con el medio ambiente, ofrecen
Los cereales como el arroz, el maíz y el trigo
soluciones a los graves problemas actuales de
son los cultivos más importantes para la
contaminación por productos químicos de
nutrición humana y curiosamente desarrollan
forma que la agricultura sostenible, basada
simbiosis con micorrizas arbusculares usando
principalmente en el uso de microorganismos,
las mismas proteínas que juegan un papel
pueda ser una realidad en un futuro muy
crítico en las etapas iniciales de las simbiosis
cercano.
descubrimientos
abren
raíz-nódulo en leguminosas [24], por lo que la nodulación de cereales por rizobios puede ser 8 Artículo de revisión
líneas
de
investigación
con
AyTBUAP 6(21):1-11 Bernal, 2021
CONFLICTO DE INTERESES
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AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.21.02
Identificación molecular de especies de Mycobacterium aisladas de pacientes con diagnóstico clínico de tuberculosis Carlos García-Cortés1, Perla M. Martinez-Cruz2,4, Edith A. Bernabé Pérez2, Jesús Muñoz-Rojas3 ID, Lucía Martínez-Martínez2* ID. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca, Oaxaca, México. 2 Laboratorio de Biología Molecular, Centro de Investigación Facultad de Medicina UNAM-UABJO, Facultad de Medicina y Cirugía, Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca, Oaxaca, México. Carretera a San Felipe del Agua s/n, Exhacienda de Aguilera, Oaxaca, Oaxaca, México. C.P. 68020, Tel 951-5139784. 3 Grupo Ecology and Survival of Microorganisms, Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. 4 División de Estudios de Posgrado e Investigación, Instituto Tecnológico de Oaxaca, Oaxaca, México. 1
*Email autor corresponsal: lumartin1969@yahoo.com.mx Recibido: 27 noviembre 2020. Aceptado: 8 febrero 2021 RESUMEN Antecedentes: La incidencia de tuberculosis (TB) en México aumenta debido, entre otras causas, a un diagnóstico inespecífico o retardado. Marcadores moleculares como los genes rpoB y 16S rRNA se han utilizado en la identificación del género Mycobacterium. La secuencia de inserción 6110 (IS6110) ha sido empleada como marcador genético en la genotipificación del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB). Objetivo: Realizar un estudio retrospectivo para evaluar a los genes rpoB, 16S rRNA y la IS6110, en la identificación de aislados del género Mycobacterium y del CMTB. Métodos: Se analizaron 146 muestras clínicas. Empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplificaron fragmentos de los genes rpoB, 16S rRNA e IS6110. La especie M. bovis fue identificada mediante un ensayo de PCR Multiplex. Resultados: En 65 muestras clínicas se determinó la presencia de micobacterias mediante amplificación de los genes 16S rRNA y rpoB. En 22/65 aislados se amplificaron únicamente los genes rpoB y/o 16S rRNA. La presencia del CMTB se confirmó en 43/65 aislados mediante la amplificación 12 Artículo original
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
de la IS6110. La comparación de las secuencias obtenidas de los fragmentos amplificados de los genes rpoB, 16S rRNA y la IS6110 con las reportadas en el GenBank, demostró una homología de 98%-100% con especies de micobacterias pertenecientes al CMTB. Discusión: El uso de técnicas moleculares para el diagnóstico de enfermedades infecciosas permite obtener resultados precisos y en tiempos cortos. En el caso de las infecciones por micobacterias, el empleo de los marcadores genéticos rpoB, 16S rRNA y la IS6110 coadyuva al diagnóstico diferencial entre TB y micobacteriosis, lo que contribuye a orientar el tratamiento que se administre al paciente. Palabras clave: Diagnóstico, IS6110, Mycobacterium, rpoB, 16S rRNA, tuberculosis.
ABSTRACT Background: Tuberculosis (TB) incidence in Mexico is increasing due to an unspecific or delayed diagnosis, among several other causes. Molecular markers such as rpoB and 16S rRNA genes have been used to identify the Mycobacterium genus. Insertion sequence 6110 (IS6110) has been used as a genetic marker in Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) genotyping. Objective: To perform a retrospective study to evaluate rpoB and 16S rRNA genes and IS6110 usefulness to identify the Mycobacterium genus and MTBC isolates. Methods: A total of 146 clinical samples were analyzed. Amplification products from rpoB, 16S rRNA and IS6110 were obtained by Polymerase Chain Reaction (PCR). M. bovis was identified using a Multiplex PCR assay. Results: Mycobacteria were identified in 65 clinical samples as shown by rpoB and 16S rRNA genes amplification. In 22 isolates (22/65) amplification products were obtained only for rpoB and/or 16S rRNA genes. MTBC presence was confirmed in 43/65 isolates as IS6110 amplification product was obtained. Sequencing products of rpoB, 16S rRNA and IS6110 showed 98%-100% homology with MTBC species reported in the GenBank database. Discussion: Inclusion of molecular techniques in infectious diseases diagnosis allows to get precise results in short time. In mycobacterial infections, molecular makers such as rpoB, 16S rRNA and IS6110, largely contribute to make a specific diagnosis and differentiate between TB and mycobacteriosis, leading to the best treatment administration to the patient. Keywords: Diagnosis, IS6110, Mycobacterium, rpoB, 16S rRNA, tuberculosis. 13 Artículo original
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
INTRODUCCIÓN
en general, son útiles las primeras 500 pb para
La tuberculosis (TB) es un padecimiento
realizar una adecuada identificación [3] . En el
infeccioso y transmisible. De acuerdo a datos de
caso de las micobacterias, se han diseñado
la Organización Mundial de la Salud (OMS),
oligonucleótidos que permiten amplificar,
afecta a una tercera parte de la población
eficientemente, fragmentos de entre 500-550 pb
mundial,
los
correspondientes a segmentos no polimórficos
principales problemas de salud [1]. El agente
del 16S rRNA [2]. El gen rpoB es unicopia de
causal de la TB es un bacilo Gram-positivo de
723
lento crecimiento perteneciente al género
conservadas y tres regiones variables. Kim et
Mycobacterium. Se ha identificado un grupo de
al., obtuvieron y compararon la secuencia
estos microorganismos como los responsables
completa de este gen en 44 especies de
de la enfermedad y se le ha designado
micobacterias, concluyendo que existe un
“complejo
tuberculosis”
93.1% de homología entre especies no
(CMTB), el cual agrupa a M. tuberculosis, M.
patógenas y que un fragmento de 306 pb,
bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M.
localizado en una región muy conservada del
caprae, M. pinnipedii, M. mungi y M. orygis. La
gen, presenta una secuencia idéntica en las
elevada homología de los genomas de las
especies pertenecientes al CMTB [4]. Se ha
especies del CMTB permite el uso de ciertas
empleado el gen rpoB –junto con otros genes
regiones como marcadores en la identificación
como hsp65 y 16S rRNA– para detectar
de un probable caso de TB [2].
especies de micobacterias, especialmente las
La identificación molecular de bacterias se
del CMTB [5], así como en el diagnóstico
realiza
altamente
diferencial de especies del complejo M. avium
conservados entre las especies. En el caso del
[6,7] y otras especies de micobacterias no
género Mycobacterium los genes 16S rRNA y
tuberculosas (MNTB) [8].
rpoB se han utilizado con éxito. Pocos genes se
La secuencia de inserción 6110 (IS6110), es un
encuentran tan conservados entre especies
fragmento de 1355 pb que se encuentra inserto
pertenecientes al mismo género como el 16S
en un arreglo de 36 pb, denominado regiones
rRNA. Este gen tiene una secuencia de hasta
repetidas directas (DR) [9]. La secuencia
1550
regiones
IS6110 sólo es detectable en genomas del
En
la
CMTB y tiene la estabilidad necesaria para ser
identificación de bacterias en aislados clínicos,
utilizada como herramienta de diagnóstico [10].
convirtiéndola
en
uno
Mycobacterium
empleando
pb
conservadas
que
genes
contiene
como
tanto
variables.
de
14 Artículo original
pb
que
contiene
cuatro
regiones
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
Fue descrita en 1990 [11] como un elemento de
METODOLOGÍA
inserción micobacteriano que se ha utilizado
Muestras clínicas y descontaminación
sistemáticamente como marcador genético para
Durante el periodo 2006 a 2008, se obtuvieron
la genotipificación de especies de CMTB dado
aislados de 146 muestras clínicas provenientes
su nivel de conservación entre ellas mediante el
de 106 pacientes quienes fueron diagnosticados
polimorfismo de longitud de fragmentos de
clínicamente con TB en instituciones públicas
restricción (RFLP) [12-14].
de salud del estado de Oaxaca. El 95% (139) de
La diferenciación entre especies del CMTB es
las muestras fueron expectoraciones y el 5% (7)
importante para fines de administración de
correspondieron a: jugo gástrico (3), líquido
pirazinamida,
principales
ascítico (1), líquido pleural (1), heces (1) y
antifímicos empleados en el tratamiento contra
orina (1). En este estudio se incluyeron las
TB. M. bovis presenta resistencia intrínseca a
cepas de referencia M. tuberculosis H37Rv, M.
este fármaco debido al cambio C por G en la
tuberculosis H37Ra, M. bovis AN5 y M. canetti
posición 169 del gen pncA por lo que este
1728. Las muestras de expectoración fueron
polimorfismo se ha empleado como marcador
descontaminadas
molecular en la identificación de esta especie
modificado de Petroff [16] previo a la
[15,18].
extracción de ADN.
uno
de
los
La incidencia de TB en México va en aumento
de
un
método
La extracción del ADN total se realizó de
administración de un tratamiento adecuado consecuencia
el
Extracción de ADN
debido, entre otras causas, al retraso en la
como
empleando
acuerdo a las instrucciones del fabricante
diagnóstico
utilizando el kit de extracción Wizard Genomic
inespecífico o retardado. Por lo que el objetivo
DNA Purification Kit (Promega. Madison, WI,
de este trabajo fue realizar un estudio
USA). El ADN se cuantificó mediante
retrospectivo para evaluar la utilidad de los
espectrofotometría
genes rpoB, 16S rRNA e IS6110, como
UV
(Nanodrop
Lite,
Thermoscientific. Wlatham, MA, USA) y se
marcadores genéticos en la identificación de
observó en gel de agarosa al 0.8%.
aislados del género Mycobacterium, así como Ensayos moleculares
del complejo Mycobacterium tuberculosis.
