BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA Rector, Dr. José Alfonso Esparza Ortiz Secretario General, Mtra. Guadalupe Grajales y Porras Vicerrector de Investigación y Estudios de Posgrado, Dr. Ygnacio Martínez Laguna ALIANZAS Y TENDENCIAS BUAP. Año 6, Nº 22, Enero-Marzo de 2021, es una publicación trimestral editada por la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, con domicilio en 4 sur 104, Col. Centro, C.P. 72000, Puebla Pue., Tel. +52 222 2295500 Ext. 2234 Director Fundador: Dr. Martín Pérez Santos (Dirección de Innovación y Transferencia del Conocimiento, BUAP). Director y Editor en jefe: Dr. Jesús Muñoz Rojas (Instituto de Ciencias, BUAP). Editores asociados: Dra. Verónica Quintero-Hernández (Cátedra CONACYT-Instituto de Ciencias, BUAP). Dra. Yolanda Elizabeth Morales-García (Facultad de Ciencias Biológicas, Licenciatura en Biotecnología, BUAP). Comité Editorial/Editorial Board D. C. Patricia Bernal Guzmán (Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, Andalucía, España). D. C. Abdelali Daddaoua (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II. Facultad de Farmacia. Universidad de Granada, Granada, España). D. C. Miguel Matilla Vázquez (Department of Environmental Protection, Estación Experimental del Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Granada, España). D. C. Antonino Báez Rogelio (Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México). D. C. Miguel Ángel Villalobos López (Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada, Instituto Politécnico Nacional, Tepetitla de Lardizabal, Tlaxcala, México). D. C. Hortencia Silva Jiménez (Área de Oceanografía Química, Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California, Ensenada, Baja California, México). D. C. Alma Rosa Netzahuatl Muñoz (PTC del programa académico de Ingeniería en Biotecnología, Universidad Politécnica de Tlaxcala, Colonia San Pedro Xalcaltzinco, Tepeyanco, Tlaxcala, México). D. C. Arturo Elías Domínguez ("Facultad de Ciencias Básicas, Ingeniería y Tecnología", Ingeniería Química, Universidad Autónoma de Tlaxcala, Calzada Apizaquito s/n. Apizaco, Tlaxcala, México). D. C. José María Sigarreta Almira (Facultad de Matemáticas de la Universidad Autónoma de Guerrero, Acapulco, México).
M. C. Carla de la Cerna-Hernández (Dirección de Innovación y Transferencia de Conocimiento, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México). D. C. Mayra Z. Treviño Garza (Departamento de Alimentos, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, San Nicolás de los Garza, Nuevo León, México). D. C. Jesús Manuel Muñoz Pacheco (Facultad de Ciencias de la Electrónica, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México). D. C. Siara Silvestri (Postgraduate Program in Environmental Engineering, Environmental Engineering Department, Federal University of Santa Maria–UFSM, 1000, Roraima Avenue, Santa Maria, RS, 97105-900, Brazil). D. C. Cindy Bandala ((1) Instituto Nacional de Rehabilitación LGII. (2) Sección de Posgrado e Investigación, Escuela Superior de Medicina, Instituto Politécnico Nacional). D.C. Paulina Estrada de los Santos (Instituto Politécnico Nacional, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Prol. Carpió y Plan de Ayala s/n, Col. Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo C.P.11340. Ciudad de México, México). D. C. J. Antonio Ibarra García (Laboratorio de Genética Microbiana, Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n Col. Santo Tomás C.P. 11340, Alc. Miguel Hidalgo, Ciudad de México, México). D. C. Marbel Torres-Arias (Dpto. de Ciencias de la Vida y la Agricultura, Universidad de las Fuerzas Armadas - ESPE, 593 23989400 ext 2122, 0983929887, Centro de Nanociencia y Nanotecnología, Sangolqui, Ecuador). D. C. Judith Percino Zacarías (Polymer Research Group, Centro de Química, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México). Reserva de Derechos al uso exclusivo 04-2016-061316422200203, ISSN: 2594-0627, ambos otorgados por el Instituto Nacional de Derecho de Autor de la Secretaría de Cultura. Responsable de la última actualización de este número la Dirección de Innovación y Transferencia de Conocimiento de la BUAP, Dr. Martín Pérez Santos, domicilio en Prolongación de la 24 Sur y Av. San Claudio, Ciudad Universitaria, Col. San Manuel, Puebla, Pue., México, C.P. 72570, fecha de la última modificación, 17 de junio de 2021. Email: jesus.munozrojas@viep.com.mx Las opiniones expresadas por los autores no necesariamente reflejan la postura del editor de la publicación.
Revista indizada en: Latindex, REDIB, CiteFactor, International Scientific Indexing, Academic Resource Index, Scientific Journal Impact Factor.
Portada Lic. Arte Digital Ximena Gordillo Ibarra Lic. Arte Digital Jesús Mauricio Muñoz Morales
CONTENIDO AyTBUAP 6(22)
i.
Sustancias poliméricas extracelulares microbianas con propiedades floculantes: una alternativa al empleo de copolímeros de acrilamida.
54
Itzia Citlali Guevara-González, Ricardo CarreñoLópez, Luis Ramiro Caso-Vargas, Vianey MarínCevada*.
Alma Rosa Netzahuatl-Muñoz*
1
Distribution of Triatoma (Meccus) phyllosoma and Triatoma (Meccus) longipennis as vectors of Trypanosoma cruzi in the state of Aguascalientes, Mexico and surroundings. Susana Morales-Moran, Eduardo SánchezGarcía, Rosa Isela Chávez-Gómez, Norma Adela Carrasco-Esparza, Alberto AguayoAcosta, David Alejandro Hernández-Marín*
16
Búsqueda in silico de inhibidores de Quorum Sensing y estudios preclínicos en Chromobacterium violaceum. Esmeralda Escobar-Muciño*
Caracterización de cepas rizosféricas pertenecientes al género Paraburkholderia sp. aisladas de la sierra norte del Estado de Puebla.
76
Análisis de las encuestas de satisfacción realizadas en consulta de farmacia hospitalaria. Comparación de resultados. Joaquín Urda Romacho*, Jesús María Fernández Martín, Diana González Vaquero, María del Carmen Torres Rodríguez, José Cantó Mangana, María Ángeles Castro Vida
AyTBUAP 6(22):i-vi Netzahuatl-Muñoz, 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.22
Sustancias poliméricas extracelulares microbianas con propiedades floculantes: una alternativa al empleo de copolímeros de acrilamida Alma Rosa Netzahuatl Muñoz1* ID. 1
Universidad Politécnica de Tlaxcala. Av. Universidad Politécnica No. 1. San Pedro Xalcaltzinco, Tepeyanco, Tlaxcala, México. CP 90180. *Email autor corresponsal: almarosa.netzahuatl@uptlax.edu.mx
RESUMEN La operación de coagulación-floculación para la remoción de partículas suspendidas es muy utilizada en el tratamiento de aguas residuales. Entre los floculantes más empleados actualmente se encuentran los copolímeros de acrilamida, sin embargo, el uso extensivo de estas moléculas recalcitrantes podría ocasionar efectos indeseables en los ecosistemas. En estudios recientes se han reportado sustancias poliméricas extracelulares de origen microbiano con propiedades floculantes semejantes a los polímeros sintéticos. Estos hallazgos muestran el gran potencial de los polímeros microbianos en el área ambiental y la importancia de estudios adicionales que permitan su producción a gran escala. Palabras clave: floculantes, tratamiento de aguas, copolímeros de acrilamida, biopolímeros, EPS.
ABSTRACT The coagulation-flocculation operation for the removal of suspended particles is widely used in wastewater treatment. Among the flocculants most used today are acrylamide copolymers, however, the extensive use of these recalcitrant molecules could cause undesirable effects on ecosystems. Recent studies have reported extracellular polymeric substances of microbial origin with flocculating properties like synthetic polymers. These findings show the great potential of microbial polymers in the environmental area and the importance of additional studies that allow their large-scale production. Keywords: flocculants, water treatment, acrylamide copolymers, biopolymers, EPS.
i Editorial
AyTBUAP 6(22):i-vi Netzahuatl-Muñoz, 2021
EDITORIAL
información publicada hasta el momento es
Los copolímeros de acrilamida (CAM) son
todavía escasa [6]. Algunas problemáticas
moléculas muy versátiles que han sido usadas
potenciales debidas al uso de copolímeros de
ampliamente en el tratamiento de aguas
poliacrilamida son la presencia de monómeros
residuales, clarificación de agua potable,
de acrilamida y otros intermediarios residuales
retención de agua en suelos agrícolas, espesante
tóxicos
en la industria química, formulación de
comerciales [2], así como la posibilidad de
pesticidas, etc., [1-3]. En el tratamiento de
formación de productos de degradación tóxicos
aguas
propiedades
por su transformación física, química y/o
floculantes para la remoción de partículas
biológica en los ecosistemas, tal como se ha
suspendidas de contaminantes, así como en el
observado en condiciones de laboratorio [1, 2,
espesamiento de lodos [4], estas aplicaciones
5]. Por otra parte, se ha reportado que los
tienen un gran auge, basta con realizar una
copolímeros de acrilamida particularmente las
búsqueda en un navegador de internet con la
formas catiónicas pueden ser tóxicas a las
frase genérica “floculantes de poliacrilamida”
especies acuáticas [6, 7], además el hecho de su
para que cientos de páginas de fabricantes y
lenta degradación en los ambientes naturales
distribuidores se desplieguen ante nuestros
puede provocar su acumulación hasta alcanzar
ojos.
concentraciones que pudieran ocasionar efectos
La pregunta obligada hoy en día para cualquier
indeseables.
sustancia xenobiótica usada ampliamente y
Como una alternativa al uso de floculantes
descargada al medio ambiente es ¿Puede
sintéticos
continuar empleándose este compuesto sin que
biopolímeros, entre los más estudiados se
la salud del ser humano y los ecosistemas sean
encuentran la quitosana obtenida a partir de
afectados? En el caso de los CAM por regla
quitina de carapachos de especies marinas de
general se considera que no son tóxicos y que
interés
resisten a la degradación microbiana en
modificados, gomas y mucílagos vegetales,
condiciones naturales debido a su alto peso
alginato y celulosa [8-10]. Estos biopolímeros
molecular [5] ¿Esta información es suficiente
tienen como ventaja principal que se degradan
para continuar con el uso de estos productos?
fácilmente en condiciones naturales, pero son
No, hay muchas interrogantes sobre el destino
usualmente moléculas menos efectivas en el
final de estos polímeros en el ambiente y la
proceso
se
aprovechan
sus
ii Editorial
en
se
los
ha
comercial,
de
productos
propuesto
taninos
floculantes
el
y
uso
de
taninos
coagulación-floculación
en
AyTBUAP 6(22):i-vi Netzahuatl-Muñoz, 2021
comparación con los polímeros sintéticos y por
otras áreas de la biotecnología, el estudio de
esta razón algunos solo pueden ser empleados
floculantes de origen microbiano tendrá un
como coagulantes-ayuda [9].
largo recorrido lleno de hallazgos interesantes y
Floculantes
de
origen
biológico
un potencial que podría concretarse a mediano
menos
estudiados son las sustancias exopoliméricas
plazo.
(EPS por sus siglas en inglés) microbianas. Las
La ciencia avanza continuamente y para
EPS están compuestas de moléculas de alto
contribuir con un granito de arena, en este
peso molecular como polisacáridos, proteínas,
número de Alianzas y Tendencias BUAP se
lípidos y algunos de sus derivados [11, 12]. Las
publican cuatro artículos de investigación, el
EPS son polielectrolitos aniónicos al igual que
primero presenta un trabajo de entomología con
los principales copolímeros de acrilamida
gran repercusión en el área de la salud sobre la
empleados en el tratamiento de aguas, por lo
distribución de dos vectores de Trypanosoma
que
de
cruzi en comunidades de Aguascalientes y
floculación podrían compararse a la de los
Zacatecas, México [17], el segundo artículo
floculantes sintéticos [11]. La mayoría de las
presenta una búsqueda de los inhibidores de
investigaciones presentes se encuentran en una
Quorum sensing en bacterias patogénicas e
etapa inicial en la que se aíslan y cultivan
incluye un estudio preclínico también in silico
microorganismos productores de EPS; se
que indica el potencial que puede tener el uso
extraen, purifican y
caracterizan nuevas
de estos compuestos inhibitorios como terapia
sustancias poliméricas; se cuantifican sus
farmacológica alternativa [18]. El tercer
propiedades
estudia su
artículo reporta la caracterización de siete cepas
mecanismo de acción [13-15]. Con base en
rizosféricas del género Paraburkholderia sp.;
estos resultados se han planteado ya algunas
que incluye la construcción y análisis de sus
investigaciones
identificar
árboles filogenéticos [19]. En el cuarto artículo
condiciones que permitan su producción a bajo
se presentan los resultados del estudio que
costo [16] y por lo tanto la posibilidad de
determina el nivel de satisfacción de pacientes
fabricación de estos biopolímeros a gran escala,
e identifica oportunidades de mejora del
también se ha explorado el uso de las EPS en la
servicio de consulta externa de farmacia
recuperación de células en el cultivo de
hospitalaria
microalgas para la obtención de biodiesel y la
esperamos que este número sea de su agrado e
adsorción de metales tóxicos [15]. Como tantas
invitamos a más investigadores a enviar sus
sus
mecanismos
floculante
y
eficiencias
y se
enfocadas
a
iii Editorial
[20].
Estimados
lectores,
AyTBUAP 6(22):i-vi Netzahuatl-Muñoz, 2021
propuestas para ser evaluadas. Adicionalmente,
ingresar
al
repositorio
REDIB
tras
damos a conocer que la revista ha logrado
evaluación correspondiente (Figura 1).
su
Figura 1. Alianzas y tendencias BUAP en el repositorio REDIB (https://redib.org/Serials/Record/oai_revista6253-alianzas-y-tendencias-buap). Revisado el 2 de junio de 2021.
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Aguascalientes, Mexico and Surroundings.
wastewater:
Alianzas y Tendencias BUAP [Internet] 2021;
comparative
properties
and
flocculation performances. Chem Eng J, 2018;
6(22):1–15.
349:622-632.
https://drive.google.com/file/d/1VqtU2uWkLt v Editorial
Available
from:
AyTBUAP 6(22):i-vi Netzahuatl-Muñoz, 2021
KwdIBWiD7NjhfWxX6QuSoy/view
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https://drive.google.com/file/d/1Az52KkAPG
Inhibidores de Quorum Sensing y estudios
R5iWM9g5IJw075RtQj33rlk/view
preclínicos en Chromobacterium violaceum.
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Alianzas y Tendencias BUAP [Internet] 2021;
González Vaquero D, Torres Rodríguez M del
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Available
from:
Available
from:
https://drive.google.com/file/d/1FBoWmsjFxa
de las encuestas de satisfacción realizadas en
9vsV1eZb2lo38AjbPiuuO9/view
consulta de farmacia hospitalaria. Comparación
[19] Guevara-González IC, Carreño-López R,
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Caso-Vargas
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Caracterización
LR, de
Marín-Cevada cepas
V.
https://drive.google.com/file/d/1Sx2unAN3Bz
rizosféricas
UgaHyH3fte0QOI4IwRtAQF/view
pertenecientes al género Paraburkholderia sp. aisladas de la sierra norte del Estado de Puebla. Alianzas y Tendencias BUAP [Internet]. 2021;
vi Editorial
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.22.01
Distribution of Triatoma (Meccus) phyllosoma and Triatoma (Meccus) longipennis as vectors of Trypanosoma cruzi in the state of Aguascalientes, Mexico and surroundings Susana Morales-Moran1, Eduardo Sánchez-García2 ID, Rosa Isela Chávez-Gómez1, Norma Adela CarrascoEsparza1, Alberto Aguayo-Acosta3 ID, David Alejandro Hernández-Marín1,2* ID. 1
Laboratorio de Microbiología, Departamento de Microbiología, Centro de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Aguascalientes. Aguascalientes, México. CP 20131. Tel +52-4499108412. 2 Laboratorio de Química Analítica, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León. San Nicolás de los Garza, Nuevo León, México. CP 66455.Tel +52-81-83294110 ext 3652. 3 Laboratorio de Bioquímica y Genética de los Microorganismos, Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Autónoma de Nuevo León. San Nicolás de los Garza, Nuevo León, México. CP 66455. Tel +52-81-83763044. *Email autor corresponsal: dahernandez@correo.uaa.mx Recibido: 23 febrero 2021. Aceptado: 4 abril 2021
ABSTRACT Chagas disease is transmitted by hematophagous triatomine insects of the Reduviidae family. These vectors tend to hide in dark and humid places in homes in the endemic areas, mainly rural in Latin America. The Mexican territory is considered a critical endemic area, in recent years; more than 34 species of triatomines have been described as carriers of the disease, mainly the genera Rhodnius, Paratriatoma, Eratyrus, Dipetalogaster, Belminus, Panstrongylus, Meccus, and Triatoma. In Aguascalientes and Zacatecas's states, the observationand capture of the Triatoma phyllosoma and Triatoma longipennis species have been reported over three decades. Recent studies show that both species belong to the genera Meccus. This work summarizes the capture, identification, and analysis of Triatoma (Meccus) phyllosoma and Triatoma (Meccus) longipennis species as vectors of Chagas disease in the towns of Palo Alto, El Terrero de la Labor, Temazcal, Piedras Chinas, La Labor, Ojocaliente, Malpaso, Las Cabras and the center of the municipality of Calvillo in the state of Aguascalientes, Apulco and Jalpa in the state of Zacatecas, during March to August of the year 2019. Of a total of 252 collected bed bugs, 44% presented positivity as a carrier of Trypanosoma cruzi. 1 Artículo original
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
Simultaneously, the morphological identification showed that 66.66% corresponds to the M. longipennis species, and the remaining 33.34% is for the M. phyllosoma species. Keywords: Chagas, Meccus phyllosoma, Meccus longipennis, Triatomines, Trypanosoma cruzi, Vector. RESUMEN La enfermedad de Chagas es transmitida por insectos triatominos hematófagos de la familia Reduviidae. Estos vectores tienden a esconderse en lugares oscuros y húmedos en los hogares de las zonas endémicas, principalmente rurales de América Latina. El territorio mexicano es considerado un área endémica crítica, en años recientes; se han descrito más de 34 especies de triatominos como portadores de la enfermedad, principalmente los géneros Rhodnius, Paratriatoma, Eratyrus, Dipetalogaster, Belminus, Panstrongylus, Meccus y Triatoma. En los estados de Aguascalientes y Zacatecas, la observación y captura de las especies Triatoma phyllosoma y Triatoma longipennis se han reportado durante tres décadas. Estudios recientes muestran que ambas especies pertenecen al género Meccus. Este trabajo resume la captura, identificación y análisis de especies de Triatoma (Meccus) phyllosoma y Triatoma (Meccus) longipennis como vectores de la enfermedad de Chagas en las localidades de Palo Alto, El Terrero de la Labor, Temazcal, Piedras Chinas, La Labor, Ojocaliente, Malpaso, Las Cabras y el centro del municipio de Calvillo en el estado de Aguascalientes, Apulco y Jalpa en el estado de Zacatecas, durante marzo a agosto del año 2019. De un total de 252 chinches recolectadas, 44% presentó positividad como portador de Trypanosoma cruzi. Simultáneamente, la identificación morfológica mostró que el 66,66% corresponde a la especie M. longipennis y el 33,34% restante corresponde a la especie M. phyllosoma. Palabras clave: Chagas, Meccus phyllosoma, Meccus longipennis, Triatomines, Trypanosoma cruzi, Vector. INTRODUCTION Chagas
Trypanosoma cruzi. It has been estimated that 8
disease,
as
million people are infected worlwide, and more
life-threatening
than 65 million living in risk areas. This disease
anthropozoonosis caused by the blood parasite
is transmitted mainly to humans and some
trypanosomiases,
also is
a
known
2 Artículo original
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
mammals (dogs, cats, rodents, marsupials, and
Mexico is considered a country inside the
primates) through the feces or urine of blood-
endemic zone for the Chagas disease, with an
sucking triatomine Reduviidae family insects.
estimate of more than one million infected
However, human infections can also occur in
people. Likewise, various species of mammals
non-endemic areas due to blood transfusions,
stand out as carriers of the parasitosis, these
congenital
transplantation,
include dogs, cats and domestic rodents, which
international migration, laboratory accidents,
makes it an essential zoonotic disease and
and the ingestion of beverages or food
increases the risk to human health. [9, 10]. In
contaminated by the feces urine of the Triatoma
different states of Mexico such as San Luis
[1, 2, 3, 4].
Potosí, Jalisco, Querétaro, Estado de Mexico,
Human infections by T. cruzi present two
Oaxaca, and Chiapas, higher seroprevalence
phases of development; phase one, it is also
has been reported to humans; however, cases of
known as acute phase, lasting up to 3 months,
seropositivity to T. cruzi have been described in
presenting parasitemia, fever, Romagna's sign
all of Mexico [3].
and headaches. On the other hand, phase two,
In two-thirds of the Mexican territory, around
also known as chronic phase, develops even 10
34 species of triatomines transmitting Chagas
years after infection (30-35% of infected cases),
disease have been described, and these belong
the parasite produces amastigote nests in
to
various organs and peripheral nervous system,
Eratyrus,
causing
Panstrongylus, Meccus, and Triatoma; of
route,
cardiac,
organ
nervous
and
digestive
the
genera
Rhodnius,
Paratriatoma,
Dipetalogaster,
Belminus,
disorders [5, 6].
which the most reported species belong to the
Triatomines hide in holes and slots of poorly
genus Meccus and Triatoma [10, 11, 12, 13].
built houses; this is one reason why Chagas
Concerning the genus Meccus, the most
disease is endemic to rural areas of Latin
important species as transmitters are M.
America. Triatomines are active at night, and is
bassolsae, M. longipennis, M. mazzottii, M.
when they feed. Transmission occurs primarily
pallidipennis,
through contact with the feces or urine of
picturata [11, 13]. Within these vectors, the
triatomines infected with the parasite [7],
Phyllosoma complex comprises six species of
causing health problems in several countries of
the genus Meccus;
the American continent [4], mainly in Mexico,
mazzottii, M. pallidipennis, M. picturatus, M.
Brazil, and Argentina [2, 8].
bassolsae, and M. phyllosomus [14]. On the 3 Artículo original
M.
phyllosomus,
and
M.
