MARCADORES TUMORALES by bacteriologia Lab clinico

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El diseño, esquema, modelo, ilustraciones, fotografías y las marcas contenidas en este material están protegidos por las leyes de Copyright o de Derechos de Autor, de los cuales es titular la ENTIDAD PROMOTORA DE SALUD ORGANISMO COOPERATIVO SALUDCOOP. Es distribuido de forma gratuita con el fin de capacitar internamente y orientar a los profesionales de la salud del Grupo SaludCoop. No está permitida la fijación, reproducción, transmisión y comunicación total o parcial de este documento, ni la difusión o publicación de su contenido por ningún medio electrónico, impreso, fotocopia u otro, sin el permiso previo y por escrito de SALUDCOOP EPS. En consecuencia, el usuario de la información asume toda responsabilidad y riesgo por el uso y aplicación de la misma. En ningún caso, SALUDCOOP EPS se responsabilizará por los daños materiales o inmateriales, directos o indirectos, o de cualquier otro tipo, que se deriven del uso de información no autorizada, o por la negligencia del usuario en el cumplimiento de las normas sobre Derechos de Autor.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES SALUS KEDOS N.7, ABRIL 2005 .Manual de capacitación interna que circula entre los profesionales del Grupo Saludcoop EPS. COMITE EDITORIAL Carlos Gustavo Palacino Antía, Ana María Piñeros Ricardo, Alberto Castro Cantillo, Patricia Guerra Morales, Maritza Pérez Borrero, María Antonina Román Ochoa.

DIRECTOR Alberto Castro Cantillo Vicepresidente Científico

DISEÑO GRÁFICO Y DIAGRAMACIÓN Lina Marcela Rojas Gutiérrez

DESARROLLO HeOn AVAL ACADEMICO Fundación Universitaria Juan N. Corpas

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EDITORIAL Política de Reducción de la Mortalidad Materna y Perinatal en SaludCoop EPS, Cruz Blanca EPS y Cafesalud EPS. Teniendo en cuenta el comportamiento de la mortalidad materna y perinatal en Colombia, en especial la situación relacionada con nuestras EPS y ARS, así como la misión de la Organización; la Presidencia Ejecutiva, las Vicepresidencias y su equipo, las Gerencias Regionales y su equipo y en general todos los colaboradores de SaludCoop EPS, Cruz Blanca EPS y Cafesalud EPS y ARS reconocen que:

la salud y la vida son derechos fundamentales e inalienables del ser humano tal como está expresado en la Constitución Política Colombiana,

la calidad de la atención de salud individual y colectiva es un valor y un principio de la prestación de nuestros servicios,

el enfoque y las acciones en promoción de la salud y prevención de la enfermedad son fundamentales para lograr las mejores condiciones de salud de nuestros usuarios,

la concepción de los derechos de salud sexual y reproductiva, los derechos humanos, la equidad social y de género y el empoderamiento de las mujeres son principios fundamentales en la prestación de los servicios, tal como lo expresa la política de salud sexual y reproductiva colombiana vigente,

existe un problema institucional de mortalidad materna que requiere ser intervenido de manera efectiva contribuyendo así a la reducción de este problema de salud pública nacional.

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Las mujeres tienen el derecho a condiciones que les permitan hacer posible que la gestación y el parto conduzcan a la mejor oportunidad de tener un niño saludable.

Por lo anterior, la Presidencia Ejecutiva resuelve: -

Adoptar la Política de Reducción de la Mortalidad Materna y Perinatal, la cual será de conocimiento y aplicación por parte de todos los funcionarios de SaludCoop EPS, Cruz Blanca EPS, Cafesalud EPS y ARS.

Dar atención preferencial a las mujeres embarazadas en todos los contactos que éstas tengan con la EPS, para lo cual todo el personal administrativo y asistencial de las EPS y de las Empresas Anexas que pueda llegar a tener contacto con gestantes en cualquier momento, deberá conocer y aplicar la Política para evitar demoras que puedan interferir en una adecuada y oportuna atención.

Adoptar el Sistema Informático Perinatal –SIP- del Centro Latinoamericano de Perinatología y Desarollo Humano de la OPS –CLAPcomo sistema único de información tanto de la Red de Corporaciones Regionales como de la Red Externa.

Reforzar la actual conformación de los Comités Regionales de Casos Centinela, garantizando la participación y cumplimiento del reglamento y funciones acogidas mediante la Política.

Continuar ofertando los servicios de Planificación Familiar, incluyendo el método de emergencia y haciendo especial énfasis en la población adolescente.

Fomentar el acompañamiento de las mujeres durante el trabajo de parto, medida que se implementará a partir de la fecha en las Clínicas de las Corporaciones Regionales que atiendan partos y que se concertará con las de la Red Externa.

Aumentar progresivamente la estancia hospitalaria de la puérpera y el recién nacido hasta lograr 24 horas de estancia posparto para

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parto normal y cesárea, garantizando las valoraciones y controles durante la hospitalización tanto a la materna como al recién nacido. -

Concertar con la red externa contratada para la atención de partos, la implementación de depósitos de sangre y definirlo como compromiso contractual.

Cordialmente,

CARLOS GUSTAVO PALACINO ANTIA

Presidente Ejecutivo

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AUTORES

María Mercedes Bravo Hernández. Microbióloga. M. Sc. Universidad de los Andes, Coordinadora Grupo de Investigación en Biología del Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología

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CONTENIDO

INTRODUCCION CLASIFICACIÓN DE LOS MARCADORES TUMORALES MARCADORES TISULARES MARCADORES CIRCULANTES MARCADORES GENÉTICOS

APLICACIONES CLÍNICAS DE LOS MARCADORES TUMORALES TAMIZAJE DIAGNÓSTICO PRONÓSTICO SEGUIMIENTO

MARCADORES TUMORALES CIRCULANTES DE MAYOR USO EN LA PRÁCTICA CLÍNICA ANTÍGENO CARCINOEMBRIONARIO CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS FACTORES QUE AFECTAN LAS CONCENTRACIONES SÉRICAS DEL CEA EN CÁNCER COLORECTAL Estadio tumoral Estado del hígado Grado tumoral Tabaquismo

CEA COMO MARCADOR EN CÁNCER COLORECTAL

Tamizaje Diagnóstico Pronóstico Seguimiento de los pacientes con cáncer colorectal diagnósticado

CEA COMO MARCADOR EN CÁNCER DE MAMA

GONADOTROPINA CORIÓNICA HUMANA (HCG)

CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS INMUNOANÁLISIS PARA DETERMINAR HCG Y MOLÉCULAS RELACIONADAS HCG EN ENFERMEDAD TROFOBLÁSTICA HCG EN TUMORES DE CÉLULA GERMINAL

11 14 14 14 14 16 16 17 18 18 20 20 20 22 22 23 23 23 23 23 24 24 25 26 26 26 30 31 32

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ALFAFETOPROTEÍNA AFP EN TUMORES DE CÉLULA GERMINAL AFP EN CARCINOMA HEPÁTICO

ANTÍGENO ESPECÍFICO DE PRÓSTATA CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS MECANISMOS REGULADORES DEL PSA FACTORES QUE AFECTAN LA EXPRESIÓN DEL PSA PSA COMO MARCADOR EN CÁNCER DE PRÓSTATA Diferentes formas de PSA en sangre como marcadores de diagnóstico y progresión Tamizaje Seguimiento Utilidad de PSA para definir estado libre de enfermedad PSA post prostatectomía radical Utilidad de PSA en enfermedad metastásica

RECEPTOR DE ESTRÓGENO

ERα Y RESPUESTA O RESISTENCIA A TERAPIAS ENDOCRINAS RESISTENCIA A TERAPIAS DE PRIVACIÓN DE ESTRÓGENOS ER COMO FACTOR PREDICTIVO DE RESPUESTA A TERAPIA

HER - 2/neu (c-erbB-2) CARACTERISTICAS BIOLOGICAS DETERMINACION DE HER - 2/neu A NIVEL TISULAR LACTATO DESHIDROGENASA ENOLASA ESPECÍFICA DE NEURONA CATECOLAMINAS SEROTONINA CALCITONINA

APLICACIONES CLÍNICAS DE LOS MARCADORES TUMORALES SÉRICOS MÁS COMUNES MARCADORES TUMORALES EN TUMORES DE CÉLULA GERMINAL MARCADORES TUMORALES EN CÁNCER COLORECTAL MARCADORES TUMORALES EN CÁNCER DE MAMA MARCADORES TUMORALES EN CÁNCER DE OVARIO MARCADORES TUMORALES EN CÁNCER DE PRÓSTATA MARCADORES TUMORALES EN CÁNCER DE PULMÓN, NEUROENDOCRINO Y DE TIROIDES

33 35 35 36 37 38 39 40 40 40 41 41 43 45 46 47 49 50 50 51 52 64 64 64 65 65

66 66 68 69 71 72 73

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MARCADORES GENETICOS METODOLOGÍAS EMPLEADAS EN EL ANÁLISIS GENÉTICO DE LOS TUMORES Cariotipo de bandas G Hibridación in situ con fluorescencia (FISH) Hibridación genómica comparativa (CGH) Cariotipo espectral (sky-FISH) y multi-FISH (M-FISH) Análisis molecular mediante PCR Cariotipo espectral (sky-FISH) y multi-FISH (M-FISH) Análisis molecular mediante PCR

HACIA UNA CARACTERIZACION MOLECULAR DEL CANCER MICROARREGLOS DE ADN

MANUFACTURA DEL MICROARREGLO DISEÑO EXPERIMENTAL PREPARACIÓN DEL ESPECIMEN E HIBRIDACIÓN OBTENCIÓN DE DATOS ANÁLISIS ESTADÍSTICO VALIDACIÓN DE LOS GENES SELECCIONADOS MEDIANTE MICROARREGLOS PERFILES DE EXPRESIÓN GÉNICA EN CÁNCER Clasificación molecular de los tumores Sensibilidad a drogas Plataformas de diagnóstico Determinación de la función de los genes Aplicaciones de la tecnología de los microarreglos

PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL

PCR MÚLTIPLE EN TIEMPO REAL EN DIAGNÓSTICO PCR MÚLTIPLE EN TIEMPO REAL EN ANÁLISIS DE MUTACIONES EN TUMORES SÓLIDOS CONCLUSIONES

LECTURAS RECOMENDADAS

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MARCADORES TUMORALES

Introducción La transformación de una célula normal a tumoral comprende un conjunto de procesos mediante los que los genes involucrados en los mecanismos de homeostasis normal, que controlan la proliferación y la muerte celular, son alterados por agresiones al DNA (mutaciones, deleciones, translocaciones etc), lo que resulta en activación de genes que estimulan la proliferación, los oncogenes, y en la inactivación de genes que normalmente inhiben la proliferación, los genes supresores de tumores. Esta célula además debe adquirir capacidad de proliferar indefinidamente y de obtener fuentes adecuadas de nutrientes y oxígeno para mantener sus altas tasas de proliferación. Todas estas características biológicas que distinguen a la célula tumoral son mediadas por complejas redes moleculares, cualquiera de sus componentes puede ser un marcador tumoral potencial. Los marcadores tumorales en su más amplia definición, son atributos moleculares de las células transformadas que las diferencian de las células normales. Los marcadores tumorales pueden ser genes únicos o sus productos que se encuentran exclusivamente en la célula tumoral, o pueden ser genes o productos de genes presentes en células normales que se encuentran en cantidades anormales en la célula tumoral. Los marcadores tumorales pueden encontrarse dentro de la célula o en su superficie o pueden ser secretados al espacio intracelular y alcanzar la circulación sanguínea.

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MARCADORES TUMORALES Los marcadores tumorales son genes o sus productos exclusivos de la célula tumoral ó expresados de manera anómala en ella. Un marcador tumoral puede ser detectado en un tumor sólido, en células tumorales circulantes, en los ganglios linfáticos o en líquidos corporales. Los marcadores tumorales pueden ser empleados en tamizaje poblacional y para detección, diagnóstico, estadificación, pronóstico y seguimiento del cáncer.

A medida que se revelan las características moleculares del cáncer, aumenta el potencial de desarrollar marcadores de mayor especificidad y sensibilidad. Sin embargo se deben cumplir una serie de etapas para desarrollar un marcador tumoral desde que se identifica una característica molecular del tumor hasta que se obtiene una prueba con utilidad clínica. La biología del marcador propuesto se debe conocer claramente, de manera que proporcione el fundamento científico para su desarrollo como prueba clínica y permita la interpretación de los resultados clínicos de una población heterogénea de pacientes. Se debe desarrollar un ensayo robusto, adecuado, preciso y reproducible para detectar el marcador en especimenes clínicos, los resultados del ensayo deben ser considerados en el contexto de otras informaciones clínicas y moleculares para determinar si provee información nueva e independiente de la ya disponible, y finalmente los resultados deben ser validados estadísticamente teniendo en consideración los datos clínicos de los pacientes, incluyendo variables demográficas, variables terapéuticas y los resultados clínicos.

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ETAPAS EN EL DESARROLLO DE UN MARCADOR TUMORAL 1. Identificar una característica molecular en el tumor. 2. Conocer la biología del marcador propuesto, de manera se tenga una base científica para su desarrollo. 3. Desarrollar un ensayo reproducible para detectar el marcador en especimenes clínicos. 4. Determinar si el marcador provee información adicional e independiente de la información clínica o molecular ya disponible. 5. Validar los resultados estadísticamente, en relación con los datos clínicos de los pacientes.

Con estos requerimientos, no sorprende que hasta ahora sólo unos pocos marcadores tumorales hayan sido bien validados como pruebas con utilidad clínica. Marcadores de uso clínico frecuente como el CA125 en cáncer de ovario, el antígeno carcinoembrionario (CEA) en cáncer colorectal, el antígeno específico de próstata (PSA) en cáncer de próstata, la alfafetoproteína (AFP) y la gonadotrofina coriónica humana (hCG) en tumores de células germinales son usados principalmente en el seguimiento del curso de la enfermedad después del tratamiento. A excepción de los receptores de estrógenos y la amplificación o sobre expresión del gen HER-2/neu en cáncer de mama, hasta el momento no ha sido validado ningún marcador que permita predecir la respuesta a la terapia para los cánceres más comunes.

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CLASIFICACIÓN DE LOS MARCADORES TUMORALES MARCADORES TISULARES Identificados sobre el tejido tumoral, permiten caracterizar biológicamente los tumores en cuanto a origen, tipo histológico, grado de diferenciación, capacidad de metástasis, susceptibilidad a fármacos, etc, permiten identificar subgrupos de riesgo.

MARCADORES CIRCULANTES Corresponden a los marcadores clásicos, son sustancias sintetizadas y liberadas por las células tumorales o por el organismo en el que se está desarrollando un tumor, que reflejan la progresión de la enfermedad y/o la respuesta del huésped. Su principal aplicación se da en el seguimiento de los tumores, pues permiten detectar tempranamente las recaídas y reflejan también la eficacia de la terapia. Los marcadores tumorales circulantes se clasifican en antígenos oncofetales, glucoproteínas, enzimas, hormonas, proteínas séricas. En la tabla 1 se presentan los marcadores circulantes más frecuentes en cada categoría.

MARCADORES GENÉTICOS Detectados a partir de los ácidos nucleicos presentes en el tumor. A nivel del DNA se pueden detectar cambios en el número de copias de genes, traslocaciones cromosomales, deleciones, hipermetilación de promotores y mutaciones puntuales. A nivel del RNA es posible detectar niveles de expresión alterados, o mutaciones puntuales.

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Tabla 1. Marcadores tumorales circulantes

CLASIFICACIÓN DE LOS MARCADORES TUMORALES CIRCULANTES Antígenos oncofetales

Antígeno carcinoembrionario (CEA) Alfafetoproteína (AFP) Gonadotrofina coriónica humana (hCG)

Glucoproteínas

Antígeno específico de próstata (PSA) CA-125 CA 15-3 CA 19.1 CA 72.4

Enzimas

Lactato deshidrogenasa (LDH) Enolasa específica de neurona (NSE) Fosfatasas ácidas Fosfatasa alcalina

Hormonas

Catecolaminas Serotonina ACTH ADH

Proteínas Séricas

Tiroglobulina Ferritina Inmunoglobulinas Beta-2-microglobulina

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APLICACIONES CLINICAS DE LOS MARCADORES TUMORALES Los marcadores tumorales tienen el potencial de influir las decisiones clínicas en diferentes estadios del tratamiento del cáncer. Han sido empleados en tamizaje, diagnóstico, pronóstico, detección temprana de recurrencias y monitoreo de la terapia. Definir la utilidad clínica de un marcador no es tarea fácil, un marcador puede mostrar utilidad en una o más categorías de las mencionadas. Un marcador tiene utilidad clínica si su detección o cuantificación contribuye en una decisión en la práctica clínica que implique un resultado clínico más favorable para el paciente, por ejemplo una mejora en el periodo de supervivencia libre de enfermedad, mejora a la calidad de vida, evitar un tratamiento inefectivo o potencialmente tóxico, reducir el costo del cuidados. El uso inapropiado del marcador tumoral puede resultar en un incremento en la ansiedad del paciente, incremento en los costos, tratamientos o toxicidad innecesarios.

TAMIZAJE El tamizaje es definido como la aplicación de una prueba para detectar una enfermedad en una población de individuos que no tienen síntomas de ésta. La meta de un programa de tamizaje es detectar la enfermedad en un estado temprano, con mayores posibilidades de tener éxito al brindar un tratamiento con intención curativa. Los criterios establecidos para un programa de tamizaje ideal son: 1-Una prueba diagnóstica de bajo costo, rápida, accesible y lo menos invasiva posible, con sensibilidad y especificidad altas. 2-Una enfermedad que constituya un problema importante de salud para la que se conozca bien la historia natural y para la que exista un tratamiento efectivo.

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La mamografía en mujeres mayores de 50 años es un ejemplo de una prueba de tamizaje efectivo cuya aplicación ha demostrado mejora en la supervivencia en cáncer de mama. A la fecha no hay evidencia concluyente del beneficio de medir marcadores séricos como prueba de tamizaje. La subunidad ß de la hCG y la AFP son marcadores tumorales importantes asociados con el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de tumores de células germinales. Sin embargo, a pesar de su alta sensibilidad y especificidad no tienen utilidad en tamizaje por que el cáncer testicular es un cáncer poco frecuente. El antígeno específico de próstata es un marcador tumoral que ha sido de utilidad en la detección temprana del cáncer de próstata, sin embargo el papel del PSA como marcador tumoral de tamizaje es controversial, no existen estudios de distribución aleatoria que demuestren un beneficio en relación con la supervivencia con la detección temprana y tratamiento de este cáncer. Actualmente hay dos estudios en curso, uno en Europa y otro en Estados Unidos con respecto a este tema.

DIAGNÓSTICO El diagnóstico hace referencia a la posibilidad de diferenciar la enfermedad maligna de la benigna o una enfermedad maligna de otras. Un marcador tumoral que ayuda al diagnóstico puede ser útil en el diseño del plan de tratamiento más apropiado. La medición de los niveles séricos de ß-hCG y AFP ha jugado un papel muy importante en el diagnóstico de tumores de célula germinal sensibles a la quimioterapia. Los niveles séricos de uno de estos marcadores o de ambos se encuentran elevados en más del 80% de tumores de célula germinal no seminomatosos. De hecho niveles elevados de estos marcadores y la presencia de una masa son diagnósticos de cáncer testicular. De igual manera, niveles altos de PSA, una masa en la próstata y/o una escanografía ósea positiva son diagnósticos de cáncer de próstata con una alta especificidad.

