Cromatografia Líquida Moderna: HPLC / CLAE

2ª Edição | Revisada e Ampliada

cromatografia líquida moderna H

P

L

C

|

C

Fernando M. Lanças

L

A

E

DIRETOR GERAL Wilon Mazalla Jr. COORDENAÇÃO EDITORIAL Marídia R. Lima COORDENAÇÃO DE REVISÃO E COPYDESK Alice A. Gomes REVISÃO DE TEXTOS Paola Maria Felipe dos Anjos EDITORAÇÃO ELETRÔNICA Fabio Diego da Silva Patrícia Lagoeiro CAPA Patrícia Lagoeiro Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) (Câmara Brasileira do Livro, SP, Brasil) Lanças, Fernando M. Cromatografia líquida moderna : HPLC/CLAE / Fernando M. Lanças. - - Campinas, SP: Editora Átomo, 2016. 2ª Edição 1. Cromatografia líquida I. Título.

09-04396

CDD-543.0894

Índices para catálogo sistemático: 1. Cromatografia líquida moderna HPLC/CLAE : Química analítica 543.0894 ISBN 978-85-7670-269-6 Todos os direitos reservados ao

Grupo Átomo e Alínea Rua Tiradentes, 1053 - Guanabara - Campinas-SP CEP 13023-191 - PABX: (19) 3232.9340 e 3232.0047 www.atomoealinea.com.br Impresso no Brasil

CONSELHO EDITORIAL Área | Química Aécio Pereira Chagas Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP

Célio Pasquini Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP

Flávio Leite T & E Analítica

José de Alencar Simoni Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP

Mário Sérgio Galhiane Universidade Estadual Paulista – UNESP

Pedro Faria Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP

Robson Fernandes de Farias Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN

Sumário

Apresentação.................................................................................................................9 Capítulo 1 Introdução...................................................................................................................13 Classificação das técnicas cromatográficas...........................................................14 O processo de separação.......................................................................................20 Contrastes entre cromatografia líquida clássica e moderna..................................22 A literatura básica da LC.......................................................................................32 Capítulo 2 Fundamentos da Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE): a teoria dos pratos e o alargamento das bandas em LC..............................................39 Introdução..............................................................................................................39 Número de pratos teóricos (N) e altura equivalente a um prato teórico (H).........40 Processos de difusão e transferência de massa em cromatografia........................42 Nomenclatura, definições e cálculos.....................................................................53 Capítulo 3 Instrumentação............................................................................................................63 Introdução..............................................................................................................63 Reservatório do solvente.......................................................................................65 Bombas..................................................................................................................66 Gradiente de eluição..............................................................................................77 Monitoramento da pressão....................................................................................84 Sistemas de introdução da amostra (injetores)......................................................84

Colunas e termostatos............................................................................................87 Detectores..............................................................................................................89 Sistema de dados...................................................................................................90 Precauções.............................................................................................................90 Capítulo 4 Detectores...................................................................................................................93 Introdução..............................................................................................................93 Principais características e propriedades dos detectores empregados em LC.......94 Detectores baseados no índice de refração..........................................................100 Detectores baseados no espalhamento de luz......................................................106 Detectores baseados na absorção de luz UV-VIS...............................................108 Detectores baseados no fenômeno da fluorescência...........................................116 Detectores eletroquímicos...................................................................................118 Detecção baseada em espectrometria de massas.................................................119 Comparação entre as características dos principais detectores...........................124 Capítulo 5 A Coluna...................................................................................................................131 Introdução............................................................................................................131 A escolha do tubo................................................................................................132 Dimensões da coluna...........................................................................................136 Tamanho e forma das partículas de fase estacionária.........................................138 Partículas ou monolitos?.....................................................................................140 Sílica-gel (silgel) ou sol-gel?...............................................................................141 Escolha das características da coluna em função do tipo de aplicação...............142 Empacotamento das colunas de LC....................................................................154 Avaliação, cuidados, manutenção e recuperação de colunas para LC................158 Capítulo 6 A Fase Estacionária...................................................................................................163 Introdução............................................................................................................163 Sílica-gel..............................................................................................................164 Fases quimicamente ligadas................................................................................166 Tipos de fases quimicamente ligadas..................................................................170 Novos suportes e fases estacionárias para LC.....................................................176 Capítulo 7 Cromatografia Líquida em Fase Normal..................................................................211 Introdução............................................................................................................211