M. longipennis, M.
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
other hand, of the genus Triatoma, the most
distribution of Triatoma (Meccus) phyllosoma
relevant species as transmitters of the parasite
and Triatoma (Meccus) longipennis in various
are T. gerstaeckeri, T. mexicana, T. rubida, T.
localities of Aguascalientes and Zacatecas and
barberi, and T. dimidiata [10, 11].
to establish the relevance of these triatomines as
For the year 2019, the Mexican government
vectors of Chagas disease.
reports that the species that transmit Chagas disease in Aguascalientes and Zacatecas are
METHODOLOGY
Meccus longipennis and Meccus phyllosoma
Collection areas
(Supplementary figure 1) [15]. In previous
Triatomine collections were carried out in 9
years,
towns
the
triatomine
species
Triatoma
in
Calvillo's
municipality,
(Meccus) phyllosoma and Triatoma (Meccus)
Aguascalientes (Figure 1); this geographical
longipennis have been reported in the state of
location has an average annual temperature of
Aguascalientes and Zacatecas [11, 16, 17, 18].
approximately 19.3 °C, with an average
The synonymy for the genera is explained in
temperature increase to 23 °C between May and
2010, when Licón-Trillo et al. [19] reported the
June [24]. It is known that the state of
presence of Meccus phyllosomus longipennis =
Aguascalientes has three types of climate: semi-
Triatoma longipennis in Mexican territory, and
dry temperate, semi-dry warm, and mild sub-
Rodríguez-Bataz et al., in 2011 [20] reported
humid with rains in summer. In these climates,
the same species as a carrier of T. cruzi in San
the average annual temperature is 17.1, 20.1,
Tadeo, Presa de Los Serna, Malpaso, Jatiche de
and 14.5 °C, respectively, and the mean annual
Arriba and La Labor towns, in Aguascalientes,
rainfall is 488, 579.1 and 688.3 mm,
Mexico. In the same year, Meccus longipennis
respectively. Particularly in Calvillo region
was reported as a species distributed in
(Aguascalientes)
Aguascalientes and Zacatecas [11, 21]. For the
Aguascalientes collection zones, the average
case of Triatoma phyllosoma, Cortés-Jiménez
annual temperature is 14-22 °C, and the mean
et al. in 1996 [22], reported his findings for
annual average annual rainfall is 500-800 mm,
Aguascaliente’s’ state and in 2006 Cruz-Reyes
the Apulco (Zacatecas) region the average
and Pickering-Lopez [23] reported presence of
annual temperature is 16-20 °C, and the mean
T. longipennis and T. phyllosoma in the states
annual average annual rainfall is 600-800 mm
of Aguascalientes and Zacatecas.
and finally the Jalpa (Zacatecas) region the
This work's objective was to determine the
average annual temperature is 14-24 °C, and the 4
Artículo original
including
all
others
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
mean annual average annual rainfall is 600-
minimum 6 °C; the average yearly rainfall is
1000mm [25, 26, 27]. The state's arid zone's
510 mm, with a maximum of 910 mm and a
vegetation comprises secondary scrub and
minimum of 314 mm [29, 30]. In its territory,
grasslands; the temperate zone is home to
six vegetation types are distinguished: thorn
different oak forests or mixed forests (oak-
forest, tropical deciduous forest, Quercus
conifers). The tropical area is mostly covered
forest, coniferous forest, xerophilous scrub, and
by secondary subtropical scrub [28].
grassland [31, 32]. The collections were carried
On the other hand, collections were made in the
out from March to August 2019; besides, they
municipalities of Apulco and Jalpa, belonging
were carried out at a specific time from 20:00
to Zacatecas (Figure 1). These collection areas
to 24:00; this was due to tonight's behavior
were selected due to the records and capture of
feeding triatomines [33, 34]. The capture was
triatomines in central and northern Mexico and
carried out under a security protocol, which
the sighting reported by its inhabitants with the
consists of avoiding direct contact, this using
help of the community participation method
gloves and tweezers [35, 36]. The places where
[11, 19]. It should be noted that the state of
the searches were carried out were in stone
Zacatecas has a mainly dry climate and has an
fences, barns, chicken coops, abandoned
average annual temperature of 16 °C and
houses, and near corrals and resting places for
moderate variations maximum 35 °C and
cattle [37].
Figure 1. Collection locations in the states of Aguascalientes and Zacatecas, Mexico, the numbers correspond to location code in table 1. 5 Artículo original
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
Table 1. Locations and coordinates of the sampling carried out LOCATION CODE 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11
AGUASCALIENTES LOCATIONS Palo alto El Terrero de la Labor Temazcal Piedras Chinas La Labor Ojocaliente Malpaso Centro Calvillo Las Cabras ZACATECAS LOCATIONS Apulco Jalpa
COORDINATES 22°02’30.19’’ N y 102° 40’57.64’’O 22°1’28.999’’ N y 102° 40’ 20.20’’ O 22°0’15’’ N y 102° 43’ 01.99’’ O 21°58’29.33’’ N y 102° 40’ 32.76’’ O 21°57’50.59’’ N y 102° 41’ 30.13’’ O 21°52'51.07"N y 102°40'25.59"O 21°51’34’’ N y 102° 39’ 50.999’’ O 21°50'56.80"N y 102°42'53.15"O 21°49'37.10"N y 102°44'19.40"O
ELEVATION (masl) 1920 m 1850 m 1950 m 1785 m 1750 m 1705 m 1710 m 1628 m 1669 m
21°23'32.64"N y 102°40'31.72"O 21°38'16.39"N y 102°58'29.85"O
1798 m 1390 m
Following the method of Rubio et al. [38], with
approximately 60 min, and the light feeding
some
area was covered to simulate the conditions in
modifications,
all
the
individuals
obtained were placed in glass jars, which
which the vectors feed [33, 41, 42].
contained folded paper to minimize the Microscopic examination of feces
triatomines' stress and try to simulate their
Immediately after feeding, the specimens were
habitat conditions. Each container was covered
handled,
with gauze and held firmly with an elastic band
labeled
with
the
into
consideration
all
biosecurity measures [35, 36], execute an
to allow the triatomine to breathe. Each bottle was
taking
abdominal-ventral massage to each of them to
corresponding
stimulate the excretion of feces; each sample
coordinates. Also, it was worked in an
collected was diluted with 20 µL of PBS (pH of
approximate radius of 100 meters [39, 40].
7.2).
Subsequently,
the
search
for
the
Maintenance and feeding
Trypanosoma cruzi parasite in its metacyclic
To keep alive and ensure the prevalence of
trypomastigote stage was carried out through
triatomines, they were fed with rabbit blood; for
the microscopic review of each sample with the
this, it was placed in a dorsal position, and the
help of a bright-field microscope (Leica
flasks with the collected individuals were
DM750) at 40X magnification (Supplementary
placed on its abdomen. The feeding time lasted
figure 2) [35, 43]. 6
Artículo original
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
Morphological identification of triatomines
2019, of which 87.2% belong to the state of
Various morphological characteristics were
Aguascalientes and 12.8% to the state of
considered to identify the species of the
Zacatecas (Table 2). Two species of triatomines
collected triatomines, such as length, convex,
were identified in the collection areas, being
type of abdomen, hemeliters, the color of the
Triatoma (Meccus) longipennis and Triatoma
convex bands, and their anal socket [44].
(Meccus)
phyllosoma,
morphological
help
with
their
characteristics.
After
observation
this
RESULTS
microscopic
(40X)
Table 1 shows the localities of the states of
samples, positives for the Trypanosoma cruzi
Aguascalientes and Zacatecas where the
parasite were recorded. According to size
samplings were carried out, the sampled areas
(between 15 and 45 µm), shape (flagellate), and
present a similar elevation above sea level
stage (metacyclic trypomastigote). It resulted in
(masl); above 1,300 m but below 2,000 m. In
110 positive triatomines that correspond to
the same way, these localities are adjacent or
43.65% of the total individuals collected (Table
close to each other. A total of 252 triatomines
2).
were collected between April and August of
Table 2. Number of triatomines and species collected in the different locations Localities
Number of triatomines
M .longipennis
M. phyllosoma
Palo alto 21 (5)* 10 (5) 11 El Terrero de la Labor 27 (5) 24 (5) 3 Temazcal 21 (5) 21 (5) 0 Piedras Chinas 17 (0) 17 0 La labor 17 (2) 17 (2) 0 Ojocaliente 28 (21) 20 (15) 8 (6) Malpaso 27 (11) 27 (11) 0 Centro Calvillo 1 (0) 0 1 Las Cabras 61 (44) 24 (22) 37 (22) Apulco 29 (15) 23 (14) 6 (1) Jalpa 3 (2) 1 (1) 2 (1) TOTAL 252 (110) 184 (80) 68(30) * ( ) represents the number of individuals positive for Trypanosoma cruzi after microscopic examination.
7 Artículo original
of
fecal
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
The triatomines identification showed that both
locations mentioned above. This information
species collected and identified are carriers of
corresponds to what was reported in previous
the Trypasonoma cruzi parasite. In M.
years regarding the sighting, capture, and
longipennis, a 31.75% positivity was recorded,
identification
while for M. phyllosoma, it presented 11.90%
mentioned above and its surroundings [11, 16,
positivity for the total number. In Las Cabras, a
18, 19]. From the year 2010 [19], there is
greater number of triatomines were found,
mention that the genus Meccus is synonymous
being 61 total and 44 positives, and there is a
or that it presents homology to the genus
higher prevalence of M. phyllosoma. Regarding
Triatoma; this happens again in 2012 [21]. But
the morphological identification of triatomines,
until 2019, Mexico's government reports
73% corresponds to the M. longipennis, while
Meccus longipennis and Meccus phyllosoma
27% corresponds to the M. phyllosoma.
species in Aguascalientes and Zacatecas
of
Aguascalientes
species
regions [15]. On the other hand, the specimens DISCUSSION
were collected between 1390 and 1950 masl. To
Carrier vectors of T. cruzi (triatomines) are
this respect, it has been reported that the species
found mainly in Latin America's rural areas,
different triatomine species carrying T. cruzi
being Mexico one of the countries with the
have been collected between 100 and 2360 masl
greatest health problems due to these carrier
in Mexican territory [11, 21, 46, 47], biotic
insects [2, 7, 8]. It has been pointed out that the
characteristics consistent with this work.
Mexican territory is considered endemic for
It is essential to highlight that the different
more than 34 species of triatomines. Being, the
vectors of the Hemiptera family: Reduviidae,
genus Meccus and Triatoma species the most
develop in a great variety of climates and
widely reported [10, 13]. Specifically, the
temperatures; within the latter, the annual
Aguascalientes state is considered a place of a
averages of the states where the collections
high risk of infection by T. cruzi due to the
were made oscillate between 14.5 and 20.1 °C
triatomes present in the area [45]. It is for the
with a record of average variations of up to 35
above reasons that it was decided to sample
°C as a maximum [25, 26, 27, 29, 30].
various rural areas of Aguascalientes and some
Documents have determined that for the
nearby areas in search of triatomines.
Triatoma dimidiata species, the sighting and
Triatoma (Meccus) longipennis and Triatoma
capture have been reported in Campeche,
(Meccus) phyllosoma were found in the
Mexico. This state has an average annual 8
Artículo original
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
temperature of 26 °C [48]; this is higher than
study. Finally, it should be noted that in 1993
that of the previously mentioned areas. For the
100% positivity was reported in the Meccus
Meccus pallidipennis species, its capture was
longipennis specimens collected by Rubio [51]
recorded in Guerrero, Mexico, a state with an
(n = 46), Calvillo, Aguascalientes; however,
average annual temperature of 18 °C [49].
our collections indicate a lower percentage of
These temperatures are similar to the yearly
positive triatomines for T. cruzi. The latter may
averages of Aguascalientes and Zacatecas,
be due to the number of samplings carried out,
Mexico.
the number of individuals analyzed, the
Before morphological identification of the
collection schedule, a difference of more than
triatomines, microscopic observations of the
20 years between both studies and the
feces were made to determine the presence of
collection time.
T. cruzi. The results indicate that 43.65% of the total triatomines were positive for T. cruzi.
CONCLUSIONS
Specifically, it was recorded that Triatoma
The 43.65% of triatomines collected in the
(Meccus)
31.75%
present investigation were positives for T. cruzi.
positivity. While for Triatoma (Meccus)
Triatoma (Meccus) longipennis and Triatoma
phyllosoma, there was 11.90% positivity.
(Meccus) phyllosoma
Molina-Garza [50] report that approximately
potentially transmitting Chagas disease vectors.
59% of the triatomines of the Triatoma
It is recommended that in these areas and their
gerstaeckeri species analyzed were positive for
surroundings,
the T. cruzi parasite. Likewise, Salazar-
regularly to establish adequate controls; such as
Schettino et al. [11] mentioned different
fumigations, specific areas for domestic
percentages of triatomines carries T. cruzi, 37%
animals and the construction of houses. Also,
and 72% of positivity in Triatoma Barberi,
carry out analyzes in its human inhabitants to
4.1% and 34% in Triatoma dimidiate, 25% and
verify seropositivity and carry out more studies
85% in Meccus longipennis and, 6.6% and 53%
of the non-human reservoirs of the areas under
in Meccus mazzottii. All these data were
research.
longipennis
presented
these
were identified as
vectors
be
sampled
obtained from collections and records in various states of the Mexican Republic. The
INTEREST CONFLICT
percentages mentioned are similar or higher
The authors of the present work do not present
than those obtained for the two species under
any conflict of interest regarding the project 9
Artículo original
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
developed and its writing. This project was
[2]. Nunes MCP, Beaton A, Acquatella H, Bern
financed
C, Bolger AF, Echeverria LE, et al. American
with
financial
support
from
CONACYT donation number 41226. It was
Heart
also supported with reagents, equipment and
Endocarditis,
facilities from the Centro de Ciencias Básicas
Committee of the Council on Cardiovascular
of
Disease
the
Universidad
Autónoma
de
Aguascalientes.
Association
in
and
the
Rheumatic Kawasaki
Young,
Fever Disease
Council
on
Cardiovascular and Stroke Nursing, Stroke Council. Chagas cardiomyopathy: an update of
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Artículo original
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15 Artículo original
del
gobierno
del
estado
de
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.22.01
Supplementary figures
Supplementary figure 1. morphological characteristics of T. longipennis (A) y T. phyllosoma (B). according to Lent & Wygodzinsky, 1979 the main differences between T. longipennis (A) and T. phyllosoma (B), are: 1*) in (A) connexivum color are in yelloworange range, in other hand in (B) connexivum color are in red-orange range, 2*) (A) has elongated hemelytron, meanwhile (B) has short hemelytron, almost reaching the sixth connexivum, 3*) in (A) Anal basin not protruding from the abdomen, contradictory to (A) in (B) anal basin protruding from the abdomen. 4*,5*) in (A) abdomen cavity has an oval shape, more length than wide, divergent to (A) in (B) abdomen cavity has a circular shape. *numbers indicate the lines and arrows using in the figure indicate the zones of differentiation in T. longipennis (A) y T. phyllosoma (B) morphology.
AyTBUAP 6(22):1-15 Morales-Morán et al., 2021
2
1 3
4 4
Supplementary Figure 2. T. cruzi parasite in the epomastigote development stage. T. cruzi, isolated from T. longipennis feces, arrows indicate (1) nucleus and (2) kimetoplast and (3) flagellum sections. Additionally, figure indicate a (4) lysed erythrocyte of T. longipennis digestion process.
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.22.02
Búsqueda in silico de inhibidores de Quorum Sensing y estudios preclínicos en Chromobacterium violaceum Esmeralda Escobar-Muciño* ID Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Posgrado en Microbiología. Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, México. *Email autor corresponsal: esmeeem2014@gmail.com Recibido: 16 marzo 2021. Aceptado: 23 abril 2021 RESUMEN La búsqueda de inhibidores de Quorum sensing (QS) en bacterias Gram-negativas es de importancia por su patogenicidad, por ello actualmente se buscan nuevas alternativas para inhibir la virulencia. El objetivo del presente estudio fue determinar la energía libre de Gibbs (-ΔG) por medio del acoplamiento molecular de 11 compuestos aromáticos con el regulador CviR de QS en Chromobacterium violaceum, obtener los parámetros farmacocinéticos y preclínicos de los mejores inhibidores de QS. Evaluando la -ΔG por 2 programas (Chimera 1.14 y mcule) comparando los promedios por método Tukey (p≤0.05) y representando la unión ligando-proteína por medio de modelos de lazos y listones. Además de analizar las interacciones entre los aminoácidos del regulador CviR (puente de hidrogeno y enlaces no covalentes) y los grupos funcionales de los compuestos aromáticos. Finalmente, se realizó un estudio in silico preclínico reportando la Dosis Letal en ratón (DL50) por 3 modelos QSAR y 5 parámetros farmacocinéticos. Los resultados demostraron que al analizar la -ΔG por ambos programas se obtuvieron 5 fuertes inhibidores de QS; el ácido ferúlico (-6.37±0.21), el ácido hidroxicinámico (-6.53±0.35), 4-hidroxibenzaldehído (6.6±0.61), el eugenol (-6.2±0.38) y el isoeugenol (-6.23±0.59). Obteniendo que cada compuesto inhibe la actividad de CviR por un mecanismo de bloqueo del dominio de unión al autoinductor-1. Además, se obtuvieron valores significativos de DL50 sin reportar toxicidad en ratón y valores farmacocinéticos aceptables de los 5 inhibidores seleccionados. Concluyendo que los inhibidores podrían ser objetivo de investigación como terapia alternativa contra la patogénesis de C. violaceum. Palabras clave: acoplamiento molecular, autoinductor-1, compuestos aromáticos, estudios farmacocinéticos, estudios preclínicos e inhibidores de Quorum sensing (IQS). 16 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
ABSTRACT The search for inhibitors of Quorum sensing (QS) in Gram-negative bacteria is important due to its pathogenicity, therefore new alternatives are being sought to inhibit its virulence. The objective of the present study was to determine the Gibbs free energy (-ΔG) through a molecular coupling of 11 aromatic compounds with the CviR regulator of QS in Chromobacterium violaceum and to obtain the pharmacokinetic and preclinical parameters of the best QS inhibitors. Evaluating the -ΔG by 2 programs (Chimera 1.14 and mcule) comparing the averages by Tukey method (p≤0.05) and representing the ligand-protein binding employing loops and ribbons models. Furthermore, the interactions between the amino acids of the QS regulator (hydrogen bridge and non-covalent bonds) and the functional groups of aromatic compounds were analyzed. Finally, a preclinical in silico study was carried out reporting the Lethal Dose in mice (LD50) by 3 QSAR models and 5 pharmacokinetic parameters. The results showed that when analyzing the -ΔG by both programs, 5 strong QS inhibitors were obtained: ferulic acid (-6.37 ± 0.21), hydroxycinnamic acid (-6.53 ± 0.35), 4hydroxybenzaldehyde (6.6 ± 0.61), eugenol (-6.2 ± 0.38), and isoeugenol (-6.23 ± 0.59). Obtaining that each compound inhibits the activity of CviR by a blocking mechanism of the autoinducer-1 binding domain of CviR. Also, significant LD50 values were obtained without reporting mouse toxicity and acceptable pharmacokinetic values of the 5 selected inhibitors. Concluding that the inhibitors could be the target of research as an alternative therapy against the pathogenesis of C. violaceum. Keywords: aromatic compounds, autoinducer-1, docking molecular, inhibitors of Quorum sensing (IQS), pharmacokinetic studies and pre-clinical studies. INTRODUCCIÓN
humanos causante de casos de septisemia grave
La aparición reciente de cepas bacterianas con
en recién nacidos y adultos inmunodeprimidos.
fenotipos de resistencia a múltiples fármacos
Además, es muy tolerante a 24 antibióticos
(MDR) se ha convertido en un grave problema
como los betalactámicos, el cloranfenicol, la
de salud a nivel mundial, constituyendo una de
biciclomicina, la bacitracina, la kasugamicina y
las principales causas de mortalidad humana.
la metilenomicina.
En este contexto, Chromobacterium violaceum
Entre los mecanismos más importantes de esta
es considerado un patógeno oportunista de 17 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
resistencia bacteriana a múltiples fármacos se
infectados [5, 6].
encuentra la eliminación de dichos compuestos,
Por otro lado, se sabe que el mecanismo de
tanto del citoplasma como de la propia
Quorum Sensing (QS) de C. violaceum está
membrana celular, por medio de la acción de
regulado por el par de proteínas homólogas a
proteínas
LuxI/LuxR,
de
membrana
específicas
donde
CviI
es
la
enzima
denominadas “transportadores de eflujo o
autoinductor sintasa y CviR es el regulador
bombas resistencia a múltiples antibióticos”.
transcripcional
Por ello, hay un incremento de terapias
homoserina lactona (AHL, por sus siglas). Y a
alternativas para el tratamiento de infecciones
su vez CviR regula algunos fenotipos como la
causadas por el patógeno C. violaceum [1-4].
activación de los genes que conforman el
La causa principal es el número de casos
operón vioABCDE que codifican para la
reportados de pacientes hospitalizados por
producción del pigmento violeta insoluble en
infección
4
agua (la violaceína), los genes que codifican la
principales manifestaciones clínicas: fiebre
producción y degradación del cianuro, los
(100%), sepsis (82%), lesiones cutáneas
genes de la quitinasa, el promotor cviI, la
(67,9%) y dolor abdominal (31,1%). Además,
regulación de una guanina desaminasa, el
de la presencia de absceso localizado (49%)
sistema de secreción de tipo VI, la actividad
afectando con mayor frecuencia al hígado y
exoproteasa, la agregación, la formación de
conduciendo a la insuficiencia multiorgánica en
biopelícula, el swarming, la tolerancia al estrés
pacientes enfermos [5, 6]. Asimismo, se han
por H2O2, la utilización de fuentes de nitrógeno
registrado casos de sepsis grave debido a
y la síntesis de la molécula C6-AHL y C10-AHL
infecciones del tracto urinario y bacteremia
[12, 13].
transmitidas
del
por
patógeno,
el
observando
consumo
de
agua
resistencia bacteriana a los antibióticos es un
Unidos, Brasil, Argentina, Australia, Senegal y
problema grave para la salud pública. Por lo
Sri Lanka [3, 7-11]. Por lo anterior, es necesario una
acil
crecimiento bacteriano, considerando que la
como: Vietnam, Suiza, Taiwán, Japón, Estados
y
la
se basan en el uso de compuestos que inhiben el
enfermos contagiados en diferentes países
rápido
a
tradicionales de las enfermedades infecciosas
padecimientos se tienen los reportes de
diagnóstico
responde
Asimismo, la mayoría de los tratamientos
contaminada con C. violaceum. De estos
un
que
que,
terapia
hoy
en
día
se
continua
con
el
descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas,
antimicrobiana eficaz para curar pacientes
debido al abuso del uso de los antibióticos y el 18
Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
surgimiento de la multirresistencia en las
actividad anti-QS de algunos aceites esenciales
bacterias Gram-negativas [14, 15].
y la vainillina en bacterias Gram-negativas
Por ello, los inhibidores de QS son utilizados
[26].
para que estas moléculas compitan por el sitio
Por otro lado, existen pocos estudios in silico
de unión al autoinductor-1 del regulador
que aborden el efecto inhibitorio del QS en C.
transcripcional homólogo a LuxR y sus
violaceum basados en varios compuestos
homólogos en bacterias patogénicas Gram-
aromáticos [28]. En el caso de algunos
negativas. Como ejemplo el uso de la furanona
patógenos multirresistentes Gram-negativos se
que fue eficaz contra la patogenicidad de
reportó que han adquirido resistencia al
Chromobacterium [16-19].
inhibidor furanona. Por esta razón, se han
Otros ejemplos de inhibidores son la vainillina,
estudiado nuevos inhibidores con la finalidad
el ácido vanílico y el ácido ferúlico que han sido
de atenuar la virulencia y reducir el número de
adicionados en algunas especies bacterianas
casos de enfermedades proponiendo nuevas
como Listeria, Pseudomonas, Chronobacter y
terapias clínicas. Además del hecho de que la
E. coli [20-25]. Además, se ha informado el
biopelícula es difícil de eliminar de los órganos
efecto de estos compuestos aromáticos en
humanos,
algunos
la
membranas utilizadas en los biorreactores. Por
resistencia al calor, los cambios en el pH y la
lo que el QS se ha convertido en una diana
inhibición de las bombas de flujo relacionadas
molecular para la creación de nuevos agentes
con la resistencia a los antibióticos [20, 21, 26,
anti-biopelícula en diferentes superficies [32-
27]. A su vez, se ha investigado sobre la
35].
disminución de los factores de virulencia
Hay que destacar que este trabajo es de los
adicionando extractos metanólicos de la
primeros informes que describen la unión de
vainillina. Observando que es una terapia
varios compuestos aromáticos cuya función es
antimicrobiana
inhibir
fenotipos
bacterianos
eficaz
que
como
inhiben
la
el
la
material
actividad
quirúrgico
del
y
las
regulador
producción de la violaceína en la cepa reportera
transcripcional CviR de QS en C. violaceum
C. violaceum CV026, mostrando resistencia al
comparando la energía libre de Gibbs por
tratamiento
la
medio de 2 programas. Además de representar
producción de la biopelícula [28-31]. Los
las interacciones ligando-proteína mediante
resultados fueron consistentes con los estudios
experimentación in silico y la descripción de
de Nazzaro y cols.,2013, confirmando la
algunos parámetros preclínicos de los 5 mejores
y
efecto
inhibitorio
en
19 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
inhibidores del regulador CviR que compiten
fueron identificados por medio del programa
con el ligando natural C6-AHL en C. violaceum.