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PRONÓSTICO El pronóstico puede definirse como la predicción de que tan bien o mal le irá al paciente en términos de respuesta a la terapia, recurrencias, tiempo de supervivencia u otras medidas de resultado clínico. Los niveles séricos de ß-hCG, AFP y LDH son importantes determinantes de pronóstico en tumores de células germinales. Desde 1997 los niveles séricos de estos marcadores son incluidos en la estadificación de estos tumores, adicionalmente son empleados como factores pronóstico independientes para categorizar los paciente con cáncer de células germinales metastásico en grupos de riesgo bajo, medio y alto, influenciando el tratamiento que recibirá el paciente. Los niveles séricos de PSA tienen valor pronóstico en hombres con cáncer de próstata aparentemente localizado y han sido usados en conjunto con otros criterios para clasificar los pacientes en grupos de pronóstico. Estos pueden ser útiles en la selección de pacientes para tratamiento radical local con intención curativa (niveles bajos de PSA), que resulta inadecuado para pacientes con altos niveles de PSA. En contraste, los niveles séricos de PSA no tienen valor pronóstico en la supervivencia de pacientes con cáncer de próstata metastásico resistente a terapia hormonal, esto probablemente debido a la selección de clones tumorales con baja producción de PSA en algunos pacientes. Sin embargo, la disminución de PSA luego de la iniciación de la quimioterapia, en pacientes con niveles iniciales altos, es indicador pronóstico.

SEGUIMIENTO El seguimiento se define como la valoración periódica del paciente con el fin de detectar señales tempranas de recurrencia (enfermedad residual mínima) u otros signos de activación de la enfermedad o de progresión. Para que el seguimiento se constituya en una estrategia exitosa debe existir un tratamiento efectivo de manera que la identificación temprana de la recidiva resulte en un cambio en el manejo terapéutico que redunde en un resultado clínico favorable para el paciente.

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Durante la quimioterapia la elevación del nivel del marcador tumoral puede indicar la necesidad de rediseñar el tratamiento, los cambios en los niveles del marcador observados en mediciones seriadas se deben a cambios en la actividad tumoral, cualquier cambio por encima del intervalo de confianza del 95% respecto al valor previo debe considerarse significativo. La concentración del marcador refleja el éxito de procedimientos terapéuticos como la cirugía y/o la quimioterapia. Los valores elevados después de la cirugía pueden indicar una resección incompleta del tumor o la presencia de metástasis o recurrencias.

USOS CLINICOS DE LOS MARCADORES TUMORALES TAMIZAJE Como prueba para detectar una enfermedad maligna en una población de individuos que no tienen síntomas de ésta. DIAGNÓSTICO Como prueba para diferenciar la enfermedad maligna de la benigna o una enfermedad maligna de otras. PRONÓSTICO Como prueba para predecir que tan bien o mal le irá al paciente en términos de respuesta a la terapia, recurrencias, tiempo de supervivencia u otras medidas de resultado clínico. SEGUIMIENTO Como prueba para valorar periódicamente al paciente con el fin de detectar señales tempranas de recurrencia (enfermedad residual mínima) u otros signos de activación de la enfermedad o de progresión.

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MARCADORES TUMORALES CIRCULANTES DE MAYOR USO EN LA PRÁCTICA CÍNICA ANTÍGENO CARCINOEMBRIONARIO (CEA) El antígeno carcinoembrionario fue descrito en 1965 por Gold y Freedman, quienes lo identificaron como un antígeno presente en tanto en colon fetal como en adenocarcinoma de colon pero que aparentemente estaba ausente en colon adulto sano. En estudios posteriores se observó que el CEA o al menos moléculas similares a este se encontraban presentes en tejidos sanos, aunque las concentraciones en los tumores eran en promedio 60 veces mayores. Se presentan elevaciones del CEA en individuos con diferentes enfermedades no malignas, muchas de ellas inflamatorias: diverticulitis, gastritis, úlcera gastrica, bronquitis, colangitis, abscesos hepáticos y cirrosis alcohólica, especialmente en personas ancianas y en fumadores. El CEA se encuentra elevado en varios tipos de tumores epiteliales. Además del cáncer colorectal, se han encontrado niveles elevados de CEA en sueros de pacientes con cáncer de estómago, seno, pulmón, páncreas, ovario, próstata, hígado y páncreas. Cuarenta años después de su descubrimiento en suero, el CEA es uno de los marcadores más utilizados en el mundo entero y el más frecuentemente usado en carcinoma colorectal.

CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS EL CEA es codificado por un gen que hace parte de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Esta familia incluye genes que codifican proteínas de adhesión, como la molécula de adhesión intercelular ICAM-1, el

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antígeno asociado a la función de los linfocitos (LFA-1) y los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad. La familia de genes del CEA está localizada en el cromosoma 19q, está compuesta por 29 genes. El CEA es una glicoproteína de 180 a 200 kDa de peso molecular con aproximadamente un 60% de carbohidratos. La heterogeneidad en peso que presenta este antígeno parece ser atribuible a variaciones en sus cadenas laterales de carbohidratos. La mayoría de los carbohidratos están compuestos de manosa, galactosa N-acetilglucosamina, fucosa y ácido siálico. El CEA se une a la membrana celular mediante un anclaje glicosil fosfatidilinositol y es liberado en su forma soluble por una fosfolipasa C o D. La similitud estructural del CEA con algunas proteínas relacionadas con las inmunoglobulinas como ICAM-1 e ICAM-2, sugirió su posible rol como molécula de adhesión, probablemente involucrado en procesos de adhesión y metástasis, experimentos recientes en modelos animales arrojan evidencia en este sentido. Se ha observado que en ratones desnudos transplantados con tumores colorectales el número de metástasis se eleva del 2 al 48% después de inyectar CEA a los animales. Sin embargo no existe evidencia directa de que el CEA esté involucrado en la diseminación del cáncer, adicionalmente en colon humano sano este antígeno se localiza en la superficie apical de enterocitos maduros, hecho que difícilmente se correlaciona con un rol en la diseminación del cáncer. Se ha observado también que el CEA se une a algunas cepas de Escherichia coli, unión que algunos investigadores asocian con una mayor colonización del intestino, otros sugieren que el CEA puede proteger el colon de la infección bacteriana, uniéndose a los microorganismos infecciosos.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES Tabla 2. Principales características del antígeno carcinoembrionario

CARACTERÍSTICAS DEL ANTÍGENO CARCINOEMBRIONARIO 1955, Gold y Freedman Descubrimiento Glicoproteínas 180-200 kDa, Estructura Gene Sitio de producción Vida Media Valores de referencia Utilidad en oncología

monómero, carbohidratos 50-60%. Brazo largo del cromosoma 19 Hígado fetal, células epiteliales superficiales diferenciadas de la mucosa del colon . 3 a11 días. < 5 µg/mL. Seguimiento de recurrencias tempranas en adenocarcinoma colorectal.

FACTORES QUE AFECTAN LAS CONCENTRACIONES SÉRICAS DEL CEA EN CÁNCER COLORECTAL Estadio tumoral Tanto los niveles séricos como la proporción de pacientes con niveles altos son mayores en estados más avanzados de la enfermedad. En uno de los primeros estudios de este antígeno se reporta la proporción de pacientes con niveles mayores de 2,5 µg/L de acuerdo al estadio: 28% en Dukes A, 45% en Dukes B, 75% en Dukes C y 84% en Dukes D. Con un punto de corte de 5 µg/mL, estas proporciones fueron 3%, 25%, 45% y 65%.

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Grado tumoral Los cánceres colorectales bien diferenciados producen más CEA que los poco diferenciados. Se ha reportado una concentración promedio de CEA en los tumores bien diferenciados, moderadamente diferenciados y poco diferenciados de 18, 5,5 y 2,2 µg/g de proteína. A nivel sérico los niveles de CEA son mayores a mayor grado de diferenciación del tumor.

Estado del hígado El CEA se metaboliza principalmente en el hígado. El CEA es tomado por las células de Kupfer en las que es retirado el ácido sialico, el CEA desprovisto de ácido siálico es endocitado por células del parénquima que lo degradan. Algunas afecciones hepáticas afectan la eliminación del CEA, por lo que el antígeno puede estar elevado en el suero de pacientes con enfermedad hepática no maligna.

Tabaquismo En un estudio en más de 700 voluntarios sanos los valores promedio de CEA en hombres fumadores y no fumadores fueron 6,2 y 4,3 µg/L respectivamente, para mujeres las concentraciones fueron 4,9 y 2,5 mg/L. Los niveles sérico son dos veces mayores en los fumadores.

CEA COMO MARCADOR EN CÁNCER COLORECTAL Tamizaje El propósito de un tamizaje en cáncer colorectal es detectar estadios tempranos Dukes A y B. Con un punto de corte de 2,5 µg/L, se ha calculado una sensibilidad del 36% y una especificidad del 87% en el tamizaje de cáncer colorectal estados Dukes A y B, teniendo en cuenta la baja prevalencia de este tipo de cáncer en poblaciones no seleccionadas, el valor predictivo del CEA es muy bajo para proponerlo como método de tamizaje en individuos sanos. La detección de sangre oculta y la

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colonoscopia continuan siendo los métodos de tamizaje para este tipo de cáncer.

Diagnóstico La falta de especificidad y sensiblilidad de este marcador limita su aplicación en diagnóstico, especialmente en estadios tempranos. El CEA puede estar elevado en la mayoría de tipos de adenocarcinoma avanzado y en un buen numero de afecciones benignas. En general en las enfermedades benignas los niveles no sobrepasan los 10 µg/L. En pacientes sintomáticos niveles elevados de CEA (superiores a 5 veces el limite superior) sugieren la presencia de cáncer.

Pronóstico Un marcador de pronóstico en cáncer colorectal debe proveer información independiente de la existente en los sistemas de estadificación, y brindar información pronóstico dentro de los subgrupos de estadificación. Particularmente, en estado Dukes B, un 40 a 50% de los pacientes presenta enfermedad agresiva y se puede beneficiar de quimioterapia adyuvante, sería deseable contar con un marcador que permita distinguir los pacientes con enfermedad agresiva de aquellos con enfermedad más indolente, de manera que sólo aquellos pacientes con enfermedad agresiva sean tratados con quimioterapia adyuvante, mientras que en aquellos con buen pronóstico se puede disminuir el costo del tratamiento y evitar los efectos colaterales de los agentes citotóxicos. En varios estudios se ha demostrado que los pacientes que presentan altos niveles de CEA antes de la cirugía tienen un pronóstico menos favorable que aquellos con bajos niveles del marcador. En la mayoría de estudios en pacientes en estados Dukes B, los niveles elevados de CEA predicen pronóstico adverso, por lo que su medición puede ayudar en la identificación de un subgrupo de pacientes con enfermedad agresiva que se pueden beneficiar de quimioterapia adyuvante. Sin embargo, no hay aun estudios que demuestren beneficio del uso de terapia adyuvante con base exclusivamente en concentraciones de CEA elevadas antes de la cirugía.

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La medición del CEA después de la cirugía puede tener valor pronóstico, después de una resección quirúrgica de cáncer colorectal exitosa las concentraciones de CEA deben alcanzar la normalidad después de 4 a 6 semanas, si esto no ocurre es altamente probable que se dé una recurrencia temprana. El CEA también puede proveer información sobre el pronóstico en pacientes que desarrollan metástasis hepáticas después de resección del cáncer colorectal con fines curativos. El hígado es el principal sitio de metástasis de este tipo de cáncer, aproximadamente el 60% de los pacientes desarrollan metástasis en este órgano, un 25% de ellos son candidatos a resección hepática, con una supervivencia a 5 años del 21 al 48%. Entre el 50 y el 80% de los pacientes sometidos a este tratamiento desarrollan enfermedad recurrente, se ha determinado que altas concentraciones de CEA previas a la cirugía predicen un resultado clínico adverso.

Seguimiento de los pacientes con cáncer colorectal diagnosticado El propósito de las mediciones del CEA luego de la resección curativa del cáncer colorectal es detectar las recurrencias en una fase tratable. La mediciones seriadas del CEA permiten detectar el cáncer recurrente con una sensibilidad y especificidad aproximadas del 80% (rango 17-89%) y 70% (rango 34-91%). Las mediciones seriadas son especialmente útiles en la detección de metástasis hepáticas con una sensibilidad del 94% y una especificidad del 96%. El CEA es poco sensible para la detección de enfermedad local o regional. CEA es el indicador más frecuente de recurrencia en pacientes asintomáticos y es la prueba que presenta la mejor relación costo/ beneficio para la detección de enfermedad recurrente potencialmente curable. En varios estudios se ha observado que los pacientes que muestran una disminución en los niveles de CEA con la quimioterapia presentan una mayor supervivencia comparados con aquellos en los que no se presenta disminución.

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CEA COMO MARCADOR EN CÁNCER DE MAMA Los niveles de CEA se encuentran elevados en un 30 a 50% de pacientes con cáncer de seno metastático sintomático. En varios estudios se ha reportado una correlación positiva entre alteraciones en los niveles de CEA y la respuesta terapéutica en pacientes con cáncer de seno metastático.

GONADOTROFINA CORIÓNICA HUMANA (hCG) CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS La gonadotrofina coriónica humana es una hormona producida por el tejido trofoblástico durante el embarazo, en enfermedad trofoblástica y por varios tumores. Es un miembro de la familia de hormonas glicoproteicas, a esta familia también pertenecen la hormona estimulante del folículo, la hormona luteinizante y la hormona estimulante tiroidea. Cada una es un heterodímero consistente de dos subunidades, una subunidad α común y una subunidad ß, específica para cada hormona, unidas de manera no covalente. La subunidad α está compuesta de 92 aminoácidos unidos por cinco puentes disulfuro, tiene unidas dos cadenas laterales de oligosacaridos mediante enlaces N en los residuos 52 y 78. La subunidad ß es única y distingue la hCG de las otras hormonas glicoproteicas, está compuesta de 145 aminoácidos unidos por 6 puentes disulfuro, contiene dos cadenas laterales de oligosacáridos unidas a los residuos 13 y 30 mediante enlaces N. Adicionalmente presenta cuatro oligosacáridos unidos mediante enlaces O a la región C-terminal rica en prolina y serina (residuos 122 a 145). Sus concentraciones séricas pueden elevarse en pacientes con tumores de células germinales de origen gonadal y extragonadal y en enfermedad trofoblástica gestacional, también en otros cánceres de origen epitelial como cáncer de mama, pulmón, vejiga y tumores gastrointestinales.

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Las concentraciones de hCG en suero y orina se elevan exponencialmente en el primer trimestre del embarazo, con un tiempo de duplicación de 48 horas, el pico máximo se da a las 10 semanas de gestación. Las concentraciones disminuyen entre la semana 10 y la 16 hasta un 20% del valor del pico máximo y continúan así hasta el final del embarazo. La hormona biológicamente activa en suero y orina se encuentra acompañada de un conjunto de moléculas disociadas o degradadas con poca o ninguna actividad biológica. La hCG-fragmentada tiene una única ruptura, en la subunidad ß entre los residuos 47 y 48, o menos frecuentemente entre el 43 y el 44 o el 44 y 45. El pico de hCG-fragmentada ocurre al mismo tiempo que el de la hCG intacta, esta forma fragmentada representa en promedio el 9% de la hCG sérica en el segundo mes del embarazo. Hacia el noveno mes la proporción es del 21% en promedio, en orina se observan proporciones similares. Sin embargo estos porcentajes presentan variaciones importantes entre individuos.

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Tabla 3. Principales características de la gonadotrofina coriónica humana

CARACTERÍSTICAS DE LA GONADOTROFINA CORIÓNICA HUMANA Descubrimiento 1927 por Ascheim y Zondek Estructura Glicoproteína, heterodímero de 45 kDa, 30% de carbohidratos, (4. cadenas N-glicano y 4 Oglicano), 7 isómeros, pI 3,8-4,7. Gene Subunidad α un gen en 6q21q23, 4 exones. Subunidad ß genes en 19q13 (52kb); 3 exones. Sitio de producción Células trofoblásticas de la placenta, pituitaria. Vida Media 24-36 h, b: 3-4 h, a: 2 h. Valores de referencia hCG<101 U/L, hCG ß <0,1, hCGα<0,5mg/mL. Utilidad en oncología hCG, hCG ß libre: diagnóstico y seguimiento de pacientes con tumores trofoblásticos y cáncer testicular. HCG ß seguimiento de pacientes con cánceres no trofoblásticos, particularmente cáncer de vejiga.

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En muestras de suero y orina se pueden encontrar dos formas de subunidad a libre, una que es la que normalmente hace parte de la hCG y una subunidad α grande. Esta última se encuentra hiperglicosilada, con oligosacáridos de mayor tamaño y complejidad unidos por enlaces N, que previenen su combinación con la subunidad ß. Esta forma es producida únicamente por células del trofoblasto y no es incorporada a la hCG. La concentración sérica de subunidad α libre (ambas formas) alcanza en promedio el 5% del total de hCG en el segundo mes de gestación y el 54% en promedio en el noveno mes. En orina la proporción es ligeramente mayor. La proporción de estas formas de subunidad α libre así como de hCG-fragmentada es muy variable. Tanto la hCGß-fragmentada como la hCGß intacta libres están presentes en suero y orina. Para la HCGß la concentración máxima también ocurre en la décima semana de gestación. Las concentraciones de HCGß libre son muy bajas, 0,9% de la concentración de hCG en promedio para el segundo mes de gestación, decreciendo hasta el 0,5% de la concentración de hCG al final del embarazo, en orina se observan proporciones mayores, 9% en el segundo mes y 40% al final del embarazo. El fragmento ß-core es el producto terminal de la degradación final de hCG. Aunque es la principal molécula relacionada con la subunidad ß de hCG en muestras de orina de embarazadas, es prácticamente indetectable en el suero de estas mujeres (0,03 % de la concentración de hCG). El fragmento ß-core comprende dos péptidos, los residuos 6 a 40 y 55 a 92 de la subunidad ß unidos entre sí por cinco enlaces disulfuro. Su peso molecular es de 9.000, aproximadamente el 25% del peso de la hCG completa que es de 36.700. En orina las concentraciones se comportan igual que en suero, con pico máximo en la décima semana de gestación. Las concentraciones del fragmento ß-core comienzan a elevarse a la quinta semana de gestación, alrededor de la semana sexta o séptima de gestación igualan la concentración mol/mol de hCG. En el segundo mes de embarazo el fragmento ß-core corresponde al 58% (promedio) de la concentración de hCG en orina, alcanzando el 305% (promedio) en el último mes de embarazo.

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La hCG intacta, la hCGß libre no fragmentada y la subunidad a grande son secretadas in vivo por células trofoblásticas. La hCG-fragmentada, la hCGß libre y el fragmento ß-core no son secretadas por células de trofoblasto. Mediante cultivos celulares e inmunohistoquímica se ha demostrado que la hCG es fragmentada, después de su secreción, por enzimas producidas por los macrófagos asociados a las células trofoblásticas. Esta hCG fragmentada es poco estable y rápidamente se degrada en hCGß fragmentada y subunidad-α. La ausencia prácticamente total de ß-core en suero y su presencia en orina sugiere que este fragmento es generado en el riñón, a partir de la HCGß fragmentada. Las proporciones tanto en suero como en orina de hCG-fragmentada, hCGß-libre y fragmento ß-core son mucho mayores y más variables en embarazos de síndrome de Down, preclampsia y enfermedad trofoblástica. En suero y orina en algunos casos de enfermedad trofoblástica, cáncer testicular y cáncer de vejiga y en mujeres con embarazo normal 3 a 10 días posparto se ha encontrado la totalidad de la hCG fragmentada o como hCGß- libre o muestras de orina con fragmento ß-core unicamente. Aparentemente la actividad fragmentadora de la enzima y la vía de degradación de hCG tienen mayor actividad en embarazos anormales, cáncer y enfermedad trofoblástica y en los días posteriores a la eliminación de hCG.