Cromatografia líquida de adsorção.....................................................................212 Cromatografia de partição líquido-líquido..........................................................222 Cromatografia de partição em fase normal quimicamente ligada.......................224 Capítulo 8 Cromatografia Líquida em Fase Reversa..................................................................227 Introdução............................................................................................................227 Modos de operação..............................................................................................235 Capítulo 9 Cromatografia de Troca Iônica.................................................................................243 Cromatografia de íons.........................................................................................244 Capítulo 10 Cromatografia de Exclusão.......................................................................................249 Cromatografia de Exclusão por Tamanho...........................................................249 Capítulo 11 A Fase Móvel em Cromatografia Líquida................................................................261 Solventes para cromatografia em fase normal....................................................262 Solventes para cromatografia em fase reversa....................................................264 Solventes para cromatografia de troca iônica.....................................................267 Solventes para cromatografia de pares de íons...................................................270 Solventes para cromatografia de exclusão por tamanho.....................................271 Capítulo 12 Cromatografia Líquida com Interação Hidrofílica (HILIC).....................................273 Introdução............................................................................................................273 O que significa HILIC?.......................................................................................275 Mecanismos de separação em HILIC .................................................................276 Fases estacionárias utilizadas em HILIC ...........................................................278 Fases móveis utilizadas em HILIC .....................................................................283 Aplicações da HILIC...........................................................................................284 ERLIC ................................................................................................................285 Conclusões .........................................................................................................286 Capítulo 13 Validação em Cromatografia Líquida.......................................................................291 Introdução............................................................................................................291 Validação da metodologia...................................................................................298

Validação da instrumentação...............................................................................316 Adequação do sistema (system suitability)..........................................................320 Capítulo 14 Análise Qualitativa e Quantitativa............................................................................327 Introdução............................................................................................................327 Análise qualitativa...............................................................................................327 Análise quantitativa.............................................................................................337

Apresentação

A técnica hoje denominada Cromatografia foi sistematizada por Mikhael Tswett no início do século XX. Dentre os vários trabalhos que o cientista desenvolveu no período, dois deles, publicados em 1906, no volume 24 do Ber. Deut. Botan. Gesell., são considerados ‘marcos fundadores’ da cromatografia, apesar de registros anteriores a este descreverem experimentos em alguns aspectos similares aos relatados por Tswett. Passaram-se algumas décadas até que a cromatografia obtivesse uma aceitação ampla, e, durante esse período, pequenas modificações foram introduzidas na técnica.

Destacam-se os trabalhos de A. J. P. Martin que, com diferentes colaboradores e ao longo de mais de duas décadas dedicadas a novos desenvolvimentos na técnica, implementou a cromatografia de partição (que lhe daria o Prêmio Nobel em Química, juntamente com um dos colaboradores, Synge), além dos fundamentos da cromatografia em papel, da fase reversa, e da cromatografia gasosa.

Entretanto, até a implementação da cromatografia gasosa na década de 1950 por Martin e colaboradores, a cromatografia líquida continuou a ser praticada em colunas abertas ou superfícies planas como papel (cromatografia em papel), vidro ou metais (camada delgada). A cromatografia gasosa, em razão da natureza da fase móvel (um gás), exigiu a criação de um equipamento que contivesse forno para armazenar a coluna, injetor para introduzir amostras gasosas e um detector em linha (on-line) para o aprimoramento da análise qualitativa e quantitativa.

Desde então, em cromatografia líquida, várias tentativas foram feitas para o desenvolvimento do equivalente à cromatografia gasosa, porém usando­‑se um líquido como fase móvel. O desenvolvimento das colunas para

10

Cap. 1 • Apresentação

cromatografia gasosa e os estudos de Van Deemter, logo aprimorados por vários pesquisadores, demonstraram que a diminuição no tamanho das partículas era fundamental para o avanço da cromatografia – tanto líquida quanto gasosa.

