LABORWELT 05/2011 by BIOCOM Interrelations GmbH

laborwelt Nr. 5 / 2011 â&#x20AC;&#x201C; 12. Jahrgang

Zellbiologie Zellrezeptor auf Neuronen kontrolliert das Angstempfinden

Paper des Monats: Transport-Defekt akkumuliert Alzheimerprotein

Krebszellen erkennen mit Hilfe von elektrischem Zellstrecker

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Editorial | Inhalt

Industrielle Zelltechnologie Als mit der Gründung der Firma Genentech das Biotechnologie-Zeitalter in den USA anbrach, hatten die Forscher eines im Sinn: Zellen zu nutzen, um Wirkstoffe zu produzieren. Gut dreißig Jahre später geht es darum, komplexere Aufgaben zu bewältigen: Dreidimensionale Zellkulturen und mit Stammzellen beschichtete Implantate sollen in der Regenerativen Medizin, aus Stammzellen gewonnene Zellmodelle in der Wirkstoffforschung helfen. Die Förderung der Zusammenarbeit von Forschungslabors und Firmen hat sich die Deutsche Gesellschaft Industrielle Zelltechnologie e.V. auf die Fahnen geschrieben (vgl. Seite 30). Zusammen mit der BIO Deutschland, die die politische Interessenvertretung übernimmt, wollen sich die zehn Gründungsmitglieder für die Förderung von Nachwuchsforschern, die Vernetzung von Arbeitsgruppen und die Umsetzung innovativer Zelltechnologie-Ansätze in Produkte einsetzen. Dass es davon viele gibt, dokumentiert diese Themenausgabe „Zellbiologie“. So haben etwa Wissenschaftler des Fraunhofer-Instituts für biomedizinische Technik ein kosteneffizientes, einfach zu handhabendes Verfahren entwickelt, mit dem Zellen elektrisch gestreckt werden können (vgl. Seite 16). Der Zell-Stretcher soll helfen, Krebszellen anhand ihrer viskoelastischen Eigenschaften zu erkennen. Gleich zwei Gruppen berichten von Zellmodellen, die die Untersuchung der Herztoxizität von Arzneimittelkandidaten in frühem präklinischen Stadium gestatten sollen – ein Ansatz nutzt dazu die nicht-invasive Messung von aus Stammzellen differenzierten Kardiomyozyten (vgl. Seite 6). Eine andere Gruppe will mit spannungssensitiven Farbstoffen an adulten Herzzellen Veränderungen im Aktionspotential nachweisen (Seite 20). Ein dritter Themenkomplex widmet sich neuen durchflusszytometrischen Verfahren (vgl. Seite 12 und 32). Eine informative Lektüre wünscht Thomas Gabrielczyk

In diesem Heft

Expertenpanel: Next-Gen Sequencing Mit einer neuen Rubrik beleuchtet LABORWELT von dieser Ausgabe an Technologien, aktuelle Produktentwicklungen und Probleme, mit denen sich Anwender an der Laborbank konfrontiert sehen. Das erste LABORWELT-„Expertenpanel“ widmet sich dem NextGeneration-Sequencing, in dem sich die zunehmende Konkurrenz der Anbieter vor allem bei den Desktop-Geräten durch dramatisch fallende Gerätepreise bemerkbar macht. Welche Vorteile die Systeme am Markt wirklich haben, wann Dienstleister besser sind etc. verraten vier ausgewiesene Experten ab Seite 23. LABORWELT

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Inhalt 4

Paperwelt Highlight des Monats Morbus Alzheimer – ein Transportproblem? Jens Pahnke et al., Universität Rostock

Blitzlicht Arzneimittelforschung Physiologische Messung der Kardiotoxizität Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg Titel: Zellbiologie Ein Gen aus dem Bakterium Bacillus subtilis reduziert die Folgen von Trockenstress für Nutzpflanzen. Querschnitt durch die Leitbahnen. Bild: BASF SE

Wissenschaft AML Depletion von ab-T-Lymphozyten aus peripheren Stammzellen Rupert Handgretinger, Universitätsklinikum Tübingen

Blitzlicht Zellsortierung Einzelzellmessung mechanischer Eigenschaften Magnus Jaeger et al., Fraunhofer-Institut für biomedizinische Technik, Golm

Blitzlicht Verbrauchsmaterialien Die wichtigsten Überlegungen bei der Auswahl von Laborhandschuhen Jaime Cassar, Roberto Greselin, Kimberly-Clark Professional Wissenschaft Toxizitätsscreening Neues zelluläres QT-Screen-Konzept mit adulten Herzmuskelzellen Dr. Lars Kaestner, Prof. Dr. Peter Lipp, Universität des Saarlandes, Homburg

Blitzlicht Regenerative Medizin Standardisierung der Stammzellgewinnung und -herstellung Dr. Andreas Emmendörffer, V-Care Biomedical GmbH, Leipzig

Wissenschaft Technologietransfer Zelltechnik-Innovationen für die Industrie Anja Rasch, Deutsche Gesellschaft Industrielle Zelltechnik e.V., Lübeck

Blitzlicht Analytik Durchflusszytometer: Kompaktklasse für Zellanalysen Jason Whalley, Merck Millipore, Billerica

Wissenschaft Neurowissenschaften Bidirektionale Kontrolle der Angst durch den CRH-Rezeptor Typ1 Jan M. Deussing, Florian Holsboer, MPI für Psychiatrie, München

Blitzlicht Probenvorbereitung RNA-Isolation aus FFPE-Gewebe: Säulchen vs. Beads Robert Loewe, GeneWake GmbH, Neuried

Labormarkt im Umbruch

Stellenmarkt

Verbände

Produktwelt

Termine

Ausblick / Impressum 12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 3

20.10.2011 12:53:51 Uhr

Paperwelt Highlight des Monats

Morbus Alzheimer: ein Transportproblem? Markus Krohn, Cathleen Lange, Jacqueline Hofrichter, Katja Scheffler, Jan Stenzel, Johannes Steffen, Toni Schumacher, Thomas Brüning, Anne-Sophie Plath, Franziska Alfen, Anke Schmidt, Felix Winter, Katja Rateitschak, Andreas Wree, Jörg Gsponer, Lary C. Walker und Jens Pahnke. Cerebral amyloid-b proteostasis is regulated by the membrane transport protein ABCC1 in mice. Journal of Clinical Investigation 2011;121(10):3924–3931 Sind Alzheimer und andere neurodegenerative Erkrankungen auf einen mangelhaften Abtransport aggregierender Proteinspezies aus dem Hirn zurückzuführen? Arbeiten einer Gruppe um Jens Pahnke legen dies nahe. In Mausmodellen der Alzheimer-Demenz konnten sie zeigen, dass das Ausschalten des ABC-Transportproteins C1 der Blut-Hirn-Schranke zu einer 12- bis 14-fachen Akkumulation von Amyloid-beta-(Ab)Peptiden im Hirn führt. Aktivatoren des ABCC1-Transportproteins, wie der zugelassene Wirkstoff Thiethylperazin, bewirkten dagegen eine bis zu 75%ige Auflösung der Plaques im Mausmodell. Frühere Arbeiten, die eine 30%-ige Reduktion des Ab-Transports über die Blut-HirnSchranke in alten Alzheimer-Patienten zeigen, stützen die These, dass Alzheimer die Folge einer schleichenden Akkumulation „klebriger“ Peptide infolge ihres gestörten Abtransportes ist. LABORWELT: Welche Perspektiven eröffnen Ihre Ergebnisse? Pahnke: Völlig neue. Fast alle bisherigen Ansätze konzentrierten sich auf die Suche nach genetischen Ursachen für Alzheimer und andere neurodegenerative Erkrankungen. Für die familiäre Form kennt man auch drei Gene. Was die sporadische Form der Alzheimererkrankungen ausmacht, lag dagegen bislang völlig im Dunkeln. Dass ein gestörter Transport des Amyloid-beta(Ab)-Proteins und ähnlicher Proteine aus dem Hirn die Ursache von Krankheiten wie Morbus Alzheimer, Parkinson oder Huntington sein könnte, eröffnet ein ganz neues Forschungsfeld. Es könnte ein grundlegender Mechanismus sein, dass Peptide über Jahre aufgrund ihres schlechten Abtransportes im Gehirn abgelagert werden. LABORWELT: …und das zeigt sich dann erst mit einer zeitlichen Verzögerung im Patienten … Pahnke: Richtig. Daten einer Gruppe aus St. Louis vom Dezember 2010 zeigen, dass in den alten Alzheimer-Patienten der Ab-Abtransport um 30% reduziert ist. Wir haben in unserem Modell eine Veränderung von nur 11% gesehen. Das heißt, wir reden hier gar nicht über Veränderungen in großem Stil, aber trotzdem hat dies über Jahre einen Rieseneffekt. Das würde vieles erklären, zum Beispiel, warum Alzheimer schon viel früher anfängt als die Symptomatik, warum die Krankheit so langsam, aber stetig fortschreitet und sich schließlich in Symptomen manifestiert. Wenn erst einmal eine gewisse Konzentration erreicht ist, fällt das Protein aus, und die Krankheit bricht aus. 4 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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LABORWELT: Was brachte Sie auf die Idee, dass Transportproteine der Blut-Hirn-Schranke an der Entstehung von Alzheimer beteiligt sind? Pahnke: Zwei Dinge. Zum einen Arbeiten in der Pharmakologie, die ABC-Transportproteine untersuchen, weil sie eine Rolle beim Abtransport von Krebs-Chemotherapeutika aus Krebszellen spielen. Die Transporter sind in Krebszellen so hochexprimiert, dass diese Chemotherapieresistent werden. Zweitens, veröffentlichte im Jahr 2001 eine kanadische Arbeitsgruppe Ergebnisse, die darauf hindeuteten, dass der ABCB1-Transporter auch Ab transportieren könnte. Das war 2004 der Ausgangspunkt für uns. Wir haben in Gehirnen von alten Alzheimer-Patienten geschaut, ob dieser Transporter eventuell weniger aktiv ist als in Gesunden, und genau das war der Fall. Dann habe ich mit Mausexperimenten und der Erzeugung entsprechender Defektmutanten für ABC-Transporter angefangen. LABORWELT: Aktuell haben Sie sich ganz gezielt die Transportproteine der Blut-Hirn-Schranke angeschaut… Pahnke: Wir haben drei der zehn Transporter in knock out-Mäusen angeschaut, ABCB1, von dem wir bereits wussten, dass er Ab transportiert, und als Kontrollen ABCC1 und ABCG2. Das Ergebnis hat uns sehr überrascht. Denn zwar war die Ab-Konzentration in ABCB1-Mutanten um das 3,5 bis 4-Fache erhöht, in ABCC1-Mutanten fanden wir aber eine 12- bis 14-fache Erhöhung. Aktivierten wir den ABCC1-Transporter mit dem seit den 60er Jahren marktzugelassenen Anti-Brechmittel Thiethylperazin

Prof. Dr. Dr. Jens Pahnke, ist Leiter des Forschungslabors für Neurodegenerative Erkrankungen (NRL) und des Maushauses am Zentrum für Nervenheilkunde der Universität Rostock. Seit 2005 ist er Professor für Neurodegeneration. Vom 1. Dezember 2011 an wird er an der Universität und dem Deutschen Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen in Magdeburg eine Arbeitsgruppe Translationale Forschung aufbauen. Nach Studium der Medizin und Humanbiologie an der Universität Greifswald und Promotion zum Dr. med. im Jahr 2000 ging Pahnke ein Jahr als Post-Doc an die Klinik für Neurologie des Zentrums für Nervenheilkunde der Universität Rostock. Danach wechselte er an das Department für Pathologie des Universitätsspitals Zürich. 2004 promovierte er zum Dr. rer. nat. im Fachgebiet Molekularbiologie. Pahnke ist Experte auf dem Gebiet der Funktion Transportproteinen der Blut-Hirn-Schranke, spezifischen mitochondrialen Mutationen und neuen Mausmodellen zur Untersuchung der Entstehung von Proteinaggregaten bei neurodegenerativen Erkrankungen.

verschwanden binnen 25 Tagen 70% bis 80% des Ab-Proteins aus dem Maushirn. LABORWELT: Wie gehen Ihre Arbeiten jetzt weiter? Pahnke: Als nächstes stehen die genaue Charakterisierung der Bindungstasche des ABCC1-Transporters für den Wirkstoff und der funktionell relevanten Polymorphismen an. Wir werden dazu den Transporter kristallisieren. Zweitens werden wir zusammen mit der Firma Immungenetics AG eine umfassende SNP-Analyse des Transporters in Alzheimerkranken durchführen. Drittens sind wir dabei, Assays zu etablieren, um die Aktivität der Transporter mit Hilfe radioaktiver Tracer mittels PET zu untersuchen. Man kann dann sehen, wo sich die Tracer ablagern und daraus frühzeitig Informationen erhalten, welche Krankheit da im Entstehen ist, wie eine holländische Arbeitsgruppe bereits zeigen konnte. LABORWELT

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18.10.2011 17:19:28 Uhr

Blitzlicht Arzneimittelforschung

Physiologische Messung der Kardiotoxizität Dr. Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg Die Kardiotoxizität von Substanzen ist ein Hauptgrund für das Scheitern von Arzneimittelkandidaten. Die nicht-invasive Messung der Impedanzänderung schlagender Kardiomyozyten nach Applikation von Wirkstoffen eröffnet die automatisierte und frühe Beurteilung der Kardiotoxizität im Forschungsstadium der Medikamentenentwicklung. Mit Hilfe von aus embryonalen Mausstammzellen differenzierten Kardiomyozyten gelang es Abbassi et al.1 unlängst, Arrhythmie-assoziierte DosisAntwort-Profile von 60 Substanzen mit Hilfe des xCELLigence Cardio Instrumentes (Roche Applied Science, Penzberg) sensitiv und quantitativ zu erfassen, die wegen ihrer kardiotoxischen Wirkungen vom Markt genommen worden waren – darunter Ionenkanalmodulatoren, Chrono-/ionotrope Substanzen, hERG-Kanal-Blocker und Induktoren von Torsages-de-Pointes-Arrhythmien. Auf Basis der ermittelten Profile gelang es den Forschern, auch andere proarhythmogene Modulatoren der Herzfunktion zu erkennen, auch solche die mit elekrophysiologischen Messungen nicht erfasst werden können. Als Vorteil des eingesetzten Systems sehen die Autoren, dass die Kardiotoxizität in hohem Durchsatz an ganzen Zellen erfasst wird, was die physiologische Situation eher wiedergibt als die isolierte Betrachtung einzelner Ionenkanäle. Substanzen aus verschiedenartigsten Stoffklassen sind aufgrund kardiotoxischer Nebenwirkungen vom Arzneimittelmarkt verschwunden. Zwischen 1990 und 2006 waren ventrikuläre Arythmien – sogenannte Torsades-de Pointes (TdP) – für das Zurückziehen rund ein Drittel aller Arzneien verantwortlich. Dazu kommt das Scheitern vieler Projekte im Tierversuchsstadium. Deshalb gibt es einen hohen Bedarf an Assays, die kardiotoxische Effekte bereits im frühen vorklinischen Entwicklungsstadium verlässlich nachweisen. Bisher fehlt noch ein prädiktives, biologisch relevantes Modellsystem für das Screening kardiotoxischer und proarrhythmogener Wirkungen für den Einsatz während der Hitto-Lead- oder Lead-Optimierungs-Phase2. Obwohl grundsätzlich primäre Kardiomyozyten aus Nagern und dem Menschen für die frühe Abschätzung der Herztoxizität von Substanzen

eingesetzt werden können, hat die technische Schwierigkeit, ausreichende Mengen dieser Zellen in hoher Qualität zu erhalten, ihrer breiten Anwendung bisher entgegengestanden 3. Stattdessen dient die Messung der Interaktion des heterolog exprimierten hERGKanals mit Substanzen als Surrogatmarker für TdP-Arrhythmien. Direktere Methoden setzen ganze Tierherzen oder Purkinje-Fasern ein, um die Länge von Aktionspotentialen zu ermitteln4. Sie weisen aber Limitationen bezüglich des Durchsatzes und einer technisch einfach handzuhabenden Umsetzung auf. Aktuelle Fortschritte bei der Differenzierung embryonaler oder induziert-pluripotenter Stammzellen schaffen nun die Grundlage für die Etablierung physiologisch und krankheitsrelevanter Modellsysteme für die präklinische Prüfung der Sicherheit von Substanzen2,3,5,6,7. Die Möglichkeit, selektiv Zelltypen wie etwa

Abb. 1: Roches automatisiertes System zur Echtzeitüberwachung schlagender Herzzellen 6 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Abb. 2: E-Plate für die Echtzeit-Impedanzmessung Kardiomyozyten zu differenzieren, verbunden mit der Möglichkeit Stammzellen genetisch so zu verändern, dass sich daraus differenzierte Phänotypen anreichern lassen, bietet einen vielversprechenden Ansatz für die toxikologische Forschung. In einer aktuellen Publikation haben Abbassi et al.1 das Potential Stammzell-abgeleiteter Kardiomyozyten für die Sicherheitsüberprüfung vorklinischer Arzneimittelkandidaten mit Hilfe des xCELLigence Cardio Instrumentes überprüft. Das System gestattet die nicht-invasive Messung des rhythmischen Schlagverhaltens dieser Zellen anhand der Impedanzänderung adhärenter Zellen in einer speziellen 96-Well-Platte (E-Plate), an deren Boden sich Mikroelektroden befinden. Mit Hilfe von aus Mausstammzellen differenzierten Kardiomyozyten (mESCCs) gelang es mit dem System, die Effekte von Ionenkanalmodulatoren und anderen Modulatoren der Herzfunktion zu erfassen. Auch komplexe Mechanismen, wie Arrhythmien, die sich auf eine Inhibition des Proteintraffickings zurückführen lassen, konnten durch Langzeitmessungen mit dem XCELLigence Cardio Instrument erfasst werden.

Methoden Zellkultur: Aus Maus-ES-Zellen abgeleitete Kardiomyozyten (Cor.At) wurden von Axiogenesis (Köln) erhalten und mit leichten Modifikationen gemäß Herstellerprotokoll behandelt. Jede Vertiefung der E-Plate wurde mit 50 µl einer 1:100-verdünnten Fibronectin-Lösung (F1114, Sigma Aldrich, St. Louis) beschichtet und bei 4 °C über Nacht inkubiert. Nach Entfernen des Fibronectins wurden die Wells mit PBS gewaschen und die Zellen ausgesät. Dazu wurden die in Stickstoff gelagerten Zellen bei 37 °C in einem Wasserbad angetaut, in ein konisches 15mLRöhrchen mit 9 mL Cor.At Complete Culture Medium gegeben (CXAM-250E, Lonza, Köln), 5 Min. bei 100g zentrifugiert und in einem kleinen Volumen Medium mit 10 µg/ml Puromycin resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt und der Anteil lebender Zellen mit der Trypan-BlauMethode bestimmt. Alle chemischen Reagenzien wurden von Sigma Aldrich (St. Louis) oder Tocris (Ellisville) bezogen. LABORWELT

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Blitzlicht Arzneimittelforschung

Monitoring der KardiomyozytenAnheftung und -Kontraktion

Ineinandergreifende Gold-Mikroelektroden

Stunden

Schlagmuster

nach

Kultivierung (h)

Schlagfre-

Amplitude

± Standard-

N=8

quenz (1/min abweichung)

Kontrolle

www.laborwelt.de 8 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Schlagdauer (ms)

Zeit bis

Abklingzeit

(Tr)

(ms)

Maximum (ms)

Kontrolle

D Zellindex (CI)

D Zellindex (CI) Zeit (s)

(Td)

nach Waschen

+ 10mM Blebbistatin

Begriffs- und Parameterdefinition Jeder gemessene Schlagzyklus entspricht der Kopplung von Erregung und Kontraktion der Kardiomyozyten (Abb. 2C). Die Schläge werden als Abfolge positiver (P+) und negativer (P–) Peaks dargestellt. Die Zellindex-Differenz zwischen P+ und dem nachfolgenden P– wird als Amplitude bezeichnet. Die Zeit zwischen jedem P+ heißt Schlagperiode, und die Schlagrate (Schläge/min) wird aus vielen Schlagperioden berechnet. Drei Parameter beschreiben die zeitliche Schlagcharakteristik: die Anstiegszeit Tr, die Abklingzeit Td und die Halb-Amplitudenweite TIBD50. Bei der Datenanalyse werden die Parameter für jeden Schlag eines Messzyklus berechnet und die mittlere und Standardabweichung abgeleitet. Um die Wirkung von Substanzen zu vergleichen, wurden die Schlagrate oder Amplitude nach Behandlung mit dem gleichen Zeitwert vor Behandlung normalisiert. Um das Ausmaß der Arrhythmie zu bestimmen, wurde der BRI

(D CI)

N=8

D Zellindex (CI)

Zwischen 40.000 und 60.000 lebende Zellen wurden in je eine Vertiefung einer 96-WellE-plate (Roche Applied Science, Penzberg/ ACEA Biosciences, San Diego) gesät. Die Zellen wurden mit dem xCELLigence Cardio System überwacht. Das Zellkulturmedium wurde täglich gewechselt. Im Allgemeinen wurde die Behandlung mit Wirkstoffen 60 bis 80 Stunden nach dem Aussäen begonnen, abhängig von der Dichte des Zellrasens. Die Datenerfassung erfolgte mittels eines Softwareprogrammes, das die Hardware steuert und es gestattet, die Abtastfrequenz und das Abtastfenster zu definieren. Abtastfrequenz ist dabei definiert als der Zeitraum, der zwischen zwei Messungen verstreicht, Abtastfenster ist die Zeit einer Einzelmessung. Vor Substanzzugabe betrug die Abtastfrequenz normalerweise 1 h und das Abtastfenster 20 s; 5 Minuten vor Beginn der Behandlung wurden die Zellen jede Minute einmal für 20 s abgetastet, um eine Basislinie aufzuzeichnen. Nach Substanzzugabe betrug die Abtastfrequenz in den ersten 60 Min. 1 Minute, in der zweiten Stunde 5 Min. und nach 3 bis 24h 15 Min. bei einem Abtastfenster von je 20s. Nach der Datenerfassung wurde die Software genutzt, um Parameter wie die Schlagrate, Amplitude, Schlagperiode, normalisierte Schlagrate, normalisierte Amplitude und den Schlagfrequenz-Abweichungs-Index (BRI) sowie statistische Parameter und EC50-Werte für die Dosis/Antwort-Testung zu errechnen.

Zeit (s)

10mM Blebbistatin

Abb. 3: Dynamische Überwachung und Charakterisierung von schlagenden mESCCs mittels Impedanz-basierter Detektion [aus 1]. A. Schema der geteilten Gold-Mikroelektroden der E-Plate. Das Anlegen einer niedrigen Wechselspannung erzeugt ein elektrisches Feld das von den adhärenten Kardiomyocyten beeinflusst wird. B. Schlagverhalten von mESCCs zu bestimmten Zeiten nach Zellaussaat im xCELLigence Cardio System. Die Schlagrate (1/min), -amplitude (D CI), Schlagdauer (IBD50; ms), Zeit bis zum Maximum (ms) and Abklingzeit (ms) wurden mittels xCELLigence Cardio-Software quantifiziert. Mittelwert aus 8 Wells ± Standardabweichung. C. Messung mit xCELLigence Cardio System: Schlagverhalten nach Zugabe von Blebbistatin. D. Messung des Effektes von Blebbistatin auf mESCC mittels Multi-Electrode Arrays: Kein Effekt ist sichtbar. abgeleitet, und zwar auf Basis des Variationskoeffizienten der Schlagperiode während einer Aufzeichnungsperiode.

Mikrolelektronische Überwachung des Schlagverhaltens der Kardiomyozyten In der Präsenz von Zellkulturmedien und nach Anlegen einer geringen Spannung an den GoldMikroelektroden im Boden einer E-Plate entsteht

ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden. Dieses kann durch die Anwesenheit adhärenter Zellen beeinträchtigt werden. Dabei ist das Ausmaß der Impendanzänderung proportional zu der ausgesäten Zellzahl, der Zellmorphologie und der Beschaffenheit der Anheftung. Da die Kontraktion von Kardiomyozyten mit einer zyklischen Veränderung der Zelladhäsion und Morphologie einhergeht, kann die Impedanztechnologie angewandt werden, um die Kardiomyozyten-Kontraktion zu erfassen. LABORWELT

20.10.2011 12:56:24 Uhr

Für entsprechende Bestimmungen wurden 40.000 mESCCs pro Well ausgesät und bis zu 96 Stunden lang in Kultur beobachtet. Das Schlagverhalten wurde nach 12, 24, 48, 72 und 96 Stunden für jeweils 20 s aufgezeichnet. Interessanterweise zeigte sich bis 24 Stunden nach Aussäen keine gleichmäßige Schlagaktivität, obgleich mikroskopisch Haufen asynchron schlagender Kardiomyozyten detektiert werden konnten, die noch kein Synzytikum gebildet hatten. Nach 48 Stunden begannen die Zellcluster Verbindungen auszubilden und die Einzellschicht am Grunde der Vertiefung synchron zu schlagen. Zugleich konnte mittels Impedanzmessung zu diesem Zeitpunkt eine reproduzierbare Schlagaktivität gemessen werden (Abb. 2B). Die Schlagfrequenz betrug nach 48 Stunden 80 Schläge/Minute und nahm während der Kultivierung kontinuierlich zu, bis nach einem Monat in Kultur eine Schlagrate von 250 Schlägen/Minute erreicht wurde. Diese Beobachtungen decken sich mit elektrophysiologischen Messungen der Dauer von Aktionspotentialen in aus embryonalen Mausstammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten10. Um die Schagaktivität quantiativ zu erfassen wurden die drei Parameter Anstiegszeit Tr, Abklingzeit Td und Halb-Amplitudenweite TIBD50 abgeleitet. Der TIBD50 -Wert von 142±4,6 ms nach 48 Stunden sank auf 105±2,4 ms nach 96 Stunden (Abb. 2B). Der als Tr bezeichnete Anstieg der Amplitude reichte von 29±5,1 ms bis 38±1,4 ms. Die Abklingzeit Td, die die Zeit wiedergibt, die verstreicht, bis das Signal von 80% auf 20% der Peakhöhe abgenommen hat, war länger als Tr und lag zwischen 88±7,2 ms und 124±12 ms (Abb. 2B). Die Kinetik des Anstiegs und Abfallens verhielt sich analog zu jener von Calcium in embryonalen Maus-Kardiomyozyten11, was auf einen Zusammenhang mit den beiden Phasen des Schlagzyklus, Kontraktion und Relaxation, hindeutet. Um dies zu überprüfen, setzten Abbassi et al.1 Blebbistatin ein, einen Inhibitor der ATPaseAktivität der schweren Myosinkette, der die Kardiomyozyten-Kontraktion hemmt 12. Es zeigte sich eine anhaltende Inhibition des Impedanzsignals (Abb. 2C). Die Impedanzmessung erwies sich somit als grundsätzlich geeignet, die Wirkung von Substanzen zu erfassen, die die Anregung und Kontraktion voneinander entkoppeln.