PyMol versión 4.60 y se visualizaron por medio
Por lo que, el objetivo de este trabajo fue
del uso del programa discovery studio versión
estudiar mediante herramientas in silico los
2020 [36-38].
inhibidores de QS que compiten con el sitio de unión
al
autoinductor-1
del
Preparación del regulador transcripcional CviR para la prueba de acoplamiento molecular
regulador
transcripcional CviR de C. violaceum y describir algunos parámetros preclínicos.
La
estructura
cristalina
del
regulador
transcripcional CviR se obtuvo de la base de
METODOLOGÍA
datos del Protein Data Bank (PDB) con un
Búsqueda in silico de inhibidores de QS por acoplamiento molecular
código PDB de 3qp2. Posteriormente, el
Para la presente investigación se seleccionaron
ligando natural C6-AHL del regulador CviR fue
varios compuestos aromáticos producidos por
removido utilizando el programa chimera
medio de la bioconversión bacteriana. Los
version 14.1. Y la proteína CviR se preparó y
compuestos
se
guardó en formato PDB para la prueba de
buscaron en la base de datos del ZINC
acoplamiento utilizando el programa Chimera
(http://zinc.docking.org) para obtenerlos en
14.1 y la herramienta Dock Prep [37, 38].
formato SDF. Posteriormente, se obtuvo el
Después, se obtuvo la energía libre de Gibbs
código PDB (3qp2) de la proteína reguladora
(-ΔG) resultante del acoplamiento de los
CviR para llevar a cabo el estudio de
compuestos
acoplamiento molecular. Con la finalidad de
transcripcional CviR, utilizando el programa
obtener los promedios de la energía libre de
Chimera (herramienta Auto Dock Vina) y el
Gibbs (-ΔG) de cada uno de los acoplamientos
programa
con el regulador CviR, por medio de 2
acoplamiento con 1 clic). La grid-box o caja de
programas (mcule versión 2021 y Chimera
selección del sitio de unión del del ligando, se
versión 14.1). Además, se obtuvieron los
generó utilizando los residuos del dominio de
grupos
compuestos
unión a las AHL de CviR cuyas coordenadas
aromáticos que interactuaron con el dominio de
fueron: x; 19.7552, y; 12.846 y z; -12.4327.
unión al autoinductor-1 o las acil homoserina
Especificando, el área de interacción del
lactonas (AHLS) del regulador transcripcional
monómero
CviR de C. violaceum. Los grupos funcionales
transcripcional
aromáticos
funcionales
de
seleccionados
los
20 Artículo original
aromáticos
mcule
2021
y
regulador
(herramienta
correspondiente CviR
el
con
al los
de
regulador grupos
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
funcionales de cada uno de los compuestos
compuestos aromáticos se modificaron a
aromáticos para describir las interacciones
formato mol2 para su uso posterior en la
entre los aminoácidos de CviR y los enlaces
herramienta Autodock Vina. Asimismo, los
formados entre el ligando y la proteína. El
códigos
acoplamiento molecular se realizó en presencia
introducción lineal molecular simplificada) de
de neutralizantes y moléculas de agua con la
cada uno de los compuestos aromáticos fueron
finalidad de simular condiciones biológicas
obtenidos en la base de datos PubChem al
[39]. Los promedios de la -ΔG obtenidos del
dibujar las estructuras químicas en el programa
acoplamiento molecular se compararon y
mcule versión 2020. Utilizando la herramienta
clasificaron en base a los estudios in vitro
refine in drawer tool y la herramienta de
reportados de los inhibidores de QS en Gram-
acoplamiento molecular 1-Click-Docking [37,
negativas como la furanona y la vainillina [16,
38]. Los códigos obtenidos de los 11
28, 40, 41]. Tomando como criterio la energía
compuestos
libre de Gibbs igual o superior a los resultados
continuación reportando los códigos SMILES y
del acoplamiento molecular de la vainilla (-
ZINC. Los datos de los compuestos aromáticos
ΔG>=-5.63±0.152) con CviR del presente
fueron los siguientes: ácido ferúlico (código
estudio. Los 11 ligandos se compararon con la
SMILES code (COc1cc(/C=C/C(=O)O)ccc1O)
vainillina con la finalidad de encontrar el mejor
y código ZINC (ZINC58258)), ácido vanílico
inhibidor, seleccionando los valores más altos
(código SMILES (COc1cc(C(=O)O)ccc1O) y
de -ΔG durante las interacciones con el dominio
código ZINC (ZINC338275)), alcohol vanílico
de unión al autoinductor-1 de CviR.
(código
SMILES
código
ZINC
Obtención de los ligandos de las bases de datos ZINC y PubChem: código SMILES y formato SDF
de
datos
del
(especificación
aromáticos
resumen
(ZINC1164388)), (código
(O=C(O)c1ccc(O)cc1) (ZINC332752)),
se
de
(COc1cc(CO)ccc1O)
hidroxibenzoíco
Los compuestos aromáticos se obtuvieron de la base
SMILES
ácido
y
a
y
ácido SMILES
código
ZINC
hidroxicinámico
(código SMILES (O=C(O)/C=C/c1ccc(O)cc1)
ZINC
y código ZINC (ZINC39811)), catecol (código
(http://zinc.docking.org/substances/home/)
SMILES
[42], con la intensión de preparar las moléculas
(Oc1ccccc1O) y código
ZINC
(ZINC13512214)), eugenol (código SMILES
para los estudios posteriores de acoplamiento
(C=CCc1ccc(O)c(OC)c1) y el código ZINC
mediante el uso programa Chimera versión
(ZINC1411)), isoeugenol (código SMILES
1.14. Los archivos SDF de cada uno de los 21
Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
(C/C=C\c1ccc(O)c(OC)c1) y código ZINC
elaboraron mediante modelos de lazos y
(ZINC12405001)),
listones utilizando Chimera versión 1.14 y las
4-hidroxibenzaldehído
(código SMILES (O=Cc1ccc(O)cc1) y el
interacciones
código ZINC (ZINC156709)), protocatecolato
realizadas por el programa Discovery Studio
(código
visualizer versión 2020 [37, 38].
SMILES
receptor-ligando
fueron
(COC(=O)C1=CC(=C(C=C1)O)O) y el código Estudios in vitro de farmacocinética y propiedades fisicoquímicas de los compuestos aromáticos
ZINC (ZINC13246)) y vainillina (código SMILES (COc1cc(C=O)ccc1O) y el código ZINC (ZINC000002567933)). La molécula C6AHL;
código
A partir de los valores más altos de -ΔG
SMILES
obtenidos de los resultados de acoplamiento
(CCCC(=O)CC(=O)NC1CCOC1=O) y código
molecular
ZINC (ZINC6220). Este último compuesto fue
se
seleccionaron
los
mejores
inhibidores. Posteriormente, se elaboraron
tomado como control de los acoplamientos
predicciones que consistieron en evaluar los
moleculares elaborados con el regulador
parámetros fisicoquímicos y de toxicidad
transcripcional de QS (CviR) en C. violaceum
ADME (Absorción, Distribución, Metabolismo
[43].
y Excreción, por sus siglas) de cada molécula
También, se utilizó la furanona C30 (código
con
SMILES (C1=C(C(=CBr)OC1=O)Br) y el
(http://www.swissadme.ch/) [44]. El protocolo
código ZINC (ZINC34279630)) como un
utilizó los códigos SMILES de cada molécula
inhibidor de QS C. violaceum como control
para
para comparar los datos reportados con los
farmacocinéticos como: la absorción del
resultados obtenidos [16]. Finalmente, se
intestino grueso (GI), la permeabilidad de la
mostraron los mejores acoplamientos de los
barrera hematoencefálica (BBB: blood-brain
aminoácidos del regulador CviR de C.
barrier, por sus siglas in ingles), el valor de
violaceum y los grupos funcionales de los
inhibición de la Glucoproteína-P 1 (P-gp), los
compuestos aromáticos, para determinar el
valores de inhibición de la enzima citocromo
posible mecanismo de inhibición de cada
oxidasa (CYP) y sus variantes CYP1A2,
compuesto aromático con el dominio de unión
CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6 y CYP3A4.
al autoinductor-1 del regulador transcripcional
Además de obtener algunas propiedades
CviR.
fisicoquímicas de cada uno de los compuestos
Las representaciones de los acoplamientos se
aromáticos seleccionados. 22
Artículo original
el
programa
obtener
online
diferentes
SwissADME
parámetros
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
Estudios de la concentración inhibitoria (IC50) en ratón por métodos QSAR
un promedio de tres sustancias similares a la
Se utilizó el programa de estimación de
moleculares necesarios se calculan dentro de la
toxicidad o T.E.S.T versión 4.2.1 (Toxicity
herramienta
Estimation Programa Tool (por sus siglas en
(https://www.epa.gov/chemical-
inglés), para estimar la toxicidad en el modelo
research/toxicity-estimation-programa-tool-
del ratón de los compuestos aromáticos
test) [45]. Obteniendo un promedio del valor
resultantes
acoplamiento
LD50 en ratón reportadas en mg/kg y el
molecular. Cuyo protocolo se basó en ingresar
coeficiente de determinación (R2) por medio de
los compuestos aromáticos para evaluarlos por
la regresión lineal de la recta en cada uno de los
medio del esbozo químico en el programa
modelos matemáticos creados para cada
T.E.S.T versión 4.2.1 ingresando los códigos
molécula analizada [46].
del
tamiz
del
sustancia problema. Todos los descriptores
T.E.S.T
versión
4.2.1
SMILE de cada compuesto aromático. La toxicidad se estimó usando varias metodologías
Análisis de datos
QSAR como: (a) el método jerárquico, en el
La energía libre de Gibbs (-ΔG) se consideró
cual la toxicidad para un compuesto se estima
como recurso de variación. La comparación de
usando
las
medias entre los tratamientos se realizó
predicciones obtenidas a partir de diferentes
mediante la prueba de Tukey (p≤ 0.05). El
modelos
se
análisis estadístico se realizó con el programa
utilizó una técnica basada en algoritmos para
Minitab 2020 [47]. Todos los resultados fueron
generar
compuesto
obtenidos a partir de la media obtenida de los
aromático y obtener el valor de toxicidad. (b) El
triplicados obtenidos de los programas mcule
método de la Administración de Medicamentos
versión 2021 y Chimera versión 1.14.
el
promedio
matemáticos.
modelos
para
ponderado
de
Posteriormente,
cada
y Alimentos (Food drugs and administration, FDA, por sus siglas en inglés) que consiste en
RESULTADOS
una predicción para cada sustancia problema
Inhibidores del regulador transcripcional
por medio de la creación de un modelo que busca
sustancias
químicas
similares
CviR
al En el presente estudio se obtuvieron los valores
compuesto de prueba. Y (c) el método del
de energía libre de Gibbs (-ΔG) para el
vecino más cercano o Nearest Neighbor por sus
regulador transcripcional de QS (CviR) y su
siglas en inglés, que utiliza la toxicidad prevista
ligando natural C6-AHL (-5.63 ± 0.25 y -5.76
de un compuesto químico y se estima tomando 23
Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
±0.057) usando los programas mcule y
fueron el ácido ferúlico (-6.57±0.25), el ácido
Chimera,
hidroxicinámico
respectivamente.
Además,
se
(-6.27±0.21), el eugenol
consideró como un control positivo al valor de
(-6.6±0.3), el isoeugenol (-6.6±0.61). y el 4-
energía de libre de Gibbs obtenido de la
hidroxibenzaldehído (6.6±0.61).
vainillina (ΔG= -5.53 ± 0.14) al considerarse
Destacando que, utilizando el
como un inhibidor de QS en C. violaceum [28,
Chimera se obtuvieron los valores más altos de
40].
energía libre de Gibbs. Considerándolo, el
Los resultados obtenidos del análisis de
mejor método de evaluación del acoplamiento
acoplamiento molecular de los compuestos
molecular entre los compuestos aromáticos y el
aromáticos probados con el regulador CviR de
regulador transcripcional de QS (CviR) de C.
C. violaceum se obtuvieron en rangos de
violaceum. Proponiendo, al ácido ferúlico, el
energía libre de Gibbs de ΔG= -5.5±0.26 y ΔG=
ácido
-6.53±0.35
hidroxicinámico,
isoeugenol y 4-hidroxibenzaldehído como los
respectivamente) utilizando el programa mcule.
mejores inhibidores de QS (IQS) del patógeno
Mientras que, los resultados obtenidos de
C. violaceum. Debido a que los valores de
acoplamiento molecular se obtuvieron en
energía libre de Gibbs fueron superiores a los
rangos de energía libre de Gibbs de ΔG=-
promedios obtenidos de los inhibidores de QS
5.43±0.21 y ΔG =-6.60± 0.30 (vainillina y el
vainillina (5.53± 0.14) y furanona C30 (4.89±
eugenol,
0.12) como se observa en la figura 1.
(ácido
respectivamente)
utilizando
el
hidroxicinámico,
el
programa
eugenol,
el
programa Chimera. En la tabla 1 se muestran
En la tabla 1 se resumen los grupos funcionales
los resultados del acoplamiento molecular de
de los compuestos aromáticos que interactuaron
los
con los aminoácidos del dominio de unión al
compuestos
aromáticos,
considerados
posibles inhibidores del QS de C. violaceum.
autoinductor-1 del regulador transcripcional
De los 11 compuestos aromáticos analizados,
CviR, encontrando la formación de: (1) puentes
los valores de -ΔG más altos correspondieron al
de hidrógeno, (2) enlace pi-anión, (3) enlace pi-
ácido
ferúlico
(-6.37±0.21),
el
ácido
donante unido al hidrógeno, (4) enlace pi-
hidroxicinámico
(-6.53±0.35),
el eugenol
alquilo y (5) las fuerzas de Vander Waals. En
(-6.23±0.38) y el isoeugenol (-6.23±0.59)
cuanto al mecanismo de inhibición del
utilizando el programa mcule. Y al comparar
regulador CviR seguido se encontró que
los resultados de acoplamiento molecular con el
comparten los 11 compuestos aromáticos
programa Chimera, los mejores valores de -ΔG
evaluados, compartieron ciertos aminoácidos 24
Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
de CviR que se unen al autoinductor-1 (C6-
Val67 (cadena lateral de la AHL). Encontrando
AHL) como: Trp103 (anillo de lactona), Ser147
como principales resultados que el isoeugenol
(anillo de lactona), Trp76 (anillo de lactona),
(9 aminoácidos) y la vainillina (8 aminoácidos)
Tyr72 (anillo de lactona y grupo acilo), Tyr80
mostraron
(grupo amino y la cadena lateral de la AHL),
aminoácidos que interactúan con los grupos
Asp89 (grupo amino), Leu77 (cadena lateral de
funcionales del ligando natural de CviR (C6-
la AHL), Leu47 (cadena lateral de la AHL) y
AHL) (Tabla 1)
más
interacciones
con
los
Figura 1. Energía libre de Gibbs obtenida a partir del acoplamiento molecular de los compuestos aromáticos y el dominio de unión al autoinductor-1 o AHLS del regulador transcripcional CviR del patógeno C. violaceum. El análisis estadístico fue elaborado basándose en la comparación de medias mediante la prueba de Tukey, utilizando los promedios de la energía libre de Gibbs de cada compuesto aromático obtenido por los 2 programas. Las letras diferentes indican las diferencias significativas entre los promedios obtenidos.
25 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
Tabla 1. Resultados de las interacciones de los compuestos aromáticos y el regulador CviR de C. violaceum visualizados en Discovery Studio 2020 Molécula
C6-AHL (ligando natural) Furanona (inhibidor de QS) Vainillina (inhibidor de QS) Catecol Eugenol
Ácido ferúlico Hidroxibenzald ehído Ácido hidroxibenzoíc o Ácido hidroxicinámic o Isoeugenol
Protocatecolato
Ácido vanílico Alcohol vanílico
Compuestos
Grupos funcionales de los compuestos aromáticos que se unen a CviR Anillo de lactona
Aminoácidos del regulador CviR que se unen a los grupos funcionales de los compuestos aromáticos Ser147, Trp103, Trp76, Phe118, Tyr72 y Asp89 Asp89 y Tyr80 Tyr80 y Asp89 Val67, Leu49 y Leu77
Amino: R-NH Ceto: R-C=O Cadena lateral Ciclopentano R-Br R-C=O R-C=CH2-Br R-CH2-OH R-C-O-CH3 Anillo aromático R-OH Anillo aromático Anillo aromático R-C=C-CH3 R-O-CH3 R-O-CH3 R-OH Anillo aromático R-C=O Anillo aromático R-OH COOH Anillo aromático
Trp103, Tyr80, Ile91, Asp89 y Tyr72 Trp76, Trp103 y Tyr72 Ser147 Tyr80, Leu77 y Leu49 Ser147 Tyr80, Trp76, Leu49 y Leu77 Trp103, Asp89 y Ile91 Tyr72 y Trp76 Trp103, Asp89, Ile91 y Ala122 Ile91, Asp89 y Tyr80 Ala122, Phe118, Trp103 y Phe107 Tyr80, Leu77 y Leu49 Trp103, Met127 y Trp76 Ser147 Asp89, Leu49 y Tyr72 Tyr72 y Ser147 Asp89, Trp103 y Ile91 Met127 Ser147 y Tyr72 Phe107, Trp103 y Asp89
R-OH Anillo aromático
Met127 Trp103, Ile91 y Asp189
Anillo aromático R-C=C-CH3 R-O-CH3 R-O Anillo aromático COOH Anillo aromático COOH R-O-CH3 R-CH2-OH R-O-CH3 Anillo aromático
Asp89, Ser147 y Tyr72 Trp103, Phe107, Phe118, Ala122 y Met127 Tyr80, Leu49, Leu77 y Tyr72 Ser147 Tyr80, Tyr72 y Asp89 Met127, Ala122, Phe118, Trp103 y Phe107 Ile91, Tyr72 y Asp89 Trp76 Leu77, Tyr80 y Leu49 Met127 Trp76, Leu77 y Tyr80 Trp103, Ile91, Asp89 y Tyr72
Análisis de los aminoácidos que conforman el dominio de unión al autoinductor-1 de CviR que se unen a los grupos funcionales de los compuestos aromáticos
aminoácidos fueron los más repetitivos en las visualizaciones de las interacciones receptorligando. Encontrando que, el aminoácido Trp103 de CviR formó enlaces con 9
En el análisis de las interacciones se observó
compuestos aromáticos (el catecol, el eugenol,
que de los 6 aminoácidos de CviR que se
el ácido ferúlico, 4-hidroxibenzaldehído, el
unieron al anillo de lactona de la C6-AHL, 3 26
Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
ácido
hidroxibenzoíco,
ácido
funcionales del autoinductor (el grupo acilo (R-
el
C=O), el anillo aromático) y los grupos
protocatecolato y el ácido vanílico). También se
funcionales encontrados en la estructura
identificó que el aminoácido Asp89 se unió a 9
química de los compuestos aromáticos como R-
compuestos aromáticos (el catecol, el eugenol,
OH, COOH, RC=C-CH3, RO-CH3, RO, R-
el ácido ferúlico, el 4-hidroxibenzaldehído, el
CH2-OH y el anillo aromático (Tabla 1).
ácido hidroxicinámico, el isoeugenol, el
Concluyendo
catecolato,
alcohol
mediante técnicas in silico que los compuestos
vainílico). Y también formaron interacciones
aromáticos probados en el presente estudio, en
con los inhibidores de QS (furanona C30 y
su mayoría pueden actuar como inhibidores del
vainillina). Por otro lado, se identificó que el
regulador transcripcional CviR de patógeno C.
aminoácido Tyr80 de CviR se unió a 5
violaceum.
compuestos
el
Los compuestos aromáticos analizados que
isoeugenol, el protocatecolato, el ácido vanílico
presentaron mayor energía libre de Gibbs y
y el alcohol vanílico) y a los inhibidores
cuyo efecto inhibitorio fue mayor se muestran
furanona C30 y vainillina.
en la figura 2. Donde se observan los modelos
Se observó que el aminoácido Leu49 de CviR
de lazos y listones resultantes del acoplamiento
se unió a 4 compuestos aromáticos (el eugenol,
molecular de cada interacción con CviR. En la
el ácido ferúlico, el isoeugenol y el ácido
figura 2A y 2B se observan los enlaces
vanílico) y los inhibidores furanona C30 y
formados entre el complejo CviR y su ligando
vainillina. Y finalmente, el aminoácido Leu77
natural C6-AHL. Y complejos formados por
de CviR se unió a 4 compuestos aromáticos (el
CviR-furanona C30 (figura 2C y 2D) y CviR-
eugenol, el isoeugenol, el ácido vanílico y el
vainillina (figura 2E y 3FC).
alcohol vanílico). Entendiendo que los 5
También, se representaron los compuestos
aminoácidos resultantes de este estudio son los
aromáticos que mostraron mayor energía libre
aminoácidos clave implicados en el mecanismo
de Gibbs con el dominio de unión al
de inhibición del QS por competencia,
autoinductor-1 del regulador transcripcional
formando diferentes enlaces con el dominio de
CviR
unión
regulador
isoeugenol (figuras 3A-B, 3C-D y 3E-F) luego
transcripcional de QS (CviR). Las interacciones
de someterlos a un tamiz in silico de
se llevaron a cabo con varios grupos
acoplamiento molecular
hidroxicinámico,
del
ácido
el
el isoeugenol,
vanílico
aromáticos
(el
autoinductor-1
y
el
eugenol,
del
27 Artículo original
como:
que
fue
ácido
posible
ferúlico,
verificar
eugenol
e
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
Figura 2. Modelo de lazos y listones del acoplamiento molecular de los inhibidores de QS con mayor energía libre de Gibbs (-ΔG) y visualización de los enlaces formados en cada interacción. (A) el ligando natural C6-AHL y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (C) la furanona C30 y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (E) la vainillina y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR. Y los diagramas de interacción proteína-ligando que resume los enlaces formados entre de (B) el ligando natural C6AHL y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (D) la furanona C30 y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (F) la vainillina y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR. Los resultados fueron visualizados en los programas Pymol y Discovery studio 2020.
28 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
Figura 3. Modelo de lazos y listones del acoplamiento molecular de los inhibidores de QS con mayor energía libre de Gibbs (-ΔG) y visualización de los enlaces formados en cada interacción. (A) el ácido ferúlico y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (C) el eugenol y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (E) el isoeugenol y el dominio de unión a las AHLS del regulador transcripcional CviR. Y los diagramas de interacción proteína-ligando que resume los enlaces formados entre de (B) el ácido ferúlico y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (D) el eugenol y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (F) el isoeugenol y el dominio de unión a las AHLS del regulador transcripcional CviR. Los resultados fueron visualizados en los programas Pymol y Discovery studio 2020.
29 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
También se representaron los compuestos
CviR tales como: 4-hidroxibenzaldehído y
aromáticos que mostraron mayor energía libre
ácido hidroxicinámico (figuras 4A-B y 4C-D)
de Gibbs con el dominio de unión al
luego de someterlos al tamiz por medio del
autoinductor-1 del regulador transcripcional
análisis in silico por acoplamiento molecular.
Figura 4. Modelo de lazos y listones del acoplamiento molecular de los inhibidores de QS con mayor energía libre de Gibbs (-ΔG) y visualización de los enlaces formados en cada interacción. (A) el ácido hidroxicinámico y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (C) el 4hidroxibenzaldehído y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR. Y los diagramas de interacción proteína-ligando que resume los enlaces formados por (B) el ácido hidroxicinámico y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR, (D) el 4hidroxibenzaldehído y el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR.