Esforços empreendidos por vários grupos em diferentes países, notadamente na Europa (Áustria, Holanda, Alemanha e outros) conduziram ao desenvolvimento de partículas de sílica de tamanho inferior a 20 mícrons, bastante abaixo das utilizadas em cromatografia líquida ‘clássica’ (a praticada até então). O uso de partículas menores, mais uniformes e mais reprodutíveis trazia um novo problema que não ocorria em cromatografia gasosa: um aumento muito grande da pressão em relação à até então utilizada em cromatografia (ambiente ou pouco acima dela). Para conseguir empurrar a fase móvel através de uma coluna que contenha partículas pequenas (na época 20 mícrons) foi necessário o desenvolvimento de bombas de pressurização adequadas, além de um novo sistema de introdução da amostra por meio de válvulas de alta pressão e de detectores em linha cujas celas suportassem as condições experimentais então praticadas.

Apesar de vários grupos haverem contribuído para tal desenvolvimento, destacam-se J. Huber na Áustria, J. Kirkland e Horvath dos Estados Unidos.

Para diferenciar o novo sistema instrumental do clássico, que empregava apenas colunas abertas de vidro que operavam à pressão ambiente, e considerando as elevadas pressões necessárias para empurrar a fase móvel nesse novo sistema, foi cunhada a expressão High Pressure Liquid Chromatography e a sigla HPLC. Em curto espaço de tempo, fases estacionárias confeccionadas com partículas menores que 20 mícrons foram desenvolvidas e as pressões começaram a aumentar acentuadamente em relação às utilizadas no início da técnica. Um novo nome, mantendo a sigla HPLC foi cunhado para descrever a nova situação: High Performance Liquid Chromatography. Nessa ocasião, o termo Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi proposto na língua portuguesa, considerando-se que a principal mudança da técnica foi o desenvolvimento de colunas mais eficientes, como na HPLC ou CLAE, e que o termo performance (desempenho, em português) não possui definição e uso em cromatografia. Na tentativa de propor um termo abrangente para o novo

Cromatografia Líquida Moderna

11

conceito, que não fosse suscetível a mudanças com novos desenvolvimentos, na década de 1970, Snyder propôs o termo Modern Liquid Chromagraphy, ou seja, Cromatografia Líquida Moderna. Esse nome pretende descrever a técnica instrumental desenvolvida em contraposição à cromatografia líquida clássica e não tem sentido temporal, ou seja, de moderna por ser contemporânea. É nesse sentido proposto por Snyder que o título deste livro é empregado.

A tradução de vários termos do inglês para o português foi evitada sempre que possível, porque existe, em nossa língua, uma quantidade grande de termos com várias traduções diferentes, o que causa mais confusões que esclarecimentos. Assim, o termo HPLC e outros foram mantidos, com ocasionais referências aos termos em português. A tradução de alguns termos seguiu a nomenclatura adotada há muito tempo na área. ‘Fluxo da fase móvel’ (mais utilizado por cromatografistas) é usado no lugar de ‘vazão’ (mais empregado por engenheiros); ‘empacotamento’ é usado no lugar de ‘recheio’, ‘empacotar’ em vez de ‘rechear’ etc. Sempre que o termo aparece, pelo menos na primeira vez, a equivalência é apresentada para dirimir dúvidas. A última edição da nomenclatura e simbologia da IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada) foi adotada ao longo do texto. Assim, utiliza-se k em vez de k’; ‘número de pratos’ em vez de ‘pratos teóricos’; H em vez de HETP etc.

A Cromatografia Líquida Moderna possui, atualmente, um alcance que ultrapassa, em muito, as barreiras da Química, com aplicações em áreas como alimentos, farmácia, bioquímica, engenharia em suas várias modalidades, biologia, meio ambiente, petroquímica e muitas outras. O autor espera que o presente trabalho possa trazer uma contribuição para o desenvolvimento destas e outras áreas no Brasil, agradecendo sugestões para correções e melhoramentos no livro.

O autor