Messung der Substanzwirkung Um die Effekte verschiedener pharmakologischer Modulatoren der Schlagaktivität zu überprüfen, wurden mESCCs für drei Tage in den Vertiefungen des xCELLigence Cardio Instrumentes kultiviert. Nach Behandlung mit ansteigenden Konzentrationen von Modulatoren der Na+-, K+, und Ca2+-Kanalaktivität und kanalunabhängig wirkenden Modulatoren wurde die Impedanz über 24 Stunden mit dem xCELLigence Cardio System verfolgt. LABORWELT

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Spannungsgesteuerte Calcium-Kanäle: Von embryonalen Stammzellen abgeleitete Kardiomyozyten kontrahieren infolge intrazellulärer, hauptsächlich durch das Sarcoplasmatische Reticulum vermittelte Ca 2+-Oszillationen spontan13. Das Auffüllen der Ca2+-Pools des Sarcoplasmatischen Reticulums wird wahrscheinlich durch einen spannungsaktivierten Ca2+-Einstrom kompensiert11. Die Zugabe von Isradipin, einem spannungsaktivierten L-Typ-Ca2+ -Kanalblocker, zu mESCCs führ te zu einer mit der Zeit zunehmenden, dosisabhängigen Abnahme und Hemmung der Schlagak tivität. Die halbmaximale Dosis-Antwort auf Basis der normalisierten Schlagrate und Amplitude lag 5 min nach Substanzzugabe bei 20 nM bzw. 43,2 nM (Tab. 1): Diese Werte sind konsistent mit Daten die für isoliertes Kaninchenherz und mit rekombinanten HEK-293-Zellen, die den humanen Cav1.2-Kanal exprimieren, ermittelt wurden14,15. Tests mit Bay K8644, einem Agonisten spannunggesteuerter Ca2+-Kanäle, resultierten in einer über 12 Stunden erhöhten Schlagrate, die im Einklang mit der für Rattenmyozyten beschriebenen chronotropen Wirkung der Substanz und dem erhaltenen EC50-Wert von 77nM ist (Tab. 1). Kalium-Kanal-Modulatoren: Beim Test von Chromanol 293B, einem Inhibitor des verzögerten aktivierenden K+-Ausstroms, zeigte sich bei einer Dosis von 100 µM eine vollständige Hemmung der Schlagaktivität. Bei Konzentrationen von 25 µM und 3 µM zeigte sich dagegen eine Verlangsamung der Schlagfrequenz (69% bzw. 80% vgl. mit Kontrolle) und eine Verlängerung der Schlagdauer, die im Einklang zu publizierten Daten steht16. ERG-Kanal-Inhibitoren wie E4031 zeigten ein charakteristisches Bild bei der Impedanzmessung mit dem xCELLigence Cardio System: Bei hohen Konzentrationen (200-800 nM) war der normale Schlagrhythmus unterbrochen, und eine verlängerte Schlagdauer wurde von Plateau-Oszillationen begleitet. Die ermittelten IC50-Werte von 27 bzw. 57 nM (Tab. 1) stehen im Einklang mit Werten, die mit der Patch Clamp-Technik an aus humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten gewonnen wurden17. Natrium-Kanal-Modulatoren: Spannungsabhängige Na+-Kanäle sind hauptsächlich verantwortlich für den Na+-Strom und die Depolarisierungsphase des kardialen Aktionspotentials. In mESCCs ist dafür nach elektrophysiologischen und Expressionsdaten das SCN5-Genprodukt zuständig. Hemmung von mESCCs mit dem Na+-Kanal-Inhibitor Tetrodotoxin führte erwartungsgemäß zu einer dosisabhängigen Abnahme der Schlagfrequenz, die bei höheren Konzentrationen über die gesamte Messzeit erhalten blieb. Der halbmaximale Dosis-AntwortWert lag bei 0,28 µM.

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19.10.2011 9:38:08 Uhr

Blitzlicht Arzneimittelforschung

Tab. 1: Quantitative Parameter der Schlagchakteristika von mESCCs. Alle Parameter wurden 5 Min. nach Substanzzugabe erfasst. Erklärung siehe Text. Substanz

Normalisierte Schlagrate [IC50/µM]

Normalisierte Amplitude [IC50/µM]

Isradapine

0.02

0.04

N.A.

(S)-(-)BayK8644

0.08

N.A.

0.024

N.A.

0.027

N.A.

0.24

0.057

Tetrodotoxin

0.28

0.053

N.A.

Isoproterenol

0.014

N.A.

0.007

N.A.

Chromanol 293B E4031

Chronotrope Modulatoren: Die Aktivierung des sympathischen Nervensystems und die neurohormonelle Regulation über den b-adrenergen Rezeptor ist ein Hauptmechanismus, um die Schlagrate und Kontraktilität des Herzgewebes zu steuern. Da sämtliche Proteine, die für eine Antwort auf ein Signal des b-adrenergen Rezeptors erforderlich sind, in mESCCs exprimiert werden, untersuchten Abassi et al.1 auch, ob die Wirkung chrono- und ionotroper Stimulatoren mit dem xCELLigence Cardio System erfasst werden kann. Behandlung mit Isoproterenol, einem Agonisten, erhöhte dosis- und zeitabhängig die Kontraktionsfrequenz der mESCCs, verkürzte aber die Gesamtdauer eines Schlages. Die Wirkung ähnelte jener des L-Typ-Ca2+-KanalAgonisten Bay K8644, was im Einklang zu der Tatsache steht, dass die Stimulation des b-adrenergen Rezeptors zur Aktivierung von L-Typ-Ca2+-Kanälen führt. Die Impedanzmessung bietet hier einen sensitiven Readout für die Bestimmung pharmakologischer Wirkungen, die die elektrophysiologischen beziehungsweise kontraktilen Eigenschaften von Kardiomyozyten verändern.

Messung des kardiotoxischen Nebenwirkungsprofils Um die Eignung des xCELLigence Cardio Systems für die Sicherheitstestung in der kardialen Grundlagenforschung und Medikamentenforschung zu überprüfen, führten Abbassi et al.1 zwei, einander ergänzende Untersuchungen durch. Zunächst wurden vier TdP-induzierende, vom Markt zurückgezogene hERG-KanalInhibitoren mit mESCCs gescreent und deren proarrhythmogene Parameter quantitativ erfasst. Zudem wurden die Dosis-Antwort-Profile von 50 arrhythmogenen Substanzen mittels Echtzeit-Impedanz-Messungen bestimmt, um eine Basis für Vorhersagen kardiotoxischer Wirkungen zu etablieren. Die Untersuchung der hERG-Hemmstoffe mit dem xCELLigence Cardio System lieferte ähnliche Daten wie schon für den K+-KanalBlocker E4031 hinsichtlich Kurvenform und BRI (Beating rhythm irregularity), was auf einen gemeinsamen Mechanismus hindeutet. 10 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Schlagdauer [IC50/µM]

BRI [IC50/µM]

Abassi et al. deuten das Auftreten von PlateauOszillationen als Effekt früher Nach-Depolarisationen, die über den blockierten hERG-Strom zur vorzeitigen Aktivierung spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle und einen Ca2+-Einstrom führen. Die mit dem System auf Basis des kinetischen Parameters BRI bestimmten halbmaximalen Hemmkonzentrationen für E4031 (57 nM), Astemizol (290 nM), Cisaprid (2700 nM), Droperid (2100 nM) und Sertindol (290 nM) befanden sich im Bereich von Bestimmungen, die mit elektrophysiologischen Methoden erzielt wurden15. Mit Patch Clamp-Ableitungen erzielte IC50-Bestimmungen liegen dagegen niedriger16-17, was Abassi mit Unterschieden in der Medienzusammensetzung erklärt. Neben den kardialen Wirkungen der hERGKanal-Modulatoren wurden die Effekte 50 weiterer pro- und antiarrhythmogener Substanzen mit dem xCELLigence Cardio System bei einer Dosis von jeweils 10, 1 und 0,1 µM bestimmt.

Bestimmung von Kurz- und Langzeit-Schäden Die Qualität eines in vitro-Assays, der auf die Modellierung des Auftretens kardialer Wirkungen in vivo abzielt, zeigt sich oft erst in dessen Fähigkeit, komplexe, herztoxische Eigenschaften zu erfassen, die über die Identifizierung einfacher Arrhythmien hinausgehen. Das Chemotherapeutikum Doxorubicin etwa induziert nicht nur Arrhythmien, sondern interferiert auch mit der Mitochondrienfunktion. Messungen an mESCCs zeigten hier eine zeit- und dosisabhängige Abnahme der Impedanz, den Abbassi et al. auf den Viabilitätsverlust der Zellen zurückführen. Die detektierten Impedanzmuster zeigten zudem Eigenschaften von Substanzen, die Arrhythmien induzieren.

Verfahren zu komplementieren. Als Vorteil zu Methoden, die Wirkungen von Substanzen auf einzelne Ionenkanäle als Surrogatmarker der Herztoxizität erfassen, steht mit der Messung ganzer Zellen ein physiologisches Modell zur Verfügung. Die Impedanzmessung an aus Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten kann in der pharmakologischen Forschung eingesetzt werden: I um Modulatoren von Natrium-, Calcium- und Kaliumkanälen zu identifizieren, I um direkte hERG-Kanal-Inhibitoren zu detektieren, I um Modulatoren der Interaktion mit Zellrezeptoren nachzuweisen, I um Inhibitoren des ERG-Kanal-Traffickings aufzudecken, I um Inhibitoren der Schlagperiodizität sowie des Langzeitüberlebens, wie Doxorubicin, zu identifizieren und I um Substanzen nachzuweisen, die die Kontraktilität beeinträchtigen, aber nicht mit elektrophysiologischen Verfahren nachweisbar sind. Verblindete Studien an einer großen Anzahl von Substanzen sind nun erforderlich, um die Vorhersagekraft und Übertragbarkeit des hier vorgestellten Assays auf die in vivo-Situation beim Menschen kritisch zu prüfen.

Literatur [1]

[2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10]

[11] [12] [13] [14] [15]

[16]

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Fazit Das vorgestellte Verfahren erscheint im Hinblick auf seine Anwendung mit Stammzellen oder primären Zellen grundsätzlich geeignet, die Kardiotoxizität von Substanzen automatisiert zu erfassen und existierende

Abassi YA, Xi B, Li N, Ouyang W, Seiler A, Watzele M, Kettenhofen R, Bohlen H, Ehlich A, Kolossov E, Wang X, Xu X. (2011) Br J Pharmacol. doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01623.x. Pouton CW, Haynes JM (2007). Nat Rev Drug Discov 6(8): 605 616. Denning C, Anderson D (2008). Drug Discovery Today 5(4): 223 232. Fermini B, Fossa AA (2003). Nat Rev Drug Discov 2(6): 439 447. Freund C, Mummery CL (2009). J Cell Biochem 107(4): 592 599. Kamp TJ, Lyons GE (2009). Circ Res 105(7): 617 619. Kettenhofen R, Bohlen H (2008). Drug Discovery Today 13(15/16): 702 707. Doetschman TC, Eistetter H, Katz M, Schmidt W, Kemler R (1985). J Embryol Exp Morphol 87: 27 45. Kolossov E, Bostani T, Roell W, Breitbach M, Pillekamp F, Nygren JM, et al. (2006). J Exp Med 203(10): 2315 2327. Fijnvandraat AC, van Ginneken AC, de Boer PA, Ruijter JM, Christoffels VM, Moorman AF, et al. (2003). Cardiovasc Res 58(2): 399 409. Rapila R, Korhonen T, Tavi P (2008). J Gen Physiol 132(4): 397 405. [6] Kamp TJ, Lyons GE (2009). Circ Res 105(7): 617 619. Kovacs M, Toth J, Hetenyi C, Malnasi Csizmadia A, Sellers JR (2004). J Biol Chem 279(34): 35557 35563. Sachinidis A, Fleischmann BK, Kolossov E, Wartenberg M, Sauer H, Hescheler J (2003). Cardiovasc Res 58(2): 278 291. Mellemkjaer S, Bang L, Nielsen Kudsk F (1992). IPharmacol Toxicol 70(5 Pt 1): 366 372. Balasubramanian B, Imredy JP, Kim D, Penniman J, Lagrutta A, Salata JJ (2009). J Pharmacol Toxicol Methods 59(2): 62 72. Volders PG, Stengl M, van Opstal JM, Gerlach U, Spatjens RL, Beekman JD, et al. (2003). Circulation 107(21): 2753 2760. Peng S, Lacerda AE, Kirsch GE, Brown AM, Bruening Wright A T., J Pharmacol Toxicol Methods 61(3): 277 286.

Korrespondenzadresse Dr. Burkhard Ziebolz Roche Applied Science burkhard.ziebolz@roche.com LABORWELT

19.10.2011 9:38:14 Uhr

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Wissenschaft AML

Depletion von ab-T-Lymphozyten aus peripheren Stammzellen

30 Min. inkubiert, zweimal mit CliniMACS-Pufferlösung gewaschen (Miltenyi Biotec, Auburn, CA USA) in 300 mL Pufferlösung resuspendiert. Zum Schluss haben wir sie im automatisierten CliniMACS-Gerät (Miltenyi Biotec) mit LS/TS (162.01)-Trennsäulen unter Verwendung des Programms Depletion 2.1 entsprechend Herstelleranweisungen aufgetrennt.

Prof. Dr. Rupert Handgretinger, Universitätsklinikum Tübingen

Durchflusszytometrische Analyse

Die allogene Stammzelltransplantation gewinnt eine neue Qualität. Grund dafür ist der Dia gnostikgewinn durch die moderne Durchflusszytometrie, die eine gezieltere Auswahl der Zellen des Transplantats erlaubt. Bei der allogenen Stammzelltransplantation müssen wir die Schwierigkeit bewältigen, Spender mit immunologisch passendem HLAProfil zu finden oder die verfügbaren Transplantate für eine erfolgversprechende Transplantation so zu manipulieren, dass Komplikationen wie die Graft versus Host Disease (GvHD) gemildert werden. Die im folgenden dargestellte Studie1 soll dazu beitragen, hierfür bessere Lösungen zu finden. Forschungsziel war es, eine Methode für die klinische, großmaßstäbliche Depletion von abTLymphozyten aus mo bilisierten peripheren Stammzellen zu entwickeln und so allogene Transplantate zu erhalten, die mit Stammzellen, Natürlichen Killerzellen (NKZellen) und gdTLymphozyten angereichert sind. Gängiges Verfahren bei der Stammzelltransplantation ist die T-Zelldepletion mit Hilfe von Antikörpern, die gegen T-Zell-Oberflächenantigene gerichtet sind. Derzeit ist hierfür die Positivselektion von Stammzellen mit dem CD34-Marker eine weitverbreitete Methode. Die Transplantation dieser Zellen kann allerdings lebensbedrohliche Virus- und Pilzinfektionen sowie Leukämierückfälle begünstigen. Denn die Positivselektion von CD34+-Stammzellen führt zwar zu einer ausgezeichneten T-Zelldepletion, entfernt aber andere, immunologisch nützliche Zellen, insbesondere Natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Die im folgenden beschriebenen Untersuchungen dienen der Entwicklung eines optimierten Depletionsverfahrens, das den Kreis der möglichen Spender und Zellquellen erweitert und darüber hinaus durch bessere Selektion mehr hilfreiche Zellarten im Transplantat belässt.

Mobilisierung und Gewinnung von peripheren Blutstammzellen Hierfür haben wir sieben Großversuche durchgeführt. Im ersten Arm wurden „nicht-mobilisierte“ periphere Blutstammzellen (PBSCs) mittels Leukapherese aus drei gesunden erwachsenen Freiwilligen gewonnen, im zweiten Arm aus vier „mobilisierten“, gesunden, freiwilligen erwachsenen Spendern nach täglicher subkutaner Injektion von G-CSF (10 µg pro kg Körpergewicht, bei einer Maximaldosis von 480 µg/pro Tag; Neupogen; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) für vier Tage. Eine Leukapherese

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Abb. 1: Einfluss der Kopplung von abT Zellen an Magnetkügelchen auf de ren Depletion. Nähreres siehe Text. wurde am fünften Tag unter Anwendung eines Cobra Spectra Cell Separators (Cobe, Lakewood, CO, USA) durchgeführt.

Depletion von ab-T-Zellen PBSC wurden mit der gleichen Menge autologen Plasmas vermischt und über Nacht bei 4°C gelagert. Dann wurden diese Zellen (7 x 109 Gesamtzellzahl) einmal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen (PBS unter Zusatz von 1 mM EDTA) und mit 1 ml Biotin-konjugiertem (BMA031-biotin; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) anti-ab-Antikörper für 30 Min. bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 7,5 mL anti-Biotin an magnetische MicroBeads (Miltenyi Biotec) gekoppelt. Unter ständigem Schütteln wurden die an die Beads konjugierten Zellen bei Zimmertemperatur für

Vor und nach der ab-T-Zelldepletion haben wir das Auftreten der Oberflächenmarker CD3, CD14, CD19, CD20, CD56, CD133, CD34 und der TZellrezeptoren ab und gd untersucht. Eingesetzt wurde hierzu ein LSR-Durchflusszytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) . Mit folgender Methode haben wir das Produkt auf verbliebene T-Zellrezeptor-ab-Zellen geprüft: Eine Mischung der an den ab-T-Zellrezeptor gekoppelten Farbstoffe Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (BMA 031; Caltag Laboratories, Burlingame, CA USA) und Phycoerythrin (11F2; BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA), an den CD45-Rezeptor gekoppeltes PE-TR (J33; Coulter/ Immuntech Co., Miami, FL, USA), an den CD3-Rezeptor konjugiertes APC (SK7; BD Biosciences Pharmingen) sowie an CD14 gebundendes APC-CY7 (MoP9; BD Biosciences Pharmingen) wurde in 5-ml Prüfröhrchen gegeben. Nach Zugabe von etwa 106 Zellen in jedes Prüfröhrchen inkubierten wir diese für 10 Min. bei Zimmertemperatur im Dunkeln. Dann wurden verbliebene Erythrozyten (RBK) mit 3 mL Ammoniumchloridlösung lysiert, zentrifugiert und einmal mit färbender Pufferlösung (Dulbecco‘s PBS, enthält 1% hitzeinaktiviertes FKS) und 0,01% NaN3, behandelt. Zur Unterscheidung abgestorbener Zellen wurden 50 µl einer auf eine Konzentration von 1 µg/ml eingestellten DAPI (4′,6-Diamidin-2-Phenylindol, Dihydrochlorid, Molekularproben, Eugene, OR, USA)-Lösung hinzugefügt. Gesammelt haben wir die Datensätze mittels eines BD LSR II (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), der mit drei Lasern ausgestattet ist. Die Ergebnisse der Prüfröhrchen – jedes mit 1x105 bis 1x106 Frischzellen – wurden mittels BD FACS Diva-Software (Becton Dickinson) analysiert. Da die gleichen Antikörper zur Depletion (Clone BMA031) und zur Erkennung von ab-T-Zellen nach Depletion verwendet wurden, haben wir weitere anti-abAntikörper (Clone WT31; Becton-Dickinson) zur Erkennung der nach der Depletion verbleibenden T-Zellen eingesetzt.

Funktionelle in vivo- und in vitro-Experimente Kolonieexperimente: Nach der Depletion haben wir die in vitro-Funktionalität der Stammzellen mittels Kolonieexperimenten geprüft. Somit konnten wir die Anteile an CD133+ in den Zellen vor der Depletion und im depletierten Produkt LABORWELT

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Wissenschaft AML

intensität, jedoch waren αβ-T-Zellen nach immunomagnetischer Markierung (Abbildung 1) weiterhin eindeutig gefärbt. Nachfolgende Experimente mittels weiterer Methoden zur Feststellung von residuellen T-Zellen haben diese Ergebnisse bestätigt, wie zum Beispiel durch Kombinationen aus CD3, CD4, CD8, und dem T-Zell-Rezeptor (TCR) gd. Es wurde kein Unterschied der Empfindlichkeit des Nachweises residueller αβ-T-Zellen festgestellt (Daten nicht gezeigt), und wir haben das FITC-markierte BMA031 weiterverwendet.

Abb. 2: Repräsentative Durchflussanalyse vor und nach großmaßstäblicher Depletion von αβ-TLymphozyten. Die Zahlen stehen für die Prozentanteile an Zellen in den Quadranten. bestimmen. Sie wurden auf dieselbe Anzahl von CD133+ angepasst. Des Weiteren isolierten wir CD133+-Stammzellen aus den mononukleären Zellen (mononuclear cells, MNC) vor Depletion mittels des CD133-Selektionssatzes (Selection kit, Miltenyi Biotec) und AutoMacs (Miltenyi Biotec). Die Zellen wurden in einer Konzentration mit dem Äquivalent von 1.000 CD133+ pro Platte in einem Methylcellulose-basierten, halbfesten Kulturmedium (Methocult H4433; Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) ausplattiert. Nach 14 Tagen konnten die Kolonien ausgezählt und die Anwesenheit von Erythroid Burst Forming Units (BFU-E), Erythroid Colony Forming Units Granulozyten-Macrophage- (CFU-GM) und Erythroid Colony Forming Units Macrophage (CFU-M) quantifiziert werden. Alle Experimente haben wir dreifach wiederholt. In vivo-Engraftment-Studien: Die in vivoEngraftment-Kapazität der αβ-depletierten, mobilisierten Stammzellen wurde jüngst im NOD-scid IL2rnull-Modell beschrieben. Dieses Modell haben wir für unsere weitere Untersuchung genutzt. In Kürze: NOD-scid IL2rnull -Zellen wurden mit 325 cGy unter Verwendung eines 137 Cäsium-Isotops (J. L. Shepard & Associates, San Fran Fernando, CA, USA) bestrahlt. Für die Transplantation werden Mäusen Zellen intravenös in eine Querader des Schwanzes injiziert – entweder mit αβ-T-Zell-depletierten Zellen, die auf insgesamt 1x 106 CD133-Zellen angepasst wurden, oder mit 1x 106 CD133+-Positivselektion

mononukleärer Zellen vor der Depletion. Die Mäuse wurden nach acht Wochen getötet und auf menschliche Zellen in Knochenmark, Milz, Thymus und peripherem Blut untersucht. Das menschliche Engraftment hatten wir durch Doppelfärbung der Zellen mit einem AntiHuman-CD45- und Anti-Maus-CD45-Antikörper (Becton Dickinson) festgestellt, die Analyse erfolgte per Durchflusszytometer. Die humanen CD45+ -Zellen wurden dann auf CD19, CD3, CD4, CD8, αβ, gd, CD14 und CD56 hin geprüft.

Ergebnisse – Erfassungsrate einer Interferenz bei Depletion Um sicherzustellen, dass residuelle αβ-TZellen auch nach der Depletion verlässlich und genau erkannt werden konnten, wurden unbehandelte mononukleäre Zellen inkubiert – entweder direkt mit dem markierten FITCanti-αβ-Antikörper BMA031 oder indirekt, mit dem mit Biotin-markierten Primer BMA031, gefolgt von magnetischem MicroBeads-antiBiotin-Antikörper. Danach wurden sie mit dem FITC (Fluoresceinisothiocyanat)-markierten BMA031-Antikörper markiert.Wie in Abbildung 1 gezeigt, hatte die Markierung der Zellen mit dem MicroBeads-Biotin-markierten Primer BMA031 und dem MicroBeads-anti-Biotin-Antikörper keine Auswirkungen auf die Bindungsqualität des FITC-markierten BMA031-Antikörpers. Es gab nur eine geringe Abnahme der Färbungs-

Tab. 1: Anzahl an CD34+- Stammzellen aus Spendern, deren Stammzellen mit G-CSF mobilisiert wurden, vor und nach der αβ-T-Zell-Depletion sowie prozentuale Ausbeute von CD34+-Zellen Spender

Anzahl an CD34+-Zellen x Anzahl an CD34+-Zellen x 107, vorher 107, nachher

Mobilisiert 1

Mobilisiert 2

Mobilisiert 3

Mobilisiert 4

4,2

2,4

Durchschnitt

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% Ausbeute an CD34+Stammzellen 71

Depletion von αβ-T-Lymphozyten in großem Maßstab Bei drei Spendern wurde eine Leukapherese ohne vorherige Stammzell-Mobilisierung durchgeführt. Bei vier Spendern wurde vor der Leukapherese mit G-CSF mobilisiert. Die durchschnittliche Zahl mononukleärer Zellen (MNC) vor αβ-T-Zelldepletion betrug 1,63 x 1010 (0,6-2,5 x 1010). Die durchschnittliche Ausbeute der MNC nach Depletion betrug 67% (56-75%). Der durchschnittliche Anteil an T-Zellen vor Depletion betrug 40,2% (21-67%). Der Anteil residueller Zellen nach der Depletion lag bei 0.02% αβ-T-Zellen (0,01%-0,04%). Die durchschnittliche gemessene Depletion an αβ-T-Zellen betrug demnach 3,9 (3,5-3,4) Größenordnungen (Log 10). Die durchschnittliche absolute αβ-T-Zellzahl nach Depletion lag bei 1,8 x 106 (0,8 x – 3,6 x 106). Die Ergebnisse aus den mobilisierten Präparaten waren sehr ähnlich mit einer mittleren αβ-TZell-Depletion (log10) von 3,8 log-Stufen (3,5 - 4) und einer mittleren absoluten αβ-T-Zellen-Zahl von 1,36 x 106 (0,9-1,8 x 106). Abbildung 2 zeigt eine repräsentative DurchflusszytometrieAnalyse vor und nach T-Zell-Depletion. Nach der Depletion von αβ-T-Zellen aus den G-CSF-mobilisierten PBSC der vier Spender betrug die durchschnittliche Ausbeute von CD34-Stammzellen 66% (57%-71%) (Tabelle 1). Die die mittlere Ausbeute von CD56+-NK-Zellen und gd-T-Zellen nach Depletion aus nicht mobilisierten und mobilisierten Spendern betrug 80% (50-100%) beziehungsweise 92% (58-100%).

Funktionelle in vivo- und in vitro-Experimente In vitro-Experimente zur Koloniebildung und in vivo-NOD-SCID IL2rnull: Um zu beurteilen, ob diese Methode zur αβ-T-Zelldepletion einen negativen Einfluss auf die biologische Funktion der Stammzellen hat, haben wir Repopulationsexperimente durchgeführt. Für die KolonieExperimente wurden unberührte MNC, αβ-TZell-depletierte MNC oder vor der Depletion aus den MNC aufbereitete CD133+-Stammzellen in gleicher Anzahl in Methylzellulose plattiert. Die Kolonien konnten nach 14 Tagen ausgewertet werden. Die Anzahl verschiedener Kolonien (BFU-E, CFU-M und CFU-GM) war bei LABORWELT

20.10.2011 12:58:23 Uhr

Wissenschaft AML

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Abb. 3: Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten-Anteile von BFU-E, CFU-GM und CFU-GEMM aus positiv selektierten CD133+Stammzellen, von αβ-T-Lymphozyten befreiten PBMCs und unmanipulierten Zellen. den getesteten Zellpopulationen gleich (Daten nicht gezeigt). Bei den in vivo-Engraftment-Experimenten konnten wir zeigen, dass die Vorgehensweise der αβ-Depletion keinen Einfluss auf die Engraftment-Kapazität der Stammzellen hatte. Im Knochenmark und Thymus von Mäusen, denen der αβ-depletierte Anteil injiziert wurde, konnten wir sogar ein besseres Engraftment menschlicher CD45+-Zellen beobachten als bei Mäusen, die mit der gleichen Menge an aufbereiteten CD133+-Stammzellen behandelt wurden. Der Anteil der erkennbaren menschlichen Zellen in Milz und peripherem Blut war bei beiden Gruppen gleich. Da dieses neubeschriebene Mausmodell myeloisches und lymphoides Engraftment unterstützt, haben wir die menschlichen PeproTech GmbH · Hamburg CD45+-Zellen weiter auf Lymphozyten-Subpopulationen hin analysiert. In der detaillierten Analyse wiesen die Mäuse, denen αβ-depletierte Stammzellen gegeben wurden, ein Engraftment-Niveau von CD3+-Zellen auf, das mindestens dem der Mäuse glich, die CD133-positiv-selektierte tk7_11_PeproTech_90x116.indd 1 Transplantate bekommen hatten. Die Mäuse der αβ-depletierten Gruppe wiesen signifikante Konzentrationen an gd-T-Zellen auf, wie auch eine vielfach verzweigte Rekonstitution.

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Fazit Die hier dargestellte Methode ermöglicht eine neue Qualität der Transplantatmanipulation mit möglichen signifikanten Vorteilen. Die effektive αβ-T-Zelldepletion sollte die Verwendung von nicht HLA-passenden und NK-alloreaktiven Spenden ermöglichen. Darüber hinaus könnte sie die Anwendung von reduced-intensity conditioning (RIC)-Regimen (intensitätsreduzierte Konditionierung) und die Verkürzung intensiver Immunsuppression ermöglichen und so zu vorteilhafteren Krankheitsverläufen und geringerer Mortalität bei der allogenen Transplantation führen.