30 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
Papel biológico aromáticos
de
los
interacción de la nube de electrones π en cada
compuestos
uno de los 11 grupos aromáticos que se unen al
Inicialmente, se describieron las interacciones
grupo alquilo de los aminoácidos de CviR como
del ligando natural C6-AHL con el regulador
la leucina, isoleucina, metionina y alanina
transcripcional de QS conocido como CviR, el
(Tabla 2).
cual activa positivamente procesos bacterianos Enlace por puente de hidrógeno
por lo tanto su papel biológico es como un o
Estos enlaces se formaron entre 7 compuestos
agónico. Por otro lado, se describió la función
aromáticos y los aminoácidos ubicados en la
antagónica de la furanona, la vainillina, el ácido
cavidad formada por el sitio de unión al
ferúlico, el eugenol, el isoeugenol, el 4-
autorinductor-1 del regulador transcripcional
hidroxibenzaldehído, el ácido hidroxicinámico,
CviR de C. violaceum.cuyo carácter es polar
el catecol, el ácido hidroxibenzoíco, el alcohol
hidrofóbico (Ser, Thr, Tyr y Asp) y los
vanílico, el protocatecolato y el ácido vanílico.
aminoácidos que tienen una cadena lateral R
Todos estos compuestos aromáticos presentan
neutral (Met127 y Trp76).
regulador
transcripcional
positivo
QS
un mecanismo antagónico de unión al regulador
Enlace π-anión
transcripcional CviR por competencia con el Se identificaron en todos los compuestos
ligando natural C6-AHL en el dominio de unión
aromáticos uniéndose al aminoácido Asp89. El
al autoinductor-1. A su vez todos estos
enlace se formó entre el anillo aromático de los
compuestos formaron diferentes interacciones
compuestos aromáticos y el grupo carboxilo (-
con los aminoácidos que se encuentran en el
COOH) del aminoácido Asp89. Ubicando en la
dominio de unión al autoinductor-1 y se
cavidad formada por el sitio de unión al
caracterizaron porque fueron interacciones no covalentes (enlace π-álcali, enlace por puente
autorinductor-1 del regulador transcripcional
de hidrógeno, enlace π-anión, enlace π en forma
CviR de C. violaceum. Las excepciones fueron
de T, enlace del hidrógeno con el enlace π y las
la C6-AHL y la furanona C30 que no poseen anillo aromático en su estructura química
fuerzas de Van der Waals), las cuales a
(Tabla 3).
continuación se describen.
Enlace π en forma de T
Enlace π-álcali
La unión se observó en 8 compuestos
Este tipo de unión se caracteriza porque hay una
aromáticos (Tabla 2), el enlace se basa en la 31 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
interacción de la nube de pi-electrones y dos
medio de enlaces de hidrogeno para dar forma
grupos aromáticos, pero en forma de T. Es
a la cavidad que conforma el sitio de unión de
decir, una nube de electrones lateral del anillo
CviR. Mientras que, se observó que los
aromático de los compuestos aromáticos y la
aminoácidos Met y Tyr contienen grupos
nube de electrones de los anillos aromáticos de
funcionales polares con cierto grado de
los aminoácidos aromáticos como Trp103 y
hidrofobicidad, lo cual hace que las fuerzas de
Tyr80, lo cual modificó el plegamiento original
Van der Waals estén presentes en la cavidad del
del regulador transcripcional CviR de C.
regulador CviR.
violaceum.
Además, se percibió que los compuestos aromáticos como el ácido ferúlico, el ácido
Enlace del hidrógeno con el enlace π
hidroxibenzoíco y el ácido vanílico presentaban Se observo en 7 compuestos aromáticos (la
4, 5 y 5 aminoácidos, respectivamente y eran
vainillina, el ácido ferúlico, el eugenol, el isoeugenol,
el
alcohol
vanílico,
parecidos a los que se unen a la molécula C6-
el
AHL de CviR. Sin embargo, la mayoría de los
protocatecolato y el ácido vanílico) incluyendo
compuestos
a C6-AHL, la unión fue por medio del
aromáticos
presentaron
un
mecanismo de unión diferente al dominio de
aminoácido Tyr72 del regulador transcripcional
unión al autoinductor-1 de CviR. Solo se
CviR (Tabla 2).
observó similitud en los aminoácidos que formaron las fuerzas de Van der Waals en los
Fuerzas de Van der Waals
compuestos aromáticos ácido vanílico y la Son descritas como fuerzas residuales, de
vainillina.
atracción o repulsión entre moléculas o grupos La tabla 2 resume el papel biológico de cada
atómicos. En los resultados del análisis de
compuesto aromático analizado en el presente
imágenes se representan las interacciones
estudio,
proteína-ligando y se apreciaron 9 aminoácidos
los
enlaces
formados
por
los
compuestos aromáticos y los aminoácidos
que se unen a C6-AHL (Tabla 2).
ubicados Las fuerzas de Van der Waals fueron
en
el
dominio
de
unión
al
autoinductor-1 de CviR como: los enlaces π-
representadas por los aminoácidos hidrofóbicos
álcali, el enlace por puente de hidrogeno, el
(Ala, Val, Leu, Ile y Phe) que tienen la
enlace π-anión, el enlace π en forma de T, la
capacidad de interactuar con los grupos
unión del hidrogeno con el enlace π y las
funcionales de C6-AHL y los inhibidores por
fuerzas de Van der Waals. 32
Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
Tabla 2. Datos experimentales obtenidos mediante el análisis in silico de los aminoácidos ubicados en el dominio de unión al autoinductor-1 del regulador transcripcional CviR y los grupos funcionales de los inhibidores de QS. Compuesto/ PubChem CID
Mecanismo de unión
Papel biológico In vitro con CviR
Enlace π- álcali
Enlace por puente de hidrogeno
Enlace π-anión
Enlace π en forma de T
Unión del H con enlace π
C6-AHL, el ligando natural de CviR (119133)
Ligando naturala
Agonista
Leu49, Trp76 Leu77, Val77, Trp103 y Phe118
Tyr80, Asp89 y Ser147
-
-
Tyr72
Furanona, un inhibidor de QS (140765)
Competitivob
Antagonista
Leu49, Tyr72, Trp76, Leu77, Tyr80 y Trp103
Ser147
-
-
-
Vainillina, un inhibidor de QS (1183)
Competitivoc
Antagonista
Leu49, Trp76, Leu77, Tyr80 y Ile91
Tyr72
Asp89
Trp103
Tyr72
Ácido ferúlico (445858)
Competitivo
Antagonista
Leu49, Trp76, Trp103 y Met127
Ser147
Asp89
-
Tyr72
Eugenol (3314)
Competitivo
Antagonista
-
Asp89
Tyr80
Tyr72
Isoeugenol (853433)
Competitivo
Antagonista
-
Asp89
-
Tyr72
4-hidroxibenzaldehído (126)
Competitivo
Antagonista
Ile91
Tyr72, Met127 y Ser147
Asp89
Trp103
-
Ácido hidroxicinámico (637542)
Competitivo
Antagonista
Ile91
-
Asp89
Trp103
-
Leu49, Leu77, Ile91, Trp103, Phe107, Ala122, Phe118 y Met127 Leu49, Leu77, Tyr80, Ile91, Trp103, Phe107, Phe118 y Ala122
Catecol (289)
Competitivo
Antagonista
Ile91 y Ala122
Tyr72 y Trp76
Asp89
Trp103
-
Ácido hidroxibenzoíco (135)
competitivo
Antagonista
Ile91
-
Asp89
Trp103
-
Alcohol vanílico (62348)
Competitivo
Antagonista
Trp76, Leu77, Tyr80 y Ile91
Met127
Asp89
Trp103
Tyr72
Protocatecolato (72)
Competitivo
Antagonista
Trp103, Phe107, Phe118 y Ala122
Ser147
Asp89
Tyr80
Tyr72
Ácido vanílico (8468)
Competitivo
Antagonista
Leu49, Leu77 Tyr80 y Ile91
Trp76
Asp89
-
Tyr72
Fuerzas de Van der Waals Leu64, Met81, Ile91, Leu92, Phe107, Ala122, Met127, Thr132, y Ile145 Asp89, Ile91, Leu92, Phe118, Met127 y Ile145 Leu92, Phe107, Phe118, Ala122, Met127, Thr132 y Ile145 Leu64, Val67, Leu77, Tyr80, Met81, Ile91, Phe118, Ala122, Thr132 y Ile145 Trp76, Leu92, Thr132, Ile145 y Ser174 Trp76, Leu92, Met127, Thr132, Ile145 y Ser147 Leu49, Trp76, Tyr80, Phe107, Phe118, Ala122 y Ile145 Tyr80, Phe107, Phe118 y Met127 Leu49, Tyr72, Trp76, Leu77, Tyr80, Leu92, Phe107, Phe118, Ala122, Met127, Ile145 y Ser147 Leu49, Leu92, Ala122, Phe118, Thr132, Ile145 y Ser147 Leu49, Trp76, Ile91, Thr132, Ile145, Thr191 y Leu192 Leu92, Trp103, Phe107, Phe118, Ala122, Met127, Thr132, Ile145, Ser147 y Ala149
a, b y c
Estudios previos de ligandos e inhibidores de QS [43, 28, 16, 40]. Las visualizaciones de las interacciones ligando-proteína se analizaron utilizando el programa PyMol y se dibujaron con el programa Discovery studio 2020. Análisis preclínico in silico de los inhibidores de QS
debido a que por medio de programas es posible
Estudios de LD50 en ratón
ciertas sustancias antes de comenzar con los
Los estudios en ratón son conocidos como
experimentos en células humanas. En el
ensayos preclínicos y son de importancia,
presente estudio se hizo una predicción de los
conocer la concentración a la cual son dañinas
33 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
valores cercanos de LD50 en ratón expresada en
Además, son altamente absorbidos por el
mg/kg de los 5 mejores compuestos aromáticos
intestino grueso (IG) y en el BBB. Asimismo,
resultantes
se
del
análisis
de
acoplamiento
obtuvieron
resultados
negativos
de
molecular. De los cuales se obtuvieron los
inhibición de la glicoproteína-P (P-gp) de cada
valores más altos de energía libre de Gibbs,
inhibidor. Mientras que se obtuvieron algunos
además del análisis del inhibidor furanona C30
valores positivos de inhibición de la isoenzima
y la vainillina. Los resultados obtenidos de
citocromo P450 CYP1A2 por los inhibidores
LD50 administrada oralmente en ratón (mg/kg)
eugenol e isoeugenol. Pero en general se
se resumen en la tabla 3. Observado, que en
observó que los 5 inhibidores alcanzaron
general los valores de LD50 se encontraban por
valores aceptables de CYP. Observando que los
debajo de 5000 mg/kg, indicando que no
inhibidores en general no son dañinos para el
existen efecto tóxico de los compuestos
hígado humano de acuerdo con los resultados
analizados.
ADME y toxicológicos. Y finalmente, el valor de la permeabilidad en la piel de cada
Tabla 3. Valores de LD50 obtenidos en el programa T.E.S.T por 3 métodos QSAR
componente vario de -6.41 a -5.14 cm/s en los 5 compuestos investigados (Tabla 4).
Componente
LD50 en ratón (mg/kg)
R2
Furanona C30 Vainillina
1373±385.18 1929.62±12.30
0.80 0.97
Ácido ferúlico
4750.11±320.13
0.90
Ácido hidroxicinámico
2838.02±82.01
0.89
Eugenol
1879.02±54.97
0.99
4-hidroxibenzaldehído
1903±487.96
0.82
inhibidores del QS de C. violaceum, por medio
Isoeugenol
2553.55±432.89
1.00
de un tamiz de selección basado en la energía
DISCUSIÓN En el presente estudio se encontraron varios
libre de Gibbs obtenida por acoplamiento Estudios de farmacocinética
molecular.
Los
compuestos
aromáticos
De acuerdo con el análisis de predicción de
propuestos en el presente estudio son aceites
absorción gastrointestinal humana se encontró
esenciales (como el eugenol e isoeugenol),
que todos los 5 mejores inhibidores presentaron
sustratos y productos de la bioconversión
propiedades fisicoquímicas similares. Debido a
microbiana (el catecol, el protocatecolato, el
que en su mayoría son compuestos insaturados
ácido ferúlico, el ácido vanílico, la vainillina y
de acuerdo con los diagramas de radar que
el alcohol vanílico) [23, 49]. Además, se
fueron encontrados en la base de datos del
tomaron
programa SwissADME (datos no mostrados).
aromáticos que participan en la vía de 34
Artículo original
en
cuenta
algunos
compuestos
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
degradación
beta-ceto-adipato
como
4-
procesos relacionados con la virulencia que a su
ácido
p-
vez son regulados por el QS como: la actividad
hidroxibenzoíco. Que en conjunto todos estos
exoproteasa, la agregación, la formación de
compuestos aromáticos son reportados como
biopelícula, el swarming, la tolerancia al estrés
seguros para su consumo y la salud humana por
por H2O2 y la utilización de diferentes fuentes
la FDA (Administración de drogas y alimentos,
de nitrógeno [12]. También, se han publicado
por sus siglas en inglés) [48, 50, 51]. Además,
casi 200 artículos que utilizan al biosensor C.
se conoce que los compuestos aromáticos
violaceum cepa CV026 como indicador de la
seleccionados
presencia
hidroxibenzaldehído
propiedades
poseen
el
efectos
bioactivas,
antioxidantes, antiviral,
y
protectores,
anticancerígenas,
antiinflamatorias,
actividad
moléculas
autoinductoras
producidas por bacterias Gram-negativas. Y
actividad
antibacteriana
de
para probar mediante experimentación in vitro
y
e in silico un sin fin de inhibidores de QS de
propiedades inhibitorias de QS en algunos
distinto origen (vegetal, sintético, extractos
microorganismos Gram-negativos [24, 28, 52-
naturales, hierbas, aceites esenciales, especias,
55].
fitoquímicos y de algunos cultivos) mediante
Por otro lado, se sabe que C. violaceum tiene
escrutinios muy laboriosos [30, 31].
Tabla 4. Propiedades farmacocinéticas de los inhibidores de QS Modelo
Furanona C30
Vainillina
Ácido ferúlico
Ácido hidroxicinámico
Eugenol
4-hidroxi benzaldehído
Isoeugenol
Absorción por el IG
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Permeación BBB
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Sustrato de la glicoproteína-P (gp-P)
No
No
No
No
No
No
No
Inhibidor de CYP1A2
No
No
No
No
Si
No
Si
Inhibidor de CYP2C19
No
No
No
No
No
No
No
Inhibidor de CYP2C9
No
No
No
No
No
No
No
Inhibidor de CYP2D6
No
No
No
No
No
No
No
Inhibidor de CYP3A4
No
No
No
No
No
No
No
Permeación en la piel (cm/s)
-6.71
-6.37
-6.41
-6.26
-5.69
-6.09
-5.14
35 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
También, la información reportada sobre las
estudios reportan 4 aminoácidos diferentes
estructuras
(Met89,
cristalina
de
la
familia
de
Leu72,
Arg74
y
Asn77),
que
reguladores transcripcionales LuxR y sus
interactúan con las moléculas autoinductoras
homólogos ha permitido descubrir una gran
C6-AHL y C10-AHL [42]. Estos reportes fueron
variedad de antagonistas. Sin embargo, esta
comparados con los aminoácidos encontrados
información no es suficiente, porque es
en el presente estudio in silico, observando la
necesario conocer cómo se produce el cambio
unión de diferentes aminoácidos del regulador
conformacional o plegamiento del dominio de
CviR con los principales grupos funcionales de
unión al autoindutor-1, para distinguir entre un
los compuestos aromáticos probados. Por lo
"ligando natural" (agonista) y "ligando falso"
tanto, el presente estudio reveló el tipo de
(antagonista). Por lo que, las estructuras
aminoácidos que se unen a los compuestos
cristalinas de la interacción LuxR-AHL se
aromáticos con el dominio de unión al
encuentran disponibles para algunas especies
autoindutor-1 del regulador transcripcional
bacterianas, pero es de interés obtener más
CviR del patógeno C. violaceum. Encontrando
datos in vitro e in silico de las estructuras
que los aminoácidos se unen por medio de
cristalinas de la unión de los reguladores
uniones fuertes, mayores a las reportadas por el
transcripcionales de QS con su ligando natural
inhibidor furanona C30, cuyo efecto inhibitorio
y algunos antagonistas [56, 57, 58].
al igual que los compuestos aromáticos del presente escrutinio han sido observados en
A pesar de que no existen muchos estudios
varios procesos relacionados con la inhibición
descriptivos in silico sobre los aminoácidos que
del QS en el patógeno C. violaceum y otros
forman parte del dominio de unión del
modelos bacterianos Gram-negativos [24, 28,
autoinductor-1 que interactúen con inhibidores
29, 60].
del del regulador transcripcional CviR de C. violaceum. Se han reportado algunos estudios
El presente estudio fue de importancia para
comparativos de acoplamiento molecular,
comprender los mecanismos de inhibición in
describiendo a los aminoácidos que se unen al
silico del QS, basado en la competencia o
dominio de unión al autoinductor-1 en el
antagonismo con el ligando natural del dominio
regulador transcripcional CviR. Observando
de unión al autoindutor-1 del regulador
que los aminoácidos clave en la unión al
transcripcional CviR, lo cual ha sido observado
regulador transcripcional son Trp84, Asp97,
en otros estudios que han considerado
Ser155, Tyr80, Tyr88 y Leu100 [59, 58]. Otros
homólogos de LuxR en otros modelos 36
Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
bacterianos. Describiendo la inactivación de la
Efecto inhibitorio de los compuestos aromáticos con los valores más altos de energía libre de Gibbs
transcripción de los genes de virulencia regulados por QS [57]. A su vez, se ha demostrado que algunos compuestos naturales
Se han encontrado pocos casos en donde la
se comportan como antagonistas del QS, como
vainillina favorece la producción de la
la acil-furanona halogenada obtenida del alga
biopelícula, sugiriendo que estos compuestos
marina Delisea pulchra. Este compuesto
estimulan el sistema QS bacteriano [62].
natural puede desplazar a la señal autoinductora
En la mayoría de los casos se reporta que la
3-oxo-C6-AHL del regulador LuxR afín,
vainillina puede inhibir algunos procesos
inhibiendo de este modo la expresión génica
bacterianos regulados por el QS de C.
mediada por la detección del autoinductor-1
violaceum. Por ejemplo, se ha descrito en la
[56, 57]. El mecanismo molecular in silico de
inhibición de la formación de biopelículas, que
inhibición de la furanona C30 fue también
son un problema persistente en la industria del
dislumbrado en el presente estudio mediante el
procesamiento de alimentos y de tratamiento de
acoplamiento molecular. Encontrando varios aminoácidos
que
se
unen
al
agua residual. Por lo que, la inhibición del QS
regulador
en C. violaceum en las concentraciones
transcripcional CviR, lo cual sugiere un
adecuadas puede disminuir la formación de las
mecanismo de inhibición competitiva por el
biopelículas bacterianas. Y, por lo tanto,
dominio de unión al autoinductor-1, siendo un
retrasar el deterioro y aumentar la seguridad de
aporte importante del presente estudio el cual
la producción de ciertos alimentos [63]. Otros
fue parecido a las conclusiones de otros trabajos
reportes, mencionan que la vainillina tiene una
[16]. En otros reportes de acoplamiento
importante utilidad en la prevención de la
molecular se describieron los principales
bioincrustación bacteriana en membranas que
residuos aminoacídicos de las proteínas del tipo
se utilizan en la limpieza de aguas residuales
LuxR que se unen al inhibidor furanona,
[40, 29, 64]. También, se reporta el uso de la
encontrando 5 aminoácidos clave (Tyr63,
vainillina como antibacteriano y se ha
Trp67, Tyr71, Asp80 y Ser134) [61]. Los cuales
observado inhibe la síntesis del autoinductor-1
fueron comúnmente encontrados en el análisis
(AHL), mostrando una inhibición significativa
de los enlaces formados con los compuestos
en las moléculas AHL de cadena corta y larga
aromáticos del presente estudio.
(C4-AHL (69%) y 3-Oxo-C8-AHL (59.8%)) en bacterias Gram-negativas sin reportar estudios 37 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
de interacción por acoplamiento molecular [28,
violaceum cepa CV12472 con una MIC50 de
40, 65]. Por otro lado, en el presente estudio se
1000 µg/mL [64]. Disminuyendo la producción
logró observar un mecanismo in silico de
de la violaceína, modulando la actividad y la
inhibición competitiva con el regulador CviR
síntesis del autoinductor-1 interfiriendo con los
de QS por medio de la unión de los grupos
procesos regulados por el par de proteínas
funcionales de la vainillina que compiten por el
CviI/CviR del sistema QS del modelo biosensor
dominio de unión al autoinductor-1. Lo cual fue
[67-69]. A su vez, se reporta que el ácido
comparable con los estudios de Pal y cols., 2020
ferúlico reduce un 72% de la producción del
que comprobaron mediante experimentos in
pigmento violaceína de C. violaceum, en
silico la habilidad de la vainillina como
comparación con otros compuestos fenólicos.
inhibidor del QS, observando la interacción de
Y su efecto es comparable con la furanona,
la vainillina con ciertos aminoácidos del
reduciendo el 79% de la producción del
regulador transcripcional homólogo a LuxR.
pigmento, resultando un buen prospecto como
Estos resultados fueron validados en 2 bacterias
un inhibidor del QS [70]. Finalmente, se reportó
Gram-negativas, pero se observó que el modo
la disminución de la transcripción de algunos
de acción fue por medio de la unión de 2
procesos bacterianos que son regulados por
aminoácidos clave (Thr131 y Ilu214) de los
proteínas homólogas a LuxR en bacterias
reguladores transcripcionales de QS (LuxR y
Gram-negativas. Pero a la fecha, no se reportan
LsrR, respectivamente) [41].
estudios de acoplamiento molecular para comprender a mayor detalle las interacciones
En resumen, en la mayoría de los reportes
con los residuos aminoacídicos del dominio de
encontrados a la fecha, no se describen estudios
unión
de acoplamiento molecular cuya utilidad es
al
autoindutor-1
del
regulador
transcripcional de QS [24].
comprender el mecanismo de unión de la vainillina
y
el
dominio
de
unión
al
Con respecto al eugenol e isoeugenol, ambos
autoinductor-1 del regulador transcripcional
compuestos aromáticos son aceites esenciales
CviR [24, 64].
obtenidos del aceite del clavo, el cual ha sido probado como un antimicrobiano en bacterias
Por otro lado, se ha observado que el ácido
Gram-positivas y Gram-negativas, que en
ferúlico, un compuesto obtenido a partir de
muchos de los casos son multirresistentes y
extracto metanoico de ciertos aceites esenciales
patógenos oportunistas [71]. Se ha observado
puede inhibir el mecanismo de QS de C.
que al adicionar el isoeugenol en cultivos 38
Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
bacterianos se ha disminuido la producción de
homólogo a LuxR y se reportó efecto
algunos procesos bacterianos relacionados con
inhibitorio mediante experimentación in vitro
la virulencia como: la biopelícula, los genes
[60].
relacionados como el curli (cgsABDFG), los El ácido hidroxicinámico y sus derivados son
genes de la fimbria (fimCDH) y la producción
en general poco polares, poseen una cadena
de toxinas (espD, escJ y escR) [26, 72, 73]. A
lateral con el grupo poliprenoide, lo cual facilita
su vez, se ha observado que la mínima
el transporte a través de la membrana celular
concentración inhibitoria del QS o MQSIC del isoeugenol (0.062 mg
bacteriana [67, 74]. De este compuesto, se ha
mL-1), inhibe la
observado actividad antimicrobiana en algunas
producción de la violaceína de C. violaceum,
bacterias Gram-positivas (MIC50=20 μg mL−1)
sin embargo, no se reportan estudios in silico
y Gram-negativas (MIC50 en rangos de 10-80
que describan la interacción del isoeugenol y el
μg mL−1) [75]. Por otro lado, se sabe que
regulador transcripcional CviR [71]. Por otro
algunas
lado, se reporta el efecto sinérgico del eugenol y el carvacol al inhibir procesos regulados por el QS, como ejemplo; las enzimas degradadoras
bacterias
como
solonacearum
presentan
resistencia
ácido
al
Ralstonia
mecanismos
de
hidroxicinámico
(el
principal componente de la pared celular de las
de la pared celular (PCWDEs), la producción de
plantas) [76]. También, se ha identificado el
biopelícula y los genes homólogos al par de
ácido hidroxicinámico a partir de extractos de
proteínas homologas a LuxI/LuxR [60]. Por
miel, con efecto inhibitorio en la producción de
otro lado, en Pectobacterium se encontró un
la violaceína inactivando los genes encargados
estudio de acoplamiento molecular del eugenol
de la síntesis del pigmento (vioA, vioD y vioE),
y el regulador transcripcional homólogo a
sin reportar estudios de interacción por
LuxR. Obteniendo valores de energía libre de
acoplamiento molecular para comparar con el
Gibbs de -6.2 kcal/mol, un valor muy similar al
presente estudio [77, 78].
del presente estudio, siendo superiores a los valores obtenidos de la furanona C30 obtenido
Además, en el presente estudio se demostró que
por Joshi y cols., 2016 cuyos resultados fueron
el p-hidroxibenzaldehído puede inhibir el QS de
comparables
estudio.
