C u r s o: Biología Mención Módulo 4
Unidad I: Organización, Estructura y Actividad Celular Ácidos nucleicos.
La molécula de DNA es la portadora de la información genética en las células, compuesta por dos cadenas complementarias de nucleótidos enrolladas en una doble hélice, capaz de autorreplicarse y de dirigir la síntesis de RNA.
ÁCIDOS NUCLEICOS Los ácidos nucleicos son macromoléculas formadas por C, H, O, N y P cuyas unidades monoméricas son los nucleótidos. Hay dos tipos: DNA y RNA, son los polímeros que sirven como códigos para la formación de las proteínas. El material genético que los organismos heredan de sus padres es el DNA. En él están los genes, porciones específicas de la macromolécula de DNA que programan las secuencias de aminoácidos, en la estructura primaria de las proteínas. De este modo, y a través de las acciones de las proteínas, el DNA controla la vida de la célula y del organismo. 1. Nucleótidos. Los nucleótidos constituyen la unidad fundamental de los ácidos nucleicos y está formada por tres subunidades características (Figura 1):
un grupo fosfato; un azúcar de cinco carbonos (pentosa); y una base nitrogenada ( púrica o pirimídica),
Figura 1. Estructura básica de un nucleótido.
El DNA posee el azúcar desoxirribosa (en el carbono 2’ le falta un átomo de oxígeno), mientras que el RNA contiene ribosa (Figura 2). Unido a un extremo del azúcar se encuentra un grupo funcional llamado grupo fosfato. En el otro extremo del azúcar se localiza la base nitrogenada orientada hacia la zona central de la macromolécula. Existen cinco tipos diferentes de bases nitrogenadas las que pueden estructurar igual número de nucleótidos diferentes. Dos de ellas, la adenina y la guanina, tienen una estructura de dos anillos y se conocen como purinas. Las otras tres, citosina, timina y uracilo, tienen un anillo único y se conocen como pirimidinas (Figura 3). La adenina, la guanina y la citosina se encuentran tanto en el DNA como en el RNA, mientras que la timina se encuentra sólo en el DNA y el uracilo sólo en el RNA.
Figura 2. Estructura de dos pentosas, ribosa y desoxirribosa.
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Bases pirimídicas Bases púricas
Figura 3. Bases nitrogenadas. Citosina, timina y uracilo son pirimídicas y adenina y guanina son púricas.
Aunque sus componentes químicos son muy semejantes, el DNA y el RNA desempeñan papeles biológicos muy diferentes. El DNA es el constituyente primario de los cromosomas y es el portador del mensaje genético. La función del RNA es transcribir el mensaje genético presente en el DNA y traducirlo a proteínas. También puede ser el constituyente primario de un virus. Los nucleótidos, además de su papel en la formación de estas dos importantes macromoléculas, tienen funciones independientes y de vital importancia para la vida celular. a) Funciones de los nucleótidos libres: •
Transportadores de energía, fundamentalmente, el sistema ATP/ADP. El principal portador de energía, es una molécula llamada ATP (adenosín trifosfato), que se forma a partir del AMP, al cual hay que agregarle dos fosfatos más. Los enlaces fosfato del ATP son relativamente débiles y pueden romperse por hidrólisis (Figura 4), liberando 10 kilocalorías de energía por mol de ATP hidrolizado. La reacción puede ocurrir en sentido contrario si se aportan las 10 kilocalorías por mol.
Figura 4. La hidrólisis del ATP y su transformación en ADP.
Esta reacción se representa de la siguiente manera: •
•
ATP ADP + P + Energía Mensajeros intracelulares como el AMP cíclico (AMPc), que se forma por la acción de la enzima adenilato ciclasa en respuesta a la unión de ciertas hormonas a los receptores de membrana. Coenzimas, participan junto a enzimas en la transferencia de un grupo de átomos de una sustancia a otra. Las más comunes son las derivadas del
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dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD y NADP), los derivados de la flavina (FMN y FAD), y la coenzima A (CoA) (figura 5).
Fig a
ur 5.
Estructura del NAD+ y del FAD.
2. ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA). Todos los organismos celulares, tanto procariotas como eucariotas, tienen DNA de doble cadena como molécula hereditaria; sin embargo entre los virus se pueden encontrar cuatro variantes: • DNA de doble cadena, por ejemplo: los fagos T, herpesvirus, SV40, virus de la viruela. • DNA de cadena sencilla, por ejemplo: el fago ФX174. • RNA de doble cadena, por ejemplo: rotavirus (causante de diarrea infantil). • RNA de cadena sencilla, por ejemplo: el virus del mosaico del tabaco, el virus de la hepatitis A, poliovirus, VIH y los virus del resfriado. En las células eucariotas, el DNA se encuentra en el núcleo y una pequeña cantidad en las mitocondrias y los cloroplastos. En las células procariotas, la molécula de DNA es bicatenaria, circular, cerrada y desnuda (libre de histonas). Además, estas células pueden tener otras moléculas más pequeñas de DNA, llamadas plásmidos (pueden ser transferidas de una bacteria a otra, importantes en biotecnología).
a) Organización del DNA. Al igual que en las proteínas, en la molécula de DNA se pueden describir varias estructuras: Estructura primaria Se trata de la secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de la cadena polinucleotídica. Los desoxirribonucleótidos que forman el DNA son los de
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adenina, guanina, citosina y timina. La información genética está contenida en el orden exacto de los nucleótidos. Estructura secundaria La estructura secundaria de la doble hélice del DNA, permite explicar, además del almacenamiento de la información genética, el mecanismo de duplicación del DNA (replicación semiconservativa), para transmitir la información a las células hijas. Watson y Crick (1953) postularon un modelo para la estructura tridimensional del DNA, basándose en los datos obtenidos mediante difracción de rayos X por Franklin y Wilkins, y en las leyes de equivalencia de bases de Chargaff que indica que el número de bases de adenina es igual al de timina, así como el número de guanina es igual a la de citosina.
Figura 6. La estructura de doble hélice del DNA, según Watson y Crick.
El modelo de doble hélice de Watson y Crick establece las siguientes características: • La molécula de DNA está constituida por dos cadenas polinucleótidas enrolladas alrededor del mismo eje, formando una doble hélice dextrógira. Las cadenas no pueden separarse sin desenrollarse. • Las dos cadenas son antiparalelas, es decir, se enfrenta el extremo 3’ P de una con el extremo 5´ OH de la otra. • El esqueleto covalente se sitúa en el exterior de la hélice, con los grupos fosfato cargados negativamente, dispuestos hacia afuera. • Las bases nitrogenadas se proyectan hacia el interior de la doble hélice, según planos paralelos entre sí y perpendicularmente al eje de la hélice. Las bases nitrogenadas de ambas hebras están enfrentadas formando puentes de hidrógeno entre ellas: dos entre la Adenina y la Timina tres entre la Guanina y la Citosina .
Esta estructura explica la replicación exacta de las dos hebras. Cada cadena sirve de molde a la complementaria, de manera que se pueden formar dos hélices con la misma secuencia de nucleótidos que la parental. Esta propiedad permite transmitir la información genética de generación en generación.
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Estructura terciaria
La forma de cómo se almacena el DNA en un volumen reducido es diferente en los procariontes y en los eucariontes. Las bacterias contienen una sola molécula de DNA bicatenaria (doble hélice), desnuda (no asociada a proteínas) que tiene forma circular. Para conseguir el máximo empaquetamiento se pliega como una súper hélice, que consiste en un plegamiento de la doble hélice, algo así como una “trenza”. En las mitocondrias y cloroplastos de las células eucariotas, el DNA presenta la misma estructura, lo que apoya la teoría endosimbionte de Margulis. El DNA de los eucariontes, que desplegado mediría como un centímetro, debe empaquetarse para caber en un espacio de un micrómetro. Se une a proteínas de dos tipos: histonas y proteínas cromosómicas no histonas. Estas últimas incluyen miles de proteínas con funciones muy diversas, como la síntesis de RNA o de DNA, entre otras. Esta asociación DNA-proteínas forma una unidad estructural y funcional llamada cromatina. La forma en que se pliega la molécula de DNA en el núcleo de las células eucariontes es importante por dos razones: permite disponer de grandes moléculas en poco espacio y determina la actividad de los genes. Las histonas son proteínas estructurales que contienen gran cantidad de aminoácidos con carga positiva, por lo que se unen estrechamente al DNA. También se ha demostrado que son reguladoras de la actividad de muchos genes o promueven su expresión. b) Replicación del DNA. La replicación consiste en la formación de dos moléculas de DNA con una secuencia de bases idénticas a partir de una molécula de DNA inicial. (Figura 7). De acuerdo al modelo de Watson y Crick, la replicación del DNA se basa en la complementariedad de las bases. Si una cadena de la molécula de DNA tiene una secuencia de bases, la otra cadena debe tener la cadena complementaria. Por ejemplo, si una cadena tiene la secuencia 5’ – ATTCGG – 3’, la cadena complementaria es de 3’ –TAAGCC – 5’. Esta complementariedad de la molécula de DNA provee un medio fiel de replicación. A esta forma de replicación se le denomina semiconservativa, ya que se conserva la secuencia de cada una de las hebras de la macromolécula doble original. Se separan las dos hebras originales y cada una sirve como molde para construir una nueva cadena. De esta forma, la secuencia de nucleótidos se duplica con exactitud y la información genética permanece constante.