Literatur [1]

Originalarbeit: S Chaleff, M Otto, RC Barfield, T Leimig, R Lyengar, J Martin, M Holiday, J Houston, T Geiger, V Huppert and R Handgretinger (2007): A large-scale method for the selective depletion of αβ T lymphocytes from PBSC for allogeneic transplantation, Cytotherapy (9,) 8: 746-754

Korrespondenzadresse Prof. Dr. Rupert Handgretinger Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinik für Kinder- und Jugendmedizin Hoppe-Seyler-Straße 1, 72076 Tübingen rupert.handgretinger@med.uni-tuebingen.de LABORWELT

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Blitzlicht Zellsortierung

Einzelzellmessung mechanischer Eigenschaften Dr. Isabella Guido, Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Peking University, Beijing, China; Dr. Magnus Jäger, Dr. Claus Duschl, Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik (IBMT), Potsdam Markierungsfreie Methoden zur Identifikation einzelner Zellen in komplexen Gemischen werden vielerorts diskutiert. Besonders günstig ist es für zahlreiche Anwendungen, wenn die Untersuchung zusätzlich zerstörungsfrei abläuft, die Zellen also nicht beispielsweise lysiert werden müssen, um an Inhaltsstoffe zu gelangen, sondern nachträglich noch intakt zur Verfügung stehen. Als Sortierungskriterium bietet sich die Auswertung der mechanischen Eigenschaften der Zellen an, die dank neuer Entwicklungen mit sehr geringem Aufwand schnell und automatisierbar vermessen werden können. Hierbei werden externe Kräfte an die einzelnen Zellen angelegt. Aus der resultierenden Verformung werden Rückschlüsse auf ihre viskoelastischen Parameter gezogen. Dieser Artikel stellt ein Zell-Stretcher-Verfahren vor, das besonders einfach in mikrofluidische Kanäle integriert werden kann. Wir zeigen Anwendungsfelder auf und diskutieren mögliche Probleme. Zellen werden in einem Gemisch verschiedener Zelltypen – wie sie in einer Patientenprobe auftreten – anhand spezifischer Biomarker

identifiziert. Als Biomarker kann zum Beispiel die Expression bestimmter Membranproteine dienen, die durch fluoreszente Liganden oder

Abb. 1: Prinzip und technische Umsetzung des elektrischen Stretchers. Oben: Grundlage der Zelldehnung. Das elektrische Feld zwischen zwei Elektroden polarisiert die Zelle. Diese Ladungen werden von den Elektroden angezogen. Unten: Praktische Umsetzung auf einem Chip. Die Vergrößerung zeigt Stretcher-Elektroden im verzweigten Mikrokanal und Manipulationselektroden zum Sortieren der Zellen. 16 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Antikörper markiert werden können, oder etwa der Nachweis charakteristischer Nukle insäuresequenzen. Soll die Zellidentifikation diagnostischen Zwecken dienen, muss beim Nachweis berücksichtigt werden, dass im medizinischen Umfeld ein geringstmöglicher Vorbereitungsaufwand und ein rasches Mess ergebnis wichtig sind.

Zellmechanik als Biomarker Vor diesem Hintergrund bieten sich Unter schiede in den mechanischen Eigenschaften verschiedener Zellen als Biomarker an. Sie ermöglichen eine Zellanalyse ohne vorherige Färbeprozeduren und potentielle Artefakte durch hinzugefügte Reagenzien (labels). Die im akademischen Bereich gebräuchlichste Technik zur Bestimmung der mechanischen Parameter lebender Zellen ist die Nanoinden tation mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM)1. Die Erweiterung um frequenzmodulierte Belastungen erlaubt darüber hinaus auch die Messung viskoelastischer Eigenschaften2 . Ungewöhnlichere Verfahren umfassen etwa die Beobachtung einer magnetisch induzierten Verschiebung von Partikeln, die an adhärente Zellen gekoppelt wurden3. Einen wesentlichen Fortschritt der mechanischen Zellcharakteri sierung stellte die Nutzung optischer Kräfte für die kontrollierte Verformung einzelner Zellen dar, aufgrund derer sich beispielsweise Zellen zweier unterschiedlich aggressiver Neopla sien unterscheiden ließen4. Dieser „optische Stretcher“ wurde in eine Durchflussmesszelle eingebaut, um seriell eine größere Anzahl von Zellen auswerten zu können. Nachfolgende Arbeiten zielten auf einen quantitativen Ver gleich der OptischenStretcherTechnologie mit der etablierten AFMTechnik ab5. Diesem Ansatz ähnelt physikalisch die Ver wendung elektrischer statt optischer Kräfte, um lebende Zellen mechanisch zu verformen und daraus charakteristische Materialeigen schaften zu bestimmen. Die absolute Größe der ausgeübten Kräfte ist in beiden Fällen an nähernd gleich. Der elektrische Stretcher weist jedoch eine Reihe weiterer Vorteile gegenüber den optischen Aufbauten auf: Die Notwendig keit einer LaserQuelle entfällt, ebenso wie die der genauen Justage zweier Glasfasern. Die Integration nahezu beliebig großer und ge formter Mikroelektroden in Mikrofluidiken ist aufgrund langjähriger Entwicklung in diesem Gebiet6 deutlich einfacher zu bewerkstelligen als die von Glasfasern. All dies schlägt sich nicht zuletzt im Preis eines zu konstruierenden Gerätes nieder. Der erste Bericht eines dedizierten elektri schen Stretchers stammt aus der Zeit vor dem routinemäßigen Einsatz der Photolithographie, als Mikroelektroden noch aus Rasierklingen angefertigt wurden7. Zwar erbrachten diese Aufbauten wertvolle Daten, doch blieb ihr Ein satz meist auf grundlagenwissenschaftliche LABORWELT

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Enhance Cell Productivity Deliver Scalable Results Make Processes Reproducible

Abb. 2: Ergebnis bei verschiedenen Zelltypen. Oben: Dehnung zweier humaner neutrophiler Promyelozyten (HL-60) zwischen den Mikroelektroden. Unten: Unterschiedliche Dehnung ε der murinen Fibroblastenlinien L-929 (lila) und 3T3 (grün). Rechts: 37°C-Isotherme (rot) in Abhängigkeit von den experimentellen Parametern elektrische Spannung U und elektrische Leitfähigkeit σ. Näheres siehe Text. Fragestellungen zu den mechanischen Eigenschaften beispielsweise von Lipidmembranen beschränkt8 – mit begrenzter medizinischer Relevanz. Erst in jüngster Zeit erfolgte die diagnostisch hochinteressante Nutzung der Zelldehnung als Biomarker mit den einfachen und kostengünstigen elektrischen Aufbauten.

Der elektrische Stretcher Das physikalische Grundprinzip des elektrischen Stretchers ist leicht verständlich: Die einzelne zu untersuchende Zelle wird in das elektrische Feld zwischen zwei Mikroelektroden gebracht. Infolgedessen kommt es – bei geeigneter Wahl der experimentellen Parameter – innerhalb der Zelle zur Umorientierung von Molekülen mit Dipolcharakter oder auch zur Verschiebung der Gegenionen um fixe Ladungen herum. All diese Effekte werden zusammengefasst als die Ausbildung von Polarisationsladungen in der Zelle bezeichnet (Abb. 1). Im Ergebnis befinden sich effektiv elektrische Ladungen in einem äußeren elektrischen Feld. Gemäß den bekannten Gesetzen der Physik resultiert daraus eine wirkende Kraft. Diese zieht die Ladungen zu den Elektroden, wobei sie die Zelle entsprechend ihrer begrenzten Verformbarkeit dehnen. Die vorher sphärische Zelle ist daher nun ellipsoid. Die Deformation wird mit einfachen bildgebenden Verfahren als strain ε gemessen. Um schädliche Effekte auf die Zelle zu minimieren, wie etwa die räumliche

Bewegung geladener Moleküle in der Zelle oder ihrer Membran, wird üblicherweise kein zeitlich konstantes elektrisches Feld angelegt, sondern ein schnelles Wechselfeld im Kurzwellenbereich. Dies ändert jedoch nichts am zugrundeliegenden Prozess. Die technische Umsetzung dieses Prinzips zeigt ebenfalls die Abbildung 1: Zum Zwecke der Identifikation der Zellen über das Ausmaß ihrer elektrisch induzierten Dehnung werden zwei Mikroelektroden an geeigneter Stelle in einen Mikrokanal integriert. Dabei können sich die Elektroden je nach dem gewählten Herstellungsverfahren zum Beispiel in den Seitenwänden des Kanals befinden oder – wie hier gezeigt – auf dem Boden oder der Decke aufgebracht sein. Für die meisten untersuchten humanen Zellen erwies sich ein Abstand von 20 µm als optimal. Die elektrische Feldstärke beträgt dann 300 kV/m. Um die identifizierten Zellen beispielsweise entsprechend ihrer Eigenschaften sortieren zu können, weisen diese Chips üblicherweise stromabwärts des elektrischen Stretchers eine Verzweigung in mehrere fluidische Ausgänge auf. Weitere Manipulationselektroden dienen dazu, die Zellen in einen davon zu führen. Das ganze Verfahren lässt sich im Sinne einer Geräteentwicklung weitgehend automatisieren. Dazu gehören unter anderem die Steuerung des Generators, eine rechnergestützte Bildanalyse zur Auswertung der Zelldehnung sowie das Schalten der Ventile und der Pumpe, die den Transport der Zellsuspension kontrollieren.

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Einige beispielhafte Ergebnisse Ein typisches Ergebnis veranschaulicht die Abbildung 2: Die Dehnung der Zellen entlang der elektrischen Feldlinien im Spalt zwischen den Elektroden ist hier deutlich zu erkennen. Da Zellen nicht nur elastisch, sondern viskoelastisch sind, ist dieser Prozess auch zeitabhängig. Trägt man die gemessene Dehnung ε gegen die Zeit auf, so werden Unterschiede im Verhalten verschiedener Zellen offensichtlich. Zum anderen liefern diese Kurven Informationen darüber, wie lange nach dem Einschalten der Spannung gewartet werden muss, bevor zwei gegebene Zelltypen sicher voneinander unterschieden werden können. Diese Zeitspanne beträgt in der Regel ungefähr zehn Sekunden. Als Resultat erhält man Dehnungsdiagramme wie das in der Abbildung 2 gezeigte. In diesem Beispiel wurden Zellen desselben Typs (Fibroblasten) aus dem gleichen Organismus (Maus) verglichen. Bereits bei einander derart nahe verwandten Zellen sind deutliche Unterschiede messbar. Analoge Untersuchungen erfolgten auch für humane Brustkrebszellen (MCF-7) und nichtentartete Zellen aus dem gleichen Gewebe (MCF-10)4. Bei diesen erwies sich das Mikrotubuligerüst als maßgeblich für ihr Dehnungsverhalten9. Eine weitere Anwendung des elektrischen Stretchers fokussierte sich auf die Identifikation von Faktoren, die für die Änderung der zellulären mechanischen Eigenschaften im Verlauf der Kultivierung verantwortlich sind10. Eine berechtigte Frage, die jede Manipulation lebender Zellen aufwirft, ist die nach der hervorgerufenen Schädigung. Dies betrifft natürlich auch die Stretcher. Während es für den optischen Bereich – nicht zuletzt, seitdem Laser-Pinzetten weite Verbreitung gefunden haben – umfangreiche Literatur über photoinduzierte Zellschädigungen gibt, sind bei elektrischen Feldern im Hochfrequenzbereich nach heutigem Wissensstand Schäden stets thermisch bedingt. Der Strom, der durch das die Zellen umgebende Medium fließt, erzeugt gemäß dem Ohmschen Gesetz Wärme. Dieser Vorgang ist klar physikalisch beschreibbar und beispielsweise mittels Infrarotthermographie quantifizierbar. Im Ergebnis erhält man für die hier vorgestellten elektrischen Stretcher die in der Abbildung 2 gezeigte 37 °C-Isotherme in Abhängigkeit von den beiden experimentell einstellbaren Parametern elektrische Spannung U und elektrische Leitfähigkeit σ. Wählt man einen der beiden Parameter (oder beide) hinreichend niedrig, so überschreitet die Temperatur in der Messkammer nicht die als zellunschädlich angenommenen 37 °C und andersherum. Die blauen Geraden zeigen an, dass etwa bei einer elektrischen Spannung von 6 V eine elektrische Leitfähigkeit von maximal 250 mS/m verwendet werden dürfte. Tatsächlich kam jedoch in sämtlichen genannten Arbeiten eine 50-fach niedrigere Leitfähigkeit

zum Einsatz. Die dazugehörige Gerade ist in der Abbildung 2 grün markiert und in dieser Darstellung von der Abszisse kaum noch zu unterscheiden. Eine nennenswerte Erwärmung ist in diesem Bereich ausgeschlossen. Die kritische Spannung zum Erreichen von 37 °C würde dort 40 V betragen – ein etwas „pathologischer“ Wert.

Wie wird es weitergehen? Der wichtigste Schritt auf dem Weg in die Anwendung ist die Überführung eines als wertvoll erkannten Prinzips in ein nutzbares Gerät. Entsprechende Tätigkeiten sind derzeit in Zusammenarbeit mit der ETH Lausanne im Gange. Der wesentliche Vorteil der Methodik ist dabei – neben dem einfachen Messaufbau und dem Entfallen aufwendiger Probenvorbereitungsschritte – die geringe erforderliche Materialmenge. Dies ermöglicht besonders patientenschonende Verfahren, wie die Feinnadelbiopsie. Eine beispielhafte Anwendung in dieser Hinsicht ist die Selektion mesenchymaler Stammzellen aus Gelenkproben. Eine biologische Fragestellung für zukünftige Untersuchungen wird sich darauf fokussieren, den Zusammenhang des Biomarkers „Biomechanik“ mit den Intermediärfilamenten des Zytoskeletts weiter aufzuklären. Seit Ende der 80er Jahre ist die Korrelation zwischen der Vimentinexpression und dem Metastasierungsgrad von Brustkrebs bekannt 11. Hier arbeiten die Stretcher um Größenordnungen schneller als jede biochemische Expressionsanalyse.

Literatur [1] [2]

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Korrespondenzadresse Dr. Magnus Jäger Tel.: +49-(0)-331-58187-305 Fax: +49-(0)-331-58187-399 magnus.jaeger@ibmt.fraunhofer.de LABORWELT

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Blitzlicht Verbrauchsmaterial

Die wichtigsten Überlegungen bei der Laborhandschuhauswahl Jaime Cassar, Roberto Greselin, KIMBERLY-CLARK PROFESSIONAL Die Auswahl der passenden Handschuhe für Laboranwendungen gewinnt immer mehr an Bedeutung. Dazu kommen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien sowie GLP-Vorgaben (Good Laboratory Practices), deren Einhaltung nachgewiesen werden muss. Das heißt, die Auswahl von Laborhandschuhen muss nach strengen Regeln erfolgen und überzeugend begründet werden können. Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien: Laborhandschuhe müssen gemäß der EURichtlinie 89/686/EWG als PSA-Produkt der Kategorie 3 – für den Einsatz in Bereichen, in denen potentiell irreversible Folgen oder Lebensgefahr drohen – zertifiziert sein. Die Verpackung muss das CE-Zeichen tragen, gefolgt von vier Ziffern als Kennzeichnung des Instituts, das die Handschuhe als PSAProdukt der Kategorie 3 zertifiziert hat. Darüber hinaus muss die Konformität mit folgenden Standards durch Piktogramme auf der Verpackung angegeben sein: Schutz vor Chemikalien gemäß EN374-1 (geringes Risiko), Schutz vor Mikroorganismen gemäß EN374-2, allgemeine Anforderungen an Schutzhandschuhe gemäß EN420. Handschuhe mit einer Zer tif izierung als Medizinprodukte gemäß der Richtlinie 93/42/EWG sind für den Einsatz im Labor nicht geeignet, es sei denn, sie sind auf der Verpackung zusätzlich als PSA-Produkt der Kategorie 3 gekennzeichnet. Das Labor muss unter Beachtung der Teststandards für die betreffenden Risiken, die Gefährdungsart und den Gefährdungsgrad der Mitarbeiter ermitteln und Handschuhe mit entsprechender Zertifizierung und Leistungsstufe auswählen.

Gefahr durch Chemikalienspritzer Chemikalienspritzer können einen Handschuh durchdringen und den Träger schädigen. Bei der Risikobewertung müssen die Gefahrenstoffklasse der Chemikalie sowie deren potentielle Einwirkdauer im Rahmen der fraglichen Anwendung berücksichtigt werden. Empfehlenswert sind Handschuhe, deren Durchdringungszeit laut veröffentlichten EN374-3:2003-Testdaten – bezogen auf die

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nationsschutz und Funktionalität. Unter den Aspekt der Funktionalität fallen die physischen Eigenschaften von Handschuhen. Von diesen hängt die sichere und effektive Durchführung der verschiedenen Laborverfahren ab. Handschuhe mit niedrigen Reinheitsstandards setzen unter Umständen Substanzen frei, die das Ergebnis eines Verfahrens verfälschen können. Besonders Elektrophorese und PCR (Polymerasekettenreaktion) reagieren hochempfindlich auf Kontamination. Handschuhe für diese Anwendungen sollten daher frei von Latexproteinen sein und keine erkennbaren Gerüche oder Rückstände auf den Oberflächen aufweisen. Bestimmte Tätigkeiten erfordern Handschuhe mit bestimmten physischen Attributen. Dazu gehören Tastempfindlichkeit, Griffigkeit, Tragekomfort, Länge, Stärke und Reißfestigkeit. Verfahren beispielsweise, für deren effektive Durchführung ein hohes Maß an Präzision und Kontrolle notwendig ist, erfordern Handschuhe mit hoher Tastempfindlichkeit.

Anwenderspezifische Anforderungen

betreffende Chemikalie in der fraglichen Konzentration – länger ist als die Einwirkdauer.

Gefahr durch Mikroorganismen Mikroorganismen können durch mikroskopisch kleine Löcher in Handschuhe eindringen und den Träger schädigen. Laut Teststandard EN374-2:2003 für den Schutz vor Mikroorganismen müssen die Handschuhhersteller mithilfe von Luft- oder Wasserdichtigkeitstests den AQL-Wert (Acceptable Quality Level) ermitteln und damit die Lochfreiheit der Handschuhe bestätigen. Ein niedrigerer AQL-Wert entspricht laut ISO 2859 einer geringeren Defekttoleranz bei der betreffenden Fertigungscharge. Für die Arbeit mit Viren sollten Handschuhe gemäß EN374-2 Stufe 3 zertifiziert sein, was einem AQL-Wert von 0,65 entspricht. Handschuhe mit einer Zertifizierung gemäß EN374-2 Stufe 2 dagegen haben einen AQL-Wert von 1,5 und eignen sich eher zum Schutz gegen Bakterien oder Pilze.

Menschen haben unterschiedlich große Hände. Einige haben besonders empfindliche Haut oder reagieren allergisch auf bestimmte Substanzen. Handschuhe müssen gut sitzen, damit sie die gesundheits-, sicherheits- und anwendungsspezifischen Anforderungen erfüllen, für die sie ausgewählt wurden. Ein zu großer Handschuh beeinträchtigt die Tastempfindlichkeit oder sitzt zu locker, so dass er den erforderlichen Schutz nicht bieten kann. Handschuhe aus Naturkautschuklatex können bei manchen Menschen allergische Reaktionen unterschiedlichen Schweregrades auslösen, von Typ I (anaphylaktischer Schock) bis Type IV (Kontaktdermatitis). Durch latexfreie Handschuhe oder Latexhandschuhe mit einem geringen Anteil allergieauslösender Proteine lässt sich das Risiko von Latexallergien mindern. Chemische Beschleuniger oder Prozesschemikalien, die bei der Handschuhfertigung zum Einsatz kommen, können Hautreizungen auslösen, besonders bei Personen mit empfindlicher Haut. Unterschiedliche Hersteller nutzen unterschiedliche chemische Beschleuniger und Prozesschemikalien und setzen unterschiedlich aufwendige Reinigungsprozesse ein. Durch Handschuhe, deren Gehalt an chemischen Beschleunigern und Prozesschemikalien dank wirkungsvoller Reinigungsprozesse unterhalb der Messgrenze liegt, lässt sich die Gefahr von Hautreizungen verringern.

Anwendungsspezifische Anforderungen

Kontakt

Je nach Anwendung bestehen unterschiedliche Anforderungen hinsichtlich Kontami-

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Wissenschaft Toxizitätsscreening

Neues zelluläres QT-Screen-Konzept mit adulten Herzmuskelzellen Dr. Lars Kaestner, Prof. Dr. Peter Lipp, Forschungsstelle für Molekulares Imaging und Screening, Institut für Molekulare Zellbiologie, Medizinische Fakultät, Universität des Saarlandes, Homburg Neue Medikamente müssen vor ihrer Markteinführung auf Herztoxizität geprüft werden. Bisher fehlen hierzu Verfahren, die aussagekräftig und im Industriemaßstab durchführbar sind. In einer Reihe von Arbeiten wurden kürzlich Ansätze und Voraussetzungen publiziert, die sich mit der zuverlässigen Gewinnung und Kultivierung adulter Herzmuskelzellen, optischen molekularen Sensoren und mikroskopischen Konzepten beschäftigen. Die Weiterführung dieser Arbeiten unter Beteiligung eines Konsortiums industrieller Partner wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung im Verbundprojekt „CordiLux“ gefördert.

Abb. 1: Dreidimensionale Teilrekonstruktion einer adulten Herzmuskelzelle aus der Hauptkammer des Herzens, die mit Hilfe eines Membranpotentialsensors gefärbt wurde. Zu erkennen ist die komplexe, netzartige Struktur der Membraneinstülpungen. Das Übersichtsbild zeigt die gesamte Länge der Zelle (Länge der Pfeile entspricht 12 µm), in der herausvergrößerten Detailabbildung entspricht die Länge der Pfeile 2 µm. Die Induktion arrhythmogener Potentiale ist eine der häufigsten akuten und lebensbedrohenden Nebenwirkungen pharmakologisch wirksamer Substanzen. Das prominenteste Beispiel eines Medikamentes das aus diesem Grund vom Markt genommen werden musste, ist das Arthrose- und Rheumamedikament Vioxx®.

QT-Screens – state of the art Inzwischen ist es etablierter Wissensstand, dass eine Verlängerung des QT-Intervalls im 20 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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EKG mit einer proarrhytmogenen Aktivität assoziiert ist. Ebenfalls etabliert ist die Erkenntnis, dass das zelluläre Äquivalent des QT-Intervalls die Länge des Aktionspotentials darstellt1. Das Aktionspotential wiederum setzt sich aus vielen Komponenten zusammen, die sich molekularen Entitäten zuordnen lassen. An der Verlängerung des Aktionspotentials ist häufig ein Kaliumkanal beteiligt, der hERG-Kanal. Daher hat man diesen heterolog in Zelllinien exprimiert und führt an diesen Zellen mit Patch-clamp-Robotern automatisierte Screens durch. Die einfache Handhabbarkeit der Zellen ist ein Vorteil dieser Methodik. Allerdings wird

dabei der Effekt von Substanzen auf nur einen einzelnen molekularen Baustein getestet. Da aber sehr viele Elemente und Prozesse die Zelle potentiell proarrhythmogen beeinflussen können, ist ein aussagekräftigeres Verfahren zu bevorzugen, das den Test aller beteiligten Strukturen und Funktionseinheiten einschließt.

Adulte Herzmuskelzellen in Kultur Isolierte Herzmuskelzellen sind ein populäres Zellmodell in der pharmakologischen und kardialen Grundlagenforschung. Dabei sind neonatale Zellen bezüglich der Isolation und Handhabung wesentlich einfacher und robuster, aber leider auch bezüglich ihrer zellulären Charakteristika völlig verschieden von adulten Zellen2. Fortschritte in der reproduzierbaren Zusammensetzung von Verdauungsenzymen zur Zellvereinzelung haben in den letzten Jahren zu verlässlichen Protokollen für die Isolation adulter Kardiomyozyten geführt 3 . Außerdem wurden die Kulturbedingungen soweit optimiert, dass die Zellen mindestens drei Tage ohne gravierende morphologische oder funktionelle Änderungen untersucht werden können 4,5 . Damit sind wesentliche Voraussetzungen geschaffen, in isolierten Herzmuskelzellen in vitro genetische Manipulationen vorzunehmen. Dies betrifft auch genetisch kodierte Biosensoren – insbesondere Membranpotentialsensoren (siehe unten). In Herzmuskelzellen differenzierte Stammzellen besitzen ein großes Potential für den Einsatz in Screening-Anwendungen, weil dies die Bereitstellung der Zellen vereinfachen würde. Leider lassen sich Stammzellen zur Zeit noch nicht zuverlässig und determiniert in entsprechender Anzahl in Vorhof-, Ventrikel- oder Schrittmacherzellen differenzieren und besitzen daher gegenüber isolierten adulten Ventrikelzellen noch schwerwiegende Nachteile. Diese Situation wird sich allerdings wahrscheinlich in den nächsten Jahren ändern; Stammzellen sollten somit zunehmend an Bedeutung gewinnen.

Molekulare Sensoren Molekulare Sensoren zum optischen Auslesen von Membranpotentialen sind seit mehr als 40 Jahren bekannt6 und wurden seitdem ständig weiterentwickelt. Dennoch konnte erst kürzlich ein Ansatz veröffentlicht werden, der den Einsatz von Membranpotentialsensoren zur quantitativen Messung des Aktionspotentials ermöglicht, ohne das Aktionspotential selbst zu beeinflussen2. Die-

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Wissenschaft Toxizitätsscreening

Abb. 2: Prototyp-Design eines Mikroskops, welches repräsentativ für eine neue Generation vom Mikroskopen ist, die präzise Screens mit Mikrotiterplatten erlauben und Emissionsdetektion in zwei spektralen Kanälen ermöglichen. Diese Abbildung ist ein Nachdruck aus der Originalpublikation [14]. se Sensoren sind kleine Fluoresenzmoleküle, mit denen die Herzmuskelzellen angefärbt werden. Ein Beispiel für eine solche Färbung ist in Abbildung 1 zu sehen. Parallel dazu gibt es seit fast 15 Jahren Bestrebungen, genetisch kodierte Potentialsensoren zu etablieren (für einen Review siehe [7]). Einer der am weitesten entwickelten genetisch kodierten Potentialsensoren ist ein Konstrukt namens Mermaid8, das in Herzmuskelzellen umfassend charakterisiert wurde2,9,10. Ob sich in Zukunft in pharmakologischen Screens eher niedermolekulare Farbstoffe oder genetisch kodierte Sensoren durchsetzen werden, ist noch offen. Aktuell tendiert die Entwicklung bei beiden Ansätzen zu Farbstoffen, die in den roten Spektralbereich verschoben sind11, weil das einerseits für die Zellen weniger phototoxisch ist und andererseits auch Autofluoreszenzen reduziert.

in automatisierte Prozesse. Abbildung 2 zeigt das Design eines Mikroskop-Prototypen, der inzwischen Produktreife erreicht hat und für Screening-Anwendungen geeignet ist. Da die Detektion der Fluoreszenz effektiv erfolgen soll, empfehlen sich Ölimmersionsobjektive mit einer hohen numerischen Apertur. Das scheint zunächst im Widerspruch zu den Anforderungen an Screens mit Mikrotiterplatten zu stehen. Allerdings wurde kürzlich ein Konzept vorgestellt, das die Verwendung von speziellen Multiwellplatten unter Verwendung von Ölimmersionsobjektiven in Screeningprozessen erlaubt 13. Zusätzlich kann man in diesen Platten – durch in den Deckel eingebrachte Kohlenstoffelektroden – eine elektrische Feldstimulation der Herzmuskelzellen erreichen. Eine solche Multiwellplatte ist in Abbildung 3 zu sehen.

CordiLux – die Perspektive Für die Durchführung optischer, zellbasierter QT-Screens sind, wie oben ausgeführt, die grundlegenden Voraussetzungen geschaffen worden. Durch die berührungslose Messung an adulten Herzmuskelzellen ist das Potential für pharmakologisch-prädiktive Aussagen sehr hoch14 . Aus diesem Grund fördert das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) seit dem 1. Juli 2011 ein Verbundprojekt der Pharmafirmen (Pharmacelsus GmbH, Saarbrücken und PHAST GmbH, Homburg) mit Geräteherstellern (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing und CyBio AG, Jena), einer Softwarefirma (arivis GmbH, Rostock) und zwei Unternehmen der Biodiagnostik bzw. Nanotechnologie (ibidi GmbH, Martinsried und CoTec GmbH, Karlstein) in Zusammenarbeit mit der Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes. Dieses Projekt mit dem Acronym

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Literatur [1]

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Optische Technologien Optische Messungen von Aktionspotentialen sind bisher entweder photometrisch durchgeführt worden (die gesamte Fluoreszenz der Zelle wird auf einen Punkt fokussiert) oder örtlich stark eingeschränkt in Form von Linien- oder Einzelpunktmessungen. Die Sensitivität einer neuen Generation von Kameras mit sogenannten „scientific CMOS“-Chips12 wird es künftig ermöglichen, aussagekräftige Bilder mit einer Aufnahmegeschwindigkeit von 1.000 Bildern pro Sekunde zu erhalten. Diese Technologie erlaubt es, ein Kollektiv von 10 bis 15 Herzmuskelzellen gleichzeitig zu messen. Ein Screening-Verfahren stellt aber auch an das Mikroskop spezielle Anforderungen, beispielsweise die zeitgleiche Messung von mindestens zwei spektralen Kanälen oder die Möglichkeit zur Einbindung

„CordiLux“ liegt im BMBF-Forschungsschwerpunkt Biophotonik15. Innerhalb von drei Jahren sollen die notwendigen Technologien zu einem gesamtheitlichen Design zusammengeführt werden.