Las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descritas a continuación se realizaron en un volumen final de 50µL, el cual 15 Artículo original
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
contenía Buffer 1X, mezcla de dNTPs 10 mM,
16S rRNA y rpoB, respectivamente [2].
MgCl2 25 mM, 1.25 U taq ADN polimerasa Amplificación de la IS6110
(GoTaq Flexi DNA Polymerase, Promega.
La amplificación de un fragmento de 245 pb de
Madison, WI, USA) y 20 ng/µL de ADN
la secuencia de inserción 6110 (IS6110) fue
obtenido a partir de cada aislado clínico. Los
efectuada para determinar la presencia de
oligonucleótidos correspondientes para cada
aislados
reacción se muestran en la Tabla 1. Los
del
complejo
Mycobacterium
tuberculosis [17].
productos de amplificación se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al
PCR multiplex
1.5%.
La diferenciación entre M. bovis y otras especies del CMTB se estableció mediante la
Amplificación de genes 16S rRNA y rpoB
amplificación de dos fragmentos del gen pncA
La identificación de aislados del género Mycobacterium
se
realizó
mediante
en un ensayo de PCR multiplex de acuerdo a lo
la
descrito previamente [18]. La secuencia de los
amplificación, por separado, de dos fragmentos
oligonucleótidos y las condiciones de reacción
de 543 pb y 359 pb correspondiente a los genes
se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Oligonucleótidos y condiciones de amplificación. Primer
Secuencia
IS6110
INS–1 INS–2
CGTGAGGGCATCGAGGTGGC GCGTAGGCGTCGGTGACAAA
245
94°/30 seg 65°/2 min 72°/3 min
16S rRNA
16SrNAF 16SrNAR
ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA
543
94°/1 min 60°/1 min 72°/1 min
rpoB
rpoBF rpoBR
TCAAGGAGAAGCGCTACGA GGATGTTGATCAGGGTCTGC
359
94°/1 min 60°/1 min 72°/1min
JB21 JB22
TCGTCCGCTGATGCAAGTGC CGTCCGCTGACCTCAAGAAAG
500
pncATB-1.2 pncAMT-2
ATGCGGGCGTTGATCATCGTC CGGTGTGCCGGAGAAGCGG
185
pncA
Producto
16 Artículo original
Condiciones
94°/1 min 67°/1 min 72°/1 min
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
Secuenciación Los
IS6110,
productos
de
este
grupo
de
amplificación
micobacterias. En las 22 muestras restantes no
correspondientes a los genes 16S rRNA, rpoB y
se observó la amplificación de la IS6110, aun
la
cuando si se obtuvo el amplicón para el gen 16S
IS6110
se
de
específico
purificaron
mediante
minicolumnas (Wizard SV Gel and PCR Clean-
rRNA y/o rpoB (Tabla 2).
up System, Promega. Madison, WI, USA) y
Los 43 aislados que mostraron la IS6110 por
fueron enviados a secuenciación a la empresa
PCR se clasificaron en tres grupos de acuerdo
Macrogen
al número de marcadores amplificados como se
(Rockville,
USA).
Los
oligonucleótidos empleados para este proceso
describe a continuación.
fueron: rpoBF, INS-1 y 16SRNAF (Tabla 1).
En 10 de los 43 aislados (Tabla 2) se obtuvieron productos de PCR para los tres marcadores
Análisis de similitud de secuencias
analizados (16S rRNA, rpoB e IS6110). De
Una vez obtenidas las secuencias de cada uno
estos 10 aislados, 7 mostraron crecimiento en
de los amplificados, se analizaron empleando la
medio de cultivo Lowentein-Jensen específico
herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool)
Información
del
Centro
Nacional
Biotecnológica
para micobacterias tuberculosas, identificando
de
mediante morfología colonial que tres de ellas
(NCBI)
(24, 91 y 113) son semejantes a la cepa de
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para determinar
referencia H37Ra de M. tuberculosis; dos (32a
su homología con genomas de otros organismos
y 95), a M. canettii 17228; y, finalmente, los
reportados previamente.
aislados 36 y 92 presentaron combinaciones de características identificadas en ambas cepas de
RESULTADOS
referencia. Adicionalmente, para las muestras
Se analizaron 146 aislados clínicos para la identificación
de
micobacterias.
24, 36, 91, 92, 95 y 113 se obtuvieron las
La
secuencias de los fragmentos amplificados de
amplificación de los genes IS6110 y/o 16S
los genes rpoB, 16S rRNA e IS6110, las cuales
rRNA y/o rpoB en 44.5% (65) de las muestras
posteriormente se compararon con lo reportado
confirmó la existencia de aislados del género
en el GenBank mediante la herramienta
Mycobacterium; en tanto que en el 55.5% (81) restante, no se obtuvieron amplificados. En 43 de los 65 aislados se confirmó la
BLAST,
observándose
secuencia
nucleotídica
una de
similitud 98-100%
de con
especies de micobacterias pertenecientes al
presencia del CMTB al obtenerse el producto
CMTB (Tabla 3).
de amplificación de 245 pb correspondiente a la 17 Artículo original
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
Tabla 2. Amplificación de marcadores moleculares. NR: No realizado ID aislado
Origen del aislado
M. tuberculosis H37Rv M. tuberculosis H37Ra
Cultivo Cultivo
M. canetti 1728
PCR IS6110 16S rpoB + + + +
+
+
Cultivo
+
+
NR
24, 32a, 36, 48, 89, 91, 92, 95, 113, 158
Expectoración
+
+
+
61, 65, 93
Expectoración
+
+
-
131a, 166a, 184
Expectoración
+
-
+
Expectoración
+
-
-
109
Expectoración
-
+
+
57, 57a, 67a, 75, 82a, 103, 129a, 155a, 160a, 172a
Expectoración
-
+
-
68b, 154b, 160, 161, 161a, 166b, 167a, 171a, 183, 192a
Expectoración
-
-
+
11
Jugo gástrico
+
-
-
23
Heces
-
+
+
15, 46, 49, 69, 97, 104, 130, 133a, 135a, 138a, 146b, 147b, 148a, 148b, 149b, 150b, 166, 169a, 177, 177a, 178a, 180, 181, 181a, 182, 198a
La amplificación de la IS6110 en seis aislados
AN5.
(61, 65, 93, 131a, 166a, y 184) coincidió con la Finalmente, se identificó un grupo de 27
presencia de dos marcadores, el fragmento del
aislados (27/43) en las que sólo se obtuvo el
16S rRNA (61, 65, 93) y del rpoB (131a, 166a,
amplicón de 245pb correspondiente a la IS6110
184). Al comparar la secuencia de los
(Tabla 2). Además del resultado de esta prueba
fragmentos correspondientes a la IS6110 (65,
molecular, el aislado 138a mostró colonias
93) y 16S rRNA (93) con lo reportado en el
semejantes a la cepa de referencia de M. bovis
GenBank (Tabla 3), se identificó una similitud
AN5
de secuencia nucleotídica de 98% y 99%
microti,
respectivamente
(Tabla
cultivo
Lowenstein-Jensen.
La
identificación de este aislado como M. bovis se
correspondiente a M. tuberculosis, M. bovis y M.
en
confirmó mediante el ensayo de PCR multiplex,
3).
mismo que demostró que el aislado 147b
Adicionalmente, la morfología de las colonias
también pertenece a M. bovis.
observadas en cultivo de la muestra 93, coinciden con la cepa de referencia de M. bovis
18 Artículo original
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
Tabla 3. Similitud de secuencias nucleotídicas obtenidas de los aislados clínicos con las reportadas en GenBank. Aislado
Gen
Especie reportada (BLAST) Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium microti Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium microti
Homología (%)
24
IS6110
36
IS6110
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium microti Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium microti
99
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium microti
99
16S rRNA
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis
99
rpoB
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium microti
99
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium microti
99
16S rRNA
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis
99
rpoB
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium microti
99
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis
98
rpoB 65
IS6110
91
IS6110
rpoB 92
93
IS6110
IS6110
16S rRNA 95
113
IS6110
IS6110
16S rRNA
19 Artículo original
100
99
98
99
96
99
98
96
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
En siete pacientes se analizaron muestras de
Lowenstein Jensen (LJ), debido a la baja
días
sensibilidad del primero (0-40%) y, en el caso
consecutivos.
mostraron
Los
únicamente
aislados el
57/57a, amplicón
del
cultivo,
al
prolongado
tiempo
de
correspondiente a 16S rRNA; en tanto, con los
crecimiento de estos microorganismos, sumado
aislados 161/161a se amplificó solamente el
a la poca disponibilidad de laboratorios con las
gen rpoB. Al analizar los aislados 148a/148b,
medidas de seguridad requeridas para su
177/177a y 181/181a mostraron el fragmento de
manejo [19-21]. Desde hace más de una década
245 pb correspondiente a la IS6110, no así los
se ha recomendado el empleo de técnicas de
productos de rpoB y 16S rRNA (Tabla 2). En
diagnóstico
cuanto a los aislados 160/160a, se obtuvo de
amplificación de marcadores genéticos, siendo
cada
ambos
posible confirmar en menor tiempo con relación
resultados coinciden en mostrar la presencia de
a otras técnicas si la infección es provocada por
micobacterias y la ausencia de aislados del
alguna especie del CMTB [22-25].
uno
distintos
amplicones,
molecular
basadas
en
la
CMTB en el paciente. Finalmente, en los Diversos estudios encaminados a la evaluación
aislados 166/166a/166b se presentó un patrón
de
distinto para cada uno (Tabla 2); sin embargo,
que,
como
se
ha
moleculares
para
la
identificación del CMTB validan sus resultados
dos de ellos muestran el amplificado para la IS6110
marcadores
al compararlos con los obtenidos en medio de
comentado
cultivo Lowenstein-Jensen [26-28]. En este
previamente, es suficiente para demostrar la
trabajo
presencia de aislados del CMTB en las
se
adoptó
la
misma
estrategia,
observándose crecimiento únicamente en 9
muestras clínicas analizadas.