INMUNOANÁLISIS PARA DETERMINAR HCG Y MOLÉCULAS RELACIONADAS Actualmente se emplean inmunoanálisis tipo sándwich con anticuerpos monoclonales, con sistemas de detección espectrométricos o luminiscentes. Dependiendo de la mezcla de anticuerpos empleada, esos ensayos miden diferentes mezclas de moléculas relacionadas con hCG. Se han identificado múltiples sitios de unión de anticuerpos en la molécula de hCG, cinco sitios diferentes en la hCG intacta, cuatro en hCGfragmentada, dos en la subunidad a libre, seis en la subunidad-ß libre y cuatro en el fragmento ß-core.

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En general los ensayos comerciales incluyen varios anticuerpos hacia diferentes sitios de hCG y sus subunidades libres. Un anticuerpo monoclonal se emplea para la captura, la hCG inmovilizada es detectada por un segundo anticuerpo policlonal o monoclonal dirigido hacia otro sitio de la hormona. Este anticuerpo trazador es marcado radioactiva o enzimáticamente para medir la cantidad de hCG. En algunos ensayos se emplea un segundo anticuerpo monoclonal de captura para inmovilizar hCGß-libre, que es detectada con el mismo anticuerpo marcado que detecta hCG. Dada la amplia gama de anticuerpos empleada, no todas las pruebas miden lo mismo, algunos ensayos detectan sólo hCG intacta, otros hCG intacta más hCGß libre, otros detectan las formas fragmentadas o todas las formas. Todos estos ensayos son adecuados para detección de embarazo normal. En gestaciones anormales (enfermedad trofoblástica, embarazo de síndrome de Down, preeclampsia), cáncer testicular y de vejiga se puede producir una mayor proporción de moléculas de hCG disociadas o degradadas, la detección de estas moléculas puede ser mucho más importante en estos casos, por lo que es recomendable emplear ensayos que detecten estas moléculas degradadas. La medición de hCGß libre ha sido ampliamente usada para el diagnóstico y manejo de enfermedad trofoblástica, más recientemente concentraciones elevadas de hCGß libre se han usado en tamizaje para embarazos con fetos con síndrome de Down, y como un mejor marcador tumoral en cáncer testicular y probablemente en otros cánceres. La hCGß libre fragmentada se ha sugerido como alternativa en tamizaje para Down. Actualmente están en desarrollo ensayos de detección del fragmento ßcore como prueba única de alta eficiencia en embarazos Down. El uso de estas pruebas también ha sido aprobado en algunos países como marcador tumoral en el seguimiento de cáncer de ovario, vejiga y de cérvix.

HCG EN ENFERMEDAD TROFOBLÁSTICA En enfermedad trofoblástica gestacional la medición de hCG y de la tasa a la que disminuye después de cirugía y/o quimioterapia son esenciales en el manejo de las pacientes. Después de la evacuación de un embara-

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zo molar, la concentración de hCG debe determinarse semanalmente hasta su normalización y después cada mes durante el primer año. La desaparición de la hCG se da alrededor de las ocho semanas en el 40% de las pacientes, entre 9 y 22 semanas en el 55% y en más de 22 semanas en un 5% de los casos. En algunos casos la concentración se mantiene estable o se aumenta sugiriendo presencia de enfermedad trofoblástica evolutiva persistente (retención molar, mola invasora o coriocarcinoma). En varios estudios se han empleado las curvas de regresión de hCG para una detección temprana de enfermedad persistente, se proponen corredores de regresión normal que permiten la detección de 85 a 90% de los pacientes con enfermedad persistente a las 4 a 6 semanas. Las pacientes que desarrollan enfermedad trofoblástica metastásica de alto riesgo requieren quimioterapia. En general esas pacientes presentan uno o más de los siguientes factores: concentración sérica de hCG pretratamiento > a 40.000 IU/L, diagnóstico de coriocarcinoma, historia de embarazo no molar, metástasis y resistencia a la quimioterapia. La relación entre hCGß libre (subunidad ß libre) y hCG total (hCG + hCGß libre) es por lo general mayor en estas pacientes que en pacientes con mola hidatiforme o enfermedad de bajo riesgo. Durante la primera semana de quimioterapia los valores de hCG tienden a subir por la destrucción celular, la remisión se alcanza cuando los valores del marcador se hacen indetectables. Tanto las pruebas de detección de hCG como de hCGß libre son altamente sensibles, capaces de detectar 104 células tumorales. Sin embargo dado que ese pequeño número de células puede generar una recidiva el tratamiento es continuado después de la normalización de los niveles de la hormona. Un decaimiento lento de los niveles de hCG o hCGß libre identifica pacientes que probablemente no van a entrar e remisión completa que se pueden beneficiar de terapia adicional o de un cambio de terapia.

HCG EN TUMORES DE CÉLULA GERMINAL HCG, hCGß libre y AFP son los marcadores más útiles en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de pacientes con tumores testiculares no

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seminomatosos de células germinales como coriocarcinoma, carcinoma embrionario y teratocarcinoma. Estos tumores se localizan en las gónadas y en ocasiones raras en sitios extragonadales. En tumores germinales no seminomatosos se encuentran niveles altos de hCG y hCGß libre en 60% y 40 a 70% de los casos respectivamente. La combinación de los tres marcadores permite detectar hasta el 90% de pacientes con estos tumores. La hCG reviste menos interés en seminomas pues sólo un 16% de pacientes con este tipo de tumor tiene elevación de la hormona, por lo general los valores séricos son < a 200 IU/L. Los valores por encima de 5.000 IU/L señalan la presencia de tumores testiculares no seminomatosos de células germinales. El valor pronóstico de la concentración de hCG antes de la quimioterapia y del tiempo de eliminación ha sido ampliamente evaluado con el fin de identificar el 20 a 30% de pacientes que no responden a la terapia. Varios estudios han señalado que las cinéticas de hCG y de AFP son buenos indicadores de pacientes con probabilidad de no responder al tratamiento, otros concluyen que el análisis de los valores del marcador tumoral no permite hacer esta predicción. De hecho, la concentración del marcador antes de la terapia parece predecir de manera más adecuada la no respuesta al tratamiento que su tiempo de eliminación. Adicionalmente después de la orquidectomía los pacientes con AFP elevado recaen con mayor frecuencia que los que presentan hCG elevada.

ALFAFETOPROTEINA (AFP) La alfafetoproteína es una glicoproteína de cadena simple con un peso molecular aproximado de 70 kD, en conjunto con la albúmina constituyen las principales proteínas en la circulación del feto. La producción primaria de esta proteína ocurre en el hígado fetal y en el saco vitelino, se secreta a la circulación fetal donde su concentración alcanza el punto máximo a las trece semanas, disminuyendo posteriormente en forma gradual hasta el nacimiento. Después del nacimiento es eliminada de la sangre, a los dos años de edad no es detectada en el suero.

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La AFP fue descrita por primera vez por Bergstrand y Czar en 1956, como una proteína presente en suero fetal, posteriormente Tatarinov en 1964 la asocia con tumores humanos. Desde entonces su elevación se ha descrito en varios tipos de cáncer, principalmente en cáncer testicular y en hepatocarcinoma. La AFP también es de utilidad en la detección precoz de enfermedades congénitas de defectos del cierre del tubo neural, como anencefalia y espina bífida, pues se encuentra elevada en el líquido amniótico en 99% de fetos con defectos del cierre del tubo neural, su determinación es de utilidad en la valoración de embarazos de alto riesgo. Los niveles de AFP en líquido amniótico alcanzan su valor máximo hacia la semana 13 de gestación, disminuyen rápidamente hacia la semana 22, para continuar decreciendo hasta el nacimiento. Se pueden encontrar niveles elevados de AFP en mujeres con amenaza de aborto, muerte fetal y embarazos múltiples. Niveles bajos de AFP en la circulación materna se pueden encontrar en embarazo molar, aborto retenido, embarazo imaginario, sobreestimación de la edad gestacional y síndrome de Down. Tabla 4. principales características de la alfafetoproteína

CARACTERÍSTICAS DE LA ALFAFETOPROTEÍNA Descubrimiento 1956 por Bergstrand y Czar. Estructura Glicoproteína, 67-69 kDa (4-5% de glicanos), dos isómeros. Gene Brazo largo del cromosoma 4. Sitio de producción Hígado, saco vitelino (síntesis fetal). Vida Media 5-6 días. Valores de referencia 8,5-20 mg/mL incrementado en el recién nacido 150 mg/mL. Utilidad en oncología Diagnóstico y seguimiento en hepatocarcinoma, cáncer testicular, teratocarcinomas y canceres germinales de ovario.

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AFP EN TUMORES DE CÉLULA GERMINAL Como marcador tumoral es de utilidad en pacientes con tumores de células germinales de origen testicular, ovárico y extragonadal, y en hepatocarcinoma. En tumores de células germinales la elevación sérica de la AFP es evidencia de presencia de tumores no seminomatosos, se detecta usualmente en tumores de seno endodérmico y en carcinoma embrionario, y se emplea en asocio con la hCGß. En los seminomas no se eleva la AFP.

AFP EN CARCINOMA HEPÁTICO En carcinoma hepático la AFP se encuentra elevada en un 70 a 80% de los pacientes, algunos estudios han reportado mayor supervivencia en pacientes con niveles normales de AFP, los valores elevados se asocian con mayor extensión tumoral. Las determinaciones séricas de AFP tienen utilidad a nivel de diagnóstico y seguimiento. La medición de AFP es usada para evaluar si la resección quirúrgica fue total y también la respuesta a la terapia y las recaídas. El carcinoma hepatocelular presenta comúnmente recaídas después de la cirugía, las determinaciones séricas seriadas de la AFP permiten detectar la enfermedad recurrente entre 3 y 18 meses antes de la aparición de sintomatología. El intervalo de tiempo entre la cirugía y la recurrencia se correlaciona con el tiempo de duplicación de la AFP. Una disminución de la AFP sérica indica respuesta clínica a la quimioterapia, las mediciones séricas seriadas permiten obviar terapias prolongadas inefectivas, sin embargo un valor negativo no excluye la posibilidad de enfermedad subclínica. La sensibilidad de la AFP para detección temprana de hepatocarcinoma no es satisfactoria. A pesar de sus limitaciones, se ha demostrado en estudios de tamizaje con ecografía y/o elevación de niveles de AFP que estos métodos permiten detectar tumores en estados iniciales con mayor posibilidad de tratamiento quirúrgico curativo. En países con baja preva-

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lencia de hepatocarcinoma el tamizaje para este cáncer no resulta costoefectivo. En poblaciones asiáticas, con infección crónica por virus de la hepatitis B y C y con riesgo elevado de desarrollar hepatocarcinoma, el tamizaje con AFP puede tener una mejor relación costo-efectividad, especialmente si el tamizaje se limita a grupos de pacientes con hepatitis crónica B o C por encima de lo 40 años. En áreas de baja prevalencia de hepatocarcinoma también es recomendable el tamizaje en grupos seleccionados, que deben incluir pacientes con cirrosis hepática asociada a hepatitis B o C, alcoholismo o hemocromatosis genética.

ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO (PSA) Es una proteasa de la familia de las kalicreínas, inicialmente se pensó que esta glicoproteína se producía exclusivamente en la próstata, sin embargo se ha visto que también se produce en las glándulas mamarias y salivares aunque en cantidades muy pequeñas. Los niveles detectables de PSA en suero se considera que sólo se originan del epitelio columnar de la próstata. Esa casi total especificidad de órgano ha permitido que este marcador sea ampliamente usado como herramienta en la detección temprana del cáncer de próstata. En combinación con el estudio histopatológico del material de biopsia y el estado clínico (basado en tacto rectal y/o ultrasonografía transrectal), el PSA ha mejorado en gran medida la predicción del estado patológico en pacientes con cáncer de próstata.

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Tabla 5. Principales características del antígeno específico de próstata

CARACTERÍSTICAS DEL ANTÍGENO ESPECÍFICO DE PRÓSTATA Descubrimiento 1.971 por Hara y cols. Estructura

Gene Sitio de producción Vida Media Valores de referencia Utilidad en oncología

Glicoproteína, monómero de 34 kDa, 7% de carbohidratos, 5 isómeros, pI 6,8-7,2. Actividad quimiotríptica, formas ligadas a antiquimiotripsina y alfa 2 macroglobulina. Un gen en 19q3 de 6 kb, con 4 intrones y 5 exones. Acinos prostáticos, mama y parótida. 1,5-3,2 días luego de preostatectomía radical. 4 µg/L. Seguimiento en cáncer de próstata.

CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS La familia de genes de la kalicreina está compuesta por 15 genes ubicados en el cromosoma 19 que codifican PSA (o hK3), hK2, hK4, y hK15 (o prostina), y otras proteasas de serina, varias de estas son expresadas en la próstata en niveles altos. Los niveles de PSA liberados al lumen glandular desde las células epiteliales, donde es funcionalmente activo, están en el rango de 10 a 50 µmol/L. En contraste, el nivel extracelular de la PSA latente o inactiva es significativamente más bajo < 0,1 nmol/L. Tanto PSA como hK2 son sujeto de investigación, y se ha demostrado que ambas moléculas son liberadas en altos niveles a la circulación sanguínea tempranamente en el desarrollo de cáncer de próstata o en paralelo con la progresión de la enfermedad. A la fecha no se ha demostrado que el

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PSA sea un mitógeno. Un mejor entendimiento de las formas latentes activa e inactiva de el PSA y sus proteínas relacionadas, así como su significado en la detección y progresión del cáncer de próstata proveen importantes avances en el pronóstico y en blancos de tratamiento para pacientes con esta neoplasia. MECANISMOS REGULADORES DEL PSA Un elemento clave en el entendimiento de PSA es la regulación de la actividad proteasa. Existen cuatro mecanismos reguladores diferentes para proteasas de serina: activación de zimógeno, regulación alostérica, escisión proteolítica externa e inhibición de proteasas. La activación de zimógeno, que es común en las proteasas de serina, se caracteriza por un cambio conformacional. La conversión irreversible de PSA activo a inactivo ocurre cuando la proteína alcanza compartimentos subcelulares o un ambiente extracelular. El proceso puede ser autocatalítico o requerir moléculas enzimáticas o no enzimáticas. En la liberación del péptido de activación, que para PSA y hK glandulares es relativamente corto, la acción enzimática es adquirida por un cambio conformacional inducido en el PSA maduro. Hay elementos adicionales involucrados en la regulación del PSA activo y hK2, que incluyen iones divalentes, particularmente Zinc. En modelos de inhibición se ha visto que cada molécula hK2/PSA es inhibida por ligación a dos sitios de unión a Zinc con concentraciones inhibitorias a nivel micromolar, aunque la contribución precisa de este mecanismo in vivo permanece desconocida. En la tercera vía reguladora, PSA pierde actividad debido a la conversión del PSA de cadena única, maduro y activo en una enzima multicadena interrumpida por escisión interna. Los sitios de escición son los residuos lisina 145 y /o lisina 182. Esto sugiere algún tipo de actividad enzimática similar a plasmina para inactivar la enzima PSA funcional, aunque las enzimas responsables no se conocen.

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El cuarto mecanismo regulador, reportado a principios de los 90, es la interacción entre PSA e inhibidores de proteasa, muchos de los cuales se producen en el hígado y se encuentran en gran exceso en comparación con el PSA liberado extracelularmente. Las interacciones de PSA con dos clases diferentes de inhibidores revisten interés. La primera clase son los inhibidores de proteasas de serina, en los que la α1- antitripsina es el arquetipo, esta clase también incluye la α1-antiquimiotripsina (ACT), el inhibidor de proteína C y antitrombina. La segunda clase de inhibidores de proteasa incluye α2 -macroglobulina (AMG) y la proteina análoga de embarazo que ha demostrado alta capacidad de interacción con PSA. La formación in vitro de complejos AMG-PSA es 20 veces más rápida que la de complejos ACT-PSA. AMG encapsula el PSA, lo que dificulta el acceso a epitopes antigénicas de PSA para medir adecuadamente los niveles del complejo PSA-AMG, sin embargo se ha podido demostrar que los niveles de PSA-AMG in vivo pueden permanecen bajos, cercanos o por debajo de los límites de detección en sangre, al menos en estados clínicos de cáncer de próstata localizado. Esto puede darse probablemente por mecanismos efectivos de eliminación, a pesar del hecho que esta puede ser una vía importante de eliminación de PSA activo de los fluidos extracelulares. FACTORES QUE AFECTAN LA EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO ESPECÍFICO DE PRÓSTATA La expresión de PSA es dependiente principalmente de la activación ligando dependiente o independiente del receptor de andrógenos y la señalización posterior. La elevación de niveles de PSA extracelulares es debida generalmente a deterioro en la relación entre expresión de PSA y el sistema ductal glandular, que debe proteger el ambiente extracelular de la exposición a la acción de PSA y de proteasas relacionadas como hK2 y de mantener los niveles extracelulares de PSA en una concentración menor a 0,1 nmol/L (107 veces menor que la intraductal que es menor a 1 mmol/L). Además, los niveles extracelulares de cada forma de PSA y de hK2 son también dependientes de la vías metabólicas y de los mecanismos de eliminación: El PSA libre es eliminado de la sangre por filtración glomerular en el riñón, su vida media es de 12 horas, un daño

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en la función renal eleva los niveles de PSA libre, los complejos de PSA son muy grandes para ser eliminados por esta vía. La vía de eliminación de PSA-ACT no se conoce, la tasa de eliminación es bastante lenta, en hombres con cáncer de próstata localizado la tasa de eliminación es muy lenta < 1ng/mL día. PSA COMO MARCADOR EN CÁNCER DE PRÓSTATA Diferentes formas de PSA en sangre como marcadores de diagnóstico y progresión Varias formas de PSA se encuentran en el suero, 65 a 95% de PSA se encuentra en complejos con ACT, mientras que 5 a 40% de PSA se encuentra libre. La relación de PSA libre/PSA total es significativamente menor en hombres con cáncer de próstata que en hombres con hipertrofia prostática benigna. Se ha sugerido que la relación PSA libre/PSA total mejora la sensibilidad sin alterar la especificidad de la detección de cáncer de próstata entre pacientes con niveles séricos de PSA entre 4 y 10 ng/mL. Sin embargo, el porcentaje de PSA libre es alterado por el tacto rectal, la cistoscopia, y la biopsia por lo que no hay un consenso sobre el punto de corte más adecuado. Una vez diagnosticado el cáncer de próstata el porcentaje de PSA libre no es útil en el seguimiento de los pacientes. De manera que el porcentaje de PSA libre debe usarse únicamente en casos dudosos, previo a la detección del cáncer, cuando el nivel de PSA está entre 4 y 10 ng/mL. Tamizaje Los niveles séricos de PSA y el tacto rectal son las herramientas de diagnóstico de primera línea aceptados para efectuar el tamizaje y detección precoz del cáncer de próstata. En varios estudios de tamizaje con más de 19.800 hombres se ha demostrado el innegable valor del PSA para detectar el cáncer de próstata en un estado precoz, potencialmente curable. Existe evidencia de que este marcador no es suficientemente sensible para detectar los cánceres indolentes, sin significado clínico descubiertos incidentalmente en autopsias o en la prostatectomía. Los cánce-