Figura 7. Replicación semiconservativa del DNA.
Para comprobar que la replicación era semiconservativa, Mathew Meselson y Franklin Stahl (1958) del Instituto Tecnológico de California, emplearon la técnica del gradiente de densidad para separar distintas cadenas de DNA con densidades algo diferentes. El experimento consistió en lo siguiente: 6
•
Cultivaron bacterias E. Coli en un medio con amoniaco marcado con nitrógeno pesado (15N), dejándolo un par de horas, tiempo suficiente para que el nitrógeno contenido en el compuesto se utilizase durante el ciclo de división bacteriana en la síntesis de DNA. Después las pasaron a un medio con amoniaco con nitrógeno liviano (14N) y compararon la densidad de los DNA aparecidos en sucesivas generaciones (Tabla 1 y Figura 8). Los resultados obtenidos se esquematizan en la siguiente tabla. Tabla 1. Densidades de DNA. Generación
DNA pesado
DNA híbrido
DNA liviano
I II III IV V
100% 0 0 0 0
0 100% 50% 25% 12,5%
0 0 50% 75% 87,5%
Los datos indican que el DNA intermedio es una cadena híbrida constituida por dos cadenas de diferente densidad, una liviana y otra pesada. En cada generación disminuye a la mitad el DNA híbrido y aumenta el DNA con nitrógeno liviano.
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Figura 8. Experimento de Meselson y Stahl
(p = pesado, L = liviano).
c) Enzimas de la replicación. Como todo proceso biológico, en la replicación participa un conjunto de enzimas que permiten que la replicación sea rápida, fiel y eficiente: •
Primasas, sintetizan el RNA cebador (primer).
•
DNA polimerasas, permiten la formación de enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos, agregando el desoxirribonucleótido complementario al de la hebra molde. Utilizan trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) que además aportan energía para la reacción (Figura 9).
•
DNA girasa (Topoisomerasa), desenrollan el DNA.
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Helicasas, separan las dos hebras del DNA.
•
Proteínas SSB, mantienen separadas las dos hebras monocatenarias.
•
Ligasas, unen trozos de polinucleótidos adyacentes.
Figura 9. La reacción fundamental de la replicación es la adición de un desoxirribonucleótido al extremo 3’ de una cadena de DNA.
3. ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA). El RNA es un polirribonucleótido formado fundamentalmente por los ribonucleótidos de adenina, guanina, citosina y uracilo (en vez de la timina del DNA). La pentosa es la ribosa. Los RNA suelen ser monocatenarios, salvo en algunos virus, aunque pueden presentar regiones de apareamiento intracatenarias. Los RNA se transcriben copiando una cadena de la doble hélice del DNA (molde, templado o patrón)), mediante la complementariedad de bases. Se debe mencionar que existe una hebra molde, y otra no molde (codificadora). Existen distintos tipos de RNA que se pueden clasificar según su actividad biológica: a) RNA heteronuclear (hnRNA) b) RNA mensajero (mRNA) 8
c) RNA ribosómico (rRNA) d) RNA transferencia (tRNA) a) RNA heteronuclear (hnRNA). Es un RNA de alto peso molecular, también conocido como transcrito primario del RNA, ya que es el RNA recién sintetizado por la RNA polimerasa en el proceso de transcripción. En células procariotas, el transcrito primario actúa directamente como molde para la síntesis de proteínas. En el núcleo de las células eucariotas actúa como precursor de los demás tipos de RNA que se encuentran en el citoplasma. La fragmentación del hnRNA para formar otros tipos de RNA constituye la maduración o procesamiento del RNA. b) RNA mensajero (mRNA). El mRNA es el molde biológico de la información contenida en el DNA (gen), transporta la información desde el núcleo a los ribosomas para que se sinteticen las proteínas. El RNA recién transcrito (hnRNA), en eucariontes, no es la molécula definitiva que sale al citoplasma, debido a que ésta es una molécula precursora de mayor tamaño, formada por regiones con información (exones) para sintetizar una proteína específica, interrumpida por segmentos de RNA sin información (intrones). Este transcrito primario sufre un proceso de maduración donde ocurren diferentes tipos de cortes y empalmes que origina el mRNA que saldrá al citoplasma para traducirse en proteínas. Por lo tanto, el proceso de maduración en el RNA permite controlar la expresión génica. c) RNA ribosómico (rRNA) Los rRNA forman parte de los ribosomas que se encargan de sintetizar las proteínas según la secuencia de nucleótidos de los mRNA. Son filamentos muy plegados, sobre los cuales se asocian proteínas específicas, constituyendo las subunidades mayor y menor del ribosoma. Las subunidades ribosómicas, salen luego por los poros de la carioteca al citoplasma. Hay varios tipos, que se clasifican atendiendo a su coeficiente de sedimentación. Estas moléculas se sintetizan en el DNA nucleolar a partir de un único RNA precursor. El rRNA contribuye a dar al ribosoma su estructura acanalada, la cual le permite albergar simultáneamente un mRNA y una proteína. d) RNA de transferencia (tRNA) Se trata de moléculas pequeñas y constan de alrededor de 80 nucleótidos. Cada tRNA, ayudado por la enzima aminoacil tRNA sintetasa, reconoce y se une a cada uno de los 20 aminoácidos. Los tRNA tienen una zona con forma de bucle donde se encuentra el anticodón, que es un triplete de nucleótidos complementario de un codón o triplete específico del mRNA. Si se despliega la molécula de tRNA de forma parcial, presenta el aspecto de una hoja de trébol con cuatro tramos doble hélice y tres asas, una de las cuales es el anticodón. Esta estructura se vuelve a plegar adquiriendo aspecto de L invertida (Figura 10), en uno de cuyos extremos se encuentra el anticodón y en el otro la unión al aminoácido. Los tRNA reconocen los codones del mRNA y transfieren un aminoácido determinado a la proteína que se está sintetizando de forma específica (traducción). Existe al menos un tRNA para cada aminoácido.
Figura 10. Estructura del tRNA.
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El dogma central de la Biología molecular afirma que la información genética debe fluir desde los ácidos nucleicos a las proteínas.
DNA
RNA
4. La
PROTEÍNAS
tecnología del DNA. Lederberg, Tatum y sus colegas fueron los pioneros en la genética bacteriana, un campo que en 20 años hizo de la E. coli el más estudiado de todos los organismos a nivel molecular. Finalmente, en la década de los 70, la investigación sobre las bacterias condujo al desarrollo de la tecnología del DNA recombinante. Ésta es un conjunto de técnicas para combinar, en un tubo de ensayo los genes de diferentes fuentes, incluso la de especies diferentes y de ese modo transferir el DNA recombinante resultante a células blanco de interés, donde se pueda replicar, transcribir y traducir en proteínas. El uso masivo de estas técnicas ha rendido altos dividendos en la investigación básica. Por ejemplo, haciendo uso de la tecnología del DNA, se descubrieron las secuencias no codificadoras dentro de los genes eucarióticos (intrones). Esta tecnología también ayudó a descubrir mutaciones y/o genes que provocan cáncer (oncogenes) y quizás el uso más importante es la investigación en el proyecto del genoma humano. El proyecto del genoma humano, está revelando las bases genéticas de lo que significa ser un humano. A nivel más práctico, se espera que este ambicioso esfuerzo nos ayude a comprender y curar muchas enfermedades. a) Obtención de múltiples copias de DNA Los clones, en genética molecular, son copias múltiples de la misma secuencia de DNA. Las secuencias a ser clonadas se introducen en células bacterianas por medio de vectores. Los plásmidos y los virus se usan como vectores. Las secuencias de DNA que se desean clonar deben ser insertadas en los vectores. Una vez en la bacteria, el vector y el DNA extraño que lleva, se replican y las múltiples copias pueden ser recuperadas de las células (Figura 11).Los extremos pegajosos, formados por secuencias TTAA y AATT, pueden unirse con cualquier otro segmento de DNA que haya sido escindido por la misma enzima. Así es posible insertar un gen extraño en el plásmido. (En el diagrama de la figura 11, la longitud de las secuencias GAATTC se ha exagerado y las longitudes de las otras porciones del gen extraño y del plásmido se han acortado). Cuando estos plásmidos recombinantes, que llevan un gen extraño, se incuban en ciertas condiciones con bacterias en medio líquido, son captados por algunas de las células bacterianas. Cuando estas células se multiplican, los plásmidos también se replican; el resultado es un número creciente de células, todas sintetizando copias del mismo plásmido. Los plásmidos pueden separarse luego de los otros contenidos celulares y tratarse con EcoRI para liberar copias múltiples del gen clonado.