[13]

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Arrigoni, C., Crivori, P. Assessment of QT liabilities in drug development. Cell biology and toxicology 23 (2007), 1–13. Tian, Q., Oberhofer, M., Ruppenthal, S., Scholz, A., Buschmann, V., Tsutsui, H., Miyawaki, A., Zeug, A., Lipp, P., Kaestner, L. Optical action potential screening on adult ventricular myocytes as an alternative QTscreen. Cellular Physiology and Biochemistry 27 (2011), 281–290. Kaestner, L., Scholz, A., Hammer, K., Vecerdea, A., Ruppenthal, S, Lipp, P. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp 31 (2009). Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S., Kaestner, L., Lipp, P. A primary culture system for sustained expression of a calcium sensor in preserved adult rat ventricular myocytes. Cell calcium 43 (2008), 59–71. Tian, Q., Pahlavan, S., Oleinikow, K., Jung, J., Ruppenthal, S., Scholz, A., Schumann, C., Kraegeloh, A., Oberhofer, M., Lipp, P., Kaestner, L. Functional and morphological preservation of adult ventricular myocytes in culture by sub-micromolar cytochalasin D supplement. JMCC (2011), e-pub ahead of print. Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 61 (1968), 883–888. Kaestner, L., Tian, Q., Lipp, P. Action potentials in heart cells. In: G. Jung (ed.) Fluorescent Proteins II – Application of Fluorescent Protein Technology. Springer (2012), in press. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods 5 (2008), 683–685 . Tsutsui, H., Higashijima, S.-I., Miyawaki, A., Okamura, Y. Visualizing voltage dynamics in zebrafish heart. J. Physiol. (Lond.) 588 (2010), 2017–2021. Kaestner, L., Tian, Q., Lipp, P. Cardiac safety screens: Molecular, cellular and optical advancements. SPIE biomedical optics III 8089 (2011), 80890H-1 – 80890H6. Lee, P., Bollensdorff, C., Quinn, T.A., Wuskell,J.P., Loew, L.M., Kohl, P. Single-Sensor System for Spatially-Resolved, Continuous and Multi-Parametric Optical Mapping of Cardiac Tissue. Heart Rhythm 8 (2011), 1482–1491. Coates, C., Fowler, B., Holst, G. Scientific CMOS technology – A high-performance imaging breakthrough. White Paper (2009) 1–14. Müller, O., Tian, Q., Zantl, R., Kahl, V., Lipp, P., Kaestner, L. A system for optical high resolution screening of electrical excitable cells. Cell calcium 47 (2010), 224–233 . Kaestner, L., Lipp, P. Screening action potentials: the power of light. Front Pharmacol 2 (2011), 42 . Biophotonik at <http://www.biophotonik.org>

Korrespondenzadresse

Abb. 3: 24-Well Platte mit integrierten Kohlenstoffelektroden im Deckel zur elektrischen Feldstimulation von Herzmuskelzellen. Diese Abbildung ist ein Nachdruck aus der Originalpublikation [13].

Dr. Lars Kaestner Prof. Dr. Peter Lipp Universität des Saarlandes Medizinische Fakultät Forschungsstelle für Molekulares Imaging und Screening – Gebäude 61 66421 Homburg/Saar Tel.: +49-(0)-6841-1626103 Fax: +49-(0)-6841-1626104 lars_kaestner@me.com LABORWELT

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Expertenpanel: NextGeneration-Sequencing Mit der Markteinführung kompakter Desktop-Sequencer mit vergleichsweise niedrigerem Durchsatz ist das Next-Generation Sequencing für jedes Labor erschwinglich geworden. Mitte September hatten sich die Preise für ein Endgerät auf 40.000 bis 60.000 Euro halbiert. Damit werden nicht länger nur die wenigen hundert großen Zentren für Genomsequenzierung bedient, sondern die schnelle Sequenzierung dringt in den Forschungsmarkt und das Gesundheitswesen vor. Experten prognostizieren, das NGS die PGFE bereits in ein bis zwei Jahren in der mikrobiellen Diagnostik ersetzt haben wird. Was die Systeme leisten, was Dienstleister anbieten und wo Zukunftsanwendungen liegen, beleuchtet LABORWELT in der neuen Rubrik Expertenpanel. Hier kommen Spezialisten aus Industrie und Academia zu Wort.

Prof. Dr. Dag Harmsen Dag Harmsen leitet die Forschungsabteilung an der Poliklinik für Parodontologie der Universität Münster. Seine Arbeitsgruppe erlangte weltweite Anerkennung durch Arbeiten zur angewandten Bioinformatik in der Mikrobiologie und baute weltweit die größte öffentlich molekulare Typisierungsdatenbank auf. Kontakt: Dag.Harmsen@ukmuenster.de

LABORWELT: Wie können Benchtop-Next-GenerationSequenzer zu einer genombasierten Diagnose und Überwachung von Epidemien beitragen? Harmsen: Die Karten auf dem Markt für Next-Generation-Sequenzer (NGS) werden gerade neu gemischt. War NGS seit den Anfängen im Jahr 2005 eine Angelegenheit von weltweit wenigen hundert Genom-Sequenzierzentren, so öffnet sich gerade durch Einführung von erschwinglichen Benchtop-NGS-Geräten ein riesiger neuer Markt. Jedes Krankenhauslabor wird zum potentiellen Kunden – es tritt quasi gerade eine „Demokratisierung“ von NGS ein. Benchtop-NGS-Geräte, wie die Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) oder in Kür-

ze der Illumina MiSeq, sind jedoch nicht nur günstig in der Anschaffung, sondern skalierbar im Einsatz und insbesondere sehr schnell, das heißt von der DNA zur Sequenz in ein bis zwei Tagen. Damit eignen sie sich hervorragend für den Routineeinsatz in der Mikrobiologie, Onkologie, Humangenetik oder Transfusionsmedizin. Gerade beim Einsatz im Rahmen von mikrobiellen Ausbruchsgeschehen ist Geschwindigkeit natürlich Trumpf. Der Einsatz von NGS steht damit gerade am Wendepunkt von der Grundlagen- hin zur angewandten Forschung und Routinediagnostik. Dies konnte wir an der Universität Münster (WWU) gerade beim Management von EHEC in Deutschland und Klebsiella OXA-48 in den Niederlanden exemplarisch für die Bakteriologie demonstrieren. Dies dürfte den Beginn der prospektiven genomischen Epidemiologie markieren. Hierbei werden klassische epidemiologische Überwachungsparameter (Ort, Zeit und Person) mit genomweiten NGS-Typisierungsergebnissen für spezifischere Frühwarnsysteme kombiniert. In letzter Konsequenz könnten beispielsweise auch Abwässer mit NGS für eine „KrankheitenWetterkarte“ überwacht werden, um durch die Kenntnis von der Verbreitung von Erregern in der Umwelt noch vor dem Auftreten von Ausbrüchen geeignete Präventionsmaßnahmen ergreifen zu können. Die größten Herausforderungen beim Routineeinsatz von NGS dürften zukünftig in der bioinformatischen Analyse und in der Beseitigung von legalistischen (Datenschutz) und sozialen (einheitliche Datenbankformate)

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Roche brachte 2010 mit dem GS Junior das erste Benchtop-NGS-Gerät auf den Markt.

LABORWELT

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Hindernissen liegen. Wir und andere träumen etwa von einer „Bioinformatik für Dummies“, welche automatisch aus den NGS-Rohdaten umgangssprachliche Berichte für behandelnde Ärzte oder Mitarbeiter der Gesundheitsdienste erzeugt.

Dr. Marcel de Leeuw

Bearbeitung. Die Roche/454-Reads liefern mittlere und lange Leseweiten und nutzen normalerweise eine 3 kb mate-pair-Bibliothek. Die Illumina-Reads bieten eine hohe lokale Sequenzqualität und in schlecht abgedeckten Sequenzbereichen, in denen beide Technologien Schwierigkeiten haben, eine ergänzende Sequenzabdeckung. Da es in der Regel nicht rentabel ist, mehrere Next-Gen-Plattformen für den Eigenbedarf zu implementieren, bietet es sich an, die Vorteile der Kombination von mehreren Next-Gen-Plattformen bei einem Dienstleister zu nutzen. Beckman Coulter Genomics setzt diesen hybriden Ansatz seit über einem Jahr routinemäßig ein, der so de facto zum Gold-Standard für die publikationsfertige Sequenzierung geworden ist. Dieser kombinierte Ansatz reduziert die Notwendigkeit des Finishings genomischer Regionen niedriger Qualität mit der Sanger-Methode. Kombiniert mit der automatischen Präparation der Sequenzbibliothek vor der Sequenzierung und der bioinformatischen Auswertung danach, ermöglicht dieses Vorgehen eine sehr kosteneffiziente und schnelle genomische Sequenzierung.

Marcel de Leeuw ist Staff Bioinformatics Scientist bei Beckman Coulter Genomics in Grenoble. Der Dr. der Informatik arbeitet seit 12 Jahren in der Genomforschung. Nach Tätigkeiten als Head of IT bei Genome Express und als Global Business Leader bei Cogenics wechselte er zu Beckmann Coulter Genomics in Grenoble. Kontakt: mdeleeuw@beckman.com

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LABORWELT: Welche Vorteile bietet die Nutzung von NGSDienstleistungen auf mehreren Technologieplattformen gegenüber einem eigenen Gerät? De Leeuw: Sämtliche Next-Generation-Sequencing-Technologien haben ihre Stärken und Schwächen. Keine der aktuellen Plattformen ist imstande, komplette Coverage auch nur für ein moderat komplexes mikrobielles Genom zu liefern – typischerweise werden kurze Stränge mit hohem GC-Anteil nicht abgedeckt. Dazu kommt, dass es für das Programme schwierig ist, Teile des Genoms richtig zu asssemblieren, zum Beispiel die multiplen Kopien der ribosomalen Operons in mikrobiellen Genomen. Bei den Genomen höherer Organismen, wie etwa Säugern oder Pflanzen, brechen Regionen “niedriger Komplexität” die Assemblierung in viele Contigs auf. Die kombinierte Nutzung multipler Plattformen kann die Qualität der Resultate wesentlich verbessern. Ein Beispiel ist die “hybride” Assemblierung unter kombinierter Nutzung der Roche/454- und Illumina-Plattform – also entweder durch den Einsatz beider Auslesearten nacheinander oder durch stufenweise

Dr. Tom Jarvie Thomas Jarvie ist als internationaler Produktmanager bei 454 Life Sciences an der Entwicklung der 454 Hardware, Reagenzien, Kits und Software beteiligt. Im Anschluss an seine Postdoc-Zeit arbeitete der Biophysiker von 1995 bis 2002 für Curagen, bevor er in der High-troughput Sequencing Facility und ab 2005 als Technical Product Manager in der Applikationsentwicklung für das 454-Sequencing tätig war. Kontakt: thomas.jarvie@roche. com, www.my454.com

LABORWELT: Kürzlich berichtete Roche über eine weitere Verlängerung der Leseweiten ihrer Next-Generation-Sequenziersysteme. Welche Vorteile ergeben sich dadurch gegenüber anderen Sequenzern am Markt? LABORWELT

19.10.2011 9:42:00 Uhr

Wissenschaft Expertenpanel

Jarvie: Der Vorteil der langen Leseweite der 454-Systeme GS FLX+ und GS Junior ist ihre Fähigkeit; komplexe biologische Vorgänge aufzuklären. Anders als kurze Reads (von 50 bis 100 Nukleotiden) helfen lange Leseweiten (von 500 bis 750 Basen), weit voneinander entfernte Genvariationen funktionell miteinander zu verknüpfen und Sequenzen zu unterscheiden, die über weite Distanzen identische Sequenzen aufweisen. Das ist bei einer Reihe von Anwendungen wichtig. Beim Transkriptom-Sequencing decken lange Leseweiten mehrere Exons ab und geben eindeutig Auskunft darüber, dass diese zum selben Transkript gehören. Bei der de novo-Sequenzierung von Organismen erhält man so einen besseren Überblick über die Vollängengene beziehungsweise Transkripte. In Organismen, die ein einzelnes Gen in multiplen Isoformen exprimieren, sind lange Reads entscheidend, um die Expression der verschiedenen Isoformen aufzuklären. Denn um die zahlreichen Exonunterbrechungen zu überspannen, muss die Leseweite lang genug sein. In jüngeren Mikrobiomstudien wurden komplexe mikrobielle Gemeinschaften anhand der Sequenzierung ihrer 16S-rRNA in verschiedenen ökologischen Nischen untersucht. Hier ist das 454-Sequencing bereits zum de facto-Standard geworden und ermöglicht die Klassifizierung der Mikroorganismengemeinschaften bis auf Gattungs- oder Artebene. Next-GenerationSequenzer, die kurze Leseweiten liefern, sind bei der Klassifikation deutlich gröber und klassifizieren nur bis zur Stammesebene. Eine korrekte Assemblierung der Sequenz großer komplexer Genome, zum Beispiel von Pflanzen oder Tieren, ist aufgrund der darin enthaltenen zahlreichen Repeats nur mit langen Leseweiten möglich, die die Repeats überspannen. Auch die in komplexen Genomen auftretenden Pseudogene und Familien nahe verwandter Gene können mit den langen und sehr genauen Reads unterschieden werden. Zusammengefasst sind das GS FLX+ und das GS Junior System sehr leistungsfähige Werkzeuge für die de novo-

Sequenzierung und die Assemblierung jeder Genomgröße. Ein letztes Beispiel ist die gezielte Sequenzierung hochvariabler Regionen, wie etwa in Virusgenomen oder den HLA-Genen. In Viren, wie etwa HIV, ist das Genom ist in bestimmten Loci so variabel, dass lange Leseweiten erforderlich sind, um die hochvariablen Teile zu überbrücken und die stabileren Teile zu verbinden. Auch die HLA-Region ist so hochvariabel, dass es erforderlich ist, die multiplen Variationen mittels einer langen Leseweite eindeutig miteinander zu verbinden und so den individuellen HLA-Typ zu bestimmen. Das GS Junior System ist ein ideales Werkzeug, um gezielt interessierende genomische Bereiche über Target-Anreicherungstechnologien oder Multiplex-Amplicons zu sequenzieren.

LABORWELT: Worin liegen für die Nutzer von Desktop-NGS derzeit die Hauptprobleme und Kostenfallen? Timmermann: Um auch kleinere Labore adressieren zu können, brachte Roche im März 2010 den GS Junior auf den Markt. Dieser produziert ca. 100.000 Reads mit einer Leselänge von ca. 400 Basen und zeichnet sich durch seine Schnelligkeit und Stabilität aus. Der Ion PGM Sequencer von Ion Torrent, der die gleiche Zielgruppe hat, kämpft derzeit mit noch sehr unzureichenden Leselängen (momentan ca. 160 Basen) und vor allem mit der noch ungenügenden Genauigkeit des Basecallings. Der Dritte im Bunde wird der MiSeq von Illumina sein. Gegenwärtig werden hier die ersten Geräte in Europa ausgeliefert. Er basiert auf der etablierten Illumina-Technologie und soll mittels paired end-Sequenzierung (2 x 150 Basen) einen Duchsatz von 1 GB erreichen. Während noch vor kurzem die NGS-Datenauswertung als Hauptproblem galt, zeigt sich nun, dass eher die Probenvorbereitung oft unterschätzt wird. Zur Hauptnutzergruppe des GS Junior gehören bereits heute die diagnostischen Labore. Hier dürfte eine der wichtigsten Applikationen die Amplicon-Sequenzierung, z.B. zur Analyse ausgewählter Kandidatengene sein. Aber bereits bei den 100.000 Reads des Gerätes stellt sich die Frage der Äquimolarität der eingesetzten Produkte – alle PCR-Produkte müssen mit der gleichen Anzahl eingesetzt werden, um am Ende auch eine gleichmäßige Verteilung der resultierenden Reads zu gewährleisten. Diese Fragestellung ist sicher lösbar, erfordert jedoch einen gewissen Automatisierungsgrad, also auch zusätzliche Investitionen. So scheint z.B. das Fluidigm Access Array System eine sehr gute Lösung in Kombination mit dem GS Junior. Generell ist allen potentiellen Nutzern von NGS Desktop-Geräten zu empfehlen, sich den gesamten Weg der Datenproduktion von PCR/ Library-Präparation, den jeweiligen monoklonalen Amplifikationsschritt, die Sequenzierung über die Datenauswertung – mit Blick auf die Praktikabilität im individuellen Laborsetting genau anzuschauen.

Single Sub-Brand Dr. Bernd Timmermann Dr. Bernd Timmermann leitet seit Ende 2007 die Next-Generation Sequencing-Gruppe, seit 2010 die Max-Planck Core Sequencing Facility am Berliner MPI für molekulare Genetik (MPIMG). Nach Promotion in Molekularbiologie an der Charité leitete er die DNASequenzierung der Genprofile AG. Seit 2002 ist er leitender Wissenschaftler am MPIMG. Kontakt: timmerma@molgen.mpg.de

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Branche Labormarkt im Umbruch

Tecan: Hausaufgaben für den neuen Chef Dr. Patrick Dieckhoff, BIOCOM AG Milliardenschwere Übernahmen sind gang und gäbe im Labormarkt. Grund genug, in dieser LABORWELT-Serie einen Blick auf die Player, ihre Strategien und Deals zu werfen. Klar ist: Elefantenhochzeiten bleiben an der Tagesordnung. Die Preise bleiben hoch, genauso wie die Wahrscheinlichkeit, dass sich der Labormarkt in zehn Jahren völlig anders darstellen wird als heute. Die Tecan AG hat sich in den vergangenen Jahren neu ausgerichtet und sich auch als Komponenten-Zulieferer etabliert. Nach einem Höhenflug an der Börse bremsen jetzt jedoch Projektverzögerungen die hochfliegenden Erwartungen. Zudem muss ein neuer Chef gesucht werden. Mehr als verdreifacht hatte sich die Aktie des Schweizer Laborausrüsters Tecan AG vom Tief im Jahr 2009. Seitdem schien das Unternehmen mit Sitz in Männedorf bei Zürich sich in einem unaufhaltbaren Höhenflug zu befinden. Der Börsenwert überschritt erstmals seit langem wieder lässig die 500 Mio. Euro-Grenze. Im Sommer verließ den Spezialisten für Laborautomation jedoch der Erfolg, und zwar ohne dass er etwas dafür gekonnt hätte.

OEM-Projekt verschiebt sich Denn Tecan produziert nicht nur eigene Geräte, sondern tritt auch als OEM-Partner auf. Als sogenannter Originial Equipment Manufacturer liefert das Unternehmen Komponenten für Geräte Dritter zu. Die werden jedoch nur gebraucht, wenn der Kunde den entspre-

chenden Erfolg mit seinem Gerät hat. Im Falle des großangekündigten „P14“-Projektes, das nach Analystenschätzung im kommenden Jahr für 12 Mio. Schweizer Franken Umsatz sorgen sollte, wurde Tecan eine verzögerte Produkteinführung zum Verhängnis.

Tecan-Chef vor Abschied Die anvisierten Verkäufe für das kommende Jahr schrieben die Analysten ab. Solche Überraschungen schätzt die Börse gar nicht. Parallel dazu musste Tecan vermelden, dass sich ein Wechsel in der obersten Führung anbahnt. Nach rund sechs Jahren im Amt soll der Vorstandsvorsitzende Thomas Bachmann ersetzt werden. In seiner Amtszeit hatte sich der Kurs des Unternehmens mehr als verdoppelt, genauso wie der Umsatz, der auf 370 Mio.

Tecan in Zahlen: Umsatz: Gewinn (EBIT): Umsatzrendite: F&E-Investiton:

370 Mio. CHF (2010) 56 Mio. US-$ (2010) 15,1% 2,5% des Umsatze

Börsenwert: Mitarbeiter: CEO:

536 Mio. Euro (Stichtag 19.10.) 1.100 Thomas Bachmann (bis 31.10.)

Umsätze: – OEM 44% – Verkauf an Endbenutzer 66%

CHF im vergangenen Jahr stieg. Gründe für das Ausscheiden des 52-jährigen CEOs wurden nicht genannt. Sein Vertrag, der turnusgemäß am 31. Oktober dieses Jahres endet, wird nicht verlängert. Bei Anlegern weckt das unschöne Erinnerungen, denn vor Bachmanns Ernennung im Jahr 2005 gehörte eine regelmäßige Chefdebatte quasi zum Tagesgeschäft in Männedorf. Zudem verzettelte sich die Firma Anfang des Jahrtausends mit zahlreichen Übernahmen. Auch Bachmann hatte sich mit dem Kauf des Probenlagerungsspezialisten REMP verspekuliert. Im vergangenen Jahr wurde das Unternehmen mit zweistelligem Millionenverlust verkauft. Unter Analysten gilt Bachmann jedoch als derjenige, der das Unternehmen auf Kurs und zwei Kernbereiche ausgerichtet hat. Immer wieder wurde Tecan selbst als Akquisitionsziel gehandelt.

Laborzulieferer mit eigenen Produkten Im OEM-Bereich liefert Tecan Komponenten zu, die von Partnern im Bereich Labor, Diagnostik oder Forensik verkauft werden. Die Schweizer treten aber auch als Verkäufer eigener Systeme auf. Bekannt sind vor allem die automatisierten Liquid-Handling-Systeme aus der Freedom-EVO-Serie. Aber auch Mikroplatten-Auslese- und Waschgeräte sowie Microarray-Scanner gehören zum Programm des Life Sciences-Spezialisten.

Geographische Expansion und neue Geräte im Fokus

Zu Tecans bekanntesten Produkten gehören Liquid-Handling-Plattformen. 26 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Will Tecan als eigenständiges Unternehmen am Markt erfolgreich bleiben, hat der Nachfolger von Thomas Bachmann einige Hausaufgaben zu erledigen. Denn derzeit erwirtschaftet Tecan kaum mehr als 10% des Umsatzes in Asien. Die Verkäufe in anderen Regionen wie etwa Südamerika oder dem Nahen Osten werden gar nicht erst einzeln aufgeschlüsselt. Bei deren Eroberung sollen auch neue Produkte wie etwa eine neue Liquid Handling-Plattform helfen, die derzeit als größtes Projekt in der Tecan-Geschichte entwickelt wird. LABORWELT

19.10.2011 14:09:31 Uhr

Blitzlicht Regenerative Medizin

Standardisierung der Stammzell-Gewinnung und -Herstellung Dr. Andreas Emmendörffer, V-Care Biomedical GmbH, Leipzig Die standardisierte Gewinnung und Herstellung von Stammzellen umfasst alle Teilschritte von der Entnahme bis zur Auslieferung der Zellen. Auf der Basis des Produktdesigns und einer Risikoanalyse werden die einzelnen Schritte geplant, umgesetzt und dokumentiert. Auf die gestiegenen regulatorischen Anforderungen haben sich Kliniker, Hersteller und Lieferanten eingestellt. Die Detailtiefe der Qualitätsnachweise für produktberührende Teile oder Medien ist in den letzten Jahren deutlich höher geworden. Die Produkte müssen hinsichtlich Wirksamkeit, Sicherheit, Reinheit, Immunogenität, Tumorigenität und Biodistribution charakterisiert werden. Eine enge Zusammenarbeit zwischen Herstellern, Behörden, Lieferanten und Anwendern und das Verständnis für die ggf. unterschiedlichen Anforderungen schaffen die besten Voraussetzungen für ein sicheres und wirksames Produkt. Mit der zunehmenden Bedeutung der somatischen Zelltherapie und neuen Möglichkeiten der Gewebezüchtung sind die Anforderungen an eine Standardisierung bei der Gewinnung und Herstellung von Stammzellen gestiegen.Wichtige Faktoren sind dabei die Art der Stammzellen (hämatopoetische, mesenchymale), der Grad der Differenzierung und die geplante Anwendung

(allogener oder autologer Einsatz). Bei Zugrundelegen des Herstellungsbegriffs aus regulatorischer Sicht umfasst das „Manufacturing“ alle Schritte von Gewinnung, über Herstellung bis zur Freigabe und Auslieferung der Zellen zum Endverbraucher (Klinik, Zellbank oder Kunde). Auch in den Einrichtungen der Grundlagenforschung ist die Erkenntnis gereift, dass

standardisierte Zellen, die mit einem entsprechenden Zertifikat ausgestattet sind, essentiell und eine Voraussetzung für reproduzierbare und international vergleichbare Studien sind. Die Zeiten, in denen Daten in hochrangigen Zeitschriften mit unkontrollierten Zellen oder Zelllinien publiziert werden, sollten der Vergangenheit angehören. Entsprechende Daten für die Reinheit der Zellen – zumindest der Nachweis der Mycoplasmen-Freiheit – sollten für den Material- und Methodenteil Pflicht werden. Mit dem berechtigten öffentlichen Interesse, dass Erkenntnisse der Grundlagenforschung in die Anwendung gelangen sollten und auf die Weise Fördergelder auch zu marktfähigen Produkten führen, erscheinen Maßnahmen zur Standardisierung der (Stamm-)Zellgewinnung geboten. Während diese Anforderungen in der Hämatologie und Onkologie schon seit den 80er Jahren des letzten Jahrhunderts für die hämatopoetischen Stammzellen entwickelt und verfeinert wurden, ist dies für die anderen Stammzellarten (mesenchymale oder neuronale, adulte organspezifische Stammzellen) erst in den letzten 10 Jahren stärker umgesetzt worden. Dabei ist eine Standardisierung nicht zuletzt im Rahmen qualitätssichernder Maßnahmen bei Arbeiten unter GLP- oder GMP-Bedingungen erforderlich geworden. Mit zunehmenden Erkenntnissen aus der Forschung in der Regenerativen Medizin, der somatischen Zelltherapie

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19.10.2011 9:50:06 Uhr

Blitzlicht Regenerative Medizin

Abb. 1: Morphologie equiner mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark, Fettgewebe und Nabelschnurblut (aus [5]) und der Gewebezüchtung (Tissue engineering) haben sich die Anwendungsgebiete in Humanund Veterinärmedizin stark erweitert. So wird der Einsatz von Stammzellen zur Geweberegeneration in nahezu jeder medizinischen Disziplin diskutiert und geprüft. Der Gesetzgeber hat dieser Entwicklung in seiner höchsten Ausprägung mit den Bestimmungen zur Herstellung von Arzneimitteln für neuartige Therapien Rechnung getragen1-4.

Dokumentation und die Qualitätssicherung zu berücksichtigen. Am Ende des Produktionsprozesses steht ein Zellprodukt, das hinsichtlich seiner Reinheit, Vitalität, Haltbarkeit, Tumorigenität, Immunogenität und Wirksamkeit bestmöglich charakterisiert ist.