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res descubiertos por medio de PSA a pesar de no ser palpables tienen un volumen suficiente para ser considerados de importancia clínica en el 95% de los casos, en los que el tratamiento es necesario. Sin embargo, dos de cada tres pacientes con niveles séricos de PSA por encima de 4 ng/mL (limite superior de normalidad) tendrán una biopsia negativa para cáncer de próstata, esto debido a que PSA no es un marcador específico de cáncer y puede estar elevado en situaciones no malignas como prostatitis aguda, isquemia prostática, retención urinaria aguda y especialmente en la hipertrofia prostática benigna. Adicionalmente, una tercera parte de los cánceres de próstata no producen PSA, sobre todo los menos diferenciados. Para mejorar la especificidad de este marcador se ha desarrollado el concepto de densidad de PSA, PSA según edad, PSA según volumen y porcentaje de PSA libre. Seguimiento Utilidad de PSA para definir estado libre de enfermedad El uso de la supervivencia como punto final para determinar eficacia terapéutica del tratamiento local definitivo es de valor limitado en hombres con diagnóstico de cáncer de próstata localizado, debido a que la determinación de la supervivencia se tarda varios años y se complica por la competencia con otras causas de muerte en esta población. La evaluación del control local después de radioterapia con base en regresión de la masa tumoral mediante tacto rectal carece de sensibilidad, de una parte la mayoría de tumores nuevos diagnosticados no son palpables, aun si existe una anomalía al tacto, puede también deberse a calcificaciones, granulomas, hipertrofia prostática benigna, que pueden persistir luego de la radioterapia. El tacto rectal tampoco es confiable en el seguimiento después de prostatectomía radical. Varias observaciones sugieren que PSA puede ser un marcador apropiado de tratamiento exitoso con radioterapia. Los pacientes con PSA elevado después de la radioterapia tienen un riesgo mayor de tener una biopsia positiva, y aquellos con evidencia histológica de enfermedad

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residual probablemente presentaran evidencia clínica de recurrencia local y metástasis distantes. Además, los pacientes con elevación de PSA en el primer año después de completada la terapia tienen una probabilidad mucho mayor de desarrollar enfermedad metastásica temprana. El punto de corte seleccionado para considerar a un paciente libre de recaída bioquímica ha sido definido de manera variable por los investigadores como: mantener nivel de PSA sérico menor o igual a 4 ng/mL, 2 ng/mL, 1,5 ng/mL, 1,0 ng/mL, 0,5 ng/mL, o menor a 0,2 ng/mL. El punto de corte escogido para definir la recaída tiene un impacto importante en la supervivencia libre de enfermedad que se reporte, por ejemplo en un estudio de pacientes con niveles pretratamiento entre 4 y 10 ng/mL con el punto de corte de 4 ng/mL un 26% de los pacientes presentó recaídas a 5 años mientras que con un punto de corte de 1 ng/mL este porcentaje fue del 55. La recomendación del panel de consenso de la Asociación Americana de radioterapia oncológica (ASTRO), es la más aceptada. En este panel se recomienda un lapso de 24 meses antes de reportar resultados, debido a que es muy raro que se presenten fallas terapéuticas durante los dos primeros años después de finalizado el tratamiento. Se recomienda hacer tres mediciones consecutivas del PSA en lugar de usar un punto de corte específico. Este método para definir recaída bioquímica resulta más conveniente puesto que en algunos pacientes con próstata grande (en parte debido a hipertrofia prostática) con altos niveles de PSA antes de tratamiento se puede haber eliminado totalmente el cáncer y aun tener niveles de PSA por encima de un punto de corte arbitrario. Por el contrario, en pacientes con niveles de PSA muy bajos antes del tratamiento, aun un PSA menor a 1 ng/mL puede reflejar enfermedad residual, particularmente si va en ascenso. Se recomendó que la fecha de recaída sea arbitrariamente definida como el punto medio entre el valor de PSA más bajo luego de la radioterapia (nadir PSA) y la primera de tres elevaciones consecutivas. A pesar de ser la definición más aceptada, su utilidad es cuestionada, ya que esta definición lleva a que la determinación del tiempo de recaída sea totalmente dependiente de la frecuencia de medición del PSA.

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El nadir PSA (valor de PSA más bajo luego de la radioterapia) parece correlacionarse con la probabilidad de permanecer libre de enfermedad. El riesgo de recaídas declina progresivamente a medida que el nadir decrece a menos de 1,0 ng/mL. Se han observado menos recaídas entre pacientes con nadires menores a 0,4 ng/mL en comparación con nadires más altos, pero aun menores a 1,0 ng/mL. En un estudio reciente, se evaluó el impacto del nadir PSA en la recaída bioquímica y en la supervivencia. Los pacientes con nadires mayores a 1,2 tuvieron un peor pronóstico para falla bioquímica (p=0.001) y para supervivencia (p= 0.0001). Un 70% de pacientes con nadires de PSA por debajo de 1,2 estaba libre de enfermedad después de 4 años comparado con solo un 40% de pacientes con nadir de PSA de 1,2 o mayor. En un modelo multivariado el nadir de PSA alcanzado fue el predictor más significativo de supervivencia libre de recaída bioquímica (p<0.0001) y de supervivencia libre de progresión (p<0.0001). Aunque en general se acepta que la elevación del PSA es una medida sensible de progresión no hay claridad en cuanto a que tan significativa es una elevación. Una evaluación adecuada del estado libre de enfermedad requiere varias observaciones en intervalos de tiempo relativamente cortos (cada 3 o 6 meses) para diferenciar una elevación consistente de un error de laboratorio, o de una variación biológica normal. Una forma de evaluar el riesgo particular asociado a elevación de PSA después de radioterapia es calcular el tiempo de duplicación del PSA (DT), definido como log 2 x t/ [log(PSA final) -log(PSA inicial)], donde t es el tiempo desde el nivel inicial de PSA hasta el nivel final. Un tiempo de duplicación inferior a 12 meses y un intervalo corto desde el final del tratamiento a la primera elevación de PSA (menor a 12 meses) son predictores significativos e independientes de metástasis distantes. Sin embargo, en paciente tratados con radioterapia el empleo de la cinética de marcador es bastante controversial. PSA post prostatectomía radical La prostatectomía radical está indicada en tumores clínicamente localizados y la eficiencia del tratamiento es evaluada a largo término. El PSA

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se hace indetectable 21 días después de la prostatectomía, a partir de ese momento cualquier elevación del PSA por encima del límite inferior de detección significa presencia de tumor residual. Esto arguye a favor del uso de ensayos ultrasensibles. La definición más apropiada para recaída bioquímica luego de prostatectomia radical es usualmente un valor no-cero. En la diferentes series quirúrgicas se han definido valores no-cero como PSA desde mayor de 0,02 ng/mL hasta mayor de 0,6 ng/mL. Definiciones que tienen efectos en interpretación de los datos reportados. Por ejemplo, el riesgo relativo de recaída a 5 años es 1,3 veces mayor si se define la recaída como PSA mayor de 0,2 ng/mL que si se define como PSA mayor de 0,4 ng/ mL. Otros investigadores mediante el uso de pruebas de detección de PSA ultrasensibles, con definición no-cero como PSA mayor de 0,02 ng/ mL, reportan que las recaídas son diagnosticadas 2,5 años antes que cuando se usa el nivel más convencional de 0,3 ng/mL. En contraste, en otro estudio se sugiere que la especificidad se disminuye al usar puntos de corte muy bajos, los investigadores analizan el efecto de varios puntos de corte en un grupo de 2.782 hombres con cáncer de próstata clínicamente localizado sometidos a prostatectomía radical, ellos concluyen que un valor de 0,4 ng/mL o mayor puede ser el punto de corte más adecuado. La tasa de elevación del PSA muestra una relación con el riesgo de metástasis distantes luego de prostatectomía radical. Un estudio sobre la historia natural de pacientes que desarrollan elevación de PSA después de prostatectomía radical, analiza 1.997 pacientes de los que 315 desarrollan elevación de PSA, no reciben tratamiento hasta la aparición de metástasis. El tiempo medio entre la elevación del PSA y la aparición de metástasis fue 8 años, una vez aparecen las metástasis el tiempo medio de fallecimiento fue de cinco años. El tiempo transcurrido entre la prostatectomía y la primera elevación de PSA, el score Gleason, y el tiempo de duplicación de PSA predicen la probabilidad y tiempo de desarrollo de enfermedad metastásica. La historia natural de la progresión después de la elevación del PSA puede ser prolongada, y los resultados pueden ser útiles en la identificación de pacientes en riesgo de progresión rápi-

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da para los que la quimioterapia adyuvante o la inclusión en ensayos clínicos pueden ser adecuados. Otros estudios sugieren que el valor máximo de PSA alcanzado luego de prostatectomía predice la duración de la respuesta luego de radioterapia de salvamento. Varios estudios retrospectivos han sugerido que menos del 20% de los pacientes con PSA mayor a 1 ng/mL al momento de la radioterapia permanecerán libres de progresión bioquímica mientras que el 70% de pacientes con PSA menor a 1 ng/mL lo hará. Utilidad de PSA en enfermedad metastásica La utilidad de este marcador como variable predictiva antes y después de tratamiento ha sido evaluada en pacientes con cáncer de próstata metastásico no tratados (sensibles a hormonas). Aunque los niveles de PSA antes de tratamiento muestran relación con el tamaño del tumor, la producción de PSA por los tumores es muy variable debido a la importante heterogeneidad biológica del cáncer de próstata; como consecuencia de esto, el valor absoluto de PSA antes del tratamiento no muestra una buena correlación con la respuesta o con la supervivencia. En contraste, el grado y la tasa de disminución del PSA después de la terapia hormonal pueden predecir el resultado clínico. Se ha observado que, en pacientes con cáncer de próstata metastástico, una disminución mayor al 80% del PSA durante el primer mes de tratamiento hormonal predice una mayor supervivencia libre de progresión. También se ha demostrado que la normalización del PSA en los primeros 6 meses de terapia predice un buen resultado clínico. Múltiples estudios indican que una disminución en los niveles de PSA predice un mejor resultado clínico en pacientes con cáncer de próstata tratados con privación de andrógenos. En general, los pacientes tratados con privación de andrógenos tienen una duración media de respuesta de 18 meses, todos los pacientes tratados eventualmente desarrollarán enfermedad independiente de andrógenos, cuya manifestación será elevación en los niveles de PSA y progresión de la enfermedad. El tiempo medio de progresión después de elevación de PSA por encima de 4 ng/mL es de cinco meses en pa-

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cientes con cáncer de próstata metastástico cuyo valor de PSA se disminuyó por debajo de 4 ng/mL y posteriormente aumentó. El PSA tiene también utilidad como marcador de progresión después de terapia hormonal.

RECEPTOR DE ESTRÓGENO Desde finales del siglo XIX se conocía que la ooforectomía causaba regresión en tumores avanzados de seno, evidencia de que los estrógenos estaban implicados de alguna manera en el desarrollo de esta neoplasia. En los años 50 se identifica el receptor de estrógenos (ER), molécula que media los efectos de los estrógenos en los tejidos blanco, y se describió su presencia en tumores de seno. ER es actualmente reconocido como un marcador de pronóstico en cáncer de seno, cuya expresión determina si una paciente debe o no recibir tratamiento con antiestrógenos como terapia endocrina adyuvante. El gen del ER fue clonado y secuenciado y se demostró que su secuencia de aminoácidos guardaba homologia con el receptor de glucocorticoides y con el encogen v-erb-A. En 1996 se describió un segundo receptor de estrógeno denominado ERß para diferenciarlo del original, que ahora se denomina ERα, posteriormente se describieron dos isoformas de ERß de 530 y 485 aminoácidos. La de 530 corresponde al receptor maduro. Las dos isoformas están codificadas en genes similares de ocho exónes, pero ubicados en diferente cromosoma, en el 6 la de 485 aminoácidos y en el 14 la de 530. Adicionalmente se describió otra forma de ERß de 548 aminoácidos con un dominio amino terminal más largo, que aparentemente es funcionalmente diferente a las otras dos isoformas. En estudios poblacionales con individuos de varias etnias se ha visto que esta isoforma es una variante muy poco frecuente y se desconoce su contribución en la respuesta estrogénica. Estos receptores forman parte de una superfamilia de factores de transcripción que son blancos de moléculas pequeñas liposolubles como las hormonas esteroideas (andrógenos, progesterona, glucocorticoides) y hormonas tiroideas, retinoides, vitamina D3.

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ERα contiene regiones que conforman dedos de Zinc tipo C4 y se une como un dímero a secuencias palindrómicas conocidas como elementos respondedores a estrógenos (ERE). El dominio de unión al ligando está en una región de 300 aminoácidos y a éste se unen estrógenos y antiestrógenos, en esta región también se encuentran la función de activación de transcripción activada por el ligando AF-2 y las secuencias requeridas para la dimerización dependiente del ligando. Los 180 aminoácidos n-terminales contienen la región de activación de transcripción AF-1. AF-1 y AF-2 actúan de manera independiente y específica de tipo celular y de promotor. Al igual que otras proteínas que activan transcripción, los receptores nucleares activan expresión génica mediante el reclutamiento de componentes de la maquinaria de transcripción en los promotores de los genes respondedores. Existen múltiples estudios que describen los mecanismos que llevan a la inhibición de la actividad del ERα por antiestrógenos parciales como tamoxifen y antagonistas puros como ICI 164, 384 y sus derivados ICI 172, 780. Se ha demostrado que la actividad agonista del tamoxifen resulta de activación del sitio AF-1 y su actividad antagonista de interacción con el sitio AF-2. ICI 164, 384 previene la activación de AF-1 y AF-2. No se ha reportado ningún antiestrógeno capaz de impedir la unión del ER al DNA, aunque ICI 164, 384 desestabiliza el receptor reduciendo su vida media y causando su salida del núcleo al citoplasma. ERα Y RESPUESTA O RESISTENCIA A TERAPIAS ENDOCRINAS La relación entre la expresión del receptor de estrógeno en cáncer primario de seno y la probabilidad de que el tumor responda a terapias endocrinas ha sido sujeto de numerosos estudios. Se ha demostrado una relación entre expresión del receptor y la respuesta para todos los tipos de terapia endocrina incluyendo estrógenos, antiestrógenos, y terapias de supresión de estrógenos como ooforectomia quirúrgica y médica, e igualmente inhibidores de la aromatasa o progesteronas. En todas las pacientes con cáncer de seno localmente avanzado metastásico, las terapias de antiestrogenos o de supresión llevan a remisiones cortas con una duración media de 9 a 12 meses, sin embargo

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cuando las pacientes recaen aun tienen células cancerosas que expresan ERα ; en contraste, varios grupos han demostrado una disminución del receptor de progesterona en tumores resistentes. La resistencia aunque aparece uniformemente en pacientes con cáncer localmente avanzado o metastásico, puede no aparecer en pacientes con cáncer de mama primario, puesto que la terapia adyuvante con tamoxifen o la ablación de los ovarios administrada en pacientes que tienen sólo focos microscópicos de enfermedad lleva a una reducción durable en la probabilidad de morir a causa del cáncer de mama. Las reducciones en las tasas anuales de muerte y de recurrencia son del 17% y 23% respectivamente. El éxito de las manipulaciones endocrinas de segunda línea, como los inhibidores de aromatasa, después de la aparición de resistencia al tamoxifen, sugiere que la vía de transducción de los estrógenos está intacta en pacientes con cáncer de mama resistente al tamoxifen; en estudios de ensayos de unión de ER y de inmunocitoquímica en cáncer de seno resistente a tamoxifen se ha visto que la resistencia no es debida a la pérdida del ER. Es posible que la resistencia a la terapia endocrina resulte de mutaciones adquiridas o preexistentes en el gen del ERα que llevan a la resistencia, sin embargo no se han hallado mutaciones en este gen, la mayoría de mutaciones que se han descrito son silenciosas y no afectan la secuencia de aminoácidos. Dado que el gen del ER tiene más de 140 kb, consta de 8 exones y su transcripción ocurre desde tres promotores alternos, se ha sugerido que existen varias especies de polipéptidos de ERα en los tumores, algunos de ellos con propiedades anómalas, como distribución subcelular alterada; se han observado también variantes alternativas de corte y empalme del mRNA desprovistas de los exones 2, 3, 4, 5 y 7, que podrían codificar proteínas truncadas; con el uso de anticuerpos monoclonales en biopsias de pacientes con cáncer de mama se ha detectado al menos una variante de ERα que no tiene el exón cinco. En varios estudios clínicos no ha sido posible encontrar relación entre la presencia de estas variantes y el resultado clínico o la aparición de resistencia.

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Otro mecanismo por el que puede generarse la resistencia a la terapia endocrina ha sido sugerido por hallazgos que implican la fosforilación del receptor α en la alteración de sus funciones. La fosforilación es un mecanismo importante de regulación de factores de transcripción, varios estudios han generado evidencia que apoya la posibilidad de que la fosforilación del receptor α sea responsable (al menos en parte) de la resistencia a la terapia endocrina. El ERα presenta varios sitios de fosforilación, algunos de ellos implicados en la regulación de unión a ligando, dimerización y transactivación. Algunas cinasas de proteínas que incrementan la actividad del ERα se han encontrado elevadas en cáncer de seno, lo que apoya la posibilidad de que a mayor actividad de cinasas de proteínas mayor fosforilación de ERα , que lleva a actividad independiente de ligando y en cáncer de seno a resistencia a terapias endocrinas.

RESISTENCIA A TERAPIAS DE PRIVACIÓN DE ESTRÓGENOS La aromatización periférica de andrógenos a estrógenos que representa la principal fuente de estrógenos endógenos en mujeres posmenopáusicas, es mediada por la aromatasa. La aminoglutamida es un inhibidor no específico de la aromatasa, fue el primero empleado y se asocia con varios efectos colaterales no deseados, posteriormente han aparecido nuevos agentes (anastrazole, vorozole y letrozole) todos de amplio uso como tratamiento de segunda línea en cáncer avanzado de mama. Al igual que el tamoxifen la terapia de privación de estrógenos, ya sea ooforectomía o terapia con inhibidores de aromatasa, también tiene efectos de corta duración, las células tumorales que vuelven a proliferar también son positivas para el receptor hormonal y un porcentaje de pacientes muestra respuesta a tratamiento posterior con progesterona. La resistencia a la terapia endocrina es un obstáculo importante en el tratamiento del cáncer de mama. Es probable que la activación del ERα por mecanismos independientes de ligando sea responsable de esa resistencia en algunos pacientes.

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ER COMO FACTOR DE PREDICCIÓN DE RESPUESTA A TERAPIA El marcador de predicción de más amplio uso en oncología es el receptor de estrógenos para selección de tumores que responderán a tratamiento hormonal. Aunque inicialmente su principal uso era en la predicción de respuesta a terapia endocrina ablativa en pacientes con cáncer de seno avanzado, hoy día es más ampliamente empleado para seleccionar pacientes con cáncer de mama en estadios tempranos con mayor probabilidad de responder al tratamiento con tamoxifen. En un estudio reciente con 37.000 mujeres, aquellas pacientes con tumores positivos para ER tuvieron 7 veces menos probabilidad de desarrollar enfermedad recurrente que las mujeres con tumores negativos para ER. La determinación del receptor de progesterona (PR) puede también ayudar en la selección de pacientes con cáncer de mama que responderán a terapia hormonal. En estudios clínicos iniciales se demostró que las pacientes con cáncer de mama avanzado tenían más probabilidad de responder a terapia hormonal si el tumor primario expresaba ER y PR, en comparación con tumores que sólo expresaban receptores de estrógeno. Sin embargo la determinación de los PR aparentemente no incrementa la capacidad de predicción del ER en la selección de la terapia adyuvante. Dado que la determinación de receptores hormonales aporta una información única, su determinación en todos los cánceres de mama ha sido recomendada por la American Society of Clinical Oncology (ASCO) y por el European Group of tumor markers (EGTM). HER-2/neu (c-erbB-2) El gen HER-2, también denominado c-neu o c-erbB-2 está localizado en el cromosoma 17q23 un área de bastante inestabilidad genómica en cáncer de seno, codifica una glicoproteína transmembranal de 185kD.

