Kombucha & Co.: Essigsäurebakterien als Starterkulturen: Einfluss

 KOMBUCHA & CO.

Essigsäurebakterien als Starterkulturen: Einfluss von Hefeextrakt auf die Biomasseproduktion

Maximilian Schmacht, Dr.-Ing. Martin Senz, VLB Berlin, Forschungsinstitut für Biotechnologie und Wasser, Bioprozesstechnik und Angewandte Mikrobiologie

Vor dem Hintergrund eines steigenden Bewusstseins für eine gesunde und bewusste Lebensführung erfreuen sich fermentierte alkoholarme oder alkoholfreie Getränke wie Kombucha oder Wasserkefir zunehmender Beliebtheit. Die traditionellen Produktionsmethoden mit undefinierten mikrobiellen Konsortien stehen jedoch dem Bedarf an reproduzierbaren und skalierbaren industriellen Produktionsprozessen gegenüber. Das Forschungsinstitut für Biotechnologie und Wasser versorgt seine Kunden mit entsprechenden Starterkulturen.

Traditionell fermentierte Getränke wie Kombucha, Wasserkefir oder Kwass gewinnen zunehmend an Beliebtheit bei Kunden, die an natürlichen Getränken, die potenziell auch zu einem gesunden Lebensstil beitragen, interessiert sind. Die traditionellen Produktionsmethoden beruhen jedoch auf der Verwendung nicht definierter mikrobieller Gemeinschaften. Somit ist eine reproduzierbare Herstellung von Produkten mit immer gleichen Eigenschaften schwer zu erreichen. Eine Lösung für dieses Problem ist die Verwendung definierter Starterkulturen, was zu einem besser kontrollierbaren Fermentationsprozess führt. Das VLB-Forschungsinstitut für Biotechnologie und Wasser stellt seinen Kunden seit Jahrzehnten Starterkulturen für verschiedenste Getränke bereit und ist auch aktuell aktiv in der Erweiterung seines Angebotsspektrums. Bei Kombucha wird der sogenannte SCOBY (symbiotic culture of bacteria and yeast, dt.: symbiotische Bakterien-Hefe-Kultur) zur Fermentation von gezuckertem Tee zu einem essigsauren Erfrischungsgetränk eingesetzt. Er besteht hauptsächlich aus Essigsäurebakterien (z. B. Acetobacter, Komagataeibacter) und Hefen (z. B. Brettanomyces, Zygosaccharomyces). Um hohe Biomassen zu erreichen, müssen die Fermentationsmedien an die Anforderungen der jeweiligen Stämme angepasst werden. In der Regel ist die Verwendung komplexer Medien der effizienteste Weg für eine hohe Biomasseproduktion, da sie ein breites Spektrum an Nährstoffen bereitstellen. Die Auswahl bestimmter Komponenten wie Hefeextrakt kann jedoch einen großen Einfluss auf das Endergebnis haben. Hier wurde eine Studie zum Einfluss verschiedener Hefederivate auf das Wachstum von Komagataeibacter hansenii mit der miniaturisierten Fermentationsplattform BioLector® Pro (m2p-labs GmbH) durchgeführt. Diese hochmoderne Fermentationsanlage wurde vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie (INNO-KOM Modul IZ: IZ150029) gefördert und ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening unterschiedlicher Versuchsbedingungen sowohl im Batch- als auch im Fed-Batch-Modus im Mikrolitermaßstab.

Batch-Screening-Experimente ohne pH-Kontrolle

Die Fermentationen in den verschiedenen Medien verliefen in der ersten Stufe gleich. Innerhalb der Phase des exponentiellen Wachstums ermöglichte X-SEED® KAT jedoch ein deutlich verbessertes Wachstum im Vergleich zu allen anderen verwendeten Hefederivaten, mit Biomassewerten von 25,37 AU, was 5,52∙109 Zellen/ml

Tabelle 1: Verschiedene Hefederivate für Fermentationsstudien mit K. hansenii Ko-0201

entsprach (Abb. 1). Die Verwendung von X-SEED Pepton führte zu ungefähr der gleichen finalen Biomasse, jedoch mit einer Verzögerung von ca. 10 Stunden. Zusammenfassend kann davon ausgegangen werden, dass K. hansenii Ko-0201 für das Wachstum eher freie Aminosäuren als Ribonukleotide benötigt. Die Bereitstellung dieser Aminosäuren in Form von Peptiden erfordert deren enzymatische Spaltung, was zu einem verzögerten Wachstum im Vergleich zur direkten Bereitstellung freier Aminosäuren führt.