aislados. Este comportamiento puede deberse a DISCUSIÓN
diversos factores entre ellos el manejo de la
La TB es una enfermedad reemergente que
muestra clínica, ya que las especies del CMTB
presenta una creciente incidencia en México. El
son viables por poco tiempo fuera del
diagnóstico rápido y preciso del agente
organismo
infeccioso es de suma importancia en la
probabilidad de crecimiento en cultivo depende
administración del tratamiento adecuado a cada
de la rapidez con la que se siembre la muestra,
paciente. No resulta fácil determinar la
el número de bacilos presentes, pH favorable –
presencia de aislados del CMTB a través de los
contrario a lo que ocurre en orina y jugo
métodos convencionales de diagnóstico como
gástrico, por ejemplo- y la exposición a calor o
la tinción de Ziehl-Nielsen o el cultivo en medio
luz solar [29,30]. 20
Artículo original
hospedero,
por
lo
que
la
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
En el presente estudio, se considera que otro
tratamiento, motivo por el cual el cultivo resultó
factor que afectó el crecimiento bacteriano en
negativo.
medio de cultivo fue la exposición a antifímicos El empleo de marcadores moleculares en la
en 22 pacientes incluidos, quienes habían
identificación de especies de microorganismos
finalizado su tratamiento entre 7 a 30 días antes
en aislados clínicos, favorece la certeza del
de la obtención de la muestra. En estos casos,
diagnóstico. En el caso de las infecciones por
se observó la amplificación del gen 16S rRNA,
micobacterias, es muy importante distinguir
pero sin crecimiento bacteriano en medio de
entre las provocadas por el CMTB y las
cultivo, resultado que concuerda con lo
causadas por micobacterias atípicas también
observado por Rodríguez y colaboradores,
denominadas micobacterias no tuberculosas
quienes obtuvieron muestras de expectoración
(MNTB). La elevada homología que presentan
semanas después de que el paciente inició el tratamiento,
siendo
positivas
al
genes como el 16S rRNA y rpoB entre las
ensayo
especies
molecular pero negativas al cultivo [31]. En el
y
recibió
Mycobacterium,
ha
para su identificación precisa [2,34,35]. Ambos
el caso de un paciente a quien se diagnosticó TB cultivo
género
permitido el empleo de fragmentos específicos
trabajo publicado por Hashimoto et al., reportan
mediante
del
marcadores han sido empleados para la
tratamiento
identificación de micobacterias en humanos en
antifímico durante tres meses. Transcurrido el
quienes pueden provocar TB [5] , lepra [36] o
periodo se recolectó una nueva muestra, la cual
micobacteriosis
fue cultivada sin éxito y, sin embargo, se
[6,7,37]. Incluso
se han
diseñado ensayos para confirmar la presencia
amplificó la IS6110 mediante PCR [32]. En un
de este género entre la diversidad de
estudio realizado en los países bajos, la IS6110
microorganismos que pudieran estar presentes
fue amplificada en 9 de 17 pacientes de cuyas
en una muestra clínica [38]. Reportes del uso de
muestras clínicas no se obtuvo crecimiento
estos marcadores incluyen una diversidad de
bacteriano en cultivo [33]. Por lo anterior, es
muestras, entre ellas suelo [39] y peces [40],
importante considerar la historia clínica del
confirmando la eficacia y precisión de estos
paciente a fin de colectar la muestra, previo a la
genes
administración de cualquier tratamiento, ya que
en
la
identificación
del
género
Mycobacterium. Con base en lo anterior, en 38
los fármacos influyen en el análisis, así como
aislados con la amplificación del gen 16S rRNA
en el resultado mismo del diagnóstico.
(13), rpoB (13) o ambos genes (12) se identificó
Considerando en este caso el éxito del
la presencia de micobacterias, 22 de las cuales 21 Artículo original
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
corresponden a micobacterias atípicas o MNTB
especies del CMTB, lo que servirá para orientar
con ausencia del amplificado correspondiente a
en primera instancia, el tratamiento que se
la IS6110.
administre al paciente. Los marcadores moleculares 16S rRNA o rpoB
La IS6110 es una región exclusiva de las
son
especies que forman el CMTB [9,11,41,42].
útiles
para
micobacteriosis
Desde su descripción se ha utilizado tanto para
el
mediante
diagnóstico
de
el
de
análisis
amplicones específicos de 543 y 359 pb
la identificación de especies del CMTB como
respectivamente. La IS6110 es eficiente, por su
para su genotipificación mediante ensayos de
especificidad, en la determinación de la
RFLP y fingerprinting [13,43]. En el presente
presencia de aislados pertenecientes al CMTB
trabajo se observó que 27 aislados amplificaron
en muestras clínicas. En el presente trabajo, con
este marcador genético, pero con ausencia de
el empleo de estos marcadores genéticos, se
amplificados para el gen 16S rRNA y/o rpoB,
identificaron 43 aislados del CMTB y 22
esto posiblemente debido a la baja calidad del
aislados de MNTB. Los cultivos realizados a
material genético al momento de realizar la
partir de las muestras clínicas, así como las
amplificación, mal manejo del ADN utilizado
secuencias
y/o la posibilidad de la presencia de inhibidores
obtenidas
amplificados,
en la reacción. Reportes previos de estudios
de
los
fragmentos
confirman
los
resultados
obtenidos en este estudio validando la utilidad
realizados en México identificaron la presencia
de estos marcadores en la identificación de
del CMTB empleando únicamente la IS6110
micobacterias tuberculosas y no tuberculosas.
[44,45] validando su utilidad y confirmando
Con base en la evidencia, estos marcadores
que, por sí mismo, la IS6110 es un marcador
moleculares pueden ser empleados para obtener
adecuado para el diagnóstico de TB.
un diagnóstico confiable de TB en periodos cortos, superando en estas características a los
CONCLUSIONES
métodos convencionales de microscopia y
La inclusión de pruebas moleculares en el panel
cultivo.
de estudios de laboratorio realizados para el diagnóstico
de
enfermedades
infecciosas, CONFLICTO DE INTERESES
permite obtener resultados precisos y en
Los autores declaran no tener conflictos de
tiempos cortos. En el caso de las infecciones por
micobacterias
es
muy
intereses.
importante
determinar si éstas son causadas o no por 22 Artículo original
AyTBUAP 6(21):12-27 García-Cortés et al., 2021
AGRADECIMIENTOS
fragment length polymorphism with capillary
El apoyo financiero para la realización del
electrophoresis as an effective algorithm for
presente trabajo se obtuvo a través del
identification of Mycobacterial species from
Programa
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Integral
Institucional
(PIFI)
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Fortalecimiento el
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Métodos de identificación molecular para Gluconacetobacter diazotrophicus Cristian Molinares-Pacheco1,2, Julieta Mariana Muñoz-Morales2 ID, Adriana Carbajal-Armenta2, Ana Laura Hernández-Tenorio2, Alejandro Cueto-Becerra1, Jesús Muñoz-Rojas2* ID. 1
2
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Libre seccional Barranquilla, Colombia. Grupo “Ecology and Survival of Microorganisms”, Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. *Email autor corresponsal: joymerre@yahoo.com.mx Recibido: 2 diciembre 2020. Aceptado: 24 febrero 2021
RESUMEN Los métodos para la identificación de microorganismos se valen de sus características morfológicas, fisiológicas, proteómicas y genómicas. En la identificación tradicional se emplean técnicas dependientes de cultivo que pueden presentar inconvenientes según el tipo de microorganismo a identificar, su capacidad de crecimiento, su parecido con algún otro microbio y el tiempo total para su identificación. El uso de PGPB en la agricultura ha repercutido positivamente reduciendo costos de producción, disminuyendo el impacto negativo sobre el medio ambiente y la salud humana. G. diazotrophicus es una bacteria diazótrofo-endofítica con características de PGPB que tiene un tiempo de crecimiento más extenso en comparación con otras bacterias, y presenta características fenotípicas y genéticas similares a bacterias fijadoras de nitrógeno de su mismo género, por tanto, su identificación empleando únicamente métodos tradicionales puede ser algo laboriosa e inespecífica. En la presente revisión se analizaron algunos de los métodos de identificación molecular utilizados para G. diazotrophicus. Palabras clave: Identificación molecular, Gluconacetobacter diazotrophicus, ARNr 16S, ARNr 23S, ITS 16S-23S.
ABSTRACT The methods for identifying microorganisms are based on their morphological, physiological, 28 Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
proteomic, and genomic characteristics. Under traditional identification, culture-dependent techniques are used, but they may present drawbacks depending on the type of microorganism to be identified, its growth capacity, its resemblance to some other microbe and the total time for its identification. The use of PGPB in agriculture has had a positive impact by reducing production costs, reducing the negative impact on the environment and human health. G. diazotrophicus is a diazotrophic-endophytic bacterium with PGPB characteristics that have a longer growth time compared to other bacteria, and it presents phenotypic and genetic characteristics like nitrogen-fixing bacteria of the same genus, therefore, its identification using only traditional methods can be somewhat laborious and unspecific. In this review, some molecular methods for identification of G. diazotrophicus were analysed. Keywords: Molecular identification, Gluconacetobacter diazotrophicus, rRNA 16S, rRNA 23S, ITS 16S-23S. INTRODUCCIÓN
micólicos, análisis de proteínas celulares
Para la identificación de un microorganismo
totales, etc.) [2]. El principal inconveniente con
nos
este tipo de métodos es el tiempo que se
valemos
morfológicas,
de
sus
fisiológicas,
características proteómicas
y
requiere para dar con la identidad del
genómicas, para ello existen una gran variedad
microorganismo en cuestión, sin mencionar las
de métodos dirigidos a una o a la combinación
dificultades que surgen cuando se trata de un
de estas características y varían en su
microbio de crecimiento lento, uno poco
especificidad, sencillez, sensibilidad y rapidez
reactivo o muy similar a otro microorganismo
[1].