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CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS HER-2/neu es una glicoproteína de 182 aminoácidos de expresión normal en el epitelio de varios órganos: pulmón, vejiga, páncreas, mama y próstata, la sobreexpresión y/o amplificación de Her-2/neu en las células tumorales de origen epitelial lleva a un importante incremento en la densidad de la proteína en la membrana celular. Her-2/neu hace parte de la familia del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR) que tiene cuatro miembros designados HER-1 (EGFR) a HER-4. El receptor Her-2/neu tiene tres dominios: una porción intracelular con actividad de cinasa de tirosinas, un dominio trans membrana hidrofóbico y un dominio extracelular (ECD) que es la parte del receptor con actividad de unión a ligando. El dominio extracelular es escindido de la proteína completa por proteólisis mediada por metaloproteinasas, y liberado al torrente sanguíneo como antígeno circulante, es una glicoproteína de 97 a 115 kD, generalmente denominada HER-2/neu sérico. En el 25 a 30% de los cánceres primarios de mama se detecta amplificación del gen HER-2/neu y/o sobre expresión de la proteína. Los tumores positivos tienden a ser negativos para receptores de estrógeno, tener diseminación a ganglios linfáticos, ser de alto grado, por lo que tienen alta probabilidad de presentar resistencia al tratamiento y recaídas. Esta mayor agresividad representada en mayor potencial metastástico y mayor resistencia a la terapia de los tumores HER-2/neu positivos puede depender del proceso de liberación del antígeno ya que , cuando el dominio extracelular de HER-2/neu es escindido, la proteína cinasa de tirosinas truncada retiene su capacidad de señalización. Los niveles séricos de HER-2/neu pueden reflejar el estado de activación asociado con el proceso de liberación y adicionalmente los niveles séricos elevados reflejan la expresión de HER-2/neu en el tumor y se asocian con el tamaño tumoral. Se ha sugerido que el efecto inhibitorio en la liberación de HER-2/neu inducido con la administración de trastuzumab (herceptin) puede ser uno de sus mecanismos de acción y puede ser resultado de impedimento estérico.

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DETERMINACION DE HER-2/neu A NIVEL TISULAR Inmunohistoquímica (IHQ) El análisis inmunohistoquímico de HER-2/neu en el material tumoral, fue la técnica empleada en los estudios clínicos de trastuzumab (Herceptin). La IHQ permite detectar el grado de sobre expresión de HER-2/neu en material tumoral embebido en parafina mediante el empleo de anticuerpos policlonales o monoclonales que se unen de manera específica a la proteína HER-2/neu expresada en la membrana celular. Los complejos antígeno anticuerpo son visualizados mediante la adición de un conjugado detector de anticuerpos acoplado a una enzima y la posterior adición de cromógeno. Está técnica permite una gradación semi cuantitativa de 0 a 3, 2 y 3 son considerados positivos (más del 10% de las células tumorales presentan al menos una tinción moderada de su membrana). Sin embargo la IHQ presenta limitaciones: pérdida de los antígenos durante el procesamiento y fijación del tejido, variaciones en la calidad de los anticuerpos, variaciones interobservador. FISH (hibridación fluorescente in situ) La técnica FISH mide el número de copias del gen HER-2/neu por núcleo (amplificación del DNA). En esta técnica, se emplea una sonda de DNA complementaria al gen HER-2/neu marcada de manera fluorescente en un ensayo de hibridación sobre el tejido. La FISH es considerada una técnica más objetiva que la IHQ debido a que evalúa el número exacto de señales de hibridación por núcleo, y a que el DNA es menos susceptible que las proteínas a deterioro durante el procesamiento. Sin embargo, es una técnica más costosa, laboriosa y técnicamente compleja que la IHQ. Tanto la técnica de FISH como la IHQ se pueden realizar sobre tejidos embebidos en parafina con técnicas y estuches comerciales normalizados y aprobados por la FDA en Estados Unidos. Las determinación de niveles de RNA mensajero en el tumor sólo tienen aplicación a nivel de

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investigación, no hay ensayos aprobados para uso en la clínica. Su gran limitación es la baja estabilidad del RNA que exige disponibilidad de tejido congelado en fresco.

Figura 1. Detección de amplificación de HER-2/neu en tejido embebido en parafina. Detección de HER-2/neu en rojo (más de dos señales por célula), control de hibridación sonda centromérica cromosoma 17 (dos señales por célula). Tomado de Muhlman M, Genet. Mol. Res.2002, 1 (2): 117-127 con autorización.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES DETERMINACION DE HER-2/neu A NIVEL SÉRICO Tanto la amplificación del gen como la sobre expresión de la proteína pueden evaluarse sobre el tejido tumoral, sin embargo, los niveles séricos circulantes de HER-2/neu pueden emplearse en la evaluación de este marcador tumoral. Los niveles séricos del dominio extracelular escindido de la membrana celular pueden detectarse mediante ELISA tipo sándwich con dos anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopes diferentes de la proteína, el anticuerpo NB-3 va fijado a la placa mientras que el anticuerpo TA-1 marcado con biotina es usado para detectar el HER-2/neu inmobilizado en la placa por el NB3. El límite superior normal de HER-2/neu es 15 ng/mL. El ensayo no tiene reacción cruzada con otros miembros de la familia del receptor EGF. En cáncer de seno la sensibilidad incrementa con el estadio, de 0 en estadios I, a 40 a 50% en estadios IV. La especificidad para mujeres sanas y mujeres con enfermedad benigna es del 97 y 98% respectivamente. La medición de niveles séricos de HER-2/neu tiene algunas ventajas, se emplean metodologías normalizadas que no están sujetas a interpretación variable, los resultados son cuantitativos, es un método poco invasivo y permite repeticiones.

USOS CLINICOS DE HER-2/neu Marcador pronóstico En estudios pre clínicos se ha observado que la detección de HER-2/ neu se asocia con mayor agresividad del tumor, hecho que sugiere que su detección favorecería la decisión de una terapia más agresiva. Los resultados de los ensayos clínicos para corroborar esta hipótesis han sido controversiales. En un metaanálisis reciente se sugiere que en pacientes con ganglios linfáticos negativos no tratadas la sobreexpresión y/o amplificación del gen HER-2/neu se asocia con pronóstico desfavorable, pero la asociación es débil. Un estudio en el que se empleó la técnica de FISH refiere un pronóstico altamente favorable para pacientes con HER-2/neu normal y ganglios linfáticos negativos, otro reporte revela fuerte asociación de la medición de HER-2 neu en ELISA con el pronóstico.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES Es muy probable que HER-2/neu tenga un valor pronóstico, que, exceptuando algunos estudios, no parece ser muy fuerte. En subgrupos específicos de pacientes es probable que tenga mayor valor pronóstico. Sin embargo, estos datos deben validarse en ensayos prospectivos antes de implementarlos en la clínica. Factor predictivo En estudios preclínicos se sugiere que HER-2/neu reduce la dependencia de estrógenos en líneas celulares de mama positivas para ER, lo que lleva a pensar que la alteración de HER-2/neu en cáncer de seno puede asociarse a una resistencia relativa a la terapia endocrina. Aunque esta hipótesis ha sido sustentada en varios estudios clínicos, la resistencia observada no es absoluta y puede ser especifica del agente terapéutico, por lo que no debe limitarse el acceso a la terapia endocrina a pacientes con tumores ER positivos. Varios estudios clínicos han analizado la posible asociación de HER-2/ neu con resistencia a quimioterapia neoadyuvante con agentes alquilantes. En varios de estos se sugiere que las pacientes con sobre expresión de HER-2/neu tienen menos probabilidad de beneficiarse con la quimioterapia neoadyuvante con agentes alquilantes en comparación con las pacientes cuyos tumores son negativos, en un estudio encuentran una relación opuesta. En relación con la quimioterapia basada en antraciclinas, las pacientes con tumores HER-2/neu positivos responden igual o mejor que las que tienen HER-2/neu normal. En relación con el uso de taxanos, los resultados de los estudios clínicos son muy preliminares para seleccionarlos con base a la presencia o no de alteraciones en HER-2/neu. Sensibilidad a terapia con trastuzumab Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el dominio extracelular de HER-2/neu, se ha demostrado que es activo

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES como agente terapéutico único y que aumenta la efectividad de la quimioterapia en enfermedad metastásica. En general , las pacientes con resultado de 3 en IHQ para HER-2/neu, o positivas para HER-2/neu en FISH se benefician del tratamiento con trastuzumab. Los niveles séricos circulantes de HER-2/neu ECD pueden ser predictivos de respuesta a trastuzumab, sin embargo en tres estudios reportados no se ha encontrado buena correlación entre los niveles circulantes y la respuesta a trastuzumab con o sin quimioterapia. Los cambios en los niveles de HER-2/neu ECD antes y después de la terapia reflejan el curso de la enfermedad.

CA-125 Este antígeno fue descubierto en 1981 mediante el uso de anticuerpos monoclonales murinos generados a partir del bazo de animales inmunizados con una línea celular derivada de carcinoma de ovario. Un 75 a 90% de las pacientes con cáncer de ovario presenta valores elevados de esta molécula, su utilidad en el seguimiento de la respuesta al tratamiento y en la detección de enfermedad recurrente es ampliamente aceptada.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES Tabla 6. Principales características del CA-125

CARACTERÍSTICAS DEL CA-125 Descubrimiento Estructura Gene Sitio de producción Vida Media Valores de referencia Utilidad en oncología

1.981 Bast y cols. Glicoproteína similar a las mucinas, de 200 a 250 kD. Brazo largo del cromosoma 17. Epitelio ovárico. 4-7 días. < 35 kilounidades/L. Pronóstico y seguimiento en cáncer de ovario.

Los niveles del CA-125 previos a la cirugía se correlacionan con el tamaño tumoral y con el estadio, su significado pronóstico es más controversial. Las concentraciones después de la cirugía se correlacionan de manera importante con el tumor residual y tienen valor predictivo en la supervivencia. La medición del marcador debe hacerse por lo menos tres semanas después de la cirugía, puesto que al abrir la cavidad abdominal hay liberación de CA-125. En un 61% de las pacientes que presentan niveles elevados de CA-125 antes de la quimioterapia ocurre progresión de la enfermedad, cuando el marcador está por debajo de 35 kilounidades/L la progresión ocurre en un 33%. Después del primer ciclo de quimioterapia el valor predictivo de la concentración de CA-125 para supervivencia libre de enfermedad es altamente significativo. Durante la quimioterapia los cambios en la concentración del CA-125 muestran correlación con el curso clínico de la enfermedad. El tiempo promedio de normalización de los valores séricos es 1,5 meses en pacientes que entran en remisión completa y 4 meses en pacientes con respuestas parciales. Niveles elevados del marcador preceden la detección clínica de la enfermedad y por lo general se asocian con progresión tumoral, hecho corroborado en cirugías de segunda mirada. Sin embargo, la cirugía de segunda mirada es necesaria así los niveles séricos se hayan normalizado, pues la concentración de marcador en el rango de referencia no excluye la existencia de tumor. En más del 40% de pacientes con niveles en el rango de referencia se detecta enfermedad microscópica en la cirugía de segunda mirada.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES En estados I el nivel del CA-125 antes de la cirugía se considera factor pronóstico, en estudios multivariados resulta el indicador pronóstico de supervivencia con mayor robustez. En cáncer de ovario en estados avanzados el valor de CA-125 previo a la cirugía no presenta la misma correlación con la supervivencia. La vida media de este marcador es de 4 a 7 días, a mayor tiempo de eliminación del CA-125 de la circulación, el pronóstico es más pobre. El valor pronóstico de la vida media del CA-125 ha sido analizado durante la terapia de inducción para identificar pacientes con alto riesgo de progresión. En un estudio en pacientes con enfermedad estados I y II cuyo tumor había sido resecado en su totalidad la vida media del marcador varió entre 5,1 y 12 días en diferentes estudios. La mayor diferencia en tasas de progresión se encontró cuando la vida media del CA-125 excedió los 20 días. El tiempo promedio de progresión fue de 43-50 meses y 11-23 meses, para estados I y II respectivamente. Los pacientes con una vida media del marcador menor a 20 días tienen un buen pronóstico, cuando esta está entre 20 y 40 días es intermedio y cuando es mayor de 40 días es pobre, con un cálculo actuarial de supervivencia a 5 años de 76%, 48% y 0% respectivamente. La vida media del CA-125 es el marcador pronóstico de mayor valor para supervivencia y probabilidad de alcanzar remisión completa en cáncer de ovario estados III y IV en quimioterapia inicial. Dado que el 50% de las pacientes con cáncer de ovario en estados I y el 90% en estados II presenta elevación de CA-125, se ha sugerido su uso para detección precoz de este cáncer. Sin embargo su especificidad no es adecuada puesto que puede elevarse en otros tipos de cáncer (pulmón, endometrio, mama, hígado, páncreas y otros), y en algunas condiciones benignas (endometriosis, quistes de ovario hemorrágicos, pancreatitis, cirrosis, enfermedad renal). En estudios en los que se incluyen determinaciones seriadas la especificidad mejora, pues en el cáncer de ovario los valores son ascendentes mientras que en condiciones benignas permanecen estables o disminuyen. El uso del CA-125 en combinación con otros marcadores mejora la sensibilidad y especificidad en la detección precoz del cáncer de ovario, se ha reportado que el uso del CA-125 en conjunto con el anticuerpo

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES monoclonal OVX1 incrementa de 65 a 87% la detección del estado I. Los niveles elevados del CA-125 antes de la cirugía en mujeres con masa pélvica predicen el diagnóstico de carcinoma de ovario, su elevación, puede preceder varios meses la evidencia clínica de enfermedad. En otros tipos de cáncer se presentan elevaciones del CA-125, sin embargo no se ha encontrado asociación de las mismas como factores independientes de pronóstico. En adenocarcinoma de endometrio se observa correlación con el estadio. En cáncer de pulmón el incremento del CA-125 se asocia con enfermedad avanzada.

MUCINA MUC-1 (CA 15.3, CA 27.29) La mucina polimórfica epitelial (PEM) es uno de varios términos empleados para describir a la glicoproteína de gran tamaño codificada en el gen MUC-1. La mucina MUC-1 es una glicoproteína expresada por la mayoría de epitelios “húmedos” (vejiga, seno, estómago, páncreas, ovarios y tracto respiratorio). En tejido mamario normal MUC-1 se expresa en la superficie apical de las células epiteliales de los ductos y acinos, de dónde es liberada en glóbulos grasos y en forma soluble en la leche. En el tejido tumoral la pérdida de la polarización celular ocasiona una expresión alterada de moléculas en la membrana celular que en conjunto con la alteración en la arquitectura normal del tejido lleva a que la glicoproteína MUC-1 alcance la cirulación sanguínea, donde es detectable mediante inmunoanálisis. MUC-1 es una glicoproteína de alto peso molécular (250 a 1.000 kD), con un centro proteíco y cadenas laterales de carbohidratos. El dominio extracelular de MUC-1 consiste de un péptido central altamente glicosilado mediante enlaces O, este péptido contiene un número variable de repeticiones de una secuencia de 20 aminoácidos denominada como dominio de repeticiones en tá ndem de número variado (VNTR). Cada VNTR tiene cinco sitios potenciales de O-glicosilación. La glicolisación está controlada mediante enzimas y ocurre post-traduccional y secuencialmente, con la potencialidad de introducir enlaces de O-

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES glicosilación con cuatro tipos de carbohidratos diferentes capaces de elongación en cadenas de polisacáridos. El proceso tumoral per se implica la alteración de estos procesos enzimáticos involucrados en las modificaciones postraduccionales, hecho que ocasiona alteraciones en el estado de glicosilación de MUC-1. En general, las cadenas laterales de polisacáridos asociadas a la proteína MUC-1 son más cortas en el tumor que las de la molécula expresada en tejido normal. Tanto la sobreexpresión de MUC-1 como la presencia de moléculas de MUC-1 aberrantes son características de malignidad. Es claro que la proteina MUC-1 es muy heterogénea debido a su naturaleza polimórfica (los VNTR) y al alto grado de variabilidad en la glicosilación. Se ha generado un número alto y diverso de anticuerpos monoclonales con especificidad hacia esas diferentes epítopes. Anticuerpos que han sido la base del desarrollo de varios inmunoanálisiss como: Antígeno de cáncer 15.3 (CA15.3), antígeno asociado a carcinoma similar a mucina (MCA), CA549, CA27.29, mucina de cáncer de seno (BCM), EMCA, M26 y M29. La mucina MUC-1 detectada mediante un inmunoanálisis de captura para medir CA 15.3 en el que se emplean los anticuerpos monoclonales específicos 115D8 (producido contra membranas de glóbulos grasos de la leche) y DF3 (producido contra una fracción enriquecida de membranas de un carcinoma de seno metastático) fue el primer marcador de mucinas en el que se describieron cambios secuenciales en los niveles asociados con repuesta a la terapia. CA 15.3 ha sido el ensayo más usado y ha sido visto como el estándar de oro contra el que se han comparado los demás ensayos. Los niveles séricos de CA 15.3 están elevados en el 54 a 80% de pacientes con cáncer de seno metastático. También puede estar elevado en otros tipos de cáncer (de pulmón, ovario, endometrial y gastrointestinal) y en enfermedades benignas (hepatitis crónica, cirrosis hepática, tuberculosis, sarcoidosis y lupus eritematoso sistémico). Debido a la presencia de múltiples epítopes en la molécula MUC -1 se ha generado una amplia variedad de anticuerpos monoclonales para la detección de la mucina MUC-1 circulante, el uso de diferentes conjuntos de anticuerpos monoclonales en la detección de MUC-1 puede arrojar

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diferentes resultados en el seguimiento de cáncer de seno en una minoría de pacientes. El inmunoanálisis de CA 15.3 fue el más utilizado hasta la aparición del anticuerpo monoclonal CA 27.29 utilizado en un radioinmunoanálisis competitivo para detectar MUC-1. Aunque ambos ensayos proveen información similar, se han observado diferentes límites en el rango normal cuando se emplean ensayos diferentes y los resultados no son intercambiables, por lo que es importante tener en cuenta que se debe emplear el mismo ensayo de mucina MUC-1 para poder interpretar resultados secuenciales. Si por algún motivo es necesario cambiar la prueba durante el seguimiento de un paciente, es indispensable establecer una nueva línea de base.

CA 19.9 Es una glicoproteima mucinosa que se eleva en cáncer de páncreas avanzado y en cáncer de vías biliares.También se ha encontrado elevado en otros cánceres (de colon, esófago y hepático). Este marcador tumoral presenta una sensibilidad y especificidad del 80 a 90% para cáncer de páncreas y del 60 a 70% para cáncer de las vías biliares. En enfermedades benignas como cirrosis, colestasis, colangitis y pancreatitis también se presentan elevaciones del CA 19.9 aunque los valores son por lo general menores a 1,000 U/mL. Los pacientes del tipo sanguíneo Lewis nulo no producen CA 19.9, por lo que un 5% de los individuos son incapaces de producir este antígeno. El uso de este marcador es limitado, no tiene valor en tamizaje puesto que su valor predictivo positivo es menor al 1%. Sin embargo, el valor predictivo positivo de los niveles por encima 1.000 U/mL es 97% cuando se emplea en condiciones clínicas consistentes con cáncer de páncreas (ictericia asociada a masa en páncreas). Además los niveles de CA 19.9 por encima de 1,000 U/mL predicen la presencia de enfermedad metastásica. Es poco sensible en estados iniciales en los que la curación aun es posible. En pacientes con cáncer de páncreas resecable con elevación de 19.9, cuyos valores no se normalizan luego de la cirugía, la supervivencia es menor.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES LACTATO DESHIDROGENASA (LDH) Esta enzima está presente en todos los tejidos del cuerpo, por lo que puede estar elevada en la mayoría de tumores y en muchas enfermedades benignas. A pesar de su inherente baja sensibilidad y especificidad, puede ser un marcador tumoral de utilidad. La LDH se asocia principalmente con la carga tumoral. Es considerada de valor pronóstico importante en tumores de células germinales, aunque a diferencia de AFP y hCG, su elevación por si misma no es suficiente para iniciar un tratamiento, aunque sí puede señalar una posible recidiva. En cánceres indiferenciados de ovario se eleva y sus niveles se relacionan con el estado tumoral. En cáncer de pulmón de célula pequeña en el seguimiento luego de tratamiento.