C. violaceum por medio de un mecanismo
Considerando, que la furanona presentó un
antagonista con el regulador transcripcional
valor bajo de energía libre de Gibbs al estudiar
CviR alcanzando una energía libre de Gibbs
su interacción in silico con el regulador
alta, mayor a la de los inhibidores de QS
con
el
presente
39 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
furanona y vainillina. Estos estudios son
bacteriano de 6 UFC/cm2, reduciendo un 26-
concordantes con los de Bucio-Cano y cols.,
51% la adherencia a los catéteres y se ha
2015 encontrando mediante experimentación in
apreciado que puede tener efecto sinérgico con
vitro por acoplamiento molecular que el
otros
compuesto aromático es afín al dominio de
disminución de la adherencia a ciertas
unión
superficies, sugiriendo al ácido vanílico como
del
autorinductor-1
del
regulador
componentes
de Gibbs. Además de las observaciones de
catéteres [80]. También, se han encontrado
Choo y cols., 2006 que ayudaron a demostrar
estudios
que el extracto de las vainas de vainilla puede
antimicrobianas del ácido vanílico en Gram-
inhibir el QS de C. violaceum, resaltando que el
negativas,
4‐hidroxibenzaldehído forma parte del extracto
bacteriano, actuando como bactericida a ciertas
de las vainas de vainilla y se observó que este
concentraciones (1.5 mg/ml), aumentando la
microorganismo
permeabilidad de las células hasta 3 veces su
resistencia
al
compuesto aromático [28, 79].
confirman
reduciendo
las
el
para
la
un
que
antimicrobiano
en
transcripcional CviR con una alta energía libre
presentó
tratamiento
aromáticos
los
propiedades
crecimiento
valor original e inhibiendo la expresión de los genes de virulencia (hilD, invH, prgH, prgK y
Finalmente, para los compuestos aromáticos protocatecolato, hidroxibenzoíco,
catecol, alcohol
sipA) que son regulados por QS [81].
ácido
Finalmente, se probó el efecto en C. violaceum
vanílico,
CV026 del ácido vanílico con una MIC de
protocatecolato y el 4-hidroxibenzaldehído
0.062 mg/ml inhibiendo la producción de
cuyos valores de energía libre de Gibbs fueron
violaceína sin reportar estudios de interacción
bajos, no se reportan estudios de inhibición de
in silico de acoplamiento molecular [71]. A
QS y acoplamiento molecular. Pero se reportan
continuación, en la figura 5 se muestra un
estudios descriptivos del ácido vanílico sobre la
modelo representativo del mecanismo de
inhibición de QS. Este último compuesto
inhibición de QS de C. violaceum. Resumiendo,
aromático inhibe el proceso de adhesión de algunas
bacterias
Gram-negativas
a
el efecto de los compuestos aromáticos (el
los
ácido ferúlico, el eugenol, el isoeugenol, el 4-
catéteres hechos a base de silicona así como el
hidroxibenzaldehído
swarming y el swiming. Observando que, las
y
el
ácido
hidroxicinámico) en la inhibición del QS de C.
dosis empleadas del compuesto aromático no
violaceum como la producción de violaceína y
son letales, obteniendo un máximo crecimiento
algunos genes de virulencia. 40
Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
Figura 5. Mecanismo de inhibición del QS de C. violaceum por los compuestos aromáticos ácido ferúlico, eugenol, isoeugenol, 4-hidroxibenzaldehído y ácido hidroxicinámico. Imagen adaptada del KEGG, 2020 y la información reportada por [24, 28, 70, 71, 77-79, 82].
Enlaces no covalentes formados durante los acoplamientos de los inhibidores con CviR
También, se asemejo el aminoácido Tyr, que se
Las interacciones observadas en el presente
conforma la AHL. Y el grupo acilo presente en
estudio demostraron que el aminoácido Trp del
la cadena lateral de la AHL que se unió a los
regulador transcripcional CviR se une al anillo
aminoácidos Ser y Tyr del dominio de unión a
de lactona del autoinductor-1. Lo cual es de
las AHLS en el regulador transcripcional CviR
importancia debido a que en los residuos
[43]. Con respecto a los enlaces π se mostraron
polares del extremo N terminal incluyen 3
coincidencias con el aminoácido Leu del
triptófanos conservados (Trp), que tienen
dominio de unión a las AHLS en el regulador
contacto con una fracción de la AHL, lo cual
transcripcional CviR [43].
unió al ácido graso la cadena lateral que
define su orientación en el sitio de unión de
Mientras que, las interacciones hidrofóbicas
CviR [83]. Por otro lado, se observó semejanza
entre la cadena lateral de la AHL y los residuos
con el aminoácido Asp de CviR, el cual se une
de aminoacídicos dentro de la cavidad de unión
al grupo amino de la molécula C6-AHL. 41 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
a la AHL sugieren que las interacciones en esos
ya que se obtuvieron diferentes aminoácidos, lo
sitios están dominadas por las fuerzas de Van
cual se atribuye al acomodo de cada molécula
der Waals [84]. Estas últimas interacciones son
en el sitio de unión de CviR [85]. Estas
consideran fuerzas de atracción o repulsión
diferencias se deben también a que no todos los
débiles entre moléculas o grupos atómicos que
aminoácidos son conservados en las proteínas
no son el resultado de enlaces covalentes o
del tipo LuxR de acuerdo con las secuencias
interacciones electrostáticas entre iones o
[86].
grupos iónicos. Observando que los residuos de
Por otro lado, se describen estudios de
aminoácidos que conforman la unión a la
acoplamiento molecular de la furanona C30 y
cadena de acilo de la AHL están menos
los reguladores LuxR homólogos. Donde se
conservados, lo cual fue comparable y
describe que esta molécula perdió la capacidad
observado en el presente estudio. Además, se
de unirse a los mismos aminoácidos que se unen
sabe que las moléculas autoinductoras pueden
a las AHL (como se observó en el presente
ocupar
el
estudio). Debido a que hay diferencias entre los
dominio de unión al autoindutor-1 de los
grupos funcionales y estructura química de la
reguladores del tipo LuxR. Por ejemplo, las
furanona C30, lo cual inestabiliza al regulador
AHL cortas se extienden y apuntan hacia el
transcripcional del tipo LuxR y es la razón por
disolvente, mientras que las cadenas largas se
la cual se observa la inhibición del QS en
doblan y miran hacia al interior del sitio de
distintos modelos bacterianos Gram-negativos
unión. Aparentemente, las proteínas LuxR
[87]. Mientras que no se reportan estudios
utilizan
detallados sobre compuestos aromáticos y el
diferentes
una
configuraciones
combinación
en
variada
de
aminoácidos que brindan cierta flexibilidad en
acoplamiento
la cavidad que forma el sitio de unión al ligando
describan las interacciones por puente de
para lograr la especificidad de unión a las AHL
hidrogeno, enlaces π y Van der Waals.
molecular
con
CviR,
que
como se observó en el presente estudio [83]. Se sabe que los principales aminoácidos ubicados
Toxicidad en ratón (LD50)
en el dominio de unión al autoindutor-1 del
Los resultados obtenidos de toxicidad en ratón
regulador transcripcional homológo a LuxR y
demostraron que los compuestos aromáticos
se unen al autoinductor son 6 (Trp57, Tyr61,
poseen
Asp70, Pro71, Trp85 y Gly113). Estos datos no
correspondiendo a una toxicidad de categoría 3,
fueron tan comparables con el presente estudio
lo cual puede ser interpretado como una 42
Artículo original
valores
de
LD50<5000
mg/kg
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
toxicidad ligera [88]. Por otro lado, se encontró
compuestos que son sustrato o no de la
en la literatura que el eugenol y el ácido
glicoproteína P-gp, un miembro de la familia de
hidroxicinámico mostraron un valor de LD50
transportadores de unión al ATP del tipo ABC.
similar al experimental (1929.42/2850 mg/kg,
Que son clave para evaluar el flujo de salida de
respectivamente) además de una baja toxicidad
los fármacos por medio de membranas
[75, 51]. Mientras que, los estudios de Talapatra
biológicas como las que conforman las vías
y Sarkar, 2015 reportaron una LD50 parecida a
gastrointestinales y el sistema nervioso central
la obtenida en el presente estudio [89]. Además,
[44].
de los valores experimentales obtenidos por por La enzima citocromo P450 (CYP) y sus isómeros
Salau y cols., 2019 para ácido ferúlico fueron mayores (1772 mg/kg) a los del presente
El estudio de la interacción de los compuestos
estudio con una toxicidad moderada [90]. Finalmente,
los
valores
reportados
aromáticos con los citocromos P450 (CYP) y
para
sus isómeros son de importancia ya que son una
isoeugenol y vainillina fueron un poco
superfamilia de isoenzimas clave en la
superiores a los obtenidos experimentalmente
eliminación de fármacos por medio de la
(1560 y 1578.70 mg/kg, respectivamente)
biotransformación metabólica. Se ha sugerido
indicando que los compuestos aromáticos
que las enzimas CYP y la proteína P-gp pueden
pueden ser empleados en dosis similares a las
ayudar a metabolizar pequeñas moléculas
encontradas en el presente estudio [51, 91].
sinérgicamente, para mejorar la protección de tejidos y órganos en los seres humanos.
Valores ADME
Además, se reporta que algunas moléculas
En el ámbito farmacéutico, el uso de Machine
terapéuticas existentes son sustrato de las cinco
Learning (ML) es apreciado debido a que se
principales isoformas de CYP. Por lo que, la
pueden predecir propiedades de las moléculas o
inhibición de estas isoenzimas es uno de los
fármacos para conocer propiedades como: la
principales parámetros relacionados con la
tasa de absorción, el metabolismo y la
reactividad de los grupos funcionales de las
excreción, estos parámetros son conocidos
moléculas, describiendo los efectos en células
como ADME. Además, de que se puede conocer
la
toxicidad,
del hígado por la acumulación de ciertos
carcinogenicidad,
fármacos y sus metabolitos [44].
solubilidad y afinidad de unión de las moléculas
Con respecto a los resultados obtenidos en el
[92]. A su vez, se puede conocer sobre los
presente estudio se ha encontrado que el ácido 43 Artículo original
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
ferúlico no posee efecto significativo en la
CONCLUSIONES
actividad de enzima citocromo P40 (CYP) y las
El presente estudio fue de interés debido a que
isoenzimas CYP1A2, CYP2E1 y CYP3A4 tal
es un completo análisis de las interacciones de
como se observó en los resultados del algoritmo
los grupos funcionales de los compuestos
obtenido. Además, se ha observado que en
aromáticos y los aminoácidos que conforman el
células
dominio de unión al autoinductor-1 del
HaCaT
(una
línea
queratinocitos
aneuploides
transformados
espontáneamente
celular
de
inmortales de
regulador
piel
violaceum.
transcripcional
CviR
de
C.
Concluyendo que en general la
humana adulta), que el ácido ferúlico cumple un
mayoría de los inhibidores compite por el sitio
papel no tóxico en las enzimas citocromo y
de unión de las AHLS en CviR, los 5
protege contra el daño oxidativo [64].
compuestos aromáticos seleccionados son
Con respecto a la vainillina se ha demostrado
inhibidores potenciales de CviR alcanzando
mediante experimentación in vitro que este
valores de energía de Gibbs mayores a furanona
compuesto aromático no presentó efecto
y vainillina. Y que los aminoácidos Trp103,
significativo en la actividad de las cinco
Asp89, Tyr80, Leu49 y Leu77 fueron clave en
enzimas citocromo CYP450 humanas como se
la unión de los inhibidores con el dominio de
observó en los resultados [93].
unión al autoinductor-1 en el regulador
Del eugenol no se ha observado efecto
transcripcional CviR.
inhibitorio aparente en la familia de citocromos
Se produjo evidencia in silico del potencial
CYP450 [94]. Pero, otros autores reportan que
inhibitorio de los 5 compuestos aromáticos
el eugenol inhibe fuertemente la actividad de
resultantes
CYP1A1 y CYP1B1, un efecto parecido al
molecular (el ácido ferúlico, el eugenol, el
encontrado mediante las herramientas in silico
isoeugenol, el 4-hidroxibenzaldehído y el ácido
parecido a los resultados obtenidos [95, 96]. Y
hidroxicinámico). También se demostró que el
finalmente, del ácido hidroxicinámico se ha
isoeugenol (9 aminoácidos) y la vainillina (8
demostrado la interacción con la familia de
aminoácidos) mostraron un mecanismo de
enzimas citocromo P450 (CYP2C9, CYP2C19
unión parecido al del autoinductor-1.Ademas,
y CYP3A4) lo cual fue contrario a lo
el mecanismo de inhibición es por medio del
encontrado en el presente estudio [97, 98].
bloqueo del dominio de unión a las AHL de
44 Artículo original
del
tamiz
de
acoplamiento
AyTBUAP 6(22):16-53 Escobar Muciño, 2021
CviR, observando que los aminoácidos de CviR
CONFLICTO DE INTERESES
se unen de forma diferente a los compuestos
La autora declara que no tiene conflictos de
aromáticos por medio de interacciones no
intereses.
covalentes con el anillo aromático de cada compuesto inhibidor como el enlace puente de
REFERENCIAS
hidrogeno, los diferentes enlaces π y las fuerzas
[1]. Durán N, Menck CF. Chromobacterium
de Van der Waals. Lo cual permite un cierto
violaceum: a review of pharmacological and
plegamiento del regulador CviR al interactuar con
los
inhibidores,
demostrando
industrial perspectives. Crit Rev Microbiol.
un
2001; 27:201-222.
mecanismo de competencia con el ligando [2]. Fantinatti-Garboggini F, Almeida RD,
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Portillo VDA, Barbosa TA, Trevilato PB, Neto
compuestos aromáticos resultantes del análisis
CER,
por acoplamiento molecular no presentaron
Brocchi
M.
Drug
resistance
in
Chromobacterium violaceum. Genet Mol Res.
efecto tóxico en el modelo de ratón y no se
2004; 3:134-174.
observó efecto elevado en la inhibición de la familia de los citocromos (CYP). Lo cual es de
[3]. Moretti E, Baggi Menozzi F, Elzi L, Lepori
utilidad debido a que no pueden inhibir la
M. Chromobacterium violaceum bacteraemia: a
mayor ruta de eliminación de fármacos y
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investigaciones
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basados en la sinergia de los compuestos
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AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.22.03
Caracterización de cepas rizosféricas pertenecientes al género Paraburkholderia sp. aisladas de la sierra norte del Estado de Puebla Itzia Citlali Guevara-González1 ID, Ricardo Carreño-López2 ID, Luis Ramiro Caso-Vargas1 ID, Vianey Marín-Cevada2* ID. 1
Facultad de Ciencias Biológicas, Biotecnología, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP). 2 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP), Puebla, México. Edificio IC-11, Ciudad Universitaria, San Manuel, Puebla, México. C. P. 72570. *Email autor corresponsal: vianey.marin@correo.buap.mx Recibido: 3 marzo 2021. Aceptado: 24 abril 2021 RESUMEN El género Paraburkholderia comprende más de 100 especies, las cuales pueden ser aisladas de diversos ambientes como plantas, suelos agrícolas, suelos volcánicos e incluso, a partir de cuerpos de agua. Existen pocos estudios en nuestro país que reportan el aislamiento de miembros pertenecientes a este género. En éste trabajo, se estudió la posición taxonómica de siete cepas rizosféricas pertenecientes al grupo de Burkholderia sensu lato, aisladas en el municipio de Chignahuapan del estado de Puebla de árboles maderables como el pino y de plantas silvestres como los helechos y las bromelias, utilizando un enfoque taxonómico polifásico. Con base en las secuencias de los genes ARNr 16S, atpD y recA se confimó que todas las cepas pertenecen al género Paraburkholderia y que GB45, GB51, GB53, GB62, GB152 y GB203 forman un clúster con Paraburkholderia sediminicola y Paraburkholderia aspalathi, con excepción de la cepa GB190, la cual podría representar una nueva especie al separarse de este grupo como lo demuestran los árboles filogenéticos. Con respecto a la caracterización fenotípica, las siete cepas de Paraburkholderia mostraron un crecimiento óptimo a una temperatura de 35 °C y un pH 6 en ausencia de NaCl. La tolerancia a distintas concentraciones de metales pesados (Co, Pb, Mo, Ni, Zn y V) fue diversa, así como en las pruebas de antibióticos. La cepa GB51 fue la única que creció en presencia de zinc hasta 200 ppm y en vanadio hasta 50 ppm, mientras que la cepa GB190 no creció a 39 °C y a un pH 4 pero fue la única cepa que si lo hizo en presencia de gentamicina a una concentración 54 Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
de 1 µg/mL y kanamicina a 2.5 µg/mL, estas características fueron las que la diferenciaron del resto de los aislamientos. Palabras clave: Burkholderia sensu lato, metales pesados, resistencia a antibióticos, filogenia, árboles maderables, plantas silvestres. ABSTRACT The genus Paraburkholderia comprises more than 100 species, isolated from various environments such as plants, agricultural soils, volcanic soils, and even water bodies. Few studies in our country report the isolation of members belonging to this genus. In this work, we focus on the taxonomic position of seven rhizospheric strains belonging to the Burkholderia sensu lato group, all of them were isolated from timber trees such as pine and wild plants such as fern and bromeliads, in the municipality of Chignahuapan situated in the state of Puebla using an approach polyphasic taxonomic. Based on the sequences analysis of the 16S rRNA, atpD, and recA genes confirmed that all the strains belong to the genus Paraburkholderia, even GB45, GB51, GB53, GB62, GB152, and GB203 form a cluster with Paraburkholderia sediminicola and Paraburkholderia aspalathi, except for the GB190 strain, which might represent a new species of this genus because it is separated from this group, as shown by phylogenetic trees. Regarding the phenotypic characterization, the seven strains showed an optimal growth at at 35 °C and pH 6.0 in the absence of NaCl. The ability to tolerate different heavy metal concentrations (Co, Pb, Mo, Ni, Zn, and V) and antibiotics concentrations (ampicilin, gentamicin, tetracyclin, kanamycin, and chloramphenicol) was diverse. Only the GB51 strain grew in the presence of zinc (≤200 ppm) and vanadium (≤50 ppm). The GB190 strain was not able to grow at 39 °C and pH 4.0 but it was the only strain resistant to gentamicin (1 µg/mL) and kanamycin (2.5 µg/mL), characteristics that also differentiated it from the rest of the isolates. Keywords: Burkholderia sensu lato, heavy metals, antibiotic resistance assay, phylogeny, timber trees, wild plants. INTRODUCCIÓN
conjunto muy limitado de aislados [1], esto
Durante muchos años se han descrito nuevas
debido a las deficiencias que propiciaban los
especies bacterianas basadas en el análisis de un
estudios usados que estaban basados en 55
Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
caracteres
morfológicos,
fisiológicos
oportunistas), de plantas y de animales [5].
(necesidad de nutrientes) y estructurales
Beukes y colaboradores (2017) utilizaron datos
(diferencias entre lípidos de membranas) que no
completos de las secuencias del genoma de 78
permitían
microorganismos
cepas tipo, mostrando, por un lado, una división
existentes hasta ahora. Lo anterior era cierto
formal entre las especies patógenas y las
para muchas especies bacterianas, incluidas
especies ambientales beneficiosas para las
varias que pertenecen al grupo de Burkholderia
plantas (PBE) sobre la base de sus genomas
sensu lato [2, 3]. Sin embargo, la taxonomía
centrales; por otro lado, resolvieron las
bacteriana cambió al adoptar una combinación
relaciones filogenéticas y propusieron arreglos
de métodos para la identificación y descripción
taxonómicos entre las especies de los géneros
de nuevas especies basada en un enfoque
Paraburkholderia y Caballeronia. Además, a
polifásico de la taxonomía utilizando tres clases
partir de este punto, sería considerado como
de
y
perteneciente al grupo Burkholderia (s.l) [6].
filogenético para complementar los problemas
Posteriormente, la división de este grupo fue
de agrupación y caracterización. Este enfoque
respaldada por Estrada-de los Santos y
ha
género
colaboradores (2018) aclarando las posiciones
Burkholderia ahora Burkholderia sensu lato
de diversas cepas dentro de Burkholderia (s.l)
(s.l.) en seis géneros: Burkholderia sensu stricto
desde un enfoque filogenómico basado en un
(s.s.),
análisis de máxima verosimilitud de genes
conocer
métodos:
permitido
los
fenotípico,
la
división
Caballeronia,
genotípico
del
Paraburkholderia,
Trinickia, Mycetohabitants y Robbsia mediante
conservados de más de 100 especies [3].
análisis filogenéticos de los genes ARNr 16S y
Paraburkholderia
de mantenimiento; secuencias de genomas y
proteobacterias, Gram-negativas, bacilos rectos
proteínas [3]. El género tipo, Burkholderia (s.
o ligeramente curvados, con uno o más flagelos
l.), se encuentra constituido por más de 200
polares, que aparecen por separado, en pares o
especies que habitan diferentes ambientes,
en grupos. Las características morfológicas y
como el agua y el suelo [4]. Asimismo, pueden
metabólicas son similares a las del género
establecer simbiosis con plantas, ya sea como
Caballeronia. Actualmente, está compuesta por
endófito
102
o
desarrollando
nódulos
en
especies
es
un
género
identificadas
en
de
β-
diversos
leguminosas. También se han descrito especies
ambientes, incluidos suelos agrícolas, suelos
que pueden comportarse como patógenas de
volcánicos, agua y plantas [7, 4]. A diferencia
humanos
de las especies de Burkholderia (s.s), los
(algunas
con
carácter
de 56
Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
miembros de Paraburkholderia no se asocian
Paraburkholderia [10, 11, 12, 13, 14, 15, 16] y
comúnmente
humanas.
se ha especulado que tal preferencia puede estar
Además de que forman un clado monofilético
asociada con su versatilidad catabólica que les
dentro de la familia Burkholderiaceae, que es lo
permite degradar los exudados y otros
que les llevó a distinguirse como un género
compuestos derivados de la raíz, y así persistir
independiente de las especies de los géneros de
en la superficie de ésta [17].