Batch-Screening-Experimente bei kontrolliertem pH

Im Anschluss an diese Ergebnisse wurden Versuche durchgeführt, um den Einfluss des pH-Wertes zur weiteren potenziellen Verbesserung der Biomasseausbeute zu untersuchen. Daher wurden Fermentationen mit Medien, die X-SEED KAT als aussichtsreichsten Hefeextrakt enthielten, mit pHKontrolle auf 5,5 sowie 4,5 unter Verwendung von mikrofluidischen BioLector-Mikrotiterplatten durchgeführt. Die höchste Endbiomasse wurde mit X-SEED KAT bei pH 4,5 mit 34,55 AU entsprechend 7,20∙109 Zellen/ml (n=2) erreicht, was im Vergleich zu pH 5,5 (28,24 AU; 6,46∙109 Zellen/ml, n=3) etwas höher war (Abb. 2). Dementsprechend war auch die Produktion und Wiederaufnahme von Gluconsäure bei pH 4,5 etwas schneller. Dieser Trend war jedoch statistisch nicht signifikant (Student’s t-Test > 0,05). Nichtsdestotrotz ermöglichte die Kontrolle des pH-Wertes eine höhere Biomasse als ohne pH-Kontrolle, was darauf hindeutet, dass die Enzyme und der gesamte Zellstoffwechsel bei leicht sauren Bedingungen im Gegensatz zu deutlich niedrigeren Abb. 1: Biomasseverlauf von K. hansenii Ko-0201 in Medien, die verschiedene Hefederivate enthalten. Die Experimente wurden in biologischen Duplikaten durchgeführt (gezeigt sind Mittelwerte ± Mittelwertabweichung)

Reinzuchthefen & Starterkulturen Reinzuchthefen & Starterkulturen

Hefestämme und funktionelle Mikroorganismen für die Brauerei, die Spirituosen- und Getränkeindustrie Hefestämme und funktionelle Mikroorganismen für die Brauerei, die Spirituosen- und Getränkeindustrie

+ + obergärige Hefestämme obergärige Hefestämme + + untergärige Hefestämme untergärige Hefestämme + + Hefen für alkoholarmes Bier und Hefen für alkoholarmes Bier und

Spezialbiere (z.B. Sauerbier) Spezialbiere (z.B. Sauerbier) + + Brennerei-, Wein- und Brennerei-, Wein- und

Champagnerhefen Champagnerhefen

VLB Berlin – Biologisches Labor VLB Berlin – Biologisches Labor Seestraße 13, 13353 Berlin Seestraße 13, 13353 Berlin biolab@vlb-berlin.org biolab@vlb-berlin.org + + Milchsäurebakterien zur biologischen Milchsäurebakterien zur biologischen

Säuerung Säuerung + + Kulturen für alternative Gärgetränke Kulturen für alternative Gärgetränke (z.B. Kombucha oder Wasserkefir) (z.B. Kombucha oder Wasserkefir)

Versand als Schrägagar oder Hefekonzentrat Versand als Schrägagar oder Hefekonzentrat

www.vlb-berlin.org/hefe www.vlb-berlin.org/hefe

pH-Werten < 3,0 besser arbeiten. Mittels Online-Biomassemessung kann der Erntezeitpunkt direkt bestimmt und zwischen verschiedenen Versuchsbedingungen verglichen werden, was zu einer wirtschaftlich sinnvollen Starterkulturproduktion führt.

Zusammenfassung

Die Wahl des richtigen Kultivierungsmediums, das alle essentiellen Nährstoffe für eine effektive Biomasseproduktion bereitstellt, ist entscheidend für die industrielle Herstellung von Starterkulturen. Fünf verschiedene Hefederivate wurden auf ihren Einfluss auf das Wachstum von Komagataeibacter hansenii Ko-0201 getestet und es zeigte sich, dass die Bereitstellung freier Aminosäuren durch X-SEED KAT der vorteilhafteste Weg zur Erzielung hoher Biomassen war. Dieser Effekt war bei kontrollierten pH-Werten noch ausgeprägter. Der Screening-Ansatz in der miniaturisierten Fermentationsplattform BioLector Pro lieferte in kurzer Zeit wesentliche Daten für alle Versuchsbedingungen.

Danksagung

Die Autoren bedanken sich herzlich für die gute Zusammenarbeit mit Anna Korona (m2p-labs GmbH) und Dr. Abhishek Somani (Ohly GmbH).

Die hochmoderne Fermentationseinheit BioLector® Pro wurde vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie gefördert, INNO-KOM Modul IZ: IZ150029 Abb. 2: Kultivierung von K. hansenii Ko-0201 in Medium mit X-SEED® KAT Hefeextrakt, kontrolliert auf pH 4,5 bzw. pH 5,5. Durch die Probenahme nimmt die Zahl der biologischen Replikate mit der Zeit ab. Die Werte repräsentieren jedoch ein Minimum von drei biologischen Replikaten für pH 5,5 und mindestens Duplikate für pH 4,5

Kontakt: Dr.-Ing. Martin Senz Leiter Forschungsinstitut für Biotechnologie und Wasser m.senz@vlb-berlin.org Kontakt: Maximilian Schmacht Forschungsinstitut für Biotechnologie und Wasser m.schmacht@vlb-berlin.org