ENOLASA ESPECÍFICA DE NEURONA (NSE) Es una isoenzima de la enolasa que se encuentra en el cerebro y en los tejidos neuronales. Se ha empleado principalmente en el carcinoma de pulmón de célula pequeña, en este cáncer la elevación del marcador se asocia con mayor extensión de la enfermedad, también es de utilidad en el seguimiento. En neuroblastoma los valores de NSE se asocian con el estadio y tiene valor pronóstico.

CATECOLAMINAS Estas sustancias o sus metabolitos ácido vanilmandélico y ácido homovanílico pueden estar elevados en pacientes con feocromocitoma, neuroblastoma y tumores carcinoides. Se relacionan con la extensión de la enfermedad y son de utilidad para determinar el pronóstico y en el seguimiento de estos pacientes.

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SEROTONINA Es producida de manera ectópica por los tumores carcinoides, su degradación en ácido 5.hidroxiindolacético permite su medición en orina. Niveles elevados de esta sustancia en orina indican presencia de metástasis hepáticas. Niveles superiores a 50 mg en 24 horas se asocian con un pronóstico pobre.

CALCITONINA Esta hormona es secretada normalmente por las células parafoliculares C en la glándula tiroides, su papel es regular los niveles sanguíneos de calcio. En el carcinoma medular de la tiroides (originado en las células parafoliculares C) los niveles de esta hormona se encuentran elevados. Este marcador, que no es de uso muy frecuente, puede emplearse en el diagnóstico inicial de este cáncer; dado que este tipo de tumor tiene un componente hereditario, es posible determinar la calcitonina periódicamente en los familiares que están en riesgo para detectar el cáncer precozmente. Otros tipos de cáncer, en particular de pulmón, pueden producir calcitonina pero en estos cánceres no se emplea este marcador en el seguimiento.

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APLICACIONES CLINICAS DE LOS MARCADORES TUMORALES SERICOS MÁS COMUNES MARCADORES TUMORALES EN TUMORES DE CELULA GERMINAL La AFP, la hCG y la LDH son marcadores tumorales bien establecidos para el manejo exitoso de pacientes con tumores testiculares y otros tumores de línea germinal. La disponibilidad de tratamientos efectivos y curativos y el hecho de que los cambios en la concentración sérica de estos marcadores reflejen y predigan de manera confiable la respuesta clínica, al tal grado que la serología predomine sobre la histología en las decisiones de tratamiento, hace obligatoria la determinación de estos marcadores tumorales antes y después del tratamiento. El grupo europeo de marcadores tumorales también recomienda determinar la fosfatasa alcalina placentaria en suero, dado que esta se eleva hasta en 80% de los seminomas testiculares, de los que menos del 20% produce hCG. Esta medición no se debe hacer en fumadores, ya que en estos las concentraciones de fosfatasa alcalina placentaria en suero pueden estar elevadas hasta 10 veces en comparación con el valor de individuos no fumadores. La asociación europea de urología considera la medición de fosfatasa alcalina placentaria y NSE como opcionales en los casos de seminomas. Los estudios del International Germ Cell Cancer Collaborative Group han confirmado el valor pronóstico de AFP, hCG y lactato deshidrogenasa. Las concentraciones de estos marcadores antes del tratamiento contribuyen a la clasificación de los tumores de célula germinal metastásicos como de pronóstico bueno, intermedio o pobre.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES El seguimiento después del tratamiento es también esencial para un cuidado óptimo, la normalización del marcador tumoral es requerida para evaluar la respuesta a la quimioterapia. La rapidez en la disminución de la concentración del marcador tumoral en las primeras seis semanas de quimioterapia puede predecir el potencial de recaída meses después, durante la quimioterapia se recomiendan mediciones semanales. Los esquemas de seguimiento dependen de la histología, el estadio y del tratamiento elegido después de la orquidectomía. En general se recomiendan mediciones mensuales para el primer año después del tratamiento, mediciones cada dos meses el segundo año, cada dos o tres meses el tercer año y cada seis meses hasta los cinco años. La disminución en la concentración del marcador tumoral después de la orquidectomía contribuye al manejo de los pacientes con tumores de células germinales y puede determinarse a partir de las mediciones seriadas recomendadas por la mayoría de grupos. La tasa de disminución debe calcularse y compararse con las tasas normales de desaparición de AFP (vida media < 7 días) y la hCG (vida media < 3 días). En las mediciones de laboratorio la definición de una línea de base estable es esencial, pues se puede instaurar un tratamiento con base en incrementos relativamente pequeños de estos marcadores. Tabla 7. Uso clínico de marcadores tumorales en canceres de célula germinal

MARCADORES TUMORALES EN TUMORES DE CÉLULA GERMINAL Uso clínico Marcador tumoral Tamizaje Ninguno Diagnóstico AFP, hCG, LDH Estadificación/pronóstico AFP, hCG, LDH Detección de recurrencias AFP, hCG, LDH Monitoreo de terapias AFP, hCG, LDH

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MARCADORES TUMORALES EN CANCER COLORECTAL En cáncer colorectal el CEA sigue siendo el marcador más relevante. Aunque en este tumor la detección temprana es la clave para su control existe acuerdo unánime en que el CEA no tiene utilidad en tamizaje o en diagnóstico temprano debido a su falta de sensibilidad y especificidad. Una mejora en la detección temprana de este cáncer será más probablemente el resultado de una mayor conciencia de los síntomas de los pacientes y sus médicos y probablemente de la implementación de programas de tamizaje de sangre fecal oculta. En los pacientes con cáncer colorectal las mediciones de CEA antes de la cirugía son recomendadas puesto que el resultado puede complementar la clasificación en estadio y ayudar en la planeación del tratamiento quirúrgico, estas recomendaciones se basan en múltiples estudios que han mostrado una asociación entre niveles altos antes de la cirugía y mayor riesgo de recurrencia; sin embargo, aun no hay evidencia de que los pacientes se beneficien de terapia adyuvante solamente con base en concentraciones anormales de CEA previas a la cirugía. El papel de CEA en la detección temprana de recurrencias también es controversial, probablemente debido a que son pocos los estudios que señalan que la intervención temprana mejore el resultado clínico. Sin embargo los resultados de dos metaanálisis recientes señalan una diferencia estadísticamente significativa en la supervivencia a cinco años en pacientes en seguimiento intensivo, en uno de los estudios se sugiere que la mejora se da sólo si se realizan mediciones de CEA. Para los pacientes que han sido sometidos a resección de metástasis hepáticas aisladas se recomienda la medición post operatoria de CEA cada dos a tres meses durante los dos años siguientes al diagnóstico, si se confirman niveles anormales de CEA, se debe buscar evidencia de enfermedad metastásica antes de iniciar terapia. También se recomienda el uso del CEA en el seguimiento de pacientes con cáncer colorectal avanzado y en el seguimiento de la respuesta al tratamiento, con mediciones cada 2 a 3 meses durante los dos años posteriores al diagnóstico

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inicial. Se requieren dos resultados sucesivos por encima de la línea de base para documentar enfermedad progresiva. Aunque las mediciones de CEA no deben ser usadas aisladamente para seleccionar el tratamiento pueden brindar información adicional por ejemplo identificar terapias poco efectivas que deben ser descontinuadas, también puede ser útil cuando no es posible acceder a la enfermedad por otros medios.

Tabla 8. Uso clínico de marcadores tumorales en cáncer colorectal.

MARCADORES TUMORALES EN CANCER COLORECTAL Uso clínico Tamizaje Diagnóstico Estadificación/pronóstico Detección de recurrencias Monitoreo de terapias

Marcador tumoral Ninguno Ninguno CEA CEA CEA

MARCADORES TUMORALES EN CANCER DE MAMA Existe acuerdo unánime en que la determinación del estatus de receptores de estrógeno y progesterona es esencial en las lesiones primarias de todas las pacientes pre o post menopaúsicas para identificar aquellas con mayor probabilidad de responder a terapia endocrina. En cáncer de seno metastásico las concentraciones de receptores se determinan sólo si los resultados afectan decisiones terapéuticas. La determinación de la amplificación de HER-2/neu (c-erbB2) es obligatoria en la selección de pacientes para terapia con trastuzumab.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES En múltiples estudios se ha confirmado que el CA15-3 y el CA 27.29 son los mejores marcadores séricos disponibles para cáncer de mama, sin embargo su aplicación es limitada por su baja sensibilidad en estadios tempranos de la enfermedad, su falta de especificidad y la controversia en relación con si su medición mejora el resultado clínico. Estos dos marcadores no son recomendados para tamizaje, diagnóstico o estadificación de cáncer de mama. Aunque su presencia en altas concentraciones séricas usualmente señala enfermedad metastásica, los datos son insuficientes para incorporarlos en el sistema de estadificación. Con respecto a su uso en el seguimiento post tratamiento también existe controversia, los mayores problemas tienen relación con el uso de CA 15-3 como indicador de recurrencia asintomática, por la baja incidencia de CA 15-3 en estadios tempranos, la falta de opciones de tratamiento en la enfermedad recurrente y la baja eficiencia de detección. En general no se recomienda el uso de rutina de los marcadores CA 15.3 o CA 27.29 solos para monitoreo de respuesta al tratamiento, sin embargo, estos marcadores se pueden emplear para sugerir falla en el tratamiento cuando la enfermedad no es fácilmente mesurable. En general se recomienda su uso con precaución como una ayuda en el monitoreo del curso clínico de pacientes con cáncer de mama. El CEA en cáncer de mama es recomendado por algunas escuelas, en algunas de ellas se estipula que se debe usar sólo si el CA15-3 no está incrementado inicialmente.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES Tabla 9. Uso clínico de marcadores tumorales en cáncer de Mama. MARCADORES TUMORALES EN CANCER DE MAMA Uso clínico Marcador tumoral. Selección de pacientes para terapia ER y PR en lesiones primarias. endocrina Selección de pacientes para terapia Sobreexpresión de Her2/neu. con trastuzumab Tamizaje Ninguno. Diagnóstico Ninguno. Pronóstico Ninguno. Monitoreo de tratamiento CA15-3 o CA27.29, CEA*. * Sólo si CEA está elevado inicialmente y CA15-3 no.

MARCADORES TUMORALES EN CANCER DE OVARIO El CA-125 es el mejor marcador disponible para cáncer epitelial de ovario. Aunque su sensibilidad y especificidad no son suficientes para utilizarlo en tamizaje o en diagnóstico, este marcador podría tener un papel en tamizaje de malignidad, en mujeres con historia familiar de cáncer de ovario. El CA-125 también es útil en el diagnóstico diferencial de masas pélvicas en mujeres post menopáusicas. Se ha demostrado ampliamente el valor pronóstico de la tasa de disminución en los niveles de CA-125 después de la cirugía citoreductora y durante la quimioterapia citotóxica. Debido a la ausencia de tratamiento curativo para la enfermedad recurrente, no existe un consenso con respecto al empleo del CA125 en el seguimiento, ni de la frecuencia con que se debe medir, sin embargo es importarte tener en cuenta que la enfermedad puede progresar en ausencia de elevación del marcador.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES Tabla 10. Uso clínico de marcadores tumorales en cáncer de ovario

MARCADORES TUMORALES EN CANCER DE OVARIO Uso clínico Marcador tumoral Tamizaje Ninguno Diagnóstico Ninguno Estadificación/pronóstico CA125 Detección de recurrencias CA125 Monitoreo de terapias CA125

MARCADORES TUMORALES EN CANCER DE PRÓSTATA El antígeno específico de próstata (PSA) es sin lugar a dudas el marcador tumoral mejor conocido, su uso en tamizaje de cáncer de próstata ha generado gran interés tanto en el público como en los profesionales de la salud, sin embargo no existe consenso con respecto a los beneficios derivados del mismo. Por el contrario, el uso del PSA con el tacto rectal como ayuda diagnóstica es mucho menos controversial y ampliamente recomendado, sin embargo el diagnóstico definitivo requiere de biopsia. Aunque no está oficialmente incorporado en el sistema de estadificación TNM, el PSA es comunmente empleado como un indicador pronóstico en el manejo de pacientes y es generalmente recomendado en el seguimiento de pacientes con cáncer de próstata. Sin embargo, el uso e interpretación de las determinaciones seriadas de PSA reviste importantes desafíos, por ejemplo, no todos los pacientes con recurrencia bioquímica desarrollarán enfermedad metastásica, el PSA puede ser poco confiable en tumores poco diferenciados y no hay una terapia efectiva para la enfermedad endocrino-resistente.

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Tabla 11. Uso clínico de marcadores tumorales en cáncer de próstata.

MARCADORES TUMORALES EN CANCER DE PRÓSTATA Uso clínico Marcador tumoral Tamizaje PSA (con tacto rectal) Ayuda en diagnóstico PSA (con tacto rectal) Pronóstico PSA Seguimiento después del PSA diagnóstico

MARCADORES EN CANCER DE PULMÓN, NEUROENDOCRINO Y DE TIROIDES En cáncer de pulmón el uso de marcadores tumorales es bastante restringido debido a que las opciones terapéuticas son muy limitadas. La enolasa específica de neurona (NSE) se recomienda en el diagnóstico diferencial de cáncer de pulmón de célula pequeña. Aunque el seguimiento de pacientes asintomáticos después de la terapia de primera línea es controversial, las determinaciones seriadas del marcador pueden proveer evidencia de resección completa y/o recurrencia temprana. Los tumores neuroendocrinos son poco frecuentes, pero los marcadores tumorales pueden contribuir de manera importante a su diagnóstico, que por lo general es difícil. Las Catecolaminas y el ácido vanilmandélico y/ o el homovanílico como indicadores de feocromocitoma y neuroblástoma. La Calcitonina para diagnóstico y seguimiento de carcinoma medular de tiroides, la tiroglobulina en cáncer tiroideo.

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MARCADORES GENÉTICOS A partir del descubrimiento en la década del 60 de la aparición de un pequeño cromosoma, denominado cromosoma Philadelphia (Ph), en pacientes con leucemia mieloide crónica, el análisis citogenético ha tenido gran impacto tanto en el entendimiento de las bases biológicas del cáncer como a nivel clínico. La descripción de alteraciones cromosómicas asociadas específicamente a un tipo de cáncer dado, y su seguimiento posterior ha permitido conocer su significado clínico y constituye un paso previo a la identificación de genes implicados en el proceso tumoral. El conocimiento de la alteración cromosómica asociada a un diagnóstico determinado es una herramienta de utilidad en el seguimiento, en la evaluación de la respuesta al tratamiento y en la detección de enfermedad residual mínima. Día a día son más los protocolos clínicos, especialmente en neoplasias hematológicas y sarcomas, en los que el análisis genético del tumor es parámetro importante en las decisiones terapéuticas. La mayoría de laboratorios de genética realizan análisis citogenético convencional en neoplasias hematológicas, debido a la facilidad para obtener células en metafase a partir de cultivos de médula ósea. Existen múltiples estudios clínicos en los que se han analizado las alteraciones cromosomales asociadas específicamente a un tipo determinado de leucemia o de linfoma y se ha valorado igualmente su valor respecto al pronóstico. Por ejemplo, la detección del cromosoma de Philadelphia t(9;22) en un paciente con diagnóstico de Leucemia linfoblástica aguda tiene un significado pronóstico desfavorable, su presencia conlleva a la aplicación de una terapia más agresiva. En la tabla 12 podemos ver algunos ejemplos de este tipo de alteraciones y los tumores que las portan.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES Tabla 12. Alteraciones genéticas en neoplasias hematológicas.

Neoplasias Hematológicas Patología Leucemia mieloide crónica Leucemia mieloide aguda

Leucemia mieloide crónica Leucemia linfoide aguda Desordenes mieloproliferativos Síndromes mielodisplásicos Leucemia linfoide crónica Policitemia vera Leucemia linfoide aguda Cronicidad relacionada a terapia Leucemia mieloide Sindrome mielodiaplásico Leucemia promielocítica aguda

Alteración genética

Aplicación

Traslocación 9,22 genes BCR/ABL Trisomía 8 Trisomía 19 Trisomy 21 Iso (17q) Trisomía 8 8(p11.1-q11.1)

Diagnóstico

Deleción 5q31 ERG-1

Pronóstico

Translocation 15,17 PML/RARA 3’RAR/5’RARA Síndromes mielodisplásicos 7q31 D 75486 Leucemia linfocitica crónica B Deleción 13q D13525 13q14.3q Deleción P53 17p13.1 Leucemia linfocítica aguda B de la Traslocación 12, 21 infancia TEL/AML1

Pronóstico

Pronóstico Crisis blástica mieloide y basofilia

Diagnóstico Pronóstico Seguimiento Pronóstico Resistencia a terapia Pronóstico Enf. Resid. Mínima

Tabla modificada de Muhlmann M, Genet. Mol. Res.2002 1 (2): 117-127 con autorización

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES En los linfomas, el análisis citogenético convencional es más complicado que el de la leucemias, el acceso al tejido tumoral es más limitado, los cariotipos resultan más complejos y adicionalmente existen muchos tipos histológicos con distintas características clínicas. Sin embargo, ha sido posible identificar algunas alteraciones genéticas en linfomas con significado pronóstico independiente. En los tumores sólidos existen dificultades de tipo metodológico que han impedido el uso de rutina del análisis citogenético convencional. La obtención de metafases analizables a partir de muestras de tejido tumoral es complicada por la baja viabilidad celular, la presencia de bacterias contaminantes, la presencia de células no tumorales, y la presencia de alteraciones cromósomicas muy complejas que dificultan la identificación de las alteraciones cromosómicas primarias asociadas con un tipo tumoral específico. En la tabla 13 se presentan algunas alteraciones genéticas descritas en tumores sólidos

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES Tabla 13. Alteraciones genéticas en tumores sólidos

Tumores sólidos Patología Alteración genética Retinoblastoma Gen RB1: 13q14 D13525 Cáncer de seno Deleción 7q31-D75522 Amplificación 17q11.2q12 Her-2/neu Amplificación 8q24.2q24.3 Oncogen c-myc Amplificación 20q13.2 Amplificación 11q13 Neuroblastóma Amplificación N-myc 2p23-p24 Carcinoma de Deleción 13q14 colon Osteosarcoma RB-1

Cáncer de próstata recurrente

Amplificación Xq12 Locus de l receptor de andrógeno

Aplicación Diagnóstico Pronóstico Resistencia a terapia

Pronóstico Evaluación Diagnóstico pronóstico Diagnósticopronóstico Indicador de tratamiento Diagnósticopronóstico Indicador de tratamiento

Tabla modificada de Muhlmann M, Genet. Mol. Res.2002 1 (2): 117-127 con autorización

Estas dificultades han estimulado el desarrollo de nuevos métodos citogenéticos para identificar alteraciones cromosómicas. La incorporación de la citogenética molecular basada en la hibridación in situ con fluorescencia ha permitido importantes avances en el análisis citogenético de los tumores sólidos. En el último catálogo de alteraciones cromosómicas asociadas a cáncer se describen alrededor de 100.000 alteraciones en más de 30.000 neoplasias de las que algo más de 8.000 corresponde a tumores sólidos (base de datos del Proyecto de Alteraciones Cromosómicas en Cáncer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCAP).