Caballeronia
En
con
y
infecciones
Burkholderia
(s.s),
en
México,
se
han
identificado
especies
combinación con el hallazgo de secuencias
diazotróficas del género Paraburkholderia como P.
conservadas
deleciones
unamae, P. xenovorans, P. tropica, y otras dos
(Conserved Signature Indels, CSI) que son
estrechamente relacionadas filogenéticamente con
exclusivas
de
P. kururiensis aisladas de rizósfera y rizoplano de
Paraburkholderia. Los CSI en proteínas que
plantas de tomate (Lycopersicon esculentum)
de
de
insertos
las
y
especies
cultivadas en Morelos y en el Estado de México;
distinguen este género como son: transposasa A,
glicosiltransferasa
del
grupo
estas especies de Paraburkholderia fijadoras de
1,
nitrógeno exhibieron actividades relacionadas a
undecaprenilfosfato glucosa fosfotransferasa y
biorremediación,
monooxigenasa 4-hidroxiacetofenona fueron
promoción
del
crecimiento
vegetal y control biológico in vitro. P. tropica
descritas por Sawana y colaboradores [8]. Con
también ha sido aislada de rizósfera, rizoplano y
respecto al contenido en C+G, los miembros de
tejidos internos de maíz y de plantas de teocintle
este clado asociado a plantas muestran
recolectadas de los estados de Guerrero, Veracruz,
diferencias en su genoma con respecto a
Morelos, Chiapas, Puebla y Oaxaca [10]. En 2004
miembros del género Burkholderia (s.l),
se describió por primera vez la especie P. unamae
oscilando la proporción de guaninas y citosinas
que fue seleccionada de un estudio taxonómico
entre 59-65%, distinguiéndose del género
polifásico que incluía varias cepas aisladas de la rizósfera del maíz cultivado en campos de
Burkholderia (s.l.) (fitopatógenos o patógenos
Tlayacapan, Morelos [18]. En Oaxaca, se lograron
oportunistas de mamíferos) que presentan un
aislar de suelo de un campo de maíz algunas cepas
alto contenido de G+C, mayor a 65%. Además, se
han
reportado
especies
del
de
género
Burkholderia
sp.
endófitas
fijadoras
de
nitrógeno, y, además, se aislaron otras identificados
Paraburkholderia con potencial para el control
como P. tropica a partir de plantas de maíz en
biológico, biorremediación o bacterias que
Tlayacapan, Morelos y Coatepec, Veracruz [13].
promueven fijación de nitrógeno en plantas [9].
Nuestro grupo de investigación recolectó
La rizósfera es el hábitat más frecuente de
muestras de suelos rizosféricos a partir de 57
Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
plantas silvestres y especies maderables en el
las cepas rizosféricas; iii) identificar las cepas a
municipio de Chignahuapan, Puebla. Antonio-
partir del análisis filogenético del gen 16S y de
Flores (2015) [19] y Cervantes-Álvarez (2016)
los genes de mantenimiento: recA y atpD.
[20], aislaron e identificaron cepas bacterianas mediante secuenciación y análisis filogenético
METODOLOGÍA
del gen ribosomal 16S demostrando que los
Material biológico
aislados GB45, GB51, GB53, GB62, GB152, GB190
y
GB203
Burkholderia
pertenecen
(s.l),
al
Se reactivaron las siete cepas aisladas de
grupo
además,
rizósfera de pino (GB190, GB203), y helecho
están
(GB45, GB51, GB53, GB62) y bromelia
estrechamente relacionados con las cepas tipo: Paraburkholderia Paraburkholderia
sediminicola aspalathi,
(GB152) en medio de cultivo Luria Bertani
y
aisladas
(LB), y un medio semi-selectivo para el género
de
Burkholderia y Pseudomonas cepacia (PCAT)
sedimento de agua dulce y de nódulos de raíces
[23].
de una leguminosa, respectivamente [21, 22]. La existencia de pocos estudios que evidencien
Caracterización fenotípica
la presencia de este género asociado a un mayor
Se evaluó durante cinco días el crecimiento de
número de plantas, impulsan este trabajo para
las siete cepas bajo diferentes parámetros:
ampliar el conocimiento de este género con la
temperatura (30, 35 y 39 °C, incubación 120 h),
finalidad de elucidar que ciertas especies no
pH (4, 6, 7; incubación 72 h) y salinidad (1, 2,
solo son propias de cuerpos de agua o asociadas
3% NaCl; incubación 72 h). También se
a leguminosas. Por lo anterior, se plantea
realizaron algunas pruebas bioquímicas clave
aportar conocimiento de su presencia e
para identificar cepas Paraburkholderia sp.
identificación a través de una taxonomía
(asimilación de carbohidratos como D-manosa,
preliminar de estas siete cepas, miembros del
D-sorbitol, prueba citrato,
género Paraburkholderia aisladas en el Estado
se determinó el grado de tolerancia de las cepas
evaluar el crecimiento de las cepas rizosféricas acuerdo
con
algunos
D-
gluconato, actividad hemoltíca). Por otro lado,
de Puebla, proponiéndose como objetivos: i)
de
oxidación
rizosféricas a metales pesados en presencia de
parámetros
diferentes concentraciones de estos en agar
fisicoquímicos y bioquímicos; ii) determinar el
nutritivo: Ni (25, 50, 100, 200, 250 y 300 ppm),
grado de tolerancia a metales pesados de las
Co (25, 50, 100 y 200 ppm), Mo (250 y 300
cepas rizosféricas y la resistencia antibiótica de
ppm), Zn (25, 50 100 y 200 ppm), Pb (25, 50, 58
Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
100, 200, 250 y 300 pm) y V (25, 50, 100 y 200
para la PCR fueron las siguientes: 95 °C por 6
ppm). También se probó su resistencia
min; 29 ciclos de 94 °C por 40 s, seguido por la
antibiótica: Amp (10, 20, 50, 100 y 150
temperatura de alineamiento (58 °C para el gen
µg/mL), Cm (1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 y 20 µg/mL),
recA y 56 °C para el gen atpD) por 50 s y una
Gm (1, 2.5, 5 y 7.5 µg/mL), Tc (2.5, 5, 10, 15 y
extensión de 72 °C por 1 min, y una extensión
20 µg/mL) y Km (1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 y 20
final de 75 °C por 9 min. Finalmente se verificó
µg/mL). La cepa Pseudomonas putida KT2440
la amplificación mediante una electroforesis en
se utilizó como control positivo para los
gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, y
ensayos de tolerancia a metales y resistencia
luego,
antibiótica. Todos ensayos se realizaron por
correspondiente al tamaño del amplicón. La
triplicado.
secuenciación se llevó a cabo en la empresa
se
procedió
a
cortar
la
Macrogen
banda
Korean
Caracterización genotípica
(https://dna.macrogen.com/esp/).
Primeramente, se realizó la extracción del ADN
secuencias del gen ARNr 16S utilizadas en este
genómico de las cepas utilizando el kit
trabajo fueron obtenidas a partir de los estudios
Wizard®
realizados por Cervantes-Álvarez [20].
Genomic
DNA
Purification
Otras
(Promega) siguiendo el protocolo descrito por Análisis y construcción de los árboles filogenéticos
el fabricante. Para amplificar los genes de mantenimiento recA y atpD se utilizaron los
Una vez obtenido los cromatogramas de las
cebadores reportados por Spilker et al [24]:
secuencias en sentido forward y reverse de cada
recAF (5´-AGGACGATTCATGGAAGAWAGC) y recAR
cepa se analizaron con el programa BioEdit ver.
(5´-GACGCACYGAYGMRTAGAACTT),
7.2.5. obteniendo la secuencia consenso.
atpDF (5´-ATGAGTACTRCTGCTTTGGGTAGAA GG), TCG),
atpDR
Posteriormente, las secuencias consenso fueron
(5´-CGTGAAACGGTAGATGTTG
comparadas mediante un análisis BLASTn con
generando un amplicón de 704 y 756 pb,
las secuencias contenidas en la librería de
respectivamente. La reacción consistió en 1 μl
nucléotidos del GenBank. Las secuencias
de ADN molde (26 ng) y una alícuota de 9 μl
generadas por las cepas de estudio, así como las
de la mezcla de PCR, que contenía buffer 1x,
de las cepas tipo se alinearon y editaron
dNTP’s 2 mM, 1 μl de cada cebador, y 1.25U
utilizando el programa BioEdit ver. 7.2.5.,
de DreamTaq DNA Polymerasa (Thermo
ClustalX 2.0 [25] y GeneDoc 2.7 [26]. Las
Scientific™). Las condiciones del ciclo térmico
alineaciones individuales se concatenaron 59 Artículo original
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utilizando DnaSP v5 [27] con los parámetros
concentración de 300 ppm. Para el cobalto, las
establecidos. Los árboles filogenéticos fueron
siete cepas solo fueron capaces de crecer en
construidos mediante el método de inferencia
presencia de 25 y 50 ppm, y la cepa control
de Neighbor-Joining con base en distancias
positivo en 100 ppm pero no a 200 ppm. En el
maximum composite likelihood y por el método
caso del zinc, todas las cepas crecieron bajo las
de máxima verosimilitud mediante el modelo
concentraciones de 25 y 50 ppm, y solo la cepa
de sustitución Tamura-Nei usando 1,000
GB51 y la cepa control positivo crecieron en
réplicas de arranque con el programa MEGA v7
100 y 200 ppm.
[28].
RESULTADOS Caracterización fenotípica Para su reactivación las colonias cultivadas en medio sólido PCAT y LB, presentaron morfología
colonial
blanca,
cremosa
A
y
puntiforme (Figura 1). Con excepción de la cepa GB190 que, además de presentar estas tres características, se observó un halo transparente alrededor de la colonia. Los resultados de los ensayos con respecto a la evaluación del crecimiento de las siete cepas
B
bajo diferentes parámetros como temperatura,
Figura 1. Colonias de color blanco cremoso y mucoide en medio PCAT (A) y medio LB (B).
salinidad, pH, asimilación de carbohidratos y actividad hemolítica se muestran en la tabla 1.
Todas las cepas crecieron en presencia de
Al evaluar la tolerancia a metales en las siete
vanadio (25 ppm) y solo la cepa GB51 creció
cepas se registraron diferentes grados de tolerancia
dependiendo
del
metal,
en 50 ppm. La cepa P. putida KT2440 creció
su
bajo todas las concentraciones evaluadas para
concentración y de la cepa. Las siete cepas
vanadio (25, 50, 100 y 200 ppm). Molibdeno y
crecieron hasta una concentración máxima de
plomo, fueron los únicos metales que no
níquel de 250 ppm; sin embargo, solo la cepa P.
mostraron afectación en el crecimiento de todas
putida KT2440 (control positivo) creció bajo la 60
Artículo original
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las cepas bajo las concentraciones evaluadas
distinguen las diferencias entre las cepas en
(25, 50, 100, 200, 250 y 300 ppm), incluyendo
presencia de metales pesados bajo diferentes
al control positivo.
concentraciones.
En la tabla 2 se muestra los resultados que Tabla 1. Resultados de las pruebas fenotípicas. Código de cepas y fuente de aislamiento / Pruebas
GB45 Helecho
GB51 Helecho
GB53 Helecho
GB62 Helecho
Bromelia
Temperatura 39 °C
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
Temperatura 35 °C
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
Salinidad 1%
⁺
⁻
⁺
⁺
Salinidad 2%
⁻
⁻
⁻
Salinidad 3%
⁻
⁻
Sin NaCl
⁺⁺
pH 4 (crecimiento)
P. aspalathi
P. sediminicola
⁺
ND
ND
⁺⁺
⁺⁺
ND
ND
⁺
⁻
⁺
⁺
ND*
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
ND
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
ND
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁻
pH 6 (crecimiento)
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
pH 8 (crecimiento)
⁺⁺
⁺⁺
⁺⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
D-manosa
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
-
D-sorbitol
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
Prueba citrato
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
Oxidación Dgluconato
-
-
-
-
-
-
-
⁺
-
Actividad hemolítica
[γ]
[γ]
[γ]
[γ]
[γ]
[γ]
[γ]
ND
ND
GB152
GB190 GB203 Pino Pino
Asimilación de carbohidratos:
++, Condición óptima de crecimiento; +, crecimiento; -, cepa negativa; ND, no determinado. [γ] Hemólisis gamma
61 Artículo original
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Tabla 2. Resistencia a metales pesados de los aislamientos bacterianos. Código de cepas/Tipo de metal
GB190
GB51
GB203
GB62
GB45
GB53
GB152
P. putida KT2440
Níquel 250 ppm
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
Níquel 300 ppm
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
Cobalto 50 ppm
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
Cobalto 100 ppm
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
Molibdeno 300 ppm
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
Zinc 200 ppm
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
Plomo 300 ppm
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
Vanadio 50 ppm
-
⁺
-
-
-
-
-
⁺
Vanadio 200 ppm
-
-
-
-
-
-
-
⁺
+, crecimiento; -, no crecimiento; ND, no determinado Los resultados del ensayo de resistencia a
evaluadas (GB62 y GB53). Además, se observó
antibióticos se muestran en la tabla 3, la
crecimiento de las cepas (GB45, GB51, GB152,
ampicilina y el cloranfenicol, mostraron
GB190 y GB203) bajo las concentraciones de
algunas coincidencias con lo reportado de las
cloranfenicol evaluadas, excepto en 20 μg/mL.
cepas tipo P. aspalathi y P. sediminicola. Fue
La cepa P. putida KT2440 utilizada como
el caso de todas las concentraciones evaluadas
control
para la ampicilina, con excepción de las cepas
concentraciones de ampicilina y cloranfenicol
GB51 y GB62, en las cuales no se observó
evaluadas. De las siete cepas evaluadas,
crecimiento bajo la concentración de 150
únicamente la cepa GB190 creció bajo la
μg/mL. Para el caso del cloranfenicol, solo P.
concentración de gentamicina más baja (1
aspalathi ha reportado sensibilidad a este
μg/mL) y en la cepa control positivo se observó
antibiótico y P. sediminicola está reportada por
crecimiento en 1 y 2.5 μg/mL. La tetraciclina
su resistencia a cloranfenicol a la concentración
fue el único antibiótico en el cual no se registró
de 5 μg/mL, lo que coincidió con dos cepas
crecimiento para las siete cepas evaluadas bajo 62
Artículo original
positivo
creció
bajo
todas
las
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ninguna concentración, y solo el control
creció en la concentración más baja de este
positivo creció en la concentración más baja
antibiótico (1 μg/mL). Según la literatura, las
(2.5 μg/mL). La cepa GB190 fue la única cepa
cepas tipo, P. sediminicola y P. aspalathi, son
que creció bajo la concentración de 1 y 2.5
sensibles a la presencia de gentamicina,
μg/mL de kanamicina. El control positivo solo
tetraciclina y kanamicina [21, 22].
Tabla 3. Resistencia de antibióticos de las siete cepas bacterianas. Código de cepas / Antibiótico
GB190
GB51
GB203
GB62
GB45
GB53
GB152
P. putida KT2440
P. aspalathi
P. sediminicola
Ampicilina 10 µg/ml
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
Ampicilina 150 µg/ml
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
Cloranfenicol 1 µg/ml
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
Cloranfenicol 15 µg/ml
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁻
⁺
⁺
⁻
⁻
Gentamicina 1 µg/ml
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
Gentamicina 2.5 µg/ml
-
-
-
-
-
-
-
⁺
-
-
Tetraciclina 2.5µg/ml
-
-
-
-
-
-
-
⁺
-
-
Kanamicina 1 µg/ml
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
Kanamicina 2.5 µg/ml
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
+, crecimiento; -, cepa negativa; ND, no determinado
63 Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
Caracterización genotípica La identificaciónn genotípica de las siete cepas
Construcción y análisis de los árboles filogenéticos
se verificó mediante la amplificación de los genes de mantenimiento: recA y atpD
Cervantes-Álvarez (2016) [20], evidenció un
utilizando a la cepa control Paraburkholderia
bajo poder de discriminación cuando se genera
unamae MTl-641, y la secuenciación. Los
una filogenia a partir del gen marcador ARNr
amplicones obtenidos y visualizados de 704 pb
16S, el cual es sumamente conservado en el
para el gen recA y 756 pb para el gen atpD se
grupo Burkholderia (s.l), con los siete
identificaron como Burkholderia spp. que
aislamientos de este estudio, debido a la
coincide con lo establecido por Spilker et al.
cercanía genética unos de otros obteniendo un
[24]. Al comparar por BLAST las secuencias
árbol filogenético poco resuelto. Sin embargo,
del ARNr 16S (~1380 pb) de las siete cepas con
al construir el árbol filogenético con las
la base de datos de nucleótidos de NCBI
secuencias de los genes recA y atpD (material
mostraron que se agrupaban con las especies
suplementario), así como también con las
del género Paraburkholderia, por ejemplo, las
secuencias concatenadas parciales de los tres
secuencias del ARNr 16S de las cepas GB45,
genes de mantenimiento; ARNr 16S, recA y
GB53, GB62, GB152 y GB203 compartieron
atpD (2135 pb), se observa que las cepas GB45,
entre el 100 y el 99.78 de identidad con P.
GB53, GB62, GB152 y GB203 e incluso GB51,
sediminicola, y en menor porcentaje con otras
se posicionaron muy cerca de P. aspalathi
especies descritas del género como es P.
VG1C y P. sediminicola HU2-65W. En cuanto
aspalathi. En cuanto a GB51 mostró identidad
a la cepa GB190 se observó fuera de este clúster
del 99.55% con B. phytofirmans y con P.
aún, con un bootstrap del 98% (Fig. 2).
caledonica el 99.35%, así mismo, la cepa GB190 se alineó con otros siete aislados
Para especificar solo las relaciones entre los
identificados como Paraburkholderia sp. en el
taxones y GB190 se construyó un árbol
GenBank (NCBI), como es el caso de la cepa
mediante
PA-G9 y PA-C10 con un porcentaje de
observando que esta cepa se mantiene separada
identidad
de las dos especies de Paraburkholderia
del
99.50%
y
99.21%,
(Figura 3).
respectivamente. En todos los casos el valor de expectancia E (E-value) fue de 0.0.
64 Artículo original
Neighbor-Joining
sin
enraizar,
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
Figura 2. Árbol filogenético por el método máxima verosimilitud basado en las secuencias de genes concatenados (16S rRNA + recA + atpD) (2135 pb) que muestran las relaciones de las cepas y otros miembros del género. El árbol se enraizó con Cupriavidus necátor (Bootstrap de 1000 repeticiones). El rombo muestra las cepas de interés.
65 Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
Figura 3. Filogenia por el método Neighbor- Joining basado en las secuencias de genes concatenados (16S rRNA + recA + atpD) (2135 pb) que muestran la separación de GB190 con respecto de P. sediminicola y P. aspalathi. (Bootstrap de 1000 repeticiones, sin enraizar). El rombo muestra las cepas de interés. DISCUSIÓN
reportado para Paraburkholderia sediminicola y Paraburkholderia aspalathi [21, 22]. No
La morfología colonial que exhibieron las siete
obstante, GB190 además de presentar las tres
cepas en medios PCAT y LB coincide con lo 66
Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
características morfológicas (blanca, cremosa y
pseudomallei las temperaturas altas inducen
puntiforme), mostró un halo transparente
cambios
alrededor de la colonia lo que la distingue del
chaperonas, proteínas de movilidad celular,
resto. De igual modo, para el ensayo de
antioxidantes
temperatura, en particular a 39 °C, después de
ocasionando
96 h de incubación, la cepa GB190 no creció a
crecimiento [30]. Razones por las cuales, la
diferencia del resto de las cepas que presentaron
temperatura es uno de los factores ambientales
ligero crecimiento. La temperatura para un
más
crecimiento óptimo en todas las cepas fue a 35
proliferación y mantenimiento de la viabilidad
°C, el cual se observó después de 48 horas.
de los microorganismos.
Comparado
estos
resultados
con
cambios
importantes
que
en
estructurales las
fases
influyen
en
de
la
de las 48 horas, pero no en GB51 y GB190. A una concentración al 2% se tiene que sólo GB62
aspalathi es de 20-30 °C, sin embargo, se
y GB203 presentaron un ligero crecimiento, a
reporta un crecimiento moderado a 37 °C y sin
partir de una concentración al 3% ya no hay
crecimiento a 45 °C [21]. Como resultado de
proliferación celular de ninguna de las siete
este estudio, se observó un crecimiento óptimo
cepas.
a una temperatura de 35 °C después de 48 h de
Por
lo
tanto,
mostraron
cierta
sensibilidad en presencia de cloruro de sodio,
incubación, considerando que esta temperatura
dependiendo la cepa, y el mejor crecimiento se
está dentro del rango de temperaturas propia
obtiene
que caracterizan a bacterias mesófilas en el
sin
NaCl
en
todas
las
cepas.
Comparando con otras especies, se reporta que
suelo (30-39 °C) [29]. Además, se observó que
en P. sediminicola es posible el crecimiento en
entre más alta la temperatura, los aislados
presencia de NaCl al 1.5% incubada a 28°C
tardaban más en crecer, infiriendo que las
[22], para P. aspalathi en una concentración del
bacterias quizás pueden sobrevivir, pero por un
1% al 10% [21], P. sartisoli crece a una
tiempo determinado no hay división celular su
proteínas
GB45, GB53, GB62, GB152 y GB203 después
temperatura para un crecimiento óptimo en P.
de
y
metabólicas,
observó crecimiento moderado de las cepas
crecimiento a 42 °C [22]. Mientras que la
después
enzimas
En cuanto al ensayo de NaCl al 1% sólo se
crecimiento es de 15-30 °C; no presenta
hasta
las
P.
sediminicola el rango de temperatura para el
sino
en
concentración de 0.5% [14], sin embargo, el
adaptación,
crecimiento óptimo es en ausencia de NaCl para
conllevando a una recuperación y comenzando
estas tres especies, así como para las siete cepas
de nuevo la división. Como en el caso de B.
estudiadas. Otra característica importante para 67 Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
estudiar el crecimiento de bacterias en
en el caso de P. aspalathi se reporta crecimiento
presencia de NaCl es la búsqueda de genotipos
en un rango de pH 4−8 a 28 °C. Pero, en ambos
bacterianos tolerantes a la salinidad para
casos se obtiene un crecimiento óptimo a pH 6
solucionar los problemas que ocurren con la
y 7. Existen reportes de aislamientos de
fijación
[31]
Paraburkholderia a partir de rizósfera con pH
demostrando que altas concentraciones de
ácido, tales como P. tropica, especie aislada en
NaCl,
influyen
el rango de pH 4.5 a 6.5 [10] y P. unamae, la
negativamente en el crecimiento bacteriano de
cual fue aislada de la rizósfera en un rango de
Burkholderia gladioli y Paraburkholderia
pH de 4.5−7 [18]. P. acidipaludis y P. heleia
heleia asociadas a plantas de caña de azúcar
fueron aisladas a partir de la planta Eleocharis
cultivadas en Pernambuco, Brasil; a pesar de
dulcis, la cual crece en pantanos altamente
que B. gladioli presentó más tolerancia a la
ácidos (pH 2−4) [15]. Por ende, es posible que
salinidad que P. heleia. Como un efecto
un determinado rango de pH favorezca el
indirecto, Pereira y colaboradores, observaron
establecimiento
que altas concentraciones de NaCl (> 25 g/L)
pertenecientes al género.
biológica
por
encima
de
de
nitrógeno
10g/L,
de
ciertas
especies
influye negativamente en la producción del ácido indol acético in vitro e inhibe la capacidad
Se conoce que la base de agar sangre es
de fijar nitrógeno in vitro tanto para B. gladioli
adecuada para aislar y cultivar diversos
y de P. heleia.
microorganismos de difícil crecimiento y posibles bacterias que podrían afectar la salud
El pH es también un factor muy importante en
humana, y en este caso se utilizó como una
el metabolismo y la reproducción de las
prueba indirecta para vislumbrar la posibilidad
bacterias, ya que la variación en éste puede
de que los aislados fueran agentes patógenos en
llegar a inactivar el sistema metabólico y
mamíferos o humanos. Al añadir sangre, puede
destruir a la bacteria. En el ensayo de pH 4 sólo
usarse para mostrar la actividad hemolítica
no se observó crecimiento de dos cepas: GB53
debido a que los microorganismos hemolíticos
y GB190. En pH 8 crecen todas las cepas pero
liberan enzimas (hemolisinas) al medio que
el crecimiento óptimo se registró en un pH 6.
destruyen los glóbulos rojos apareciendo halos
Las siete cepas utilizadas en este estudio se
de hemólisis. Sin embargo, se observó ausencia
aislaron en un rango de pH (5.2−5.8). Con
de lisis de los glóbulos rojos ya que el medio no
respecto a P. sediminicola se ha publicado que
presentó modificaciones de color y aspecto
las células crecen en un rango de pH 6.0−8.0 y
alrededor de la colonia en estudio. En el género 68
Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
Burkholderia sensu stricto algunas cepas han
solubilizando el plomo y el cadmio en cultivo
mostrado actividad hemolítica, aun siendo
en disolución [33]. Otras especies que son
aisladas
potencial
capaces de inmovilizar metales pesados y
biotecnológico. A la fecha, ha sido claro que el
reducir su translocación en las plantas mediante
linaje Paraburkholderia no contiene cepas
precipitación, formación de complejos y
patógenas, estudios de análisis de genómica
adsorción, promueven el crecimiento en
comparativa han validado su potencial no
plantas. Por ejemplo, Burkholderia gladioli en
patogénico, lo cual establece la posibilidad de
la mitigación del estrés por cadmio en
su uso como promotoras de crecimiento en
Lycopersicon esculentum [34] y Burkholderia
plantas, manejo de enfermedades y otras
cepacia CS2-1 que mejoró el crecimiento en
aplicaciones biotecnológicas [32].