[3]. El estudio de bacterias, estaba sujeto a
Las técnicas de identificación tradicional
técnicas dependientes de cultivo, sobre todo
generalmente se enfocan en características
para su identificación, sin embargo, en los
morfológicas y fisiológicas y son dependientes
últimos años, han sido desplazadas por técnicas
de cultivo. Estas técnicas incluyen a las pruebas
de identificación molecular para superar los
bioquímicas, la colorimetría, y pruebas de
inconvenientes de dichos métodos, ya que se
sensibilidad/resistencia
obtiene una mayor precisión [2,4].
antimicrobiana,
la
serotipificación y las denominadas técnicas de
Las técnicas de biología molecular ayudan a
quimiotaxonomía (que analizan la composición
esclarecer la identidad de un organismo en poco
de la pared celular, exopolisacáridos, ácidos
tiempo, 29
Artículo de revisión
estos
métodos
se
valen
de
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
procedimientos como la amplificación de genes
en cuestión y su interacción con la planta que se
conservados mediante la Reacción en Cadena
desee inocular [10]. Dentro de los mecanismos
de la Polimerasa (PCR) [5] y secuenciación de
de promoción de crecimiento vegetal, se
los genes [6,7]. Por ejemplo, la amplificación
pueden incorporar aquellos que permiten la
de los genes gyrB, recA, rpoB, o el que codifica
biodisponibilidad de nutrientes como los
para el ARNr 16S, se han usado como pruebas
fosfatos o el zinc, la fijación biológica de
rutina para la identificación molecular de las
nitrógeno, producción de fitohormonas que
bacterias [6,8]. El análisis de fragmentos de
intervienen en el desarrollo de la planta, la
restricción, la hibridación de ADN-ADN, son
actividad antagónica contra fitopatógenos y la
otras dos técnicas ampliamente usadas para la
degradación
identificación molecular de bacterias [7,9]. En
(tóxicas para las plantas) [11,12].
general,
métodos
La diversidad de PGPB descritas es enorme,
moleculares permite la obtención de resultados
este grupo incluye bacterias que habitan en la
más rápidos y confiables [1]. En la presente
rizósfera (área del suelo que abarcan los
revisión se analizaron algunos de los métodos
exudados de las raíces), y en el interior de las
de identificación molecular utilizados para G.
plantas (o endófitos). Estos últimos pueden
diazotrophicus.
encontrarse a nivel intercelular (entre los tejidos
la
aplicación
de
los
de
sustancias
contaminantes
de las plantas) e intracelular (en el interior de la Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal
célula vegetal) [12]. Considerando las capacidades promotoras de
En respuesta a la búsqueda de alternativas para
crecimiento vegetal particulares de cada
tener cultivos libres de fertilizantes químicos,
microorganismo, se pueden crear inoculantes
plaguicidas, o cualquier agroquímico que pueda
para satisfacer distintas necesidades en los
atentar contra el bienestar del medio ambiente
cultivos. Por ejemplo, Azospirillum brasilense
o del ser humano y con el objetivo de abaratar
es capaz de producir fitohormonas, de ejercer la
costos de producción, la biotecnología se ha
fijación biológica de nitrógeno y de inhibir el
dispuesto a diseñar métodos para aprovechar las
crecimiento
características favorables que pueden brindarle
de
fitopatógenos
mediante
sideróforos; Bacillus sp. LMA5 produce
las Bacterias Promotoras del Crecimiento
fitohormonas y solubiliza fosfatos; y diferentes
Vegetal (PGPB, por sus siglas en inglés) a los
especies de Pseudomonas se han visto
cultivos. Tales características pueden ser muy
implicadas en el antagonismo de fitopatógenos
variadas, dependiendo así del microorganismo 30
Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
y degradación de compuestos tóxicos para las
indolacético, el aumento de la tolerancia al
plantas [13]. De igual manera, se han formulado
estrés por sequía, la solubilización de fosfatos y
multi-inoculantes que buscan potenciar su
la actividad antagónica contra patógenos; de
efecto sobre las plantas mediante interacciones
tipo
sinérgicas
Fusarium spp.), bacteriano (Xanthomonas
que
se
dan
entre
los
fúngico
(Colletotrichum
microorganismos que los componen [14,15].
albilineans)
Para desarrollar métodos que permitan utilizar
incognita) [15,18,20]. Este microorganismo se
los beneficios de las PGPB sobre los cultivos,
ha aislado de diferentes plantas ricas en
es necesaria la identificación correcta del (los)
azúcares y almidón, como arroz, camote y caña
microorganismo(os)
los
de azúcar (de donde fue aislada inicialmente), y
inoculantes, para afirmar con certeza que una
de otras plantas de las familias Poaceae,
bacteria o un grupo de ellas, es capaz de
Rubiaceae,
potenciar el crecimiento de una planta.
Malphigiaceae alrededor de todo el mundo
presente(s)
en
y
nemátodo
falcatum,
Bromeliaceae,
(Meloidogyne
Rosaceae
y
[18]. Gluconacetobacter bacteria endófita biotecnológico
Las técnicas moleculares facilitan los estudios
diazotrophicus, una con alto potencial
que buscan comprender los mecanismos de promoción de crecimiento, de colonización e
G. diazotrophicus es una bacteria diazótrofo-
interacción microorganismo-planta [7,19].
endofítica con mecanismos promotores de La identificación precisa de especies del grupo
crecimiento vegetal, lo que la clasifica como
de las bacterias ácido acéticas (BAA), incluidas
una PGPB [16–18]. Durante su colonización en
las especies de los géneros Acetobacter,
plantas de caña de azúcar, esta bacteria
Gluconobacter y Gluconacetobacter, es difícil,
contribuye significativamente a la demanda de nitrógeno
de
su
huésped
mediante
pues presenta especies con un alto grado de
el
similitud en su secuencia del ARNr 16S (de
mecanismo de fijación biológica de nitrógeno
entre 91.7 a 99 %). Esto constituye un problema
[19]. Sin embargo, se han reportado diferentes
para discernir entre los integrantes de este
mecanismos PGPB en G. diazotrophicus
grupo, sobre todo a nivel de especie, pues el gen
adicionales a la fijación biológica de nitrógeno, como
la
solubilización
de
que codifica para el ARNr 16S es una de las
compuestos
dianas moleculares más utilizadas para la
insolubles de zinc como ZnO, ZnCO3 y
identificación bacteriana [21]. En el género
Zn3(PO4)2, la producción de fitohormonas promotoras
de
crecimiento
como
Gluconacetobacter se han identificado 3
ácido 31
Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
especies fijadoras de nitrógeno (G. johannae,
bacteriano. Tiene una distribución universal en
G. azotocaptans y G. diazotrophicus), éstas
organismos procariotas por ser un componente
presentan un alto grado de similitud en la
esencial para su maquinaria celular, al estar
secuencia de su gen ARNr 16S [16]. No es
implicado en la síntesis de proteínas. Este gen
recomendable
pruebas
es útil como un “cronómetro molecular” por su
fenotípicas para la identificación de especies de
alta conservación y presencia de regiones
este grupo, por tanto, se ha recomendado
variables
emplear técnicas de identificación molecular
polimorfismos que pueden ser específicos para
para las BAA [22].
las especies [5]. En su secuencia se pueden
basarse
solo
en
encontrar
(V1
a
sitios
V9)
para
que
la
contienen
unión
de
Dianas moleculares para la identificación bacteriana
oligonucleótidos específicos para un grupo
Existen diferentes genes que han sido utilizados
moleculares para la identificación en todos los
como dianas moleculares para la clasificación
niveles
taxonómica de las bacterias, siendo el ARNr
especificidad). La secuencia de este gen
16S el más empleado, llegando a obtener
contiene aproximadamente 1500 pb, tamaño
identificaciones precisas en muchas ocasiones.
suficiente para proporcionar polimorfismos
Sin embargo, presenta inconvenientes por la
interespecíficos para establecer diferencias
alta homología en la secuencia que comparten
estadísticamente significativas. La base de
ciertos géneros bacterianos, diversas copias con
datos GenBank almacena más de 2 millones de
polimorfismos dentro de una cepa o su reciente
secuencias de este gen. El análisis de la
reclasificación taxonómica, lo que impide
secuencia completa no es necesaria en todos los
utilizar este marcador para la identificación a
casos, pues se pueden analizar fragmentos de
nivel de especie o de género en aquellos casos
500 pares de bases (pb) para abaratar costos,
[23]. Es por ello, que se han propuesto otros
logrando una identificación correcta, aunque se
genes o secuencias como dianas moleculares
pierde especificidad, ya que al ser una
para clasificación taxonómica de las bacterias
secuencia más corta, disminuye su diversidad
[5,24].
de polimorfismo [24].
rrs (ARNr 16S). Es el gen que codifica el
El número de copias del operón ribosómico
polirribonucleótido ARNr 16S, que forma parte
(rrn), por genoma bacteriano puede ser muy
estructural de la subunidad menor del ribosoma
variable (entre 1 y 15). Al existir varias copias
filogenético, lo que permite realizar marcadores
32 Artículo de revisión
taxonómicos
(con
diferente
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
del ARNr 16S en un genoma, se puede intuir
tener
una
longitud
de
entre
3411
pb
que existe un pequeño grado de heterogeneidad
(Staphylococcus aureus) a 4185 pb (Neisseria
(microheterogeneidad), debido a mutaciones en
meningitidis), su secuenciación ha sido muy
las secuencias, que puede verse reflejado en una
utilizada en identificación de bacterias por su
identificación bacteriana incorrecta [25].
alta robustez, por ser un gen monocopia, por la
ARNr 16S-23S. Es el espaciador transcribible
calidad de las secuencias depositadas en las
interno (ITS) entre los genes codificantes del
bases de datos (debido a que han sido
ARNr 16S y 23S, ha sido utilizado en estudios
secuenciadas con técnicas de nueva generación)
de relaciones filogenéticas. Al existir un
[27], sustituyendo en algunos casos el ARNr
número variable de copias del operón rrn al que
16S para diferenciar especies del género
pertenece, pueden encontrarse varias de estas
Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, entre
ITS en el genoma de una bacteria, que pueden
otras. Permite la identificación a nivel de
variar a nivel de especies, esto es lo que permite
género, especie y en ocasiones a nivel de
su uso para identificación bacteriana [23],
subespecie [28,29]. En la figura 1 se indican
filogenia y tipificación [5,24].
recomendaciones para el análisis del gen rpoB y ARNr 16S en la identificación bacteriana.