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES El estudio a nivel molecular de las alteraciones cromosómicas encontradas ha permitido conocer los mecanismos patogénicos subyacentes. Se han identificado más de 1.800 puntos de ruptura en las alteraciones cromosómicas asociadas a neoplasias, muchos de estos han sido caracterizados, lo que ha llevado a la identificación de nuevos oncogenes y supresores tumorales. En linfomas por ejemplo las traslocaciones t(8;14) en Linfoma de Burkit, t(14;18) detectada en linfoma folicular y t(11;14) detectada en linfoma de manto han permitido identificar los oncogenes implicados en estas patologías c-myc, bcl-2 y bcl-1, en este caso los protooncogenes son activados debido la translocación que los ubica en un lugar adyacente a secuencias reguladores del gen de la cadena pesada de la inmunoglobulinas, lo que causa sobreexpresión de la proteína codificada por el protooncogén. En la traslocación t(9;22) asociada a leucemia mieloide crónica se produce la traslocación del oncogen abl con el oncogen bcr, generándose un gen de fusión híbrido bcr-abl, que codifica una proteína quimérica de características oncogénicas. Este mecanismo es común en leucemias y sarcomas. Los protoncogenes pueden activarse por mecanismos de amplificación génica, mecanismo descrito para los oncogenes rel, c-myc y erbb-2. Las deleciones cromosómicas son otro tipo de alteración comúnmente encontrada en cáncer, que a nivel molecular puede traducirse en inactivación de genes supresores tumorales. Es el caso de las deleciones en el brazo corto del cromosoma 17 que causan la deleción de un alelo del gen p53, si el otro alelo está alterado el gen se inactiva.

METODOLOGÍAS EMPLEADAS EN EL ANÁLISIS GENÉTICO DE LOS TUMORES Cariotipo de bandas G Las alteraciones cromosómicas son estudiadas sobre metafases de células neoplásicas provenientes de medula ósea, ganglios linfáticos, o biopsias cultivadas in vitro por corto tiempo. La tinción de bandas G (Giemsa-tripsina) permite observar tanto alteraciones en número

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES (trisomías, disomías etc) como alteraciones estructurales (traslocaciones, deleciones etc). En la Figura 2, panel izquierdo, se muestra un cariotipo convencional de una leucemia mieloide crónica. Se puede apreciar la traslocación 9, 22 y la presencia del pequeño cromosoma filadelfia.

Hibridación in situ con fluorescencia (FISH) Esta metodología se basa en la hibridación de una sonda de DNA marcada con un fluorocromo con su secuencia complementaria del genoma en metafases cromosómicas o en núcleos en interfase. Esta técnica se introdujo en los ochenta, dada su alta especificidad y sensibilidad, hoy día es muy empleada en los laboratorios de genética. Existen varios tipos de sonda a emplear: sondas centroméricas, de coloreado cromosómico (marcan todo un cromosoma) y específicas de secuencia (marcan regiones cromosómicas de secuencia única). Esta técnica no detecta nuevas alteraciones, permite detectar alteraciones conocidas, complementa la citogenética, pues permite buscar alteraciones en las que no se pudo obtener el cariotipo. En la figura 2 panel derecho, se puede apreciar un estudio de FISH en una leucemia mieloide crónica, en el que se empleó una sonda marcada (rojo) para detectar el gen abl (cromosoma 9), y una sonda marcada (verde) para detectar el gen bcr (cromosoma 22), la presencia de la traslocación 9,22 se hace evidente por la detección de las dos señales en el mismo cromosoma. En la parte inferior de la figura se muestra un esquema de la ubicación de los genes a nivel molecular.

Hibridación genómica comparativa (CGH) Esta técnica está basada en la hibridación competitiva de dos tipos de DNA marcados con fluorocromos diferentes, DNA tumoral (verde) y DNA normal (rojo). Los dos tipos de DNA se mezclan en cantidades iguales y se hace una hibridación in situ sobre metafases con cromosomas normales. Se da una competición entre los DNA marcados por hibridar sobre su secuencia complementaria.

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Figura 2. Detección del cromosoma filadelfia en un caso de Leucemia mieloide crónica. Panel izquierdo, cariotipo convencional, panel derecho FISH sobre células en interfase utilizando sondas específicas para los genes comprometidos en la translocación (abl cromosoma 9 rojo y bcr cromosoma 22 verde). Nótese la presencia del cromosoma traslocado con los colores de las dos sondas. Fotografías cortesía del Laboratorio de genética y oncología molecular del Instituto Nacionel de Cancerología. Bogotá. Colombia.

En DNA tumoral sin alteraciones cromosómicas, la hibridación de los dos tipos de DNA se da en proporciones similares y los cromosomas se ven amarillos. Cuando el tumor presenta alteraciones cromosómicas existe mayor cantidad de DNA tumoral para hibridar, y la hibridación en esa zona tendrá mayor fluorocromo de DNA tumoral (verde). Si en el tumor han ocurrido deleciones, la región delecionada en el tumor aparecerá en rojo, pues existe mayor cantidad de DNA normal para hibridar. La CGH permite detectar tanto pérdidas como ganancias de regiones cromosómicas en todo el tumor mediante la comparación de las intensidades de las señales de hibridación. Esta técnica ha permitido importantes avances en el conocimiento de las alteraciones cromosómicas en

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES cáncer, particularmente en tumores sólidos, en los que es muy difícil la obtención de metafases. En las figuras 3a y 3b se presenta un ejemplo de CGH en el que se detectó la presencia de un cromosoma X supernumerario.

Figura 3a. Hibridación genómica comparativa de una metafase humana. Resultados de un caso de múltiples X. (Nótese la señal más intensa en los cromosomas X y x). Tomado de Muhlmann M, Genet. Mol. Res.2002 1 (2): 117-127 con autorización.

Figura 3b. Ejemplos del análisis de la hibridación genómica comparativa. Panel izquierdo, Cromosoma uno: señal normal con relación rojo / verde de uno. Panel derecho: Cromosoma X con relación rojo verde de 2,5, lo que indica presencia de un supernumerario. Tomado de Muhlmann M, Genet. Mol. Res.2002 1 (2): 117-127 con autorización.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES Cariotipo espectral (sky-FISH) y multi-FISH (M-FISH) Estas son técnicas de citogenética molecular de desarrollo reciente, utilizadas por el momento con fines de investigación. En estas el DNA de cada cromosoma es marcado con uno o varios fluorocromos, de manera que el espectro de emisión de cada cromosoma es único y diferente del de los demás. La mezcla de las 24 sondas de coloreado cromósomicoo se híbrida sobre las metafases de células tumorales, los cromosomas alterados no se ven uniformes, sino con los colores de los cromosomas que intervienen en la translocación. Estos cariotipos multicolor han permitido caracterizar translocaciones complejas y traslocaciones crípticas en cariotipos en apariencia normales y por lo tanto identificar un gran número de alteraciones nuevas. Su uso en tumores sólidos se dificulta por la necesidad de tener metafases de muy buena calidad.

Análisis molecular mediante PCR Desde su descripción en 1985 la PCR es una metodología que revolucionó completamente la biología molecular, actualmente es utilizada para detectar alteraciones genéticas en el diagnóstico y el seguimiento de pacientes con cáncer. Está técnica permite amplificar secuencias específicas de DNA o RNA 106 veces a partir de un DNA blanco. Uno de los usos más frecuentes de la PCR en neoplasias es la detección de traslocaciones. La caracterización a nivel molecular de las traslocaciones observadas en el cariotipo y asociadas a determinado tipo tumoral, ha permitido identificar y caracterizar los genes involucrados. La caracterización de estos genes (clonación, secuenciación) permite diseñar estrategias basadas en PCR para estudiar esas traslocaciones mediante PCR (a partir del DNA) o PCR reversa (a partir del RNA tumoral). En general los estudios de PCR son cualitativos, indicando sólo presencia o ausencia de la alteración, sin embargo en estudios de seguimiento o evaluación de enfermedad residual mínima es importante la cuantificación mediante PCR en tiempo real, técnica que permite una medición cuantitativa del grado de afectación.

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HACIA UNA CARACTERIZACION MOLECULAR DEL CANCER El conocimiento de la totalidad del genoma humano, disponible hoy día públicamente, ha abierto inmensas posibilidades de avance en el entendimiento, la caracterización y el tratamiento del cáncer. Las diferencias biológicas entre los tumores que llevan a variaciones en morfología y comportamiento clínico pueden ser analizadas mediante el empleo de metodologías como microarreglos de DNA para análisis de expresión génica, hibridación genómica comparativa, hibridación in situ fluorescente, PCR cuantitativa y análisis mutacional. La regulación normal de las células puede ser alterada por muchos factores como infecciones virales, metilación del DNA, alteraciones en su secuencia, etc; cuando estas agresiones afectan la función de los genes que controlan la proliferación celular, los mecanismos de reparación, apoptósis y angiogénesis se da el proceso neoplásico. Las técnicas moleculares actuales proveen herramientas de gran aplicación en el descubrimiento de las causas genéticas y epigenéticas del cáncer.

MICROARREGLOS DE ADN Los microarreglos de DNA consisten de miles de sondas individuales de DNA, cada una representativa de un gen diferente, sintetizadas o depositados en un arreglo de círculos en filas y columnas en la superficie de una lámina de vidrio. Cada círculo del arreglo corresponde a una sonda de DNA particular, y cada sonda corresponde a un fragmento corto de un gen. RNA derivado de ese gen puede unirse a la sonda (en el círculo), ésta es la reacción central del análisis de microarreglos. Las sondas de DNA en el microarreglo son por lo general oligonucleótidos o fragmentos de DNA copia. Los microarreglos fueron empleados inicialmente para medir la expresión génica, puesto que la técnica permite la cuantificación simultánea de los niveles de mRNA de manera simultanea para 100 a 1000 genes. Los microarreglos de ADN se han empleado también para obtener los perfiles de expresión génica en cáncer humano, permitiendo definir patrones de expresión con significado biológico y clínico

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Más recientemente han surgido otras aplicaciones de los microarreglos: Medición de alteraciones en el número de copias de DNA genómico (amplificación o deleción génica) en los tumores. También se han empleado microarreglos de anticuerpos para detectar niveles de proteína. Cualquier estudio de microarreglos incluye seis pasos: manufactura del microarreglo, preparación y marcación del RNA, hibridación del RNA blanco marcado sobre la lámina, lectura, preparación de los datos y análisis de datos asistido por computador, representados en la figura 4.

Figura 4. Principales pasos en un procedimiento de microarreglo de DNA

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MANUFACTURA DEL MICROARREGLO Los microarreglos de círculo son hechos con robots que depositan el cDNA (productos de PCR) u oligonucleótidos cortos en láminas portaobjeto de vidrio especiales. El tamaño de los círculos es de entre 80 y 180 µm y los arreglos contienen hasta 80.000 puntos. Las secuencia génicas colocadas en los microarreglos son obtenidas de bases de datos públicas, con acceso a secuencias de genes bien caracterizados y a secuencias expresadas (ESTs) representativas de genes de función desconocida. Los clones escogidos son amplificados por PCR a partir de colecciones de cDNA y purificados antes de colocarlos en el microarreglo. Los microarreglos permiten el análisis simultáneo de la expresión génica en dos muestras biológicas, la muestra en estudio y el control. Esta comparación directa de los perfiles de expresión de dos muestras, por ejemplo tejido sano v.s tejido tumoral, presenta importantes ventajas en el análisis. Además, dado que en el microarreglo se depositan miles de secuencias de genes expresados y ESTs de función no conocida, existe la posibilidad de descubrir nuevos genes y definir su rol en enfermedad. Una desventaja de los microarreglos es que proveen información únicamente sobre expresión relativa de genes específicos entre células específicas o entre muestras de tejidos. Los GeneChips son producidos mediante la síntesis in situ de decenas a miles de oligonucleótidos sobre la lámina de vidrio, en general se incluyen de 16 a 20 oligonucleótidos por gen a analizar. La ventaja de esta tecnología es que permite medir expresión absoluta de los genes en células o tejidos, sin embargo su costo es elevado, no permite comparación simultánea de dos muestras biológicas en el mismo arreglo y requiere el conocimiento previo de la secuencia del gen.

DISEÑO EXPERIMENTAL En investigación en cáncer los diseños más utilizados son casos y controles, en bloques y perfil aleatorio. En el estudio de casos y controles

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dos muestras del mismo individuo, por ejemplo tejido tumoral y tejido sano son comparadas directamente. Los diseños en bloque se emplean por lo general para examinar el efecto de un tratamiento o condición de cultivo en líneas celulares, por ejemplo líneas celulares cultivadas en ausencia o en presencia de un droga anticancerosa, o para examinar líneas diferentes relacionadas (silvestre vs. mutante o transfectada vs. no transfectada). Los perfiles aleatorios son usados cuando se seleccionan líneas celulares o pacientes y se obtienen sus perfiles, este análisis permite usar datos de varios individuos, sin control intrínseco de sesgos en la población de pacientes o de células analizadas. Tanto en el diseño de bloques como en el de perfiles la muestra se compara con un control universal (RNA de referencia disponible comercialmente) que debe tener representatividad de la mayoría de genes incluidos en el arreglo

PREPARACIÓN DEL ESPECIMEN E HIBRIDACIÓN Para obtener un perfil de expresión génica, es necesario que el tumor esté fresco, que se congele rápidamente o que se preserve de manera que se mantenga la integridad del mRNA. Los tejidos preservados en parafina no son compatibles con este tipo de análisis, se requieren al menos 0,2 g de tejido lo que impide el uso de material proveniente de biopsias con aguja fina. Dado que los tumores son heterogéneos a nivel celular y adicionalmente contienen varios tipos celulares no tumorales (células estromales, inflamatorias, endoteliales etc), para lograr una caracterización molecular del tumor es necesario identificar los perfiles de expresión en las células tumorales del espécimen, esto puede hacerse mediante aislamiento físico de las células tumorales (micro disección, micro disección con LASER, o desagregación del tejido y separación de las células). Tanto RNA total como mRNA pueden emplearse, existen varias metodologías en uso para extraer el RNA que en general dan resultados similares. La evaluación cualitativa y cuantitativa del material extraído puede hacerse por técnicas estándar como electroforésis en geles de agarosa.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES El RNA aislado es sometido a transcripción reversa, para obtener cDNA (DNA copia) en presencia de deoxinucleótidos acoplados a un trazador fluorescente o radioactivo, después de purificar y desnaturalizar, los cDNA marcados son hibridados en el microarreglo, luego los microarreglos son lavados en condiciones astringentes para eliminar uniones inespecíficas, y finalmente se dejan secar.

OBTENCIÓN DE DATOS Cada hibridación en microarreglos de DNA puede generar mediciones de expresión génica de más de 20.000 genes humanos diferentes. La obtención del perfil de 50 tumores genera más de un millón de datos, por lo que es necesario tener un sistema muy eficiente de bases de datos, para almacenar y organizar los datos y las imágenes del microarreglo, posteriormente se hace una normalización de los datos con el fin de que puedan se comparables con los obtenidos por otros laboratorios.

ANÁLISIS ESTADISTICO Se han aplicado varias aproximaciones estadísticas para analizar los datos de los microarreglos: análisis de varianza, agrupamientos jerárquicos, agrupamientos k-media, mapas de autoorganización. Los datos se pueden analizar sin tomar en cuenta los parámetros clínicopatológicos de los especimenes (análisis no supervisado), empleando metodologías como la de agrupación jerárquica, esto permite delinear patrones de expresión génica con significado biológico, identificar nuevos subtipos tumorales e inferir funciones génicas. También se pueden analizar tomando en cuenta los datos clinicopatológicos (análisis supervisado) para identificar específicamente genes asociados con un diagnóstico determinado, con respuesta al tratamiento etc. Ambas aproximaciones aplicadas en el análisis de los microarreglos son de gran utilidad. Al hacer la caracterización molecular del cáncer mediante microarreglos, muchos genes resultan de interés clínico o biológico, y sería deseable

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES evaluarlos como candidatos a marcadores diagnóstico o como blancos terapéuticos. Un reto importante es seleccionar prioritariamente aquellos a investigar. Los candidatos interesantes son genes con funciones patológicas plausibles, genes asociados con éxito en su empleo como inhibidores, genes asociados con alteración en número de copias del DNA, y genes que codifican proteínas de membrana, estos últimos serían blancos ideales de terapia citotóxica o radioactiva dirigida con anticuerpos específicos.

VALIDACIÓN DE LOS GENES SELECCIONAD OS MEDIANTE MICROARREGLOS Mientras que los experimentos de microarreglos caracterizan la expresión génica de miles de genes, en general sólo un pequeño número de especimenes son examinados (de 10 a 50). Los hallazgos deben validarse en un conjunto mayor de especimenes, además debido a que se requiere mRNA intacto para los ensayos, en general los especimenes deben recolectarse de manera prospectiva y por lo general no se tiene el suficiente seguimiento clínico para la evaluación de marcadores tumorales potenciales. Los microarreglos de tejidos son una nueva alternativa para incrementar la eficiencia en la evaluación de muchos genes de interés, estos son un arreglo de alta densidad de fragmentos de tejido de 0,6 mm provenientes de cientos de especimenes diferentes, lo que permite su análisis en paralelo por inmunohistoquímica, hibridación in situ, FISH. Dado que los tejidos provienen de bloques de parafina obtenidos retrospectivamente es posible tener mucha más información sobre el seguimiento clínico, necesaria para la evaluación de la utilidad pronóstico. Otra tecnología de utilidad en la validación de genes y evaluación de candidatos a marcadores diagnóstico es la RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) cuantitativa, esta técnica permite la cuantificación de niveles de mRNA en formatos de 96 o 384 muestras. Sin embargo, al igual que con la hibridación in situ el grado de preservación del mRNA suficientemente intacto en tejidos embebidos en parafina es muy variable.

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PERFILES DE EXPRESIÓN GÉNICA EN CÁNCER El cáncer es causado por la acumulación de alteraciones genéticas y epigenéticas que resultan en expresión alterada de genes relacionados con el proceso de transformación maligna, como oncogenes, genes supresores de tumores, e igualmente genes involucrados en el control de: ciclo celular, apoptosis, adhesión, reparación del DNA y angiogénesis. Dado que los perfiles de expresión génica proveen una vista general de las funciones y procesos celulares en el momento de la toma de muestra, el análisis completo de los patrones de expresión de miles de genes en las células tumorales y la comparación con los perfiles en células sanas brinda una información única en cuanto a cambios consistentes en expresión génica asociados con la disfunción celular en cáncer. Los microarreglos han sido de utilidad para un mejor entendimiento de los mecanismos biológicos, el diagnóstico y el tratamiento del cáncer.

Clasificación molecular de los tumores Las mejoras en la clasificación de los tumores permiten la aplicación de terapias más racionales. Es frecuente que tumores similares en su histología muestren diferencias en su comportamiento clínico, la clasificación de estos tumores según sus perfiles, puede explicar el porque de sus diferencias en la respuesta al tratamiento. Un diagnóstico molecular adecuado debe permitir definir tumores que se originan de un estado particular de diferenciación celular y que utilizan un mecanismo común de transformación maligna. Si se cumple esta meta los pacientes en los que se identifique el mismo diagnóstico molecular deben tener un curso clínico y una respuesta a la terapia similares, el principal valor del diagnóstico molecular reside su utilidad clínica, de manera que se pueda seleccionar la terapia óptima entre las opciones disponibles. Idealmente el diagnóstico molecular debe señalar la anomalías en las rutas de señalización que guíen en el futuro el desarrollo de drogas terapéuticas. La tecnología de los microarreglos ha permitido desarrollar nuevas clasificaciones de leucemias, mediante esta estrategia es posible diferenciar leucemia mieloide aguda de leucemia linfoide aguda sin emplear análisis supervisado. Los patrones de expresión génica han sido útiles para

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES clasificar a nivel molecular tumores de seno, linfomas B, melanomas cutáneos y adenocarcinoma de pulmón. Recientemente se establecieron los perfiles de expresión génica en próstata normal, neoplasia prostática benigna, cáncer de próstata localizado y cáncer de próstata metastásico. Un ejemplo que ilustra la efectividad de los perfiles de expresión génica en la definición molecular de distintas enfermedades, es su aplicación en linfomas B difusos de célula grande (DLBCL), estos linfomas se conocen por su gran heterogeneidad clínica, el análisis de los perfiles de expresión génica ha permitido definir dos enfermedades diferentes dentro de esta categoría de diagnóstico. Los DLBCL se clasifican morfológicamente en centroblástico, inmunoblástico, y otras variantes y son muy heterogéneos en cuanto a respuesta al tratamiento. Mediante microarreglos se demostró que la mitad de los DLBCL expresaban genes altamente expresados en el estadio de diferenciación de los linfocitos B de centro germinal (Bcl-6, CD10, A-myb y otros), estos se denominaron similares a centro germinal B, (GCB), otro subgrupo importante de estos linfomas denominado similar a células B activadas (ABC) no expresa los genes del centro germinal, pero sí expresa genes de alta expresión en linfocitos B activados por mitógenos (Bcl-2, IRF-4, ciclina D2 y CD44) ver figura 5. Estos hallazgos señalan que los dos subgrupos son derivados de linfocitos B en diferentes estadios de diferenciación. El resultado clínico es muy diferente para los dos subgrupos 76% de pacientes con el subtipo GCB estaban vivos después de cinco años mientras que sólo el 16% de los del tipo ABC lo estaban.