Brassica rapa al disminuir la absorción de Zn+
del
ambiente
y
con
indicando Por otra parte, en la prueba de metales se
Existen
la
diversos
metales pesados; algunos están codificados en
respectivamente. Mientras tanto, en zinc y en
plásmidos y tienden a ser específicos para un
vanadio sólo GB51 fue capaz de crecer después
metal en particular. También se ha observado la
de dos días en una concentración de 200 y 50
producción
ppm, correspondientemente. Los resultados
de
sustancias
poliméricas
extracelulares que se unen fuertemente a los
mostraron que estas cepas bacterianas pueden
metales. Los exopolímeros microbianos, los
estar bajo concentraciones elevadas de diversos
cuales están compuestos de residuos de
metales pesados, y esto podría deberse a las
azúcares
diferencias en la estructura de su pared celular
que
son
secretados
al
medio
circundante, son particularmente eficientes en
o variaciones en sus mecanismos de resistencia.
la unión de metales pesados, como plomo,
A pesar de que a la fecha no existen evidencias
cadmio y uranio, coadyuvando en la absorción
experimentales de la tolerancia a metales
de metales pesados para células bacterianas en
pesados de las cepas. P. sediminicula y P.
ambientes naturales [36]. En el caso particular
aspalathi, existen diversos reportes sobre
de Burkholderia cepacia GYP1, la cual se aisló
Burkholderia (s.l) capaces de crecer en pesados,
[35].
para
cuales un sistema puede conferir resistencia a
una concentración de 250, 50, 300 y 300 ppm,
metales
adecuada
mecanismos en las bacterias a través de los
plomo hay crecimiento de las siete cepas hasta
de
es
biorremediación
observó que en níquel, cobalto, molibdeno y
presencia
que
de suelos agrícolas contaminados con metales
como
pesados, Zhang y colaboradores evidenciaron
Burkholderia sp. J62 la cual fue la mejor 69 Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
que esta cepa bajo condiciones oligotróficas, es
filogenéticos y taxonómicos dentro del grupo
decir, un ambiente en donde existen bajas
Burkholderia (s.l), incluido la reclasificación
concentraciones
carbono,
reciente de las especies ambientales de
fosfatos, nitratos y hierro, tuvo una alta
Paraburkholderia [8, 42]. En este estudio, las
capacidad de acumulación de cadmio de hasta
topologías
116 mg/g de biomasa (peso seco) al producir
obtenidos, por una parte, muestran la estrecha
estas sustancias poliméricas extracelulares [37].
relación de cinco de las siete cepas utilizadas en
de
fuentes
de
de
los
árboles
filogenéticos
este estudio con P. sediminicola y P. aspalathi, Por otro lado, este estudio reveló que las siete
y, además, que la cepa GB190 en ambas
cepas no mostraron sensibilidad hacia dos
topologías, se distingue claramente fuera de
antibióticos, ampicilina y cloranfenicol, y
este grupo, representando un linaje separado,
ninguna de ellas creció en presencia de
sugiriendo que representa una nueva especie.
tetraciclina. Solo GB190 fue capaz de crecer en
De igual modo, se evidenció una similar
kanamicina (1 y 2.5 µg/ml) y gentamicina (1 µg/ml),
diferencias
aprovechadas
para
que ser
podrían
utilizadas
posición taxonómica de la cepa GB190 cuando
ser
se realizó la filogenia a partir de los genes de
como
mantenimiento
marcador para evaluar su supervivencia en
por
separado
(Material
suplementario).
experimentación posterior, si fuera el caso. Hasta el momento se cree que la primera línea
CONCLUSIONES
de defensa contra los antimicrobianos en las Los aislados utilizados en este estudio
especies de Burkholderia es la barrera de penetración
de
la
membrana
presentaron una morfología colonial muy
externa
similar, caracterizándose por ser de color
impermeable y por las proteínas efluentes
blanco
eficientes [38], no obstante, existen diversos
y
cremoso
como
el
género
Paraburkholderia, a excepción del aislado
estudios que han reportado la sensibilidad a
GB190 que mostró en su fenotipo un halo
aminoglicósidos, como son la gentamicina,
transparente alrededor de la colonia blanca y
kanamicina, en cepas pertenecientes al género
cremosa en medio PCAT. Todas las cepas
Paraburkholderia [39, 40, 41].
crecieron a 35 °C y a un pH 6 y mostraron Entre los marcadores moleculares, los genes
sensibilidad en presencia de NaCl, incluso al
constitutivos
sido
1% como fue el caso para las cepas GB51 y
estudios
GB190. Al evaluarse la actividad hemolítica,
ampliamente
recA
y
adoptados
atpD, en
han
70 Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
todas las cepas mostraron hemólisis tipo
Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana
gamma, es decir, ninguna fue capaz de realizar
(CICM-ICUAP).
hemólisis ya que no hubo halo alrededor de la
Se agradece el apoyo brindado por la Dra.
colonia. De las cinco fuentes de carbono; solo
Guadalupe Rocha-Bonilla en la instrucción
el citrato fue utilizado por las siete cepas. GB51
bioinformática.
toleró concentraciones de 200 ppm de zinc y 50
Los autores también agradecen a la VIEP-
ppm de vanadio. La cepa GB190 presentó
BUAP por el apoyo para realizar este trabajo.
ciertas diferencias con las demás cepas, por
Así mismo, la primera autora agradece el apoyo
ejemplo; a pesar de ser aislada del mismo pino
y la participación en el programa “Jóvenes
como GB203 no creció a una temperatura de 39
Investigadores”.
°C y a un pH 4, pero fue la única cepa que creció en gentamicina (1 µg/mL) y kanamicina
REFERENCIAS
(2.5µg/mL). La amplificación de los genes
[1]. Rosselló-Mora, R., Amann, R. The species
atpD y recA sirvieron como base para elucidar
concept for prokaryotes. FEMS microbiology
las relaciones filogenéticas entre las cepas y las
reviews. 2001;25(1), 39-67.
especies
de
características
Paraburkholderia. fenotípicas
y
Las
[2]. Caballero-Mellado J, Onofre-Lemus J,
genotípicas
Estrada-De Los Santos P, Martínez-Aguilar L.
permitieron distinguir a GB190 como posible nueva
especie
perteneciente
al
The tomato rhizosphere, an environment rich in
género
nitrogen-fixing Burkholderia species with
Paraburkholderia. Las cepas GB45, GB51,
capabilities of interest for agriculture and
GB53 GB62 y GB152 se identifican como
bioremediation.
Paraburkholderia sediminicola, y GB203
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Se declara que no existe un conflicto de
suggests that Burkholderia sensu lato contains
intereses por parte de los autores.
two additional novel genera (Mycetohabitans AGRADECIMIENTOS
gen.
La cepa Pseudomonas putida KT2440 fue
Implications for the evolution of diazotrophy
proporcionada amablemente por el grupo
and nodulation in the Burkholderiaceae. Genes
“Ecology and Survival of Microorganisms”,
(Basel). 2018;9(8). 71
Artículo original
nov.,
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Trinickia
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75 Artículo original
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.22.03
Caracterización de cepas rizosféricas pertenecientes al género Paraburkholderia sp. aisladas de la sierra norte del Estado de Puebla Itzia Citlali Guevara-González1 ID, Ricardo Carreño-López2 ID, Luis Ramiro Caso-Vargas1 ID, Vianey Marín-Cevada2* ID. 1
Facultad de Ciencias Biológicas, Biotecnología, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP). 2 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP), Puebla, México. Edificio IC-11, Ciudad Universitaria, San Manuel, Puebla, México. C. P. 72570. *Email autor corresponsal: vianey.marin@correo.buap.mx Recibido: 3 marzo 2021. Aceptado: 24 abril 2021
A Material Suplementario
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
Figura suplementaria 1. Filogenia por el método Neighbor- Joining basado en las secuencias del gen ARNr 16S (~1380 pb) que muestran la separación de GB190 con respecto de P. sediminicola y P. aspalathi. (Bootstrap de 1000 repeticiones). El rombo muestra las cepas de interés.
B Material Suplementario
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
Figura suplementaria 2. Filogenia por el método Neighbor- Joining basado en las secuencias del gen atpD (641 pb) que muestran la separación de GB190 con respecto de P. sediminicola y P. aspalathi. (Bootstrap de 1000 repeticiones).El rombo muestra las cepas de interés.
C Material Suplementario
AyTBUAP 6(22):54-75 Guevara-González et al., 2021
Figura suplementaria 3. Filogenia por el método Neighbor- Joining basado en las secuencias del gen recA (577 pb) que muestran la separación de GB190 con respecto de P. sediminicola y P. aspalathi. (Bootstrap de 1000 repeticiones). El rombo muestra las cepas de interés.
D Material Suplementario
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021 https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.22.04
Análisis de las encuestas de satisfacción realizadas en consulta de farmacia hospitalaria. Comparación de resultados Joaquín Urda Romacho1* ID, Jesús María Fernández Martín2, Diana González Vaquero3, María del Carmen Torres Rodríguez1, José Cantó Mangana 1, María Ángeles Castro Vida1. 1
Servicio de Farmacia. Hospital de Poniente. Almería. Servicio de Farmacia. Hospital Materno Infantil HRU. Málaga. 3 Servicio de Farmacia. Complejo Hospitalario Universitario Badajoz. 2
*Email autor corresponsal: joaquin.urda@ephpo.es Recibido: 24 marzo 2021. Aceptado: 13 mayo 2021 RESUMEN Antecedentes: La satisfacción del paciente es un reflejo del tipo y calidad de la asistencia prestada por los profesionales sanitarios. La encuesta de satisfacción al paciente se considera como un estándar de calidad para evaluar los resultados del proceso de atención médica. Objetivo: Determinar el nivel de satisfacción del paciente con el servicio prestado en nuestra consulta de farmacia hospitalaria, detectar posibles acciones de mejora y analizar los resultados comparándolos con los obtenidos en estudio previo. Método: Estudio transversal realizado entre febrero y diciembre de 2015 en la consulta externa de farmacia de un hospital comarcal. Para evaluar el grado de satisfacción se utilizó una encuesta validada con 19 preguntas. Resultados: Se recogieron 386 encuestas. El 97,67 % de los pacientes se mostró satisfecho o muy satisfecho de forma global con la consulta de farmacia de pacientes externos. El espacio físico y la organización obtuvieron la valoración más baja. Conclusión: El nivel de satisfacción general obtenido en nuestro estudio fue muy alto. Es importante conocer la percepción del paciente para identificar oportunidades de mejora y aumentar la calidad del servicio prestado. Palabras clave: satisfacción del paciente, encuesta, unidad de atención farmacéutica a pacientes externos. 76 Artículo original
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
ABSTRACT Background: Patient´s satisfaction is a reflection of the type and quality of care provided by health professionals. Patient satisfaction survey is considered a quality standard for evaluating the results of the health care process. Objective: The aims of this study were to determine the level of patient satisfaction with the service provided in our Outpatient Pharmacy Unit, spot possible improving actions and to analyze the results comparing them with those obtained in previous study. Method: Cross-sectional study carried out from February to December 2015 in the Pharmacy Outpatient Unit of a 256-bed regional hospital. To evaluate patient satisfaction, we used a validated survey with 19 questions. Results: 386 surveys were collected. 97.67 % patients were satisfied or very satisfied overall with the Outpatient Pharmacy Unit. The physical space and the organization obtained the lowest valuation. Conclusion: Overall satisfaction was very high. It is important to know patient perception to identify opportunities for improvement and increase the quality of the service provided. Keywords: satisfaction patient, survey, outpatient pharmacy unit. INTRODUCCIÓN
La encuesta de satisfacción al paciente se
La satisfacción del paciente es un reflejo del
considera como un estándar de calidad para
tipo y calidad de la asistencia prestada por los
evaluar los resultados del proceso de atención
profesionales sanitarios, factores como la
médica [3]. La satisfacción del paciente es un
información recibida, la resolución de dudas, la
fenómeno subjetivo y está vinculado a las
atención personalizada y el tiempo dedicado en
expectativas del paciente, al estado de salud, las
consulta pueden ser predictores del grado de satisfacción
de
los
pacientes
preocupaciones,
las
necesidades
[1].
Las
y
las
características personales, entre otros por lo que es muy importante establecer y determinar el método de evaluación [4].
preferencias de los pacientes son componentes Aunque existen diferentes métodos disponibles
críticos de la calidad, por lo tanto, es necesario
para medir la satisfacción del paciente, la
medirlos para obtener una mejora continua de
encuesta se considera la práctica más útil para
la misma [2]. 77
Artículo original
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
obtener datos de satisfacción del paciente sobre
con los obtenidos en el mismo cuestionario
la calidad de la atención. La medición de la
realizado años antes [9].
satisfacción del paciente con la prestación del servicio, debe incluir no solo la actividad
METODOLOGÍA
clínica,
características
Estudio transversal realizado entre febrero y
estructurales y la organización de la unidad
diciembre de 2015 en la consulta externa de
(sala, calendario, recursos, etc.) [5]. Los
Farmacia (CEF) de un hospital comarcal de 256
profesionales sanitarios deben conocer y
camas. Se incluyeron en el estudio a todos
comprender el punto de vista del paciente para
aquellos pacientes que previamente habían
aumentar su satisfacción y mejorar la calidad de
recogido tratamiento en los tres meses
la atención sanitaria [6] con el objetivo de
anteriores al inicio del estudio. Para evaluar el
recopilar información sobre la percepción que
grado de satisfacción y poder comparar los
tiene el paciente en la atención que recibe [7].
datos con resultados anteriores, se utilizó el
sino
también
las
mismo cuestionario que se empleó en el trabajo
Los pacientes que se encuentran satisfechos con
realizado por Gimeno y col [9] en la misma
los servicios de atención médica tienen más
CEF. Se utilizó la encuesta validada de Ventura
probabilidades de continuar usando dichos
y col [5] (Anexo I) que consta de 19 cuestiones
servicios que aquellos que no lo están,
agrupadas en 4 áreas: A. Espacio físico,
manteniendo una relación más estrecha con los
localización y organización de la CEF, que
profesionales y cumpliendo mejor con los
incluye 7 cuestiones; B. Dispensación, que
regímenes de atención [8].
incluye 5 cuestiones; C. Consulta farmacéutica, Aunque existen distintos estudios que miden la
evaluada con 6 cuestiones y D. Satisfacción
satisfacción de los pacientes en la atención que
global con la unidad con una única cuestión.
ofrecen los servicios de farmacia hospitalaria,
Los pacientes podían expresar su percepción
muy pocos establecen áreas de mejora y comparan
sus
resultados
tras
sobre el nivel de servicio que la CEF les
su
brindaba indicando su acuerdo o desacuerdo en
implementación.
una escala de 5 puntos. Además, en el apartado
El objetivo de este estudio fue determinar el
C se incluyó una pregunta para conocer si el
nivel de satisfacción del paciente con el servicio
paciente había tenido o no consulta con el
prestado
farmacia
farmacéutico. Debido a las características de los
hospitalaria, detectar posibles acciones de
pacientes que suelen acudir a la CEF, las
mejora y analizar los resultados comparándolos
encuestas fueron traducidas a distintos idiomas
en
una
consulta
de
78 Artículo original
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
(inglés, francés, rumano, árabe y ruso).
RESULTADOS Se seleccionaron 988 pacientes que cumplían
El cuestionario se entregó a los pacientes
criterios de inclusión para participar en el
cuando acudieron a la CEF a retirar su
estudio. Se repartieron cuestionarios a 598
medicación. Se les ofreció la posibilidad de
pacientes (60,5%), de los cuales 386 (64,5%)
rellenarlas en la misma CEF o en su domicilio,
los devolvieron debidamente cumplimentadas.
pero siempre manteniendo la confidencialidad
Hubo 19 pacientes que se negaron a realizarla.
y el anonimato. Las encuestas rellenadas en la CEF no se hicieron bajo la presencia del
La
farmacéutico. Las encuestas se realizaron de
demográficas de la población que participó en
forma voluntaria y los pacientes recibieron
el estudio.
información
En la CEF la mayoría de pacientes que acuden
oral
cumplimentación.
para Solo
se
su
correcta
permitió
una
tabla
1
recoge
las
características
son hombres (66,2%) y la principal patología
encuesta por paciente.
atendida es VIH (40,3%). Existe también un
Los datos recopilados de cada grupo se
alto porcentaje de población
analizaron según los datos demográficos (sexo,
(33,2%). Consideramos que los resultados de la
edad, tiempo transcurrido desde que el paciente
encuesta son representativos de todos los
recoge
de
pacientes atendidos en la CEF ya que no se
tratamiento) y según programa de dispensación.
encontró diferencias en las características
Para obtener un grupo homogéneo, los datos se
iniciales entre los pacientes que respondieron la
distribuyeron en dos grupos cuando el análisis
encuesta y los que no la contestaron.
se realizó en función de la edad (<41 años y >
En la tabla 2, se muestran los resultados de cada
41 años)
grupo de preguntas y su comparación con los
Se realizó un análisis descriptivo de las
datos obtenidos en 2010.
variables demográficas (sexo, edad, tiempo de
El espacio físico y la organización obtuvieron
tratamiento recogido
por el paciente y
la valoración más baja. Dentro de este apartado,
tratamiento del tiempo). Se realizó análisis
la opinión acerca del mobiliario fue la que
estadístico mediante ANOVA. Los resultados
obtuvo la consideración más baja, aunque solo
del análisis se obtuvieron utilizando SPSS
el 6% de los pacientes estimó que el mobiliario
V.17.
era incómodo o muy incómodo
el
tratamiento
y el
tiempo
79 Artículo original
inmigrante
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
Tabla 1. Características demográficas basales de los pacientes. Sexo
n 245 139 2
% 63,47% 36,01% 0,52%
Hombres Mujeres No contesta Grupo de edad Menos de 18 años 6 1,55% De 19 a 40 años 119 30,83% De 41 a 65 años 216 55,96% Más de 65 años 40 10,36% No contesta 5 1,30% ¿Desde cuándo acude a por su tratamiento a la consulta/servicio de Farmacia? Es la primera vez 17 4,40% Menos de 1 año 59 15,28% Entre 1 y 3 años 85 22,02% Entre 3 y 5 años 79 20,47% Más de 5 años 144 37,31% No contesta 2 0,52% ¿Cuánto tiempo hace que toma tratamiento? Es la primera vez 15 3,89% Menos de 1 año 57 14,77% Entre 1 y 3 años 76 19,69% Entre 3 y 5 años 76 19,69% Más de 5 años 160 41,45% No contesta 2 0,52% Programa de dispensación Virus Inmunodeficiencia Humana (VIH) 175 45,34% Terapia biológica 78 20,21% Virus Hepatitis B (VHB) 55 14,25% Resolución 403 21 5,44% Bronquiestasias graves 21 5,44% Virus Hepatitis C (VHC) 12 3,11% Coinfección VIH-VHC 7 1,81% Síndrome de Sjogren 5 1,30% Dato no disponible 5 1,30% Otros 7 1,81%
80 Artículo original
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
Tabla 2. Resultados de la encuesta y comparación con datos obtenidos en 2010.
Ítem
A. Espacio físico y organización
B. Proceso de dispensación
C. Consulta con el farmacéutico
D. Grado de satisfacción global
( 7 preguntas)
( 5 preguntas)
( 7 preguntas)
( 1 pregunta)
Media ± DS 2010
2015
Ítem
Media ± DS 2010
2015
Ítem
Media ± DS 2010
2010
2015
4,56 ± 0,61
4,54 ± 0,52
4,56 ± 0,61
4,54 ± 0,52
1
4,16 ± 0,97
4,32 ± 0,76
6
4,18 ± 0,76
4,24 ± 0,61
11
si 79%
si 76,7%
2,1
3,87 ± 0,8
3,94 ± 0,77
7
4,2 ± 0,86
4,30 ± 0,66
12
4,39 ± 0,69
4,41 ± 0,59
2,2
3,88 ± 0,77
3,81 ± 0,80
8
3,9 ± 1,27
3,99 ± 1,10
13
4,66 ± 0,57
4,59 ± 0,55
2,3
4,18 ± 0,62
4,12 ± 0,65
9
4,38 ± 0,66
4,48 ± 0,59
14
4,62 ± 0,54
4,55 ± 0,55
3
4,12 ± 0,87
4,25 ± 0,73
10
4,35 ± 0,79
4,43 ± 0,65
15
4,69 ± 0,67
4,67 ± 0,60
4
4,07 ± 0,84
4,11 ± 0,82
16
4,69 ± 0,67
4,74 ± 0,51
5
3,68 ± 0,96
3,89 ± 0,84
17
4,57 ± 0,62
4,59 ± 0,57
Total
3,99 ± 0,5
4,06 ± 0,52
Total
4,60 ± 0,46
4,59 ± 0,57
Total
4,21 ± 0,57
4,29 ± 0,59
81 Artículo original
Media ± DS
2015
Total
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
Analizando el proceso de dispensación, cerca
consulta con el farmacéutico, el proceso de
del 75% de los pacientes consideraron que la
dispensación y la valoración global del espacio
fecha programada para volver a la CEF se
físico y la organización.
adaptaba a otras visitas programadas en el
En cuanto al apartado de las observaciones
hospital. Acerca de la confidencialidad, más del
efectuadas por los pacientes, 67 pacientes
95% de los pacientes consideró que era
(17,35 %) dejaron constancia de algún
adecuada o muy adecuada.
comentario, entre los cuales 35 (52,24 %) eran
Observamos que el 96,37 % de los pacientes
de agradecimiento sobre el trato recibido,
opinaba que el farmacéutico tenía una alta
refiriendo que todo les parecía correcto, 8
competencia profesional: el 94,82 % respondió
pacientes (11,94 %) solicitaban dispensaciones
que siempre o a menudo recibía información
de mayor cantidad de medicación, 5 pacientes
sobre un uso seguro de los medicamentos y
(7, 46 %) reclamaron una mejor ubicación de la
todas las dudas sobre las medicinas que
consulta y 4 pacientes (5, 97 %) solicitaban
tomaban habían sido aclaradas, y el 95,85 %
ampliación del horario de la CEF.
obtuvo toda la información necesaria sobre su tratamiento. El 95,20 % de pacientes consideró
DISCUSIÓN
que el farmacéutico era útil o muy útil para su
En España la atención farmacéutica a pacientes
estado de salud.
externos se basa en un modelo estratificado por
El 97,67 % de los pacientes se mostró
riesgo, lo que facilita la optimización de
satisfecho o muy satisfecho de forma global con
recursos y el desarrollo de la intervención más
la consulta de farmacia de pacientes externos.
adecuada para cada uno de los niveles
Respecto al análisis por subgrupos, en la tabla
establecidos [10]. La integración de los
3 se observa que no hubo diferencias
farmacéuticos
significativas en cuanto al grado de satisfacción
multidisciplinario, el desarrollo de la farmacia
global entre hombres y mujeres. Los pacientes
clínica y la creación de las CEF han hecho
menores de 41 años que llevaban recogiendo
posible que los farmacéuticos tengan mayor
tratamiento entre 3 y 5 años son los que
contacto tanto con los pacientes hospitalizados
presentaron mayor índice de satisfacción. Los
como con los pacientes ambulatorios, por lo que
pacientes pertenecientes al programa de VHB
es fundamental conocer y entender el punto de
se mostraron más satisfechos en cuanto a la
vista de los pacientes.