ARNr 23S. Es poco preferido para estudios filogenéticos en comparación con el ARNr 16S
gyrB. Es otro de los genes que se utilizan para
debido a los costos. Sin embargo, los avances
identificación bacteriana, sobre todo para
en las técnicas de Secuenciación de Nueva
grupos de bacterias estrechamente relacionados
generación (NGS por sus siglas en inglés) han
como por ejemplo aquellas de los géneros
logrado reducir sus costos. Su mayor longitud
Bacillus,
(3000 pb), en comparación con el ARNr 16S,
Mycobacterium, entre otras (donde llega a tener
contribuye a una mejor resolución debido a una
mejor fidelidad que el ARNr 16S). Codifica la
mayor variación en su secuencia, inserciones
subunidad β de la ADN girasa o también
y/o deleciones únicas [26].
llamada topoisomerasa II, es imprescindible
Pseudomonas,
Vibrio,
para la duplicación del ADN y es un gen
rpoB. Es el gen codificante de la subunidad β
monocopia y presente en todas las bacterias
de la ARN polimerasa, enzima que se encarga
[5,30]. Tiene una longitud de alrededor de
del proceso de transcripción de ARNt, ARNm
2.400 pb en bacterias de tipo ácido acético [21].
y ARNr, tiene una distribución universal en bacterias y posee un buen potencial para ser
recA. Codifica una proteína recombinasa que
utilizado como cronómetro molecular. Puede
funciona 33
Artículo de revisión
en
la
reparación
del
ADN
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
recombinacional en las bacterias [31]. Es
niveles inferiores a la especie donde es
empleado como diana molecular para la
utilizado,
identificación bacteriana y también es utilizado
genomovares de Burkholderia cepacia, en estos
para tipificación molecular cuando el ARNr
genomovares la longitud de este gen es de
16S no otorga la información necesaria para dar
alrededor de 1050 pb [32].
por
ejemplo,
para
distinguir
con una identificación precisa, sobre todo en
Figura 1. Recomendaciones para la utilización del análisis del ARNr 16S y del gen rpoB en la identificación bacteriana [5].
Métodos para la identificación molecular para el género Gluconacetobacter
logra mediante la previa amplificación de
La secuenciación es una técnica que permite
anteriormente [24].
conocer el orden específico de los nucleótidos
Las técnicas NGS, han sido muy útiles para los
que componen una secuencia de ADN, esto se
análisis metagenómicos y poblacionales de
alguna de las secuencias diana mencionadas
34 Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
comunidades bacterianas del medio ambiente e
cepas del género Gluconacetobacter aisladas de
incluso endófitos como G. diazotrophicus [33].
diferentes frutas, realizando el análisis de la
Los avances en la plataforma de secuenciación
secuencia en BLAST y utilizando el algoritmo
Illumina han logrado adquirir una longitud de
de Neighbor joining para establecer relaciones
lectura mayor y a bajo costo, lo que ha
filogenéticas [37]. Torija y colaboradores [38]
permitido
comunidades
elaboraron pruebas para la identificación de dos
microbianas relacionadas con plantas, por
especies de Gluconacetobacter a partir de la
ejemplo, se ha caracterizado la microbiota
secuencia de su ARNr 16S. Estos autores
endófita
arroz
encontraron que una de las pruebas arrojaba un
secuenciando la región V3-V4 de ARNr 16S
falso positivo al identificar otras 4 especies del
[34], de la misma manera, se ha logrado
mismo género (con una homología del 100%)
conocer la comunidad bacteriana endofítica en
que no hacían parte de su objetivo, resaltando la
4 especies del género Allium [35].
alta similitud que tiene la secuencia de este gen
Zhang y colaboradores [36] identificaron a
para este género de bacterias.
Gluconacetobacter
La identificación específica para las especies
caracterizar
de
raíces
y
tallos
de
xylinus
mediante
taxonomía polifásica, a partir de aislados de
fijadoras
Kombucha, “un té japonés en el que se
Gluconacetobacter
desarrollan levaduras y bacterias del tipo ácido
azotocaptans y G. diazotrophicus), es posible
acético”, esclareciendo que se trataba de esta
mediante la amplificación del gen ARNr 16S
especie al encontrar una alta homología en sus
utilizando
secuencias
realizar
CTGTTTCCCGCAAGGGAC-3’) y D1 (5’-
alineamientos en ClustalX y la relación
GCGCCCCATTGCTGGGTT-3’), que generan
filogenética que exhibió al comparar la
un producto de 445 pb [39], estas especies
secuencia con las de las bases de datos. De igual
crecen de manera idéntica en medio LGI
manera,
G.
(exhibiendo colonias de color naranja intenso
diazotrophicus de caña de azúcar en Perú, que
después de 5 días de incubación a 30 °C). Sin
fueron identificadas por su secuencia de ARNr
embargo, G. diazotrophicus forma colonias de
16S, su posterior análisis en bases de datos y
color café obscuro con bordes claros al
perfil bioquímico que coincidía con el de la
sembrarla en un medio de cultivo a base de
cepa de referencia [17]. Asimismo, se usó la
extracto de papa adicionado con 10% de
secuenciación del ARNr 16S para identificar 3
sacarosa (5 a 7 días de incubación a 30 °C), G.
se
de
ARNr
aislaron
16S
5
al
cultivos
de
35 Artículo de revisión
de
los
nitrógeno (G.
del
género
johannae,
oligonucleótidos
AC
G.
(5’-
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
johannae y G. azotocaptans exhiben colonias
secuencia amplificada por PCR, lo que
de color beige o crema incluso después de 10
confirma que las copias de estas ITS dentro de
días de incubación [16].
cada cepa tienen secuencias muy similares.
La secuenciación de la región ITS 16S-23S
Al amplificar el gen que codifica para el ARNr
también ha sido utilizada para la identificación
23S de G. diazotrophicus, se puede lograr su
de BAA. Esta región no es demasiado larga en
identificación, empleando los oligonucleótidos
este grupo de bacterias, tiene una longitud de
1440 (5’-GTTGGCTTAGAAGCAGCC-3’) y
entre 759 y 778 pb, posee elementos
AD (5’-TGCGGCAAAAGCCGGAT-3’), los
conservados, pero también segmentos variables
cuales generan una banda de 411 pb [41]. Sin
con
especies
embargo, es necesario determinar si tales
estrechamente relacionadas que la secuencia
oligonucleótidos permiten diferenciar a G.
del ARNr 16S (que tiene una similitud de entre
diazotrophicus
91,7 a 99 % en BAA), como resultado de una
azotocaptans. La secuencia complementaria al
mayor tasa evolutiva [21]. La secuenciación de
oligonucleótido AD ha sido empleada como
esta región ITS puede permitir la distinción de
sonda de hibridación para la identificación de
bacterias a niveles inferiores de especie, y
G. diazotrophicus [16]. Los oligonucleótidos
parece que las copias de esta región espaciadora
1440 (que también es nombrado como
(se han reportado un mínimo de 4 copias del
HerbaGd) y AD han sido utilizados en
locus
diferentes estudios para la identificación
menor
rrn
similitud
en
especies
entre
del
género
de
G.
johannae
y
G.
Gluconacetobacter) no difieren tanto en
molecular de G. diazotrophicus [41–43].
longitud y en secuencia en las BAA, pues en el
Mehnaz y colaboradores [44] emplearon
estudio realizado por Ruiz y colaboradores
diferentes métodos para la identificación de
[40], se obtuvo solo una banda al amplificar la
cepas bacterianas aisladas de la rizósfera de
ITS 16S-23S de varias cepas del grupo BAA
maíz, entre ellos, la secuenciación del ARNr
(incluyendo
género
16S, el análisis de restricción de ADNr
Gluconacetobacter). Además, al sumar las
amplificado (ARDRA) y análisis bioquímicos.
longitudes de los fragmentos de restricción
Para la secuenciación utilizaron los cebadores
obtenidos al digerir estas secuencias con 8
U475 (5’-AATGACTGGGCGTAAAG-3’) y
endonucleasas de restricción (TaqI, CfoI,
L923Ga (5’-AATGCTCAATCTGAACA-3’),
HaeIII, AluI, HinfI, MboI, MspI y RsaI), se
obteniendo una secuencia de 469 pb que
observó que la longitud era equivalente a la
presentó una homología del 100% (con una
algunas
del
36 Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
identidad de secuencia de 467/467 posiciones)
grupo [45].
con G. azotocaptans, 99,1% con G. johannae Técnicas de tipificación molecular en G. diazotrophicus
(identidad 467/461 posiciones) y para G. diazotrophicus presentó una identidad de 448/449 posiciones. El ARDRA se llevó a cabo
La tipificación molecular consiste en comparar
empleando los cebadores FGPS4-281 bis (5’-
los
FGPS1509′-153
nucleicos
microorganismos
y
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
ácidos
polimorfismos
(5’-
de
dos
para genéticos.
o
conocer La
más sus
tipificación
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’),
molecular comprende diferentes técnicas que se
obteniendo un producto de 1500 nucleótidos
fundamentan
que fue sometido a digestión enzimática por
cromosómico y extracromosómico, el análisis
RsaI, obteniendo 4 fragmentos de restricción
del número de copias en secuencias de
que variaron entre 500 y 150 pb. La
inserción o secuencias que se repiten en el
secuenciación, el ARDRA y las pruebas
genoma, al igual que de regiones entre
bioquímicas, indicaron que los aislados eran
secuencias de inserción y secuencias repetitivas
cepas de G. azotocaptans. Este trabajo es un
adyacentes (como REP-PCR, ERIC-PCR y
ejemplo de que se requiere de diferentes
BOX-PCR), o amplificación aleatoria de
métodos para dar con la identificación precisa
secuencias (como AP-PCR) [2,46]. Este grupo
de un microorganismo, pues con solo uno, se
de técnicas permiten conocer la relación
pueden obtener resultados inconcluyentes.
existente entre un grupo de microorganismos
Se han llevado a cabo trabajos que buscan
para ser empleadas en su distinción e
oligonucleótidos “acetiespecíficos” basados en
identificación rápida [46,47].
genes diferentes a los convencionales, tal como
El análisis de polimorfismo de longitud de
el gen adhA (que codifica la subunidad
fragmento de restricción (RFLP por sus siglas
deshidrogenasa
quinohemoproteína
en inglés) es útil para la diferenciación de cepas
alcohol deshidrogenasa o ADH), que está
[19], consiste en amplificar la secuencia de un
presente en la mayoría de las BAA (excepto en
gen para someterlo a digestión por enzimas de
el género Asaia que exhibe poca o nula
restricción determinadas, y posteriormente
actividad de este gen) y que presenta regiones
visualizar el patrón de bandas obtenido
conservadas y variables que le permite ser un
empleando una electroforesis en gel de agarosa.
candidato para la clasificación a nivel de este
Se le conoce como ARDRA al RFLP del ARNr
de
la
en
estudios
del
ADN
16S [1]. El RFLP de la región espaciadora 16S37 Artículo de revisión
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
23S puede afiliar directamente a una bacteria al
que el ARDRA con las enzimas TaqI y RsaI
grupo de las BAA [45], además, ha permitido
permite la diferenciación de colonias de BAA
identificar nuevas especies de este grupo de
(al observar que éstas distinguieron el mayor
bacterias [21].
número de especies BAA, pero sin variaciones
Ruiz y colaboradores [40] obtuvieron el mismo
intraespecíficas).
grado de diferenciación a nivel de especie luego
tamaños de los RFLP obtenidos del ARNr 16S
de comparar los RFLP del ARNr 16S y de la
de G. diazotrophicus DSM 5601 exhibidos en
ITS
la figura 2.