Zu berücksichtigende Parameter und Vorgehensweise

Beispielhaft soll hier die Gewinnung equiner mesenchymaler Stammzellen dargestellt werden. Als Zellquelle kommen das Knochenmark, das Fettgewebe und das Nabelschnurblut in Frage. Jedes dieser Ausgangsmaterialien stellt seine eigenen Anforderungen an die Gewinnung, die verwendeten Materialien und Geräte für die Gewinnung sowie die Aufrechterhaltung aseptischer Bedingungen. Während das Knochenmark mittels Punktion aus dem Brustbein oder dem Beckenkamm gewonnen wird, lassen sich die Stammzellen aus dem Fettgewebe über Absaugung oder Entnahme größerer Gewebestücke (z.B. kastaniengroß) und anschließender Abtrennung der Fettzellen isolieren. Die Gewinnung von Nabelschnurblut hat hingegen die spezifischen Bedingungen der Geburt zu berücksichtigen. Nach Anreicherung der Zellen über Dichtegradientenzentrifugation und Plastikadhärenz

Am Anfang der Produktentwicklung sollte ein „Workshop“ stehen, in dem der gesamte Prozess hinsichtlich seiner Risiken und Einzelschritte analysiert wird. Gleichzeitig müssen Anforderungen an das Endprodukt definiert und festgehalten werden. In diesem ersten Schritt haben sich Methoden wie die des Mindmappings bewährt; sie sind offen, parallel verschiedene Aspekte des Prozesses zu berücksichtigen. Hieraus leitet sich dann ein erster Prozessflow ab, in dem einzelne Prozessschritte mit den jeweiligen Anforderungen an Ausgangsprodukte, Geräte und Personal abgebildet werden. Fragen, die ferner zu klären sind, behandeln den Ort der Gewinnung (z.B. OP, Pathologie, in der Veterinärmedizin auch der Stall), die Temperaturbedingungen, die Art und Zusammensetzung des Transportmediums und die erforderlichen Transportbedingungen. Wichtig ist auch die Klärung der Frage der längstmöglichen Transportdauer, ohne dass es zu Einschränkungen in der Qualität der Zellen kommt. Empfehlenswert ist es, schon auf dieser Stufe eine Risikoanalyse durchzuführen, deren Ergebnis unter anderem notwendige InProzess-Kontrollen und die Freigabe relevanter Parameter sind. Abhängig vom späteren Einsatz der Stammzellen sind in einem weiteren Schritt die erforderlichen Verarbeitungsbedingungen zu organisieren. Ist eine therapeutische Anwendung lebender Zellen geplant, sind aseptische Produktionsbedingungen (Reinraum oder Isolator) zu wählen. Damit verbunden sind Aufwendungen und Maßnahmen für die Aufrechterhaltung der Produktionsbedingungen (Zonenkonzept, Hygienekonzept, regelmäßige Wartung, Schulung etc.). Neben der eigentlichen Arbeit im Labor beziehungsweise Reinraum sind Personal und Zeit für die 28 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Anwendungsbeispiel: Gewinnung von equinen mesenchymalen Stammzellen

sind die weiteren Kultivierungsschritte der Stammzellen identisch. Auch morphologisch und rein lichtmikroskopisch sind zwischen den Zellen keine großen Unterschiede zu erkennen (Abb. 1). In der Literatur lassen sich keine Hinweise auf eine unterschiedliche therapeutische Effizienz der mesenchymalen Stammzellen für die Behandlung von Sehnen- oder Bandverletzungen beim Pferd oder Hund finden. Klassische klinische Studien liegen noch nicht vor, so dass nur auf Synopsen verschiedener Anwendungsbeobachtungen zurückgegriffen werden kann. Die Herstellung equiner mesenchymaler Stammzellen ist mittlerweile standardisiert und an GMP-Bedingungen angeglichen. Für Tab. 1: Marker für die Charakterisierung equiner mesenchymaler Stamm zellen in der Durchflusszytometrie (nach [8]) Antigen

Expression

CD14

Positiv (++)

CD34

Positiv (++)

CD45

Schwach positiv (+)

CD73

Negativ (–)

CD90

Negativ (–)

CD105

Positiv (+++)

CD160

Negativ (–)

Tab. 2: InProzessKontrollen In-ProzessKontrolle

Pharm Eur-Kapitel

Vitalität

Pharm. Eur. monograph 2.7.29

Sterilität

Pharm. Eur. monograph 2.6.1

Endotoxin

Pharm. Eur. monograph 2.6.14

Mycoplasmen

Pharm. Eur. monograph 2.6.7

Summer +22°C to 10°C ramped over 12 h +10°C to 22°C ramped over 12 h Repeat to 48 h Results Product temerature +2°C to 8°C over 48 h Maximum temperature 8°C @ 48 h

Winter +14°C to 5°C ramped over 12 h +5°C to 14°C ramped over 12 h Repeat to 48 h Results Product temerature +2°C to 8°C over 48 h Maximum temperature 7.5°C @ 48 h

Abb. 2: Aufbau eines für verschiedene Umgebungsbereiche qualifizierten Transport behälters9 LABORWELT

19.10.2011 9:50:34 Uhr

Blitzlicht Regenerative Medizin Laborwelt Hintergrund

Internationales Treffen der Stammzellforschung und Regenerativen Medizin Auf der World Conference on Regenerative Medicine 2011, 2. – 4. November in Leipzig, werden etwa 1.000 internationale Teilnehmer aus Forschung, Klinik und Wirtschaft über Fachgrenzen hinaus die neuesten Erkenntnisse und Anwendungen der Regenerativen Medizin diskutieren. Insbesondere Vorträge zu den Herstellungsmethoden von pluripotenten Stammzellen und deren Potential für therapeutische Anwendungen werden mit Spannung erwartet (Andras Nagy, Kun Zhang). Auch veterinärmedizinische For-

schungsarbeiten bieten Gesprächsstoff (Roger Smith). Deren Ergebnisse liefern wertvolle präklinische Daten, die der Humanmedizin als Basis für weitere Entwicklungen dienen können. Ein vielseitiges Rahmenprogramm mit Industrieausstellung, Networking-Events und einer Veranstaltung in Europas größter Tropenhalle „Gondwanaland“ gewährleistet einen interdisziplinären Austausch.

eventuell erforderliche In-Prozess-Kontrollen sind durchflusszytometrische Analysen geeignet, und entsprechende Protokolle stehen für humanund veterinärmedizinische Bereiche zur Verfügung. Weitere mögliche In-Prozesskontrollen sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Dabei sind die Anforderungen des Europäischen Arzneibuchs zu erfüllen. Ein wichtiger Schritt im Rahmen der Standardisierung der Herstellung der Stammzellen ist die Qualität der verwendeten Medien und Reagenzien. Auch wenn einige Zusätze und Faktoren nicht unter GMP oder arzneimittelrechtlichen Gesichtspunkten hergestellt werden, hat sich das Angebot an GMP-konformen und für die Zelltherapie verwendbaren Medien vergrößert. Eine vertrauensvolle Kommunikation mit den Herstellern ist dabei von entscheidender Bedeutung und kann viel Zeit in Anspruch nehmen. Insbesondere sind Informationen zur Abschätzung möglicher

Risiken durch TSE oder auch der virologischen Sicherheit erforderlich, zum Beispiel über die Abwesenheit beziehungsweise Inaktivierung von porcinen oder bovinen Viren. Dies betrifft auch die Herstellung von Einzelkomponenten der Medien (z.B. Aminosäuren) im Rahmen von Fermentationsprozessen. Der Transport des Endproduktes erfolgt in dazu qualifizierten Transportbehältern (Abb. 2) entweder in geschlossenen Beuteln oder in den vorbereiteten Röhrchen oder Spritzen zusammen mit den Analysezertifikaten und schriftlichen Hinweisen zur bestimmungsgemäßen Verwendung (Gebrauchsanweisung).

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Referenzen [1] [2] [3] [4]

Verordnung (EU) 1394/2007 Direktive 2006/17/EC Direktive 2006/86/EC EU-GMP Leitfaden

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

Brehm, W. (2006). Stammzellen, Stammzelltherapie - Begriffserklärung, Zusammenhänge und mögliche klinische Anwendungen. Pferdeheilkunde 22, 259-267. Smith, R., Young, N., Dudhia,J., Kasashima, Y., Clegg, P.D., and Goodship, A. (2009). Effectiveness of bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells for naturally occurring tendinopathy in the horse. World Conference on Regenerative Medicine. Regen.Med.Suppl.Nov.2009,Vol.4, No.6 (Suppl.2), Ref Type: Conference Proceeding Ribitsch I., Burk J., Delling U., Geißler C., Gittel C., Jülke H., Brehm W. (2010) Basic science and clinical application of stem cells in veterinary medicine, Adv Biochem Eng Biotechnol. 2010;123:219-263. Braun, J; Hack, A; Weis-Klemm, M; Conrad, S;Treml, S; Kohler, K; Walliser, U; Skutella, Th; Aicher, W. (2010) Evaluation of the osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of equine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. AJVR, 71:1-9. www.sca-cool-logistics.com

Korrespondenzadresse Dr. Andreas Emmendörffer V-Care Biomedical GmbH Deutscher Platz 5b 04103 Leipzig

12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 29

19.10.2011 9:50:42 Uhr

Wissenschaft Technologietransfer

Zelltechnik-Innovationen für die Industrie Dr. Anja Rasch, Gesellschaft für Industrielle Zelltechnik e.V., Norgenta Lübeck an der Fraunhofer-Einrichtung für Marine Biotechnologie (EMB), Lübeck Ob Stammzelltechnologie, Zelltracking, Herstellung von Biomaterialien, Aquakultur, Inkubatoren oder zellbasierte Systeme zur Arzneimitteltestung – die neugegründete Deutsche Gesellschaft Industrielle Zelltechnik e. V. (www.industrielle-zelltechnik.de) will das Know-how von Forschern und Unternehmen bündeln, um innovative Plattformtechnologien der Zelltechnik in die Anwendung zu überführen. Im Vordergrund stehen dabei die Translation komplexer 3D-Zellkultursysteme, Analysetechnologien, die Herstellung von Instrumenten und Materialien (z.B. Biomimetika/intelligente Scaffolds) für biomedizinische, medizintechnische und lebensmitteltechnologische Anwendungen. Die interdisziplinäre Vernetzung und Zusammenarbeit der Akteure, gemeinsame Veranstaltungen, die Förderung des Fachkräfte-Nachwuchses und eine internationale verbesserte Wettbewebsfähigkeit bei biomedizinischen Innovationen sind erklärte Ziele der auf dem 2. Kongress „Industrielle Zelltechnik“ Anfang September in Lübeck ins Leben gerufenen Interessenvertretung. Unter den zehn Gründungsmitgliedern (vgl. Foto) der administrativ von der Norddeutschen Life Science Agentur Norgenta geführten Gesellschaft befindet sich auch der Biotechnologie-Unternehmensverband BIO Deutschland. Dieser wird die fachpolitischen Interessen der beteiligten Forscher und Firmen übernehmen. In diesem Beitrag werden exemplarisch einige der an der Fraunhofer-EMB entwickelten und auf dem Kongress präsentierten Innovationen vorgestellt. Besonders das Feld der Stammzellkultur und -differenzierung könnte vom Verfahren der optischen Zeitraffermikroskopie profitieren, das durch eine am Fraunhofer-EMB entwickelte Software nun erstmals die automatisierte mikroskopische Überwachung in vitro kultivierter Einzelzellen gestattet. In Abständen von 1-15 Minuten werden dabei die Zellen während des Wachstums in der Kulturschale mit einem

automatisierten Mikroskop aufgenommen, das durch aktive Fokusnachführung so stabil ist, dass es zuverlässige Zellbeobachtungen über viele Tage erlaubt. Bisherige Analysen der Bilderfolgen erforderten stets die manuelle Überwachung der Zellen mit Auge und Hand, was einen enormen Aufwand bedeutet und keine durchgängige Zuverlässigkeit garantiert. An der Fraunhofer-EMB konnten Wissenschaft-

Abb. 2: Innovativer Zelltransporter: Einen zellschonenden Transport ermöglicht eine autarke, am Fraunhofer-EMB entwickelte Minitransportbox. Der zum Patent angemeldete Container hält Standardbedingungen für Zellkulturen (37°C, 5% CO2) über 48 h konstant und protokolliert die geregelten Größen. ler das Zelltracking mittels einer Software nun vollständig automatisieren: Eine systematische Fehlersuche überprüft dabei die Trackingresultate und nur vertrauenswürdige Ergebnisse werden an den Experimentator weitergereicht. Aus diesen lassen sich statistisch signifikante Parameter und Merkmalsbündel (sog. Deskriptoren) berechnen, die die eindeutige Identifikation und Qualitätskontrolle von Zellpopulationen eröffnen. Das Verfahren ermöglicht Aussagen zu Lebenszeitverteilungen, Teilungssymmetrie, Migrations- und Wachstumsverhalten, den inneren Zellbewegungen und Zellformen sowie das automatische Auffinden von proliferativen „hot spots“. Unlängst berichteten Becker et al.1 über die Nutzung der Zelltracking-Software zur automatischen Detektion teilungsaktiver, kultivierter, adulter Stammzellen durch das „Tracking“ morphologischer Veränderungen..

Kokultivierungstechnologie

Abb. 1: Die Gründungsmitglieder der Deutschen Gesellschaft für Industrielle Zelltechnik und Wolfgang-Dieter Glanz (3. v. rechts) vom Ministerium für Wissenschaft, Wirtschaft und Verkehr des Landes Schleswig-Holstein (v. l. n. r.): Prof. Dr. Ralf Pörtner (TU Hamburg-Harburg), Dr. Oskar-W. Reif (Sartorius Stedim Biotech GmbH), Dr. Cordula Kroll (Eppendorf AG), Rüdiger Schacht (IHK Lübeck), Dr. Mira Grättinger (European ScreeningPort GmbH), Dr. Oliver Wehmeier (CCS Cell Culture Service GmbH), Dr. Viola Bronsema (BIO Deutschland e.V.), Dr. Kathrin Adlkofer (Norgenta Norddeutsche Life Science Agentur GmbH) Prof. Charli Kruse (Fraunhofer-EMB) 30 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Aus Stammzellen differenzierte Zelltypen versprechen langfristig einen Einsatz in der regenerativen Medizin, kurzfristiger aber als Zellmodelle, zum Beispiel in der Arzneimittelforschung. Allerdings sind heute geläufige Kultivierungsverfahren auf Basis der sequentiellen Zugabe von Wachstumsfaktoren und Zytokinen zum Kulturmedium mit hohem Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Ein von der EMB-Arbeitsgruppe „Zelldifferenzierung“ entwickeltes Verfahren (Petschnik et al.)2 setzt stattdessen auf die Kokultur humaner Stammzellen mit lebenden Biopsien aus Säugergewebe. Die von diesen Geweben ausgeschütteten Faktoren induzieren dabei die Differenzierung in das entsprechende Zielgewebe. Mit einem indirekten Kokultursystem, gelang bereits eine neurale Differenzierung. Zwei Tage nach indirekter Kokultur von humanen Stammzellpopulationen aus Haut oder Pankreas mit Gewebebiopsien aus Rattenhirn betrug die LABORWELT

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Wissenschaft Technologietransfer

Ausbeute an Zellen mit Nervenzellmorphologie und -markern 12%.

Zellcoating schützt Neuroprothesen Eine große Herausforderung bei der Implantation sogenannter Hirnschrittmacher zur Therapie psychomotorischer Bewegungsstörungen wie Parkinson und psychischen Erkrankungen wie schweren Depressionen ist die dauerhafte Integration impulsgebender Elektroden im Gehirn. Infolge kleinster Verletzung bei Einführen starrer Elektroden kommt es zu einer Aktivierung der immunologisch aktiven Mikrogliazellen und Astrozyten, die das Einwachsen des Implantats in das Hirngewebe stören. Aktuelle Arbeiten deuten auf den Nutzen flexibler, mit körpereigenen Stammzellen und Hydrogel beschichteten Elektroden zur Tiefenhirnstimulation hin. Ziel dabei ist es, die Immunreaktion durch die in-vivo-Differenzierung der Stammzellen in körpereigene Nervenzellen zu minimieren und damit die Biokompatibilität und Gewebeintegration der Elektrode zu verbessern. Richter et al.3 setzten dazu flexible Elektroden ein, deren Elektrodenmaterial außer an den Stimulationspunkten, von einer Polyimidhülle umgeben ist. Auf dem Kunststoffmantel immobilisierten sie glanduläre Stammzellen aus Acinuszellen des Pankreas. Erste Tests zeigen, dass die Stammzellen ihre Differenzierungsfähigkeit auch nach Immobilisierung behielten. Zudem konnte demonstriert werden, dass das Aufbringen eines Hydrogels auf die Zellen, der Zellabrasion bei Einführen der Elektroden wirksam entgegenwirkt. In derzeit laufenden Untersuchungen konnte belegt werden, dass die Schutzschicht weder die Zellmigration noch die Zellteilung beeinträchtigt. Tierversuche sollen bisher weltweit fehlende Daten zur Langzeitintegration der Elektroden liefern.

Abb. 4: Aus Forellenlarven differenzierte Herzmuskelzellen ähneln humanen Kardiomyozyten viel mehr als Mausherzzellen6,7. Nutzen wollen Forscher dies bei der Bestimmung der Herztoxizität von Wirkstoffen in zellbasierten Testsystemen, zum Beispiel auf Basis von Multielektroden-Arrays (siehe Bild). und Strukturen vollentwickelter Herzzellen, die wie im Herzorgan über Zell-Zellverbindungen miteinander verbunden und elektrisch gekoppelt sind. Weiterhin konnte die spontane Kontraktion durch ein Schrittmacherzentrum geklärt werden. In weiteren Untersuchungen wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften der aus Fischzellen differenzierten Herzzellen untersucht. Das in vitro-Modell weist wie alle Herzzellen in Fisch eine schnelle Depolarisation, eine ausgeprägte Plateauphase und eine schnelle Repolarisation auf, die dem Aktionspotential von humanen Herzzellen ähnelt. Des Weiteren konnten Grunow et al.5 die Sensitivitäten von zwei Ionenkanälen des Herzens gegenüber Arzneimittelkandidaten

belegen, die auch in humanen Kardiomyozyten vorhanden sind. Diese Aggregate können relativ einfach in großen Mengen hergestellt werden, da dazu keine Wachstumsfaktoren erforderlich sind. Aufgrund ihres dem Menschen ähnlichen Aktionspotentials könnten sie als humanrelevantes Herzmodell eingesetzt werden.

Literatur [1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

Marine Biotechnologie Der Fisch gilt aufgrund seines hohen Regenerationspotentials als geeignetes Modell, zum Beispiel in der Herzforschung. Wissenschaftler der Fraunhofer-EMB haben ein Testsystem aus Fischzellen entwickelt, bei dem über lange Zeit autonom kontrahierende 3D-Herzzellaggregate in vitro generiert werden4. Analysen mittels Immunhistochemie, PCR und Elektronenmikroskopie belegen die Existenz von Molekülen

Becker et al. Adaptive Mitosis Detection in Large in vitro Stem Cell Populations using Timelapse Microscopy. Proc. Bildverabeitung für die Medizin (BVM), Luebeck, Germany, Informatik aktuell, pp. 49-53, 2011 Petschnik et al. A novel xenogeneic co-culture system to examine neuronal differentiation capability of various adult human stem cells. PLoS One. 2011; 6(9): e24944 Richter et al. Frontiers in Neuroprosthetics, (2011). Cellular modulation of polymeric device surfaces: promise of adult stem cells for neuroprosthetics. Front. Neurosci. 5:114. doi: 10.3389/ fnins.2011.00114 Grunow et al. In vitro developed spontaneously contracting cardiomyocytes from rainbow trout as a model system for human heart research. Cellular Physiology and Biochemistry (2011) 27, 01-12 Grunow et al. In vitro expansion of autonomously contracting, cardiomyogenic structures from rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Journal of fish biology (2010) 76, 427-434 Berghmans et al. Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual and gut funtion-potential safety screen for early drug discovery. J Phamacol Toxicol Methods 2008; 58: 59-68 Brette et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochem Biophys Res Commun 2008; 374:143-146

Korrespondenzadresse Abb. 3: Stammzellen aus dem Pankreas besiedeln die flexiblen Sonden. Phalloidin färbt den Zellkörper rot und DAPI die Zellkerne blau. Das Sondenmaterial erscheint durch die Eigenfluoreszenz pink.

Dr. Anja Rasch. Deutsche Gesellschaft Industrielle Zelltechnik info@industrielle-zelltechnik.de www.industrielle-zelltechnik.de info@emb.fraunhofer.de www.emb.fraunhofer.de

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12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 31

18.10.2011 18:11:26 Uhr

Blitzlicht Durchflusszytometrie

Durchflusszytometrie: Kompaktklasse für Zellanalysen Jason Whalley, Merck Millipore Genomstudien haben dazu beigetragen, zahlreiche Krankheitsanfälligkeitsgene und Genexpressionsprofile – sogenannte genetische Signaturen – zu entdecken. Die im Rahmen dieser Untersuchungen gesammelten Informationen helfen nicht nur bei der Vorhersage des statistischen Erkrankungsrisikos des einzelnen Patienten, sondern sie dienen auch als Richtlinie für therapeutische Entscheidungen. Obwohl die Genomforschung unser Verständnis der molekularen Basis von Krankheiten ständig erweitert, sind diese Studien allein nicht ausreichend, die ganze Komplexität von Krankheitsprozessen zu erfassen. Die Post-Genom-Ära ist auch von der Notwendigkeit geprägt, das Proteom zu analysieren. Dies ist die nächste große Herausforderung auf dem Weg zum Verständnis der an Gesundheit und Krankheit beteiligten biologischen Prozesse. Denn Proteine sind die entscheidenden molekularen Akteure, die sowohl die physiologischen als auch pathophysiologischen Vorgänge steuern. Biologie ist extrem komplex und die Translation der Gene in Proteine kein einfacher Prozess. Genexpressionsprofile repräsentieren nicht exakt das, was sich auf der Ebene der Proteine ereignet, weil zwischen dem Niveau der Genexpression und der daraus resultierenden Proteinexpression keine direkte Korrelation besteht. Ein Gen kann also viele Proteine kodieren. Tatsächlich umfasst das menschliche Genom nur 21. 000 proteinkodierende Gene, obwohl es schätzungsweise zwischen 250.000 und einer Million Proteine enthält. Proteine sind dynamische Strukturen, die kontinuierlich mit anderen Proteinen in Interaktion treten oder post-translationalen Modifikationen (PTM) wie Phosphorylierung, Glykosylierung, Lipidierung und Spaltung unterliegen. Post-translationale

Proteinmodifikationen und Protein-ProteinInteraktionen spielen bekanntlich eine wichtige Rolle bei Krankheitsprozessen und könnten als krankheitsspezifische Biomarker sowie als therapeutische Zielmoleküle dienen. Proteine liegen im Körper zudem in einem weiten Konzentrationsbereich vor. Zusammen schaffen alternatives Gen-Spleißen, post-transkriptionale Genregulation und post-translationale Modifikationen ein komplexes, dynamisches Muster der Proteinexpression. Die in den 1970er Jahren entwickelten Untersuchungsverfahren Western Blot und ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) zählen nach wie vor zu den am häufigsten verwendeten Testverfahren, da sie sich als verlässlich und kosteneffektiv erwiesen haben und einfach in

der Anwendung sind. Diese Methoden konzentrieren sich jedoch auf einzelne Proteine, was einen limitierenden Faktor für Forscher darstellt, die versuchen, die komplexen Netzwerke der Interaktionen und Signalkaskaden zu enträtseln, um die molekularen Grundlagen von Krankheiten zu verstehen. Die Erforschung bestimmter, einzelner Proteine muss daher durch Techniken ergänzt werden, die die Untersuchung des interessierenden Proteins innerhalb seines biologischen Kontextes ermöglichen.

Technik der Wahl zur Erforschung der Proteine Die Durchflusszytometrie ist eine Technik, bei der die in einem Flüssigkeitsstrom suspendierten Zellen optisch analysiert werden. Diese Technik bietet die Möglichkeit, Daten von einzelnen Zellen, die sich in einer gemischten Probe befinden, zu sammeln und in jeder Sekunde gleichzeitig zahlreiche Parameter tausender Zellen zu messen. Die simultane Messung zahlreicher Proteine pro Zelle liefert im Vergleich zu anderen Methoden der Proteindetektion bessere prädiktive und quantitative Daten. Aus diesem Grund ist die Durchflusszytometrie für das gesamte Spektrum der Zellforschung rasch zur Technik der Wahl geworden und wird in der Klinik bereits routinemäßig zur Unterstützung der Diagnose bei Blutkrebs eingesetzt. Trotz der Vorteile der Durchflusszytometrie für multiparametrische Untersuchungen blieb der Einsatz der Technologie aufgrund der damit verbundenen Kosten, der komplexen Testentwicklung, des Platzbedarfs und des Wartungsaufwandes bisher auf große Laboratorien und mit Experten besetzte Zentren beschränkt. Forscher, die sich der Durchflusszytometrie bedienen wollen, müssen in der Regel bestimmte Zeiten in Core Facilities für ihre Experimente reservieren, die Proben entsprechend für den Transport vorbereiten und sich für deren Ablieferung von einem Ende des Forschungsgeländes zum anderen bewegen oder sogar die ganze Stadt durchqueren. Außerdem sehen sich die Forscher aufgrund der wachsenden Popularität des Verfahrens zunehmend mit anderen Gruppen konfrontiert, mit denen sie in den großen Durchflusszytometrie-Laboratorien um den Zugang zu den entsprechenden Instrumenten konkurrieren.

Entwicklung zum kompakten Tischgerät

Abb. 1: Das guava-Durchflusszytometrie-System passt auf jeden Labortisch. 32 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Mit der Entwicklung des Durchflusszytometers als Tischgerät sind diese Hindernisse nunmehr überwunden. Das Tisch-Durchflusszytometer ermöglicht auch den kleinsten Labors mit begrenztem Budget die Durchführung von komplexen Zellanalysen, wann immer diese benötigt werden. In Kombination mit einer benutzerfreundlichen Software und optimierten, kompletten Testkits können Experten und LABORWELT

19.10.2011 9:51:55 Uhr

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18.10.2011 17:21:52 Uhr

Blitzlicht Durchflusszytometrie

Anfänger der Zellbiologie gleichermaßen die Durchflusszytometrie im eigenen Labor durchführen. Durchflusszytometrie-Tischgeräte haben viele Vorteile, unter anderem eine schnelle Assayentwicklung, geringe Kosten, eine hohe Flexibilität, die Möglichkeit zur gleichzeitigen Analyse mehrerer Datensätze und eine einfache Detektion dank benutzerfreundlicher Software. Zudem ermöglichen die Tischgeräte die direkte Integration der Durchflusszytometrie in das Forschungsszenario und die Arbeitsabläufe der Proteinexpressionsanalyse. Die neuen Mikrokapillar-Durchflusszytometer eignen sich besonders gut zur Verwendung als Tischgerät. Sie arbeiten mit kleineren Probenvolumina, erzeugen weniger Abfall, verursachen niedrigere Betriebskosten und sind einfacher einzurichten und zu bedienen als handelsübliche Durchflusszytometriegeräte. Die Tisch-Durchflusszytometer ermöglichen die Durchführung breit gefächerter, komplexer Experimente, von der Zwei-Farben-Detektion in einer einzigen Zellprobe bis zur Sechs-FarbenDetektion bei multipler Probennahme aus Röhrchen oder 96-Well-Platten. So kann das neueste guava-Gerät von Merck Millipore, das guava easyCyteTM 8HT Tisch-Durchflusszytometer (Abb. 1), bis zu acht Zellparameter gleichzeitig analysieren. Durchflusszytometrie-Tischgeräte werden immer mehr zum unverzichtbaren Forschungsinstrument für Wissenschaftler, die sich auf der Suche nach neuen therapeutischen Ansatzpunkten für Medikamente mit der Analyse von Signalwegen befassen. Signalwege steuern die zentralen zellulären Prozesse, einschließlich Apoptose, Zelldifferenzierung, Zellwachstum und Zellproliferation, die alle an der Entwicklung von Krebs und anderen Krankheiten beteiligt sind. Im Gegensatz zu den Methoden, die sich auf ein einziges Protein konzentrieren, können bei der Durchflusszytometrie gleichzeitig mehrere Schlüsselproteine und deren Aktivierungszustände bzw. Interaktionen analysiert werden. Dadurch kann eine Korrelation zwischen Aktivierung eines Weges und Veränderungen in der Zellfunktion hergestellt werden. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie lassen sich diese Parameter auch innerhalb einer heterogenen Zellpopulation analysieren. Zur Charakterisierung gemischter Zellpopulationen ist eine Messung des Gesamtproteinspiegels quer durch die gesamte Zellpopulation ungeeignet, da sich die relative Expression und/oder Signalereignisse in den einzelnen zellulären Subpopulationen unterscheidet. Die Fähigkeit, eine quantitative Unterscheidung zwischen den Proteinexpressionsprofilen verschiedener Subpopulationen von Zellen treffen zu können und die zugrundeliegenden komplexen zellulären Signalwege identifizieren zu können, ist eine absolute Voraussetzung für das Verständnis der fundamentalen Grundlagen von Krankheiten sowie die Verbesserung der Chancen auf eine erfolgreiche Entwicklung von neuen Medikamenten. 34 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Benutzerfreundliche, flexible und integrierte Plattform Der Einzug der Durchflusszytometrie in individuelle Labors fördert einen spontaneren und flexibleren Zugang zur Zell- und Proteinanalyse. So können zum Beispiel die DurchflusszytometrieExperimente je nach den von Kollegen im selben Labor erhaltenen Ergebnissen rasch modifiziert werden. Umgekehrt können die mit dem TischDurchflusszytometer erhaltenen Daten sofort von den Kollegen in ihre experimentellen Entwürfe integriert werden, wodurch eine starke Synergie entsteht, die den Forschungsprozess vorantreibt. Ein eigenes, spezielles Tisch-Durchflusszytometer kann auch, auf dieser Technik beruhende,

Abb. 2: Die Heatmap-basierten Analysepakete ermöglichen die gleichzeitige Analyse von bis zu acht Parametern für 96 Proben in einem einzigen Durchgang. sich wiederholende Analysen beschleunigen. Wissenschaftler müssen oft zahlreiche durchflusszytometrische Analysendurchgänge durchführen, egal ob dies für die Wahl einer stabilen fluoreszierenden Reporter-Zelllinie oder eines Hybridoms, das die höchste Konzentration eines besonders fest bindenden Antikörpers produziert, erforderlich ist, oder ob es um großangelegte, gepoolte siRNA-Screens geht. Es ist daher schwierig, Experimente weit im Voraus zu planen, da es häufig erforderlich ist, Zeiten in einer zentralen Durchflusszytometrie-Einrichtung zu reservieren, insbesondere wenn das Testprotokoll jeder Runde aber von den Ergebnissen des vorherigen Durchgangs abhängt. Im Gegensatz dazu können dank der Tisch-Durchflusszytometer die Experimente beginnen, sobald sie geplant und entworfen sind. Integrierte Plattformen mit Geräten, kompletten Testkits und optimierter Software versetzen jeden Wissenschaftler in die Lage, sich für die Zellanalyse der Durchflusszytometrie zu bedienen, auch dann, wenn er mit dieser Technik noch keine Erfahrung hat. Ein breites Angebot an spezifischen Reagenzienkits – validiert für die Verwendung mit Tisch-Durchflusszytometern für verschiedene Tests wie Apoptose, Zellzahlen, Lebensfähigkeit von Zellen, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und

Zytotoxizität, Chemokinrezeptorkonzentration, Signaltransduktion und Stammzellenphänotypen – steht zur Verfügung. Da alle Reagenzien (außer Zellen) in den Kits enthalten sind, entfällt der Zeitaufwand für die Entwicklung eigener Assays. Zudem ermöglichen Assayspezifische Software-Module den Forschern, wichtige Daten rasch zu erhalten, indem nur die relevanten Plots und Statistiken angezeigt werden und nur eine minimale Intervention von Seiten des Benutzers erforderlich ist. Aufgrund der großen Datenmengen, die bei Durchflusszytometrie-Experimenten erhalten werden, und infolge des höheren Probendurchsatzes kann es auch bei der Datenanalyse zu Engpässen kommen. Um dies zu vermeiden, stehen Heatmap-basierte Analysepakete zur Verfügung, die eine gleichzeitige Analyse von bis zu acht Parametern für 96 Proben in einem einzigen Durchgang ermöglichen. Diese Analyseoption ist für die guava-Durchflusszytometrie-Plattform erhältlich (Abb. 2). Unter den neuen Anwendern der Durchflusszytometrie sind unter anderem auch Wissenschaftler, die sich auf die Erforschung von Algenstämmen zur potentiellen Verwendung für die Biokraftstoffproduktion konzentrieren, wofür Tisch-Durchflusszytometer einfacher und praktischer sind. Dank der Verwendung von lipidbindenden Fluoreszenzfarbstoffen anstelle von biochemischen Bestimmungsmethoden ist es für diese Biokraftstoff-Forschungslabors viel einfacher, Algenstämme mit hohem Lipidgehalt und großer Zelldichte auszuwählen.