82 Artículo original
en
el
equipo
clínico
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
Tabla 3. Análisis de subgrupos en función de las características demográficas basales A. Espacio físico y
B. Proceso de
C. Consulta con el
D. Grado de
organización
dispensación
farmacéutico
satisfacción global
( 7 preguntas)
(5 preguntas)
( 7 preguntas)
(1 preguntas)
Media ± DS
Media ± DS
Media ± DS
Media ± DS
- Hombre
4,05 ± 0,78
4,26 ± 0,75
4,58 ± 0,59
4,51 ± 0,52
- Mujer
4,07 ± 0,79
4,32 ± 0,77
4,60 ± 0,54
4,52 ± 0,51
- < 41 años
4,05 ± 0,81
4,30 ± 0,76
4,60 ± 0,56
4,58 ± 0 ,51
- ≥ 41 años
4,06 ± 0,77
4,28 ± 0,76
4,59 ± 0,58
4,51 ± 0,52
- < 1 año
4,04 ± 0,81
4,33 ± 0,75
4,58 ± 0,57
4,52 ± 0,50
- 1-3 años
4,06 ± 0,78
4,26 ± 0,78
4,62 ± 0,60
4,54 ± 0,52
- 3-5 años
4,07 ± 0,76
4,30 ± 0,73
4,63 ± 0,56
4,64 ± 0,48
- > 5 años
4,06 ± 0,78
4,25 ± 0,77
4,55 ± 0,57
4,47 ± 0,54
- < 1 año
4,07 ± 0,80
4,34 ± 0,74
4,60 ± 0,54
4,52 ± 0,50
- 1-3 años
4,09 ± 0,78
4,28 ± 0,78
4,61 ± 0,61
4,55 ± 0,52
- 3-5 años
4,05 ± 0,76
4,31 ± 0,72
4,61 ± 0,57
4,63 ± 0,48
- > 5 años
4,05 ± 0,78
4,25 ± 0,78
4,56 ± 0,57
4,48 ± 0,53
- VIH
4,06 ± 0,84
4,28 ± 0,78
4,60 ± 0,58
4,53 ± 0,52
- VHB
4,21 ± 0,77
4,41 ± 0,67
4,63 ± 0,60
4,64 ± 0,52
- Terapia biológica
4,01 ± 0,71
4,22 ± 0,79
4,56 ± 0,57
4,54 ± 0,50
Sexo
Edad
Tiempo recogiendo medicación en CEF
Tiempo en tratamiento
Programa
En nuestro estudio, realizamos una encuesta de
pacientes que acudieron a la CEF. No se
satisfacción
observaron
diferencias
previamente por otros autores [5,9], lo que
demográficas
entre
aumentó el valor de los resultados obtenidos.
completaron la encuesta, los pacientes que no la
La confidencialidad y la libertad de datos
devolvieron y los pacientes que en general
estuvieron garantizados. Las encuestas se
acudieron a la CEF.
distribuyeron de forma sistemática entre los
Este
validada
que
fue
empleada
83 Artículo original
trabajo
se
los
puede
características pacientes
considerar
que
una
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
continuación del publicado por Gimeno y col,
estuvo relacionado con la habitación y la
ya que se realizó en el mismo escenario, con el
organización (sala de espera y mobiliario,
mismo cuestionario. En el trabajo de Gimeno la
horario,
puntuación más baja se obtuvo en el apartado
satisfacción alcanzado fue mayor que el valor
referente al tiempo que debe esperar el paciente
medio establecido como "indiferente", lo que
hasta que es atendido. Como área de mejora se
significaba
desdobló la CEF, para que un técnico (o un
satisfechos. Estos aspectos también han sido
residente de Farmacia si se encuentra en su
descritos como elementos de mejora por otros
periodo de rotación por CEF) pudiera realizar
autores que han realizado encuestas de
dispensaciones de continuación de tratamiento
satisfacción de pacientes ambulatorios [7,11].
y así poder disminuir el tiempo de espera (en
Otro aspecto que debe ser considerado es la
casos de inicio, cambios o dudas acerca del
identificación del farmacéutico, ya que el
tratamiento,
el
23,3% de los pacientes que realizaron la
farmacéutico responsable de la CEF). Los
encuesta contestaron que no reconocieron al
resultados obtenidos en este apartado muestran
farmacéutico como la persona que les había
un aumento en el grado de satisfacción respecto
atendido. Este resultado es similar al obtenido
al trabajo anterior, por lo que consideramos que
por Gimeno y col [9], donde se estableció como
la mejora realizada tuvo un impacto positivo.
acción
El nivel de satisfacción general obtenido en
farmacéutico en la primera reunión con el
nuestro estudio fue muy alto. Destaca el alto
paciente. Todos los pacientes son atendidos en
nivel de satisfacción de los pacientes con
su primera visita a la CEF por el farmacéutico
respecto a cada pregunta y, especialmente,
el cual siempre se identifica al inicio de la
aquellos relacionados con el trato directo con el
entrevista por lo que consideramos que el
farmacéutico. Varios estudios demostraron que
porcentaje de pacientes que no reconocen la
la accesibilidad, la capacidad de respuesta, la
figura del farmacéutico es debido a las
comunicación informada por el paciente, las
características basales de nuestra población con
habilidades de comunicación profesional, la
alto porcentaje de población inmigrante que
cortesía y la amabilidad, y las intervenciones
presentan barrera idiomática.
efectivas son la base de la satisfacción del
De las sugerencias obtenidas en la encuesta,
paciente [11,12].
destacamos las peticiones de ampliación del
En nuestro estudio, el ítem peor evaluado
horario de la consulta y la colocación de señales
la
atención
la
realiza
84 Artículo original
tiempo
de
que
perdido).
los
mejora,
El
pacientes
la
nivel
de
estaban
presentación
del
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
luminosas para indicar si la consulta estaba
cada grupo.
ocupada o libre por lo que se establecieron como acciones de mejora. Se ha ampliado en
CONCLUSIÓN
una hora semanal el horario de la consulta y se
El estudio del nivel de satisfacción del paciente
han colocado sobre la puerta de entrada a la
nos permite detectar debilidades en el proceso
consulta indicadores luminosos (luz verde-
de
consulta vacía; luz roja- consulta ocupada) para
oportunidades de mejora para aumentar la
tener informados a los pacientes que se
percepción del paciente sobre la calidad del
encuentran en la sala de espera y evitar
servicio prestado.
atención
al
paciente
e
identificar
interrupciones durante el acto de dispensación. La satisfacción del paciente se relaciona con la
CONFLICTO DE INTERESES
adherencia al tratamiento y también con la
Ninguno de los autores presenta conflicto de
mejora del estado de salud y la calidad de vida
intereses, ni se ha recibido financiación para su
del paciente. En nuestro estudio, no pudimos
realización.
evaluar este ítem porque no se recopilaron datos clínicos, pero el 96% de los pacientes manifestó
REFERENCIAS
que el farmacéutico era útil o muy útil para su
[1]. Martínez-López-de-Castro N., Álvarez-
estado de salud.
Payero M, Martín-Vila A., Samartín-Ucha M.,
La limitación del estudio fue que no se
Iglesias-Neiro P., Gayoso-Rey M., Feijoo-
recopilaron datos de países o nivel cultural, por
Meléndez D., et al. Factors associated with
lo que no pudimos conocer el nivel de
patient satisfaction in an outpatient hospital
satisfacción del paciente de estos subgrupos.
pharmacy. Eur J Hosp Pharm. 2018; 25(4):183-
Los resultados obtenidos muestran que los
188.
pacientes están muy satisfechos con la atención
[2]. Granado de la Orden S., Rodríguez Rieiro
farmacéutica recibida. Sus sugerencias nos han
C., Olmedo Lucerón MdC., Chacón García A.,
permitido mejorar la calidad de nuestros
Vigil Escribano D., Rodríguez Pérez P. Diseño
servicios. Sería importante conocer el nivel de
y validación de un cuestionario para evaluar la
satisfacción de los grupos de personas
satisfacción de los pacientes atendidos en las
dependiendo de la raza, país y nivel cultural,
consultas externas de un hospital de Madrid en
para poder ofrecer una mejor atención y
2006. Rev. Esp. Salud Pública 2007; 81: 637-
considerar las necesidades y expectativas de
645. 85
Artículo original
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
[3]. Braña-Marcosa B., Carrera-Martínez D., de
M., Machí Ribes JJ., Sánchez Ulayar A., Ramió
la Villa-Santoveña M., Avanzas-Fernández S.,
Montero E., Fernández Martí E., et al. Estudio
Gracia-Corbato
E.
multicéntrico de satisfacción de los pacientes en
Análisis de satisfacción en mujeres con reciente
dispensación ambulatoria. Aten Farm 2012; 14:
diagnóstico de cáncer de mama. Estudio
152-9.
multicéntrico en Servicios de Oncología. Rev
[9]. Gimeno Jordá MJ., Canto Mangana J.,
Calid Asist 2011; 26: 306-14.
Martínez de la Plata JE., Verdejo Reche F.,
[4]. Ruiz Moral R., Alba Dios A., Jiménez
Morales Molina JA., Acosta Robles P.
García C., González Neubauer V., García
Evaluation of patient satisfaction in outpatient
Torrea M. Pérula de Torres LA., et al.
pharmacy unit. Eur J Clin Pharm 2013; 15(6):
Percepción de los pacientes sobre la atención
397-405.
recibida por el personal no sanitario en los
[10]. Morillo-Verdugo R, Robustillo-Cortés
centros de salud. Rev Calid Asist 2011; 26:97-
MA, Manzano García M, Almeida-González
103.
CV. Influence of pharmacist intervention,
[5]. Ventura Cerdá JM., Sanfélix Gimeno G.,
based on CMO model, to improve activation in
Monte Boquet E., Fernández Villalba EM.,
HIV patients. Rev Esp Quimioter. 2019;
Alós Almiñana M. Satisfacción percibida por
32(1):40-49.
pacientes infectados por el VIH con la unidad
[11]. Márquez Peiró JF., Pérez Peiró C.
de atención farmacéutica a pacientes externos
Evaluación
(UFPE). Farm Hosp 2005; 29: 134-9.
insatisfacción de pacientes atendidos en la
[6]. Montero A., Feal B., Calvin M., Margusino
unidad farmacéutica a pacientes externos. Farm
L., Hurtado JL., Vázquez I., et al. Calidad
Hosp 2008; 32: 71-6.
percibida por los pacientes externos en la
[12]. Antón Torres., Murcia López A., Borrás
consulta de atención farmacéutica del servicio
Blasco J., Navarro Gracia JF., Navarro Ruiz A.,
de farmacia. Farm Hosp 2006; 30 105-11.
González Delgado M. Evaluación de la calidad
[7]. Díaz R. Satisfacción del paciente: principal
percibida por los usuarios de una unidad de
motor y centro de los servicios sanitarios. Rev
atención farmacéutica a pacientes externos.
Calid Asist 2002; 17:22-9.
Farm Hosp 2006; 30: 99-104.
M.,
Vegas-Pardavila
[8]. González Valdivieso J., González Navarro
86 Artículo original
d
la
satisfacción
y
de
la
AyTBUAP 6(22):76-88 Urda Romacho et al., 2021
ANEXO I. Cuestionario de satisfacción con la unidad de atención farmacéutica a pacientes externos.
ENCUESTA DE SATISFACCIÓN Estamos interesados en conocer su opinión acerca de la calidad de la atención que se le ofrece desde la unidad de atención farmacéutica a pacientes externos (UFPE) del servicio de farmacia. Para ello solicitamos su colaboración con esta encuesta, que será de gran utilidad para mejorar día a día. SU PARTICIPACIÓN ES VOLUNTARIA Y ANÓNIMA Por favor, marque la casilla que más se identifique con su opinión. Marque sólo una casilla en cada enunciado. A. ESPACIO FÍSICO Y ORGANIZACIÓN de la unidad de pacientes externos 1. Respecto a la localización y facilidad de acceso a la unidad de pacientes externos, le parece (ORG1): ❐ Muy buena (5) ❐ Buena (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Mala (2) ❐ Muy mala (1) 2. En cuanto a la sala de espera, cuál es su opinión acerca de (ORG2, ORG3, ORG4): Espacio: ❐ Amplio (5) ❐ Suficiente (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Insuficiente (2) ❐ Muy insuficiente (1) Mobiliario: ❐ Muy cómodo (5) ❐ Cómodo (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Incómodo (2) ❐ Muy incómodo (1) Temperatura: ❐ Muy adecuada (5) ❐ Adecuada (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Inadecuada (2) ❐ Muy inadecuada (1) 3. El horario de atención le resulta (ORG5): ❐ Muy adecuado (5) ❐ Suficiente (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Insuficiente (2) ❐ Muy insuficiente (1) 4. Cuándo ha necesitado contactar con el personal de la unidad de pacientes externos (personalmente, por teléfono, etc.), le ha resultado (ORG6): ❐ Muy fácil (5) ❐ Fácil (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Difícil (2) ❐ Muy difícil (1) 5. Hasta que se le atiende, el tiempo que debe esperar le parece (ORG7): ❐ Muy corto (5) ❐ Corto (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Excesivo (2) ❐ Muy excesivo (1)
B. EN CUANTO AL PROCESO DE DISPENSACIÓN Cuando se le atiende, el tiempo que se tarda habitualmente en realizar su dispensación le parece (DIS1): ❐ Muy rápido (5) ❐ Rápido (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Lento (2) ❐ Muy lento (1) La cantidad de medicación que se le dispensa le parece (DIS2): ❐ Muy adecuada (5) ❐ Adecuada (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Inadecuada (2) ❐ Muy inadecuada (1) La fecha que se le programa para volver, ¿se adapta a otras visitas programadas en el hospital (visita con el médico, analíticas, etc. (DIS3)? ❐ Siempre (5) ❐ A menudo (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Casi nunca (2) ❐ Nunca (1) Las condiciones de confidencialidad mientras se le dispensa su medicación son (DIS4): ❐ Muy adecuadas (5) ❐ Adecuadas (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Inadecuadas (2) ❐ Muy inadecuadas (1) El modo en que se le entrega la medicación (bolsas, etc.) le resulta (DIS5): ❐ Muy adecuado (5) ❐ Adecuado (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Inadecuado (2) ❐ Muy inadecuado (1)
C. RESPECTO A LA CONSULTA CON EL FARMACÉUTICO/A ¿Ha tenido consulta con el farmacéutico/a? ❐ Sí ❐ No Accesibilidad del farmacéutico/a (FAR1): ❐ Muy accesible (5) ❐ Accesible (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Poco accesible (2) ❐ Inaccesible (1)
87 Artículo original
AyTBUAP 6(22):76-88 Cortesía del trato (FAR2): Urda Romacho et al., 2021 ❐ Muy agradable (5) ❐ Agradable (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Desagradable (2) ❐ Muy desagradable (1) Competencia profesional (FAR3): ❐ Muy competente (5) ❐ Competente (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Incompetente (2) ❐ Muy incompetente (1) El farmacéutico/a me informa sobre el correcto uso de los medicamentos y me aclara todas las dudas acerca de las medicinas que tomo (FAR4): ❐ Siempre (5) ❐ A menudo (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Casi nunca (2) ❐ Nunca (1) Recibo toda la información que necesito sobre mi tratamiento (FAR5): ❐ Siempre (5) ❐ A menudo (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Casi nunca (2) ❐ Nunca (1) Para mi estado de salud en líneas generales, el farmacéutico/a me resulta (FAR5): ❐ Muy útil (5) ❐ Útil (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Poco útil (2) ❐ Nada útil (1)
D. DE FORMA GLOBAL, indique su GRADO DE SATISFACCIÓN con la unidad de pacientes externos (GLOBAL) ❐ Muy satisfecho/a (5) ❐ Satisfecho/a (4) ❐ Indiferente (3) ❐ Insatisfecho/a (2) ❐ Muy insatisfecho/a (1) Finalmente, indíquenos cualquier comentario o sugerencia que pueda repercutir en la mejora de su satisfacción respecto a la unidad de pacientes externos:
¡MUCHAS GRACIAS POR SU COLABORACIÓN!
88 Artículo original
INSTRUCCIONES A LOS AUTORES ENVÍO DE MANUSCRITO Los manuscritos deben ser enviados por uno de los autores. El autor correspondiente deberá enviar el manuscrito junto con una carta de Derechos de Autor firmada por los autores del trabajo, en la que se haga constar que se trata de un artículo original, no publicado con anterioridad, ni puesta a consideración de manera simultánea en otra revista. Los artículos deben enviarse por correo electrónico a la atención de: Dr. Martín Pérez Santos Director de la revista Alianzas y Tendencias: alianzasytendencias@correo.buap.mx con copia a Dr. Jesús Muñoz-Rojas Subdirector de la revista Alianzas y
tendencias
joymerre@hotmail.com LONGITUD DEL MANUSCRITO Artículo de Investigación: deberan contener entre 4000-8000 palabras, excluyendo figuras y tablas. Revisiones: deberán contener entre 800040000 palabras, excluyendo figuras y tablas. PREPARACIÓN DEL MANUSCRITO El manuscrito debe ser escrito en español en un estilo claro, directo y activo. Todas las páginas deben numerarse secuencialmente para facilitar una revisión y edición del manuscrito. SECCIONES DEL MANUSCRITO El manuscrito debe ser dividido en siguientes secciones:
1.
las
Carta de Derechos de Autor
Es obligatorio presentar, junto con el manuscrito, una carta de derechos de autor firmada por el autor correspondiente en la que se declare: a) potencial interés de conflicto, b) reconocimiento de las contribuciones de los autores, c) reconocimiento de los organismos de financiación, y d) certificación de que el manuscrito se preparó de acuerdo con las "Instrucciones para Autores".
2.
Título
El título del manuscrito debe ser preciso y breve y no contener más de 120 carácteres. Los autores deben evitar el uso de abreviaciones no estandarizadas.
3.
Nombres y afiliaciones de los autores
4.
Resumen estructurado
5.
Palabras clave
6.
Organización del texto
Los nombres de los autores deben proporcionarse de acuerdo a previas citaciones o como los autores deseen que se publique, junto con su afiliación institucional, dirección postal, y dirección de correo electrónico. Debe proporcionarse un resumen, en español e inglés, el cual debe ser claro, conciso, sin tener más de 250 palabras, e incluir los subencabezados explicítos. Se debe evitar el uso de abreviaturas, así como referencias. Idealmente, cada resumen debe incluir los siguientes subencabezados: antecedentes, objetivo, métodos, resultados y discusión. Los autores deben proporcionar palabras clave en orden alfabético.
hasta
6
El texto principal debe iniciar en una página separada y debe estar dividida en página de título, resumen, y texto principal. El texto puede ser subdividido de acuerdo a las áreas a discutirse, las cuales deben seguirse de las secciones de Agradecimientos y Referencias. Los artículos de revisión deben mencionar cualquier revisión previa, reciente o antigua en el área y contener una discusión comprensiva iniciando con los antecedentes del área. Los autores deben evitar presentar material el cual haya sido publicado en revisiones previas. Se recomienda a los autores que comenten y discutan sus observaciones en una forma breve. Para los artículos de investigación, el manuscrito debe iniciar con una página de título y resumen seguido por el texto
principal, el cual debe estructurarse en secciones separadas, tales como Introducción, Metodología, Resultados, Discusión, Conclusión, Conflicto de Interés, Agradecimientos y Referencias. El estilo del manuscrito debe ser uniforme a través de todo el texto y debe utilizarse un tipo de letra de Times New Roman, tamaño 10. El término completo para una abreviación debe preceder su primera aparición en el texto, a menos que está sea una unidad de medida estándar. Las itálicas deben usarse para nombre binominales de organismos (Género y Especie) para énfasis y para palabras o frases no familiares. Las palabras no- asimiladas del latín u otras lenguas deben también mostrarse en itálicas e.g., per se, in vivo, in vitro, in situ, versus, in silico, et al., i.e., etc. Simbolos y Unidades: Los simbolos griegos y carácteres especiales a menudo sufren cambios de formato y corrompen o se pierden durante la preparación del manuscrito para su publicación. Para asegurase de que todos los caracteres especiales están incrustados en el texto, dichos carácteres deben insertarse como un simbolo que no sea resultado de otro estilo de formato, de otra manera ellos se perderan durante la conversión al PDF. Para los parámetros deben utilizarse únicamente símbolos del ISO. Todas las clases de medidas deben reportarse solamente en el Sistema Internacional de Unidades. Dichas unidades deben escribirse siempre en Romano y separase del valor numérico por un espacio.
7.
Conclusión
Debe proporcionarse un pequeño párrafo que resuma el contenido del artículo, y que presente el resultado final de la investigación o proponga un estudio adicional sobre el tema.
8.
Conflicto de Interés
Las contribuciones financieras y cualquier potencial conflicto de interés debe ser establecido. Los autores deben listar las fuentes de financiamiento para el estudio.
9.
Agradecimientos
Debe agradecerse a cualquier (individuo/compañía/institución) que haya contribuido substancialmente al estudio para contenido intelectual, o haya estado involucrado en la redacción o revisión del manuscrito.
10. Referencias Las referencias deben ser numeradas secuencialmente (entre corchetes) en el texto y listadas en el mismo orden numérico. Todas las referencias deben ser completas y precisas. Las citas en línea deben incluir la fecha de acceso. Los títulos de las revistas deben ajustarse a las actuales abreviaturas de Index Medicus. Es necesario listar todos los autores si el número total de autores es 6 o menos, y para más de 6 autores utilizan 6 autores y luego et al. Los números de referencia deben estar finalizados y la bibliografía debe estar completamente formateada antes de la presentación del artículo. Las referencias deben ser listadas en el siguiente estilo de Vancouver: Revista: [1] Anaya-Ruiz M., Perez-Santos M. Innovation status of gene therapy for breast cancer. Asian Pac J Cancer Prev 2015; 16(9): 4133-6. Libro: [2] Minev BR. Cancer Management in Man: Chemotherapy, Biological Therapy, Hyperthermia and Supporting Measures. 1st ed. Springer: New York 2011. Capítulo de libro: [3] Khandia R, Sachan S, Munjal AK, Tiwari R, Dhama K. Tumor Homing Peptides: Promising Futuristic Hope for Cancer Therapy. In: Rahman A, Zaman K, Eds. Topics in AntiCancer Research. Bentham; 2016; 43- 86.
Memoria de Congreso: [4] Moran GW, Leslie F, McLaughlin JT. Gut hormones and appetite dysregulation in Crohn's disease. The Proceedings of the Nutrition
Society, Malnutrition Matters, Joint BAPEN and Nutrition Society Meeting, Harrogate, UK,
November 2-3, 2011. Resumen de Congreso: [5] Moss R, Bothos J, Filvaroff E, Merchant M, Eppler S, Yu W, et al. Phase Ib doseescalation study of MetMAb, a monovalent antagonist antibody to the receptor MET, in combination with bevacizumab in patients with locally advanced or metastatic solid tumors.
American Society of Clinical Oncology - 10th annual meeting, Chicago, USA (2010). Sitio Web: [6] Organogenesis company website. Available at: www.organogenesis.com/products/bioac tive_woundhealing/apligraf.html. (Accessed on: January 4, 2011).
Tesis: [7] Lindh MB. Mechanisms determining efficacy of tyrosine kinase-targeting anti- cancer drugs. PhD thesis, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, April 2011. Patente: [8] Cid-Monjaraz J, Reyes-Cortes JF. Motion control system for a direct drive robot through visual servoing. WO2016193781 (2016).
11. Tablas y Figuras Las tablas de datos y figuras deben enviarse en formato de Microsoft Word. Cada tabla y figura debe incluir un título que por si mismo explique los detalles incluidos en cada caso. Las tablas y figuras deben numerarse secuencialmente en Arábigo con el número de la tabla o figura en negrita seguida de un título. El título debe ser en minúsculas con la primera letra en mayúsculas. Las tablas y figuras deben insertarse al texto inmediato a su referencia en el texto.
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