Figura 11. Introducción de un gen extraño en un plásmido bacteriano.
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Las herramientas de corte para hacer DNA recombinante son enzimas bacterianas llamadas enzimas de restricción (Ej. EcoRI, HindIII, PstI, etc.), las cuales fueron descubiertas por primera vez a finales de la década de los 60. Estas enzimas son endonucleasas que reconocen secuencias específicas en el DNA, normalmente de 4 a 6 pares de bases con simetría rotacional y producen roturas en las dos cadenas. En la naturaleza, estas enzimas protegen a la bacteria contra el DNA intruso de otros organismos y virus. Para unir los trozos de DNA se utiliza otra enzima denominada DNA ligasa. Hasta la década de 1980, el único método para obtener grandes cantidades de un fragmento de DNA era clonándolo en vectores adecuados e introducirlo y multiplicarlo en bacterias. En el año 1986, un investigador norteamericano, K. Mullis, desarrolló un método que permite, a partir de una muestra muy pequeña de DNA, obtener millones de copias de DNA in Vitro (figura 12), en unas pocas horas y sin necesidad de usar células vivas. Esta técnica, llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR), requiere conocer la secuencia de nucleótidos de los extremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de DNA complementarios a una porción de cada una de las dos cadenas de la doble hélice. Para clonar genes específicos se puede preparar una biblioteca genómica que consiste en una colección de fragmentos de DNA genómicos, clonados en vectores, que representan el genoma entero del organismo.
Figura 12. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El método consiste en someter a una secuencia de DNA que interesa clonar, a ciclos de calentamiento y enfriamiento, más los requisitos básicos para la replicación.
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b) La electroforesis en gel. Una herramienta clave en la tecnología del DNA, es la electroforesis en gel, que es un método para separar físicamente macromoléculas, como proteínas o ácidos nucleicos, principalmente sobre la base de su carga eléctrica y tamaño (Figura 13). Si una muestra de DNA se deposita en el extremo negativo del aparato, la molécula debiera migrar al lado positivo (las moléculas pequeñas migran más rápido hacia el ánodo). En el caso del DNA tiene carga negativa gracias a su grupo fosfato. Cuando la corriente se apaga, el resultado es una serie de bandas en cada fila del gel. Cada banda consiste en moléculas de DNA de distinto tamaño.
Figura 13. Electroforesis en gel de poliacrilamida. A) Depósito que recibe las muestras para ser sometidas a un campo eléctrico. B) Bandas características una vez teñidas las macromoléculas.
c) Otras aplicaciones de la tecnología del DNA.
Como una nueva técnica para la medicina forense. Las huellas Del DNA pueden resolver crímenes. Producción de fármacos y nuevas vacunas. Mejoramiento genético en plantas y animales (Organismos transgénicos). Terapia génica para el tratamiento de enfermedades genéticas.
d) La ingeniería genética presenta algunos riesgos. Las primeras preocupaciones se enfocaron sobre la posibilidad que se pudieran crear nuevos y peligrosos patógenos, también el debate se extendió en relación con la manipulación genética en plantas y animales, y se centra en los peligros ecológicos que representa el introducir nuevos organismos al ambiente. Una forma de no generar inquietud en la población, es mantener un conjunto de procedimientos y controles estrictos para evitar el mal uso de esta tecnología. De esta forma debemos trabajar para asegurarnos de que la sociedad aprenda a usar la información genética de manera benéfica, sabiendo que la ciencia en malas manos puede provocar daños irreparables.
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