Schlussfolgerung In dem Maße, in dem sich Wissenschaftler der Leistungsfähigkeit von Tisch-Durchflusszytometern bewusst werden, wird auch die Nachfrage nach spezifischen Assays für bestimmte Zelltypen und biologische Wege steigen. Um dieser Nachfrage gerecht zu werden, sind weitere Reagenzien-Kits sowie die entsprechende begleitende Software für die Durchflusszytometrie-Tischgeräte bereits in Entwicklung. Damit werden den Forschern in den verschiedenen Bereichen der Life Science für die unterschiedlichsten Anwendungen einschließlich der Arzneitmittelentwicklung Komplettlösungen angeboten. Jeder Wissenschaftler, der sich für seine spezielle Forschungstätigkeit der Durchflusszytometrie bedienen möchte, kann dies nun tun, und zwar auch ohne Erfahrung mit dieser Technik zu haben und ohne Anleitung durch einen Experten.

Korrespondenzadresse Jason Whalley Senior Product Manager Merck Millipore Jason.Whalley@merckgroup.com LABORWELT

19.10.2011 9:52:02 Uhr

Wissenschaft Neurowissenschaften

Bidirektionale Kontrolle der Angst durch den CRH-Rezeptor Typ 1 Dr. rer. nat. Jan M. Deussing, Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Dr. h.c. Florian Holsboer; Max-Planck-Institut für Psychiatrie, München Das Corticotropin-releasing Hormone (CRH) und sein Typ 1-Rezeptor (CRHR1) spielen eine Schlüsselrolle bei der Koordination der Stressantwort. Fehlregulationen dieses Systems sind ursächlich für die Entstehung von Stress-abhängigen Erkrankungen wie etwa Depressionen und Angststörungen verantwortlich. Mit Hilfe histochemischer Methoden und genetischer Mausmodelle konnten wir erstmalig die Identität von CRHR1-exprimierenden Neuronen im Gehirn der Maus im Detail aufklären. Der CRHR1 ist insbesondere auf Neuronen des Vorderhirns lokalisiert, die Glutamat als Neurotransmitter verwenden (glutamaterge) sowie auf Dopamin-produzierenden (dopaminergen) Neuronen des Mittelhirns. Konditionale Knockout-Mäuse zeigen, dass der CRHR1 Angstverhalten bidirektional in Abhängigkeit von seiner Lokalisation in glutamatergen (Angst erzeugend) und dopaminergen Neuronen (Angst lösend) kontrolliert. Gleichzeitig moduliert der CRHR1 direkt die Glutamat-abhängige Neurotransmission sowie die Ausschüttung von Dopamin. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass möglicherweise ein Ungleichgewicht zwischen CRHR1-kontrollierten glutamatergen und dopaminergen Systemen eine wichtige Rolle bei der Entstehung psychischer Erkrankungen spielt und eröffnet zugleich Perspektiven für spezifischere Therapieansätze.

Fehlregulation als eine mögliche Ursache für die Entstehung und Pathophysiologie Stressabhängiger Erkrankungen nahelegen, wie zum Beispiel Depressionen und Angststörungen. So wurden zum Beispiel in Post-mortem-Studien in depressiven Patienten eine erhöhte Anzahl von CRH-produzierenden Neuronen im Hypothalamus sowie ein erhöhter CRH-Spiegel in der Cerebrospinalflüssigkeit gefunden, der sich nach erfolgreicher Therapie wieder normalisierte. Außerdem finden sich im präfrontalen Kortex von depressiven Patienten weniger CRH-Bindungsstellen. Dies deutet auf erhöhte CRH-Konzentrationen im Gehirn hin3. Genetische Mausmodelle haben einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der in-vivo-Funktion des CRH/CRHR1-Systems geleistet. Transgene Mäuse, die das CRH im Gehirn überexprimieren, zeigen im Verhalten und in der neuroendokrinen Antwort eine erhöhte Reaktivität auf Stress4 . Zudem zeigen diese Tiere Veränderungen in ihrer Schlafarchitektur und -qualität, analog zu Befunden bei depressiven Patienten5. Eine Überexpression – beschränkt auf das limbische System – führt ebenfalls zu Schlafstörungen und einer erhöhten Ängstlichkeit5,6. Umgekehrt zeigen konstitutive CRHR1-Knockout-Mäuse neben einer gestörten HHN-Achsenfunktion auch ein reduziertes Angst-ähnliches Verhalten7. Mäuse, denen der CRHR1 selektiv im Vorderhirn in Teilen des limbischen Systems fehlt, zeigen trotz einer normalen basalen HHN-Achsenfunktion ebenfalls eine reduzierte Ängstlichkeit8.

Der CRHR1 ist auf verschiedenen Neuronentypen im Gehirn exprimiert

Abb. 1: Schematischer Schnitt durch das Mausgehirn, der die Verteilung CRHR1-positiver Neuronen zeigt (rote Punkte). Die Neurotransmitteridentität CRHR1-exprimierender Neurone in ausgewählten Gehirnregionen ist durch die entsprechende Hintergrundfarbe angedeutet. Abkürzungen relevanter Hirnregionen sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Das Corticotropin-releasing Hormone: Das Neuropeptid Corticotropin-releasing Hormone (CRH) ist von zentraler Bedeutung für eine adäquate Anpassungsreaktion des Organismus auf einen Stressor. Im Zuge der Stressantwort koordiniert CRH sowohl die neuroendokrine Stressreaktion als auch Verhaltensweisen, die für die Stressanpassung essentiell sind, was sich in seiner dualen Funktionalität widerspiegelt: Zum einen steht das CRH als hypothalamisches Releasing-Hormon an der Spitze der Hypothalamus-HypophysenNebennieren (HHN)-Achse 1. Zum anderen LABORWELT

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fungiert es außerhalb des Hypothalamus als Neuroregulator, der die Aktivität klassischer Neurotransmitter moduliert 2 . Auf diese Weise ist das CRH sowohl in die Kontrolle des autonomen Nervensystems als auch in Prozesse rund um Lernen, Gedächtnis, Aufmerksamkeit und Emotionalität involviert. Die biologische Aktivität des CRH wird primär über den CRH-Rezeptor Typ 1 (CRHR1) vermittelt – einen G-Protein-gekoppelten SiebenHelix-Transmembranrezeptor. Die Bedeutung des CRH-Systems ergibt sich auch aus klinischen Befunden, die dessen

Der CRHR1 ist beim Menschen und in der Maus im gesamten Gehirn zu finden, allerdings war bislang weitgehend unbekannt, auf welchen Neuronen – im Hinblick auf die Neurotransmitteridentität – der CRHR1 vorkommt. Diese Wissenslücke ist in erster Linie auf das Fehlen eines geeigneten Antikörpers zur zuverlässigen Detektion des Rezeptors zurückzuführen. In Kontrollexperimenten mit Zelllinien, die eine definierte Menge des CRHR1 exprimieren und mit Mäusen, denen der Rezeptor vollständig fehlt, konnten wir zeigen, dass die derzeit verfügbaren Antikörper weder eine ausreichende Sensitivität noch eine entsprechende Spezifität besitzen, um den CRHR1 eindeutig auf Gewebeschnitten nachzuweisen6. Aus diesem Grund haben wir ein sensitives in situ-Hybridisierungsverfahren etabliert, das den parallelen Nachweis zweier verschiedener mRNA-Spezies erlaubt. Dies geschieht durch die gleichzeitige Verwendung einer radioaktiv markierten Sonde zum Nachweis des CRHR1 sowie verschiedener Digoxigenin-markierter Sonden, die den spezifischen Nachweis von Neuronen anhand ihrer Neurotransmitter-Ausstattung erlauben: Glutamat, γ-Aminobuttersäure (GABA), Dopamin und Serotonin. Darüber hinaus haben wir sogenannte Reportermäuse etabliert, die anstelle des 12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 35

19.10.2011 12:10:09 Uhr

Wissenschaft Neurowissenschaften

CRHR1 ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren. Mit Hilfe von spezifischen Antikörpern gegen das GFP und gegen Marker für die verschiedenen Neuronenpopulationen konnten wir die Identität CRHR1-exprimierender Neuronen zusätzlich auf der Proteinebene nachweisen und die Ergebnisse der in-situ-mRNA-Analyse unabhängig bestätigen (Abb. 1, Tab. 1).

Neurotransmitter Glutamat, GABA, Serotonin oder Dopamin verwenden, erfolgte die CRHR1Inaktivierung Neurotransmittertyp-spezifisch. Das Muster der CRHR1-Inaktivierung in den jeweiligen Mauslinien stimmte vollständig mit der vorherigen histochemischen Charakterisierung überein und belegt die hohe räumliche Spezifität dieses Ansatzes (Tab. 1).

Die Neurotransmittertyp-spezifische Inaktivierung des CRHR1

CRHR1 moduliert Angstverhalten bidirektional

Nun stellte sich die Frage nach der Funktion des CRHR1 auf diesen verschiedenen Neuronentypen, insbesondere im Hinblick auf die Modulation von Angstverhalten6. Klassische pharmakologische Methoden, wie zum Beispiel die Verwendung entsprechender Antagonisten, schieden hier aus, da sie auf alle CRH-Rezeptoren wirken würden, unabhängig von ihrer Lokalisation. Hier bietet die Mausgenetik mit dem sogenannten Cre/ loxP-System entsprechende Möglichkeiten, die eine selektive Neurontentyp-abhängige Inaktivierung des Rezeptors erlauben. Zu diesem Zweck wurden Mäuse, bei denen das CRHR1Gen der Maus durch gentechnische Methoden mit sogenannten loxP-Erkennungssequenzen flankiert ist, mit transgenen Cre-Mauslinien gekreuzt. Sobald die Cre-Rekombinase zwei loxP-Erkennungssequenzen erkennt, schneidet sie die dazwischenliegende DNA heraus und deletiert somit das CRHR1-Gen, wodurch der Rezeptor inaktiviert wird. Durch die Verwendung spezifischer Cre-Mauslinien, die dieses Enzym nur in Neuronen produzieren, die den

Die resultierenden vier Neurotransmittertypspezifischen konditionalen CRHR1-KnockoutMauslinien wurden umfassend hinsichtlich HHN-Achsenfunktion, Lokomotion, Stressbewältigungsverhalten, Furchtgedächtnis und Angstverhalten phänotypisiert. Tiere, denen der CRHR1 in GABA-produzierenden (GABAergen) oder in Serotonin synthetisierenden (serotonergen) Neuronen fehlt, zeigten keinerlei Veränderungen des Angstverhaltens. Tiere, denen der CRHR1 in Glutamat-produzierenden (glutamatergen) Neuronen des Vorderhirns fehlt (CRHR1Glu), zeigten in den verschiedenen Angsttests durchgehend weniger ängstliches Verhalten im Vergleich zu Kontrollgeschwistertieren (Abb. 2). Überraschenderweise und im Gegensatz zu den CRHR1Glu-Mäusen, zeigten Mäuse, denen der CRHR1 in Dopamin-produzierenden (dopaminergen) Neuronen des Mittelhirns (CRHR1DA) fehlt, in allen Tests eine erhöhte Ängstlichkeit (Abb. 2). Keine der vier Linien zeigte Veränderungen in der basalen oder Stress-induzierten HHN-Achsenaktivität, so dass die Änderungen

Tab. 1: Zusammenfassung der CRHR1-Expression im Mausgehirn

Relative Expressionsstärke Hirnregion

CRHR1

Olfaktorischer bulbus (OB)

++++

Neurotransmitter Glu ++ GABA ++++

Grad der Co-Lokalisation + +++

KnockoutMauslinie, die eine CRHR1-Deletion zeigt CRHR1GABA

Cortex (Cx)

+++

Glu +++ GABA ++

+++ +

CRHR1Glu

Hippocampus (CA1, CA2, CA3, DG)

+++

Glu +++ GABA +

+++ +/-

CRHR1Glu

Retikulärer thalamischer Kern (RTN)

+++

GABA ++++

++++

CRHR1GABA

Mediales Septum (MS)

+++

GABA ++++

+++

CRHR1GABA

Laterales Septum (LS)

GABA ++

CRHR1GABA

Bettkern der Stria Terminalis (BNST)

GABA ++

CRHR1GABA

Basolaterale Amygdala (BLA)

+++

Glu ++

CRHR1Glu

Mediale Amygdala (MA)

GABA ++

CRHR1GABA

Globus pallidus (GP)

++++

GABA ++++

++++

CRHR1GABA

Substantia nigra (SN)

+++

DA ++++

++++

CRHR1DA

Ventrales tegmentales Areal (VTA)

+++

DA +++

+++

CRHR1DA

5HT +++

–

Raphe-Kerne (RN)

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im Angstverhalten unabhängig von der HHNAchse und direkt auf den Verlust des CRHR1 in der jeweiligen Neurotransmitterpopulation zurückzuführen sind.

CRHR1 moduliert glutamaterge Neurotransmission und Dopaminfreisetzung Die Tatsache, dass Mäuse, denen der CRHR1 in glutamatergen Neuronen des Vorderhirns fehlt, eine reduzierte Ängstlichkeit zeigen, deutet auf eine Glutamat-abhängige Neurotransmission hin. Zudem fehlt CRHR1Glu-Mäusen der CRHR1 im Hippocampus und in der Amygdala, zwei Hirnregionen des limbischen Systems, die wichtig für die Ausprägung von emotionalem Verhalten sind. In der Tat zeigten elektrophysiologische Messungen im basolateralen Anteil der Amygdala, dass der CRHR1 hier spezifisch auf glutamatergen Neuronen zu einer Verstärkung der Feldpotentiale nach CRH-Stimulation führt – ein Effekt, der in CRHR1Glu-Mäusen komplett verlorengeht. Im Hippocampus stellte sich die Situation ähnlich dar: Hier konnten wir mit Hilfe des sogenannten „Voltage-sensitive dye imaging“ auf der Netzwerkebene zeigen, dass der CRHR1 selektiv auf glutamatergen Neuronen die Aktivitätsausbreitung im hippokampalen Netzwerk beeinflusst. Die Interaktion zwischen CRH/CRHR1-System und dopaminergem System wurde bislang fast ausschließlich hinsichtlich seiner Rolle im Suchtverhalten untersucht und weniger im Rahmen von emotionalem Verhalten9. Eines der Zielgebiete dopaminerger Neuronen des Mittelhirns ist der präfrontale Cortex. CRHR1DAMäuse, denen der CRHR1 spezifisch auf dopaminergen Neuronen fehlt, zeigten im Vergleich zu Kontrollgeschwistertieren eine geringere Freisetzung von Dopamin im präfrontalen Cortex nach Stress. Dieses Ergebnis zeigt, dass der CRHR1 die Dopaminfreisetzung im Rahmen der Stressreaktion kontrolliert. Diese CRHR1positiven Dopamin-produzierenden Neuronen, die Angst-lösende Effekte vermitteln, definieren möglicherweise eine neue Subpopulation von dopaminergen Neuronen, die insbesondere für das Angstverhalten von Bedeutung sind. Die beobachtete bidirektionale Kontrolle des Angstverhaltens durch den CRHR1 zeigt, dass das CRH über den CRHR1 unter physiologischen Bedingungen glutamaterge und dopaminerge Systeme kontrolliert. Die Tatsache, dass Mäuse, denen der CRHR1 im gesamten Gehirn fehlt (CRHR1ZNS) und die keinerlei Veränderungen im Angstverhalten zeigen (Abb. 2), deutet darauf hin, dass sich diese zwei antagonistischen CRHR1Systeme im Falle einer kompletten Eliminierung gegenseitig aufheben. Somit könnte eine Störung des Gleichgewichts von CRHR1-kontrollierten glutamatergen und dopaminergen neuronalen Netzwerken ursächlich für die Entstehung psychischer Erkrankungen sein. Eine erste klinische Studie mit einem CRHR1-Antagonisten zeigte eine deutliLABORWELT

19.10.2011 10:00:49 Uhr

Wissenschaft Neurowissenschaften

Science4Life Venture Cup 2012

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Abb. 2: CRHR1Glu-Mäuse sind weniger ängstlich im Vergleich zu Geschwistertieren. Umgekehrt zeigen CRHR1DA-Mäuse in allen Tests eine erhöhte Ängstlichkeit. Mäuse, denen der CRHR1 im gesamten Gehirn fehlt (CRHR1ZNS) zeigen keine Veränderungen des Angstverhaltens. DaLi: Dark/Light box; EPM: Elevated plus maze; NOET: Novel object exploration test; Ctrl: Kontrollgeschwistertier; CKO: konditionaler Knockout. che Verbesserung von Depressions- und Angstsymptomen in Patienten10. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind ein wichtiger Hinweis darauf, dass eine Fehlregulation des CRH/CRHR1-Systems, wie sie in vielen depressiven Patienten zu beobachten ist, möglicherweise auf spezifische neuronale Netzwerke beschränkt ist. Zudem unterstreichen sie, dass ein therapeutischer Nutzen von CRHR1-Antagonisten nur bei solchen Patienten zu erwarten ist, deren CRH/CRHR1-System aus dem Gleichgewicht geraten ist, was vermutlich auch die jüngsten negativen klinischen Studien mit CRHR1Antagonisten erklärt11. In Zukunft wird es entscheidend sein, aussagekräftige Biomarker, wie zum Beispiel Veränderungen der Schlafarchitektur, zu etablieren, um jene Patienten zu identifizieren, bei denen der Einsatz von CRHR1-Antagonisten sinnvoll ist12.

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10/3/10

Literatur [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12]

Vale W et al. (1981) Science 213: 1394.1397. Gallagher JP et al. (2008) Eur J Pharmacol. 583 : 215-225. Holsboer F (1999) J Psychiatr Res. 33: 181-214. Lu A et al. (2008) Mol Psychiatry 13 : 1028-1042. Kimura M et al. (2009) Mol Psychiatry 15 : 154-165. Refojo D et al. (2011) Science 333: 1903-1907. Timpl P et al. (1998) Nat Genet. 19: 162-166. Müller MB et al. (2003) Nat Neurosci. 6: 1100-1107. Sillaber I et al (2002) Science 296: 931-333. Zobel AW et al. (2000) J Psychiatr Res. 34: 171-181. Binneman B et al (2008) Am J Psychiatry 165: 617-620. Holsboer und Ising (2010) Annu Rev Psychol. 61: 81-109.

Korrespondenzadresse Dr. Jan M. Deussing Max-Planck-Institut für Psychiatrie Kraepelinstr. 2-10 80804 München Tel.: +49-(0)89-30622-639 deussing@mpipsykl.mpg.de www.mpipsykl.mpg.de LABORWELT

35-37_LW5_11_Deussing_tg.indd 37

Die Vorzüge eines MiniVap™ Selbstverständlich würden Sie keinen Haartrockner verwenden, um chromatographische Proben in einer einzelnen Mikrotestplatte zu verdampfen. Sie haben wahrscheinlich aber auch keine Lust Schlange zu stehen, um einen großen Evaporator in Ihrer Abteilung für denselben Zweck zu benutzen. In diesem Fall brauchen Sie einen Porvair MiniVap. Das Gerät ist klein, schnell, flexibel und beeinträchtigt Ihre Proben nicht. Weitere Information finden Sie unter www.microplates.com/downloads.php

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20.10.2011 13:40:20 Uhr

Blitzlicht Probenvorbereitung

RNA-Isolation aus FFPEGewebe: Säulchen- und Bead-basierte Methoden Robert Loewe, GeneWake GmbH, Neuried Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettetes (FFPE) Gewebe ist aufgrund seiner diagnostischen Bedeutung und breiten Verfügbarkeit ein interessantes Probenmaterial. Die Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus FFPE-Gewebe ist jedoch – sofern diese quantitativ und qualitativ korrekt sein soll – nicht trivial. Anhand von zwei kommerziell verfügbaren Kits wird in diesem Beitrag eine mögliche Anwendung in der Routine aufgezeigt. Eine verwendete Technik basiert auf Kieselgel-Matrix-Säulchen, die andere auf magnetischen Partikeln. Besonders im höheren Durchsatz ist generell die „Bead-Technologie“ gut geeignet. Mit einem neuen Protokoll zeigten sich bei beiden Methoden vollkommen vergleichbare Resultate. Um dies nachvollziehen zu können, wurden alternierende Schnitte des gleichen histologischen FFPEBlocks parallel aufgereinigt und im Anschluss auf RNA-Menge, RNA-Qualität und Verhalten in einer qPCR nach reverser Transkription überprüft. Abhängig vom Ausgangsmaterial und dessen Menge ist die Nukleinsäureaufreinigung aus FFPE-Gewebe in der Routine möglich und somit in einen diagnostischen Ablauf integrierbar. Der Maßstab reicht von Einzelproben bis hin zum Massendurchsatz.

Abb. 1: Schritte vom FFPE-Schnitt bis hin zur aufgereinigten RNA Zielgerichtete Therapien halten immer stärker Einzug in den klinischen Alltag. Dies ist besonders in der Onkologie der Fall. Beispiele sind spezifische Antikörper, die sich gegen Wachstumsfaktoren, wie etwa EGFR (z.B. Cetuximab), oder deren Rezeptoren richten. Zielgerichtet wirken aber auch Tyrosinkinaseinhibitoren, zum Beispiel bei somatischen Mutationen des EGFR-Gens (z.B. Erlotinib) oder des BRAF-Gens (Vemurafenib) oder Medikamente zur Behandlung von Tumo38 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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ren mit einem Fusionsgen, wie etwa EML4-ALK (Crizotinib). Bei allen erwähnten Beispielen ist eine begleitende Diagnostik zwingend notwendig; dabei wird immer häufiger Real Time-PCR zur Erkennung von Tumormarkern eingesetzt1. Anders als Leukämien sind solide Tumoren jedoch schwieriger in der Probenbereitung, da eine einfache Blutabnahme nur bedingt aussagekräftig ist. Daher wird zur korrekten Diagnose Gewebematerial benötigt, welches möglichst

repräsentativ für den entsprechenden Tumor sein sollte. In der traditionellen Pathologie wird zur Analyse in der Regel Formalin-fixiertes Paraffineingebettetes (FFPE) Gewebe für Färbungen sowie Immunohistochemie verwendet. Diese Probenart gibt routinemäßig valide Ergebnisse, ist jedoch kein einfaches Material für die Nukleinsäureaufreinigung. Die angefertigten Schnitte müssen über eine aufwendige Prozedur entparaffiniert und mittels enzymatischem Verdau soweit möglich von Formalin-induzierten Quervernetzungen zur Nukleinsäure selbst und zu Proteinen befreit werden, da diese die anschließende PCR inhibieren. Das stellt gewisse Anforderungen an die verwendete Chemie. Zum einen muss das Wachs entfernt werden, zum anderen die Lyse des Schnittes vollständig genug sein, um die Nukleinsäuren für die Isolierung freizusetzen.

Säulchen versus Beads Trotz der technischen Hürden ist FFPE-Gewebe das wichtigste Ausgangsmaterial zur begleitenden Diagnose bei einer zielgerichteten Therapie. Zur Nukleinsäureaufreinigung werden dabei unterschiedliche Verfahren eingesetzt. Am häufigsten sind die sogenannten Säulchenbasierten und die Bead-basierten Aufreinigungssysteme. Säulchen sind für ihre einfache Handhabung und für gute Ausbeuten bekannt3. Sie sind allerdings ungeeignet für den hohen Durchsatz und nur schwer automatisierbar. Mit steigendem Probenvolumen ist ihr Einsatz für die Routine nicht mehr geeignet. Bead-basierte Methoden erfüllen die beiden letzteren Kriterien. Das Maxwell® 16 System von Promega nutzt ein Bead-basiertes Protokoll und ist für den mittleren Durchsatz und die Automation gut geeignet. Die meisten Vergleiche von FFPE-Aufreinigungsmethoden beschränken sich auf manuelle Verfahren4. Ziel dieser Studie war es daher, ein im Labor entwickeltes, automatisiertes Protokoll einem Säulchen-Protokoll gegenüberzustellen. Ein Vergleich der beiden Methoden sollte zeigen, ob diese in Ausbeute und Nukleinsäurequalität gleichwertig sind. Um auch Einzelproben mit hohen Probenzahlen vergleichbar zu machen, wurde das Bead-Protokoll auf geringe Mengen Einsatzmaterial angepasst. Dies ist notwendig, da unterschiedliche Ausbeuten von RNA einen direkten Vergleich der Rohwerte nicht erlauben. Erst nach einer Normalisierung über sogenannte Referenzgene wäre eine Gegenüberstellung der Werte möglich. Die Bindekapazität sowie die Lyseeffektivität der Bead-basierten Methode wurden an das Säulchenprotokoll angeglichen, was zu einer direkten Vergleichbarkeit führte. Dies wurde ermöglicht durch eine Veränderung

www.laborwelt.de LABORWELT

20.10.2011 13:40:56 Uhr

Blitzlicht Probenvorbereitung

des Lyse-Puffers, eine Anpassung des Proteinase K-Verdaus und einen Wechsel des Laufprotokolls auf dem Maxwell® 16-Gerät selbst.Wie schon öfter gezeigt wurde, kann ein optimierter Proteinase K-Verdau die RNA-Ausbeute vergrößern1,2,5.