16S-23S
en
bacterias
del
género
Además,
reportaron
los
Gluconacetobacter. Estos autores afirmaron
Figura 2. Tamaño (pb) de los RFLP del ARNr 16S de G. diazotrophicus DSM 5601 con diferentes enzimas de restricción. Los cebadores utilizados para la amplificación del gen fueron: Directo (16Sd, 5’-GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3’) y Reverso (16Sr, 5’GGAGGTGATCCAGCCGCAGGT-3’) [40]. Se han realizado análisis de cepas de G.
distintos países [48]. En el mismo estudio se
diazotrophicus donde se obtienen dos grupos
observó
con 68% de similitud al hacer un análisis
carbohidratos como fuente de carbono, lo que
filogenético con información obtenida a partir
puede permitir la selección de cepas con mayor
de los RFLP del ARNr 16S y del ITS 16S-23S,
potencial biotecnológico.
revelando una variabilidad intraespecífica en 35
Las secuencias palindrómicas extragénicas
cepas de esta bacteria, que fueron aisladas de
repetitivas (REP), pueden ser amplificadas por
diferentes variedades de caña de azúcar en
PCR (REP-PCR), empleando oligonucleótidos 38
Artículo de revisión
una
diferencia
en
el
uso
de
AyTBUAP 6(21):28-44 Molinares-Pacheco et al., 2021
diseñados según las secuencias repetidas en el
y costos. El análisis del ARNr 16S es el más
genoma. Tales secuencias se encuentran en
empleado en la identificación de esta bacteria a
distintas localizaciones en el cromosoma,
pesar de la similitud en la secuencia con G.
cuando dos secuencias están lo suficientemente
azotocaptans y G. johannae. En cuanto a las
cerca, la secuencia en su interior es amplificada,
técnicas de tipificación molecular, se destacan
dado que el número y localización de estas
las que analizan la secuencia o polimorfismos
repeticiones entre cepas son variables, los
mediante los RFLP del gen ARNr 16S e ITS
productos de la REP-PCR también variarán, el
16S-23S. Se recomienda la selección del
polimorfismo
la
método según las necesidades y recursos con
diferenciación de especies [46]. Se ha estudiado
los que cuente el laboratorio y en medida de lo
este método con el cebador (GTG)5 para la
posible, el uso de más de un método para la
identificación y clasificación de una amplia
confirmación de los resultados.
obtenido
es
útil
para
gama de BAA, incluyendo la identificación precisa de géneros como Acetobacter y
CONFLICTO DE INTERESES
Gluconacetobacter [49]. De manera similar, se
Los autores declaran no tener conflictos de
ha estudiado la técnica de polimorfismo de
intereses.
longitud de fragmento amplificado (AFLP), por su alta reproducibilidad, se obtuvo una precisa
AGRADECIMIENTOS
identificación y clasificación de BAA a nivel de
Agradecemos al apoyo de VIEP-BUAP para el
especie, empleando las enzimas de restricción
desarrollo de este trabajo.
Apa I, Taq I y la combinación de cebadores A03 y T03, parece ser muy útil para determinar la REFERENCIAS
diversidad genética intraespecífica, esta técnica puede considerarse valiosa para la taxonomía
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Extractos acuosos de plantas como inhibidores de la germinación de urediniosporas de Hemileia vastatrix; la roya anaranjada del café José Antonio García-Pérez1* ID, Enrique Alarcón-Gutiérrez2 ID, Vianey del Rocio Torres Pelayo1 ID. 1
Facultad de Biología, Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz, México. Circuito Gonzalo Aguirre Beltrán s/n, Zona Universitaria C.P. 91090, Xalapa, Veracruz, México. 2 Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana. Av. De las Culturas Veracruzanas No. 101 Col. Emiliano Zapata C. P. 91090 Xalapa, Veracruz, México. *Email autor corresponsal: antoniogarcia01@uv.mx; garci95@hotmail.com Phone: 01(228) 842-17-48, extensión: 11748,11617, 11618, 11619. Fax: 01(228) 817-92-02
Recibido: 15 febrero 2021. Aceptado: 23 marzo 2021 RESUMEN El objetivo de este estudio fue probar el efecto inhibidor de extractos acuosos de tres especies de plantas sobre la germinación de urediniosporas de la roya del cafeto (Hemileia vastatrix). Se prepararon extractos acuosos de hojas de Ardisia compressa and Eriobotrya japonica comunes en cafetales del centro de Veracruz, México, y de hojas de Ocimun basilicum, común en los jardines caseros locales. Se realizaron tres ensayos experimentales, uno con el extracto de cada especie vegetal, bajo un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos; el control negativo (extracto 0%), el control positivo (fungicida comercial), el extracto al 75% y el extracto al 100%. La variable de respuesta fue la proporción de urediniosporas germinadas y la variable explicativa fue la concentración de extracto. Para los resultados de cada ensayo, se ajustó un Modelo Lineal Generalizado (GLM), con errores binomiales, usando el lenguaje R. Los resultados indicaron que los extractos de las tres especies de plantas inhibieron totalmente la germinación de las urediniosporas a un nivel similar al del fungicida comercial. A pesar de la baja tasa de germinación de urediniosporas en los controles negativos, su tasa de germinación fue estadísticamente más alta (P < 0.01) que la de los otros tratamientos. Por lo tanto, se concluye que los extractos de las tres especies vegetales tienen un gran potencial para su uso en el control ecológico de la roya del cafeto. Sin embargo, se necesita escalar los experimentos, tanto a nivel de invernadero como de campo, y probar con surfactantes, coadyuvantes y estabilizadores. Palabras clave: Extractos acuosos, Ardisia compressa, Eriobotrya japonica, Ocimun basilicum, fitoquímica, roya del cafeto. 45 Artículo original
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
ABSTRACT The aim of this study was to test the inhibitory effect of plant aqueous extracts on the urediniospores germination of the coffee rust (Hemileia vastatrix). Aqueous extracts were prepared from leaves of Ardisia compressa and Eriobotrya japonica which are commons in coffee plantations in central Veracruz, Mexico, and from leaves of Ocimun basilicum, which is common in local home gardens. Three experimental trials were carried out, one with the extract of each plant species under a completely randomized design with four treatments; the negative control (extract 0%), the positive control (commercial fungicide), and extracts at 75% and 100%. The response variable was the proportion of germinated urediniospores and the explanatory variable was the extract concentration. A Generalized Linear Model (GLM) with binomial errors was fitted for data of each experiment using the R software. The results indicated that extracts of the three plants species, totally inhibited the germination of urediniospores at a similar level to that of the commercial fungicide. In spite of low germination rate of urediniospores in negative controls, it was statistically higher (P < 0.01) than that of the other treatments. Therefore, it is concluded that extracts of three plant species have a great potential to be used in the ecological control of coffee rust. However, experiments need to be scaled up at the greenhouse and field level and testing with surfactants, adjuvants, and stabilizers. Keywords: Aqueous extracts, Ardisia compressa, Eriobotrya japonica, Ocimun basilicum, phytochemistry, coffee rust. INTRODUCCIÓN
mundo [2, 3, 4, 5] y es uno de los principales
La roya del café (RC) es causada por el
factores limitantes para el cultivo de la especie
basidiomiceto del orden Pucciniales, Hemileia
de café arábigo (Coffea arabica) [6], la cual
vastatrix, que es un hongo biotrófico obligado
representa aproximadamente el 70 % de la
que se encuentra en casi todos los países
producción mundial [7]. La RC ha producido
productores
impactado
pérdidas de entre uno y dos mil millones de
negativamente la producción de este cultivo
dólares estadounidenses al año [1]. La roya se
desde fines del siglo XIX [1]. La RC se
dispersa a través de urediniosporas que infectan
considera la más destructiva de todas las
a las hojas de la planta de café por aire y por
enfermedades foliares de plantas de café en el
gotas de lluvia; una vez en la hoja, las
de
café
y
ha
46 Artículo original
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
urediniosporas germinan y entran por las
produce hasta un 50% o más de pérdida de
estomas
hifas
hojas (Fig. 1b) lo que puede conducir a la
germinativas, iniciando así el proceso de
muerte de las plantas de café [9]. El desarrollo
infección [10, 11, 12]. La enfermedad se
de cultivares resistentes a la RC se considera
manifiesta por la aparición de manchas
actualmente la estrategia más eficaz para su
amarillas o de color naranja [8] en las hojas
control, sin embargo, el desarrollo de líneas
(Fig. 1a) y, en ausencia de un manejo adecuado,
resistentes requiere entre 25 y 30 años.
de
las
hojas
mediante
Figura 1. Observación de signos y efectos de la roya del cafeto; a) lesiones de color amarillo que manifiestan las pústulas de urediniosporas de H. vastatrix en las hojas de las plantas; y b) la defoliación causada en los estados avanzados de la enfermedad. Las imágenes fueron tomadas en el ejido de San Marcos de León, Municipio de Xico, Veracruz, México.