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Figura 5. El perfil de expresión génica define dos subtipos de linfoma B difuso de célula grande. El agrupamiento jerárquico de las medidas de expresión de 120 genes (filas) en 45 linfomas (columnas), revela un tipo de linfoma similar a centro germinal (GBC) y otro similar a linfocitos B activados (ABC) con diferencias marcadas en comportamiento clínico. Las sombras en rojo indican alta expresión, y en verde baja expresión de un gen dado. La tinción inmunohistoquímica para CD10 y Bcl-2 ilustra como los hallazgos de los microarreglos se pueden aplicar en la practica clínica. El subtipo GCB es positivo para CD10 y negativo para Bcl-2, mientras que el subtipo ABC muestra el patrón opuesto. Modificado de Rosenwald A y Staudt LM, con autorización.

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Sensibilidad a drogas A pesar de los grandes avances en el tratamiento del cáncer, la adquisición de resistencia a la quimioterapia continúa siendo un obstáculo importante en la terapia de los pacientes. La resistencia ocurre a través de numerosos mecanismos, los microarreglos ofrecen una nueva herramienta para estudiar las vías celulares implicadas en esos mecanismos, y para predecir sensibilidad a drogas y efectos colaterales. En general estos estudios se realizan con líneas celulares cancerosas que se vuelven resistentes a las drogas anti neoplásicas. Esta estrategia tendrá gran impacto en el diseño de tratamientos más eficaces para tumores individuales.

Plataformas de diagnóstico Para un tumor dado, o un subtipo tumoral, un solo gen puede tener utilidad diagnóstica, igualmente, un único patrón de expresión derivado de varios genes (20 a 50 o más) provee información diagnóstica relevante. Particularmente en el último caso será un reto incorporar estos nuevos marcadores en el diagnóstico de rutina en el laboratorio clínico. Una posibilidad es que se generen pequeños microarreglos de DNA, específicos de enfermedad, como plataforma a utilizar a nivel diagnóstico. La RT-PCR cuantitativa representa otra posible plataforma para cuantificación de mRNA dado que permite examinar muchos genes individuales en un mismo experimento. Sin embargo, esos ensayos requieren que los laboratorios clínicos sean proficientes en el aislamiento y análisis rutinario de mRNA, que es más complejo que el diagnóstico basado en DNA.

Determinación de la función de los genes Los microarreglos permiten la medición de expresión de un número importante de genes, y proveen un abundante número de genes candidato con relevancia para la etiología del cáncer, su diagnóstico o su tratamiento. Sin embargo los microarreglos sólo proveen una inferencia indirecta de la función del gen. Dado que la función del gen es importante en el avance entendimiento del cáncer y en la selección de candidatos prioritarios

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES como blancos terapéuticos, se requieren nuevas técnicas que permitan una evaluación más rápida de la función de los genes. Los microarreglos de proteínas para determinar interacciones proteínaproteína, blancos enzimáticos y unión de pequeñas moléculas, y microarreglos de células que permiten el análisis funcional de productos de genes en paralelo son metodologías que seguramente agilizarán las investigaciones de la función de los genes.

Aplicaciones de la tecnología de los microarreglos El número de estudios con microarreglos para identificar nuevos genes, clasificar los tumores, identificar marcadores de progresión o factores de pronóstico ha tenido un crecimiento exponencial, muy seguramente esta era post genómica nos llevará al punto en el que los biomarcadores asociados con el diagnóstico, pronóstico y tratamiento identificados en los microarreglos proveerán una información personalizada para el manejo del paciente. Mediante el uso de microarreglos se han desarrollado clasificaciones basadas en expresión génica para varios tipos tumorales, entre ellos linfomas, leucemias, carcinoma de pulmón, cáncer de seno hereditario y esporádico. La programación genética de un tumor se puede constituir en una característica única, que revela su historia natural. Esto ha permitido una disección molecular de la histología de los tumores basada en el perfil de expresión génica de cada tipo celular en el tumor. Esos subtipos moleculares tienen significado clínico pues permiten predecir el curso clínico y explicar la variabilidad en el curso clínico en ciertos tumores con diagnóstico anatómico similar. La posibilidad de que los oncólogos puedan emplear los microarreglos en fases tempranas de sus estudios clínicos les permitirá confirmar los mecanismos de acción de las drogas y evaluar sensibilidad y toxicidad. En conjunto con técnicas más convencionales como la inmunohistoquímica y el ELISA, los microarreglos tendrán gran utilidad en diagnóstico y pronóstico. Un ejemplo de esta posibilidad la encontra-

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES mos en un estudio reciente en el que se identificó mediante microarreglos que el gen de la osteopontina, que codifica una glicofosfoproteína que se une al calcio, estaba sobre expresado en cáncer de ovario y no en controles sanos, posteriormente se encontró que las pacientes con cáncer de ovario presentaban concentraciones séricas elevadas de osteopontina. La tecnología de los microarreglos tiene un gran potencial para identificar biomarcadores en cáncer que luego serán validados con metodologías más convencionales.

PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL En paralelo con el desarrollo de la tecnología de los microarreglos, se han dado los avances en PCR cuantitativa en tiempo real, este es un método homogéneo que incluye amplificación y análisis sin necesidad de geles, radioactividad o manipulación de las muestras. Existen varias plataformas disponibles comercialmente que incorporan ciclados térmicos y adquisición de fluorescencia. La fluorescencia de los colorantes unidos a las sondas de DNA es monitoreada cada ciclo durante la PCR. En un cierto punto durante el ciclado se acumula suficiente producto para incrementar la fluorescencia por encima del ruido de fondo. El punto donde la fluorescencia se eleva por encima del background es cuantificado como el máximo de la segunda derivada de la curva [punto de cruce (Cp)] y se correlaciona con la cantidad de copias al inicio de la reacción de PCR. A mayor número de copias templete iniciales, más rápido aparece la fluorescencia y menor es el Cp. El número relativo de copias entre dos muestras (experimental y control) puede determinarse por la diferencia en sus valores Cp. Ver figura 6.

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Figura 6. Cuantificación relativa mediante PCR en tiempo real. Las cantidades de blanco en una muestra experimental y una muestra control son comparadas después de la amplificación por PCR y el monitoreo del nivel de fluorescencia en cada ciclo.

Dado que la PCR es un proceso exponencial, el número relativo de copias es igual a la eficiencia de la PCR elevado a potencia Cp. Debido a que no es fácil conocer la cantidad total de DNA presente en diferentes muestras, los resultados de los ensayos en general son normalizados con un gen de referencia que se presume invariante. La cuantificación mediante PCR en tiempo real usando SYBER Green I como trazador fluorescente de la producción de DNA de doble cadena es un método poco costoso y ampliamente empleado par validar experimentos de microarreglos.

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PCR MÚLTIPLE EN TIEMPO REAL EN DIAGNÓSTICO Es posible analizar simultáneamente múltiples genes en una sola reacción de PCR en tiempo real. Esta aproximación tiene varias ventajas respecto al ensayo de un solo gen, permite introducir controles internos, disminuye costos de reactivos, y permite emplear menor cantidad de muestra. El multiplex es particularmente útil cuando se requiere analizar varios blancos en tejido microdisecado. En tumores sólidos generalmente es necesaria la microdisección para determinar número de copias de genes debido a que la presencia de células normales diploides puede interferir con el resultado. Un ejemplo del uso de la PCR en tiempo real multiplex, lo tenemos en el estudio de los genes HER-2/neu y topoisomerasa II (topo II) en cáncer de seno, en esta neoplasia estos dos genes tienen importancia en pronóstico y tratamiento. En el 20% de los cánceres de seno el gen HER-2/neu está amplificado a nivel del DNA, lo que ocasiona incremento en el RNA mensajero y en la expresión de la proteína. El gen topo II está ubicado cerca de HER-2 en la región cromosómica 17q12-q21, un área que se encuentra frecuentemente alterada en cáncer de seno. La amplificación de HER-2 puede ocurrir de manera concomitante con alteraciones en topo II (amplificación o deleción), los cambios en el número de copias de topo II pueden señalar respuesta a quimioterapia con inhibidores de la topo II. En este caso, se emplea una PCR en tiempo real multiplex con tres colores para determinar simultáneamente el número inicial de copias de HER-2/ neu y topo II en relación con el gen control que es el gen de la albúmina. Los colorantes aceptores LCRed640 (HER-2), Cy5 (albúmina) y LCRed705 (topo II) se aparean con fluoresceína en tres conjuntos de sondas de hibridación adyacentes. Cada blanco es identificado por las diferentes emisiones de las sondas de hibridación marcadas con los diferentes aceptores. Las reacciones múltiples en el ensayo permiten establecer la eficiencia de amplificación para cada gen. Si los tres genes están presentes en igual número de copias y cada blanco amplifica con eficiencia similar, los tres blancos tienen el mismo Cp. En la figura 7 se presentan los resultados de amplificación de DNA de leucocitos, y de

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES DNA de un tumor de seno, como es de esperarse con el DNA de los leucocitos los tres Cp son similares, pero en el tumor los Cp para HER-2 y topo II presentan un desplazamiento del Cp que se da tres ciclos antes que el de la ábúmina, lo que equivale a una amplificación de estos genes de ocho veces.

Figura 7. Determinación del número de copias usando PCR múltiple en tiempo real con tres colores. Se comparan los Cp de los tres genes Her-2, topo II y el gen de albúmina, en leucocitos y en células tumorales de seno. En leucocitos los Cp son similares para los tres genes, en el tejido tumoral hay un desplazamiento de tres ciclos en el Cp para HER-2 y topo II, que se da más temprano, lo que representa una amplificación de estos genes de 8 veces en el tumor.

PCR MÚLTIPLE EN TIEMPO REAL EN ANÁLISIS DE MUTACIONES EN TUMORES SÓLIDOS Las mutaciones en el DNA pueden incluir grandes rearreglos, como traslocaciones, inversiones, amplificaciones, deleciones y alteraciones pequeñas como mutaciones puntuales, inserción o deleción de bases. Las alteraciones grandes son comunes en neoplasias hematológicas y por lo general se estudian con técnicas de citogenética. En contraste, las

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES alteraciones pequeñas son frecuentes en carcinomas y son muy escasas las pruebas clínicas para identificar las pequeñas alteraciones somáticas de los tumores sólidos. Las mutaciones somáticas son adquiridas durante la evolución de muchos tumores y pueden afectar de manera importante el curso de la enfermedad. El gen supresor tumoral p53 es el gen humano más frecuentemente mutado en cáncer humano, un 90% de las mutaciones en P53 ocurren en el dominio de unión al DNA (exones 58) y casi todas son cambios en una sola base, las mutaciones en los exones 5 a 8 son indicadores de pronóstico. Se ha sugerido que mutaciones particulares en el gen P53 (por ejemplo en el codón 273) pueden conferir resistencia a las antraciclinas, primera línea de terapia en cáncer de seno metastásico, la presencia de una mutación en P53 puede ser utilizada en valoración de la respuesta al tratamiento y para detección de recurrencias. La presencia de DNA de p53 mutado en el torrente sanguíneo, liberado por la muerte de células tumorales puede ser detectada en el plasma, la detección de este DNA puede emplearse en el seguimiento. A pesar de que esta posibilidad se ha demostrado, su uso en la clínica es muy controvertido, en parte debido a que los resultados obtenidos empleando diferentes metodologías son conflictivos y las técnicas de detección no son de fácil implementación en el laboratorio clínico. Se han empleado varios métodos de tamizaje de mutaciones en geles y por secuencia directa para establecer asociación entre genotipo y enfermedad. Las metodologías convencionales se basan en la alteración de la movilidad en un gel debido a la presencia de mutaciones que causan cambios conformacionales de cadena sencilla o cambios en la disociación del heteroduplex. Las sondas de hibridación fluorescentes se usan con frecuencia para genotipificación, esta se basa en el análisis de las curvas de disociación de sondas fluorescentes que permiten detectar mutaciones pequeñas en línea germinal o polimorfismos en enfermedades hereditarias como fibrosis quística, trombosis venosa, enfisema, hemocromatosis e hipercolesterolemia. El análisis de curvas de disociación con el colorante de DNA de doble cadena Syber green ha sido empleado en estudios de metilación del DNA, que puede causar silenciamiento de genes. Este método también es útil en tamizaje de mutaciones somáticas. El uso de esta aproximación metodológica se ha reportado para cáncer de colon,

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES particularmente en el análisis de mutaciones en el gen p53, en los exones 6 y 8. En este método se emplean como sondas varios oligonucleótidos superpuestos, complementarios al gen de interés. Estas sondas son diseñadas de manera que la señal fluorescente disminuye al unirse al blanco. Después de que ocurre la amplificación, se inicia en el termociclador/ detector un programa de disociación en el que se disminuye la temperatura para permitir la hibridación de las sondas con el blanco y luego la temperatura es elevada lentamente y la fluorescencia es continuamente determinada. Las mutaciones somáticas son identificadas por cambios en las curvas de disociación con respecto a las del gen silvestre (no mutado). En general aparecen picos de disociación adicionales o diferencias en el área de los picos. Figura 8.

Figura 8. Tamizaje de mutaciones en cáncer de colon. Se colocaron en la misma reacción varias sondas fluorescentes sobrepuestas complementarias con el exón ocho del gen p53 silvestre (no mutado), los diferentes sitios fueron identificados por la temperatura de disociación específica de los duplex sonda/blanco. La temperatura de disociación de cada duplex sonda/blanco y la proporción de las áreas de los picos de disociación fueron determinadas en el gen no mutado (linea verde), en el tumor (linea roja) se observó un perfil aberrante con un pico de disociación adicional.

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CONCLUSIONES La investigación en cáncer se dirige hacia la búsqueda de nuevos marcadores moleculares, la integración de los marcadores moleculares a las clasificaciones histomorfológicas existentes permitirá estratificaciones adicionales y a la vez una definición más adecuada de grupos de pronóstico y adicionalmente brindará una mejor guía para la terapia y mejores herramientas en el seguimiento. Las tecnologías empleadas hoy día como los microarreglos para determinar expresión génica y la CGH, permiten examinar la mayoría del genoma y descubrir genes alterados involucrados en el proceso canceroso. Los microarreglos pueden identificar genes regulados, y definir rutas bioquímicas que expliquen los diferentes comportamientos clínicos observados entre los tumores. La CGH permite cubrir todo el genoma en la búsqueda de regiones amplificadas o delecionadas en la progresión tumoral. El uso combinado de estas poderosas metodologías permite identificar diferencias biológicas en los tumores e identificar los mecanismos comunes que llevan a la malignidad. En un futuro cercano, los tumores serán definidos y tratados con base en las vías biológicas que llevan a la proliferación celular maligna y a la metástasis, y no solamente con base en su apariencia histológica. Los microarreglos y la CGH son herramientas invaluables en el entendimiento de la biología del cáncer. Sin embargo una vez se identifican los genes asociados al cáncer y los genes control, estos métodos no son prácticos en la clínica. En este punto metodologías como la PCR en tiempo real van a adquirir gran importancia, ya que pueden generar información sobre expresión génica, amplificación, deleciones, mutaciones puntuales. Adicionalmente tienen aplicación en la detección de virus asociados a cáncer como Epstein Bar virus y virus del papiloma humano.

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LECTURAS RECOMENDADAS Ali S, Coombes Ch. Estrogen receptor alpha in human breast cancer: Ocurrence and significance. J. Mam. Glannd Biol. Neoplasia, 2000, 5(3)271-81. Bernard P, Wittwer C. Real-Time PCR Technology for Cancer Diagnostics. Clinical Chemistry. 2002, 48(8):1178-85. Bidart JM, Thuiller F, Augereau C, Chalas C, Daver A, Jacob N et al. Kinetics of serum tumor marker concentrations and usefulness in clinical monitoring. Clinical Chemistry, 1999, 45(10)1695-1707. Canil CM, Tannock IF. Doctor´s dilemma: Incorporating tumor markers into clinical decision making. Seminars in oncology. 2002, 29(3): 286-293. Cole AL. Immunoassay of human chorionic gonadotrophine its free subunits and metabolites. Clin. Chem. 1997, 43(12) 2233-43. Cheung KL, Graves CRL, Robertson JFR. Tumour marker measurements in the diagnosis and monitoring of breast cancer. Canc. Treat. Rev. 2000; 26: 91–102. Duffy MJ. Biochemical markers in breast cancer: which ones are clinically useful? Clinical Biochemistry. 2001, 34: 347–352. Hayes DF, Thor AD. C-erbb-2 in breast cancer: Development of a clinically useful marker. Seminars in Oncology. 2002, 231-245. Lilja J. Biology of prostate-specific antigen. Urology. 2003, (Suppl. 5A) 27-33.

SALUS KEDOS No.7 BACTERIOLOGÍA MARCADORES TUMORALES

Lüftner D, Lüke C, Possinger K. Serum HER-2/neu in the management of breast cancer patients. Clinical Biochemistry. 2003, 36:233–240. Macgregor P, Squire J. Application of microarrays to the analysis of gene expression in cancer. Clinical Chemistry, 2002, 48(8)1170-77. Martínez E, Marcos M, Domínguez MA, Arias E, Villafranca E, Dueñas MT. Marcadores tumorales con valor pronóstico. Anales Sis. San. Navarra. 2000, 24 (Supl 1) 53-60. Mühlman M. Molecular cytogenetics in metaphase and interphase cells for cancer and genetic research, diagnosis and prognosis. Application in tissue sections and cell suspensions. Genet. Mol. Res.2002 1 (2): 117127. Perkins GL, Slater ED, Sanders G, Prichard JG. Serum tumor markers. American Family Physician, 2003, 68(6)1075-9. Pollack JR, Van de Rijn M, Bostein D. Challenges in developing a molecular characterization of cancer. Seminars in oncology 2002, 29 (3): 280-5. Rosenwald A, Staudt M. Clinical translation of gene expression profiling in lymphomas and leukemias. Seminars in Oncology. 2002, 29(3): 258263. Small EJ, Roach M. Prostate-specific Antigen in Prostate cancer: A case study in the development of a tumor marker to monitor recurrence and assess response. Seminars in Oncology. 29(3): 264-73. Sturgeon C. Practice Guidelines for tumor marker. Clinical Chemistry, 2002,48(8) 1151-9. Yuen MF, Lai CL. Screening for hepatocellular carcinoma: survival benefit and cost-effectiveness. Annals of Oncology, 2003,14: 1463–1467, 2003.

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