RNA-Aufreinigung Da in der Regel im testenden Labor Genexpressionsanalysen durchgeführt werden, stand die Aufreinigung von RNA im Vordergrund. Um gleiches Ausgangsmaterial zu gewährleisten, wurden alternierende Schnitte desselben histologischen FFPE-Blocks für die Isolierung verwendet. Das Tumormaterial war Granulosazelltumor. Die Schnitte wurden in Duplikaten beziehungsweise Triplikaten isoliert. In Abbildung 1 sind die einzelnen Schritte bis zur aufgereinigten Nukleinsäure schematisch dargestellt. Die gewonnene RNA wurde mit der MMLVPunktmutante (Promega) umgeschrieben. Anschließend wurde die Genexpression mittels SYBR green-basierter qPCR auf dem LightCycler480 (Roche) überprüft. Für eine genauere Diagnostik wurden 23 Gene in ihrer Expression überprüft. Zielsetzung hierbei war es, nur geringe Abweichungen in den Cq-Werten (jenseits 2 Cq bei den meisten Genen) und des globalen Mittelwertes zu erzielen. Hierfür wurde das Konfidenzintervall von 95% angestrebt (97,5% bis 99,3% wurden beim Einzelvergleich erreicht). Das Genexpressionsprofil sollte durch die unterschiedlichen Aufreinigungen nicht verzerrt werden, um eine Fehldiagnose möglichst unwahrscheinlich zu machen. Ein Vergleich der Säulchen-Systeme (für das DNA ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System bzw. für RNA ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep System, beide Promega) mit dem im Labor entwickelten Bead-Protokoll für das Maxwell® 16 Blood DNA Purification Kit zeigte keine für die Diagnostik relevanten Unterschiede der Protokolle (Tab. 1). Beim Einsatz der drei verschiedenen Aufreinigungsprotokolle traten keine Unterschiede in den Cq-Werten beziehungsweise der Expressionsstärke auf, die relevant für die Therapieentscheidung sind. Dies zeigt sich beispielsweise bei der Analyse der ERBB2-Expression, welche unabhängig vom eingesetzten Aufreinigungssystem vergleichbare Expressionslevel liefert (ERBB2 ist ein Marker, der über die Trastuzumab-Therapie entscheidet). Die Qualität und Ausbeute der aufgereinigten RNA ist also für alle drei Protokolle gleichwertig.

Protokolloptimierung für genomische DNA Das verwendete Protokoll bei der Bead-Aufreinigung wurde von uns für die RNA-Isolierung optimiert. Dies wird beim Cq-Vergleich der LABORWELT

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genomischen DNA deutlich. Hierfür wurden die gleichen Proben an drei Genabschnitten mit Primern unterschiedlicher Effizienz – und Anfälligkeit für Inhibitoren – mit SYBR green gemessen. Der vom Hersteller für genomische DNA entwickelte Kit zeigt deutlich bessere Ergebnisse als der Total RNA Kit für Säulchen und der auf RNA optimierte, Bead-basierte Kit. Durch Modifikation des Maxwell® 16-Protokolls auf optimale RNA- und DNA-Ausbeuten konnte der Cq-Wert um drei verringert werden. Dazu wurde der Bindepuffer gegen 70%-iges Isopropanol ausgetauscht und die Proteinase K-Verdauzeit von 30 Minuten auf bis zu sechs Stunden verlängert. In Tabelle 3 wird die Verbesserung der CqWerte allein aufgrund der Verlängerung der Proteinase K-Inkubationszeit gezeigt. Ausgangsmaterial war hierbei Kolonkarzinom in sehr schlechter Qualität. Das Optimum der Verdauzeit lag zwischen zwei und vier Stunden, da nach vier Stunden die RNA-Ausbeute deutlich abfiel. In der optimierten Form ist damit das Beadbasierte Protokoll mit dem Säulchen-basierten komplett vergleichbar.

Fazit: Verschiedene Methoden – vergleichbare Ergebnisse Versuchsreihen mit unterschiedlichem Durchsatz und Methoden verschiedener Labore können mit den eingesetzten Produkten problemlos gemeinsam ausgewertet werden. Zusätzlich sind sowohl Säulchen- als auch Bead-basierte Protokolle eine valide Möglichkeit um RNA und DNA gleichermaßen und von der gleichen Probe zu analysieren. Eine Entscheidung vorab – ob nun RNA oder DNA isoliert werden sollte – und der Verlust von wertvollem Probenmaterial kann somit vermieden werden.

Literatur [1]

[2] [3]

[4] [5]

Paik, S. Tang, G., Shak, S., Kim, C., Baker, J., Kim, W., Cronin, M., Baehner, F.L., Watson, D., Bryant, J., Costantino, J.P., Geyer, C.E. Jr, Wickerham, D.L., Wolmark, N.,J Clin Oncol 10 (2006), 37263734. Chung, J.Y., Braunschweig, T., Hewitt, S.M., Diagn Mol Pathol 15 (2006), 229-236. Bonin, S., Hlubek, F., Benhattar, J., Denkert, C., Dietel, M., Fernandez, P.L., Höfler, G., Kothmaier, H., Kruslin, B., Mazzanti, C.M., Perren, A., Popper, H., Scarpa, A., Soares, P., Stanta, G., Groenen, P.J., Virchows Arch 457 (2010), 309-317. Ribeiro-Silva, A., Zhang, H., Jeffrey, S.S., BMC Mol Biol 21 (2007), 118-128. Abramovitz, M., Ordanic-Kodani, M., Wang, Y., Li, Z., Catzavelos, C., Bouzyk, M., Sledge, G.W. Jr, Moreno, C.S., Leyland-Jones, B., Biotechniques 44 (2008), 417-423.

Korrespondenzadresse Robert Loewe GeneWake GmbH Floriansbogen 2–4 82061 Neuried robert.loewe@genewake.com

Tab. 1: Cq-Vergleich (Genexpression) der unterschiedlichen Kits. Proben wurden jeweils dreifach angesetzt. (Relia-g= ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep-System ohne RNase; Relia-c = RNA ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep-System; Max-c = auf RNA optimiertes Maxwell® 16 Blood Purification Kit) Relia-c

Relia-g

Max-c

9,78

10,07

8,70

ACTG2

26,88

24,65

25,64

ANXA2

22,20

22,18

22,90

18S

ATM

23,13

22,58

24,07

EGFR

28,73

28,40

28,06

ERBB2

26,22

25,65

24,89

ERCC1

26,50

26,24

26,90

FANCF

21,92

21,29

20,50

FOXM1

24,76

24,91

23,78

HMBS

26,02

25,97

22,38

MTOR

27,61

27,77

23,65

NFKB1

24,83

24,66

25,87

NFKB2

23,96

23,07

24,71

POLR2B

26,78

26,87

25,16

PTGS2

22,68

22,34

24,61

RAD50

26,97

26,59

24,69

RPL32

18,55

19,38

17,49

TOP2A

23,76

24,21

25,02

TYMP

30,59

29,29

30,76

TYMS

26,42

26,59

27,59

VEGFA

22,85

22,46

23,77

VIM

25,15

27,43

23,55

XRCC5

25,39

25,50

22,43

XRCC6

20,90

20,40

20,94

Tab. 2: Cq-Vergleich (DNA-Gehalt und Amplifizierbarkeit) der unterschiedlichen Kits. Proben wurden jeweils dreifach angesetzt. Relia-g

Relia-c

Max-c

KRAS

24,95

27,31

27,81

BRAF

25,56

28,07

28,71

EGFR

25,60

29,87

28,78

Tab. 3: Effizienz der Maxwell®16 gDNAIsolierung aus FFPE-Material in Abhängigkeit der Proteinase K-Inkubationsdauer. Ausgangsmaterial: geringe Menge an Kolonkarzinom 0,5h

KRAS

32,36

31,20

30,53

30,65

BRAF

37,03

35,94

35,015

34,58

EGFR

36,20

35,22

32,28

32,97

12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 39

20.10.2011 13:41:04 Uhr

Report Karrierewelt

Dynamik des Arbeitsmarktes fördert freies Spiel der Kräfte Dieter Lingelbach, Managing Partner, Life Science Consult, München Die Arbeitsmärkte öffnen sich dem internationalen Publikum. Die Life Sciences mit ihrem Bedarf an Spezialisten sind einer der Vorreiter. Das verändert die bisherigen Wettbewerbsbedingungen in hohem Tempo. Genauso wie sich Technologien und deren Anbieter laufend neu erfinden müssen, so gilt das auch in erheblichem Maß für die Ressource Arbeitskraft. Wer ist am ehesten herausgefordert und zu Anpassungen gezwungen? Auf Stellenauschreibungen der Life ScienceBranche in Deutschland melden sich zunehmend Kandidaten aus Indien mit teils internationaler Arbeitserfahrung. Auf den Anforderungsblättern für neue Mitarbeiter in Deutschland heißt es zunehmend, „German language skills a nice to have“. Was haben diese Beobachtungen gemeinsam? Sie beschreiben veränderte Wettbewerbsfähigeiten und Gegebenheiten auf dem internationalen und gerade auch auf dem deutschen Arbeitsmarkt. Auf Ausschreibungen für hochanspruchsvolle Stellen in der deutschen Life SciencesIndustrie melden sich auffällig viele Bewerber ausländischer Herkunft. Jüngst waren für eine Stelle in der Proteinfermentation im ersten Durchgang mehr indien- als deutschstämmige Kandidaten interessiert und geeignet (Abb. 1). Russischstämmige Kandidaten machten bereits mehr als ein Zehntel aus. Diese Kandidaten haben durchweg bereits Berufserfahrung im Westen oder mit westlichen Unternehmen in ihrem Heimatland. Ca-

rina Friedmann, ausgewiesene Indien-Expertin in Nürnberg1, beschreibt die Qualifikationen und das Interesse indischer Kandidaten so: „Insbesondere die sieben staatlichen, sehr kompetitiven Indian Institutes of Technology (IITs) und das Indian Institute of Science (IISc) in Bangalore haben ein international vergleichbares hohes Niveau im Bereich Naturwissenschaften. Für junge Absolventen dieser universitären Einrichtungen stellen Arbeitsmöglichkeiten im Ausland eine überaus interessante fachliche, persönliche und finanzielle Entwicklungsmöglichkeit dar.“ Was bedeuten diese Veränderungen für Studenten europäischer Herkunft?! Sie werden zunehmend im internationalen Kontext gemessen, allemal ihre fachlichen Qualifikationen und ihre sogenannten ‚Achievements‘. Hier wird es zunehmend schwierig, sich allein auf Ausbildungen und Post-Doc-Erfahrungen in technisch weit vorangeschrittenen Ländern zu verlassen. Die Lösung für europäische Studenten und Kandidaten liegt zunehmend in den ‚soften‘ Faktoren: bei der Besetzung von Positionen zum

Beispiel im deutschsprachigen Raum bleibt es immer noch eine legitime und auch politisch akzeptable Frage, ob man auch (fremdsprachige) Ausländer auf dem jeweiligen leeren oder neuen Posten sieht. Je nach Einzelfall wird eine analoge Frage auch zu indischstämmigen Kollegen angesprochen. Warum sind solch diskriminierende Fragen angemessen und fair? Objektiv eine Hürde sind die meist von den Unternehmen zu zahlenden Umzugskosten und die normalen sprachlichen Hürden bei der Integration im Tagesablauf. Eine sehr viel kritischere, obgleich softe Hürde, ist die mittelfristige Integration in die Unternehmenskultur. Wie ist das Verständnis von Teamplay, wie wird kritisiert, wie vorgetragen, wir- oder ichbezogen? Was ist das Verständnis von „Kontrolle“ und „Führung“? Wie detailliert ist eine „Strategie“ und die daraus resultierenden Vorgaben an die Kollegen? Hier unterscheiden sich die Kulturkreise deutlich, was im Regelfall zu Reibungsverlusten führt. Zwischen den Länderorganisationen weltumspannender Konzerne ist das Phänomen bekannt und normal – nur: Soll man sich diese Reibungsverluste innerhalb der meist kleineren und weniger etablierten Unternehmensorganisationen der Life Sciences auch noch leisten? Insofern haben deutsche (bzw. heimische) Kandidaten meist immer noch den Vorteil, daß man sie für ‚berechenbarer‘ hält. Fachlich-theoretische Kompetenz, Auslandsaufenthalte und gute Noten allein reichen nicht mehr aus; zunehmend werden in Vorstellungsgesprächen ‚soft skills‘ abgefragt. „Wichtige Karrierevoraussetzung ist die Fähigkeit, Menschen aus Japan, Indien, USA oder Frankreich gleichermaßen wirkungsvoll führen zu können oder für einen Chef aus einem dieser Länder arbeiten zu können“, sagt Dr. Manfred Baier, bei Roche Diagnostics lange Jahre für die Zusammenarbeit mit Hitachi zuständig2. Nicht glücklich operiert dann der Kandidat, der sich vom Seminar zu Personalmanagement Führungs„tricks“ erwartet, so wie es der Dozent wiederholt erfährt. Oder dem Themen wie „soziale Kompetenz“ und „emotionale Intelligenz“ völlige Fremdwörter sind. „Gerade hier müssen die im europäischen Arbeitsmarkt traditionell hofierten Männer noch viel dazu lernen“3.

Literatur [1] [2] [3]

Geschäftserfolg in Indien, Springer-Verlag, 2011 Dr. Manfred Baier, Leiter Roche Applied Science innerhalb Roche Diagnostics Hubert Friedmann, langjähriger Leiter Personal in Penzberg und Coach in Personalführung

Korrespondenzadresse

Abb. 1: Herkunft Kandidaten, Bsp.: Proteinfermentation 40 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Dieter Lingelbach Life Science Consult Lingelbach@LifeScienceConsult.com LABORWELT

19.10.2011 10:01:20 Uhr

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Akademischer Stellenmarkt Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt (auch online), der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu Ihre Anzeige (Ausschreibungstext als Word-Datei, Logo – jpg oder tiff, 300 dpi Auflösung) an a.macht@biocom.de. Annahmeschluss für die nächste LABorWeLt-Ausgabe „Systembiologie, synthetische Biologie“ (erscheinungstermin 24.11.2011) ist der 11. November 2011.

Translationale Onkologie an der Universitätsmedizin der JGU Mainz

Die Translationale Onkologie an der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz (TRON) ist ein innovatives, schnell wachsendes, biopharmazeutisches Institut mit dem Ziel, innovative Diagnostika und Arzneimittel zur Behandlung von Krebs und Erkrankungen des Immunsystems zu entwickeln. TRON arbeitet in intensiver Kooperation mit der Universität Mainz, der Universitätsmedizin Mainz sowie nationalen und internationalen Unternehmen und Instituten zusammen. Zur Verstärkung unserer Funktionseinheit „Stemcells“ suchen wir zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine/n

technische/n Assistentin/en (BTA/MTA) Die Funktionseinheit „Stemcells“ beschäftigt sich mit der Reprogrammierung somatischer Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen). Die iPS-Zell Technologie ist für zukünftige Zelltherapien hoch relevant und wird derzeit intensiv beforscht. Innerhalb unserer Funktionseinheit sind Sie direkt an der Entwicklung unserer eigenen Methoden zur iPS-Zell Generierung beteiligt. Sie können proaktiv persönliche Akzente setzen und bekommen Einblicke in die vielschichtigen Fragestellungen der Stammzellbiologie. Nach entsprechender Einarbeitung übernehmen Sie die Planung und Durchführung von eigenen Experimenten, die sie in Absprache mit Ihren Teamkollegen durchführen. Hierbei helfen Ihnen Ihre strukturierte und zuverlässige Arbeitsweise und Ihre Freude an wissenschaftlichen Experimenten. Sie erwartet bei uns ein angenehmes Betriebsklima, gründliche Einarbeitung und herausfordernde Aufgaben im Bereich Forschung und Entwicklung von Krebstherapeutika, sowie ein abwechslungsreiches und spannendes Arbeitsumfeld. Wir suchen hoch motivierte Mitarbeiter, welche unsere Begeisterung für Forschung und Wissenschaft teilen, Spaß an der Bewältigung neuer Aufgaben haben und Teil unseres engagierten Teams werden wollen. Ihr Profil entspricht genau unseren Vorstellungen und wir haben Ihr Interesse geweckt? Dann freuen wir uns schon heute auf Ihre vollständigen und aussagekräftigen Bewerbungsunterlagen unter Angabe Ihrer Gehaltsvorstellung und Ihres möglichen Eintrittstermins.

International Ph.D. Programs in the Life Sciences Description: The Life Science Zurich Graduate School consists of several highly competitive Ph.D. programs, run jointly by the ETH Zurich and the University of Zurich. Each program offers research and education opportunities in a stimulating international environment for ambitious students who wish to work towards a Ph.D. degree. Accepted students perform their research project in one of the participating research groups of their favorite program, according to their scientific interest. Advanced teaching and training courses are offered throughout the curriculum. The program language is English throughout. Ph.D. studies usually last 3-4 years. Education: Applicants must hold or anticipate receiving a Master’s degree or equivalent from a university in a relevant field before starting the Ph.D. program. Applicants accepted for the program will have to register with either the University of Zurich or ETH Zurich, depending on the affiliation of their future research group. Application: Our web pages provide detailed information for submission of application. Please refer to the guidelines as we only take into consideration applications received in the required format: http://www.lifescience-graduateschool. ch/index.php?id=108 – Application deadlines are December 1 and July 1 Contact details: Dr. Susanna Bachmann Life Science Zurich Graduate School University of Zurich Institute of Molecular Life Sciences Winterthurerstrasse 190 · 8057 Zurich e-mail: gradschool@lifescience.uzh.ch http://www.lifescience-graduateschool.ch/

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12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 41

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Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmental Health“ (Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die Forscherinnen und Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensationsfähigkeit des Organismus. Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der HelmholtzGemeinschaft Deutscher Forschungszentren e.V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands. Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderpreises sowie des Total E-Quality Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt. Für die German Mouse Clinic des Instituts für Experimentelle Genetik suchen wir zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine/n

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The IPK is a large, internationally recognized centre of plant research that addresses problems of modern biology with an emphasis on crop plants. Our laboratories host an international workforce that brings together a diversity of qualifications and scientific backgrounds. Current research aims for the development of genetic and biotechnological tools and the comprehensive use of plant-genetic resources to optimise crop traits in sustainable agricultural plant production. For this purpose, the IPK cooperates with many national and international universities and research institutions and enterprises. For the working group of Gene and Genome Mapping we are looking for a

PostDoc (m/f)

(100% up to E13 TV-L) Employment starts at earliest date possible for a period of circa three years. The position will be part of a project in the frame of the German research programme ‘Pflanzenbiotechnologie der Zukunft’ and is funded by BMBF. General project information: Association mapping has emerged as novel technique for exploiting a broad range of genetic diversity and to identify markers or genes associated to phenotypic traits. In the current project a collection of recent European wheat cultivars will be covered with SNP-markers and investigated in field trials for agronomic performance, resistance to diseases and drought resistance. Furthermore a number of mapping populations will be developed in order to validate previously identified marker-trait associations. The project takes place in collaboration with several industrial partners and other research institutes. Your duties: The incumbent will be responsible to coordinate the scientific project part of IPK. The tasks involve the development of validation populations, the statistical interpretation of genotypic and phenotypic data, the writing of project reports and publications and the coordination with the other project partners. You fit to us: Applicants should hold a PhD degree in biology or agronomy. Experiences in the application of molecular markers and the ability to handle large data sets are prerequisites for the position. Furthermore knowledge about statistical methods used in association genetics and experiences in handling appropriate software packages are an advantage and will serve as selection criteria. Special emphasis will be given to the ability to author scientific publications. If you need further information feel free to contact Dr. Marion Röder. You reach her under roder@ipk-gatersleben.de or phone +49 (0) 39482 5210. Equal opportunities exist for female and male applicants. Hence, certified women are particularly asked to apply. A family-friendly environment is given. Severely disabled people are taken in preference when the same level of qualification is given. Send your complete and informative application please up to 11th November 2011 under information of the identity figure 21/10/11 to Ms. Gläser (glaeser@ ipk-gatersleben.de). If you have questions to the application procedure and selection procedure you reach Ms. Gläser under phone +49 (0) 39482 5101. Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK) Frau Gläser Corrensstraße 3 06466 Gatersleben Germany www.ipk-gatersleben.de 12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 43

19.10.2011 15:07:34 Uhr

Service Stellenmarkt

Global Head Drug Safety & Pharmacovigilance (m/f) Company Information Our client is an international Biotech Company with locations in Europe and the US. Position • Responsible for all aspects of Drug Safety • Create and deliver the company´s Drug Safety and Pharmacovigilance strategy • Build organizational depth and competence • Partner with senior leaders to define and implement solutions to any issues • Monitoring of implementation and enhancement of SOPs • Supervision of the generation of periodic safety update reports • Analysis of safety data, Benefit-Risk assessment and Signal detection for the company products. • Chairing the Company Safety Committee • Collaboration in national and international teams and project groups • Act as QPPV and Graduated Plan Officer Candidate Profile • Medical doctor, with a focus on hematology • 8-12 years as QPPV and GPO in an international environment • Excellent communication skills, integrative thinking, assertive, results oriented Mediatum Excellence is our standard. Specialization in life sciences is our strength. Mediatum is the premier recruiting boutique for innovative and successful companies in the biotech, pharmaceutical, medical devices and diagnostics industry. If you are interested in this position please email your CV to Ms Freise: tanja.freise@mediatum.com Mediatum Deutschland GmbH Bergheimer Straße 89/1 | D-69115 Heidelberg | Germany www.mediatum.com

Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmental Health“ (Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die Forscherinnen und Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensationsfähigkeit des Organismus. Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren e.V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands. Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderpreises sowie des Total E-Quality Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt. Im internationalen Forschungsverbund des ‚Helmholtz Virtual Institute of Complex Molecular Systems in Environmental Health‘ (HICE) werden Effekte anthropogener Aerosole auf verschiedenen biologischen Ebenen mit modernsten analytischen Techniken untersucht, um detailliertere Aussagen über molekulare Wirkmechanismen zu erhalten. Im Rahmen dieses interdisziplinären Forschungsvorhabens sucht die Kooperationsgruppe ‚Comprehensive Molecular Analytics‘ (CMA) zum 01. Januar 2012 eine/n

Doktorand/in – Untersuchung von Aerosolen und deren Einfluss auf biologische Systeme mit chemischen und physikalischen Methoden 2011/1213 Ihre Aufgaben –

Entwicklung von innovativen chromatographischen und massenspektrometrischen Methoden zur Untersuchung von Aerosolen und biologischen Matrices

–

Probenvorbereitung von Aerosolproben (Modellaerosol) und biologischem Probenmaterial (Zellen und Gewebe)

–

Durchführung und Planung von Messungen mit modernen chromatographischen und massenspektrometrischen Methoden

–

statistische Auswertung von Messdaten

Ihre Qualifikationen –

exzellenter und zeitnaher Hochschulabschluss (Diplom, Master) in Chemie mit dem Schwerpunkt analytische Chemie oder Abschluss eines vergleichbaren Studiums, das eine Promotion an einer deutschen Universität erlaubt

–

praktische Erfahrungen im Umgang mit chromatographischen und massenspektrometrischen analytischen Methoden

–

großes Interesse an analytischen Arbeiten

–

ausgeprägte Teamfähigkeit

The Leipzig School of Human Origins – An International Max Planck Research School – by The University of Leipzig and The Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology The Leipzig School of Human Origins offers a unique interdisciplinary graduate program to study the evolutionary history of humans and great apes. Graduate students are accepted into one of the following areas, but are encouraged to take part in courses and seminars from all three disciplines: Comparative and Molecular Primatology Evolutionary and Functional Genomics, Ancient DNA, Molecular Anthropology and Genome Bioinformatics Human Paleontology, Prehistoric Archaeology and Archaeological Science The language of the school is English. Visit www.leipzig.de for information on living in Leipzig, Germany, in the center of Europe. For project and application details go to www.leipzig-school.eva.mpg.de or contact us at: e-mail: leipzig-school@eva.mpg.de phone: +49(0)-341-3550-0 | fax: +49(0)-341-3550-119 Application deadline: January 31, 2012

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Unser Angebot – Tätigkeit in einem innovativen, zukunftsorientierten Unternehmen –

zunächst bis 31.12.2014 befristetes Arbeitsverhältnis und eine Vergütung nach TVöD (EG 13 50 %)

Bitte senden Sie Ihre Bewerbung bevorzugt per E-Mail an: Dr. Jürgen Schnelle-Kreis E-Mail: juergen.schnelle@helmholtz-muenchen.de Telefon: +49-(0)89 3187-4605 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Massenspektrometriezentrum Ingolstädter Landstraße 1 85764 Neuherberg LABORWELT

19.10.2011 15:08:17 Uhr

Service Verbände

Seite bitte abtrennen – per Fax an 030-264921-11

Kontakt zu Verbänden Die Mitglieder der nachfolgenden Fachgesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für eine Mitarbeit oder einen Beitritt interessiert, erreicht die Fachgesellschaften unter den folgenden Kontakt daten:

und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL)

Fax

E-Mail

Gesellschaft für Genetik AFT FÜ H

GENE

Deutsche Gesellschaft für Proteomforschung

Tel.

Geschäftsstelle der DGKL Friesdorfer Str. 153 53175 Bonn Tel.: +49-(0)-228-92-68-9522 Fax: +49-(0)-228-92-68-9527 geschaeftsstelle@dgkl.de www.dgkl.de

Firma

ELLSC S

Dt. Ver. Gesell. f. Klinische Chemie

Name

Verband (siehe unten, bitte ankreuzen)

Bitte kontaktieren Sie mich

K TI

Ich interessiere mich für den Beitritt Unterstützung für Jungwissenschaftler Interessenvertretung eine Spende Fachgruppen im Bereich

Gesellschaft für Signaltransduktion c/o Prof. Dr. Ralf Hass Med. Hochschule Hannover AG Biochemie u. Tumorbiol. 30625 Hannover Tel.: +49-(0)-511-532-6070 Fax: +49-(0)-511-532-6071 www.sigtrans.de

c/o MPI für Biochemie Am Klopferspitz 18a 82152 Martinsried Tel.: +49-(0)-89-1897-9007 Fax: +49-(0)-89-1897-9009 c.kleinhammer@dgpf.org www.dgpf.org

BIO Deutschland

Gesellschaft für Pharmakologie und

Toxikologie

Geschäftsstelle der DGPT Achenbachstraße 43 40237 Düsseldorf Tel.: +49-(0)-211-600-692-77 Fax: +49-(0)-211-600-692-78 mitglieder@dgpt-online.de www.dgptonline.de

Tegeler Weg 33/ berlinbiotechpark 10589 Berlin Tel.: +49-(0)-30-3450593-30 Fax: +49-(0)-30-3450593-59 info@biodeutschland.org www.biodeutschland.org

Deutsche Gesellschaft für Hygiene

und Mikrobiologie (DGHM)

Nationales Genomforschungsnetz c/o DKFZ Im Neuenheimer Feld 580 69120 Heidelberg Tel.: +49-(0)-6221-424-743 Fax: +49-(0)-6221-423-454 S.Argo@dkfz-heidelberg.de www.ngfn.de

c/o Institut für Hygiene und Med. Mikrobiologie Carl-Neuberg-Straße 1 30625 Hannover Tel.: +49-(0)-511-532-4655 Fax: +49-(0)-511-532-4355 www.dghm.org

bts (Biotechnologische Studenten

initiative e.V.)

c/o BIOCOM Lützowstraße 33–36 10785 Berlin Tel.: +49-(0)-30-2649-21-21 Fax: +49-(0)-30-2649-21-11 www.btsev.de

LABORWELT

45_LW5_11_Verbaende.indd 45

c/o HZM – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit/Inst. of Developmental Genetics Tel.: +49-(0)-89-3187-2610 Fax: +49-(0)-89-4620 www.gfgenetik.de

Deutsche Gesellschaft für

Neurogenetik

Institut für Humangenetik Calwer Straße 7 72076 Tübingen Tel.: +49-(0)-7071-2977692 Fax: +49-(0)-7071-295171 peter.bauer@ med.uni-tuebingen.de www.hihtuebingen.de/dgng/

Netzwerk Nutrigenomik Netzwerk Nutrigenomik Arthur-Scheunert-Allee 114 14558 Nuthetal Tel.: +49-(0)-33200-88-301 Fax: +49-(0)-33200-88-541 mail@nutrigenomik.de www.nutrigenomik.de

DiagnostikNetBB Netzwerk Diagnostik Berlin-Brandenburg e.V. Neundorfstraße 17 16761 Henningsdorf Tel.: +49-(0)-3302-55-199-14 Fax: +49-(0)-3302-55-199-10 f.adams@diagnostiknet-bb.de www.diagnostiknetbb.de

Verband der DiagnosticaIndustrie e.V. Verband der Diagnostica-Industrie e.V. Neustädtische Kirchstr. 8 10117 Berlin Tel.: +49-(0)-30-200-599-40 Fax: +49-(0)-30-200-599-49 vdgh@vdgh.de www.vdgh.de

Österreichische

Reinraumgesellschaft (ÖRRG) ÖRRG Neudorf 41 A-8262 Ilz Tel.: +43-(0)-3385-8117 Fax: +43-(0)-3385-8117 office@oerrg.at www.oerrg.at

Österreichische Ges. f. Laboratoriums

medizin & Klinische Chemie

ÖGLMKC Geschäftsstelle Infomedica-KEG, Xenius Behal Tullnertalgasse 72 A-1230 Wien Tel./Fax: +43-(0)-1889-6238 office@oeglmkc.at www.oeglmkc.at 12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 45

19.10.2011 10:18:55 Uhr

Service Produktwelt Porvair

Biometra

Mikrotiterplatten

Thermocycler für Next Generation Sequencing

Porvair Sciences offeriert ein umfassendes Sortiment an Mikrotestplatten im 96 WellFormat für routinemäßige Anwendungen zur Adsorption, Absorption, Vermischung und Lagerung. Hergestellt aus durchsichtigem Polystyren oder opakem Polypropylen stellt das 96-Well-Plattensortiment von Porvair eine konkurrenzlose Kombination aus Wirtschaftlichkeit und hohem Qualitätsniveau bereit. Es kann zwischen drei Well-Ausführungen (flach, rund und V-förmiger Boden) sowie Plattenformaten in Weiß, Schwarz und Schwarz-Weiß-Kombination gewählt werden. Folglich steht für faktisch jede Testanwendung eine optimierte Platte im 96-Well-Format bereit.