47 Artículo original
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
Además, la calidad del café es inferior a los
y un 73% utilizando extractos acuosos de neem
cultivares tradicionales [13]. Otra solución a
(Azadirachta indica), papaya (Carica papaya),
corto plazo ha sido el uso de fungicidas
albahaca
sintéticos a base de cobre [14]; sin embargo,
chancapiedra (Phyllanthus niruri) y el árbol
existe evidencia de que estos fungicidas han ido
casto (Vitax nigundo) [25]. Los extractos
perdiendo efectividad debido a la adquisición
acuosos de rizoma de jengibre (Zingiber
de resistencia por parte del hongo, con el
official), bulbo de cebolla (Allium cepa) y bulbo
incremento en la frecuencia de las aplicaciones
de ajo (Allium sativum) redujeron la incidencia
y el consecuente incremento en el riesgo de
de roya del trigo (Puccinia recondita f.sp.
generar problemas de contaminación y para la
tritici) entre un 55 y un 60%. Asimismo, fue
salud humana [15, 16]. Una alternativa natural
posible inhibir en más del 93%, la germinación
y más amigable ambientalmente para el control
de las urediniosporas de la roya del trigo
de la RC, es el uso de metabolitos secundarios
(Puccinia
(MS) que se encuentran en las plantas [17], los
acuosos de ajo, clavo, quinina de jardín,
cuales han mostrado actividad plaguicida [18,
pimienta brasileña, anthi mandhaari, comino
19]. Un grupo de MS importantes son las
negro, cedro blanco y neem [26]. Similarmente,
fitoalexinas que se sintetizan en respuesta a la
el licor de roble tuvo una eficiencia del 74,4%
presencia
son
para abortar las pústulas de la roya de la Perilla
compuestos fenólicos [20] que incluyen
(Perilla frutescens) [27]. En cuanto a los
terpenos, polifenoles, glucósidos y alcaloides
escasos estudios con la roya del café, Salustiano
[21, 22], los cuales han mostrado propiedades
et al. [28] lograron la inhibición total de la
antimicrobianas, antibacterianas, fungicidas o
germinación de urediniosporas de Hemileia
fungistáticas en una variedad de patógenos [23,
vastatrix mediante el uso de extractos acuosos
24]. Hay pocos estudios disponibles sobre la
y metanólicos de hojas de lámpara (Eremanthus
efectividad de extractos de plantas para la
erythropappus).
inhibición de la germinación de urediniosporas
obtuvieron una inhibición de entre el 51 y el
de H. vastatrix (roya), pero estudios con otras
74% de la roya del café utilizando extractos
especies de roya indican el potencial que
acuosos de hojas frescas de vasaka (Adhatoda
podrían tener en el caso de la roya del café. Por
vasica),
ejemplo, fue posible reducir la incidencia de la
camara) e higuerilla (Ricinus communis). Con
roya de la morera (Cerotelium fici), entre un 33
estos mismos extractos, los autores también
de
un
patógeno.
Estos
48 Artículo original
morada
(Oscimum
triticina)
neem,
utilizando
Subramani
cinco
et
negritos
sanctum),
extractos
al.
[19]
(Lantana
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
alcanzaron a reducir en el campo, entre un 20 y
(10%), se enjuagó con agua destilada y se secó
un 35%, la incidencia de la roya del café.
durante 24 h a 60 ºC. Luego, el material seco se
Finalmente, Mudyiwa et al. [29] mostraron que
molió y se pasó a través de un tamiz de luz de
los extractos acuosos de moringa (Moringa
malla 0.5 mm y se almacenó en frascos de color
oleifera) y zacate limón (Cymbopogon citratus)
ámbar. Este material se mantuvo almacenado a
fueron efectivos en el control de la germinación
temperatura ambiente en un lugar seco hasta su
de las urediniosporas de la roya del café. Esta
uso en los ensayos.
investigación, tuvo como objetivo probar la Extractos acuosos
capacidad de extractos acuosos de hojas de
Los extractos acuosos de las tres especies se
níspero (Eriobotrya japonica), capulín (Ardisia
obtuvieron según Kobayashi y González de
compressa) y albahaca (Ocimum basilicum),
Mejía [30]. Doscientos mililitros de agua
para inhibir la germinación de urediniosporas
destilada se llevaron a punto de ebullición y se
de la roya del café.
dejaron evaporar hasta reducir a 175 ml. Luego, se agregaron 12.5 g de material vegetal seco y METODOLOGÍA
la infusión se mantuvo en punto de ebullición
Colecta de material vegetal
durante 10 segundos y posteriormente se
El material vegetal para la elaboración de los
mantuvo en reposo durante 60 segundos. El
extractos fue recolectado en cafetales de
líquido resultante se centrifugó a 5000 rpm
sombra del ejido de San Marcos de León,
durante 15 minutos para decantar los sólidos o
Veracruz, México (Longitud: -96.963611,
residuos remanentes. La infusión se filtró dos
Latitud: 19.422778). Las características de las
veces utilizando papel filtro Whatman de 0.8
plantas elegidas fueron: hojas cerosas gruesas,
mm y 2 µm, respectivamente. El extracto así
sin daño visible por hongos o herbívoros, bajo
obtenido se almacenó en refrigeración (4 °C),
el supuesto de que sería indicativo de la presencia
de
sustancias
antifúngicas
se protegió de la luz hasta su uso y análisis, y se
o
consideró la base de 100% en concentración
antibióticas. Se recolectaron cerca de 800 g de hojas de Ardisia
compressa,
para elaborar el tratamiento al 75% de
Eriobotrya
concentración.
japonica y Ocimun basilicum y se trasladaron al laboratorio en bolsas de papel. El material
Caracterización fitoquímica cualitativa
vegetal de cada especie se limpió con una
La determinación de la presencia de alcaloides,
solución de hipoclorito de sodio (Cloralex™)
flavonoides, terpenos y saponinas, se hizo por 49
Artículo original
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
triplicado mediante el uso de las técnicas
probaron tres concentraciones de extracto de
colorimétricas propuestas por Domínguez [31].
cada especie: 0.0%, 75% y 100%, más un
Los alcaloides se determinaron mediante las
control
técnicas de Mayer, Dragendorff y Wagner, los
comercial (oxicloruro de cobre 50% polvo
flavonoides con las pruebas de Shinoda,
mojable) con base en la dosis recomendada (3.7
Cloruro Férrico (FeCl3) y Ácido Sulfúrico
g/L). Los extractos acuosos se diluyeron con
(H2SO4),
agua
los
terpenos
se
determinaron
positivo
destilada
que
y
esterilizada tratamiento
fungicida
para
conformación
mientras que las cumarinas se detectaron con
Aproximadamente 1.5 ml de agua destilada,
las pruebas de KOH y rayos UV. Finalmente, la
extracto puro o extracto diluido, y agua
presencia de saponinas se determinó mediante
destilada
la prueba de la espuma y con el reactivo de
depositaron en microtubos (2 ml) a los cuales se
Rosenthaler.
les añadieron, aproximadamente, 0.04 g de
fungicida
al
la
mediante la prueba de Liebermann-Burchard,
más
del
contenía
75%.
comercial,
se
urediniosporas recién colectadas de roya del Colecta de urediniosporas de Hemileia vastatrix
café. La cantidad de urediniosporas en peso se determinó mediante pruebas repetidas, hasta
Las urediniosporas de roya para los ensayos, se
que alícuotas tomadas de la dilución de
recolectaron de plantas de Coffea arabica
urediniosporas en 1.5 ml resultaron en la
variedad típica. Las urediniosporas presentes en
cuantificación efectiva y en la visibilidad clara
las manchas color naranja de las hojas de café
de los tubos de germinación en cámaras de
se barrieron con un pincel y se depositaron en
Neubauer. Cada tratamiento consistió, para el
un microtubo. Los ensayos con cada extracto de
caso del ensayo con Ardisia compressa, de ocho
planta no se llevaron a cabo simultáneamente,
réplicas, y para Eriobotrya japonica y Ocimun
por lo que se utilizó un lote de urediniosporas
basilicum, cuatro réplicas respectivamente. La
recién recolectadas en cada ocasión para evitar
diferencia en el número de réplicas se debió a la
problemas con el almacenamiento y la
disponibilidad de las urediniosporas en ese
viabilidad de las mismas.
momento. Los microtubos de cada ensayo se Ensayos de inhibición de germinación de urediniosporas
colocaron en gradillas y se incubaron durante 24 horas a 24 °C en condiciones de oscuridad
Se realizó un ensayo experimental de inhibición
total [32, 33].
de germinación de urediniosporas con el extracto acuoso de cada especie vegetal. Se 50 Artículo original
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
Conteo de urediniosporas Después de 24 h, las urediniosporas germinadas y no germinadas se contaron auxiliados de un hemocitómetro (cámara de Neubauer, Thermo Fisher). Para ello, se tomaron muestras y se procesaron tres alícuotas de cada réplica. Dentro del hemocitómetro, se contaron las urediniosporas germinadas y no germinadas que cayeron dentro del área de los cinco cuadrados. Las urediniosporas se consideraron como
germinadas
cuando
se
observó
claramente, bajo el microscopio a 40X, el desarrollo de uno o más tubos de germinación (Fig. 2) y se consideraron como no germinadas cuando los tubos de germinación no fueron Figura 2. Aspectos del desarrollo de tubos germinativos en urediniosporas del hongo H. vastatrix a 40X.
observados. Análisis de datos Los datos de cada ensayo se analizaron
RESULTADOS
mediante un Modelo Lineal Generalizado (GLM) con errores binomiales [34] para
Caracterización fitoquímica de los extractos acuosos
determinar los efectos significativos de los
Para el extracto de hojas de A. compressa se
tratamientos. Los análisis se realizaron con el
detectó una presencia alta de alcaloides y
software R [35]. La siguiente relación se utilizó
flavonoides (Cuadro 1) por medio de las
para obtener la devianza explicada (D2) por
técnicas de Dragendorff y Cloruro Férrico
cada uno de los modelos ajustados.
(FeCl3) respectivamente. Las cumarinas se registraron débilmente y no se detectaron saponinas ni terpenos. En cambio, para el
D2 =
𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑛𝑢𝑙𝑎−𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑛𝑢𝑙𝑎
extracto de E. japonica, se evidenció una
∗ 100 [36]
presencia fuerte de alcaloides y cumarinas, mientras que la presencia de flavonoides fue 51 Artículo original
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
débil y no se detectaron terpenos ni saponinas. Finalmente, para el extracto de O. basilicum se detectó una presencia fuerte de alcaloides, flavonoides y terpenos, mientras que la presencia de cumarinas fue moderada y no se detectaron saponinas. Germinación de urediniosporas Todos los ensayos con extractos acuosos de hojas de las tres especies vegetales mostraron un efecto inhibidor sobre la germinación de urediniosporas de la roya del cafeto Hemileia vastatrix.
La
proporción
promedio
de
urediniosporas germinadas en el control negativo (agua destilada) fue baja para los ensayos de las tres especies; es decir, 27.8 ± 4.5 para E. japonica (Fig. 3a); 13.029 ± 3.59 para A. compressa (Fig. 3b); y 4.43 ± 0.35 para O. basilicum (Fig. 3c). Sin embargo, la proporción de
urediniosporas
germinadas
en
este
tratamiento (i.e., control negativo), fue la más alta estadísticamente en todos los ensayos (Fig. 4). Los modelos ajustados predijeron una alta proporción de urediniosporas germinadas en
Figura 3. Efectos observados de extractos acuosos de hojas de: a) E. japonica, b) A. compressa, y c) O. basilicum sobre la germinación de urediniosporas de roya del cafeto H. vastatrix. CN and CP representan el control negativo (agua), y el control positivo (fungicida comercial), respectivamente. Los datos son la mediana, el primer y tercer cuartil, más la dispersión.
cada ensayo; 96.75% para E. japonica (Fig. 4a), 83.11% para A. compressa (Fig. 4b) y 85.01% para O. basilicum (Fig. 4c). (Figs. 4a, 4b y 4c respectivamente).
52 Artículo original
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021 Cuadro 1. Análisis fitoquímico cualitativo de extractos acuosos de hojas de A. compressa, E. japonica and O. basilicum. Especie Componente
A. compressa
E. japonica
O. basilicum
Método
Método
Método
Mayer
Wagner
Dragendorff
Mayer
Wagner
Dragendorff
Mayer
Wagner
Dragendorff
++
-
+++
+
+
+++
+
++
+++
Alcaloides
Método
Método
Método
Shinoda
FeCl3
H2SO4
Shinoda
FeCl3
H2SO4
Shinoda
FeCl3
H2SO4
+
+++
+
-
+
+
-
+++
++
Flavonoides Cumarinas
+
+++
++
Terpenos
-
-
+++
Saponinas
-
-
-
(+) Presencia escasa, (++) Presencia relativamente abundante, (+++) Presencia abundante, (-) No detectado
DISCUSIÓN
comparación de los resultados sobre la
El presente estudio tuvo como objetivo
inhibición de urediniosporas de H. vastatrix
principal evaluar la efectividad de tres extractos
utilizando extractos acuosos de plantas. Sin
acuosos de hojas de Eriobotrya japonica,
embargo, Salustiano et al. [28], obtuvieron un
Ardisia compressa, y Ocimun basilicum,
100% de inhibición en la germinación de
plantas provenientes de cafetales del centro de
urediniosporas de varias especies de roya
Veracruz, para la inhibición de la germinación
(incluyendo
de urediniosporas de la roya del cafeto
vastatrix), utilizando extractos acuosos y
Hemileia
metanólicos
vastatrix.
Los
resultados
más
urediniosporas
de
hojas
de
de
Hemileia
Eremanthus
importantes indicaron que los extractos acuosos
erythropappus. Del mismo modo, Mudyiwa et
de Eriobotrya japonica, Ardisia compressa y
al. [29], lograron reducir entre 84 y 100 % la
Ocimun basilicum redujeron la germinación de
germinación de urediniosporas de H. vastatrix
urediniosporas de Hemileia vastatrix a sólo
utilizando extractos acuosos de hojas del
0.12, 0.34 y 0.38 % respectivamente, en
“limoncillo”,
promedio.
concentraciones de 25%, 50%) y de hojas de
Todos
estos
efectos
fueron
estadísticamente significativos (P < 0.001) con
Moringa
respecto al tratamiento control de cada especie.
concentración).
Hay pocos estudios disponibles para la
53 Artículo original
Cymbopogon
oleifera
(a
50
citratus,
y
100%
(a
de
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
La germinación de urediniosporas de otras especies de roya también ha sido inhibida con éxito por extractos acuosos de plantas, tal es el caso de las urediniosporas de la roya del trigo, Puccinia triticina, que fueron inhibidas por extractos acuosos de Jacaranda mimosifolia (Bignoniaceae), (Apocynaceae)
Thevetia y
Calotropis
peruviana procera
(Apocynaceae) en una proporción del 97%, 78% y 53% respectivamente [37]. En otro estudio, una concentración de 50 μg/ml de licor de roble piroligno, cuyo principal componente es
un
antimicrobiano
(o-metoxifenol
o
guayacol), fue suficiente para lograr un 74% de aborto de las pústulas de la roya de la Perilla (Perilla frutescens, Lamiaceae) [27]. En otros estudios utilizando extractos vegetales contra otro tipo de hongos distintos de las royas, (Mycosphaerella fijensis Morelet) se ha logrado una actividad inhibidora en la reproducción del hongo, y esto se ha atribuido a la presencia de alcaloides, esteroides, fenoles, flavonoides y de saponinas [38]. En nuestro estudio, el análisis fitoquímico cualitativo indicó la presencia de Figura 4. Modelos y predicciones del efecto de tratamientos de extractos acuosos de hojas de: a) E. japonica, b) A. compressa, y c) O. basilicum sobre la germinación promedio de urediniosporas de roya del cafeto H. vastatrix. CN and CP representan el control negativo (agua), y el control positivo (fungicida comercial), respectivamente. Letras diferentes indican diferencias significativas a P < 0.001.
alcaloides, flavonoides y cumarinas en las tres especies, mientras que sólo se registraron terpenos en Ocimum basilicum. Las saponinas no se registraron en ninguna especie. En otros estudios fitoquímicos más precisos que el nuestro, se han reportado una variedad de sustancias en las tres especies estudiadas. Por 54
Artículo original
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
ejemplo, para A. compressa, se ha reportado la
tri terpenos, flavonoides, cumarinas, glucósidos
presencia de polifenoles, ácido gálico, péptidos,
de saponina, esteroides, compuestos aromáticos
saponinas,
quinonas,
y ácido ascórbico; y para algunos de ellos se les
alquifenoles, bergenina, ardisina y derivados de
han determinado propiedades antibacterianas,
bencenina, embelina, quercetina, ardisenona,
anti
ardisiaquinona, ardisianona y norbergenina
insecticidas [47, 48, 49].
isocumarinas,
fúngicas,
antivirales,
antisépticas
e
([30, 39], y se ha señalado que aunque algunos de estos componentes se encuentran en otras
CONCLUSIÓN
plantas, la combinación única de varios
Los extractos acuosos de hojas de las tres
compuestos en esta especie, es lo que produce
especies
una
agentes
urediniosporas de Hemileia vastatrix a valores
fitoquímicos [30] en otras especies del género
que variaron de 0.12 a 0.38 %, lo cual indica
Ardisia
[40].
prácticamente una inhibición total. Por tanto,
Asimismo, se ha determinado que las hojas de
los extractos acuosos de estas especies
Eriobotrya japonica Lindl., son una fuente de
representarían una alternativa para el control de
activos fenólicos, siendo las hojas jóvenes las
la roya, sin embargo, son necesarios más
que contienen mayor cantidad de fenoles totales
estudios para el escalamiento en experimentos
[41]. Otros compuestos fitoquímicos que se han
de invernadero y de campo. Además, para el
encontrado en las hojas de esta especie son
escalamiento
terpenos,
experimentación
fuente
tan
(e.g.,
A.
novedosa
crispa,
triterpenos,
de
Thunb)
sesquiterpenos,
redujeron
la
será con
germinación
de
importante
la
surfactantes
y
flavonoides, taninos y glucósidos [42, 43, 44,
coadyuvantes agregados a los extractos para su
45, 46] y se ha determinado una actividad
mejor dispersión, mojamiento, humectación,
antimicrobiana y antifúngica para algunos de
penetrabilidad, adherencia y estabilidad del
ellos [43]. Finalmente, para Ocimum basilicum,
extracto.
L., Lamiaceae, especie de gran uso tradicional, CONFLICTO DE INTERÉS
se han encontrado más de 200 compuestos
Los autores declaran que no tienen intereses
químicos. En esta especie se han encontrado
económicos en competencia, o relaciones
compuestos tales como polifenoles, alcaloides,
personales, que pudieran haber influido en el
taninos, hidrocarburos monoterpénicos, mono terpenos
oxigenados,
trabajo informado en este documento.
hidrocarburos
sesquiterpénicos, sesqui terpenos oxigenados, 55 Artículo original
AyTBUAP 6(21):45-60 García-Pérez et al., 2021
AGRADECIMIENTOS
AIE 2010. Lecture Notes in Computer Science,
Agradecemos el apoyo técnico de la bióloga
vol 6097. Springer, Berlín, Heidelberg 2010.
Patricia del Carmen Gómez en la preparación
https://doi.org/10.1007/978-3-642-13025-
de los materiales y extractos para los ensayos
0_36.
experimentales y en la revisión de los mismos.
[4]. Ghini R., Bettiol W. & Hamada E. Diseases
Asimismo, se agradece la participación del
in tropical and plantation crops as affected by
biólogo Luis Salvador Aragón Hernández
climate change: Current knowledge and
García en la colecta, secado, molido y tamizado
perspectives. Plant Pathology 2011; 60: 122–
del
132.
material
biológico,
en
los
análisis
fitoquímicos y en la revisión de los ensayos
[5]. Cressey D. Coffee rust regains foothold.
experimentales.
Nature 2013; 493: 587.
Finalmente,
también
agradecemos a la bióloga Vanessa Alarcón
[6]. Suresh N., Santa, R. A., & Shivanna, M. B.
Córdova por su apoyo en los análisis
Coffee leaf rust (CLR) and disease triangle: A
fitoquímicos.
case study. International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences 2012;
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