Die Biometra GmbH, ein Unternehmen des Analytik Jena-Konzerns, baut ihr Produktportfolio aus. Der TProfessional Basic XL Thermocycler ist das neueste Modell der Biometra TProfessional Thermocycler-Produktlinie und mit einem anodisierten 96 Well XL-Block für extra große Volumina bis zu 100 µl ausgestattet. Besonders für neue PCR-Techniken, wie zum Besipiel die Emulsions-PCR im Rahmen des Next Generation Sequencing oder für die Bisulfitbehandlung von DNA für Methylierungsstudien, sind oftmals große Reaktionsvolumina notwendig. Der TProfessional Basic XL Thermocycler bietet den Komfort, die Reaktion in einem einzigen Gefäß zu inkubieren, ohne Kompromisse bei der Temperaturuniformität oder den Heiz- und Kühlraten eingehen zu müssen. Der Thermocycler ist wahlweise mit oder ohne Gradientenfunktion zur Optimierung von PCR-Protokollen erhältlich.

Biometra GmbH Dana Schmidt Tel.: +49-(0)3641-779-281, Fax: +49-(0)36 41-779-988 presse@analytik-jena.de www.biometra.com

Carpegen

Molekulardiagnostik für Ärzte

Die Familie der Platten mit 96 flachbödigen Wells wird aus qualitativ hochwertigem Polystyren gefertigt – die optimalen Mikrotestplatten für Messungen der Fluoreszenz, Lumineszenz und Szintillation. Weiße Well-Platten erbringen maximale Reflektivität und optimieren hochempfindliche lichtemittierende LumineszenzAssays. Schwarze Mikrotestplatten machen den vollkommen absorbierenden Hintergrund verfügbar, der zum Minimieren der sonst hierdurch bedingten Interferenz und zum Ausschalten des Crosstalks zwischen Wells benötigt wird, damit fluorimetische Tests allerhöchster Leistung möglich werden. Mit Gewebekulturen präparierte Mikrotestplatten mit 96 Kavitäten stehen für Testreihen zum Zellwachstum bereit. Wegen der identischen Abmessungen zu standardmäßigen Testplatten im 96-Well-Format sind alle Porvair-Platten dieser Kapazität mit fast allen Lesegeräten, Robotorsystemen zur Probenaufbereitung und Flüssigkeitshandhabung zu 100% kompatibel. Ein vollständiges Sortiment von Mikrotestplatten mit 384 Kavitäten vervollständigt das Angebot von Porvair Sciences. Vertrieb: Dunn Labortechnik GmbH Thelenberg 6 53567 Asbach Tel.: +49 (0)26 834 3094 info@dunnlab.de www.porvair-sciences.com 46 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Im September 2011 feierte die Carpegen GmbH aus Münster zehnjähriges Bestehen. Das Unternehmen hat sich bei Zahnärzten und Ärzten einen Namen als Spezialist für molekulardiagnostische Verfahren erworben. Viele Zahnarztpraxen beispielsweise nutzen regelmäßig das Testsystem Carpegen Perio Diagnostik, um für ihre Patienten die jeweils beste Therapie gegen Parodontitis zu finden. Andere Carpegen-Testsysteme dienen der Charakterisierung von Bakterien- und Pilzstämmen oder werden als

Nachweisverfahren in der Humangenetik eingesetzt. Getreu dem Firmennamen Carpegen, zu deutsch etwa: „Nutze das Gen“, konzentriert sich das Unternehmen auf moderne Genanalyse-Verfahren, insbesondere Real-Time-PCRVerfahren und innovative Diagnostik-Tests für die Arztpraxis. Die Entwicklungsarbeiten werden unter anderem vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert. Der im Jahr 2003 erstmals vorgestellte Test Carpegen Perio Diagnostik ermöglicht es, Art und Anzahl Parodontitis-auslösender Bakterien in der Mundhöhle exakt zu bestimmen. Mit diesem Wissen können Zahnfleischentzündungen zielgerichtet behandelt werden. Zahlreichen Zahnärzten gilt der Test seither als Referenzmethode. Auch wissenschaftliche Untersuchungen belegen regelmäßig die qualitative Marktführerschaft des Verfahrens – zuletzt eine Vergleichsstudie, die an der Steinbeis-Hochschule Berlin in Zusammenarbeit mit der Deutschen Gesellschaft für Parodontologie durchgeführt wurde. Aktuell arbeitet das Carpegen-Team daran, das weiterzuentwickeln: Künftig soll der Zahnarzt die Testergebnisse erhalten, noch während der Patient auf dem Behandlungsstuhl sitzt. So kann er sofort mit einer gezielten Therapie beginnen. Carpegen GmbH Yvonne Schoepe Tel.: +49 (0)251 - 980 2320 schoepe@carpegen.de www.carpegen.de LABORWELT

20.10.2011 14:13:33 Uhr

Service Produktwelt Promocell

in.vent Diagnostica

Ausgereiftes ISO-zertifiziertes System zur Gewinnung neuer Biomarker

Arbeiten mit Stammzellen

Mit Enhanced Biobanking stellt die in Henningsdorf ansässige in.vent Diagnostica GmbH ein ISO-zertifiziertes System zur Gewinnung neuer Biomarker vor. Die besonderen Vorteile liegen in der gezielten Probengewinnung unter definierten prä-/analytischen Bedingungen und im IT-unterstützten sowie verlinkten Probenmanagement. So lassen sich nicht nur individuelle Protokolle über das Probenhandling anfertigen, auch das Erstellen einer umfassenden, projektorientierten Probendokumentation wird möglich. Auf diese Weise können anschließend indikations-, parameter- oder matrixbezogene Kollektive genauer betrachtet werden. Enhanced Biobanking bietet eine völlig neue Qualität in der Bereitstellung humaner Proben. Gerade wegen immer neuer Fortschritte auf dem Gebiet der Entdeckung und Entwicklung von Biomarkern steigt der Bedarf an nativen Proben. Mit Enhanced Biobanking lassen sich die vielfältigsten Ansprüche an Volumen, Informationen, Matrices, Parameter sowie Behandlung erfüllen.

PromoCell bietet ein umfassendes Portfolio an adulten humanen Stammzellen inklusive der zugehörigen Expansions- und Differenzierungsmedien für Forschungsprojekte an. Dazu gehören Perizyten, mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, Monozyten und Dendritische Zellen sowie mononukleäre Zellen. Perizyten und mesenchymale Stammzellen (MSC) sind multipotente Zellen, die sich in eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen differenzieren können. Das Portfolio von PromoCell reicht von humanen Perizyten aus der Plazenta bis zu mesenchymalen Stammzellen aus

Das Enhanced Biobanking ermöglicht die effiziente Durchführung klinisch-diagnostischer Studien im Bereich der in-vitro-Diagnostik und der personalisierten Medizin durch die ziel- und projektorientierte Bereitstellung humaner Proben. Seit 2009 ist in.vent nach DIN EN ISO 9001:2008 und nach DIN EN ISO 13485:2007 zertifiziert. Es verfügt über ein schlankes Qualitätsmanagementsystem, basierend auf einem prozessorientierten Ansatz. in.vent Diagnostica GmbH Christiane Ewel Tel.: +49-(0)3302 55 199-23 Fax: +49-(0)3302 55 199-10 ch.ewel@inventdiagnostica.de www.inventdiagnostica.de

Gewo-Feinmechanik

Einfache Reinigung von Glaspipetten

So wie der Besteckkorb eines Geschirrspülers beliebig bestückt werden kann, so kann auch der Pipettenkorb des Glas-Pipetten-Reinigers beliebig für kurze, lange, dünne und dicke Pipetten eingesetzt werden. Je nach Modell werden die Pipetten in bis zu neun Körben (Köcher) gesammelt und darin gereinigt, gespült und getrocknet. Der Sieblochboden im Korb gestattet die freie Platzierung der Pipetten bei jedem Durchmesser bzw. ab 0,1 ml und bis zu einer Länge von 600 mm ohne eine vorgegebene Positionierung. Jeder Korb lässt sich mit einer Identifikationsmarke versehen, um bei Bedarf individualisiert eingesetzt zu werden. Der Korb LABORWELT

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wird am Griff von Hand senkrecht von oben bequem in den Pipetten-Reinigungsautomaten gestellt und nach dem Trocknen auf gleiche Weise entnommen. Die Pipettenwäsche selbst erfolgt glasschonend als Bad und nicht über Injektor-Düsen oder mittels einer Sprühdusche. Das Vollbad ist in jeder Hinsicht gründlicher. Das automatisch dosierte alkalische Reinigungsbad reinigt die Pipetten bei bis zu 95° C und spült sie innen wie außen entsprechend bekannter Erfahrungswerte. Darüber hinaus können alle Parameter von der Laborleitung neu definiert werden. Die Konzentration der Badlauge sowie die Verweilzeit beim Bad oder bei der Spülung, bestimmen letztendlich über den Grad der Pipettensauberkeit. Die automatische Trocknung der Pipetten findet bei 130° C im selben Zyklus statt. Die Bedienung ist vergleichbar mit der eines Geschirrspülers. Das heißt: das gewünschte Programm wird gewählt oder wiederholt und über die Starttaste eingeleitet. Der Ablaufstatus wird über Leuchtdioden angezeigt. Gewo-Feinmechanik GmbH Maria Graf Tel.: +49-(0)-8122-9748-0 Fax: +49-(0)-8122-9748-21 m.graf@hoelzel-gewo.com www.gewo-feinmechanik.de

unterschiedlichen Geweben. Beide Zelltypen können mit den zugehörigen PromoCell-Wachstumsmedien problemlos expandiert werden. Zusätzlich sind Differenzierungsmedien zur in-vitro-Differenzierung von MSC in Adipozyten, Osteoblasten, Chondrozyten und neuronale Zellen verfügbar. PromoCell CD133+ und CD34+ hämatopoetische Stammzellen werden aus frischem Nabelschnurblut isoliert. Im chemisch definierten und xeno-freien PromoCell HPC-Expansion-Medium DXF können diese primitiven Blutstammzellen unter definierten Bedingungen effizient expandiert werden. Mononukleäre Zellen (MNC) aus Nabelschnurblut und peripherem Blut sind ebenfalls verfügbar. Monozyten (Mo) sind unreife, multipotente Phagozyten und werden aus peripherem Blut aufgereinigt. Sie kommen oft in immunologischen Studien zum Einsatz und eignen sich zudem für die Differenzierung zu Makrophagen, Osteoklasten und myeloiden dendritischen Zellen (mDC). PromoCell bietet ein komplettes Kultursystem zur Herstellung von mDC aus Mo und MNC an. PromoCell GmbH Britta Carolyn Krause Sickingenstr. 63/65 69126 Heidelberg Tel.: +49 (0) 6221-649 34-36 Fax: +49 (0) 6221-649 34-40 www.promocell.com www.promokine.info 12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 47

20.10.2011 14:13:43 Uhr

Service Produktwelt Medipan

BST Bio Sensor Technology

Immunfluoreszenzbilder Mehrweg-Biosensoren für Labor, POCT, automatisiert auswerten Prozesskontrolle und Forschung Die von MediPan entwickelte AKLIDES-Technologie ermöglicht es weltweit erstmalig, dass verschiedenste diagnostische Tests über Immunfluoreszenznachweis automatisch und objektiv auswertbar sind. Nach jahrelanger Forschungsarbeit und partnerschaftlicher Zusammenarbeit mit anderen Firmen ist es gelungen, eine marktfähige Plattformtechnologie für die digitale Immunfluoreszenz mittels intelligenter mathematischer Bildverarbeitungsalgorithmen zu entwickeln.

Die Auswertung zellbasierter Immunfluoreszenztests (AKLIDES Kyto) stellt die Basistechnologie für das AKLIDES-System dar und wird bereits erfolgreich in der medizinischen Routinediagnostik eingesetzt. Bisher entwickelte Erweiterungen wie das AKLIDES Beads zur Auswertung von Multiplextesten in der Autoimmundiagnostik und das AKLIDES Nuk zum Nachweis von DNADoppelstrangbrüchen ermöglichen auch in diesen Bereichen der Diagnostik eine objektive Auswertung. Die AKLIDES-Plattformtechnologie ermöglicht schon heute die Kombination von hochsensitiven zellbasierten Tests, zum Beispiel mittels HEp-2-Zellen mit der hochspezifischen Beadtechnologie auf einem Gerät. Die automatische Auswertung von DNA-Doppelstrangbrüchen über H2AX Foci könnte zukünftig eine individuelle Strahlentherapie für Krebspatienten ermöglichen. Weitere Indikationsmöglichkeiten im Bereich Kardiologie, Virologie und Mikrobiologie werden zu den zukünftigen Entwicklungen für die Plattformtechnologie gehören. Medipan ist Mitglied im Berlin-brandenburgischen Verband Diagnostik Net | BB. MEDIPAN GmbH Ludwig-Erhard-Ring 3 15827 Dahlewitz / Berlin Tel.: +49 (0) 33708 4417 - 0 info@medipan.de www.medipan.de 48 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Die Kernkompetenz des europäischen Marktführers BST Bio Sensor Technology, liegt in der Konzeption, Entwicklung sowie der automatisierten Produktion von Mehrweg-Biosensoren. „Mehrweg-Biosensor“ deshalb, weil der Biosensor nach einer kurzen Reinigung wieder einsatzbereit ist. Je nach Anwendungsbereich, können die Sensoren bis zu fünftausendmal wiederverwendet werden. Die daraus resultierenden Vorteile der Technologie sind zum einen eine Qualitätsverbesserung durch die Möglichkeit der Kalibration und Kontrolle des Biosensors, zum anderen eine verbesserte Kosteneffizienz durch die mehrfache Verwendung eines Biosensors. Die BST-Biosensoren sind für die Bestimmung von millimolaren Konzentrationen (zum Beispiel Glukose in Vollblut) bis zu picomolaren Konzentrationen (zum Beispiel Hormone) von Substanzen geeignet. Zu den neuesten BST-Produkten gehören professionelle Analysegeräte. Das mobile Gerät GLUKOMETERPRO arbeitet mit einem Mehrweg-Glukosesensor und unvorbehandeltem Vollblut und bringt damit Laborqualität aus dem klinischen Labor in den POCT-Bereich. Für die Laboratoriumsdiagnostik wird der LABTREND zur flexiblen und ökonomischen Bestimmung von Glukose- oder Laktat-

Konzentrationen in Blut, Plasma oder Serum angeboten. BST Bio Sensor Technology ist Mitglied im Berlin-brandenburgischen Verband Diagnostik Net | BB. BST Bio Sensor Technology GmbH Dr. Dorothea Zahn Buchholzer Str. 55-61 13156 Berlin Tel.: +49-(o)30-7676-731-0 Fax.: +49-(0)30-7676-731-28 info@bst-biosensor.com www.bst-biosensor.com

Attomol

Genetisches Risiko für Blutgerinnungsstörungen mittels Kapillarelektrophorese bestimmen Attomol bietet CE-zertifizierte QuicktypeTests zur Bestimmung des genetischen Risikos von Gerinnungsstörungen an, die jetzt teilautomatisiert mittels Kapillarelektrophorese ausgewertet werden können. Besonders bei hohem Probenaufkommen reduziert dieses System den Arbeitsaufwand und vereinfacht die Bewertung und Dokumentation der Ergebnisse gegenüber der herkömmlichen Auswertung im Agarosegel. Neben den bisher schon etablierten Parametern hat Attomol seine Produktpalette kürzlich um zusätzliche Tests zur Bestim-

mung von Faktor II Prothrombin 19911A>G, Faktor V HR2 6755A>G und FSAP Marburg I erweitert. Genetische und immunologische Faktoren aber auch der Lebensstil oder die Lebenssituation nehmen Einfluss auf das Gerinnungssystem, welches für die Balance des Blutes sorgt und das sowohl Blutungen als auch Thrombosen mit schlimmstenfalls tödlichem Verlauf entgegenwirkt. Die Änderung des Lebensstils oder die Gabe von Gerinnungshemmern können das Thromboserisiko minimieren. Attomol ist Mitglied im Berlin-brandenburgischen Verband Diagnostik Net | BB. Attomol GmbH Dr. Werner Lehmann Schulweg 6, Lipten 03205 Bronkow Tel.: +49-(0)35329-5906-0 Fax: +49-(0)35329-5906-19 info@attomol.de www.attomol.de LABORWELT

20.10.2011 14:13:51 Uhr

lin nomo@

Service Kalender Oktober 2011 – Dezember 2011

Veranstaltungskalender 14.-16.11.11 NanoBioTech Montreux 2011, Montreux (CH) Info: Scitech Research SA (Tel.: +41 21 624 15 33, E-Mail: symposia@nanotech-montreux.com, Web: www.nanotech-montreux.com)

31.10.-02.11.11 BIO-Europe 2011, Düsseldorf Info: Thomas Voigt, EBD Group (Tel.: +1-760-930-0500, E-Mail: tvoigt@ebdgroup.com, Web: www.ebdgroup.com/bioeurope) 02.-04.11.11 World Conference on Regenerative Medicine 2011, Leipzig Info: Jens Augustin, Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology IZI (Tel.: +49 (0)341 35536-9320, Web: www.wcrm-leipzig.com) 02.-03.11.11 3. Symposium Energiepflanzen, Berlin Info: FNR/BMELV (E-Mail: info@fnr.de, Web: www.fnr.de/energiepflanzen2011/)

1. Dezember 2011, Würzburg

Neue Wirkstoffe Themenschwerpunkte des 5. Kooperationsforums Drug Development sind Strategien der Wirkstoffentwicklung in Industrie und Wissenschaft, Technologieplattformen für die Forschung sowie neue Wirkstoffe. Info: bayern-innovativ.de/drugdevelopment2011 05.11.11 Biologie und Bioökonomie – Tag der Biowissenschaften 2011, Berlin Info: VBIO (Web: www.tag-der-biowissenschaften.de)

2.–4. November 2011, Leipzig

Regenerative Medizin Der Weltkongress der Regenerativen Medizin 2011 in Leipzig versammelt Experten aus aller Welt, um über neueste Entwicklungen in den verschiedenen Fachgebieten zu diskutieren. Ein Schwerpunktthema sind Advanced Cell Therapies. Info:www.wcrm-leipzig.com/ 03.11.11 Fraunhofer Life Science Symposium, Leipzig Info: Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie, Leipzig (E-Mail: info@fs-leipzig.com, Web: www.fs-leipzig.com) 04.-05.11.11 12th EMBO|EMBL Science & Society Conference: Making Sense of Mental Illness: Biology, Medicine and Society, Heidelberg Info: EMBO/EMBL (Web: www.embo.org/science-societyconference-2011) LABORWELT

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08.-10.11.11 Journées Internationales Biologie – JIB 2011, Cnit / Paris la Défense (F) Info: Reed Expositions France (Tel.: +33-1-4756-5079, E-Mail: jib@reedexpo.fr, Web: www.jib-sdbio.fr)

15.11.11 T5 JobMesse der Healthcare-Branche, München Info: T5 Interface GmbH (E-Mail: info@t5-interface. de, Web: www.t5-futures.de) 15.11.11 From Bench to Bedside, Focus: Innovative Applications in Personalised Medicine, Dortmund Info: Protagen AG (Web: www.biotechnologiedortmund.de) 16.-18.11.11 COMPAMED/MEDICA 2011, Düsseldorf Info: Dana Mell, IVAM (E-Mail: dm@ivam.de, Web: www.ivam.de) 16.-17.11.11 Targeted Antibodies for Cancer 2011 – TAC 2011, London (UK) Info: MA Healthcare Conferences (Web: www.mahealthcareevents.co.uk/TAC2011) 19.-20.11.11 Paul Martini Symposium 2010: Innovative Therapien in der Hepatologie, Berlin Info: Paul-Martini-Stiftung (E-Mail: info@paul-martini-stiftung.de, Web: www.paul-martini-stiftung.de)

08.11.11 Einführung in die „Gute Laborpraxis“, Karlsruhe Info: Eva Balog, Karlsruher Institut für Technik und Umwelt (KIT) (Web: www.fortbildung.kit.edu) 09.-10.11.11 3. Potsdamer Bioanalytik Kolloquium, 2. Statusseminar „Das Taschentuchlabor“, Potsdam Info: ZMDB/BioTOP (Web: www.zmdb.de/bioanalytik2011) 09.11.11 Integrated Testing Strategies and Their Impact on the 3Rs, Brüssel (B) Info: EPAA (E-Mail: entr-epaa@ec.europa.eu, Web: http://ec.europa.eu/enterprise/epaa) 10.-11.11.11 Leachables and Extractables – Testing & Assessment, Berlin Info: CONCEPT Heidelberg GmbH (Web: www.gmp-navigator.com)

22.–23. November 2011, Dessau

Biopharmazeutika Die Konferenz Vaccines and Biologics beleuchtet aktuelle Fragen zur Entwicklung von Biopharmazeutika. Insbesondere geht es um Möglichkeiten, die Medikamentenentwicklung zu beschleunigen, um moderne mikrobiologische und analytische Methoden sowie um moderne Formen der Prozessvalidierung, beispielsweise durch Quality by Design. Info: www.vaccines-conference.org/ 12. Jahrgang | Nr. 5/2011 | 49

20.10.2011 14:12:30 Uhr

Ausblick

Sequenzierung erreicht das Gesundheitswesen von Thomas Gabrielczyk, Redaktion LABORWELT Mit lauten vernehmbarem Krachen haben Mikrobiologen, Epidemiologen und Vertreter der Gesundheitsbehörden WHO, FDA, CDC, ECDC und der Europäischen Kommission eine Lanze für die Erregerdiagnostik und Seuchenüberwachung per Next-Generation-Sequencing (NGS) gebrochen. Ende September berichtete das Wissenschaftsjournal Science (Vol 333, Seite 1818-1819) von ihrem revolutionären Vorschlag, die mikrobiologischen Stammsammlungen mittelfristig durch eine global zugängliche Datenbank zu ersetzen, die die Genomsequenzen aller bekannten mikrobiellen Pathogene enthält. Diese wollen sie nutzen, um per schnellem Sequenzabgleich Ausbrüche künftig schneller diagnostizieren und ihre Ausbreitung quasi in Echtzeit überwachen zu können. Ihr Ziel sei binnen fünf bis zehn Jahren erreichbar, je nach finanzieller und politischer Unterstützung, so die Experten. Auch den Prototyp einer solchen Erregerdatenbank inklusive der für Ärzte erforderlichen bioinformatischen Tools gibt es bereits. Er steht am National Food Institute der Technischen Universität Dänemark in Kopenhagen. Allerdings haben die Experten einige Widerstände zu überwinden, bevor ihre Idee sich bei Ärzten, Diagnostiklabors, Gesundheitsbehörden und in der wissenschaftlichen Gemeinde durchsetzt. Den Anbietern billiger Kompakt-NGS-Instrumente eröffnet die Initiative den Markt der mikrobiellen Erregerdiagnostik. „Motor der Entwicklung ist der Preisverfall bei den Desktop-Next-Generation-Sequenzern“, so Dag Harmsen von der Universität Münster . Während die Hochdurchsatzsequenzer der drei großen Anbieter Roche, Illumina und Life Technologies/ABI einen Markt von vielleicht 500 Sequenzierungszentren mit entsprechender Finanzkraft addressieren, „kann sich jedes Krankenhauslabor einen Kompaktsequenzer leisten“ . Wie schnell und billig die kleinen Geräte arbeiten, hatte Harmsens Gruppe bei der EHEC-Epidemie in Deutschland und einem Klebsiella-Ausbruch in den Niederlanden demonstriert . Derzeit liegen die Kosten zwar noch bei 500 Euro pro Genom . Laut Harmsen werden sie mit 100 bis 200 Euro aber genausoviel kosten wie der derzeitige Goldstandard der Erregerdiagnostik, die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PGFE) . Wann auch immer einem Diagnostiklabor oder Krankenhaus ein Isolat vorliegt, wird es in wenigen Stunden sequenziert werden . Danach

kann per Smartphone die Sequenz mit der globalen Datenbank abgelichen werden, und binnen Minuten ist der Erreger inklusive Antibiotikaresistenzen ermittelt“, erklärt Jørgen Schlundt, Direktor des National Food Instituts, der nach Brüssel eingeladen hatte, die Vision . Ein großes Problem seien aber die national unterschiedlichen Datenschutzbedürfnisse, die bedient werden müssten, um eine global zugängliche Datenressource vorhalten zu können, so Schlundt . Auch müsse sich die Publikationspraxis jener von Open Access-Journalen angleichen, die Publikationen auch dann akzeptieren, wenn die Sequenzdaten zuvor öffentlich zugänglich gemacht worden seien . Vertreter der Europäischen Kommission halten sich hinsichtlich der Finanzierung des Konzeptes noch bedeckt . Doch wird derzeit kräf tig in andere Infrastruktursprojekte investiert, die auf die Etablierung allgemein zugänglicher Sequenzdatenbanken abzielen, wie etwas das ELIXIR-Projekt .

Impressum

Analytik Jena AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Astra Biotech GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Beckman Coulter GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Berlin Partner GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . U3 Biotechnologische Studenteninitiative . . 33 Candor Bioscience GmbH . . . . . . . . . . . . . . . 9 DASGIP AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Gewo-Feinmechanik GmbH + H . Hölzel GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Karl Th . Plato KG / Lallemand Bio-Ingredients . . . . . . . . . . . . . . 11 Kimberly Clark Professional . . . . . . . . . . . . . 25 Kraeber GmbH & Co . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Licor Biosciences GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 New England Biolabs GmbH . . . . . . . . . . . . U4 Norgenta GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Olympus Deutschland GmbH . . . . . . . . . . . 5 Peprotech GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Porvair Sciences Ltd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Promocell GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 Roche Diagnostics GmbH . . . . . . . . . . . . . . . U2 Sony DADC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 S4L - Science for Life . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 SOCOREX ISBA S .A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Vorschau Heft 6/2011

Thema

Synthetische und System-Biologie/

Von der Gensynthese über Tools zur Analyse und zum gezielten Ausschalten von Genen, DNA-Methylierung, Proteinen sowie Metaboliten und der bioinformatischen Integration in biologische Modelle – die nächste LABORWELT-Ausgabe präsentiert top-aktuelle Themen zum Zukunftsthema Synthetische Biologie/Systembiologie .

Expertenpanel Bio-IT

LABORWELT (ISSN 1611-0854) erscheint zweimonatlich im Verlag der BIOCOM AG Lützowstraße 33–36 10785 Berlin, Germany Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11 laborwelt@biocom.de www.biocom.de Redaktion Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk Tel.: 030/264921-50

Anzeigenleitung Oliver Schnell Tel. 030/264921-45, o.schnell@biocom.de Leserservice Angelika Werner, Tel. 030/264921-40 Graphik-Design Michaela Reblin Druck: Druckhaus Humburg GmbH, 28325 Bremen

www.laborwelt.de 50 | 12. Jahrgang | Nr. 5/2011

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Inserentenverzeichnis

Für einen regelmäßigen Bezug von LABORWELT ist eine kostenlose Registrierung unter www.biocom.de oder per Fax erforderlich. Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen in der inhaltlichen Verantwortung der Autoren. Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung des BIOCOM Verlages darf kein Teil in irgendeiner Form reproduziert oder mit elektronischen Systemen verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden. © BIOCOM AG, Berlin

BIOCOM AG

Werbekunden bietet diese Ausgabe eine optimale Plattform für ihre Produkt-und Imageanzeigen . Reservieren Sie Ihren Werbeplatz in der LABORWELT-Themenausgabe bis spätestens zum 11 . November 2011 . Ergänzend zum Themenschwerpunkt „Systembiologie/Synthetische Biologie“ veröffentlichen wir erstmals Experteneinschätzungen zu aktuellen Entwicklungen im „BIO-IT“ . Informationen zu Ihrer möglichen Teilnahme gibt Oliver Schnell (Tel .: +49-30-264921-45, E-Mail: o .schnell@biocom .de) . LABORWELT

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